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02/04/2014
Il contributo della
sperimentazione animale
allo sviluppo dei farmaci
Domenico Barone
I 50 anni di SSFA e la Ricerca in Italia
XIII Congresso Nazionale
Roma, 31 marzo – 1 aprile 2014
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Dall’antichità...
…all’età moderna…
...a quella contemporanea
Ippocrate di Cos (460-377 a. C.): Corpus Hippocraticum
Galeno di Pergamo (129-216 d. C.)
William Harvey (1578-1657)
Rudolf Magnus (1873-1927)
Henry Dale (1875-1968) – Nobel 1936
Harold Burne (1892-1981)
Jack Gaddum (1900-1965)
John Vane (1927-2004) – Nobel 1982
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William Harvey (1578-1657): fu il primo a scoprire e
descrivere la circolazione sistemica e le proprietà del
sangue, studiando il sistema CV di un serpente:
cuoreà cervello e corpo à cuore
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Rudolph Magnus: 1873-1927
• lavori su muscoli isolati
da intestino e vasi, in
bagni termostatati+O2
+nutrienti+sali+glucosio
• Studi sui riflessi coinvolti
nella postura
• Studi sulla tensione
muscolare
• Effetto sostanze su cuore,
vasi, polmoni e tratto
intestinale
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Henry Dale (1875- 1968): lavori con i bagni di
organi isolati e perfusi inventati da Magnus:
• Studi sulla trasmissione degli impulsi
nervosi attraverso i neurotrasmettitori
• Ergot e derivati rilasciano messaggeri
chimici: ACH, H, ADR
• Istamina (H) àanafilassi, allergia,
secrezione HCl
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Harold Burn (1892-1981):
Allievo di Henry Dale, maestro di John Vane
• Ideatore dei bioassay
• Perfusione attraverso i vasi del tessuto
• Scrisse trattati su organi isolati e perfusi:
- Methods of Biological assays (1928)
- Biological Standardization (1937)
- Functions of autonomic transmitters
(1956)
- The autonomic nervous system (1963)
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Jack Gaddum (1900-1965):
- Allievo di Henry Dale
Tecnica organo isolato
e «super-perfuso»:
- metodo più sensibile
- prolungata
sopravvivenza
dell’organo isolato
- applicò la valutazione
statistica ai dati
(bioassay insulina)
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John Vane (1927-2004):
- Allievo di Harold Burn
- bioassay
estremamente
sensibile con strip di
fondo di stomaco di
ratto (1957):
- 5-HT 1000x più
potente di triptamina
nel contrarre strip
stomaco di ratto
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John Vane:
cascata di 8 organi
super-perfusi
diversi tessuti da diversi
organi di diversi
animali
scoperta di TxA2,
PGE2, PGH2
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John Vane
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Anni ’40: antiistaminici per curare la febbre
da fieno (H1), ma non H2-antagonisti
Anni ’60: G. Hitchings e G. Helion:
- allopurinolo (antiuricemico) e
azatioprina (Imuran, trapianti)
- scoperta recettori H2 e
vari recettori 5-HT
Anni ’60/’70: David Jack:
5-HTà vasocostrizione vasi cerebrali
la cui vasodilatazione dà emicrania;
su strip di safena di cane trovò
sumatriptan agonista 5-HT
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Anni ’70: Schild, Black e Duncan:
H2-antagonisti: cimetidina
(tagamet) antiulcera
Anni ’80: ranitidina (ranidil), H2 antagonista
antiulcera
Hitchings, Helion, Black (Nobel 1988)
- beta-bloccanti
- H2-antagonisti
- antibatterici, antimalarici
- immunosoppressori, antiuricemici
(milioni di pazienti salvati)
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Ancora…peptidi…
• Anni ’50: sistema renina-angiotensina:
renina (rene)
ACE (polmone)
angiotensinogeno à Ag I à Ag II
(14 aa)
(10 aa)
(8aa)
(ag. press.)
• 1975 -’76: Ondetti, Rubin e Cushman
mutano un peptide inibitore di ACE in un
non-peptide inibitore di ACE: captopril
(antiipertensivo) à sartanici (antagonosti
recettoriali di Ag II)
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• 1933: Ulf von Euler (Nobel 1970) scopre
lipidi acidi ciclopentanoici: le prostaglandine (PG)
• Anni ’60: nasce e si sviluppa la farmacologia PG:
- shock anafilattico à istamina + altri mediatori (?)
- l’aspirina blocca lo shock
- NSAID bloccano la biosintesi PG (E2,F2a) agendo
su cascata acido arachidonico (anti stroke/infarto)
- scoperta tromboxano A2, aggregante piastrinico e
vasocostrittore
- estratti aortici sull’ arteria celiaca di coniglio
isolata e perfusa à una PG antiaggreg./ipotensiva:
la prostaciclina che però è instabile à iloprost
(1976)
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• Per oltre 100 anni amil nitrito e nitroglicerina sono stati
usati nell’angina pectoris
• ’70s: amil nitrito e nitroglicerina à NO àrilassamento
muscolatura vasale liscia à vasodilatazione
• 1980: Robert Furchgott (Nobel 1998):
1) NADR contrae strip di aorta di coniglio
2) ACH sulle cellule endoteliali à fattore ipotensivo
à rilassamento muscolatura liscia vasale
3) rimozione cellule endoteliali à miorilassamento
• 1987: questo fattore è il NO, molecola di segnale CV
• ’80s: metabolismo di L-arginina à NO à costante effetto
ipotensivo
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’70-’80: Studi di binding recettoriale in vitro/in vivo
- recettori + 3H-ligando +/- molecola in esame
- screening/QSAR studies
- recettogramma: profilo farmaco-tossicologico
- screening di migliaia di prodotti/anno/recettore
- risparmio di migliaia di roditori/anno
- studi di binding recettoriale in vivo
- fine ’80: HTS in Discovery su recettori clonati,
uso robot, informatica à decine di migliaia di
molecole testate su centinaia di recettori/anno
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• Protocolli NIH/NCI:
screening di nuovi antitumorali:
- in vitro su cellule tumorali umane e murine
- in vivo su roditori portatori di:
- trapianti di cellule tumorali murine:
P388, L1210, MMB16, LLC (tumori
singenici)
- xenotrapianti di cellule tumorali umane
in topi nudi e SCHID (immunodeficienti)
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15 /4 /2013: Paul Tesar & Robert Miller
• un fattore di trascrizione che riprogramma le cellule
espandibili progenitrici degli oligodendrociti mielogenici
à remielinizzazione della guaina mielinica persa in MS e
leucodistrofie
• finora oligodendrociti e loro progenitori erano ottenuti
solo da tessuti fetali (bioetica!...) o da cellule staminali
pluripotenti
• questi primi studi sono stati condotti in vitro, su cellule di
topo ed in vivo in topi ipomielinati
• il prossimo passaggio: trasferire in vivo questo processo di
riprogrammazione nell’animale (Tox, Safety, efficacia) per
poter passare all’uomo
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Questa rapida carrellata, che copre la storia della
moderna farmacologia, dimostra che solo grazie alla
sperimentazione animale, sono stati trovati, valutati e
sono entrati in terapia centinaia di farmaci salvavita:
antibiotici
antivirali (HIV, …)
antineoplastici
farmaci SNC (ansiolitici, antidepressivi, antipsicotici)
ipocolesterolemizzanti, ipoglicemizzanti
antiinfiammatori, analgesici, antipiretici, anestetici
immunosoppressori / immunomodulatori
proteine ormonali e farmacologiche ricombinanti:
insulina, GH, FSH, LH, HCG, IFN, fattori di crescita,
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citochine, McAb,…
• vaccini (rabbia, vaiolo, HAV, HBV, HPV, polio, varicella,
difterite, tetano, pertosse, morbillo, parotite, rosolia,
influenza)… HCV, HIV,
• nano(bio)tecnologie:
- drug delivery system
- nuove formulazioni
- diagnostica in vitro e in vivo
• medical device (pacemaker, protesi, stent, cateteri, ecc.)
• Molto resta ancora da fare…mancanza di modelli animali…
• …terapia genica e genica somatica
• …farmaci per patologie neurodegenerative
(MS, SLA, Alzheimer, Parkinson,…)
• malattie rare e malattie orfane (5-6000!)
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Sperimentazione animale non solo nella ricerca…
• La sperimentazione animale è stata determinante nella
Ricerca e messa a punto di nuovi farmaci
• è stata altrettanto importante nel determinare i successi
della Chirurgia
• Non meno rilevante è il ruolo della sperimentazione
animale nelle attività di R&S non clinico: tossicologia,
PK/PD, ADME, safety pharmacology, tollerabilità,
sviluppo formulativo e…
• Nel QC della produzione (bioassay) dei prodotti
biotecnologici (EU/US Pharmacopeia)
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Bilancio di un secolo di
sperimentazione animale…
• E’ innegabile che…
• ….solo grazie alla sperimentazione animale, in
questi 120 anni di storia della medicina, miliardi di
persone siano state curate e guarite e/o le loro
sofferenze siano state alleviate
• ….le terapie abbiano dato anni alla vita e vita agli
anni
• ….molto resta ancora da fare, ma le prospettive
sono assolutamente positive
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La sperimentazione animale in prospettiva
• Molto ci si aspetta ancora da:
- biologia molecolare e nanobiotecnologie
- farmacogenetica, farmacogenomica
- tracrittoma, proteoma, kinoma
- modelli in vitro scientificamente validati (!)
(HTS, meccanismi di azione) e modelli animali
di patologie umane
• La sinergia tra test in vitro e modelli in vivo porterà
nuove terapie più efficaci, sicure e selettive
• Le valutazioni di efficacia, safety, tossicità e PK/PD
non possono e non potranno esimersi dal ricorso alla
sperimentazione animale prima della R&S clinici
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La sperimentazione animale ha
posto le fondamenta delle terapie del
cancro, dei trapianti,
dell’immunodeficienza acquisita,
delle patologie infettive,
infiammmatorie, cardiovascolari,
nervose, autoimmuni, e dell’ictus….
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Impossibile v isualizzare l'immagine.
Camelus dromedarius
Camelus bactrianus
Camelidi: Lama glama, Vicugna pacos
• Nanobody omodimerici (IgG): 2.5 x 4 nm, 12-15 kD,
poco immunogenici à nanoimmunobiotecnologia
• Stabili, non tossici, resistenti al calore, affinità nM, selettivi
• Legano epitopi inaccessibili a Ab classici, enzimi, attraversano BBB,
legano Ag citoplasmatici degli astrociti, rapida clearance renale
• In terapia: Alzheimer (in Fase I); in oncologia (HER2, HGF):
89Zr-1E2-Alb8 e 6E10: PET imaging, efficacia nel topo con glioblast.
• Imaging quantitativa (PET, SPECT), diagnostica aterosclerosi in
uomo e topo (VICAM1), analisi radioimmunoguidata, imaging
cerebrale, radioimmunodiagnostica
• 2Rs15d non interferisce con trastuzumab e pertuzumab anti-HER2
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Microtus ochrogaster (arvicola della prateria): modello di studio
delle basi neurologiche, genetiche, evolutive e molecolari dei
legami/dei comportamenti sociali, del legame di coppia , di
scelta/predilezione del partner, monogamia e della cura biparentale.
Ox e Vp, interagendo con i rispettivi recettori, coordinano comportamenti premianti: accoppiamento, scelta selettiva del partner, elaborazione dei comportamenti sociali necessari al riconoscimento
individuale.
Accoppiamento à modifica stabile profilo espressione genica di Ox e
VPà forte legame monogamico
Tricostatina A (inibitore deacetilasi)
: è un fenomeno epigenetico
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Saguinus oedipus
(Cotton top tamarin)
(anche per studi di efficacia,
safe
safety e Tox con biotecnologici)
X
Studiato a fondo per varietà e l’elevato livello qualitativo dei
comportamenti sociali collaborativi e altruistici
21% affetto da colite à modello naturale per lo studio dell’insorgenza
e l’evoluzione dell’ adenocarcinoma del colon à ricerca e valutazione
di antitumorali
Modello animale validato per lo studio dell’infezione da EBV (HHV-4)à
neoplasie
Dose tumorigenica di EBV inoculata nel S. oedipus à linfomi
multifocali a grandi cellule, modello per studio di antitumorali e vaccini
contro EBV
Nel S. oedipus la vaccinazione contro l’antigene virale gp340/220 non
induce immunità, ma rende l’animale capace di controllare l’infezione
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da EBV che resta latente
Chrysemis picta
bellii
Ha un antenato ancestrale in comune con l’uomo
Ibernazione: 3-4 mesi in assoluta anossia a -10 ÷ -15 °C (nel ghiaccio)
Risposte adattative:
- depressione coordinata metabolismo cellulare e pompe ioniche
- sangue senza nuclei di condensazione, adattamento cuore e SNC
- carapace e scheletro: uptake di a. lattico e tampone pH sangue
Deposizione delle uova e sesso dei neonati in funzione della °T amb.
Modello animale ideale senza alternative per:
- lo studio dei meccanismi naturali che proteggono cuore e SNC
dai danni dell’ipossia
- studi evoluzionistici, di genetica dell’evoluzione, di genomica,
di biologia evolutiva dello sviluppo, di ecologia dello sviluppo 28
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Grazie per l’attenzione!
[email protected]
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