12 Microarray ed ELISA - Dipartimento di Farmacia

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12 Microarray ed ELISA - Dipartimento di Farmacia
DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni
elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di
RNA o cDNA.
Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:
1) consente di identificare e comprendere meccanismi e origine
molecolare di patologie ereditarie, infettive, autoimmuni,
oncologiche
2) identificare differenze nell’espressione genica di tessuti esposti a
diversi composti farmacologici
3) identificare set di geni che permettono di distinguere una malattia
da un’altra.
Cenni storici
La tecnica dei microarray utilizzata nel monitoraggio
dell’
dell’espressione genica, è stata descritta per la prima volta nel
1994: utilizzazione di target radioattivi ibridizzati a probe di cDNA
immobilizzati su filtro.
1995: ibridizzazione di target marcati con due fluorescenti diversi a
probe di cDNA stampati su una superficie di vetro.
Il principio chiave per la fabbricazione di microarray è
che filamenti di DNA a singola catena legati fortemente
a supporti rigidi non interagiscano tra loro e si possano
ibridare con RNA complementare.
La produzione di un array comincia quindi con la scelta
delle sonde che devono essere posizionate sull’array.
Le sonde possono essere prelevate da librerie
genomiche, da tessuti o cellule o da raccolte di cDNA. Le
sonde scelte sono quindi amplificate in PCR e, dopo
purificazione, posizionate con un opportuno robot su un
supporto rigido.
1
Il robot deposita un campione di ciascun gene
precedentemente selezionato in posizioni prestabilite.
Il supporto dell’array, inizialmente era costituito da
membrane di nylon o nitrocellulosa, attualmente è
realizzato con vetrini da microscopio (tale materiale
sopporta meglio alte temperature, non è poroso e quindi il
volume del materiale depositato può essere ridotto e si
evita il rischio diffusione, minimizza il rumore di fondo).
Il DNA viene fissato alla matrice con raggi UV.
Il DNA fissato sul vetrino viene poi denaturato tramite
riscaldamento, in modo da ottenere singoli filamenti pronti
per legare i propri complementari.
In base all’uso i microarray si distinguono in:
1) cDNA microarray: per analizzare gli mRNA e valutare
l’espressione genica.
2) Microarray SNP e array di mutazione: per rilevare
polimorfismi o mutazioni conosciute.
2
Procedimento:
1) si estrae l’RNA da un campione test che vogliamo
esaminare.
2) Si retrotrascrive l’mRNA in cDNA marcandolo con
composti fluorescenti.
3) Si procede allo stesso modo con un campione di
riferimento (es. un tessuto normale) marcandolo
con un fluorocromo differente.
4) I due campioni vengono posizionati sul microarray
5) Si lasciano ibridare con le sonde
6) Si verifica il profilo dell’espressione genica del test
rispetto al controllo
Esempio del funzionamento del microarray nel caso di misurazione
dell’espressione dell’mRNA:
Un’alternativa alla deposizione di cDNA su chip è data
dalla sintesi di oligonucleotidi in situ su strati di
silicio o vetro.
Sulla matrice sono posizionate molecole di collegamento
sintetiche (linker). Le molecole linker forniscono una
superficie di aggancio per le sonde.
La sintesi delle sonde avviene in parallelo essendo
conseguenza dell’aggiunta di un nucleotide a più catene
che crescono contemporaneamente.
3
Per definire quali catene oligonucleotidiche dovranno
ricevere un oligonucleotide ad ogni passo, maschere
fotolitografiche, con finestre di dimensioni pari a quelle di
una singola locazione, sono poste sopra la matrice su cui
sono posizionate le molecole linker.
Le molecole linker sono modificate con gruppi di
protezione rimuovibili fotochimicamente.
Quando la luce UV colpisce la maschera i linker esposti
vengono deprotetti e sono disponibili par
l’accoppiamento con il nucleotide.
Nel passo successivo,
un’altra maschera viene
posizionata per permettere
un ulteriore ciclo di
deprotezione e
accoppiamento.
Il tutto si ripete fino a
raggiungere la lunghezza
voluta delle sonde.
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Disegno sperimentale
mRNA qualità
qualità ed omogeneità
omogeneità
La fonte di RNA oggetto di studio dovrebbe essere isolata da una
popolazione omogenea di cellule, trattate in modo da preservarne la qualità
qualità
Le linee cellulari soddisfano nel modo migliore questo criterio, poichè
poichè si
originano per espansione clonale
Tessuti umani o animali sono più
più difficili da studiare per possibile perdita di
omogeneità
omogeneità
In sezioni di tumore infatti, la popolazione cellulare può essere
essere facilmente
rappresentata da una miscela di cellule tumorali e normali, comprendenti
comprendenti
cellule infiammatorie e del tessuto connettivo
Importante è anche la qualità
qualità dell’
dell’RNA estratto, che non deve essere
contaminato da DNA genomico e proteine e deve essere conservato nel modo
adeguato per evitarne la degradazione
5
6
Microarray a DNA spottato
Disegno sperimentale: numero di replicati e ibridizzazione
La marcatura dei target con diverse molecole fluorescenti può produrre
produrre una
differente efficienza di incorporazione.
incorporazione. Quindi è importante avere:
•
La marcatura reciproca dello stesso campione con entrambi i fluorescenti
fluorescenti
•
Repliche dei campioni di esperimenti diversi, da utilizzare come controllo
per la variabilità
variabilità sperimentale
•
Più
Più di una ibridizzazione:
ibridizzazione: replicati su vetrini diversi
Cy3Cy3-
Cy5Cy5-
Cy5Cy5-
Cy3Cy3-
Cy3Cy3-
Cy5Cy5-
Cy5Cy5-
Cy3Cy3-
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Limitazioni del DNA microarray
•Possibilità di cross-ibridazione tra sequenze simili:
conferma dei dati con approcci più tradizionali per
l’analisi dell’espressione genica (Realtime RT-PCR)
•La sensibilità non è elevata e quindi non permette di
valutare
cambiamenti minimi dell’espressione genica
•La variazione dell’espressione genica dovuta alla diversa
espressione delle varianti di splicing non è identificata
•La variazione dell’espressione genica dovuta a
regolazione traduzionale e post-traduzionale non può
essere rilevata
Microarray di mutazioni:
-Vengono sintetizzate sequenze da 20-25pb normali e mutate
-Queste sequenze vengono legate su un chip da array
-I campioni di DNA, controllo e potenziali mutati, vengono
estratti, amplificati per PCR e marcati
-Si segue lo schema già descritto (ibridazione, lavaggi…)
-Si valuta l’eventuale presenza di mutazioni
Il vetrino contiene sequenze normali e mutate per 75 mutazioni differenti per un dato
Gene, spottate in triplicato.
A. Campioni di controllo
B. DNA estratto e amplificato da pazienti che presentano il gene mutato in eterozigosi
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Tecnologia Microarray
Applicazioni cliniche
Alcune delle possibili applicazioni cliniche dei microarray:
microarray:
• Oncologia: in particolare nel settore delle leucemie questa tecnologia ha
trovato buone possibilità
possibilità di utilizzo in ambito diagnostico.
Un lavoro pubblicato nel 2003 su Seminars in Hematology,
Hematology, dimostra l’l’applicabilità
applicabilità
della tecnologia Microarray alla classificazione molecolare di leucemie. Sulla base
dei differenti profili di espressione genica, si prospetta la possibilit
à di utilizzare gli
possibilità
array come strumento sia diagnostico (identificando anche nuovi sottotipi di
malattia), sia prognostico (predizione risposta a terapie, rischi di recidiva, ecc…
ecc…).
La tecnologia microarray può trovare impiego anche nell’
nell’identificazione di
trattamenti individuali in accordo con il profilo di espressione genica del paziente e
di nuovi target malattiamalattia-specifici per scopi di drug discovery.
discovery.
Tecnologia Microarray
Applicazioni cliniche
• Microbiologia: sono stati sviluppati array in grado di rilevare sequenze
geniche di diversi tipi di patogeni.
Sono stati realizzati array a oligonucleotidi,
oligonucleotidi, contenenti sequenze virali di 70 pb
altamente conservate all’
all’interno della stessa famiglia, in modo da rilevare anche
varianti virali non conosciute (PNAS 2002). Lo studio propone l’l’impiego di
questa nuova tecnologia in diagnostica e nell’
nell’identificazione di malattie di
eziologia sconosciuta.
Altri studi hanno portato alla realizzazione di diversi tipi di chip, il cui impiego può
spaziare dalla diagnosi di infezioni batteriche (con rilevazione di geni per la
resistenza ad antibiotici), agli studi sulle relazioni filogenetiche tra diversi
microorganismi.
Tecnologia Microarray
Applicazioni cliniche
• Farmacogenomica:
Farmacogenomica: studio della variazione individuale di risposta ai
farmaci sulla base del corredo genetico.
Alcuni polimorfismi genetici causano risposte differenti nei confronti
confronti di
determinati farmaci. La tecnologia microarray può trovare impiego nello
sviluppo di farmaci pazientepaziente-specifici.
• Microarray di SNP sono stati recentemente utilizzati anche per
valutare il chimerismo dopo trapianti allogenici di cellule staminali
(Leukemia 2004).
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Ab Microarray
I microarray di anticorpi consentono, in un tempo abbastanza breve,
di valutare il profilo di espressione proteica di lisati cellulari, tissutali
o altri campioni biologici.
Gli anticorpi agiscono come un’esca, legano le proteine preda
presenti nel lisato.
L’avvenuta interazione viene visualizzata tramite
chemiluminescenza o tramite l’uso di marcatori fluorescenti.
Sullo stesso vetrino vengono fissati covalentemente molteplici
anticorpi (fino a circa 800-1000), ciascuno in triplicato e una serie di
anticorpi diretti contro proteine house keeping.
Tale metodica non consente di determinare la concentrazione
assoluta della singola proteina nel lisato, ma fornisce una misura
relativa del livello di espressione tra due campioni.
Protocollo:
estrazione delle proteine da tessuto, cellule o fluidi biologici
marcatura delle proteine con Cys5 o Cys3
rimozione dell’eccesso di fluorocromo non legato
incubazione del lisato sul vetrino
analisi per valutare i livelli di espressione
Dopo aver effettuato un’analisi di microarray di anticorpi i risultati
ottenuti vanno validati con un metodo indipendente (Western blot;
ELISA, Immunistochimica,…)
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ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Tecnica che consente di rilevare la presenza di antigeni o di anticorpi.
E’ un saggio immunologico quantitativo.
Come si realizza?
La tecnica usualmente si effettuata su piastre a 96 pozzetti.
ELISA DIRETTO (rilevazione dell’antigene)
Dapprima si lega l’Anticorpo alla piastra. Il legame e’ dovuto alle
interazioni idrofobiche tra le proteine e la plastica.
Si aggiunge l’omogenato contenente l’antigene, dopo il tempo
opportuno, si aggiunge l’Anticorpo secondario legato alla perossidasi
(lega l’antigene) e si lascia legare per il tempo opportuno. Si toglie
l’eccesso di secondario non legato.
Si aggiungono quindi i substrati per il tempo necessario per avere il
segnale e si blocca la reazione prima di effettuare la lettura
spettrofotometrica.
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ELISA INDIRETTO
E' il metodo più utilizzato per la determinazione di anticorpi.
Consiste nel fare aderire alla piastra ELISA l'antigene dal quale
vogliamo sapere se nel siero campione esistono anticorpi specifici. Si
possono utilizzare come antigeni, proteine virali o batteriche ed
anche virus batterici.
I passi successivi sono l'aggiunta del siero campione,
l'incubazione e lavaggio, l’aggiunta dell’anticorpo secondario
ed infine l'aggiunta del substrato, che reagisce con l'enzima e
poi si passa alla lettura.
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