LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI NEGLI STAFILOCOCCHI

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LE MONOGRAFIE DI
DOCUMENTA
LA RESISTENZA
AGLI ANTIBIOTICI
NEGLI STAFILOCOCCHI
Esther Manso*
Pietro E. Varaldo**
*
**
Responsabile della Sezione di Microbiologia dell'U.O. Laboratorio di Analisi,
Dipartimento di Patologia. Azienda Ospedaliera "Umberto I°”, Ancona.
Direttore dell’Istituto di Microbiologia, Facoltà di Medicina
e Chirurgia, Università degli Studi di Ancona.
Monografie di Documenta pubblicate:
• F. Mandler: Microbiologia dello Sputo e delle Vie Aeree
Inferiori (1988)
• R. Bisicchia: Microbiologia delle Gastroenteriti
Batteriche e Virali (1990)
• Autori Vari: Atti del Convegno - Nuove Metodiche
Analitiche per l’Esame Microbiologico degli Alimenti.
Milano, 5 luglio 1990
• E.M. Magliano, P. Clerici: Esame Microbiologico delle
Infezioni Cervico-Vaginali (1992)
• E. Gulletta: Microbiologia Clinica dell’Apparato
Oculare (1992)
• G. Sbaraglia: Microbiologia Clinica delle Febbri di Origine
Ignota (1993)
• P. Martelossi, L. Riul, G.A. Botta: Aspetti Selezionati
di Microbiologia Clinica del Cavo Orale (1994)
• G. Giocoli, E. Manso: Infezioni Batteriche e Micotiche
della Cute (1995)
• F. Mandler, S. Frugoni, D. Stangalini: Microbiologia
delle Infezioni delle Vie Aeree Inferiori.
Sviluppi innovativi; II edizione (1996).
• D. Crotti: Aspetti Attuali nella Diagnosi
delle Infezioni Intestinali. La Coprocoltura in Chiave
Moderna (1997).
• F. Mandler, P. Casella: Orecchio-Naso-Gola, argomenti
selezionati di microbiologia clinica (1998)
• G. Miragliotta: Le infezioni da catetere vascolare (1999)
DOCUMENTA
Programma di Documentazione Scientifica
Edizioni Scientifiche
Mascia Brunelli, Biolife
Indice
INTRODUZIONE
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ß-LATTAMICI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
PENICILLINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
METICILLINA ED OXACILLINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Epidemiologia della meticillino resistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Il gene mecA, la PBP2a e il meccanismo della meticillino resistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Origine e diffusione dei ceppi MRSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
MRSA in comunità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Eteroresistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Resistenza borderline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Fattori che influenzano il fenotipo di resistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Test di laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Metodiche NCCLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Etest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Sistemi automatici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Determinazione delle PBP2a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Metodiche molecolari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Screening dei ceppi MRSA direttamente da campioni clinici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Conclusione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
GLICOPEPTIDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Meccanismo d’azione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Resistenza ai glicopeptidi in S.aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Epidemiologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Meccanismi di resistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Resistenza alla vancomicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Resistenza alla teicoplanina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Morfologia dei VISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Test di laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Metodiche NCCLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Metodi automatici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Metodi di riferimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Etest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Programmi e strategie di comportamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Algoritmo per l’identificazione dei ceppi VISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Metodi molecolari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Prevenzione e controllo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Approccio terapeutico alle infezioni da VISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Resistenza ai glicopeptidi negli stafilococchi coagulasi negativi (CNS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Meccanismo di resistenza nei CNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Test di laboratorio per i CNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
AMINOGLICOSIDI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Meccanismi di resistenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Test di laboratorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
TETRACICLINE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
MACROLIDI, LINCOSAMIDI E STREPTOGRAMINE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
Epidemiologia molecolare della resistenza MLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
FLUOROCHINOLONI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
CO-TRIMOSSAZOLO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
OXAZOLIDINONI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
RIFAMPICINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
FOSFOMICINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
ACIDO FUSIDICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
MUPIROCINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
BIBLIOGRAFIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
APPENDICE FOTOGRAFICA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . »
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55
.
BIANCA
5
INTRODUZIONE
Staphylococcus aureus continua ad essere una delle più importanti cause di infezioni
ospedaliere e comunitarie in tutto il mondo (116). Circa il 20% delle batteriemie comunitarie
e ospedaliere negli USA sono causate da S. aureus e all’incirca altrettante sono causate dagli
stafilococchi coagulasi-negativi (CNS). Nello studio SENTRY condotto nell’arco di tre anni
(1997-1999) in diverse parti del mondo, S. aureus è stato la principale causa di infezioni respiratorie (20,3%- 25,5%), batteriemie (18,6%-25,3%), e infezioni della cute e dei tessuti
molli (31,9%-46,8%) (45). L’emergenza di resistenza ad alti livelli alla penicillina seguita
dalla diffusione di ceppi resistenti alle penicilline penicillinasi-resistenti (con capostipite la
meticillina), ai macrolidi, alle tetracicline, agli aminoglicosidi, e recentemente ai glicopeptidi
ha trasformato la terapia delle infezioni stafilococciche in una sfida globale.
6
E. MANSO - P. E. VARALDO
ß-LATTAMICI
Tutti i ceppi di S. aureus producono 4 principali proteine di membrana capaci di legare la
penicillina ed altri ß-lattamici (penicillin-binding proteins, PBP). Le PBP 1, 2, 3 e 4 hanno rispettivamente pesi molecolari di circa 85, 81, 75 e 45 kDa. Le PBP hanno spesso un’attività
simile a quella delle proteasi a serine, enzimi cioè capaci di catalizzare le reazioni di transpeptidazione che portano alla formazione del legame crociato nel peptidoglicano della parete
cellulare batterica. Gli antibiotici ß-lattamici sono substrati analoghi che si legano covalentemente ai siti attivi a serina delle PBP, inattivando l’enzima a concentrazioni che sono grosso
modo paragonabili alle concentrazioni minime inibenti (MIC). Le PBP 1, 2 e 3, che hanno
un’elevata affinità per la maggior parte degli antibiotici ß-lattamici, sono essenziali per lo sviluppo della cellula e per la sopravvivenza dei ceppi sensibili, e il legame dei ß-lattamici a
queste PBP può essere letale per la cellula batterica.
PENICILLINA
Il tasso di mortalità per batteriemie da S. aureus nel Boston City Hospital, che era
dell’82% nel 1941, fu drasticamente ridotto con l’introduzione della penicillina nei primi anni
’40. Tuttavia, già fin dal 1943, poco dopo l’introduzione dell’antibiotico, comparvero alcuni
ceppi di S. aureus che avevano sviluppato una resistenza alla penicillina e che si diffusero rapidamente. La resistenza, mediata da plasmidi, era dovuta alla produzione di penicillinasi, una ß-lattamasi capace di degradare il farmaco, prima che questo potesse raggiungere il bersaglio. I ceppi produttori di penicillinasi erano universalmente presenti negli ospedali nei primi
anni ’50, ma la maggior parte dei ceppi di S. aureus comunitari isolati sembravano essere
sensibili. La penicillina continuò quindi ad essere utilizzata come antibiotico anti-stafilococcico fino ai primi anni ’70. Nel 1969, Jessen e coll. (90) a Copenhagen descrissero i risultati
dei test di sensibilità in 2.000 ceppi di S. aureus isolati dal sangue tra il 1957 e il 1966, segnalando che la prevalenza della penicillino-resistenza era elevata non solo nelle infezioni ospedaliere (85-90%), ma anche in quelle acquisite in comunità (65-70%). Negli anni ’70 la prevalenza nel mondo dei ceppi di S. aureus penicillino-resistenti era tra il 70% e l’85%
(68,82,156). Nel decennio seguente, furono descritti ceppi di S. aureus con resistenze multiple alla tetraciclina, al cloramfenicolo, all’eritromicina e ad altri antibiotici. Attualmente, non
più del 5% degli isolati di S. aureus sono sensibili alla penicillina. Insomma, la resistenza alla
penicillina, osservata poco dopo l’introduzione dell’antibiotico, impiegò circa 6 anni a raggiungere un’incidenza del 25% nei ceppi ospedalieri, e 15-20 anni per raggiugere la stessa incidenza nei ceppi isolati in comunità (Tabella 1).
Antibiotico
Anno di
introduzione
del farmaco
Anni per
osservare la
resistenza
Anni per arrivare al
25% di ceppi resistenti
in ospedale
Anni per arrivare al
25% di ceppi resistenti
in comunità
Penicillina
Meticillina
Vancomicina
1941
1961
1956
1-2
<1
40
6
25-30
?
15-20
40-50 (proiezione)
?
Tabella 1. - Tempi richiesti per arrivare a tassi di prevalenza della resistenza del 25% (32).
In laboratorio, la determinazione delle penicillinasi si esegue con il nitrocefin, una cefalosporina cromogena che vira dal giallo al porpora in presenza di ß-lattamasi, indicando in tal
modo la resistenza del ceppo alla penicillina. Con il metodo della diffusione in agar da dischetto, i ceppi resistenti alla penicillina presentano un alone di inibizione con un diametro
≤28 mm (138). I ceppi resistenti alla penicillina sono anche resistenti ad ampicillina, amoxicillina, carbenicillina, azlocillina, mezlocillina, ticarcillina e piperacillina. Un test positivo
7
per la penicillinasi predice quindi anche la resistenza a questi antibiotici. I ceppi penicillinoresistenti (purché meticillino-sensibili) sono invece sensibili alle combinazioni di penicilline
con inibitori delle ß-lattamasi, ai cefemi e ai carbapenemici.
METICILLINA E OXACILLINA
La meticillina, la prima penicillina semisintetica resistente alle penicillinasi, fu introdotta nella pratica clinica nel 1959. La prima segnalazione di ceppi S. aureus resistenti alla meticillina (MRSA) risale a solo due anni più tardi, in Inghilterra (91). Ma la meticillino-resistenza rimase a lungo un fatto occasionale, segnalato qua e là in alcuni ospedali europei, ma
praticamente inesistente al di fuori dell’Europa. Solo verso la fine degli anni ’70 e l’inizio
degli anni ’80, col manifestarsi di gravi e soprattutto sempre più diffuse (anche geograficamente) epidemie nosocomiali da MRSA, l'emergenza del problema fu riconosciuta a livello
internazionale (197). L’epidemia è tuttora in corso, con dimensioni e incidenze preoccupanti
(anche se molto variabili da zona a zona, da ospedale a ospedale, da reparto a reparto), e riguarda ormai non solo gli stafilococchi aurei, ma anche gli stafilococchi coagulasi-negativi.
Si tratta di ceppi caratterizzati generalmente da multiresistenze che limitano considerevolmente le opzioni terapeutiche. La multiresistenza, le limitazioni terapeutiche, e la prognosi
meno favorevole associate alle infezioni da ceppi meticillino-resistenti fanno sì che la determinazione della sensibilità o resistenza alla meticillina attenga in un certo senso prima ancora all'identificazione che alla valutazione di sensibilità di ogni stafilococco di isolamento clinico. Inizialmente i ceppi MRSA erano confinati nei grandi ospedali, e in particolare nei reparti con maggiore incidenza di ospiti compromessi e quindi con maggiore necessità di impiego di antibiotici (rianimazioni, ematologie), dove era possibile una situazione endemica
con trasmissione crociata fra i pazienti colonizzati e/o infetti. Attualmente invece i ceppi
MRSA sono isolati anche negli ospedali più piccoli, anche in pazienti ambulatoriali, e sono
diffusi perfino verso la comunità (32).
Epidemiologia della meticillino-resistenza
I dati del National Nosocomial Infectious Surveillance (NNIS) dei Centers for Disease
Control and Prevention (CDC) hanno rivelato che la frequenza di ceppi MRSA in USA è aumentata dal 2,4% nel 1975 al 29% nel 1991. Sempre negli USA, tra i pazienti ricoverati nei
reparti di rianimazione notificati ai CDC NNIS, la proporzione di infezioni nosocomiali da
MRSA superava il 50% nel 1999 (139). In alcuni ospedali si sono osservati ceppi MRSA con
una frequenza dell’80% (198).
I dati dallo studio europeo di point prevalence delle infezioni in rianimazione EPIC, condotto il 29 aprile 1992, indicano una elevata prevalenza delle infezioni da MRSA (60%),
non confermata però da studi successivi. Nello studio EPIC la mortalità tra i pazienti infetti
da ceppi di S. aureus meticillino-sensibili (MSSA) e da ceppi MRSA è stata rispettivamente
del 25% e del 32%, ma una differenza di mortalità significativa è stata osservata solo nelle
infezioni delle basse vie respiratorie (85).
Molte informazioni sull’epidemiologia e la prevalenza di MRSA ci vengono dal programma di studio SENTRY, condotto in diverse parti del mondo per periodi variabili fra il 1997 e
il 1999. In Asia e Sud-Africa (14) la prevalenza di MRSA è stata del 45%, con punte del
79,5% a Hong Kong, complessivamente superiore alla prevalenza riscontrata in diverse altre
aree geografiche: America latina (34,9%), Stati Uniti (34,2%), Europa (26,3%) e Canada
(5,7%) (45). In Europa, in particolare (57) la prevalenza di MRSA aumenta essenzialmente
da Nord a Sud, come indicato dai tassi di MRSA riscontrati nei 13 paesi coinvolti: Svizzera
(1,8%), Olanda (2%), Germania (4,9%), Austria (9,4%), Spagna (19,3%), Francia (21,4%),
Belgio (25,6%), Polonia (25,8%), Gran Bretagna (27,5%), Grecia (34,4%), Turchia (37,5%),
8
Italia (50,5%) e Portogallo (54,4%). Questo studio però non ha tenuto conto delle variazioni
locali, dato che in 8 dei 13 paesi riportati, i risultati provenivano da un unico ospedale. In relazione al reparto ospedaliero, la prevalenza delle infezioni stafilococciche sostenute da MRSA è stata del 38% nelle rianimazioni e del 22,6% nei reparti di medicina, contro l’1% nei
pazienti ambulatoriali e lo 0% nei pazienti del pronto soccorso. In relazione al tipo di infezione, la maggiore prevalenza di MRSA è stata osservata nelle polmoniti nosocomiali (34,4%),
seguite dalle infezioni del tratto urinario (28,3%), dalle batteriemie (23,8%) e dalle infezioni
di ferite e tessuti molli (22,4%). Sempre nello stesso studio europeo, l’87% dei ceppi MRSA
isolati erano multiresistenti (contro il 2% dei ceppi MSSA) e solo il 3% dei ceppi MRSA erano resistenti unicamente agli antibiotici ß-lattamici.
In Italia, i dati più recenti sulla resistenza di S. aureus provengono dallo studio sulle batteriemie coordinato dall’Istituto Superiore di Sanità: il progetto AR-ISS, che ha raccolto i dati
di 70 laboratori dal giugno 2001 al gennaio 2002. Su 540 ceppi di S. aureus esaminati, l’incidenza media di MRSA è stata del 42,8% (23).
La prevalenza della resistenza alla meticillina nei ceppi nosocomiali di stafilococchi coagulasi negativi, come Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus haemolyticus, è ancora più elevata che per S. aureus (88). Nella sorveglianza NNIS 1999 (139), il tasso di resistenza nei ceppi CNS isolati da pazienti ricoverati in rianimazione da gennaio a maggio dello stesso anno dimostrò un incremento dell’87% rispetto al tasso registrato nello stesso periodo di 5 anni prima.
Il gene mecA, la PBP2A ed il meccanismo della meticillino-resistenza
Il gene mecA, la cui espressione è generalmente regolata dai geni mecI e mecR1, è il determinante genetico centrale della meticillino-resistenza, che codifica la PBP2a, ossia quella
PBP a bassa affinità da cui dipende la resistenza stessa. La PBP2a è una proteina di 78 kDa
che nei ceppi meticillino-resistenti, proprio in virtù della sua bassa affinità per la maggior
parte dei ß-lattamici, non viene saturata (e quindi funzionalmente bloccata) da concentrazioni altrimenti letali di questi antibiotici, e in tali condizioni non solo continua a funzionare,
ma è in grado di vicariare anche le funzioni normalmente svolte dalle altre PBP ad elevata
affinità (funzionalmente bloccate) (71).
Il gene mecA (2,1 kb) è inserito in un blocco più ampio di DNA (fino a 60 kb), denominato staphylococcal chromosomal cassette (SCCmec), che è incorporato nel cromosoma di
S. aureus in un sito specifico (98). Come SCCmec si intende una nuova classe di elementi
mobili che, oltre ai geni mec e ai geni delle recombinasi responsabili della mobilità, contengono i determinanti di resistenza per i vari antibiotici non-ß-lattamici (74).
L'origine di mecA è sconosciuta, ma certamente non è originario di S. aureus. Nell’assemblaggio dei diversi elementi strutturali del gene sono stati probabilmente coinvolti diversi ospiti, soprattutto stafilococchi coagulasi-negativi (4). Uno stretto omologo di mecA è stato identificato come gene nativo di S. sciuri, una specie coagulasi-negativa animale, per altro solitamente sensibile alla meticillina e a tutti i ß-lattamici (206). Alcune sequenze di inserzione tipiche di certe varianti di mecA sono presenti in molte copie in S. haemolyticus, una specie coagulasi-negativa umana (6).
Origine e diffusione dei ceppi MRSA
L’emergenza e la disseminazione di MRSA rappresentano un esempio di ‘evoluzione
accelerata’, per cui questi batteri si sono rapidamente evoluti e propagati a livello planetario grazie alla pressione selettiva di grandi quantità di agenti antimicrobici (143). Il tempo
zero, in termini evolutivi, di questo processo evolutivo corrisponde al primo evento di acquisizione di mecA da parte di un ceppo MSSA.
Come già ricordato, il primo isolamento di MRSA fu segnalato nel 1961 in Inghilterra
(91). Che la meticillino-resistenza di S. aureus abbia un’origine clonale è noto già da quasi
9
10 anni (104). Più recentemente, attraverso una serie di studi coordinati dal gruppo di Alexander Tomasz e Herminia de Lencastre (39,143), 5 principali linee di discendenza clonale di MRSA sono state riconosciute essenzialmente grazie alla combinazione di tre tecniche di tipizzazione molecolare con diverse caratteristiche discriminative: anzitutto l’analisi
dei profili di macrorestrizione con SmaI mediante pulsed-field gel electrophoresis (PFGE);
l’analisi del polimorfismo del gene mecA; e l’analisi dei profili di inserzione del transposone Tn554. I 5 cloni di MRSA (denominati Iberico, Brasiliano, Ungherese, New York/Giappone, e Pediatrico a seconda della zona geografica dove furono inizialmente identificati o
di alcune loro particolari caratteristiche epidemiologiche) comprendono quasi il 70% di oltre 3.000 ceppi studiati, raccolti principalmente in Europa, USA e America Latina.
Mediante multilocus sequencing typing (MLST) si è dimostrato che questi 5 cloni pandemici di MRSA sono evoluti a partire da solo due background ancestrali geneticamente
distinti: uno risalente ai primissimi ceppi MRSA europei e anche a ceppi MSSA circolanti
in Danimarca verso la fine degli anni ’50, ed un altro, completamente diverso, che comprende ceppi MRSA originariamente isolati in USA, Giappone e tra i pazienti pediatrici di
diverse parti del mondo. I primi isolati MRSA europei, riconducibili al primo di questi due
background ancestrali, erano caratterizzati dall'appartenenza ad uno stesso gruppo fagico,
dalla resistenza a penicillina, streptomicina, tetraciclina (PST) e occasionalmente a eritromicina (PSTE), da una bassa MIC della meticillina (6-25 µg/ml), e da una espressione eterogenea della resistenza. Nel tempo, questi ceppi si sono evoluti fino all'attuale clone denominato Iberico, che ha acquisito ulteriori determinanti di resistenza (alcuni residenti su elementi mobili, come il plasmide pUB110 e il transposone Tn554) e risulta spesso resistente
ai più comuni antibiotici tranne il co-trimossazolo e i glicopeptidi. Anche i cloni Brasiliano
e Ungherese sarebbero derivati dal primo background. Dal secondo background sarebbero
invece derivati i cloni New York/Giappone e Pediatrico. I cloni Iberico, Ungherese e
NewYork/Giappone sono sensibili solo a co-trimossazolo e glicopeptidi. Il clone Brasiliano
è sensibile solo a spectinomicina e glicopeptidi. Il clone pediatrico è resistente solo a oxacillina, penicillina, gentamicina, e occasionalmente eritromicina.
In Italia, un primo studio su 53 ceppi MRSA isolati fra il 1993 e il 1995 in vari istituti
romani (124) rivelò la presenza di varianti del clone Iberico. In uno studio più recente e più
ampio su 204 ceppi MRSA isolati nel 1997 e 1998 a Roma, Napoli e Milano (125), sono
stati identificati 4 cloni principali, dei quali 2 ampiamente diffusi in Europa [il clone Iberico (18,6% ) e il clone Brasiliano (12,2%)] e 2 nuovi cloni [il clone Italia (44,1%), più variamente distribuito, e il clone Roma (15,6%), osservato solo a Roma]. Il 69% dei ceppi del
clone Italia erano sensibili a rifampicina, tetraciclina, co-trimossazolo e cloramfenicolo; il
78% dei ceppi del clone Roma erano sensibili a eritromicina, clindamicina, co-trimossazolo
e cloramfenicolo. Tutti i cloni erano sensibili a vancomicina e teicoplanina.
MRSA in comunità
Di notevole importanza sono le sempre più frequenti segnalazioni di infezioni acquisite in
comunità causate da MRSA. In questi casi, un’accurata indagine generalmente rivela una storia
di recente ospedalizzazione, o di contatto diretto con persone che sono state ospedalizzate, o altri
fattori di rischio come una precedente terapia antibiotica, tossicodipendenza, ecc. (24,32). Ma ci
sono casi recentemente descritti di infezioni da MRSA la cui possibile origine è strettamente comunitaria. Questi ceppi comunitari mostrano una tendenza ad essere resistenti unicamente ai ßlattamici, risultando generalmente sensibili alle altre classi di antibiotici (94).
L’origine dei ceppi MRSA comunitari è attualmente oggetto di discussione (32). È possibile
che si tratti di discendenti selvaggi di ceppi ospedalieri. In tal caso, però, questi ceppi devono aver subito cambiamenti considerevoli poiché mostrano pattern di PFGE diversi dai ceppi ospedalieri e hanno perso la multiresistenza agli antibiotici. Un’altra possibilità è che gli isolati comunitari abbiano avuto origine in seguito ad un trasferimento orizzontale del determinante della meticillino-resistenza in un ceppo originariamente sensibile. Questa eventualità potrebbe spiegare i
10
particolari pattern di PFGE e l’assenza di multiresistenza. D’altronde, è molto probabile che, in
precedenza, tanto una disseminazione di ceppi dall’ospedale quanto un trasferimento orizzontale
del gene della penicillinasi a ceppi comunitari sensibili abbiano ambedue contribuito all’emergenza della penicillino-resistenza stafilococcica nella comunità. Ma la penicillinasi è a codificazione plasmidica è può essere facilmente trasferita per trasduzione o coniugazione. I geni mec
della meticillino-resistenza sono invece cromosomici. Il trasferimento orizzontale dei geni mec è
raro, e solo pochi ceppi ancestrali sono all’origine di tutti i ceppi di MRSA circolanti nel mondo
(infinitamente maggiore è invece la varietà di distinti cloni di MSSA). Tuttavia, aumentando la
prevalenza di ceppi MRSA aumenta anche l’abbondanza di mec DNA, e quindi anche la possibilità (ancorché sempre remota) che il trasferimento orizzontale dei geni mec possa verificarsi.
Per contro, è stato del tutto recentemente osservato che ceppi MRSA epidemici possono perdere il gene mecA, diventando MSSA, pur conservando la resistenza ad altri antibiotici non ß-lattamici (48).
Eteroresistenza
L’eteroresistenza, o resistenza eterogenea alla meticillina, significa che solo una parte
(spesso molto piccola) della popolazione batterica esprime effettivamente la resistenza. L’eteroresistenza era più frequente in passato, nei ceppi isolati nei primi tempi della diffusione di
MRSA. Progressivamente il fenotipo eteroresistente di MRSA è stato in parte rimpiazzato dal
fenotipo omoresistente, caratterizzato dall’espressione della meticillino-resistenza da parte di
tutta la popolazione batterica.
Nei ceppi eteroresistenti, l’espressione della meticillino-resistenza può interessare una sola cellula batterica su 106-109 cellule. In questi casi, la maggior parte delle cellule sono sensibili a basse concentrazioni dell’antibiotico ß-lattamico, p. es. a concentrazioni di meticillina
di 1-5 µg/ml, mentre solo una piccola proporzione di cellule, p. es. 1 x 10-6, crescono a concentrazioni di 50 µg/ml o più di meticillina. Buona parte dei ceppi clinici mostrano questo
pattern eterogeneo di resistenza nelle condizioni di coltura abituali. I ceppi eterogenei possono tuttavia apparire omogenei (p. es l’1% delle cellule o più crescono in 50 µg/ml di meticillina) in certe condizioni di coltura capaci di favorire selettivamente la sottopopolazione più resistente, come in terreni di coltura ipertonici, addizionati con NaCl o saccarosio, o quando
siano incubati a 30°C (159). Il passaggio di un ceppo eterogeneo in terreni contenenti una
concentrazione subinibente di un antibiotico ß-lattamico può alterare il fenotipo di resistenza,
selezionando cloni altamente resistenti che costituiscono inizialmente una popolazione pressoché omogenea. Questa caratteristica tende però ad essere instabile , e attraverso passaggi ripetuti in terreni senza antibiotico la proporzione di cellule con elevata resistenza diminuisce
gradualmente e riemerge il pattern eterogeneo originale.
Resistenza borderline
Un diverso tipo di resistenza alla meticillina è manifestato dai ceppi di S. aureus denominati borderline, nei quali le MIC della meticillina (2-8 µg/ml) e delle altre penicilline antistafilococciche penicillinasi-resistenti (PRP) denotano, se non una resistenza vera e propria, una ridotta sensibilità. Secondo i primi studi al riguardo (126), la ridotta sensibilità alle PRP di tali
ceppi era da attribuirsi alla produzione di elevate quantità di ß-lattamasi che, se iperprodotta,
riusciva in qualche modo a idrolizzare queste penicilline normalmente resistenti alla penicillinasi stafilococcica. Altre caratteristiche tipicamente associate ai ceppi borderline erano il viraggio alla completa sensibilità alle PRP in presenza di inibitori delle ß-lattamasi e l’assenza di
fenomeni di eteroresistenza e di multiresistenza. Fu poi dimostrato che l'espressione del fenotipo borderline è omogenea (cioè tutta la popolazione presenta lo stesso basso livello di resistenza) (31, 22) e che i ceppi borderline, a differenza degli MRSA, non producono la PBP2a
(7, 22) né contengono nel loro cromosoma il determinante genetico mecA (33,133,189).
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In seguito, però, fu chiarito che i fattori alla base della ridotta sensibilità alle PRP dei ceppi borderline di S. aureus sono più complessi di come apparivano all'inizio, e che fra i ceppi
con resistenza intermedia alle PRP ve ne sono alcuni con livelli di sensibilità simili ma non
necessariamente con lo stesso meccanismo di resistenza. Tre diversi meccanismi sono stati finora proposti per spiegare la resistenza borderline non mediata da mecA: (i) modificazioni
delle PBP “normali” (diverse cioè dalla PBP2a) (179), (ii) iperproduzione della penicillinasi
stafilococcica (126), e (iii) produzione di una seconda ß-lattamasi (meticillinasi) in aggiunta
alla penicillinasi (122,123,131). Tuttavia, mentre può essere plausibile il ruolo delle PBP modificate nel determinare la resistenza borderline, resta invece controverso il ruolo dell’iperproduzione di penicillinasi (10,31,131,188): infatti, se per un verso i ceppi borderline mecAnegativi dimostrano livelli di attività ß-lattamasica in genere effettivamente elevati e diventano sensibili alla meticillina dopo l’aggiunta di clavulanato, per contro la sola iperproduzione
di ß-lattamasi non sembra sufficiente a spiegare il fenotipo borderline. Come meticillinasi si
intende una nuova ß-lattamasi (assente nei ceppi di S. aureus meticillino-sensibili e prodotta
dai ceppi borderline in aggiunta alla penicillinasi classica) capace di idrolizzare la meticillina
e le altre PRP (122,123). Questa scoperta ha suggerito che proprio questa meticillinasi, piuttosto che la penicillinasi iperprodotta, sia responsabile del fenotipo borderline, e che l'elevata
attività ß-lattamasica che pure spesso si osserva nei ceppi borderline possa se mai riflettere
l’azione combinata delle due ß-lattamasi (penicillinasi e meticillinasi) piuttosto che l’iperproduzione della sola penicillinasi (131,188).
I ceppi borderline hanno poi altre caratteristiche in comune: (i) la presenza di un plasmide
di 17,2 kb (oggi completamente sequenziato nel nostro laboratorio) che contiene il complesso
dei geni bla (blaZ, blaI, blaR1) necessari per l’espressione della penicillinasi stafilococcica, i
geni cadD e cadX recentemente associati a un nuovo tipo di resistenza al cadmio, e potrebbe
altresì contenere il gene della meticillinasi (11,121,123,131); (ii) l’appartenenza al gruppo fagico 94/96 (10,99,123,128,190, 211); e (iii) un particolare ribotipo determinato analizzando
la regione interna tra i geni per gli rRNA 16S e 23S (190).
Sebbene spesso sottostimati a livello diagnostico, i ceppi borderline sono relativamente
frequenti a livello clinico (188), soprattutto come agenti di infezioni nosocomiali
(99,128,188,211). In un recente studio è stata rilevata la presenza di ceppi borderline in pazienti sottoposti a profilassi con ß-lattamici (99).
Fattori che influenzano il fenotipo di resistenza
L’espressione della meticillino-resistenza può dipendere ed essere influenzata da numerosi fattori (16,31).
Anzitutto, mecA (gene strutturale della PBP2a) è di norma regolato dai geni mecI (repressione) e mecR1 (induzione). I geni mec e la loro organizzazione ricordano molto da vicino i
geni bla, coi quali hanno anche un buon grado di omologia: blaZ (gene strutturale della penicillinasi stafilococcica), blaI (repressione) e blaR1 (induzione).
Sia pur raramente, sono stato osservati ceppi di S. aureus mecA-positivi che sono fenotipicamente sensibili all’oxacillina. In questi ceppi, noti come pre-MRSA, l’espressione della
meticillino-resistenza è repressa da mecI e non può essere indotta dalla presenza di un ß-lattamico. Tuttavia, una mutazione puntiforme nel gene mecI o nella regione promoter mec, o una
delezione di mecI provocano un aumento fino ad una elevata frequenza di cellule resistenti;
ma non è questo l’unico meccanismo per superare la repressione della resistenza (196). I ceppi di S. aureus mecA-positivi isolati in campioni clinici che presentano resistenza all’oxacillina hanno quindi superato la repressione mediata da mecI. Ceppi mecA-positivi ma fenotipicamente suscettibili all’oxacillina esistono anche fra i CNS (pre-MRCNS) e sono più frequenti
dei pre-MRSA. Nei ceppi di S. epidermidis pre-meticillino-resistenti, però, non è stata osservata nessuna mutazione in mecI o nelle regioni promoter mec. Pertanto, la regolazione della
resistenza alla meticillina nei CNS meticillino-resistenti sembra essere diversa da quella dei
ceppi MRSA.
12
Altri geni cromosomici diversi dai geni mec sono necessari per l’espressione completa
della meticillino-resistenza: i geni fem (factor essential for methicillin resistance) e i geni aux
(auxiliary). Di geni fem (presenti tanto nei ceppi sensibili quanto nei resistenti), ne sono stati
caratterizzati 6 tipi: femA, femB, femC, femD, femE e fem F. I mutanti fem (tranne che per femE) hanno una composizione alterata del peptidoglicano. Gli operoni femAB codificano due
proteine citoplasmatiche di 49 kDa (FemA e FemB) strettamente legate, che sono necessarie
per la sintesi della parete (soprattutto dei ponti crociati) e hanno un ruolo nella formazione
del setto e nella separazione cellulare. Mutazioni a livello sia di femA che di femB riducono il
livello di meticillino-resitenza. Si è pensato a femA e femB come potenziali nuovi bersagli di
nuovi antibiotici antistafilococcici, che agendo su tali proteine potrebbero ripristinare l'efficacia dei ß-lattamici contro i ceppi meticillino-resistenti.
Altri loci cromosomici che influenzano il fenotipo di resistenza sono llm, agr e sar. L’inattivazione del llm, che codifica una proteina idrofoba di 38 kDa la cui funzione è sconosciuta, conferisce ad una cellula, con resistenza omogenea, un pattern di resistenza eterogenea. Il locus agr (accesory gene regulator) ed il locus sar (staphylococcal accessory regulator) sono coinvolti nel controllo dell’espressione di diversi fattori di virulenza e di esoproteine. L’inattivazione di uno dei due loci in un ceppo eterogeneo comporta un leggero decremento nel numero di cellule altamente resistenti, anche se non influenza il livello di resistenza espresso da queste cellule.
Le ß-lattamasi plasmidiche stafilococciche possono influenzare la resistenza in diversi
modi. Possono impedire la delezione spontanea di mec dal cromosoma, che produrrebbe un
fenotipo sensibile. L’introduzione di una ß-lattamasi plasmidica in un ceppo con resistenza omogenea può indurre un pattern di resistenza eterogeneo.
Il rapporto fra resistenza eterogenea e resistenza omogenea nei ceppi selvaggi non ha ancora trovato una chiara e soddisfacente spiegazione. I ceppi clinici eterogenei non sembrano
deficienti in nessuno dei fattori finora conosciuti. La loro parete cellulare è indistinguibile da
quella dei ceppi sensibili, come si dimostra mediante cromatografia liquida ad alta pressione.
I cloni omogenei stabili selezionati dopo un unico passaggio del ceppo eterogeneo in un antibiotico ß-lattamico mostrano mutazioni nei loci chiamati chr*, non-fem, non-mec, indicando
che la resistenza elevata può essere raggiunta per molte vie (158). L’introduzione di mecA
clonato da un ceppo eterogeneo in uno chr* o naturalmente omogeneo nel quale il gene mecA
residente è stato inattivato riproduce il fenotipo omogeneo. Anche se i fattori fem, aux ed altri
non sembrano spiegare la resistenza omogenea o eterogenea nei ceppi selvaggi, è stato proposto un modello della resistenza basato sulla conoscenza di questi fattori. I ceppi eterogenei
potrebbero essere deficienti in un fattore o mancare di una modificazione critica in un processo biochimico (forse collegato alla sintesi della parete) importante per le funzioni della
PBP2a che, in fondo, è una proteina estranea. I ceppi omogenei originerebbero quindi dai
ceppi eterogenei per la pressione selettiva degli antibiotici ß-lattamici che favorisce i mutanti
il cui background genetico permette una piena funzionalità della PBP2a.
Test di laboratorio
È molto importante che la determinazione della sensibilità o resistenza alla meticillina sia
molto accurata, anche perché dal suo esito dipende molto la terapia che sarà instaurata, e il
problema si collega evidentemente a quello dell’uso prudenziale dei glicopeptidi. Le infezioni
da stafilococchi meticillino-sensibili sono trattate preferibilmemente con antibiotici ß-lattamici per la loro maggiore attività intrinseca, la maggiore concentrazione nei tessuti, la bassa incidenza di effetti collaterali, la più rapida azione battericida e il minore costo. I ceppi meticillino-resistenti sono (e sono comunque da considerare) resistenti a tutti gli altri antibiotici ßlattamici, comprese le penicilline protette, cefemi e carbapenemici.
La determinazione fenotipica della meticillino-resistenza nei ceppi CNS, è difficile a causa della possibile eterogeneità della resistenza stessa. Inoltre, una piccola proporzione di ceppi MRSA che portano il gene mecA sono fenotipicamente sensibili alla meticillina. Le cellule
13
che esprimono eteroresistenza possono crescere più lentamente delle popolazioni sensibili, e
per questo motivo il National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) raccomanda l’incubazione a 35°C per 24 ore prima della lettura del test.
Metodiche NCCLS
L’NCCLS propone le procedure e i criteri di interpretazione per la diffusione in agar da
dischetto, la microdiluizione in brodo, la diluizione in agar, e l’oxacillin agar screen test
(136,137,138). La determinazione di laboratorio della sensibilità o resistenza alla meticillina
viene eseguita utilizzando non la meticillina, ma l’oxacillina, più stabile alla conservazione e
alla refrigerazione e più efficace nella determinazione dell’eteroresistenza (anche se alcuni
ceppi si studiano meglio con la meticillina, più stabile alle ß-lattamasi). Non va utilizzato il
dischetto di cloxacillina che dà risultati poco attendibili, così come poco attendibili possono
essere i risultati dei test di diffusione e di diluizione utilizzando altri ß-lattamici (cefalosporine, carbapenemici). Infatti, i ceppi meticillino-resistenti possono talora apparire sensibili ad
alcuni antibiotici ß-lattamici in vitro, ma dobbiamo considerare questa una falsa sensibilità,
poiché la produzione di PBP2a comporta una resistenza crociata per l’intera classe dei ß-lattamici. Come controllo di qualità si usa il ceppo S. aureus ATCC 25923. È da notare che i
criteri interpretativi per la meticillino-resistenza sia per i test di diluizione che per quelli di agar diffusione sono rimasti invariati per i ceppi di S. aureus, mentre sono stati aggiornati nel
1999 per i ceppi CNS (Tabella 2).
Per i test di diluizione (136), la microdiluizione in brodo utilizza come terreno il MuellerHinton brodo aggiustato cationicamente (CAMHB) con l’aggiunta del 2% di NaCl; l’inoculo
si esegue per sospensione diretta delle colonie ottenute dopo incubazione per 18-24 ore su agar sangue, aggiustando la sospensione ad una torbidità pari a 0,5 McFarland; l’incubazione è
di 24 ore a 35°C. La diluizione in agar si esegue con analoghi accorgimenti utilizzando come
terreno il Mueller-Hinton agar con l’aggiunta del 2% di NaCl. I criteri interpretativi sono riportati nella Tabella 2.
L’EUCAST (European Committee for Antimicrobial Susceptibilty Testing) della Società
Europea di Microbiologia Clinica e Malattie Infettive, invece, indica le seguenti condizioni
per la determinazione della meticillino/oxacillino resistenza negli stafilococchi mediante la
metodica di diluizione in agar: aggiunta del 2% di NaCl al terreno, incubazione a 30°C per 24
ore e continuazione dell’incubazione per altre 24 ore nei ceppi CNS (51).
Test di diluizione
Identificazione
Antibiotico
MIC (µg/ml)
Sensibile
S. aureus
Oxacillina
CNS
Oxacillina (attuale)
Oxacillina (precedente)
Resistente
≤2
≥4
≤ 0,25
≥ 0,5
≤2
≥4
Test di agar diffusione
Identificazione
Dischetto
Alone di inibizione (mm)
Sensibile
Intermedio
Resistente
11-12
≤10
S. aureus
Oxacillina (1 µg)
≥13
CNS
Oxacillina (1 µg) (attuale)
≥18
Oxacillina (1 µg) (precedente)
≥13
≤17
11-12
≤10
Tabella 2. - Breakpoint NCCLS per la definizione degli stafilococchi come meticillino-sensibili o meticillino-resistenti. Per i
CNS, i valori attuali sono in vigore dal 1999.
14
Per i test di diffusione (137), si utilizza un dischetto contenente 1 µg di oxacillina, come
terreno il Mueller-Hinton agar senza aggiunta di NaCl, e la lettura si esegue dopo 24 ore piene di incubazione a 35°C. Occorre esaminare contro luce l’eventuale presenza di colonie nell’alone di inibizione o la presenza di un doppio alone. L’inoculo (0,5 McFarland) va preparato mediante sospensione diretta in soluzione fisiologica di colonie di 18-24 ore coltivate in
terreno non selettivo. I criteri interpretativi sono riportati nella Tabella 2. In caso di risultato
“Intermedio” è necessario eseguire l’oxacillin agar screen test.
I ceppi oxacillino-resistenti presentano con frequenza una resistenza multipla ad altri
antibiotici come aminoglicosidi, clindamicina, macrolidi, cloramfenicolo, chinoloni, sulfamidici, tetracicline. L’osservazione di una multiresistenza può essere la chiave che indica
una meticillino-resistenza.
Le metodiche NCCLS, con gli attuali breakpoint per i ceppi CNS, sono metodi poco adatti a studiare la meticillino-resistenza in alcune specie di CNS. Il confronto dei nuovi
breakpoint con la determinazione del gene mecA mediante PCR dimostra una buona correlazione per i ceppi di S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, ma discrepanze cospicue
con ceppi di altre specie (p.es. S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. warneri), che non possiedono il gene mecA ma possono apparire resistenti con le metodiche NCCLS (83,84,115).
Il test di sensibilità non è raccomandato per i ceppi di S. saprophyticus, poiché il microrganismo, patogeno principalmente urinario, risponde bene alle concentrazioni di antibiotico
raggiunte nell’urina. Hussain e coll. (83) studiando 463 ceppi CNS appartendenti a 13 specie, hanno osservato una scarsa corrispondenza fra la meticillino-resistenza determinata ricercando il gene mecA mediante PCR e utilizzando il metodo di diluizione in agar: MIC di
oxacillina ≥0,5 µg/ml (resistenti) erano osservate in tutti i ceppi mecA-positivi, ma anche
nel 39,2% dei ceppi mecA-negativi; le discrepanze non riguardavano ceppi delle specie S.
epidermidis, S. haemolyticis, S. hominis, S. capitis subsp. capitis e S. schleiferi. In questo
studio, in base ai nuovi breakpoint e alla presenza del gene mecA, i CNS sono classificati
in quattro categorie: I, II, III e IV. La categoria I comprende S. epidermidis, S. haemolyticus e S. hominis. Più della metà dei ceppi di questa categoria erano mecA-positivi, ma con
differenze da specie a specie: 83,3% in S. haemolyticus, 61,9% in S. epidermidis (61,9%) e
51,8% in S. hominis. La MIC di tutti gli isolati mecA-positivi era ≥0,5 µg/ml e la MIC dei
mecA-negativi era ≤0,25 µg/ml. La categoria II comprende S. cohnii, S. saprophyticus e S.
warneri. I ceppi di questa categoria possiedono mecA ma in percentuale molto inferiore
della categoria precedente, tra il 9 e il 28,5%. La MIC di oxacillina per i ceppi mecA-positivi era regolarmente ≥0,5 µg/ml ma anche la MIC del 91,3% dei ceppi mecA-negativi era simile. La categoria III comprende S. lugdunensis e S. xylosus. Nessun ceppo di questa categoria possiede il gene mecA, ma i nuovi breakpoint dell’oxacillina classificavano tutti i
ceppi come resistenti. La categoria IV comprende S. capitis, S. schleiferi e S. simulans.
Questi microrganismi erano simili a quelli della categoria III in quanto non possedevano
mecA, ma erano correttamente classificati come oxacillino-sensibili con i nuovi breakpoints. Con gli attuali breakpoint, altri autori hanno riscontrato una errata valutazione come
meticillino-resistenti del 36% dei ceppi di S. hominis e del 50% dei ceppi di S. capitis mecA-negativi studiati (64). Per questi motivi, le più recenti disposizioni dell’NCCLS suggeriscono, in caso di infezioni gravi da CNS diversi da S. epidermidis, di eseguire la determinazione del mecA o della proteina codificata da mecA (la PBP2a) nei ceppi intermedi o resistenti. I ceppi che non possiedono mecA e non producono PBP2a devono essere considerati meticillino-sensibili, anche se apparentemente resistenti con i test di sensibilità.
L’oxacillin agar screen test è raccomandato per lo screening della meticillino-resistenza
in S. aureus. Il test impiega una piastra di Mueller-Hinton agar addizionato di oxacillina (6
µg/ml) e NaCl (4%), con inoculo di 0,5 McFarland da sospensione diretta della colonia, e lettura dopo incubazione a 35°C per 24 ore. La presenza anche di una sola colonia è indice di
resistenza. Il metodo di semina del terreno che dà migliori sensibilità e specificità è quello di
distribuire un’ansata di 1 µl in un’area di 10-15 mm di diametro (173). Non tutte le piastre di
oxacillin agar screen test in commercio hanno la stessa performance nel determinare i ceppi
MRSA eteroresistenti, sicché si raccomanda di usare come controllo positivo il ceppo S. au-
15
reus ATCC 43300 e di eseguire la lettura esaminando la piastra accuratamente con luce trasmessa. L’oxacillin agar screen test può essere utilizzato in aggiunta al metodo di routine in
uso nel laboratorio per saggiare la sensibilità o resistenza alla meticillina. Per S. aureus, la
sensibilità e la specificità del metodo sono risultate superiore al 98% (160,208). Il metodo
non è più raccomandato dall’NCCLS per i ceppi CNS, non essendo in grado di determinare la
meticillino-resistenza mecA mediata in questi ceppi (177).
La valutazione dei metodi di agar diffusione da dischetto, microdiluizione in brodo, e
oxacillin agar screen test rispetto alla determinazione del gene mecA, utilizzando 55 ceppi di
S. aureus “difficili”, ha dato risultati di sensibilità/specificità dei tre metodi di 100/89,
100/100 e 90/92, rispettivamente (174). In questo studio, 16 dei 36 ceppi mecA-negativi presentavano una MIC di oxacillina di 4 µg/ml col metodo di diluizione in brodo (quindi col 2%
di NaCl nel terreno), ma crescevano sul terreno dell’oxacillin agar screen test (quindi con 8
µg/ml di oxacillina e il 4% di NaCl nel terreno). Inoltre il ceppo di controllo S. aureus ATCC
43300 risultava erroneamente sensibile con l’oxacillin agar screen test.
Etest
L’Etest (AB Biodisk, Solna, Svezia) va eseguito in Mueller-Hinton agar con 2% di NaCl
con un inoculo, preparato mediante sospensione diretta della colonia, di 0,5-1 McFarland in
soluzione salina fisiologica, stemperato con un tampone sulla piastra o meglio per allagamento con rimozione del liquido con pipetta pasteur sterile. Si lascia asciugare la piastra per 15
minuti. Dopo incubazione a 35°C (per 24 ore per i ceppi di S. aureus e per 48 ore per i ceppi
CNS), il test va letto nel punto di inibizione completa includendo aloni leggeri o colonie isolate. Il range del ceppo di controllo S. aureus ATCC 43300 per l’oxacillina è compresso tra
16 e 64 µg/ml.
In S. aureus, l’Etest per oxacillina presenta una buona correlazione con la determinazione
di mecA mediante PCR, e viene considerato da alcuni autori il miglior indicatore della meticillino-resistenza (52). In uno studio multicentrico comparativo tra la nuova versione di VITEK 2 AES e l’Etest, la concordanza in 206 test eseguiti su ceppi di S. aureus per la meticillino-resistenza è stata del 98,1%, mentre le discordanze tra i due metodi, entro 2 diluizioni, erano superiori al 10% con ceppi MRSA distribuiti dalla bioMérieux (113).
Nei ceppi CNS, una valutazione dell’Etest risulta difficile, dato che la maggior parte degli
studi sono stati condotti prima che i criteri interpretativi dell’NCCLS per l’oxacillina fossero
modificati. La valutazione mediante Etest della meticillino-resistenza nei ceppi CNS in rapporto alla determinazione del gene mecA mediante PCR ha mostrato una sensibilità del 100%
e una specificità del 78%, se si escludono S. lugdunensis e S. saprophyticus (115). La ridotta
specificità può essere dovuta al fatto che la MIC di oxacillina per molti ceppi era di 0,38
µg/ml ed è stata interpretata, per uniformità con i valori di breakpoint dell’NCCLS, come di
0,5 µg/ml (resistente), anche se, mancando del gene mecA, potevano, di fatto, essere stati sensibili. In uno studio condotto su 45 ceppi CNS mecA positivi, la sensibilità del test è stata del
91% (9).
Sistemi automatici
Diversi studi hanno valutato la performance del sistema automatico Vitek (bioMérieux)
nella determinazione della resistenza all’oxacillina in S. aureus e CNS
(108,114,120,160,174,207,208). La valutazione della meticillino resistenza in S. aureus ha
mostrato una sensibilità tra il 95% con la card Vitek GPS-107 (174) (tra i ceppi erano inclusi
mecA-positivi eteroresistenti) ed il 100% con la card Vitek GPS-SV (89), mentre la specifictà
è compresa tra il 97% (174) ed il 100% (160). Nei ceppi CNS le card del Vitek GPS SV e GPS 107 hanno rilevato rispettivamente una sensibilità del 98% e del 100% e una specificità
del 97% e del 93% [escludendo i ceppi di S. saprophyticus e S. lugdunensis] (115). Uno stu-
16
dio condotto da Martinez e coll. (120) su 202 ceppi CNS utilizzando Vitek GPS 105 con versione software VTK-RO7-01 ha dato una sensibilità e una specificità (considerando solo S. epidermidis, S. haemolyticus e S. hominis) del 92,4 e 97,6%, rispettivamente. Per le altre specie di CNS, in particolare ceppi di S. capitis, S. cohnii, S. lugdunensis, S. saprophyticus e S.
sciuri, la correlazione tra la determinazione di mecA mediante PCR (costantemente assente) e
il Vitek è stata pari al 33%. In una recente valutazione multicentrica del sistema esperto del
VITEK 2 si è osservata una concordanza con il rilevamento genetico per la meticillino-resistenza del 99% in S. aureus e del 100% in S. epidermidis e S. warneri (113).
Con MicroscanTM (Dade Diagnostics, Brisbane, Australia), per quanto riguarda la sensibilità all’oxacillina in ceppi di S. aureus, è stata osservata una buona correlazione con la determinazione di mecA mediante PCR. La sensibilità e specificità dipendono dal tipo di pannelli,
convenzionali o rapidi, e dal tipo di ceppi studiati. La sensibilità con i panelli convenzionali
varia dal 74% (includendo ceppi con resistenza eterogenea) (174) al 100% (52), mentre la
specificità varia dal 93% (52) al 97% (174). Con i panelli rapidi la sensibilità è del 90% (174)
100% (52) mentre la specificità varia dall’86% (174) al 97% (46) .
Determinazione delle PBP2a
Nel 1998, Nakaomi e Sugiyama (135) svilupparono un test semplice per la determinazione del prodotto di mecA, la PBP2a. Il risultante test commerciale, l’MRSA-screen
(Denka-Seiken, Tokio, Giappone), è un test rapido di agglutinazione al lattice che utilizza
particelle di lattice sensibilizzate con un anticorpo monoclonale contro PBP2a. Il test è
stato ampliamente valutato e si è dimostrato sensibile e specifico per identificare la meticillino-resistenza non solo nei ceppi di S. aureus, per i quali era stato messo a punto, consentendo altresì di differenziare i ceppi MRSA dai borderline (114,160), ma anche nei
ceppi CNS (78,84,115,207). Il test MRSA-screen per la determinazione della meticillinoresistenza ha subito nel tempo alcuni aggiornamenti e perfezionamenti, passando così la
sensibilità da un valore iniziale di ≥97% al 100%. In alcuni casi, per evitare falsi negativi,
era necessario prolungare il tempo di agitazione del test da 3 a 10 minuti, oppure risaggiare dopo induzione del ceppo incubandolo in presenza di un dischetto di meticillina di 5 µg
per incrementare il livello di espressione della PBP2a (84), o impiegando un inoculo più
elevato (30-50 colonie). L’inoculo più elevato ha permesso di aumentare la sensibilità del
test al 100% senza dover ricorrere all’induzione, con conseguente allungamento del tempo
di risposta, senza però che il test perdesse in specificità (115). Tuttavia, bisogna diffidare
dei risultati del test positivi dopo 10 minuti, poiché alcuni ceppi oxacillino-sensibili possono dare una reazione positiva in seguito a un prolungato tempo di reazione (208). Inoltre, altri autori (78) ritengono necessario ripetere il test quando i risultati siano debolmente positivi, e interpretare un test concordante (positivo o debolmente positivo ritrovato nel
secondo test) come positivo. Il test è stato valutato dal CDC nel 2001 (174) con 55 ceppi
“difficili” di S. aureus: 19 ceppi mecA-positivi eteroresistenti con espressione classe 1 o 2
(MIC di oxacillina da 4 a >16 µg/ml) e 36 ceppi mecA-negativi. La sensibilità per i ceppi
mecA-positivi era del 90% con agitazione di solo 3 minuti e del 100% con agitazione di 15
minuti. Tutti i ceppi mecA-negativi risultavano negativi dopo agitazione sia di 3 minuti
che di 15 minuti. L’applicazione di questa metodica ai ceppi CNS sembra più azzardata,
anche dopo induzione. Dei 45 ceppi CNS mecA-positivi studiati solo 1 (2%) senza induzione e 36 (80%) dopo induzione sono risultati positivi: in questo studio la sensibilità del
test in 38 ceppi di S. aureus è stata solo dell’89%. (9) La performance del test è migliore
quando si parte da colonie coltivate in agar sangue piuttosto che in agar sale mannite.
Metodiche molecolari
La natura eterogenea della meticillino-resistenza è un limite intrinseco riguardo all’accu-
17
ratezza dei test di sensibilità. I test per la determinazione di mecA mediante PCR o ibridazione con sonde a DNA identificano correttamente i ceppi eterogenei e sono considerati i gold
standard per la determinazione della meticillino-resistenza, ma il loro impiego è generalmente limitato a centri di riferimento.
È stata recentemente pubblicata da Fluit e coll. (56) una revisione dei metodi molecolari
utilizzati per la determinazione della resistenza antimicrobica. Il primo frammento di DNA
utilizzato come probe per la determinazione del mecA in S. aureus e CNS è stato studiato
nel 1990 da Archer e Pennell (5). La sonda fu saggiata con marcatori radioattivi o digossigenina, ottenendosi con entrambi i marcatori gli stessi risultati. Un anno più tardi fu descritta
da Ligozzi e coll. (110) una sonda per mecA marcata con digossigenina ottenuta mediante
PCR. Negli ultimi 10 anni sono state descritte diverse tecniche di PCR per determinare la
meticillino-resistenza, la cui validità nei confronti dei ceppi CNS risulta talora incerta in seguito al recente cambiamento dei breakpoint NCCLS per l’oxacillina (56). La determinazione mediante PCR integrata è stata descritta da Ubukata e coll. (185); gli autori utilizzano una semplice PCR mecA con uno dei primer portatore di un gruppo biotina e l’altro primer
portatore di un gruppo dinitrofenolo. Dopo la PCR, il prodotto viene catturato in una piastra
microtiter di 96 pozzetti rivestita di streptavidina. Dopo cattura e lavaggi, viene aggiunto un
anticorpo anti-dinitrofenolo coniugato con fosfatasi alcalina e poi il substrato. La sensibilità
del metodo è stata >5 x 102 cfu per S. aureus e >5 x 103 cfu per CNS.
Il metodo PCR con un unico primer è una tecnica efficace e semplice da eseguire. Tuttavia, questi metodi sono sensibili all’inibizione da parte di componenti del sangue o del terreno di coltura. Il problema può essere risolto aggiungendo un secondo primer disegnato per
amplificare un gene che sia presente in tutti i ceppi studiati. Inoltre, l’impiego di un primer
specie-specifico permette anche di confermare l’identificazione della specie. Brakstad e coll.
(26) hanno sviluppato una multiplex PCR per la determinazione simultanea delle sequenze
geniche mecA e nucA (che codifica il gene della termonucleasi specifica di S. aureus). Towner e coll. (180) hanno sviluppato una multiplex PCR basata sui geni mecA e femB (quest’ultimo, coinvolto nella sintesi del peptidoglicano, si pensa sia assente nei CNS); la determinazione è stata eseguita col metodo immunoenzimatico Clearview (Unipath) che utilizza
una membrana con anticorpi anti-biotina e anti-digossigenina e particelle di lattice blu legate
a anticorpi anti-dinitrofenolo. L’amplificazione del segnale bDNA è stato anche utilizzato per
la determinazione del mecA, con un 100% di concordanze con i risultati della ricerca di mecA
mediante PCR (102).
La tecnologia rapid-cycle real-time PCR, rivoluzionaria in microbiologia clinica (37), è
stata anche utilizzata per la determinazione del gene mecA. Bekkaoui e coll. (12) hanno descritto lo sviluppo di un test di 2 ore utilizzando tecnologia cycling probe con sonde chimeriche DNA-RNA-DNA disegnate per determinare il gene mecA in S. aureus. Da questo studio è risultato un test, il Velogene Rapid MRSA Identification Assay (ID Biomedical Corporation), che è un test immunoenzimatico colorimetrico (EIA), che utilizza un probe mecA
marcato con fluoresceina, approvato dal Food and Drug Administration americano. Questo
test utilizza micropiastre di 96 pozzetti rivestite con streptoavidina, e nei ceppi mecA-negativi si osserva lo sviluppo di un colore blu mentre in quelli mecA-positivi la reazione è incolore. Il test è stato valutato solo in tre studi. Nel primo (114), condotto su 397 ceppi di S. aureus per confronto con una PCR per la determinazione del gene mecA, ha dato una sensibilità iniziale del 98,5% ed una specificità del 100%, ma ripetendo il test con un inoculo maggiore per i tre ceppi che erano risultati negativi per mecA ogni discrepanza è stata risolta. La
lettura spettrofotometrica del test si è rivelata superiore a quella visiva. Nel secondo studio,
(174) condotto su 55 ceppi di S. aureus “difficili”, sia la sensibilità che la specificità del test
sono state del 100%. Nel terzo studio (186), eseguito su 210 ceppi di S. aureus la sensibilità
(96,7%) e la specificità (100%) del Velogen sono risultate comparabili a quelle del MRSA
Screen.
La metodica rapid-cycling real-time PCR è stata applicata all’identificazione di mecA
direttamente in emocolture che mostravano cocchi gram-positivi a grappolo alla colorazione
di Gram (209). In ogni campione sono state eseguite due PCR separate, la prima per il fram-
18
mento Sa442, specifico per la specie S. aureus, e la seconda per il gene mecA. La tecnica è
stata eseguita con un sistema LightCycler che combina un rapido thermal cycling e la determinazione probe-specifica del prodotto amplificato. L’identificazione di S. aureus nelle emocolture mediante PCR ha dimostrato una sensibilità del 96% e una specificità del 100%, e
la determinazione della meticillino-resistenza sia una sensibilità che una specificità del
100%. Nei ceppi CNS l’identificazione di mecA ha mostrato una sensibilità del 97% ed una
specificità del 95%.
Screening dei ceppi MRSA direttamente da campioni clinici
Per lo screening diretto di MRSA da campioni clinici è stato utilizzato inizialmente un terreno selettivo denominato MSO (mannitol salt agar con l’aggiunta di 4 µg/ml di oxacillina).
Allo stesso scopo sono stati sviluppati terreni cromogeni con l’aggiunta di oxacillina. Il primo terreno cromogeno di questo tipo è stato il CHROMAGAR Staph aureus (Chromagar®), basato sulla colorazione della colonia per differenziare S. aureus (colore rosa malva dopo 18-24 ore
di incubazione) dai CNS e addizionato con 4 µg/ml di oxacillina. In questo terreno è stato possibile determinare il 100% dei ceppi MRSA multiresistenti, mentre i ceppi acquisiti in comunità
non multiresistenti vi crescevano più difficilmente (30%) (130). Recentemente, un altro terreno
cromogeno, ORSAB (Oxoid), è stato sviluppato per lo screening della meticillino-resistenza di S.
aureus direttamente da campioni clinici. Il terreno utilizza il blu di anilina per dimostrare la fermentazione del mannitolo negli stafilococchi, e contiene inoltre un supplemento di antibiotici (2
µg/ml di oxacillina e 50.000 UI/l di polimixina B) e NaCl (5,5%) per ridurre la presenza di altri
microrganismi diversi dagli stafilococchi e selezionare i ceppi MRSA. Si ipotizza che il terreno
con 2 µg/ml di oxacillina e 20 g per litro meno di NaCl del MSO faciliti lo sviluppo più rapido di
MRSA, mentre l’indicatore facilita la lettura riducendo il tasso di falsi positivi. In uno studio canadese, il terreno ORSAB ha dimostrato una sensibilità per i ceppi MRSA del 76% dopo 24 ore
di incubazione (contro il 64% del terreno MSO) e del 98% dopo 48 ore d’incubazione (contro il
96% di MSO), con una specificità del 74% (contro il 56% di MSO) (171), mentre in un altro studio sono stati identificati come MRSA il 21% dei 122 ceppi che sviluppavano colore blu in ORSAB e il 30% di quelli che sviluppavano colore giallo in MSO; la sensibilità di ORSAB è stata
dell’81% e quella di MSO dell’83% (202).
Un metodo per determinare rapidamente la presenza di ceppi MRSA nei campioni clinici
è la semina in brodo selettivo oltre che in piastra. Recentemente è stato valutato un brodo selettivo (PHMB+) contenente rosso fenolo, mannitolo, aztreonam (75 µg/ml) e ceftizoxime (5
µg/ml) (201). Il razionale, per l’uso di questi antibiotici, è l’osservazione che l’aggiunta di
oxacillina e colistina rallenta o inibisce lo sviluppo di MRSA. Il ceftizoxime, invece, incrementa il livello fenotipico di resistenza alla meticillina. I ceppi MRSA, alla concentrazione di
10 ufc/ml, dopo 72 ore di incubazione, inducono una modificazione del colore del terreno.
Alla densità di 105 ufc/ml la modificazione di colore avviene dopo 24 ore.
Conclusione
I ceppi MRSA sono i principali e più diffusi patogeni nosocomiali. La loro frequente eteroresistenza e la loro multiresistenza rappresentano una delle più comuni ma altresì più importanti sfide sia per il microbiologo clinico che per l’infettivologo. Nasce soprattutto da qui
l’ampio uso, spesso eccessivo, di glicopeptidi, con tutti i problemi che ne conseguono. Un ulteriore elemento di preoccupazione è la diffusione, ormai sempre più frequentemente segnalata, di ceppi MRSA dall’ospedale verso la comunità.
Del tutto recentemente, gli interi genomi di due ceppi MRSA (uno resistente anche alla
vancomicina) sono stati sequenziali (105). È auspicabile che questo evento possa rappresentare un punto di partenza per poter finalmente programmare delle strategie che ci consentano,
in un futuro non troppo lontano, di sconfiggere MRSA (204).
19
GLICOPEPTIDI
In seguito all'incremento delle infezioni causate in tutto il mondo da ceppi MRSA multiresistenti, negli ultimi 20 anni i glicopeptidi sono diventati gli antibiotici di elezione per la terapia delle infezioni stafilococciche nosocomiali. I glicopeptidi di uso clinico sono la vancomicina, il farmaco capostipite immesso sul mercato alla fine degli anni '50, e la teicoplanina,
sviluppata in Italia nei laboratori della Lepetit ed entrata nell'uso clinico dopo la metà degli
anni '80 (ma mai nel mercato degli Stati Uniti).
Meccanismo d'azione
Gli antibiotici glicopeptidici sono molecole rigide di notevoli dimensioni che inibiscono gli ultimi stadi della biosintesi del peptidoglicano (58,72,154). La loro attività antimicrobica, limitata ai batteri Gram-positivi per l'incapacità di attraversare la membrana esterna, è dovuta ad una loro particolare affinità con il dimero D-Ala-D-Ala della catena laterale del precursore del peptidoglicano, cui si legano fortemente anche se con un legame
non covalente (formazione di 5 legami idrogeno). Il vero bersaglio è rappresentato quindi
dal precursore (la cui catena pentapeptidica termina in D-Ala-D-Ala) nel momento in cui
si affaccia all'esterno della membrana citoplasmatica, ancora legato al bactoprenolo. Il legame del precursore con la grossa molecola dell'antibiotico impedisce, per ingombro sterico, la reazione di transglicosilazione, ossia la reazione deputata alla formazione del legame della catena nascente con la nuova subunità di peptidoglicano a livello della componente mucopolisaccaridica. Sempre per ingombro sterico, a livello della catena nascente
risultano inibite anche l'attività transpeptidasica e D,D-carbossipeptidasica responsabili
della reazione di transpeptidazione. Vengono quindi bloccati sia l'estensione della catena
di peptidoglicano sia la formazione dei legami crociati a livello delle catene preesistenti.
Poiché gli enzimi coinvolti in quest'ultima reazione fanno parte delle PBP, risulta giustificato (e si potrebbe spiegare a questo livello) il sinergismo osservato tra glicopeptidi e ßlattamici.
Nelle infezioni caratterizzate dalla presenza di una elevata carica batterica si verifica
un notevole "sequestro" dell'antibiotico (le cui molecole rimangono adsorbite alle pareti)
che ne riduce la quantità disponibile per il legame con il vero bersaglio. In tal modo possono verificarsi situazioni di ridotta sensibilità o resistenza, in particolare nei confronti
degli stafilococchi. È proprio a causa di questo possibile "sequestro" di antibiotico che i
glicopeptidi sono particolarmente sensibili all'effetto inoculo, ed è pertanto di vitale importanza diminuire la carica batterica presente nel sito di infezione (p. es. mediante drenaggio degli ascessi, ecc.).
Resistenza ai glicopeptidi in S. aureus
Epidemiologia
La resistenza acquisita ad antibiotici 'ultima risorsa' come i glicopeptidi ha suscitato
grandissimo allarme sull’impatto presente e futuro della resistenza batterica nelle opzioni
terapeutiche. In particolare, Staphylococcus aureus, il cui coinvolgimento in una estesa resistenza ai glicopeptidi è considerato come un potenziale disastro per la salute pubblica
(50,175), è fonte di grande preoccupazione, particolarmente dopo che è stato possibile trasferire con successo la resistenza alla vancomicina VanA da Enterococcus faecalis a S.
aureus (141) e dopo la descrizione di un mutante di S. aureus altamente resistente alla
vancomicina ottenuto in laboratorio mediante un processo di selezione per esposizione a
concentrazioni crescenti di antibiotico (166). Queste preoccupazioni sono destinate ad aumentare drammaticamente dopo la recentissima segnalazione negli Stati Uniti (luglio
20
2002) (30a) di un ceppo MRSA, isolato da un paziente emodializzato, altamente resistente
alla vancomicina (MIC, >128 µg/ml) e resistente anche alla teicoplanina (MIC, 32 µg/ml).
Questo ceppo, isolato dal sito di infezione insieme ad un enterococco VanA, è risultato
contenere nel proprio genoma non solo il gene mecA della meticillino-resistenza, ma anche il gene vanA responsabile della più diffusa forma di resistenza alla vancomicina negli
enterococchi. D'altronde, il pattern di sensibilità ai glicopeptidi (elevata resistenza alla
vancomicina e resistenza, ma a più basso livello, anche alla teicoplanina) è tipico della resistenza VanA. Questo ceppo, il primo isolato clinico di S. aureus pienamente ed altamente resistente alla vancomicina (VRSA), sembra quindi essere il frutto della diffusione, in
qualche modo, della resistenza VanA dall'enterococco allo S. aureus: un evento sempre
paventato, tanto più dopo la dimostrazione in vitro che il passaggio è possibile (141), ma
che finora non sembrava essersi verificato naturalmente. La segnalazione è troppo recente
e le informazioni sono ancora troppo limitate per poter fare ulteriori commenti, ma è certo
che, nella già drammatica evoluzione del problema delle antibiotico-resistenze negli ultimi venti anni, questo evento potrebbe segnare una svolta epocale e potenzialmente catastrofica (175), destinata a suscitare enorme scalpore ed allarme nella comunità scientifica.
Isolati clinici di S. aureus con ridotta sensibilità ai glicopeptidi (soprattutto alla teicoplanina, con sensibilità alla vancomicina in genere conservata) sono stati descritti nella
prima metà degli anni ’90 (27,96,117,191), spesso in pazienti trattati con vancomicina o
teicoplanina, e talora con diffusione nosocomiale del ceppo in questione (117).
Il primo caso di una vera e propria non-sensibilità di S. aureus alla vancomicina è stato
osservato in Giappone nel 1996, in un bambino di 4 mesi trattato con vancomicina per un mese per un’infezione da MRSA insorta dopo un intervento cardiochirurgico (75).
Il ceppo di S. aureus isolato (denominato Mu50) presentava una MIC di vancomicina di 8
µg/ml, quindi non una vera resistenza, bensì un valore intermedio, essendo i breakpoint per la
sensibilità e la resistenza alla vancomicina di ≤4 e ≥32 µg/ml, rispettivamente (138).
Il Giappone ha presentato in effetti in questi anni una situazione particolare riguardo
alle infezioni ospedaliere da S. aureus, anzitutto per la prevalenza incomparabilmente elevata di MRSA (in media oltre il 60%). Sempre in Giappone è stato infatti riportato un diverso e più comune tipo di ridotta sensibilità alla vancomicina in S. aureus, il cui ceppo
prototipo (denominato Mu3) presentava alla microdiluizione in brodo convenzionale una
MIC di 2 µg/ml (dunque al di sotto del breakpoint per la sensibilità), con presenza però di
sottopopolazioni capaci di crescere in presenza di vancomicina fino a concentrazioni di 9
µg/ml (73). I ceppi di questo tipo risultavano ampiamente diffusi negli ospedali giapponesi nella seconda metà degli anni '90 (il 9,3% dei ceppi MRSA isolati negli ospedali universitari e l'1,3% dei ceppi isolati negli altri ospedali) (73). Questi dati sono stati per altro
confutati da un più recente studio nazionale condotto in 278 ospedali giapponesi: su 6.625
ceppi di MRSA raccolti, nessuno ha mostrato una resistenza alla vancomicina eterogenea
(tipo Mu3) o intermedia (tipo Mu50) (87). I ceppi tipo Mu50 sono generalmente definiti
VISA (vancomycin-intermediate S. aureus).
I ceppi tipo Mu3 sono invece generalmente definiti hVISA (etero-VISA, heterogeneous VISA). Più in particolare, Hiramatsu et al. (75) definiscono come hVISA ceppi di S.
aureus con MIC convenzionali di vancomicina ≤4 µg/ml, ma contenenti sottopopolazioni
capaci di crescere in piastre con ≥8 µg/ml dell'antibiotico ad una frequenza ≥10-6. Al posto
dell'acronimo VISA è spesso usato l'equivalente GISA (glycopeptide-intermediate S. aureus), che però aggiunge poco alla definizione essendo scontato che questi ceppi con ridotta sensibilità alla vancomicina presentino a maggior ragione una ridotta sensibilità (o
addirittura una resistenza) all'altro glicopeptide, cioè la teicoplanina.
Tuttavia, queste ed altre definizioni correlate (p.es. VRSA, vancomycin-resistant S.
aureus; SRSV, staphylococci with reduced susceptibility to vancomycin) restano comunque piuttosto relative per non dire confuse, e non di rado lo stesso acronimo è utilizzato
con significato diverso da autori diversi.
Ulteriori elementi di confusione scaturiscono dal fatto che, anche se i criteri americani
dell’NCCLS sono quelli a cui più spesso e più convenzionalmente si fa riferimento, esi-
21
stono altri comitati nazionali che propongono talora breakpoint e criteri diversi, anche per
quanto riguarda i glicopeptidi (42).
I ceppi hVISA possono essere stabili o instabili. Quelli instabili si possono ottenere in
laboratorio mediante esposizione ai glicopeptidi (p. es. in terreni contenenti 1 µg/ml di
vancomicina): riseminati in terreno senza antibiotico, questi ceppi tenderanno a perdere le
popolazioni resistenti in un paio di settimane. I ceppi stabili invece (p. es. Mu3) resteranno eteroresistenti anche dopo passaggi ripetuti in terreno senza antibiotici per 80 gg. Nel
laboratorio di microbiologia clinica, i ceppi che sono importanti da evidenziare sono gli hVISA stabili [che sarebbero per altro rari secondo il gruppo giapponese di Ike che contesta i dati dei connazionali del gruppo di Hiramatsu (72,87)]. Questi ceppi hVISA (con
MIC di vancomicina ≤4 µg/ml, e quindi sensibili secondo i criteri NCCLS) richiedono
un’attenta valutazione in rapporto all’esito terapeutico, potendo rappresentare (pur in assenza di precise evidenze cliniche) una potenziale causa di fallimento di una terapia con
glicopeptidi. Si pensa che questi ceppi, in vivo, siano potenzialmente in grado di evolvere
verso una resistenza intermedia ed omogenea (VISA), e siano altresì capaci di una maggiore adesività alle superfici artificiali rispetto ai più comuni ceppi MRSA.
Dopo il clamore suscitato in tutta la comunità scientifica dai dati giapponesi, altre
(seppure rare) segnalazioni di casi di infezione da ceppi VISA (tutti MRSA) sono stati descritti in Francia (148), negli USA (30,169,172), a Hong Kong (127), in Corea (101), in
Sudafrica (54), in Scozia (76), di solito in pazienti sottoposti a trattamenti prolungati con
glicopeptidi. È da notare che negli USA sono stati recentemente descritti ceppi VISA isolati da un paziente non ospedalizzato (un giovane di 27 anni con un ascesso epatico, trattato a domicilio con vancomicina per 10 settimane); in questo paziente sono stati isolati due
ceppi VISA, uno MRSA e l’altro, invece, meticillino-sensibile (67).
Ma in realtà i ceppi omogeneamente intermedi alla vancomicina (MIC, 8 µg/ml) sono
molto rari, certamente più frequenti sono i ceppi eteroresistenti, di solito con una MIC
convenzionale nei limiti della sensibilità (MIC, 1-4 µg/ml) (178). In effetti, sono in aumento (anche se l’incidenza in Europa resta <1% dei ceppi MRSA) le segnalazioni di casi
di infezione da ceppi hVISA, p. es. in Gran Bretagna (79), in Spagna (8,112), in Germania
(19,61), in Grecia (97), negli USA (155), in Francia (22,34,153), in Tailandia (181) e anche in Italia (118). È da notare che uno dei ceppi hVISA isolati in Francia era meticillinosensibile (22). È altresì da notare che in diversi casi si è trattato di ceppi identificati come
hVISA in studi retrospettivi: per esempio, un ceppo hVISA isolato in Egitto nei primi anni
'80 fu identificato come tale solo alla fine degli anni '90 nello studio retrospettivo di Bierbaum et al (19). Come in quelle da VISA, anche nelle infezioni da hVISA sembra esservi
un’associazione con una maggiore mortalità, e il principale fattore di rischio sembra consistere in una esposizione prolungata ai glicopeptidi (59).
Utilizzando un modello farmacocinetico in vitro, è stata studiata sperimentalmente
l’attività della vancomicina contro ceppi vancomicino-sensibili, hVISA e VISA, quantificando le cellule con fenotipo vancomicino-intermedio dopo 48 ore (80). È stato osservato
che l’esposizione a basse concentrazioni dell’antibiotico non produce un aumento delle
cellule con sensibilità intermedia alla vancomicina; quindi l’esposizione per poco tempo
degli stipiti hVISA alla vancomicina, a gradiente di concentrazione, non produce un aumento delle cellule con fenotipo vancomicino-intermedio.
Meccanismi di resistenza
La resistenza di cui si parla qui di seguito è quella endogena, acquisita per mutazione,
che nei confronti della vancomicina non è mai una resistenza piena, ma piuttosto una sensibilità intermedia, sia pure spesso con sottopopolazione più resistenti. In altre parole, non
sarà considerata (anche perché la notizia è troppo fresca e le informazioni troppo scarne) la
recentissima e già ricordata segnalazione di un ceppo clinico di S. aureus con resistenza
VanA di apparente origine enterococcica (30a).
A differenza dell'origine esogena della resistenza acquisita ai glicopeptidi negli entero-
22
cocchi (quanto meno di tipo VanA e VanB), negli stafilococchi la resistenza ai glicopeptidi
sembra essere di regola endogena, non associata a plasmidi o transposoni, e soprattutto in
certe specie coagulasi-negative può essere selezionata in vitro in seguito a esposizione a
vancomicina o teicoplanina (18). Diversamente dagli enterococchi, inoltre, negli stafilococchi non conosciamo geni specifici associati alla resistenza o alla ridotta sensibilità ai glicopeptidi. La resistenza degli stafilococchi sembra essere multifattoriale, associata a un processo di selezione graduale dovuto alla pressione antibiotica, e acquisita per mutazione.
Resistenza alla vancomicina
Il prerequisito per la resistenza di S. aureus alla vancomicina è un inspessimento della
parete cellulare dovuto all’accumulo di un eccesso di peptidoglicano (72). Questo fenomeno si osserva praticamente in tutti i ceppi di S. aureus con ridotta sensibilità alla vancomicina. Nel ceppo Mu50, per esempio, si ritiene siano presenti un eccesso di monomeri di
mureina e un eccesso di strati (almeno 30-40, a giudicare dall'inspessimento della parete
osservato in microscopia elettronica a trasmissione). È stato suggerito che al meccanismo
di resistenza di S. aureus alla vancomicina possa contribuire l'aumentata capacità della parete cellulare dei ceppi VISA o hVISA di catturare le molecole glicopeptidiche prima che
riescano ad arrivare ai siti di sintesi all'interfaccia fra membrana citoplasmatica e parete
cellulare (167). Il grado di inspessimento è correlato con il grado di resistenza alla vancomicina. La diminuzione dei legami crociati del peptidoglicano conferisce resistenza alla
vancomicina solo in presenza di un inspessimento della parete, e inoltre aumenta l’efficacia
di due meccanismi associati: (i) l'intrappolamento per affinità (affinity trapping) nei confronti delle molecole di vancomicina, e (ii) la distruzione da parte delle molecole di vancomicina intrappolate della struttura a maglia degli strati più esterni del peptidoglicano, con
impedimento dell’ulteriore penetrazione delle molecole di vancomicina negli strati più interni della parete cellulare per un fenomeno di intasamento (clogging) (72).
Teoricamente, ci sono due modi diversi per determinare un inspessimento della parete
cellulare: (i) produrre un eccesso di peptidoglicano, oppure (ii) ridurre il turnover del peptidoglicano. In effetti, il primo meccanismo è caratteristico del ceppo Mu50 (75), il secondo del cosiddetto ceppo Michigan (172), che mostra una ridotta capacità autolitica. Per
comprendere questo secondo meccanismo, occorre considerare che a ridosso della superficie esterna della membrana citoplasmatica sono continuamente prodotti nuovi strati di peptidoglicano, che spostano i vecchi sempre più verso l'esterno finché alla fine si staccano
dalla parete: in questo processo sono coinvolti enzimi autolitici.
Altri fattori, sia pure meno importanti dell’inspessimento della parete, contribuiscono
alla resistenza alla vancomicina nei ceppi VISA, in particolare la diminuzione del livello
di glutammato intracellulare e il consumo di glutammina, con conseguente aumentata produzione di monomeri di mureina strutturalmente alterati (non amidati) che sono substrati
inefficienti per la formazioni dei legami crociati da parte delle transpeptidasi codificate
dalle PBP. Da tutto ciò risulta un aumento della proporzione dei residui D-Ala-D-Ala negli strati di peptidoglicano, con aumento sia dell'affinity trapping sia del clogging (40,70).
In ceppi hVISA è stata osservata la presenza di PBP alterate con conseguente riduzione
dei legami crociati (69); ma anche questo meccanismo può favorire la resistenza alla vancomicina solo in presenza di un inspessimento della parete cellulare.
È stata inoltre suggerita una relazione fra la PBP4 e l’espressione del fenotipo VISA
(55): l’attività della PBP4 diminuisce infatti quando un ceppo di S. aureus vancomicinosensibile diventa in vitro vancomicino-resistente. Poiché la PBP4 funziona in S. aureus
come una transpeptidasi secondaria, una riduzione della sua attività incrementerà il numero di falsi bersagli per la vancomicina, ossia il contenuto totale nella parete di muropeptidi
D-Ala-D-Ala (non coinvolti in legami crociati).
Per contro, una iperproduzione della PBP4 in cellule VISA isolate determina una diminuzione di 2-3 volte delle MIC della vancomicina. Mutanti ottenuti in vitro inattivando la
PBP4 in ceppi MRSA hanno mostrato un incremento del numero di sottopopolazioni alta-
23
mente resistenti alla vancomicina e una diminuzione dei legami crociati nella parete. Anche
modificazioni strutturali degli acidi teicoici (in particolare con carenza di esteri di D-alanina) possono influenzare la risposta alla vancomicina; ma queste alterazioni degli acidi teicoici comportano spesso conseguenze profonde anche per la virulenza di S. aureus (146).
Insomma, i ceppi VISA mostrano spesso alterazioni nella sintesi e nella composizione
della parete cellulare, con iperproduzione di falsi siti bersaglio che riducono l’accesso dei
glicopeptidi al loro bersaglio letale, la D-Ala-D-Ala del precursore muropeptidico ancora
legato al lipide II. L’incremento della resistenza ai glicopeptidi può associarsi a variazioni
delle PBP, a una maggiore attività autolitica, probabilmente all’espressione di geni con
funzioni ancora sconosciute, e comunque ad un inspessimento della parete.
Le basi genetiche della resistenza di S. aureus alla vancomicina non sono state ancora
chiarite. Ad ogni modo, l’ampio spettro di fenotipi VISA e hVISA suggerisce che potrebbero non esservi alterazioni genetiche specifiche. Quello che pare oggi chiaro è che per la
vancomicino-resistenza non sembrano necessari elementi tipo SCCmec portatori del gene
mecA come per la meticillino-resistenza.
Resistenza alla teicoplanina
Storicamente S. aureus ha acquisito la resistenza alla teicoplanina prima della resistenza
alla vancomicina. D'altra parte, come tutti gli stafilococchi, anche S. aureus mostrà più difficoltà alla resistenza alla vancomicina che alla teicoplanina. È legittimo ipotizzare che i meccanismi base della resistenza di S. aureus alla teicoplanina siano simili a quelli della sua resistenza alla vancomicina. In effetti, tutti i ceppi VISA studiati sono anche intermedi o resistenti
alla teicoplanina.
Nei ceppi VISA, la resistenza alla vancomicina decresce quando l’inspessimento della parete si riduce, ma più della metà di questi ceppi mantengono un livello intermedio di resistenza alla teicoplanina. Anche la resistenza alla teicoplanina è correlata con l’aumento dello spessore della parete cellulare, ma devono intervenire altri fattori e meccanismi, come l’aumento
della produzione di PBP2, osservato in un ceppo mutante di S. aureus teicoplanino-resistente.
Sembra che la teicoplanina sia più propensa della vancomicina a inibire la transpetidazione, e
che la vancomicina sia più incline ad inibire la transglicosilazione (72).
Morfologia dei VISA
Una caratteristica dei ceppi VISA è la lenta crescita rispetto ai ceppi di S. aureus vancomicino-sensibili. Le colonie si osservano in genere solo dopo il secondo giorno di incubazione e appaiono come colonie puntiformi o di maggiori dimensioni, gialle o grigie, con
una morfologia variabile (spesso con colonie apparentemente diverse sulla stessa piastra)
tanto nella coltura primaria come nei successivi passaggi (119,178). Utilizzando un microscopio a forza atomica, sulla superficie di un ceppo VISA (nonché del suo revertante) sono
stati osservati due anelli paralleli lungo la circonferenza, mentre sulla superficie dei ceppi
sensibili di controllo era presente un unico anello equatoriale; altri anelli comparivano nei
ceppi sensibili in presenza di vancomicina (25). Il ceppo Mu50, fin dalla sua prima segnalazione, fu descritto avere una parete cellulare due volte più spessa del normale (75). Altre
caratteristiche osservate al microscopio elettronico nei ceppi VISA sono la forma irregolare
delle cellule, la superficie non uniforme, la presenza di setti anomali, in contrasto con la
morfologia regolare del ceppo S. aureus ATCC 29213 che presenta una parete cellulare
sottile e una superficie omogenea (22).
Un mutante di S. aureus altamente resistente alla vancomicina ottenuto in laboratorio
per pressione selettiva da Sieradzki e Tomasz (166) presentava crescita lenta, morfologia anomala, rimozione dell’antibiotico dal terreno durante la crescita, ritenzione dell’antibiotico nella parete cellulare, inibizione del turnover della parete cellulare, e inibizione della separazione delle cellule figlie alla fine della divisione cellulare.
24
Test di laboratorio
I test di sensibilità ai glicopeptidi richiedono una accuratezza particolare perché variazioni nella dimensione dell’inoculo possono incidere sulla concentrazione dell’antibiotico
libero variando, quindi, i risultati della MIC. La resistenza alla vancomicina in S. aureus
deve essere testata mediante una metodica MIC (28).
Non tutte le metodiche in uso nella routine per lo studio della sensibilità agli antibiotici
sono in grado di determinare i ceppi VISA e hVISA. La determinazione può essere difficile
anche per via dell'eteroresistenza (un po' come per i ceppi MRSA). All'isolamento iniziale
questi ceppi presentano spesso colonie diverse, che danno però uguali risultati ai test di
sensibilità (178). Le cellule che crescono più lentamente nella coltura ed esprimono una più
ridotta sensibilità o una resistenza alla vancomicina possono essere difficili da determinare
con i comuni metodi di laboratorio.
Metodiche NCCLS
Riepilogando quanto già in precedenza ricordato incidentalmente circa i breakpoint
convenzionali secondo l'NCCLS (138), i breakpoint per i test di diluizione per la vancomicina sono ≤4 µg/ml (sensibile), 8-16 µg/ml (intermedio) e ≥32 µg/ml (resistente), e per la
teicoplanina ≤8 µg/ml (sensibile), 16 µg/ml (intermedio) e ≥32 µg/ml (resistente), con l'esplicita raccomandazione che tutti i ceppi con una MIC di vancomicina ≥4 µg/ml siano inviati ad un laboratorio di riferimento. Quanto ai test di agar diffusione, con la vancomicina
(dischetto da 30 µg) è previsto solo il breakpoint per la sensibilità (≥15 mm), mentre con la
teicoplanina (dischetto da 30 µg) i breakpoint sono ≥14 mm (sensibile), 11-13 mm (intermedio) e ≤10 mm (resistente).
In realtà, la metodica di diffusione in agar da dischetto (Kirby-Bauer) non deve essere
utilizzata per lo studio della sensibilità alla vancomicina negli stafilococchi, perché trattandosi di una tecnica qualitativa è chiaramente inidonea a dirimere situazioni che in realtà si
giocano su minime differenze della MIC. Infatti, tutti i ceppi VISA studiati da Tenover et
al. (176) hanno mostrato aloni di inibizione di 16-19 mm di diametro, che sarebbero quindi
da considerare sensibili secondo i breakpoint convenzionali (Tabella 3). La stessa tecnica
può invece avere un qualche valore per la teicoplanina, anche se è necessario modificare i
criteri interpretativi per gli stafilococchi per rendere il test più sensibile. Col dischetto da
30 µg di teicoplanina è possibile eseguire uno screening considerando i ceppi con diametro
≤15 mm come possibili VISA (176).
Ceppo (origine)
Vancomicina
MIC
S. aureus Mu50 (Giappone)
S. aureus Mu3 (Giappone)
S. aureus Mu3-8R (Giappone)
S. aureus N20 (Giappone)
S. aureus 963sm (Michigan)
S. aureus 966 (Michigan)
S. aureus 992 (New Jersey)
S. aureus 803 (Florida)
S. epidermidis 5289 (Virginia)
S. epidermidis 759 (Wisconsin)
S. epidermidis 12333 (California)
S. haemolyticus 142 (New York)
8
2
8
4
8
4
8
4
8
8
8
8
(I)
(S)
(I)
(S)
(I)
(S)
(I)
(S)
(I)
(I)
(I)
(I)
Teicoplanina
Alone
17
19
17
18
18
16
17
17
18
17
17
17
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
(S)
MIC
8
16
32
1
16
16
8
16
16
16
16
32
(S)
(I)
(R)
(S)
(I)
(I)
(S)
(I)
(I)
(I)
(I)
(R)
Alone
15
14
13
17
13
13
15
15
14
14
13
13
(S)
(S)
(I)
(S)
(I)
(I)
(S)
(S)
(S)
(S)
(I)
(I)
Tabella 3. - Confronto tra la microdiluizione in brodo (MIC, espressa in µg/ml) e la diffusione in agar (diametro dell'alone
di inibizione, espresso in mm). Le lettere fra parentesi (S, sensibile; I, intermedio; e R, resistente) indicano l’interpretazione
secondo i criteri NCCLS (176).
25
In uno studio di Walsh et al. (193), il metodo di diluizione in agar secondo l'NCCLS ha
dato una bassa sensibilità per la vancomicina (20%) e per la teicoplanina (47%) contro una
specificità del 100% per entrambi i glicopeptidi; il metodo della microdiluizione in brodo
secondo l'NCCLS ha dato ugualmente una sensibilità molto bassa per la vancomicina
(11%) e del 40% per la teicoplanina contro una specificità rispettivamente del 100% e
>99% (Tabella 4). In questo lavoro i test sono stati incubati solo 18 ore contro le 24 ore segnalate nei documenti NCCLS (53). Che i metodi di agar diluizione e di microdiluizione in
brodo rispettivamente l'NCCLS diano risultati subottimali è probabilmente dovuto all’inoculo basso che si utilizza in questi metodi e allo sviluppo relativamente povero in agar
Mueller-Hinton. Poiché i fenotipi resistenti sono presenti in circa 1 cellula su 106, le cellule
resistenti possono non essere presenti in quantità sufficiente nell’inoculo di partenza. Sempre nello studio di Walsh et al. (193) il metodo di screening eseguito secondo la procedura
del CDC (ossia utilizzando BHI agar con l'aggiunta di 6 µg/ml di vancomicina e seminando
10 µl di una sospensione con un inoculo di 0,5 McFarland) (176) ha dato una sensibilità del
22% soltanto con una specificità del 97%; anche il metodo di screening modificato (che utilizza Mueller Hinton agar con l'aggiunta di 5 µg/ml di vancomicina) (81) ha mostrato una
sensibilità del 20% soltanto con una specificità del 99% (Tabella 4). Il basso livello di sensibilità del metodo di screening riflette l'elevato numero di falsi negativi, soprattutto per i
ceppi hVISA. È da notare che il ceppo eteroresistente Mu3 non cresce nel test di screening
con BHI + 6 µg/ml di vancomicina.
Metodi automatici
I pannelli rapidi MicroScan (Dade Behring) non sono in grado di riconoscere i ceppi VISA, considerando i ceppi o completamente sensibili (≤2 µg/ml) o completamente resistenti
(≥16 µg/ml), mentre il metodo convenzionale MicroScan dà risultati più vicini al metodo di
riferimento della microdiluizione in brodo dell'NCCLS.
Le modificazioni recenti del software Vitek (versione 7.01; BioMérieux) hanno migliorato la capacità del sistema di trovare i ceppi VISA, ma alcuni ceppi di S. aureus con una MIC
intermedia alla vancomicina non possono ancora esse determinati (151a).
I pannelli del metodo Sensititre, letti visivamente, hanno dato risultati variabili, anche se
alcuni dei pannelli hanno permesso di determinare le MIC di 8 µg/ml (176).
Metodo
N° GISA o hGISA
identificati (n = 45)
N° di falsi
positivi
N° di falsi
negativi
Sensibilità (%)
Specificità (%)
PS
Diluizione in brodovancomicina
32
5
34
0
13
40
71
11
88
100
Diluizione in brodoteicoplanina
Agar diluizione-vancomicina
Agar diluizione-teicoplanina
18
1
27
40
>99
9
21
0
0
36
24
20
47
100
100
Etest, 0,5 McFarland
Etest, 2,0 McFarland
Metodo screening BHI
Metodo screening
Mueller-Hinton
37
43
10
9
20
7
8
3
8
2
35
36
82
96
22
20
93
97
97
99
Tabella 4. – Sensibilità e specificità dei differenti metodi utilizzati per discriminare i ceppi GISA e hGISA in ceppi MRSA (193).
26
Metodi di riferimento
I metodi di riferimento per la determinazione della eteroresistenza sono lo studio delle popolazioni (PS) e l’analisi del profilo delle popolazioni (PAP).
Il metodo di analisi delle popolazioni (PS) proposto da Hiramatsu et al.75 per studiare i
ceppi hVISA è stato utilizzato come metodo di riferimento in diversi studi, anche se in realta
non è ben chiaro se scopra effettivamente la resistenza alla vancomicina o piuttosto la selezioni. Contrariamente ai metodi standard, che valutano soltanto 104 UFC, questo metodo permette di analizzare 107-109 UFC. Nel metodo PS, un inoculo specifico viene seminato su piastra di BHI agar contenente 4 µg/ml di vancomicina. Le colonie sviluppatesi in 24 ore si presume che siano di fenotipo VISA, mentre quelle che compaiono tra le 24 e le 48 ore si presume che siano di fenotipo hVISA. La conferma si ottiene mediante subcoltura in BHI agar
contenente 8 µg/ml di vancomicina. Nello studio di Walsh et al. (193) il metodo PS ha dato una sensibilità del 71% ed una specificità dell'88%, col 10,3% di falsi positivi e il 3,9% di falsi
negativi. Uno studio pilota condotto in un ospedale inglese con 100 ceppi MRSA ha dimostrato che se si utilizzava il PAP come metodo di riferimento, il metodo PS dava un 7% di
falsi positivi (205).
Il metodo di riferimento per confermare la resistenza ai glicopeptidi è lo studio del rapporto tra il profilo dell’analisi della popolazione e l’area sotto la curva (rapporto PAP/AUC)
(193), anche se non si tratta, ovviamente, di una tecnica utilizzabile nella routine. In un recente studio multicentrico a doppio cieco, una volta studiata la riproducibilità della tecnica, il
metodo PAP-AUC (rapporto fra l'analisi del profilo della popolazione e l'area sotto la curva)
si è dimostrato più valido rispetto al metodo PS (193). Il valore di cutoff è stato stabilito per i
fenotipi VISA e hVISA (basandosi su Mu50 e Mu3) in 0,9. L’esame dei microrganismi presenta una netta linea di demarcazione tra quei ceppi che presentano un valore di PAP-AUC
<0,9 e quelli con un valore di PAP-AUC >1,0. Occasionalmente, alcuni ceppi possono presentare un rapporto PAP-AUC simile a quello di Mu50 ma con una MIC della vancomicina
≤4 µg/ml. Studi di sorveglianza che hanno utilizzato il rapporto PAP-AUC hanno osservato
una prevalenza dei ceppi con ridotta sensibilità alla vancomicina inferiore all’1% (205).
Etest
Lo studio comparativo fra PAP e Etest per vancomicina e teicoplanina, con due inoculi
diversi di 0,5 e 2,0 McFarland, ha dato con entrambi gli inoculi una elevata sensibilità
(82% e 96%) e specificità (93% e 97%), rispettivamente, e una buona riproducibilità (193)
(Tabella 4). Il terreno usato per eseguire l’Etest era il BHI agar, l’inoculo era di 200 µl per
piastra di 90 mm di diametro, e l’incubazione era di 24 e 48 ore a 37°C. I risultati non sono
stati sostanzialmente diversi prolungando l’incubazione a 48 ore, ma le microcolonie associate alla popolazione eteroresistente erano più evidenti e facili da osservare quando l’incubazione era di 48 ore. I criteri interpretativi per la determinazione dei ceppi con ridotta sensibilità ai glicopeptidi con inoculo di 2,0 McFarland sono stati ≥8 µg/ml di vancomicina e
≥8 µg/ml di teicoplanina o ≥12 µg/ml di teicoplanina. Il criterio interpretativo per la teicoplanina di ≥12 µg/ml ha permesso di determinare un maggior numero di ceppi con ridotta
sensibilità ai glicopeptidi che sarebbero stati perduti con i criteri di ≥8 µg/ml per vancomicina e teicoplanina. Il migliore valore di cutoff per determinare questi ceppi utilizzando l’Etest con un inoculo di 0,5 McFarland è stato di ≥4 µg/ml per la vancomicina e di ≥6 µg/ml
per la teicoplanina. La preparazione dell’inoculo mediante sospensione diretta delle colonie
è paragonabile come accuratezza nella determinazione di hVISA al metodo di preparazione
dell’inoculo da un brodo incubato overnight.
Dallo studio di Walsh et al. (193) si evince chiaramente che il metodo di scelta per lo
screening dei ceppi con ridotta sensibilità ai glicopeptidi è l’Etest con inoculo di 2,0 McFarland, in terreno BHI. Un inoculo maggiore e un terreno più ricco ottimizzano il recupero di hVISA. Il gradiente predefinito stabile dell’Etest risulta ampiamente “inoculo tollerante” mantenendo i risultati di categoria di sensibilità anche con l’inoculo elevato utilizzato. Benquan et al. (15) hanno osservato che i ceppi etero-VISA producono un doppio alone
di inbizione intorno alle strisce di vancomicina dell’Etest quando sono incubate oltre le 48
27
ore. Tuttavia, è anche raccomandabile che tutti i ceppi positivi con l’Etest siano confermati
con l'analisi del rapporto PAP-AUC e, se possibile, con i risultati clinici della terapia.
Programmi e strategie di comportamento
Questi dati confermano la necessità di studiare più a fondo i ceppi che presentano una
MIC di ≥4 µg/ml con i metodi convenzionali NCCLS. Di fatto, negli U.S.A. esiste una iniziativa del CDC (progetto SEARCH, Surveillance for Emerging Antimicrobial Resistance
Connected to Healthcare) che indica come comportarsi, come refertare e come inviare un
ceppo di S. aureus con una MIC di vancomicina ≥4 µg/ml. (www.cdc.gov/ncidod/hip/ARESIST/search.htm).
Un altro programma negli U.S.A. è quello del National Institutes of Health (NIH) a favore del National Institute of Allergy and Infectious Disese (NIAID) per stabilire e mantenere una rete denominata Network Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus
(NARSA) (www.narsa.net). L’iniziativa NARSA non solamente fornisce i ceppi VISA
(immagazzinati in un deposito centrale) ai ricercatori, ma rende disponibile una rete di database e di comunicazione ad uso dei ricercatori, dell’industria, dell’università, del governo
e dei settori di sanità pubblica.
Il CDC nel 2000 (30) ha indicato le possibili strategie per selezionare i ceppi di S. aureus con ridotta sensibilità alla vancomicina e per eseguire un ulteriore test di conferma:
- Selezionare i ceppi con MIC di ≥4 µg/ml (si basa sull’apparente eterogeneità dei ceppi
per cui quando la MIC è ≥4 µg/ml potrebbero essere presenti sottopopolazioni con MIC più
elevata.
- Selezionare i ceppi con MIC alla vancomicina ≥8 µg/ml.
- Selezionare tutti i ceppi meticillino-resistenti (finora pressoché tutti i ceppi VISA erano MRSA).
- Selezionare tutti i ceppi di S. aureus isolati, poiché ancora si conosce poco sulla diffusione di queste resistenze e quindi qualsiasi S. aureus può potenzialmente avere una ridotta
sensibilità ai glicopeptidi.
Il CDC ha adottato inoltre tre criteri per identificare i ceppi VISA (178): Microdiluizione
in brodo: MIC della vancomicina di 8-16 µg/ml in brodo Mueller-Hinton, lettura a 24 ore.
- Test di screening in BHI agar contenente 6 µg/ml di vancomicina: lo sviluppo dopo 24
ore di una o più colonie è un risultato positivo (si utilizzando come controllo negativo S.
aureus ATCC 25923 e come controllo positivo Enterococcus faecalis ATCC 51299.
- Etest: MIC della vancomicina di ≥6 µg/ml in Mueller Hinton agar, lettura del test dopo
24 ore.
Algoritmo per l’identificazione dei ceppi VISA
È necessario che i laboratori sviluppino un algoritmo per identificare i ceppi VISA. Eseguire uno screening di tutti i ceppi di S. aureus non solo comporta un costo esagerato, ma
non è neppure prudente, data la bassa prevalenza di tali ceppi. È forse più utile focalizzare
l’attenzione sui ceppi MRSA, visto che la maggior parte dei VISA e hVISA sono MRSA, e
sorvegliare i pazienti a rischio più elevato (come i pazienti in emodialisi, i pazienti cronici
in dialisi ambulatoriale peritoneale, quelli trattati per lungo tempo con glicopeptidi).
Metodi molecolari
Finora non esistono metodi molecolari per la determinazione della resistenza ai glicopeptidi negli stafilococchi (56).
Prevenzione e controllo
Il CDC (Centers for Disease Control and Prevention) di Atlanta ha stilato nel 1997 un
documento con le raccomandazioni per prevenire la diffusione della vancomicino resistenza (28). Altre considerazioni sul controllo delle infezioni da S. aureus resistenti alla vanco-
28
micina sono state fatte da Wenzel e Edmond (199), in particolare circa l’utilità di eseguire
studi di prevalenza della resistenza agli antibiotici, di attuare le strategie di controllo e soprattutto le precauzioni da contatto (lavaggio delle mani, uso dei guanti, isolamento, ecc.),
e la notifica immediata al Comitato Infezioni Ospedaliere dell’ospedale. Inoltre è importante (i) ridurre la pressione selettiva della vancomicina che deve essere somministrata solo in
situazioni appropriate, (ii) utilizzare tecniche diagnostiche appropriate per minimizzare il
ricorso a terapie empiriche prolungate, (iii) utilizzare i cateteri venosi per il tempo strettamente necessario, e (iv) rimuovere i materiali protesici infettati da S. aureus. Ben nota è la
trasmissibilità dei ceppi MRSA in ambiente ospedaliero, ed è ragionevole ritenere che i
ceppi VISA abbiano lo stesso potenziale di facilità di trasmissione. Le attuali linee guida
HICPAC (Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee) raccomandano di
prendere le stesse precauzioni per qualsiasi tipo di stafilococco coagulasi-negativo con
MIC ≥8 µg/ml (59).
La politica degli antibiotici non deve essere solo circoscritta ai glicopeptidi, ma deve riguardare anche le cefalosporine e i carbapenemici. L’espressione eterogenea della resistenza ai glicopeptidi è influenzata anche dall’esposizione ai ß-lattamici. Praticamente tutti i ßlattamici, anche se usati a concentrazioni ottimali, aumentano la resistenza dei ceppi hVISA. In seguito all'applicazione di misure di controllo delle infezioni, parallelamente alla riduzione dell’uso di cefalosporine e carbapenemici in ospedale diminuiscono le infezioni da
MRSA, e la diminuzione dei ceppi MRSA è la misura più efficace per prevenire l’emergenza di ceppi VISA e hVISA (72).
Approccio terapeutico alle infezioni da VISA
La mortalità dei pazienti con infezioni da VISA è molto elevata (ca. 70%), ma non è chiaro in che misura la morte sia attribuibile direttamente all’infezione da VISA. Si tratta infatti
di pazienti che spesso soffrivano di varie malattie di base, principalmente insufficienza renale, e diversi di loro avevano fattori complicanti come la presenza di focolai di infezione non
drenati, cateteri venosi centrali, ecc., che possono aver contribuito al fallimento della terapia
con vancomicina. Il livello ematico di vancomicina è stato studiato solo in tre pazienti, e tutti
e tre avevano livelli sopra la MIC (112). La vancomicina uccide gli stafilococchi più lentamente degli antibiotici ß-lattamici, come è stato osservato in pazienti trattati per endocardite
nei quali il recupero è stato più lento. In alcuni pazienti con endocardite da S. aureus, sotto
terapia con vancomicina, è stata descritta la persistenza di S. aureus nelle emocolture. Questo
fatto può essere spiegato con un’attività batteriostatica della vancomicina contro i ceppi di S.
aureus, con una bassa capacità di diffusione dei glicopeptidi nelle vegetazioni endocardiche,
e con l’elevato numero di batteri presenti in queste infezioni (112).
Diversi studi suggeriscono che i ß-lattamici e la vancomicina agiscono in modo sinergico
nei confronti dei ceppi VISA. I dati ottenuti con modelli di endocardite nel coniglio da Climo
et al. (36) hanno dimostrato che maggiore era la MIC alla vancomicina più il ceppo era sensibile alla terapia associata dell’endocardite, e che la monoterapia con vancomicina non risultava adeguata per i ceppi VISA. Dati simili sulla sinergia fra ß-lattamici e vancomicina per i
ceppi VISA sono stati riportati da Sieradki et al (169). Tuttavia, l'esperienza accumulata nell’uomo e negli animali è troppo scarsa per arrivare a una conclusione circa la perdita di efficacia della vancomicina in tali infezioni, particolarmente se causate da ceppi hVISA. L’inefficacia dei metodi di laboratorio nel distinguere i ceppi di S. aureus sensibili con sottopopolazioni resistenti da quelli sensibili senza sottopopolazioni resistenti ostacola gli sforzi per chiarire l’efficacia della vancomicina nelle infezioni stafilococicche (178). Studi sull’attività della
vancomicina su tre ceppi clinici VISA in condizioni di basso ed elevato inoculo, analizzando
le curve di battericidia in fase di crescita stazionaria e logaritmica e determinando l’effetto
postantibiotico, hanno dimostrato che la diminuita suscettibilità alla vancomicina diminuisce
la velocità di uccisione da parte della vancomicina ma non influenza l’entità dell’uccisione né
l’effetto postantibiotico (1).
29
I ceppi VISA isolati negli USA sono risultati tutti sensibili al co-trimossazolo ed erano
anche sensibili ad altri antibiotici non saggiati di routine in laboratorio. MIC di 0,25-2 µg/ml
erano generalmente osservate per il quinupristin/dalfopristin, il linezolid e l’everninomicina.
(60) Occorre però considerare la possibilità che ceppi VISA diventino resistenti ai nuovi antibiotici. Diversi pazienti con infezioni da ceppi VISA isolati in USA e in Giappone hanno risposto a terapie alternative che comprendevano arbekacina e ampicillina-sulbactam, gentamicina, e co-trimossazolo (178).
Resistenza ai glicopeptidi degli stafilococchi coagulasi negativi (CNS)
I CNS sono stati i primi patogeni Gram-positivi in cui è stata riconosciuta una resistenza acquisita ai glicopeptidi: non solo molto prima che in S. aureus, ma anche prima
che negli enterococchi (18). Le prime resistenze, segnalate nel 1986 in Gran Bretagna
(203), riguardavano solo la teicoplanina (non la vancomicina) e solo una particolare specie di CNS, Staphylococcus haemolyticus. Questa associazione fra questa particolare specie stafilococcica e la resistenza alla teicoplanina fu ribadita subito dopo anche in Italia da
Arioli e Pallanza (7), che riportarono come, per 11 su 29 ceppi di S. haemolyticus, le MIC
della teicoplanina erano comprese tra 16 e 32 µg/ml mentre le MIC della vancomicina arrivavano al massimo a 8 µg/ml; nei CNS di altre specie le MIC della teicoplanina e della
vancomicina non superavano, rispettivamente, 4 e 2 µg/ml. Contemporaneamente, in un
paziente con una peritonite da S. haemolyticus, Schwalbe et al. (164) riportarono un progressivo incremento delle MIC della vancomicina da un valore iniziale di 2 µg/ml a un valore finale di 8 µg/ml durante tre mesi di trattamento con vancomicina; inoltre, gli autori
furono in grado di selezionare in vitro sottopopolazioni relativamente stabili altamente resistenti sia alla vancomicina che alla teicoplanina, che probabilmente spiegavano il fallimento della terapia con vancomicina in questo paziente.
Negli anni successivi, le MIC della teicoplanina nei confronti dei CNS mostrarono una
tendenza a distribuirsi su un range sempre più ampio e complessivamente a crescere (≥16
µg/ml), particolarmente in certi isolati meticillino-resistenti non solo di S. haemolyticus,
ma anche di Staphylococcus epidermidis, mentre le MIC della vancomicina tendevano a
rimanere più stabili, distribuite in un range più ristretto nei limiti della sensibilità (18).
Glicopeptido-resistenze in CNS di specie diverse da S. haemolyticus e S. epidermidis
sono state segnalate così eccezionalmente che l'effettiva esistenza di tali resistenze in altre
specie di CNS resta da confermare.
Più recentemente, Sieradzki et al. (170) hanno descritto un ceppo di S. epidermidis
meticillino-resistente, isolato da un paziente in dialisi peritoneale con episodi ricorrenti di
peritonite nel corso di profilassi e trattamento con vancomicina. L’analisi delle popolazioni ha mostrato profili eterogenei: mentre la MIC della vancomicina per la maggioranza
delle cellule era compresa fra 3 e 6 µg/ml, la coltura conteneva anche sottopopolazioni
con MIC più elevate, capaci di crescere su 25 µg/ml di vancomicina. In alcuni ospedali,
sembra in aumento l’isolamento di ceppi CNS meticillino-resistenti (essenzialmente di S.
haemolyticus o S. epidermidis) con sensibilità ridotta o eterogenea alla teicoplanina (167).
Particolare attenzione continua a meritare la specie S. haemolyticus, che è al secondo posto, dopo S. epidermidis, tra i ceppi CNS isolati in ospedale, ed è stato ritrovato altamente
prevalente nell'ambiente ospedaliero e sulle mani del personale sanitario (144).
Mediante la tecnica di analisi delle popolazioni, sia i ceppi di S. haemolyticus sia quelli di S. epidermidis con ridotta sensibilità alla teicoplanina dimostrano spesso una eterogeneità di sottopopolazioni.
Una eterogeneità fenotipica alla teicoplanina (ma non alla vancomicina) è stata dimostrata anche in ceppi storici di S. haemolyticus e S. epidermidis, isolati prima dell'introduzione della vancomicina nell'uso clinico (167): ciò suggerisce una predisposizione alla gli-
30
copeptido-resistenza intrinseca a queste specie. Biavasco et al. (17), in un recente studio
su ceppi di S. haemolyticus isolati da emocolture (alcuni sensibili e altri resistenti alla teicoplanina e tutti sensibili alla vancomicina in base alle MIC ottenute mediante microdiluizione in brodo), hanno dimostrato in questi ceppi, mediante l'analisi delle popolazioni,
profili di sensibilità molto variabili (omogenei o eterogenei) sia alla teicoplanina che alla
vancomicina.
La buona attività battericida dei glicopeptidi sui CNS sensibili è ben documentata
(18), con rapporti MBC/MIC di 1-2 per la maggior parte dei ceppi. In studi sulle cinetiche
di battericidia sia la vancomicina che la teicoplanina hanno mostrato attività battericida
nei confronti di cellule in fase di crescita, ma non di cellule a riposo, di S. epidermidis,
mentre hanno mostrato scarsa attività battericida nei confronti di S. haemolyticus (142).
È stata più recentemente segnalata l’emergenza di ceppi di S. epidermidis vancomicinotolleranti (150), ed è stato osservato che ceppi di S. epidermidis altamente sensibili alla
vancomicina in condizioni normali di saggio in vitro si comportano invece come tolleranti
all'interno di un biofilm (100). Si è discusso se questa tolleranza sia da attribuire ad una
scarsa penetrazione dell'antibiotico nel biofilm oppure ad una intrinsecamente minore risposta all'antibiotico del batterio quando si trovi nel biofilm.
Meccanismo di resistenza nei CNS
Come per S. aureus, la resistenza dei CNS ai glicopeptidi è endogena e può essere selezionata in vitro per esposizione alla vancomicina o alla teicoplanina, almeno in ceppi di
quelle specie (S. haemolyticus e S. epidermidis) che possono esprimere anche una resistenza clinica. Il meccanismo della resistenza ai glicopeptidi nei CNS resta sconosciuto, anche
se è lecito ritenere che vi siano diversi punti in comune con i meccanismi più estesamente
studiati in S. aureus (ceppi VISA e hVISA). Alcuni aspetti della resistenza ai glicopeptidi
che restano tuttora poco chiari per S. aureus lo sono a maggior ragione per i CNS: per
esempio, perché negli stafilococchi la resistenza ai glicopeptidi riguardi più la teicoplanina
che la vancomicina, o perché la resistenza possa esprimersi in modo sia omogeneo sia, più
spesso, eterogeneo (18).
Sono state tuttavia osservate numerose ed importanti differenze fra i CNS glicopeptidoresistenti e quelli glicopeptido-sensibili, riguardo alla morfologia e all'ultrastruttura, alla
capacità di legare e sequestrare i glicopeptidi, alle proteine di membrana, alla composizione della parete cellulare, alla sensbilità ad antibiotici (soprattutto ß-lattamici) e ad enzimi
(litici ed autolitici) attivi sulla parete (18,36,47,63,161,167).
Test di laboratorio per i CNS
La determinazione della glicopeptido-resistenza dei CNS in laboratorio è problematica
(18). I test di sensibilità, in particolare alla teicoplanina, sono influenzati da una varietà di
fattori tecnici, come il terreno, l’aggiunta di supplementi come sangue o siero, la dimensione dell’inoculo, il tempo di incubazione, il contenuto del dischetto nei test di diffusione (in
cui la scarsa capacità di diffusione in agar di molecole di grosse dimensioni quali i glicopeptidi può rendere difficile l'interpretazione degli aloni di inibizione, soprattutto con la
teicoplanina). La teicoplanina è più attiva della vancomicina nei confronti di inoculi bassi,
ma presenta un effetto inoculo più marcato. Una scarsa correlazione fra le MIC determinate
mediante test di diluizione e i diametri degli aloni di inibizione determinati mediante test di
diffusione (con questi ultimi che danno spesso false sensibilità) è stata documentata nei
CNS non solo per la teicoplanina, ma anche per la vancomicina.
In un recentissimo studio in Italia, su 59 laboratori partecipanti ai quali erano stati distribuiti (insieme ad altri ceppi) due ceppi di S. haemolyticus con sensibilità intermedia alla
vancomicina, solo il 28,8% dei laboratori per il primo ceppo e il 23,7% per il secondo cep-
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po sono stati capaci di rilevare la glicopeptido-resistenza: in particolare, non sono riusciti a
riscontrare la resistenza i laboratori che utilizzavano la tecnica di agar diffusione da dischetto e quelli che usavano una versione non aggiornata del software Vitek (93).
La capacità di un metodo di determinare sottopopolazioni eteroresistenti richiede che
l’inoculo sia sufficientemente alto per compensare la frequenza di espressione. È possibile
però che la frequenza delle sottopopolazioni con resistenza intermedia alla vancomicina diminuisca nelle sottocolture in rapporto alle sottopopolazioni che erano presenti in origine
nelle colture primarie (49). Inoltre, l'espressione per lo più eterogenea della resistenza ai
glicopeptidi, particolarmente in quelle specie di CNS più coinvolte nel problema, come S.
haemolyticus, suggerisce che i comuni test di sensibilità (come la determinazione convenzionale della MIC mediante test di diluizione, per non parlare dei test di diffusione) possono essere poco predittivi circa l'esito di una terapia con glicopeptidi (17).
Molto meglio che con le tecniche convenzionali (tipo NCCLS), i ceppi CNS con ridotta
suscettibilità ai glicopeptidi sono riconosciuti mediante l’Etest, incubato per 48 ore, che si
è dimostrato il metodo più sensibile nello studio della sensibilità e resistenza ai glicopeptidi
sia in S. aureus che nei CNS.
Infine, è bene ricordare che l'attendibilità dei dati di laboratorio sulla glicopeptido-resistenza di un ceppo CNS può essere molto influenzata dall'identificazione di laboratorio della specie CNS coinvolta. Attualmente, i vari sistemi commerciali forniscono a qualsiasi laboratorio la possibilità di identificare i CNS a livello di specie, ma gli errori di identificazione sono molto più frequenti di quanto si creda, e per di più passano inosservati. È pertanto consigliabile che i dati di laboratorio che indichino una glicopeptido-resistenza in un
ceppo CNS di specie diversa da S. haemolyticus e S. epidermidis siano confermati da un laboratorio di riferimento non solo riguardo all'effettiva resistenza, ma anche riguardo alla
correttezza dell'identificazione (18).
AMINOGLICOSIDI
Gli aminoglicosidi agiscono a livello della sintesi proteica, fissandosi irreversibilmente
ad una proteina della subunità 30S del ribosoma. In tal modo, interferendo con l'azione del
fattore di inizio IF-3, rendono instabile il complesso d'inizio (subunità 30S, mRNA, tRNA
per la formil-metionina) ostacolando l'avvio della sintesi della catena polipeptidica. Inoltre,
l'aminoglicoside altera il sito A della subunità ribosomiale 30S interferendo con il corretto
inserimento dell'aminoacil-tRNA. Ne consegue sia un'inibizione della sintesi proteica sia
un'errata lettura del codice genetico con incorporazione di aminoacidi sbagliati e accumulo
di proteine non funzionanti e tossiche che potrebbero contribuire all'azione tipicamente battericida di questi antibiotici (103).
Gli aminoglicosidi più attivi contro gli stafilococchi sono la gentamicina, la netilmicina
e la tobramicina. Non sono da utilizzare in monoterapia a causa della facilità di insorgenza
di resistenza, e devono quindi essere utilizzati in associazione con un altro antibiotico al
quale il batterio sia sensibile. In vitro, gli aminoglicosidi mostrano sinergia con la vancomicina, ma non è certo che la sinergia abbia luogo anche in vivo.
La prima segnalazione di un ceppo MRSA resistente anche alla gentamicina risale al
1969 (106); in seguito ceppi con tali caratteristiche divennero epidemici in Australia, Stati
Uniti ed Europa. Questi stafilococchi erano generalmente resistenti a numerosi altri antibiotici, compresi il trimetoprim e, più recentemente, la ciprofloxacina e la mupirocina. In
Europa, la multi-aminoglicosido-resistenza nei ceppi MRSA era intorno al 90% all’inizio
degli anni ’90 (192). Nel programma SENTRY (45), che nel 1997-1999 ha raccolto in tutto
il mondo oltre 4.700 MRSA, un’associazione fra meticillino- e gentamicino-resistenza è
stata osservata particolarmente nell'America Latina (91,2%), nelle aree del Pacifico Occidentale (74%) e in Europa (71,7%), contro percentuali nettamente inferiori negli Stati Uniti
(35,5%) e in Canada (25,9%). Nei ceppi MSSA, invece, la resistenza alla gentamicina è rara (fra lo 0,9% nel Pacifico Occidentale e il 4,7% in Europa). Su oltre 1.500 ceppi CNS
32
meticillino-resistenti isolati in Europa, il 51,8% erano anche resistenti alla gentamicina,
mentre lo erano solo l’8,3% degli oltre 550 ceppi CNS meticillino-sensibili.
In Francia, fra il 1992 e il 1994, si è assistito alla ricomparsa di ceppi MRSA sensibili
alla gentamicina (109), pare a causa del diffondersi di un clone di MRSA che ha perduto il
gene aac6’-aph2”, che conferisce la resistenza a tutti gli aminoglicosidi, con la conservazione del gene ant4’ che conferisce resistenza a kanamicina, tobramicina e amikacina, probabilmente per escissione o delezione del transposone Tn4001 (20). Esperimenti in vitro
hanno dimostrato che i ceppi di questo clone sensibili alla gentamicina si sviluppano meglio di quelli resistenti, suggerendo che il clone ha acquisito un vantaggio durante la sua evoluzione. Questo clone si caratterizza inoltre per la ricomparsa dell'eteroresistenza alla
meticillina.
Il principale meccanismo di resistenza agli aminoglicosidi negli stafilococchi è l’inattivazione dell’antibiotico da parte di enzimi cellulari che lo modificano e inattivano
(103,165). Tra i cocchi gram-positivi ci sono cinque tipi di enzimi che modificano gli aminoglicosidi (aminoglycoside-modifying enzimes, AME) tre dei quali, APH3(3’)-III, ANT
(4’)-I e AAC(6’)/APH(2”) hanno un particolare significato clinico poiché modificano gli aminoglicosidi di importanza terapeutica (56). Questi enzimi modificanti possono essere
plasmidici o cromosomici e spesso sono portati da transposoni.
La resistenza alla gentamicina e la concomitante resistenza a tobramicina e kanamicina
e, in minor misura, ad amikacina e netilmicina è mediata da un enzima bifunzionale 6’-acetiltransferasi 2”-fosfotransferasi-aminoglicoside AAC(6’)/APH(2”). Il gene che codifica
questo enzima, aac(6’)-Ie+aph(2”), è situato su un transposone composto, Tn4001. Gli elementi Tn4001 sono ampiamente distribuiti in S. aureus e CNS. Tn4001 è stato ritrovato
nei plasmidi della famiglia pSK1 (plasmidi coniugativi come pSK41), occasionalmente in
plasmidi di resistenza ß-lattamasi/metalli pesanti (come pSK23) e anche in vari siti cromosomici.
La resistenza a neomicina, kanamicina, tobramicina e amikacina è mediata dall’enzima
ANT(4’)-I codificato da ant(4’)-Ia. Questo gene con frequenza è portato da plasmidi di
piccole dimensioni, integrati in plasmidi coniugativi più grandi (come pSK41) e anche nella regione mec del cromosoma di alcuni ceppi MRSA.
La resistenza a neomicina e kanamicina è mediata dall’enzima APH(3’)-III. Il gene codificante aph(3’)-IIIa è portato dal transposone Tn5405, a localizzazione sia cromosomica
che plasmidica.
Test di laboratorio
Per determinare la resistenza a specifici aminoglicosidi sono stati utilizzati i profili di
suscettibilità ad aminoglicosidi selezionati. Tuttavia alcuni ceppi contengono più geni codificanti AME, sicché risulta difficile determinare il profilo di resistenza agli aminoglicosidi basandosi unicamente sul risultato dell’antibiogramma; un profilo di resistenza è spesso parzialmente duplicato, cioè la presenza di un profilo addizionale risulta mascherata.
L’NCCLS (138) indica come aminoglicoside da saggiare di routine con gli stafilococchi la gentamicina. I breakpoint della gentamicina sono riportati qui di seguito. Metodo di
diffusione in agar (dischetto da 10 µg, valori in mm): resistente, ≤12; intermedio, 13-14;
sensibile, ≥15. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤4; intermedio, 8;
resistente, ≥16.
I metodi genotipici (di ibridizzazione e di amplificazione del DNA mediante PCR) sono
metodi sensibili e specifici per determinare i geni che codificano gli AME. Nel 1994,
33
Vanhoof e coll. (187) hanno sviluppato un sistema di PCR per studiare i tre principali enzimi AME in 10 ospedali belgi. Il gene aac(6’)-Ie+aph(2”) è stato quello ritrovato con maggiore frequenza; la prevalenza del gene aph(3’)-IIIa risultava significativamente ridotta nel
periodo 1991-1992, mentre gene ant(4’)-Ia era ritrovato unicamente nello stesso periodo.
In uno studio più recente condotto utilizzando una PCR multiplex in 19 ospedali europei
(162), il gene di resistenza prevalente è stato aac(6’)-Ie+aph(2”), ritrovato nel 76% dei
ceppi MRSA, nel 50% degli MSSA, nel 67% dei CNS meticillino-resistenti e nel 32% dei
CNS meticillino-sensibili. Il gene meno frequente in S. aureus è stato aph(3’)-IIIa, osservato nel 7% degli MRSA e nel 13% degli MSSA, caratterizzato da una maggiore prevalenza nei CNS, nei quali era associato più coi ceppi meticillino-sensibili (50%) che con quelli
meticillino-resistenti (20%). Ida e coll (86) hanno studiato una PCR multiplex utilizzando
tre set di primer per specifici frammenti di DNA dei geni aph(3’)-IIIa, ant(4’)-Ia e aac(6’)Ie+aph(2”), che influenzano le MIC di gentamicina, tobramicina e lividomicina. I ceppi
senza alcuno dei tre geni erano sensibili a tutti e tre gli antibiotici. I ceppi con il gene
aph(3’)-IIIa erano resistenti alla lividomicina, quelli con ant(4’)-Ia alla tobramicina, e
quelli con aac(6’)-aph(2”) alla gentamicina e in minor misura alla tobramicina. I ceppi con
i geni ant(4’)-Ia e aac(6’)-Ie+aph(2”) erano anche resistenti alla tobramicina e in minor
misura alla gentamicina. In 381 ceppi MRSA isolati in Giappone, i geni ant(4’)-Ia,
aac(6’)-Ie+aph(2”) e aph(3’)-IIIa avevano rispettivamente una prevalenza dell’84,5%,
61,7% e 8,9%. Dei ceppi MRSA con geni ant(4’)-Ia e/o aac(6’)-Ie+aph(2”), il 97% erano
resistenti agli aminoglicosidi utilizzati nella pratica clinica. Tutti i ceppi con il gene
aph(3’)-IIIa hanno mostrato resistenza alla streptomicina che è inattivata solo da ANT(6)-I.
Inoltre, 24 ceppi (6,3%) erano resistenti all’arbekacina, un nuovo aminoglicoside derivato
dalla dibekacina, e solamente i ceppi con il gene aac(6’)-Ie+aph(2”) hanno mostrato
un’elevata resistenza alla gentamicina (MIC ≥512 µg/ml).
TETRACICLINE
Le tetracicline sono antibiotici inibitori della sintesi proteica che agiscono come batteriostatici legandosi alla subunità ribosomica 30S. Penetrano nella cellula batterica probabilmente mediante diffusione passiva. La minociclina, che appare battericida per alcuni ceppi, è stata
suggerita per la terapia di infezioni causate da ceppi MRSA tetraciclino-sensibili (210).
La resistenza alla tetraciclina è in genere plasmidica e in S. aureus è spesso associata
alla resistenza alla meticillina. Negli oltre 4.700 MRSA raccolti nel 1997-1999 per il progetto SENTRY (45), l’associazione con la tetraciclino-resistenza era particolarmente elevata nelle aree del Pacifico Occidentale (82%), nell'America Latina (63,8%) e in Europa
(57,2%) rispetto agli Stati Uniti (15,6%) e al Canada (14,8%). La tetraciclino-resistenza era
invece assai più bassa nei ceppi MSSA, con un massimo di incidenza in Europa (15,8%) e
un minimo negli Stati Uniti (1,7%).
Vi sono essenzialmente due meccanismi di resistenza degli stafilococchi alle tetracicline:
la resistenza da efflusso attivo del farmaco ad opera di pompe cellulari, e la resistenza da protezione ribosomiale, dovuta cioè a proteine citoplasmiche capaci di interagire col ribosoma
rendendolo insensibile all’azione inibente del farmaco (35,128). Le proteine coinvolte nell’eflusso, codificate dai geni tetK e tetL, conferiscono resistenza alla tetraciclina ma non alla minociclina. Le proteine responsabili della protezione ribosomiale, codificate da una varietà di
geni come tetM, tetO, tetB(P), tetQ, tetS, tetT, tetW e OtrA, conferiscono resistenza a tetraciclina, doxiciclina e minociclina. Il gene tetX è l’unico che codifica un enzima che inattiva le
tetracicline, ma non se ne conosce ancora la prevalenza né il significato clinico.
34
Test di laboratorio
L’NCCLS (138) considera la tetraciclina, nei test di sensibilità degli stafilococchi, come rappresentativa di tutte le tetracicline, sicché i relativi risultati possono essere applicati
a doxiciclina e minociclina. In realtà, la doxiciclina e la minociclina possono essere saggiati al posto di o in aggiunta a tetraciclina. Alcuni ceppi sono però più sensibili a doxiciclina
e minociclina che a tetraciclina. I breakpoint della tetraciclina sono riportati qui di seguito.
Metodo di diffusione in agar (dischetto da 30 µg, valori in mm): resistente, ≤14; intermedio, 15-18; sensibile, ≥19. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤4;
intermedio, 8; resistente, ≥16.
La tecnica standard per determinare, a scopo diagnostico o epidemiologico, le diverse
classi di determinanti della resistenza alla tetraciclina è l’ibridizzazione con sonde a DNA,
ma la PCR è di fatto oggi più usata. Generalmente c’è una buona correlazione tra la determinazione della MIC e la presenza di geni tet. In un recente studio su 66 ceppi MRSA (182), lo
screening mediante PCR della presenza di quattro determinanti di resistenza (tetK, tetL, tetM
e tetO) e il confronto con le MIC di tetraciclina, doxiciclina e minociclina ha evidenziato che
tutti i ceppi portatori di tetM erano resistenti a tetraciclina e minociclina. Le MIC erano più elevate per i ceppi portatori sia di tetM che di tetK rispetto ai ceppi portatori di un solo gene.
MACROLIDI, LINCOSAMIDI E STREPTOGRAMINE
Gli stafilococchi sono naturalmente sensibili a macrolidi, lincosamidi e streptogramine,
ma i fenomeni di resistenza acquisita sono oggi assai diffusi.
I macrolidi, le licosamidi e le streptogramine sono antibiotici chimicamente distinti che
però sono spesso considerati insieme (antibiotici MLS) poiché inibiscono la sintesi proteica
fissandosi in punti molto vicini della subunità ribosomiale 50S. Ne derivano caratteristici
fenomeni di co-resistenza, per cui una stessa modificazione del bersaglio può portare a una
resistenza che coinvolge contemporaneamente queste diverse classi di farmaci (p. es. il fenotipo di resistenza MLSB che riguarda macrolidi, lincosamidi e streptogramine di tipo B).
I macrolidi sono costituiti da un anello macrolattonico che può essere di 14 atomi (p. es. eritromicina, claritromicina), di 15 atomi (le azalidi come l’azitromicina) o di 16 atomi (p.
es. josamicina, rokitamicina). Una recente variante dei macrolidi a 14 atomi è rappresentata
dai ketolidi (capostipite è la telitromicina), che sono più stabili in ambiente acido e in genere non agiscono come induttori della resistenza nei cocchi Gram-positivi. Le lincosamidi
comprendono essenzialmente la lincomicina e la clindamicina. Esistono due tipi di streptogramine, A e B. Un’associazione di una streptogramina di tipo B (quinupristin) e di una
streptogramina di tipo A (dalfopristin) in una proporzione di 3 a 7 è stata recentemente
messa in commercio col nome di Synercid®: contrariamente ai macrolidi, l’effetto sinergico
delle due streptogramine è battericida per gli stafilococchi, ma è batteriostatico per i ceppi
MRSA resistenti alla clindamicina. Come già detto, la resistenza degli stafilococchi agli antibiotici MLS è oggi molto diffusa, anche se i dati a disposizione riguardano soprattutto macrolidi, lincosamidi e quinupristin/dalfopristin, molto meno le singole streptogramine data la
grande difficoltà di disporre di singole molecole di tipo A o B per studi in vitro. Negli oltre
4.700 ceppi MRSA raccolti nel 1997-1999 per il progetto SENTRY (45), è stata osservata in
tutto il mondo un’elevata resistenza all’eritromicina (75,3%-93%) e alla clindamicina (63%88%). Nei ceppi MSSA le percentuali di resistenza erano invece meno elevate sia per l’eritromicina (21,5%-42,7%) che per la clindamicina (2,8%-14%). In uno studio condotto negli Stati Uniti nel 2000-2001 su quasi un migliaio di ceppi di S. aureus e più o meno altrettanti
CNS, la resistenza a quinupristin/dalfopristin è stata dello 0,5% in entrambi i gruppi (21). In
uno studio europeo, la sensibilità a quinupristin/dalfopristin è stata dal 99,5% nei ceppi MSSA e del 95,3% nei ceppi MRSA (57). Il quinupristin/dalfopristin si è dimostrato l’antibiotico
più attivo contro i ceppi VISA, anche in confronto con altri nuovi farmaci anti-Gram-positivi
come il linezolid (un oxazolidinone) e la daptomicina (un lipopeptide) (157). L’associazione
35
di quinupristin/dalfopristin con vancomicina ha un effetto sinergico e può essere più efficace
nella terapia delle infezioni da MRSA rispetto al trattamento coi singoli antibiotici (66).
La resistenza acquisita agli antibiotici MLS può realizzarsi negli stafilococchi attraverso
tre diversi meccanismi: modificazione del bersaglio, efflusso attivo e inattivazione dell’antibiotico (107,195). La modificazione del bersaglio è il meccanismo più diffuso. Modificazioni
post-trascrizionali dell’rRNA 23S ad opera di metilasi, enzimi che introducono un gruppo
metilico in una determinata adenina dell’rRNA 23S, modificano il bersaglio degli antibiotici
MLS in modo che questi non sono più in grado di legarvisi. Almeno quattro diverse metilasi,
tutte a codificazione plasmidica, sono state individuate negli stafilococchi. I geni che codificano queste metilasi sono stati denominati, come classe, geni erm (erythromycin resistance
methylase). La co-resistenza agli antibiotici MLS prodotta dalle metilasi codificate dai geni
erm non riguarda le streptogramine di tipo A (fenotipo MLSB); proprio per la presenza di una
streptogramina di tipo A, il quinupristin/dalfopristin mantiene la sua attività anche nei confronti dei ceppi con resistenza MLSB. L’espressione della resistenza MLSB può essere costitutiva o inducibile. Quando l’espressione è costitutiva i ceppi sono resistenti a tutti gli antibiotici MLS, compreso il quinupristin/dalfopristin. Quando l’espressione è inducibile, i ceppi
sono invece resistenti ai macrolidi a 14 e 15 atomi, ma restano sensibili ai macrolidi a 16 atomi, ai ketolidi, alle lincosamidi e alle streptogramine. Ciò dipende dal fatto che negli stafilococchi, a differenza di altri cocchi Gram-positivi, c’è infatti una sorta di dissociazione fra i
macrolidi a 14 e 15 atomi, che sono induttori, e gli altri antibiotici MLS, che non lo sono.
Finora, le uniche proteine di efflusso, che conferiscono una resistenza acquisita ai macrolidi negli stafilococchi, sono ABC transporters codificate da geni msr(A), portati da plasmidi. I geni msr conferiscono resistenza inducibile a macrolidi e streptogramina B (fenotipo MSB); in S. aureus ne sono state descritte due varietà, msrA e msrB. Sono induttori l’eritromicina e i macrolidi a 14 e 15 atomi, mentre non lo sono le streptogramine B. La clindamicina, non essendo né induttore né un substrato per la pompa, rimane pienamente attiva
(Tabella 5). Inoltre negli stafilococchi sono stati identificati due sistemi di efflusso, che
conferiscono resistenza alla streptogramina A, codificati dai geni vgaA e vgaB.
Stafilococchi
Eritromicina S
Eritromicina R
Lincomicina/
Clindamicina S
Lincomicina R
Clindamicina S
Lincomicina/
Clindamicina R
Lincomicina/
Clindamicina S
(antagonismo)
Lincomicina/
Clindamicina S
(non antagonismo)
Suscettibile
L o errore
(ritestare)
MLSB
costitutiva
MLSB
inducibile
MSB
Genotipo dedotto Nessuno
lnu(A)
erm
erm
msr(A)
Implicazioni
terapautiche
Non usare
Lincomicina.
Utilizzare
clindamicina
(probabilmente
non sicura)
Non utilizzare
Non utilizzare
Non utilizzare
nessun macrolide macrolidi
macrolidi
a 14 e 15 atomi. a 14 e 15 atomi.
Uso di macrolidi
a 16 atomi
e clindamicina
non sicuro
Fenotipo
Nessuna
Tabella 5. – Determinazione della resistenza ai macrolidi e lincosamide negli stafilococchi. I fenotipi di resistenza sono
stati identificati sulla base dei test di suscettibilità all’eritromicina e clindamicina o lincomicina e sulla base delle implicazioni cliniche. L, lincosamide; MSB, macrolidi e streptogramine B; R, resistente; S, sensibile (107).
36
Un secondo meccanismo di resistenza al componente B è l’idrolisi del farmaco ad opera di una lattonasi codificata dai geni vgbA e vgbB, rispettivamente. L’inattivazione di macrolidi da parte di enzimi tipo fosfotransferasi, codificate da geni mph(C), o idrolasi è in generale un meccanismo poco frequente, ma descritto negli stafilococchi. Sono stati anche identificati enzimi inattivanti la lincomicina, lincosamide nucleotiltransferasi, codificati dal gene lnuA (prima denominato linA), nel 1%-7% dei ceppi CNS e in <1% dei ceppi di S. aureus. Questo gene conferisce una
resistenza franca alla lincomicina, mentre la clindamicina rimane attiva, con MIC aumentate solamente di una o due diluizioni, ma con l’abolizione completa dell’attività battericida. Inoltre, sono stati identificati enzimi capaci di inattivare per acetilazione le streptogramine di tipo A (e
quindi il componente A del quinupristin/dalfopristin), codificati dai geni vatA, vatB e vatC.
Epidemiologia molecolare della resistenza MLS
Un recente studio di prevalenza europeo (163) condotto al fine di individuare i geni di resistenza ai macrolidi nei ceppi di S. aureus (358 MSSA e 493 MRSA), studiati mediante multiplex PCR, ha evidenziato che il gene di resistenza prevalente era ermA (67%), seguito da ermC
(23%) e mrsA/B (6%). Il gene ereB, che codifica un enzima inattivante i macrolidi, e il gene
ermB erano presenti solo nello 0,6% dei ceppi resistenti all’eritromicina. In particolare, il gene
ermA era più frequente nei ceppi MRSA (88%) che negli MSSA (38%) ed era predominante nei
ceppi con resistenza MLSB costitutiva, mentre il gene ermC era più frequente nei ceppi MSSA
(27%) che negli MRSA (5%) ed era predominante nei ceppi con resistenza MLSB inducibile.
Negli Stati Uniti (140), il gene ermA era l’unico responsabile della resistenza all’eritromicina in S. aureus fino al 1971. Il gene ermC è comparso successivamente ed è diventato prevalente nella popolazione americana. Il gene ereB è stato trovato solo nell’1% dei ceppi MRSA con fenotipo costitutivo di resistenza MLSB (163). La resistenza da efflusso mediata dai
geni msrA/B è stata osservata solo nei ceppi MSSA (13%). Nei CNS è stata osservata una
prevalenza del gene ermC, sia nei ceppi meticillino-resistenti che in quelli meticillino-sensibili, seguito dal gene ermA. L’incidenza di stafilococchi con resistenza isolata alla lincomicina è bassa: solo 1 ceppo su 144 di S. aureus e 7 su 150 CNS possedevano il gene linA/linA’
(111). Lo studio, in aree del Pacifico Occidentale, di 70 ceppi di S. aureus con un pattern di
resistenza ai macrolidi e sensibilità alla clindamicina ha permesso di individuare una prevalenza complessiva di ermC nei ceppi MSSA e di ermA nei ceppi MRSA, ma con una grande
variabilità a seconda delle regioni di provenienza (13).
Quanto alle streptogramine, Lina e coll. (111) osservarono resistenza a quinupristin-dalfopristin e a pristinamicina in 10 ceppi su 144 di S. aureus e in 3 su 150 CNS. Tale resistenza,
costantemente associata alla resistenza alle streptogramine di tipo A codificata dai geni vatA o
vatB, era sempre combinata alla presenza di geni erm, risultando in una resistenza MLSB più
una resistenza alla streptogramina A. Il gene vgaA, che conferisce una ridotta sensibilità alla
streptogramina A attraverso un meccanismo di efflusso, era presente solo in 3 ceppi CNS.
In uno studio di sorveglianza in 24 paesi europei (progetto SENTRY) con 3.052 ceppi di
S. aureus raccolti nel 1997-98, sono stati trovati 35 (1,1%) ceppi resistenti al quinupristin/dalfopristin (MIC, ≥2 µg/ml), dei quali 33 erano MRSA con varie resistenze ad altre classi di antibiotici. Questi ceppi provenivano da quattro ospedali francesi e uno spagnolo. In particolare, un ceppo isolato da un ospedale di Lione e 22 da un ospedale di Lille presentavano il
genotipo di resistenza alla streptogramina A vatB vgaB e possedevano ermA e/o ermC. Venti
dei ceppi di S. aureus isolati a Lille rappresentavano un cluster che era anche hGISA. In un
altro ceppo quinupristin/dalfopristin-resistente erano presenti i geni vatA (che codifica una acetiltransferasi che inattiva la streptogramina A) e vgbA (che codifica una lattonasi che inattiva la streptogramina B). In altri ceppi la resistenza alla combinazione di streptogramina A e
streptogramina B si basa sull’inattivazione per acetilazione o sull’eflusso.
I ceppi di S. aureus che possiedono geni erm costitutivamente espressi, non sono ancora
resistenti al quinupristin/dalfopristin: la resistenza richiede la presenza di meccanismi capaci
di conferire resistenza ad ambedue le componenti, A e B, come si deduce dalla perdita isolata
37
della resistenza a streptogramina A o a streptogramina B in alcuni ceppi (200). La prevenzione dell’ulteriore disseminazione dei geni di resistenza alla streptogramina A richiede una determinazione precoce nella routine batteriologica. Questo può rappresentare un problema
quando le due molecole siano saggiate in combinazione. Sarebbe auspicabile, come è stato
suggerito (2), saggiare il dalfopristin separatamente.
Test di laboratorio
Con riferimento ai più recenti dati dell’NCCLS (138), i breakpoint dell’eritromicina sono
riportati di seguito. Metodo di diffusione in agar (dischetto da 15 µg, valori in mm): resistente, ≤13; intermedio, 14-22; sensibile, ≥23. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml):
sensibile, ≤0,5; intermedio, 1-4; resistente, ≥8.
Per lo studio della sensibilità alle lincosamidi si fa riferimento alla clindamicina, i cui
breakpoint sono qui riportati. Metodo di diffusione in agar (dischetto da 2 µg, valori in mm):
resistente, ≤14; intermedio, 15-20; sensibile, ≥21. Metodo di diluizione in brodo (valori in
µg/ml): sensibile, ≤0,5; intermedio, 1-2; resistente, ≥4.
Sono infine riportati i breakpoint del quinupristin-dalfopristin. Metodo di diffusione in agar (dischetto da 15 µg, valori in mm): resistente, ≤15; intermedio, 16-18; sensibile, ≥19. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤1; intermedio, 2; resistente, ≥4.
E’ possibile osservare l’espressione della resistenza MLSB con il metodo di diffusione in
agar, collocando il disco di eritromicina vicino a quello di clindamicina.Si osserva una zona
di inibizione a forma di “D”, causata dall’induzione della produzione di metilasi da parte dell’eritromicina. Utilizzando la stessa tecnica in caso di resistenza per meccanismo di efflusso,
si osserva la mancanza di interazione tra eritromicina e clindamicina. La resistenza dissociata
tra le lincosamide, dovuta alla presenza di geni lnu(A), è possibile osservarla utilizzando unicamente il disco di lincomicina e non quello di clindamicina.
FLUOROCHINOLONI
I fluorochinoloni degli anni '80 (ciprofloxacina, ofloxacina) presentano un’attività antistafilococcica, e con questo fine possono anche essere utilizzati in terapia, sulla scorta di idonee indicazioni da parte del laboratorio. Un altro farmaco di questa generazione che proprio in questo
periodo sta per essere introdotto sul mercato italiano è la prulifloxacina, un profarmaco che dopo l'introduzione orale e l'assorbimento intestinale si trasforma in ulifloxacina, la forma microbiologicamente attiva (132). Questi farmaci restano però generalmente più attivi sui Gram-negativi, e per quanto riguarda in particolare gli stafilococchi sono di solito pochissimo attivi sui
ceppi meticillino-resistenti. Fluorochinoloni molto più attivi sui Gram-positivi (soprattutto sugli pneumococchi, ma anche sugli stafilococchi, compresa buona parte dei meticillino-resistenti) sono stati sviluppati negli anni '90 (147). Sebbene alcuni di questi nuovi fluorochinoloni abbiano dimostrato inaspettati problemi di tossicità, talora al punto di dover essere tolti dal mercato (77), altri (levofloxacina, gatifloxacina, moxifloxacina) sono più o meno largamente impiegati nalla pratica clinica. Un limite comune a tutti i chinoloni è la facilità e rapidità con cui
si sviluppano resistenze già in corso di terapia, per cui si tende a non usarli in monoterapia, preferendo usarli in associazione. I fluorochinoloni hanno effetto battericida. Agiscono come inibitori della DNA girasi, una topoisomerasi che è l'unico enzima di cui i batteri dispongono per
stabilire e mantenere il superavvolgimento negativo del cromosoma batterico. Un'altra topoisomerasi, la topoisomerasi IV, responsabile della separazione delle eliche figlie del DNA durante
la divisione cellulare, era in precedenza considerata come un target secondario per i fluorochinoloni, ma rappresenta in realtà un target primario per alcuni Gram-positivi, come gli pneumococchi e forse anche gli stafilococchi (77). Le topoisomerasi sono enzimi eterotetramerici composti da due subunità A e due subunità B, in cui i due elementi di ogni coppia sono destinati a
prendere contatto con le due eliche del DNA. Le due subunità A e le due subunità B sono codi-
38
ficate, nel caso della DNA girasi, dai geni gyrA e gyrB, e nel caso della topoisomerasi IV dai
geni parC e parE (Streptococcus pneumoniae) oppure grlA e grlB (S. aureus).
Nel 1997-1999, il programma SENTRY (45) ha evidenziato nei ceppi MRSA un’associazione con la resistenza alla ciprofloxacina che variava dal 60,5% in Canada al 90% circa nel
resto del mondo. In Europa la resistenza alla ciprofloxacina è stata dell'89,5% nei ceppi MRSA contro l'8,4% dei ceppi MSSA; la resistenza alla gatifloxacina era invece del 3,7% negli
MRSA e dello 0,4% negli MSSA. Sempre in Europa, la resistenza alla ciprofloxacina dei
ceppi CNS meticillino-resistenti era del 50,5% contro il 10,1% di quelli meticillino-sensibili,
mentre le percentuali per la gatifloxacina erano rispettivamente del 2,2% e dello 0,7%.
Meccanismo di resistenza
La resistenza degli stafilococchi ai fluorochinoloni può avvenire anzitutto per alterazione
degli enzimi bersaglio. Una mutazione puntiforme del gene grlA può produrre livelli clinicamente significativi di resistenza; livelli ancora superiori sono associati con ulteriori mutazioni
della subunità A della girasi. La resistenza può anche dipendere da alterazioni della permeabilità all’antibiotico. Infine, è stato anche segnalato in Gram-positivi e Gram-negativi un
meccanismo di efflusso con resistenza a basso livello, che però non è stato ancora approfondito per quanto riguarda gli stafilococchi. Negli stafilococchi, la resistenza ai fluorochinoloni
è spesso associata con la meticillino-resistenza; nel caso di sensibilità sia a fluorochinoloni
che a rifampicina, l’associazione di questi due antibiotici può essere efficace per la terapia di
infezioni stafilococciche gravi (31).
Test di laboratorio
Lo studio genetico della resistenza ai chinoloni è essenzialmente limitato a ricerche di base o epidemiologiche. Per determinare le alterazioni degli enzimi bersaglio sono state impiegate tecniche di sequenziamento e di amplificazione. Altre metodi comprendono il singlestranded conformation polymorphism per determinare la presenza di mutazioni puntiformi
nel gene gyrA, o la combinazione con altri sistemi per determinare i geni grlA e gyrA. (56)
I breakpoint della ciprofloxacina sono riportati qui di seguito. Metodo di diffusione in agar (dischetto da 5 µg, valori in mm): resistente, ≤15; intermedio, 16-20; sensibile, ≥21. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤1; intermedio, 2; resistente, ≥4. I
breakpoint degli altri fluorochinoloni sono diversi da quelli della ciprofloxacina (Tabella 4).
Si raccomanda di controllare la sensibilità ai fluorochinoloni durante la terapia, poiché i ceppi
sensibili possono diventare resistenti dopo 3-4 giorni dall’inizio del trattamento.
Antibiotico
Contenuto del dischetto
Breakpoint
Diametro (mm)
Ciprofloxacina
Levofloxacina
Ofloxacina
Gatifloxacina
Lomefloxacina
Norfloxacina
Enoxacina
Grepafloxacina
Sparfloxacina
Fleroxacina
MIC (µg/ml)
µ
R
I
S
R
S
5 µg
5 µg
5 µg
5 µg
10 µg
10 µg
10 µg
5 µg
5 µg
5 µg
≤ 15
≤ 13
≤ 12
≤ 14
≤ 18
≤ 12
≤ 14
≤ 14
≤ 15
≤ 15
16-20
14-16
13-15
15-17
19-21
13-16
15-17
15-17
16-18
16-18
≥ 21
≥ 17
≥ 16
≥ 18
≥ 22
≥ 17
≥ 18
≥ 18
≥ 19
≥ 19
≥4
≥8
≥8
≥8
≥8
≥ 16
≥8
≥4
≥2
≥8
≤1
≤2
≤2
≤2
≤2
≤4
≤2
≤1
≤ 0,5
≤2
Tabella 6. - Interpretazione della sensibilità degli stafilococchi ai fluorochinoloni (NCCLS 02) (138).
39
CO-TRIMOSSAZOLO
Il co-trimossazolo è un'associazione di un sulfamidico (il sulfametossazolo) con un derivato pirimidinico (il trimetoprim). Sia i sulfamidici sia i derivati pirimidinici sono attivi
sulla stessa via metabolica, che è quella della sintesi dell'acido folico. I sulfamidici interferiscono con la prima reazione del processo, che consiste normalmente nella reazione della
pteridina col p-aminobenzoato catalizzata dall'enzima diidropteroato-sintetasi (DHPS),
agendo competitivamente come analoghi strutturali di quest'ultimo. I derivati pirimidinici
interferiscono con l'ultima reazione del processo, che consiste nella riduzione del diidrofolato a tetraidrofolato, agendo come inibitori dell'enzima diidrofolato-reduttasi (DHFR).
Il fatto che il sulfametossazolo e il trimetoprim agiscano su una stessa via metabolica favorisce un cospicuo potenziamento fra i due farmaci, che altresì si proteggono l'un l’altro dallo sviluppo di resistenze. Mentre ognuno dei due farmaci ha attività batteriostatica a concentrazione terapeutica, la combinazione può dimostrare in vitro un effetto battericida. Nonostante si tratti di un vecchio farmaco, il co-trimossazolo può rivelarsi utile nelle infezioni
stafilococciche che non rispondono alla vancomicina.
Nel 1997-1999, il programma SENTRY (45) ha evidenziato nei ceppi MRSA un’associazione con la resistenza al co-trimossazolo molto variabile (dal 16% in Canada al 23% in
Europa, al 65% in America Latina), che riflette probabilmente la diversa diffusione dei cloni di MRSA. In Europa, in particolare, predomina il clone denominato Iberico che è sensibile al co-trimossazolo. Sempre in Europa, la resistenza al co-trimossazolo dei ceppi MSSA è stata solo del 2%.
Meccanismo di resistenza
La resistenza può essere causata da meccanismi diversi (149): produzione di una DHPS
più specifica, insensibile all'inibizione competitiva del sulfamidico; iperproduzione da parte dei batteri di p-aminobenzoato; iperproduzione di DHFR; mutazioni del gene strutturale
della DHFR; acquisizione di un gene (dfr) che codifica una DHFR resistente all'azione del
derivato pirimidinico. La resistenza al co-trimossazolo è molto diffusa negli stafilococchi e
può essere sia cromosomica sia plasmidica.
Test di laboratorio
Negli studi di sensibilità in vitro al co-trimossazolo, trimetoprim/sulfametossazolo sono
impiegati in combinazione nella proporzione 5%/95%. I breakpoint del co-trimossazolo sono riportati qui di seguito (138). Metodo di diffusione in agar (dischetto da 1,25/23,75 µg,
valori in mm): resistente, ≤10; intermedio, 11-15; sensibile, ≥16. Metodo di diluizione in
brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤2/38; resistente, ≥4/76.
Lo studio genetico della resistenza al co-trimossazolo è ancora poco sviluppato e unicamente utilizzato a scopo epidemiologico.
OXAZOLIDINONI
Gli oxazolidinoni sono una nuova classe di antibiotici completamente di sintesi, con uno spettro d’azione essenzialmente limitato ai batteri Gram-positivi. Gli oxazolidinoni inibiscono l’inizio della sintesi proteica con un meccanismo unico, legandosi alla subunità ribosomiale 50S in prossimità dell’interfaccia con la subunità 30S. L’unicità del meccanismo
d’azione è alla base dell’assenza di resistenze crociate con altri inibitori della sintesi proteica. Il linezolid, il primo antibiotico di questa nuova classe, ha azione batteriostatica sugli
40
stafilococchi e sulla maggior parte dei batteri sensibili, ma può risultare battericida nei confronti di alcune specie fra cui gli pneumococchi. Il linezolid, che si avvale anche di eccellenti proprietà farmacologiche (ottima biodisponibilità, eccellente concentrazione plasmatica dopo somministrazione sia orale sia endovenosa) deve molto della sua attuale considerazione alla sua attività nei confronti di cocchi Gram-positivi estremamente difficili a livello
clinico come lo pneumococco resistente alla penicillina, l’enterococco resistente alla vancomicina, lo stafilococco aureo resistente alla meticillina e alla vancomicina.
In studi multicentrici europei e americani (57,62,95,134) nessun ceppo di stafilococco è
risultato resistente al linezolid, né lo è risultato alcun batterio Gram-positivo isolato in reparti di rianimazione in Inghilterra (92). Il primo e finora unico caso di resistenza al linezolid descritto negli stafilococchi è stato riscontrato in un paziente con peritonite da MRSA
che, dopo trattamento, presentava una MIC di linezolid >32 µg/ml (183).
In uno studio europeo (62), il linezolid ha mostrato valori di MIC90 di 2-4 µg/ml, paragonabili a quelli della vancomicina, nei confronti di ceppi MRSA, di ceppi CNS meticillino-resistenti, e di stafilococchi meticillino-sensibili.
Lo S. aureus richiede molto tempo per diventare resistente al linezolid poiché, a differenza degli enterococchi, contiene 5 copie del target (dominio V rRNA). In uno studio
comparativo tra la microdiluizione in brodo secondo l’NCCLS e l’Etest è stato osservato
che le MIC del linezolid con l’Etest hanno generalmente un valore di una o due diluizioni
inferiore rispetto a quello con la microdiluizione (184).
Questa differenza fra le due metodiche si può spiegare col fatto che la lettura con l’Etest del linezolid, che ha un’attività batteriostatica sugli stafilococchi, va effettuata all’8090% dell’inibizione della crescita, mentre nei terreni liquidi va eseguita ad inibizione completa.
I breakpoint del linezolid sono previsti solo per la sensibilità, data la sostanziale inesistenza, finora, di resistenze acquisite, la qual cosa impedisce una definizione attendibile
delle altre categorie (138). I breakpoint del linezolid sono dunque attualmente come qui di
seguito riportato. Metodo di diffusione in agar (dischetto da 30 µg, valori in mm): sensibile, ≥21. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤4.
RIFAMPICINA
La rifampicina, un antibiotico semisintetico della famiglia delle rifamicine scoperto in
Italia (nei laboratori della Lepetit) negli anni ’60, ha come bersaglio la subunità ß della RNA-polimerasi batterica (194). Poiché l’RNA-polimerasi è necessaria sia per la trascrizione
sia per l’inizio della replica del DNA, la rifampicina è un antibiotico bifunzionale e come
tale è particolarmente efficace, con effetto battericida, nei connfronti della maggior parte
dei batteri.
Nei confronti degli stafilococchi, la rifampicina è, in termini di concentrazioni efficaci,
uno degli antibiotici in assoluto più potenti. In associazione con la vancomicina costituisce
una delle combinazioni più usate (secondo molti la combinazione elettiva, nonostante alcuni pareri contrastanti) nelle endocarditi protesiche stafilococciche e in altre infezioni associate a protesi e nelle osteomieliti (31). In ogni caso, la rifampicina deve sempre essere usata in associazione ad altri antibiotici, perchè se usata in monoterapia si sviluppano facilmente e rapidamente resistenze anche elevate in seguito a mutazioni puntiformi nella subunità ß della RNA polimerasi.
Negli stafilococchi del progetto SENTRY (45), la resistenza alla rifampicina era variabile nei ceppi MRSA (dal 4,9% in Canada al 7,7% degli USA, al 44,4% in Europa), mentre
bassi tassi di resistenza erano di regola osservati nei ceppi MSSA (2,2% in Europa).
I breakpoint della rifampicina sono di seguito riportati (138). Metodo di diffusione in agar (dischetto da 5 µg, valori in mm): resistente, ≤16; intermedio, 17-19; sensibile, ≥20.
Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤1; intermedio, 2; resistente, ≥4.
41
FOSFOMICINA
La fosfomicina è un antibiotico naturale prodotto da Streptomyces fradiae. Agisce sulla
sintesi della parete inibendo la piruvil-transferasi, enzima responsabile della prima tappa
nella sintesi del peptidoglicano. Esercita un rapido effetto battericida su batteri in fase di
sviluppo. È attiva contro S. aureus e S. epidermidis, compresi i ceppi produttori di ß-lattamasi, e spesso anche sui ceppi meticillino-resistenti.
Alcuni aspetti della sua attività antistafilococcica risentono di elementi specie-specifici:
p. es. è poco attiva su S. saprophyticus. I dati in vitro suggeriscono un considerevole potenziale antistafilococcico della fosfomicina, soprattutto se usata in associazione con linezolid
o quinupristin/dalfopristin (65), oppure con imipenem con cui presenta un alto grado di sinergismo (41). Una condizione di antagonismo è stata invece osservata in vitro per la sua
associazione con vancomicina (65). Per poter penetrare all’interno della cellula batterica, la
fosfomicina deve utilizzare il sistema di trasporto degli L-glicerofosfati, la cui carenza è una frequente causa di resistenza; in questo caso può però utilizzare il sistema di trasporto
degli esosi-6-fosfati, la cui presenza è indotta dal glucosio-6-fosfato: l’attività della fosfomicina dipende allora dalla presenza di questa sostanza nel terreno.
L’NCCLS non contempla la fosfomicina che invece è considerata dalla Società Francese di Microbiologia (38). Metodo di diffusione in agar (dischetto da 50 µg, valori in mm):
resistente, ≤14; sensibile, >14. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile,
≤32; resistente, >32. I diametri per la fosfomicina con il ceppo utilizzato come controllo di
qualità, S. aureus ATCC 25923, devono essere compresi tra 28,5 e 34,5 mm.
ACIDO FUSIDICO
L’acido fusidico è un antibiotico a struttura chimica steroidea, che agisce come inibitore della sintesi proteica, verosimilmente in uno degli stadi finali della sintesi della catena
polipeptidica, legandosi al fattore di allungamento G (EF-G). È attivo in vitro ed in vivo
contro i ceppi stafilococcici meticillino-sensibili e meticillino-resistenti. La resistenza avviene per mutazione cromosomica, con una frequenza di circa 1 su 10 (6) cellule batteriche. La resistenza si sviluppa facilmente se il farmaco è usato in monoterapia, per cui si
somministra in genere in associazione con un secondo antibiotico al quale il ceppo sia sensibile.
L’NCCLS non contempla l'acido fusidico che invece è considerato dalla Società Francese di Microbiologia (38), che indica i breakpoint di seguito riportati (http://www.sfm.asso.fr). Metodo di diffusione in agar (dischetto da 10 µg, valori in mm): resistente, <15; sensibile, ≥22. Metodo di diluizione in brodo (valori in µg/ml): sensibile, ≤2; resistente, >16. I
diametri per l’acido fusidico con il ceppo utilizzato come controllo di qualità, S. aureus
ATCC 25923, devono essere compresi tra 24 e 35 mm.
MUPIROCINA
La mupirocina è un antibiotico naturale (acido pseudomonico A) derivato da Pseudomonas fluorescens. È ampiamente usato come antibiotico topico per la bonifica dei portatori nasali di S. aureus, in particolare i portatori di MRSA nell'ambito del personale ospedaliero (152). Purtroppo, a breve distanza dall’introduzione della mupirocina, è comparsa e si
va diffondendo una resistenza acquisita al farmaco.
Il meccanismo d'azione della mupirocina consiste nel blocco della sintesi proteica per inibizione competitiva della isoleucina, al cui posto si lega all'enzima isoleucil-tRNA-sintetasi (IRS). Si distinguono due fenotipi di resistenza alla mupirocina, a basso livello (MIC,
4-256 µg/ml) e ad alto livello (MIC, ≥512 µg/ml), entrambi riscontrati sia in S. aureus che
nei CNS (149). La resistenza a basso livello è probabilmente dovuta nella maggior parte
42
dei casi a mutazioni nella IRS. La resistenza ad alto livello è invece dovuta alla presenza di
una IRS chimicamente diversa con ridotta affinità per la mupirocina. Il gene mupA (ileS-2),
che codifica questa IRS mupirocino-resistente, ha un'origine sconosciuta; può essere localizzato su plasmidi grossi o piccoli e può essere trasferito ad opera di un plasmide coniugativo che codifica la resistenza alla gentamicina negli stafilococchi. Mentre la resistenza a
basso livello non interferisce con l’efficacia del farmaco (che raggiunge concentrazioni
molto elevate), la resistenza ad alto livello ha rilevanza clinica in quanto compromette l'eradicazione degli stafilococchi.
Test di laboratorio
La sensibilità alla mupirocina può essere saggiata mediante agar diffusione, agar diluizione e Etest.
Pérez-Roth e coll. (145) hanno recentemente condotto uno screening della resistenza a
basso livello mediante agar diffusione utilizzando dischetti di mupirocina da 5 µg. I ceppi resistenti erano successivamente studiati con dischetti da 200 µg per determinare la resistenza
ad alto livello. La conferma della resistenza era effettuata con l’Etest e confrontata con una
PCR multiplex capace di riconoscere, oltre alla mupirocino-resistenza (ileS-2), anche la meticillino-resistenza (mecA): i due metodi mostravano una concordanza del 100% nella determinazione della resistenza alla mupirocina.
Un probe costituito da un frammento di EcoR1 di 4,05-kb è stato realizzato da Rahman e
coll. (151), partendo da un plasmide di mupirocino-resistenza. Questa sonda ibridizzava con
il DNA dei ceppi con resistenza alla mupirocina ad alto livello, ma non dei ceppi sensibili o
di quelli con resistenza a basso livello.
Un metodo per la determinazione rapida mediante PCR della mupirocino-resistenza ad alto livello è stato descritto da Anthony e coll. (3), che hanno amplificato la regione di 456 bp
del gene mupA (ileS-2) che codifica l’alto livello di resistenza alla mupirocina. I risultati sono
stati pressoché concordanti con quelli dell’agar diluizione. Talune discrepanze tra i risultati
della PCR e delle MIC sembrano dipendere dalla selezione di colonie batteriche con sensibilità alla mupirocina mista, derivante dalla mancata espressione del gene ile-S2 in una parte
delle cellule.
BIBLIOGRAFIA
43
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APPENDICE
55
APPENDICE
(Documentazione fotografica)
Figura I:
Sintesi del monomero di mureina (componente monomerico del peptidoglicano). Il monomero di mureina è composto da due aminozuccheri (acido N-acetil muramico [MurNAc] e N acetil glucosamina [GlcNAc] e dieci aminoacidi. Il precursore del monomero di mureina è composto da MurNAc e una catena di
peptidi (L-alanina, acido D-glutaminico, L-lisina, e due D-alanine). Esso viene sintetizzato nel citoplasma
e legato ad un carrier lipidico nella membrana citoplasmatica. Durante il trasferimento alla superficie esterna della membrana si aggiungono N-acetil glucosamina (GlcNAc) e cinque glicine. Infine l’acido isoglutamico viene amicato per diventare il monomero di mureina maturo.
Figura II:
Assemblaggio del peptidogliano visto dall’esterno della cellula. La glicosiltransferasi polimerizza il monomero di mureina producendo un’unica catena di peptidoglicano nascente. Le PBP si aggrappano ai
residui D-alanyl-D-alanina del fusto del peptide e lo clivano tra i residui in modo da legare il penultimo
D-alanina alla pentaglicina della catena di peptidoglicano più vicina (da Hiramatsu, 2001).
56
Figura III:
Azione dei ß-lattamici: i ß-lattamici (in colore porpora) hanno una struttura analoga ai residui D-alanylD-alanina. Inattivano le PBPs in S. aureus (in rosso), ma non possono legare con elevata affinità le
PBP2a (in verde, specifica PBP in MRSA). I ceppi MRSA, quindi, possono continuare a sintetizzare peptidoglicano in presenza dei ß-lattamici, al contrario dei ceppi di S. aureus meticillino-sensibili. (da Hiramatsu, 2001).
Figura IV:
Azione della vancomicina e della teicoplanina. L’antibiotico si lega ai residui D-alanyl-D-alanina dei monomeri di mureina. Il monomero di mureina legato alla vancomicina non può essere utilizzato come substrato dalla glicosiltransferasi (da Hiramatsu, 2001).
APPENDICE
57
Figura V:
Parete inspessita in Mu50. Mu50 presenta 30-40 strati di peptidoglicano. Vengono prodotti un maggior
numero di monomeri di mureina che vengono incorporati nelle catene nascenti di peptidoglicano. Negli
strati completi di peptidoglicano esiste un maggiore numero di residui D-alanyl-D-alanina. Negli strati di
peptidoglicano vengono intrappolate più molecole, mentre alla membrana citoplasmatica ne arrivano
meno di quelle che arriverebbero abitualmente (da Hiramatsu, 2001).
Figura VI:
S.aureus resistente alla meticillina e sensibile alla vancomicina (a sinistra) S.aureus Mu50, resistente alla
vancomicina (a destra) (75).
58
Figura VII:
La disco-diffusione non è attendibile per i glicopeptidi: 1 mm rappresenta 2 diluizioni di MIC = impossibile separare le differenti popolazioni (S-I-R).
Figura VIII:
Performance di due terreni e due inoculi per individuare i ceppi hGISA.
.
.

LA RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI NEGLI STAFILOCOCCHI

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