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OBIETTIVI:
ATTIVITA’ ANTIVIRALE DI NANOPARTICELLE DI RAME E DI ORO: Gli studi condotti
dalla dottoressa Martora Francesca si sono concentrati sulla ricerca delle caratteristiche antivirali di
particolari nanoparticelle. Le infezioni virali rappresentano una delle cause principali di insorgenza
delle malattie spesso associate a complicanze, come sovrainfezioni batteriche, ma anche
complicanze più gravi definite sindromi post-virali. La medicina convenzionale dispone soltanto di
alcuni rimedi per il trattamento delle infezioni virali comuni, mentre prevede strategie più avanzate
per l’inibizione di infezioni virali gravi. Pertanto le nanotecnologie rappresentano una nuova
frontiera scientifica applicata alla medicina. Infatti quest’ultime rappresentano una nuova speranza
per la ricerca di nuovi agenti antivirali. Partendo da ciò, tale lavoro è volto a valutare il potenziale di
attività antivirale di alcune nanoparticelle di Rame e di Oro su tre tipi di virus: HSV-1 (Herpes
Simplex Virus type 1), HSV-2 ( Herpes Simplex Virus type 2) e HPIV-3 (Human Parainfluenzae
Virus type 3).
ATTIVITA’ ANTIBATTERICA DELLA MIXINIDINA E DEI SUOI PEPTIDI OMOLOGHI:
Nell’ultimo decennio numerosi peptidi biologicamente attivi sono stati isolati da un’ampia gamma
di organismi viventi quali piante, pesci, anfibi e mammiferi. Tali peptidi agiscono o attraverso
un’azione diretta sui microrganismi bersaglio o modulando l'attività dei diversi componenti del
sistema immunitario. Molti agenti patogeni umani colonizzano l’ambiente acquatico e, per questo
motivo, è ipotizzabile che i pesci abbiano sviluppato dei peptidi antimicrobici (AMPs) come
meccanismo difensivo per contrastare tali patogeni. Tra gli AMPs isolati dalle specie ittiche, la
mixinidina ha suscitato il nostro interesse. Questo peptide viene estratto dalle cellule mucipare
epiteliali dei ciclostomi (Lampreda). Come riportato in letteratura, la mixinidina mostra uno spettro
di attività antibatterica superiore ad altri AMPs. Tali osservazioni suggeriscono che questo potrebbe
essere un interessante candidato per molteplici approcci terapeutici. Partendo dalla sequenza della
mixinidina (GLY-ILE-HIS-ASP-ILE-LEU-LYS-TYR-GLY-LYS-PRO-SER) abbiamo eseguito una
mutagenesi ALA-scanning. Sostituendo singolarmente ogni amminoacido con l’alanina, abbiamo
identificato i residui e i requisiti strutturali necessari per l’attività antimicrobica. Lo step successivo
è stato quello di disegnare peptidi dotati di un’elevata attività inibitoria a basse concentrazioni.
Sostituendo singolarmente ogni amminoacido con l’alanina, si è potuto determinare il contributo di
ogni singolo residuo alla stabilità o alla funzionalità del peptide nativo. L’alanina presenta un
gruppo chimicamente inerte e metil-funzionale, che imita la struttura secondaria presente in molti
aminoacidi. E’ stata testata l’azione antimicrobica dei 12 peptidi ottenuti.
ATTIVITA’ SVOLTE:
ATTIVITA’ ANTIVIRALE DI NANOPARTICELLE DI RAME E DI ORO: Prima di valutare
l’attività antivirale le nanoparticelle sono stati testate accuratamente su sistemi biologici. Infatti la
citotossicità delle stesse è stata valutata attraverso il saggio di MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide.
Gli esperimenti per saggiare l’attività inibitoria sono stati condotti utilizzando cellule VERO.
Gli stock virali sono stati preparati propagando il virus del ceppo SC16 di HSV-1, il ceppo 333 del
HSV-2 e il ceppo C243 del HIPV3 (virus parainfluenzale 3), di cui i primi due ingegnerizzati per il
gene LacZ regolato dal promotore IE-1 di CMV su cellule Vero.
E’ stato studiato l'effetto inibitorio delle nanoparticelle, seguendo diverse metodologie in vitro (Cotreatment assay, Cell pre-treatment, Cell post-treatment, Virus pre-treatment, Virus yeld assay). La
percentuale (%) dell’inibizione dell’infettività è stata calcolata paragonando il numero delle placche
osservate in presenza delle sostanze in esame, con il numero delle placche presenti al controllo
positivo, dove non sono presenti le sostanze antivirali e la percentuale di inibizione è 0%.
Al fine di determinare il grado di attività antivirale e chiarire il meccanismo di inibizione, abbiamo
testato le stesse in diverse condizioni.
ATTIVITA’ ANTIBATTERICA DELLA MIXINIDINA E DEI SUOI PEPTIDI OMOLOGHI: Per
valutare l’attività antibatterica dei peptidi sono stati utilizzati cinque diversi ceppi batterici ATCC:
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Gram negativo
Gram negativo
ATCC 11229
ATCC 13388
Salmonella Typhimurium
Gram negativo
ATCC 14028
Klebsiella Pneumoniae
Gram negativo
ATCC 10031
Staphylococcus aureus
Gram positivo
ATCC 6538
L’attività antimicrobica, è stata valutata mediante la concentrazione minima inibente (MIC). Le
MICs sono state calcolate usando la metodica di microdiluizione in accordo alle linee guida CLSI.
Sono stati testati la Mixinidina e i peptidi derivati dall’ ALA-scanning per identificare
quantitativamente l’attività antibatterica dei suddetti peptidi. Per tutti i peptidi è stato effettuauto il
Saggio MTT. E’ stato inoltre effettuato il saggio di emolisi.
RISULTATI CONSEGUITI:
ATTIVITA’ ANTIVIRALE DI NANOPARTICELLE DI RAME E DI ORO: La replicazione del
virus sembra essere inibita sia quando il virus e le nanoparticelle sono presenti sulla cellula
contemporaneamente, sia durante la fase successiva all’adesione virale, cioè quando il virus è già
penetrato nelle cellule. Quest'ultimo effetto potrebbe essere dovuto sia ad una interferenza con il
meccanismo di replicazione del virus all'interno della cellula, sia all’incapacità del virus di infettare
altre cellule dopo il primo ciclo di replicazione.
Dai risultati ottenuti si evince che alcune di esse possono avere attività antivirale molto efficace.
Resta ancora da capire, però, se le nanoparticelle possono penetrare nella cellula e prevenire la
replicazione del genoma virale (DNA o RNA), bloccando cosὶ la moltiplicazione dei virus, oppure
possono prevenire la fusione dell’envelope con la cellula ospite portando cosὶ al blocco della loro
penetrazione. Nonostante i meccanismi d’azione delle nanoparticelle siano ancora oggetto di studio,
sicuramente le nanoparticelle potranno essere prese in considerazione per il loro utilizzo futuro
nella medicina moderna tenendo presente, ovviamente, l’effetto che esse avrebbero sull’uomo e
sull’ambiente.
ATTIVITA’ ANTIBATTERICA DELLA MIXINIDINA E DEI SUOI PEPTIDI OMOLOGHI: I
peptidi analizzati non sono risultati essere tossici e neanche provocare emolisi. I peptidi con una
sostituzione non significativa presentano una attività inibitoria paragonabile al peptide nativo. I
risultati ottenuti suggeriscono che il meccanismo d’azione del peptide è sequenza-specifico e non
struttura-specifico. In particolare è stato isolato un peptide che mostra un’elevata inibizione sia nei
confronti dei Gram-positivi che dei Gram-negativi. Il nostro studio proseguirà testando tale peptide
a diverse concentrazioni su differenti batteri nosocomiali. Ciò indica che la mixinidina e i suoi
modificati potrebbero essere utilizzati nelle applicazioni relative alla salute umana, arricchendo il
repertorio farmacologico dedicato alle infezioni batteriche e alla conseguente comparsa di ceppi
batterici multiresistenti.
DESCRIZIONE DELLA STRUTTURA OSPITANTE: Il lavoro è stato svolto nel laboratorio di
Microbiologia e Virologia del Prof. Massimiliano Galdiero – Dipartimento di Medicina
Sperimentale sezione di Microbiologia-, che le ha fornito tutti i mezzi a sua disposizione per poter
svolgere al meglio queste attività.
Francesca Martora