Sperm global DNA methylation level

Sperm global DNA methylation level: association with semen parameters and
genome integrity
Andrology 2015;3:235-240; DOI: 10.1111/andr.12001
D. MONTJEAN (1), A. ZINI (2), C. RAVEL (3), S. BELLOC (4), A. DALLEAC (4), H. COPIN (5), P. BOYER (1), K.
MCELREAVEY (6) AND M. BENKHALIFA (4,5)
(1) Service de Medicine et Biologie de la Reproduction, Hopital Saint-Joseph, Marseille, France, (2)
Department of Surgery, St. Mary’s Hospital, McGill University, Montreal, QC, Canada, (3) Service de biologie
de la reproduction, CECOS, Universite de Rennes1-CHU de Rennes, (4) Laboratoire d’Eylau/ Unilabs, Service
de spermiologie, Paris, (5) IVF & Reproductive Genetics Laboratory, Regional University Hospital & School of
Medicine, Picardy University Jules Verne, Amiens, and (6) Human Developmental Genetics Unit, Institut
Pasteur, Paris, France
Correspondence to: Debbie Montjean, Hopital Saint-Joseph, Marseille, Service de Medecine et Biologie de la
Reproduction, 26 boulevard de Louvain, 13008 Marseille, France. E-mail: [email protected]
!
Sperm DNA methylation abnormalities have been detected in oligozoospermic men. However, the association
between sperm DNA methylation defects, sperm parameters and sperm DNA, and chromatin integrity
remains poorly understood. This study was designed to clarify this issue. We recruited a cohort of 92 men
(62 normozoospermic and 30 oligoasthenozoospermic) presenting for infertility evaluation during a 1-year
period. Sperm global DNA methylation was evaluated by an ELISA-like method, DNA fragmentation was
evaluated by flow cytometry-based terminal transferase dUTP nick end-labeling (TUNEL) assay (reported as
DNA fragmentation index or DFI), and sperm denaturation was evaluated by aniline blue staining (reported
as sperm denaturation index or SDI, a marker of chromatin compaction). We found a significant positive
association between sperm global DNA methylation level and conventional sperm parameters (sperm
concentration and motility), supported by the results of methylation analysis on H19-DMR. We also identified
significant inverse relationships between sperm global DNA methylation, and, both DFI and SDI. However,
sperm global DNA methylation level was not related to sperm vitality or morphology. Our findings suggest
that global sperm DNA methylation levels are related to conventional sperm parameters, as well as, sperm
chromatin and DNA integrity.
!
Il livello di metilazione del DNA spermatico globale: l’associazione con i parametri seminali e
l’integrità del genoma
Le anomalie della metilazione del DNA spermatico sono state rilevate negli uomini oligozoospermici. Tuttavia
rimane scarsamente compresa l’associazione tra i difetti della metilazione del DNA spermatico, i parametri
spermatici, il DNA spermatico e l’integrità della cromatina. Questo studio è stato disegnato per chiarire questi
aspetti. Abbiamo reclutato un gruppo di 92 uomini (62 normaozoospermici e 30 oligoastenozoospermici) che
si presentarono per la valutazione dell’infertilità presente da 1 anno. Valutammola metilazione globale del
DNA spermatico tramite un metodo analogo all’ELISA, la frammentazione del DNA con il test basato su
citometria di marcatura delle interruzioni terminali con dUTP transferasi (TUNEL, riportata come indice di
frammentazione del DNA o DFI), la denaturazione spermatica con la colorazione al blu di anilina (riportata
come indice di denatorazione spermatica o SDI, quale marcatore della compattazione della cromatina).
Abbiamo rilevato una significativa associazione positiva tra il livello della metilazione globale del DNA
spermatico e i parametri spermatici convenzionali (concentrazione e motilità spermatica), supportata dai
risultati dell’analisi della metilazione del H19-DMR. Inoltre abbiamo identificato una relazione significativa
inversa tra la metilazione globale del DNA spermatico e sia il DFI che il SDI. Tuttavia il livello di metilazione
globale del DNA spermatico non fu correlato alla vitalità e alla morfologia spermatica. Le nostre rilevazioni
suggeriscono che i livelli della metilazione globale del DNA spermatico sono correlati ai parametri spermatici
convenzionali così come all’integrità della cromatina e del DNA spermatici.
!
Il commento - La questione della identificazione dell’integrità del DNA spermatico si è rivelata negli ultimi
anni, anche in ragione dello sviluppo della fecondazione assistita che supera la selezione naturale degli
spermatozoi, soprattutto la riduzione della motilità, di fondamentale importanza per prevenire la presenza di
alterazioni nell’embrione (così da rendere efficaci le tecniche fecondative) e soprattutto di alterazioni nel
nuovo nato che possano rendersi evidenti nel suo futuro. Uno degli aspetti che si sta rivelando ogni giorno
più significativo è il livello della metilazione del DNA: tale evento è fondamentale sia per garantire l’integrità
del DNA spermatico difronte ai numerosi insulti che lo spermatozoo deve affrontare nel suo lungo viaggio,
sia per garantire la trasmissione dei caratteri genetici in modo equilibrato e armonico (il cosiddetto
imprinting). Numerosi sono gli studi pubblicati sul tema nell’ultimo biennio di cui alcuni anche qui riportati e
commentati, tra i tanti lo studio sull’impiego del livello di metilazione di alcuni specifici geni come marcatori
dell’alterazione significativa del DNA spermatico (Andrology 2013;1:731-740). L’aspetto importante che gli
Autori valutano è quanto i difetti della metilazione siano in corrispondenza (in correlazione) con i difetti della
qualità degli spermatozoi e della loro produzione e in particolare se sia sufficiente determinare la metilazione
globale del DNA, metodo assai più semplice e complessivo che andare a cercare quella di specifici geni. Lo
studio svolto dimostra che la metilazione globale del DNA è ridotta, esponendo così il DNA a maggiore
fragilità e quindi a frammentazione e alterazione, nei soggetti in cui è ridotto il numero di spermatozoi
(oligospermici) e la motilità degli spermatozoi (astenospermici) o ove siano presenti entrambe: ciò che
rimane inspiegato è se i fattori di alterazione (prevalentemente le infezioni e gli stati ossidativi) agiscano
producendo il difetto di metilazione a cui seguono i difetti della qualità degli spermatozoi o se agiscano
producendo sofferenza degli spermatozoi a cui segue il difetto di metilazione, indice di tale sofferenza. Lo
studio, pur dimostrando dati ben significativi, avrebbe potuto dare risultati ancora più incisivi se i gruppi
analizzati (entrambi disfertili, con analoga percentuale di alterazione morfologica discretamente consistente,
ma con differenti concentrazioni e motilità degli spermatozoi) fossero stati meglio delimitati (minore
oscillazione dei valori nel gruppo normospermico per concentrazione e motilità) e se l’intervallo di astinenza
pre-analisi fosse stato più compatto (48-72 ore invece di di 72-156 ore), ma in ogni caso i dati sono
adeguatamente significativi nel dimostrare che gli oligoastenospermici abbiano minori livelli di metilazione e
maggiore fragilità del DNA dei normospermici, a parità di alterazione della morfologia. In sintesi il voler
superare le difficoltà motorie degli spermatozoi con le tecniche di fecondazione assistita, soprattutto con la
ICSI che supera ogni problema di motilità, deve sempre far tenere presente che lo spermatozoo ipo/
immobile può essere portatore di alterazioni importanti del DNA che nella migliore delle ipotesi impediscono
l’instaurarsi della gravidanza, ma che potrebbero rivelarsi solo nel futuro del nuovo nato, così come
analizzato nella recente revisione qui riportata e commentata (Andrology 2015;3:156-162). Il che non toglie
la validità delle tecniche ma deve solo far porre molta attenzione nella loro applicazione, come dovrebbe
accadere nei Centri più qualificati che sempre dovrebbero procedere sia all’analisi di integrità che del livello
di metilazione globale e/o specifica del DNA spermatico prima di attivare le tecniche.