Estrazione di artemisinina dalla pianta Artemisia annua

Estrazione di artemisinina dalla pianta
Artemisia annua
David Bajic, liceo cantonale di Bellinzona (Ticino)
Responsabile del progetto: Roger Markwalder, Novartis Pharma AG, Basel
ABSTRACT
L’esperimento svolto su quattro giornate lavorative comprendeva sostanzialmente il percorso
che ha permesso di ottenere una quantità definita di artemisinina partendo da un certo
volume di pianta Artemisia annua tritata. Per svolgere questa serie di esperimenti si è ricorsi
ad attrezzature all’avanguardia e molto precise che erano presenti nei laboratori della
Novartis di Basilea.
INTRODUZIONE
L’estrazione dell’artemisinina è un processo molto importante nell’industria farmaceutica
poiché questa molecola è in grado di combattere la Malaria. Il processo di estrazione è stato
ottimizzato nel tempo e questa serie di esperimenti ha permesso anche di identificare il
migliore solvente da utilizzare per questa serie di processi. Sono stati presi in considerazione
quattro solventi: ciclo-esano, etilacetato, isopropanolo e eptano. L’ultimo è risultato il migliore
poiché al suo interno si è sciolta una quantità maggiore di artemisinina rispetto agli altri tre
solventi. Il processo d’isolamento dell’artemisinina dal solvente è stato dunque effettuato solo
utilizzando l’eptano come solvente e per capire il motivo di questo successo è necessario
entrare nella teoria della polarità. In poche parole possiamo dire che “il simile scioglie il
simile” ed essendo sia l’eptano sia l’artemisinina molecole polari quest’ultima riesce a
sciogliersi con relativa facilità nell’eptano. Per arrivare ad ottenere dell’artemisinina si sono
dovute fare molte analisi, le quali erano basate sul metodo della cromatografia, possibili
soltanto tramite attreazzature quali “spettrometro di massa” (ms), il detettore degli UV,
l’HPLC (High Performance Liquid Chromatography, in italiano: cromatografia liquida ad alta
prestazione) e il “Corona” (COAD). Il metodo di analisi riguardante la cromatografia permette
di visualizzare tramite dei grafici la massa molare delle varie molecole disciolte in un volume
di una certa sostanza.
MATERIALI E METODI
Si può suddividere la prima parte dell’esperienza in 3 sequenze in ordine cronologico con lo
scopo di definire quale sia il miglior solvente da utilizzare per il proseguimento
dell’esperienza.
Per la 1° serie si prendono 4 provette e in ciascuna si inserisce circa 1 g di pianta Artemisia
Annua tritata e in seguito si versano: 10 ml di ciclo-esano nella prima, 10 ml di eptano nella
seconda, 10 ml di etil-acetato nella terza e 10 ml di isopropanolo nella quarta. Dopodiché si
portano le provette ad una temperatura di circa 50° e si inseriscono in una centrifuga per
qualche minuto (3-5 minuti) affinché si depositi il precipitato. A questo punto si tarano 4
provette che vengono riempite con le rispettive 4 parti liquide (2 ml ciascuna) delle 4
provette precedenti, scartando in questo modo il precipitato. A questo punto le 4 provette
vengono trattate con il vacum in modo che evapori più velocemente e più facilmente,
lasciando solo l’estratto della pianta, che però non è solo artemisinina.
Per quanto riguarda la 2° e la 3° serie non ci sono grosse differenze rispetto la 1° serie. I
procedimenti sono esattamente gli stessi.
- Estrazione
Si prosegue l’esperienza inserendo 50 g di pianta tritata in un pallone di vetro da 1 L e in
seguito versando 500 mL di solvente (quello risultato più efficace nelle 3 serie). Si lascia il
tutto per 2 ore in una vasca con acqua a 50°C, dopodiché si lascia raffreddare e si filtra. Fare
evaporare l’estratto in un pallone tarato in modo da poter calcolare l’esatta quantità
d’estratto. Prima dell’evaporazione togliere l’aliquota e farla evaporare separatamente (in
base al peso si può calcolare il contenuto complessivo nell’estratto).
Si fa evaporare il solvente.
- Rimozione dello scarto
Si inseriscono 2 mg di estratto insieme a 10 ml di metanolo (concentrazione 2mg/10mL). Si
filtra con una siringhetta e un piccolo filtro; si procede con l’analisi spettrometrica. Si scioglie
il resto dell’estratto in una soluzione composta per il 65% da etanolo e per il 35% da acqua
per un totale di 50 mL e si versa in un pallone tarato più piccolo. Si agita il tutto per 10 ore,
dopodiché si filtra con una pompa a vuoto. Si preleva una piccola quantità (circa 1,50 mg) di
estratto in una piccola capsula, si discioglie in diclorometano (Cl2CH2) e si fa evaporare. A
Questo punto dovrebbe essere rimasta solo l’artemisinina, dunque si verifica sciogliendone
una piccola quantità in una soluzione di DMSO con 4,5 mL in tutto; abbastanza da fare 3
analisi.
Le analisi si svolgono con l’HPLC (High Performance Liquid Chromatography) e mostrano dei
picchi nei grafici corrispondenti alla massa molare dell’artemisinina (282,34 g/mol) sommati
alla massa molare di idrogeno o sodio o acqua. Se i grafici non mostrano picchi con masse
molari di altre sostanze significa che effettivamente è rimasta solo artemisinina.
L’esperimento risulta funzionato se si ottiene un minimo di 85% di artemisinina dell’estratto
totale.
RISULTATI
1° serie
Ciclo-esano
eptano
Etil-acetato
isopropanolo
Quantità pianta
(g)
Volume
solvente (mL)
Tara
provette (g)
Dopo il
vacum (g)
Netto (g)
Netto
(mg)
1.01859
0.98766
0.98633
0.99184
10.0
10.0
10.0
10.0
12.22721
12.19787
12.26124
12.26949
12.23401
12.20310
12.27230
12.27995
0.0068
0.0052
0.0111
0.0105
6.80
5.23
11.06
10.46
Tabella 1: risultati ottenuti dalla prima serie di estratti
2° serie
Ciclo-esano
eptano
Etil-acetato
isopropanolo
Quantità
pianta (g)
Volume
solvente (mL)
Tara provette
(g)
Dopo il
vacum (g)
Netto (g)
Netto
(mg)
0.98066
1.00982
0.99176
0.98930
10.0
10.0
10.0
10.0
12.32053
12.30400
12.31132
12.25809
12.33142
12.31248
12.32199
12.26558
0.01089
0.00848
0.01067
0.00749
10.89
8.48
10.67
7.49
Tabella 2: dati ottenuti dalla seconda serie di estratti
3° serie
Ciclo-esano
eptano
Etil-acetato
isopropanolo
Quantità
pianta (g)
Volume
solvente (mL)
Tara
provette (g)
Dopo il
vacum (g)
Netto (g)
Netto(mg)
1.00371
1.01404
1.00398
1.01725
10.0
10.0
10.0
10.0
12.16177
12.38225
12.30339
12.27796
12.16904
12.39098
12.31419
12.28636
0.00727
0.00870
0.01080
0.00840
7.27
8.70
10.80
8.40
Tabella 3: dati ottenuti dalla terza serie di estratti
Tutti i risultati presentati da qui in avanti sono riferiti alla serie 1, poiché oggettivamente
risulta quella più convincente su cui lavorare. Si sono svolte analisi sia con lo spettrometro di
massa (ms) che con il CAD.
Metanolo+
DMSO
(mL)
eptano
Etil-acetato
Ciclo-esano
isopropanolo
Netto
(mg) teorico
5.23
2.61
11.06
5.53
6.80
3.40
10.46
5.23
Metanolo
+DMSO
(mL)
effettivo
2.6
5.5
3.4
5.2
Estratto/ml Artemisinina (mg)
2.0
0.103
2.0
0.044
2.0
0.076
2.0
0.077
% Artemisinina
5.10
2.17
3.80
3.81
Tabella 4: efficacia dei 4 solventi nel disciogliere al proprio interno l’artemisinina in base ai dati ottenuti
dallo spettrometro di massa (ms)
eptano
Etil-acetato
Ciclo-esano
isopropanolo
Netto
(mg)
5.23
11.06
6.80
10.46
Metanolo+
DMSO
(mL)
Metanolo+
DMSO
(mL)
teorico
2.61
5.53
3.40
5.23
effettivo
2.6
5.5
3.4
5.2
Artemisinina
Estratto/ml (mg)
% Artemisinina
2.0
0.192
9.59
2.0
0.149
7.46
2.0
0.184
9.18
2.0
0.156
7.79
Tabella 5: efficacia dei 4 solventi nel disciogliere al proprio interno l’artemisinina in base ai dati ottenuti
dal CAD
Frazione
provetta
Arte_1
Arte_2
46
42-45+47-48
Total
sel.
Massa
+283.3
+283.3
Tara
mg
136026.50
201469.1
Brutto
mg
136038.30
201609.8
Quantità
mg
11.8
140.7
152.50
Tabella 6: massa effettiva di artemisinina ottenuta nelle provette in cui è stata segnalata la sua presenza
tramite analisi del cromatogramma
DISCUSSIONE
Le tre serie hanno dato risultati molto contrastanti tra loro e dunque per convenzione si è
deciso di prendere in considerazione la prima serie che era effettivamente quella più
attendibile anche secondo la teoria. Dalla tabella 4 si capisce che con lo spettrometro di massa
l’eptano risulta il più efficace nel disciogliere l’artemisinina al suo interno rispetto agli altri tre
solventi. Questa efficacia viene confermata anche dal CAD (tabella 5), confermando di
conseguenza la teoria che secondo le polarità di eptano e artemisinina si ottiene il miglior
rapporto proprio tra queste due.
Con l’eptano si è dunque effettuata l’esperienza, dal punto di vista quantitativo, più grande. Si
è separato l’estratto con DMSO in 50 provette che sono state sottoposte alle analisi del
cromatogramma (nmr) e come si può vedere dalla tabella 6 nelle provette 42-48 numerate
arbitrariamente prima di sottoporle ad analisi è presente una molecola con massa molare pari
a 283,3 g/mol (molecola di artemisinina (282,3) + un atomo di idrogeno (1,0)) che è per
l’appunto l’artemisinina. Facendo evaporare il contenuto di queste provette con l’aggiunta di
diclorometano (Cl2CH2) si è ottenuto un quantitativo di artemisinina di 152,50 mg dai 50,1 g
iniziali di pianta tritata Artemisia annua. Dopo un ulteriore analisi si è riscontrato che
l’artemisinina ottenuta era pura al 95% che è un risultato molto soddisfacente.
RINGRAZIAMENTI
I ringraziamenti vanno in primo luogo a scienza e gioventù per l’opportunità data e per
l’organizzazione di questa settimana memorabile. Un sincero “grazie” va a Roger Markwalder
e Nicolas Lambert che hanno reso possibile e sostenuto lo svolgimento del progetto di ricerca
e la redazione del rapporto finale. Per finire ringrazio l’intero istituto Novartis Pharma AG per
l’ospitalità.
BIBLIOGRAFIA E FONTI
https://de.wikipedia.org/wiki/Artemisinin
https://it.wikipedia.org/wiki/Spettrometro_di_massa
https://it.wikipedia.org/wiki/Cromatografia_liquida_ad_alta_prestazione
https://it.wikipedia.org/wiki/Artemisia_annua