6_Manipolazione genetica cellule animali

TRASFERIMENTO GENICO
IN CELLULE ANIMALI
Perché manipolare geneticamente le
cellule animali
• Per lo studio funzionale di geni e proteine tipici degli
organismi animali
• Per la produzione di proteine con modificazioni posttraduzionali che i batteri e i lieviti non sono in grado di
effettuare
• Per applicazioni in terapia genica
• Per la produzione di animali transgenici
Cellule animali in coltura
‰ Cellule primarie: derivano direttamente da tessuti
espiantati da un organismo e sono in grado di dividersi da 10
fino a 50 volte prima di andare incontro a fenomeni di
senescenza e morte. Sono caratterizzate da inibizione da
contatto e dipendenza dall’ancoraggio
‰ Cellule immortalizzate: possono crescere in maniera
indefinita in coltura se vengono diluite e nutrite in maniera
appropriata
‰ Cellule trasformate: crescono in maniera indefinita, in
pluristrato, spesso non richiedono la presenza di fattori di
crescita serici, possono proliferare in sospensione e, se
iniettate in animali da laboratorio, possono dare origine a
tumori
Mezzi di crescita per cellule di mammifero
Le cellule animali sono molto più difficili da far crescere in
coltura dei microorganismi perchè necessitano di molte più
sostanze nutritive e crescono solo se attaccate a superfici
rivestite in maniera appropriata. Un tipico mezzo di coltura
per cellule di mammifero contiene:
• Amminoacidi
• Glucosio
• Vitamine: Biotina, Colina, Folato, Riboflavina, ecc.
• Sali: NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2
• Antibiotici: Pennicilina, Streptomicina
• Siero: 5-10% del volume totale (spesso siero bovino
fetale, più ricco di fattori di crescita)
• Fattori di crescita: diversi da quelli presenti nel siero
Terminologia
Introduzione di DNA in:
o Batteri
o Eucarioti
o Virus -mediata
trasformazione
trasfezione
trasduzione/infezione
Tecniche di trasferimento genico
in cellule eucariotiche
™ Trasferimento diretto (microiniezione)
™ Trasfezione (metodi chimici e fisici)
™ Trasduzione (virus)
Trasfezione
transiente
Trasfezione
stabile
Trasfezione transiente
Se il DNA esogeno trasfettato all’interno della cellula non viene integrato nel genoma
della cellula ospite e non contiene un’origine di replicazione per cellule animali, la
cellula sarà in grado di mantenere il DNA esogeno solo per un periodo di tempo
limitato, prima di degradarlo o di perderlo durante le divisioni cellulari
Efficieza di trasfezione transiente: molto alta
Metodologia semplice, utile per esperimenti di breve tempo con cellule in coltura
Trasfezione stabile
Il DNA esogeno trasfettato all’interno della cellula viene mantenuto in maniera stabile
e propagato alle cellule figlie. La trasfezione stabile può essere ottenuta in due modi:
• Introduzione del DNA esogeno in vettori contenenti repliconi
• Integrazione del DNA esogeno nel genoma della cellula ospite
L’ efficieza dell’integrazione è molto bassa pertanto le cellule trasfettate stabilmente
vanno selezionate
Tecnica idonea per esperimenti a lungo termine
Iniezione diretta
• Efficienza del 100%
• Numero limitato di cellule da trasfettare per ogni singolo
esperimento
• Utilizzata per cellule grandi (es.: ovociti di Xenopus) e per
generare animali transgenici
• Trasfezione stabile
Metodi di Trasfezione
Metodo basato sulla precipitazione: CaPO4, DEAE-destrano
Sostanze Lipofiliche (neutre e cationiche)
Meccanici: Elettroporazione e Gene-gun
Coprecipitazione con
calcio fosfato
CARATTERISTICHE DEL METODO
• Bassa efficienza di trasfezione (~20%)
• Il DNA trasfettato spesso si integra nel
genoma (trasfezione stabile)
• Applicabile solo a cellule che crescono
in monostrato
I granuli di calcio fosfato associati al
DNA entrano nella cellula per endocitosi
e vengono poi trasportati al nucleo
Trasfezione con DEAE-destrano
Il Dietilamino-etil destrano è un carboidrato policationico,
idrosolubile, che favorisce l’interazione tra il DNA esogeno e
il macchinario endocitotico della cellula
CARATTERISTICHE DEL METODO
Trasfezione transiente
Funziona bene anche con quantità piccole di DNA
Liposomi
I liposomi sono vescicole fosfolipidiche di
origine sintetica. I lipidi possono essere
neutri o carichi positivamente
Il DNA entra nelle cellule in seguito alla
fusione delle vescicole con la membrana
plasmatica delle cellule da trasfettare
CARATTERISTICHE DELLA LIPOFEZIONE
Trasfezione sia stabile che transiente
Elevata efficienza di trasfezione
Metodo “delicato” utile quando si lavora con
frammenti di DNA di grandi dimensioni
Speranze di utilizzare tale metodologia per
la terapia genica. Sono in atto tentativi di
sviluppare liposomi cellulo-specifici
Elettroporazione
• Efficienze di trasfezione alta con molti tipi cellulari
• Facile da eseguire se si ha a disposizione
l’apparecchiatura idonea
• Trasfezione stabile
L’intesità e la durata dell’impulso
vanno stabiliti empiricamente in
base al tipo cellulare da trasfettare
cuvette
cuvette
0.4cm
Gene Gun
Microscopiche particelle di metallo vengono
ricoperte di DNA e poi sparate nelle cellule tramite
un gas ad alta pressione
CARATTERISTICHE DEL METODO
• Può essere utilizzato anche su interi organismi
• Utilizzato per la trasformazione delle piante
Marcatori selezionabili per le cellule animali
MARCATORI ENDOGENI: Tk, Ada, Aprt, Cad, Hprt
Cotrasformazione del DNA si interesse con un marcatore endogeno. I
marcatori endogeni sono geni coinvolti in vie metaboliche (in genere di
nucleotidi), pertanto si utilizza la capacità di complementare il difetto
nutrizionale di una certa linea cellulare per riconoscere le cellule
trasfettate. Lo svantaggio di tale metodo è che bisogna trasfettare
necessariamente linee cellulari mutate nel gene utilizzato come marcatore
di selezione.
MARCATORI DI SELEZIONE DOMINANTI: neo, hyg, pac, ble, gpt
Sono geni che conferiscono alle cellule trasfettate un fenotipo nuovo. Si
tratta di solito di geni di origine batterica i cui prodotti rendono la cellula
trasfettata resistente a determinati farmaci. La selezione va eseguita
crescendo le cellule in un terreno contenente la giusta concentrazione di
tali farmaci.
Sistemi di espressione utilizzati in cellule animali
Cotrasfezione
Vettori plasmidici non replicativi
Sono costrutti di espressione che permettono la trasfezione transiente poiché sono
privi di un’origine di replicazione attiva in cellule animali. Sono utili per l’analisi della
funzione di sequenze regolative e per la produzione di piccole quantità di proteina
ricombinante. Non richiedono la selezione delle cellule trasfettate.
Vettori plasmidici con repliconi virali
Repliconi di SV40 (espressione transiente)
Repliconi del virus del papilloma bovino (BPV) (espressione stabile)
Repliconi del virus di Epstein-Barr (EBV) (espressione stabile)
Vettori virali di trasduzione
Adenovirus
Virus adenoassociati (AAV)
Herpes virus
Retrovirus
Vettori plasmidici non replicativi
Promotori forti costitutivi in grado di guidare l’espressione del gene esogeno in molti
tipi cellulari: promotori virali derivati dai geni dei virus SV40, cytomegalovirus,
adenovirus e virus del sarcoma di Rous
Promotori inducibili: il sistema Tet
Promotori tessuto-specifici
Enhancers
Segnali di poliadenilazione
Segnali di terminazione della trascrizione
Segnali per la traduzione
Marcatori di selezione
Segnali di targeting
Vettore non replicativo. Il marcatore di
selezione è il gene neo (Tn5) trascritto sotto il
controllo della regione LTR del virus del
sarcoma di Rous
La biologia del virus SV40
SV40 è un virus tumorale di scimmia.
Infezione litica con produzione di migliaia di
particelle virali
Capside icosaedrico
Genoma : DNA circolare a doppio filamento
lungo 5243 bp
Trascritti precoci: T antigen grande e T
antigen piccolo
Trascritti tardivi: proteine del capside
Enhancer
Origine di replicazione
Vettori plasmidici contenenti repliconi: SV40
come sistema di espressione transiente
I geni virali possono essere sostituiti
da DNA esogeno e l’infezione va
eseguita con
1) virus helper
2) in cellule COS, cellule di scimmia
che contengono nel loro genoma la
regione codificante l’antigene T
grande
che forniscono in trans la proteina
antigene T grande necessaria per la
replicazione
Replicone di SV40
SV40 è utilizzato sia in esperimenti di
trasduzione sia come replicone come
sistema di espressione transiente per
la produzione di elevate quantità di
proteina ricombinante
Vettori plasmidici contenenti repliconi: BPV ed EBV
come vettori episomici per l’espressione stabile
Il genoma virale di questi virus viene mantenuto come replicone a
basso o medio numero di copie senza interferire con la crescita della
cellula ospite. I plasmidi che contengono le origini di replicazione
derivate da questi virus si comportano allo stesso modo e sono
pertanto ottimi vettori episomici che permettono un’espressione
stabile della proteina ricombinante senza l’integrazione del gene
esogeno nel genoma della cellula ospite
• Vettori derivati dal virus del papilloma bovino: 100-200 copie
per
cellula.
• Vettori derivati dal virus di Epstein-Barr: contengono due regioni del
genoma virale, oriP e il gene che codifica per una proteina
di
regolazione tran-attivante detta antigene nucleare 1 di Epstein-Barr
(EBNA 1). Permettono il clonaggio di frammenti di DNA di grandi
dimensioni. Utilizzati per la creazione di genoteche di cDNA episomici
per il clonaggio di espressione
Vettori virali di trasduzione
Importanti per il trasferimento genico in vivo in terapia genica
¾ Adenovirus
¾ Virus adenoassociati (AAV)
¾ Herpes virus
¾ Retrovirus
Competenti per la replicazione
o indipendenti dall’helper
Difettivi per la replicazione o
dipendenti dall’helper
Scelta del vettore virale
¾ Caratteristiche del virus
¾ Tipo di cellula ospite
¾ Dimensione del gene da trasferire
¾ Necessità di espressione stabile o transiente
Vettori adenovirali
36 kb
Il gene esogeno viene inserito nel genoma in sostituzione dei geni
precoci E1-E4 che vengono forniti in trans
Vantaggi
• Possibilità di trasfettare sia cellule in divisione che cellule quiescenti
• Raramente si integrano nel genoma della cellula ospite
• Alti livelli di espressione transiente
• Molto utilizzati in terapia genica per l’efficacia con cui entrano nelle
cellule in vivo
Svantaggi
• Espressione solo transiente
• Rischio di risposta infiammatoria in terapia genica
I Retrovirus
Nel capside è presente il genoma, costituito
da due molecole identiche di RNA di circa
10 kb, la trascrittasi inversa e l’integrasi.
Infezione: interazione con la cellula
bersaglio mediata dalle proteine virali
dell’involucro lipoproteico.
Nella cellula l’RNA viene convertito in DNA
a doppio filamento lineare che viene
integrato nel genoma della cellula ospite
dall’integrasi.
Dopo l’integrazione il genoma del virus
viene trascritto e le proteine virali vengono
prodotte. Si assemblano le particelle virali
che
fuoriescono
dalla
cellula
per
gemmazione senza provocare la morte
della cellula.
Il genoma dei retrovirus
Dopo l’integrazione
Prima dell’integrazione
Le LTR (Long Terminal Repeats) si formano in seguito all’integrazione del
genoma virale nella cellula ospite
Gag codifica per le proteine del capside
Pol codifica per la trascrittasi inversa e l’integrasi
Env codifica per le proteine di superficie dell’involucro lipoproteico
L’impacchettamento nel capside richiede la sequenza di impaccamento Ψ
Vettori retrovirali
I vettori retrovirali sono quasi sempre difettivi nella replicazione.
Gli unici elementi in cis richiesti per il processo replicativo e per
l’impaccamento sono:
ƒ le LTR, necessarie per l’integrazione, la trascrizione e la
poliadenilazione dell’RNA
ƒ la sequenza di impaccamento Ψ
ƒ i siti di legame per i primer necessari per la replicazione del virus
Il vettore virale contenente queste tre sequenze, il gene esogeno e il
marcatore di selezione viene trasfettato in una linea cellulare che
fornisce le in trans la trascrittasi inversa e le altre proteine strutturali.
I virus così prodotti vengono utilizzati per infettare le cellule bersaglio
dove il genoma virale ricombinante si integrarà e gene esogeno potrà
essere espresso.
Caratteristiche dei vettori retrovirali
• Si integrano nel genoma della cellula ospite
• Non uccidono la cellula infettata
• Presenza di promotori forti
• Piccolo genoma facile da manipolare
• Ampio spettro d’ospite (solo cellule proliferanti)