GM-CSF

GRANULOCITE-MACROPHAGE COLONY-STIMULATING
FACTOR
Elisa Gerbaudo
a.a. 2006/2007
GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) è una glicoproteina di
22 kDa, codificata da un gene localizzato nel cromosoma umano 5, che contiene 4
esoni e 3 introni.
E’ posizionato in tandem col gene per l’ IL-3 e in prossimità dei geni per IL-4, IL-5,
IL-9 ed M-CSFR.
Il precursore è una proteina di 144 aa:
-2 ponti disolfuro : Cys 54-96(importante per l’ attività biologica) e Cys 88-121
-2 potenziali siti di glicosilazione: Asn 27 e Asn 37( la forma non glicosilata ha
attività maggiore)
Il clivaggio del peptide segnale genera una proteina matura di 127 aa.
STRUTTURA GM-CSF
Martinez-Moczygemba M. et al. Biology of common β receptor-signaling cytokines: IL-3, IL-5, e GM-CSF, J Allergy Clin Immunol, 112:653, 2003
Struttura della forma non-glicosilata:
4α eliche in conformazione up-up-down-down antiparallele;
Il dominio di legame di Rα comprende il primo e terzo loop antiparalleli;
Il dominio di legame di βc contiene un residuo di glutammato (21) nella prima
α elica.
Concentrazione nel siero: 20-100 pg/ml
GM-CSF è prodotto da:
Macrofagi
Linfociti T
Linfociti B
Eosinofili
Mast cells
Neutrofili
Fibroblasti
Cellule endoteliali
Cellule placentali
Astrociti
Cellule stromali
Cheratinociti
Cellule mesoteliali
Osteoblasti
GM-CSF viene secreto in risposta a vari stimoli: IL-1, TNF-α, LPS.
Nelle cellule T la sinergia tra TCR e CD28 porta a produzione di GM-CSF
Regolazione sia a livello della trascrizione che post-trascrizionale
Il gene di GM-CSF comprende 2 regioni di controllo trascrizionale distinte:
-la regione del promotore, che si estende per 120 bp a partire dal sito di inizio della
trascrizione;
-una regione enhancer 3 kb upstream.
Il promotore risponde a diversi segnali: Ca2+, TNF, IL-1
E lega fattori quali NF-kB, NF-AT, AP.1
Oltre all’ aumentata trascrizione, è importante la degradazione dell’mRNA
(presenza di 8 motivi 5’-AUUUA-3’ nella regione 3’ UTR)
IL RECETTORE DEL GM-CSF
Appartiene alla famiglia di gp140, del gruppo di recettori per le citochine di tipo I:
Contiene domini extracellulari conservati (CRMs), ognuno costituito da 2 domini
fibronectin III-like.
4 cisteine conservate
Catena α
Si associa al GM-CSF con
bassa affinità (1-10 nM)
Motivo WSXWS
(folding)
Catena β
Necessaria per la trasduzione
del segnale, media il legame
ad alta affinità del GM-CSF
assieme al recettore α
Lyne PD et al., Molecular modeling of the GM-CSF amd IL-3 receptor complexes, Protein Sci., 4:2223, 1995.
Scott CL et al.,The beta common chain of the Granulocytemacrophage Colony Stimulating Factor , IL-3 and IL-5
receptors, The International Journal of Biochemestry &
Cell Biology,31:1011, 1999.
E’ espresso da:
Macrofagi
cellule CD34+
Neutrofili
precursori di eritrociti e megacariociti
Eosinofili
linfociti T e B fetali
Basofili
DC
cellule vascolari endoteliali
fibroblasti
Cellule tumorali di vario tipo
CATENA α
(CD116)
Gene localizzato nella regione pseudoautosomale (PAR) dei
cromosomi X e Y, copre un’ area di 45 kb, ha 13 esoni
Motivi di legame per PU.1, AP-1, GATA, C/EBP,NFkB.
Singolo passo transmembrana di 400 aa; la forma full-length
di 80 kDa è predominante (almeno 8 isoforme).
Martinez-Moczygemba M. et al. Biology of
common β receptor-signaling cytokines: IL-3,
IL-5, e GM-CSF, J Allergy Clin Immunol,
112:653, 2003
Dominio extracellulare: 1 regione N-terminale di 100 aa (omologia con IL-3Rα e
IL-5Rα), 2 domini fibronectin-III like contenenti 4 residui di Cys conservati e un
motivo WSXWS .
11 potenziali siti di glicosilazione.
Dominio citoplasmatico: 1 corto motivo proline-rich, privo di attività intrinseca.
CATENA β
(CD 131)
E’ condivisa coi recettori per l’ IL-3 e IL-5, ha 2 funzioni:
-aumentare l’ affinità di legame;
-trasdurre il segnale.
Singolo gene sul cromosoma 22;
siti di legame per i membri della famiglia Ets (PU.1), GATA,
C/EBP, Myb, AP-1, STATs, NFkB;
upregolata in risposta a IFNγ, eritropoietina, stem cell factor, IL-3
e TNFα
Polipeptide di 95 kDa e 880 aa con 3 potenziali siti di Nglicosilazione
Martinez-Moczygemba M. et
al. Biology of common β
receptor-signaling cytokines:
IL-3, IL-5, e GM-CSF, J
Allergy Clin Immunol,
112:653, 2003
Dominio extracellulare: 2 domini di omologia (4 motivi fibronectin-III), con residui
conservati: 4 Cys, una coppia Pro-Pro e il motivo WSXWS.
Dominio citoplasmatico: è più lungo, ha siti di legame per Jak (Box1 e2).
2 isoforme: full-length e una forma alternativa (βIT), tronca, che agisce come inibitore
di βc.
Modello di attivazione
del recettore
Guthridge MA et al., Mechanism of activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 family of receptors, Stem Cells, 16:301, 1998
Martinez-Moczygemba M. et al. Biology of common β receptor-signaling cytokines: IL-3, IL-5, e GM-CSF, J Allergy Clin Immunol, 112:653,
2003
1. JAK / STAT
2. RAS / MAPK
3. PI 3 K
proliferazione e differenziamento
proliferazione, crescita e sopravvivenza
proliferazione,dimensioni cellulari, apoptosi e
riarrangiamenti del citoscheletro
Guthridge MA et al., Mechanism of activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 family of receptors, Stem Cells, 16:301, 1998
Terminazione del segnale
-attivazione di fosfatasi (SHP1 è coinvolta nella downregolazione dell’ attivazione
di βc);
-induzione di soppressori del signaling delle citochine (SOCS): famiglia di small
protein contenenti SH2.
Meccanismi: inattivazione delle JAKs ; blocco dell’ accesso delle STATs ai siti di
legame del recettore; ubiquitinazione delle proteine segnale e targeting al
proteosoma.
-PIAS: inibitori delle STAT, bloccano il loro legame al DNA
-endocitosi e degradazione del recettore;
-sintesi e rilascio di recettori solubili per GM-CSF :(sGM-CSFR-α, manca del
dominio TM e IC), espressi in BM, monociti/macrofagi; cells di corio-carcinoma, T
cells del tessuto sinoviale reumatoide.
Attività biologica in vitro
Stimolazione di proliferazione, differenziamento, funzione e sopravvivenza delle
cellule ematopoietiche (attività sovrapposta a quella di altre citochine, come M-CSF,
G-CSF, IL-3, IL-6, SCF):
GM-CSF
Monfardini C et al., Structure-based design of mimetics for Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), Current Pharmaceutica
Design, 8:2185, 2002
Progenitori ematopoietici:
stimola la crescita di CFU-G, CFU-M, CFU-GM, CFU-DC, CFU-Eo.
Monociti / macrofagi:
aumenta la fagocitosi (azione sinergica con TNF-α);
potenzia l’ uccisione di microbi attraverso specie reattive di O e N;
aumenta la loro funzione di APC attraverso un’ overespressione di MHC-II e
molecole co-stimolatorie;
stimola la produzione di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-1α e β, IL-6, IL-8,
IL-12, M-CSF, IL-1Ra);
promuove la migrazione verso i loci infiammatori (aumento espressione di
molecole di adesione, quali CD11b e ICAM)
Neutrofili: ne stimola l’ attività antimicrobica attraverso aumentata fagocitosi e
killing intracellulare;
Cellule dendritiche: DCs sono specializzate nella cattura dell’ Ag, nella
migrazione e nella stimolazione delle cell T e sono una popolazione piuttosto rara.
GM-CSF ( da solo o con IL-4 o TNF-α) promuove lo sviluppo delle DCs.
Altre cellule:
eosinofili: ne promuove la sopravvivenza, la citotossicità, la produzione di
leucotrieni e l’ adesione;
granulociti basofili: induce il rilascio di istamina;
T cells: aumenta la capacità dell’ IL-2 di stimolarle;
NK: aiuta i precursori delle NK a differenziare;
cells non-ematopoietiche, tra cui fibroblasti, cells endoteliali e cells della
muscolatura liscia.
Attività biologica in vivo
Topi transgenici per il GM-CSF:
-L’ overespressione porta ad accumulo di macrofagi in diversi tessuti, cecità e danni
tissutali letali;
-Topi trapiantati con BM cells infettate con retrovirus esprimente GM-CSF sviluppano
sindrome mieloproliferativa (infiltrati di neutrofili, eosinofili e macrofagi in polmoni,
fegato, milza, cuore e muscoli
morte).
-Trasferimento genico mediato da adenovirus nei polmoni induce eosinofilia,
espansione dei macrofagi, neutrofili e DCs (sensibilizzazione agli aeroallergeni).
-Polimorfismi di GM-CSF sono determinanti dell’ asma.
-L’ espressione nello stomaco porta a gastrite autoimmune.
Topi GM-CSF deficienti:
-non hanno alterata produzione di cells ematopoietiche
-sviluppano anomalie polmonari simili alla proteinosi polmonare alveolare (PAP),
caratterizzata da progressivo accumulo di proteine surfattanti e lipidi negli alveoli
-mostrano risposte compromesse alle cell T citotossiche, produzione di IFNγ e funzioni
fagocitarie alterate, quindi aumentata suscettibilità a infezioni con L. monocytogenes,
Streptococcus e P.carinii
Topi GM-CSF Rβc deficienti:
Sviluppano PAP e hanno un numero ridotto di eosinofili
Patologie:
Infezioni:
Migliora la host response a diversi tipi di batteri e funghi (C. albicans,
Pneumococcus, P.carinii)
Guarigione delle ferite:
Accelera il riparo tissutale
Tumori:
GM-CSF induce lo sviluppo di DCs in vitro.
Le DCs sono specializzate nel dare inizio all’ immunità, a causa della loro capacità
di processare efficientemente gli Ag in pathways di MHC di classe I e II.
La vaccinazione con cells tumorali irradiate, ingegnerizzate per secernere GM-CSF
stimolano l’ espansione e la maturazione delle DCs provocano un’ immunità antitumorale potente, specifica e duratura (in topi).
Infiammazione:
Come molecola pro-infiammatoria
-Aumentati livelli di GM-CSF in biopsie di pelle da pazienti allergici con reazioni
cutanee;
-Presente in elevata quantità nelle giunture di pazienti affetti da artrite reumatoide.
-Elevati livelli in pazienti affetti da asma
Come molecola anti-infiammatoria
-Previene la progressione dell’ aterosclerosi
Differenze a seconda della dose, di stimoli addizionali, di infezioni concomitanti
Hamilton JA, GM-CSF in inflammation and autoimmunity,TRENDS in Immunology, 23:403, 2002
Artrite reumatoide:
GM-CSF è coinvolto nella patogenesi dell’ RA, sia nelle prime fasi di
presentazione dell’ Ag alle cellule T, sia nelle fasi successive di attivazione dei
macrofagi e rilascio di enzimi di degradazione.
GM-CSF
GM-CSF
Monfardini C et al., Structure-based design of mimetics for Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF),
Current Pharmaceutical Design, 8:2185, 2002
Asma
Stacey AR et al., On the generation of allergic desease: from GM-CSF to Kyoto, TRENDS in Immunology, 23:396, 2002
APPLICAZIONI CLINICHE
NEUTROPENIA E TROMBOCITOPENIA DOPO CHEMIOTERAPIA O BMT:
Riduce il periodo di neutropenia e trombocitopenia inducendo la proliferazione e la
mobilizzazione di neutrofili, eosinofili, monociti e piastrine derivati da BM
BMT su topi con 3 diverse popolazioni cellulari:
I topi trapiantati sono stati trattati con cells producenti GM-CSF
Aumento di 4 volte della ricostituzione delle T-cells e delle DCs
MOBILIZZAZIONE DELLE PBSC :
Mobilizza le PBSC dopo chemioterapia o in combinazione con G-CSF.
Il miocardio infartuato recluta cells
staminali e progenitrici circolanti
verso il sito del danno
usato GM-CSF per
mobilizzare BMSCs in pazienti
con AMI
Cells 34+ i pazienti trattati con GM-CSF
aumentano e hanno un picco a 7 gg
HIV:
Sopprime la replicazione di HIV; aumenta l’ attività antiretrovirale di zidovudina e
stavudina
Infezioni da lentivirus, come HIV, causano neutropenia e difetti nei neutrofili e
aumentano la suscettibilità a infezioni da parte di batteri Gram+, Gram- e funghi
Animali infettati con FIV trattati per 6 gg con GM-CSF
Piccole quantità di LPS provocano aumento nel rolling, adesione e migrazione dei
neutrofili negli animali non infetti; in quelli infetti il reclutamento leucocitario è impedito
GM-CSF reverte completamente i difetti causati da FIV nella migrazione e nell’
adesione mediata da LPS
I neutrofili isolati da animali infetti sono incapaci di rispondere a chemoattraenti
batterici (fMLP) o endogeni (IL-8)
GM-CSF aumenta la migrazione dei neutrofili fino a > 50%
GUARIGIONE DELLE FERITE:
Stimola la migrazione e proliferazione delle cells endoteliali; promuove la crescita
dei cheratinociti
Studiati gli effetti del trattamento con GM-CSF in ulcere venose croniche.
Analisi immunoistochimiche con Ab vs α-SMA (marca i vasi)
aumento di densità dei vasi dopo trattamento con GM-CSF
Ibridazione in situ mostra marcato aumento di VEGF, prodotto da macrofagi e
miofibroblasti
TERAPIA ANTITUMORALE:
Vaccinati topi immunocompetenti con cellule di leucemia murina letalmente
irradiate, trasdotte con una forma transmembrana di GM-CSF, in modo da
esprimere tmGM-CSF sulla superficie
Il 100% dei topi
BALB/c vaccinati
sono protetti da
leucemia
REFERENCES
2) Hamilton JA et al., GM-CSF Biology, Growth Factors, 22:225, 2004;
3) Martinez-Moczygemba M. et al. Biology of common β receptor-signaling
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