Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

Transcript

Ricerche Microbiologiche: Procedure
Standard del Regno Unito
Identificazione di specie Neisseria
Emesso da the Standards Unit, Microbiology Services Division,PHE
Batteriologia - Identificazione | ID 6 | Emissione no:2.2 | Data emissione: 10.03.14 | Pagina 1 di 23
© Crown copyright 2014
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità Pubblica
del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul sito web
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e controllate da diversi
gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i laboratori
di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo documento. Si
ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: http://www.hpa.org.uk/SMI
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Batteriologia – Identificazione | ID 6 | Emissione no: 2.2 | Data emissione: 10.03,14 | Pagina: 2 di 23
UK Standards for Microbiology Investigations | Issued by the Standards Unit, Health Protection Agency
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
RICERCHE MICROBIOLOGICHE STANDARD DEL REGNO UNITO: SCOPO E
OBIETTIVO.................................................................................................................................5
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................8
INTRODUZIONE .........................................................................................................................8
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI .................................................................................9
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .....................................................................10
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO ..................................................................................10
3
IDENTIFICAZIONE .......................................................................................................11
4
IDENTIFICAZIONEDI SPECIE NEISSERIA .................................................................17
5
REFERTAZIONE ........................................................................................................18
6
INVIO ..........................................................................................................................18
7
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE ....................................................................19
APPENDICE .............................................................................................................................20
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................21
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali
sono specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso E-mail:
[email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
6/10.03.14
Emissione eliminata. no
2.1
Emissione inserita no.
2.2
Sezione(i) interessate/Pagina no. Modifica.
Il documento è stato inserito in un nuovo formato che
evidenzia il passaggio della Health Protection Agency alla
Public Health England.
Prima pagina ridisegnata.
Documento intero .
Rinominata la pagina di “Stato come Scopo” e Obiettivo
ed aggiornata in modo appropriato.
I loghi delle organizzazioni professionali sono stati
revisionati ed aggiornati.
Revisionati e aggiornati Standard di sicurezza e referenti
delle denunce
Il contenuto scientifico rimane invariato.
Modifica No/Data.
5/11.09.07
Emissione eliminata. no
2.1
Emissione inserita no.
2.2
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Intero documento
Documento presentato in nuovo formato.
Prima pagina
Aggiunto logo Irlanda del Nord
Tutte
Inseriti link PDF per riferimenti crociati fra le NMI
Introduzione
Informazione Tecnica aggiunta e Tassonomia
4
Diagramma di fluso in formato Visio
Invio
Modificato e aggiunto il link
Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito#:
Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
• Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai
professionisti che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive.
• Le SMI forniscono ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio
riferibili alle ricerche per la diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni
forniscono indicazioni che facilitano la prenotazione elettronica di tests appropriati da parte
dei reparti ospedalieri.
• Le SMI forniscono gli standard per le ricerche microbiologiche anche ai responsabili della
sanità pubblica che devono considerarle come parte delle procedure da adottare per la
salute (sia clinica che pubblica) per la propria popolazione.
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti del
processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche (prove
di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).
Gli algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la diagnosi
differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note orientative descrivono
metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad esempio la validazione
della prova, la garanzia della qualità, la definizione dell'incertezza della determinazione.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo. Nel Regno Unito le SMI
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE, NHS,
Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali..
L'elenco delle organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito:
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. L'inclusione del logo di una organizzazione in una SMI
implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I rappresentanti
delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi di Lavoro che
sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere rigorosamente conformi a
quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a quelle delle loro organizzazioni. I
rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento bidirezionale per la consultazione e dialogo.
Le opinioni espresse sono ricercate con un processo di consultazione.
Le SMI sono sviluppate, revisionate ed aggiornate con un ampio processo di consultazione
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC (General
Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata dai
Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida prodotte
dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO 9001:2008.
Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si devono
attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica del Regno
Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di attività, e
neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno Unito.
Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e intraprendere ricerche
addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i requisiti
dell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono essere
verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo. Queste
stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI.
Le prestazioni della SMI dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e
delle attrezzature utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo
commerciale e quelli messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I
laboratori devono partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative
procedure del controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il coinvolgimento
dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di operatori sanitari,
ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà strutturalmente valida e atta a
soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di partecipazione per contribuire alla
consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al nostro sito web
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e di
garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313. I Gruppi di Lavoro SMI
sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli appartenenti al
pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano modifiche
a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate nel
corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere sostituite solo
da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da parte dell’ente
accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Identification of Neisseria Species. UK Standards for
Microbiology Investigations. ID 6 Emissione 2.2. http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf.
Ssopo del Documento
Questa SMI descrive le modalità di identificazione delle specie Neisseria patogene isolate
da materiali clinici, la loro differenziazione dalle specie non patogene ed i generi correlati
Moraxella e Kingella. L’identificazione di questi due generi è descritta nella ID 11 Identification of Moraxella Species and Morphologically Similar Organisms.
Questa SMI deve essere usata congiuntamente alle altree SMI
INTRODUZIONE
Tassonomia
Il genere Neisseria appartiene alla famiglia delle Neisseriaceae. Il genere comprende N.
gonorrhoeae e N. Meningitidis, clinicamente significative, ed alcune specie non-patogene.
Caratteristiche1
Specie Neisseria2
Le specie Neisseria sono patogene obbligate dell’uomo e di nessun altro ospite naturale. Sono
cocchi Gram negativi di diametro di 0.6-1.0 µm, si presentano come cellule singole, spesso
appaiate, con lati adiacenti appiattiti. Non sono mobili e non sono dotate di flagelli. Alcune specie
producono un pigmento carotenoide verde-giallo e possono avere caratteristiche nutrizionali
esigenti e produrre emolisi. La temperatura ottimale di crescita è di 35-37°C. Sono ossidasi e
catalasi positive (tranne Neisseria elongata). Tutte, tranne Neisseria gonorrhoeae e Neisseria
canis, riducono i nitriti.
Le specie di rilevanza clinica di Neisseria (Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,
Neisseria lactamica, Neisseria cinerea e Moraxella catarrhalis) sono facilmente differenziabili da
quelle non patogene. N. gonorrhoeae e N. meningitidis rappresentano i due principali patogeni del
gruppo. Le altre specie di Neisseria quali N. lactamica, N. cinerea and M. catarrhalis sono
generalmente considerate commensali, anche se sono state ritenute causa di infezione in pazienti
immuno-compromessi.
Specie Moraxella
Le specie Moraxella possono presentarsi come bastoncini o cocchi. I bastoncini sono di solito corti
e tozzi, di aspetto simile a cocchi, di dimensioni 1.0 - 1.5 x 1.5 - 2.5. Le cellule si presentano a
coppie ed in corte catenelle con un solo piano di divisione. I cocchi sono più piccoli, diametro 0.61.0 µm e sono presenti come cellule isolate o accoppiate con lati adiacenti appiattiti. Piani di
divisione differenti portano talvolta a formazione di tetradi. Le cellule possono essere dotate di
capsula. Le specie Moraxella sono Gram-negative con tendenza a resistere alla decolorazione.
Non sono dotate di flagelli. Alcuni ceppi si sviluppano lentamente in condizioni anaerobiche. La
maggior parte, tranne Moraxella osloensis, è esigente per quanto riguarda le richieste nutrizionali.
La temperatura ottimale è di 33 -35°C. Le specie Moraxella sono catalasi positive e non
producono acidi dai carboidrati. Tutte le specie Moraxella sono ossidasi-positive.
Specie Kingella
Le specie Kingella sono costituite da bastoncini diritti, lunghezza di 1 µm, spesso in coppie o in
corte catene. Non producono endospore. Le cellule sono Gram-negative ma tendono a resistere
alla decolorazione. Non sono mobili. Si sviluppano in condizioni aerobiche o anaerobiche
facoltative con temperatura ottimale a 33-37°C. Su agar sangue formano due tipi di colonie: una
che diffonde, tipo penetrante con mobilità a scatto ed una di tipo liscio e convesso, priva di mobilità
a scatto. Le Kingella sono ossidasi positive, ma possono presentare una reazione debole o
negativa con la tetrametil-p-fenilenediamina. Sono catalasi ed ureasi negative. Utilizzano il
glucosio ed alcuni altri carboidrati con produzione di acido. Le Kingella possono essere
erroneamente identificate come Neisseria in quanto sono bastoncini Gram-negativi spesso
accoppiati, ossidasi positive e si possono sviluppare su agar selettivo GC.
Rincipi di Identificazione
Principi di Identificazione
Gli isolati da coltura primaria sono identificati dalla colorazione Gram, prova dell’ossidasi ed almeno due dei
seguenti criteri d’identificazione: utilizzazione dei carboidrati, rilievo di enzimi in dotazione o reattività a
reagenti immunologici.
Informazione Tecnica/Limitazione
N/D
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA3-19
Microrganismi del Gruppo 2 di Rischio
Gli isolati sospetti di N. meningitidis devono sempre essere manipolati in una cabina
microbiologica di sicurezza
N. meningitidis appartiene al Gruppo di Rischio 2 ,sebbene in alcune circostanze la tipologia del
lavoro possa richiedere un Livello completo di Contenimento 3
N. meningitidis causa talvolta malattie gravi e letali. Sono state segnalate infezioni acquisite in
laboratorio. Il microrganismo infetta principalmente l’apparato respiratorio. Per alcuni seirogruppi di
meningococchi è disponibile un efficace vaccino.
Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza
microbiologica, in isolamento o in ogni altra condizione di contenimento disponibile.
Fare riferimento alle linee guida attuali sulla sicurezza della manipolazione di tutti i microrganismi
appartenenti al Gruppo di Rischio 2 descritti in questa SMIICRORGANISMI
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto
2
Microrganismi Bersaglio
Le principali specie di Neisseria segnalate come causa di infezione nell’uomo sono:
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
N. lactamica
N. sicca
Altre specie possono essere associate a malattie nell’uomo:
N. subflava
N. cinerea
N. canis
N. elongata subspecie nitroreducens
N. mucosa.
Specie che possono essere erroneamente identificate come specie Neisseria
Moraxella catarrhalis*
Kingella denitrificans*
Specie Moraxella isolate da campioni clinici:
M. atlantae*
M. catarrhalis*
M. lacunata*
M. nonliquefaciens*
M. oslensis*
M. phenylpyruvica
Specie Kingella isolate da campioni clinici
K. denitrificans*
K. indologenes
K. kingae*
Specie non saccarolitiche di Neisseria che possono essere
erroneamente identificate come N. gonorrhoeae o N. meningitidis.
N. canis*
N. caviae
N. cinerea*
N. cuniculi
N. elongata*
N. flavescens
N. ovis*
* Alcune delle specie segnalate hanno causato infezione nell’uomo
3
Identificazione
3.1
Aspetto Microscopico
Colorazione Gram (consultare BSOPTP 39 – Procedure di colorazione)
Le specie Neisseria sono cocchi Gram-negativi accoppati lungo gli assi paralleli.
3.2
Terreni di isolamento Primario
Incubare l’agar selettivo GC fino a 48 ore in 5-10% di CO2 a 35-37°C. Incubare fino a 72 ore, se
possibile, per ottenere una percentuale di isolamento ottimale.
L’agar selettivo GC è ottenuto dall’agar base GC arricchito con sangue lisato o laccato di cavallo
arriccito o non con VitoX o IsoVitaleX. Il cocktail di antibiotici usati per la selezione contiene
vancomicina o lincomicina, colistina, trimetoprim e nistatina o anfotericina.
Incubare l’agar Sangue Intero/Sangue cotto (cioccolato) per 18-48 ore in 5-10% di CO2 a 35-37°C.
Questi terreni contengono di solito agar Columbia base arricchito con 5% di sangue di cavallo o
con sangue laccato di cavallo.
3.3
Aspetto delle Colonie
Le specie Neisseria (che crescono talvolta su terreni non selettivi) sono solitamente pigmentate ed
opache. Entrambe le N. gonorrhoeae e N. meningitidis formano sulle piastre di isolamento primario
colonie lisce, rotonde, umide, uniformi, grigio/marrone con una colorazione verdastra sottostante.
N. gonorrhoeae può crescere moderatamente su agar sangue di recente preparazione o solo se il
numero dei batteri presenti nel campione è particolarmente elevato. Come per ogni altro esame
colturale, la qualità del campione determina la possibilità d’isolamento.
3.4 Procedure di Prova
Prova dell’ossidasi (consultare BSOPTP 26 – Prova dell’ossidasi)
Ossidasi-positiva: specie Neisseria, specie Kingella e M. catarrhalis
3.5
Identificazione Successiva
Le specie Neisseria possono essere differenziate da microrganismi simili con prove biochimiche o
di altro tipo. Devono essere utilizzati almeno due principi identificativi in quanto le differenze
tassonomiche fra i diversi componenti del genere sono molto scarse e l’identificazione definitiva
può essere problematica.
3.5.1
Neisseria Gonorrhoeae20,21
N. gonorrhoeae è trasmessa per via sessuale, causando principalmente infezione del tratto
anogenitale ed è sempre considerata patogena. Ciò la differenzia dalla N. meningitidis che
colonizza la parte superiore dell’apparato respiratorio come commensale ed occasionalmente
diventa invasiva causando malattia sistemica.
La Neisseria possiede una tipica parete Gram-negativa, costituita dalla membrana citoplasmatica,
un sottile strato di peptidoglicano ed una membrana esterna. Molti dei principali antigeni della
parete cellulare sono posseduti dalla N. gonorrhoeae e dalla N. meningitidis, con l’eccezione della
capsula che non è espressa da N. gonorrhoeae ma, se presente in N. meningitidis, aumenta la sua
capacità di sopravvivenza nel sangue.
Identificazione di N. gonorrhoeae
Per confermare l’identificazione di N. gonorrhoeae ed escludere altri tipi di Neisseria si possono
intraprendere due approcci diversi.
1.
Utilizzare anticorpi specifici che confermino solo N. gonorrhoeae.
2.
Utilizzare prove con utilizzo di carboidrati forniranno caratteristiche specifiche del
microrganismo per presenza o assenza di enzimi precostituiti quali aminopeptidasi e
β-glacosidasi, fornendo una completa definizione di specie del microrganismo22.
Prove di identificazione disponibili:
Utilizzazione dei carboidrati
Tradizionalmente l’identificazione è stata confermata con la ricerca dell’acidificazione di terreni
contenenti glucosio, ma non con quelli con maltosio, saccarosio o lattosio. Si tratta di un processo
ossidativo e non fermentativo. E’ importante che il terreno base sia privo di carboidrati (se si
utilizzano siero e zuccheri, verificare il siero per la presenza di maltasi). Le piastre o le provette
seminate sono incubate in 5-10% CO2 per ventiquattro ore con tappi allentati e poi lasciate
stazionare per 30 minuti per dissolvere qualsiasi acidificazione dovuta alla CO2 disciolta. Gli
svantaggi di questo metodo sono il lungo tempo e la richiesta di un inoculo abbondante e di una
semina pura di gonococchi. Alcuni meningococchi metabolizzano lentamente il maltosio e possono
richiedere almeno due giorni per l’acidificazione dei sistemi di convenzionali; alcuni gonococchi
possono metabolizzare lentamente il glucosio. Sono disponibili sistemi commerciali per il rilievo
rapido dell’utilizzazione dei carboidrati.
Enzimi preformati
Il rilievo di aminopeptidasi, gamma-glutamil transferasi e prolina iminopeptidase associate a ßgalattosidasi con substrati cromogeni consente l’identificazione a livello di specie. I reagenti sono
disponibili in confezioni commerciali. Questa rappresenta un’alternativa utile all’approccio
precedente, ma deve essere utilizzata con ceppi isolati solo da terreni selettivi, perché alcune
Neisseria non-patogene producono reazioni simili a quelle di N. gonorrhoeae. In Inghilterra e nel
Galles sono prevalenti N. gonorrhoeae che hanno subito una mutazione nel gene della prolina
iminopeptidase, risultando negative per questo enzima; pertanto, le confezioni che rilevano solo la
produzione di aminopeptidasi non devono essere usate in modo esclusivo23,24.
Combinazione carboidrati enzimi preformati
Molte delle confezioni commerciali per le prove di utilizzazione dei carboidrati includono la
aminopeptidasi. Le N. gonorrhoeae che sono prolina iminopeptidasi negative forniranno risultati
anomali con queste confezioni e dovranno essere confermate con reagenti immunologici.
Immunologici
L’identificazione di tipo immunologico può essere ottenuta utilizzando anticorpi legati a
fluoresceina, alla proteina A dello stafilococco o al lattice. Quelli commercialmente disponibili
contengono una miscela di anticorpi monoclonali verso epitomi specifici della principale proteina
della membrana esterna, Por. Si possono verificare reazioni false negative, sebbene infrequenti,
perché i reattivi contengono una miscela di anticorpi e non uno solo cross reagente con un singolo
epitopo. Per la diversità delle miscele, occasionalmente, alcuni isolati sono falsamente negativi con
una confezione ma positivi con un altro reagente.
Approcci all’identificazione di N. gonorrhoeae
L’identificazione deve essere ottenuta con una combinazione di prove che consentano il riconoscimento del
microrganismo ed escludano altre specie di Neisseria. N. gonorrhoeae è di solito isolata da pazienti ad alto
rischio, per i quali e necessario eseguire l’identificazione associata ad una sola prova di conferma. E’ in ogni
modo necessario utilizzare più di una prova per la conferma nei pazienti a basso rischio e nei bambini
soggetti ad abuso sessuale (medico-legale).
Identificazione preliminare
Tutti gli isolati di N. gonorrhoeae devono soddisfare almeno quattro condizioni:
1.
Crescere sui terreni selettivi per le specie patogene di Neisseria.
Nota: Se il ceppo di Neisseria gonorrhoeae considerato è sensibile alla
vancomicina potrà non crescere su questo terreno.
2.
Morfologia della colonia appropriata per ogni tipo di terreno.
3.
Morfologia tipica alla colorazione Gram (diplococchi Gram negativi).
4.
Ossidasi positiva.
•
Alto rischio: Pazienti assistiti presso istituzioni sanitarie quali i Consultori
per Malattie Genito Urinarie (popolazione ad elevata prevalenza)
Prelevare ed analizzare campioni genitali e non (rettale e faringeo) a pazienti considerati a rischio
elevato. E’ richiesta una ma preferibilmente due prove di conferma per isolati da campioni genitali
nei quali la colorazione Gram e la prova dell’ossidasi hanno fornito una diagnosi preliminare di
infezione da N. gonorrhoeae. Queste dovrebbero essere di tipo biochimico o immunologico. Tutti
gli isolati negativi alla prova immunologica devono essere ulteriormente saggiati con prove
biochimiche per rilevare l’utilizzazione dei carboidrati con/senza aminopeptidasi per eliminare la
possibilità di N. gonorrhoeae aminopeptidasi negativa.
•
Basso rischio: Pazienti ambulatoriali (popolazioni a bassa prevalenza)25-27
Per gli isolati da pazienti considerati a basso rischio (tranne quelli medico-legali) si raccomandano
due prove addizionali per la conferma successiva all’identificazione preliminare. Queste
dovrebbero essere di tipo biochimico e immunologico. Le confezioni per prove biochimiche non
devono includere solo quelle che rilevano le aminopeptidasi, ma devono contenere anche quelle
per i carboidrati.
•
Medico-legale: Bambini o abuso sessuale26,27
Nei casi Medico-legali il Sexually Transmitted Bacteria Reference Laboratory (STBRL) raccomanda che tutti
gli isolati siano identificati soddisfacendo l’indicazione minima di tre prove addizionali; biochimica,
immunologia e molecolare (le prove molecolari devono essere inviate al STBRL).
Nei pazienti medico-legali, adottare prove sufficientemente specifiche per garantire, nei limiti del
possibile, un’identificazione sufficientemente sicura e che possa sostenere una rigorosa verifica in
aula di giustizia. L’identificazione deve essere eseguita con almeno una o due prove di conferma
nel laboratorio in cui inizia l’esame. Per opportuna precauzione questa deve essere seguita dalle
prove di conferma dell’identificazione da parte del Laboratorio di Riferimento. Per ovviare
all’eventuale perdita del ceppo inviato o per morte dei microrganismi gli isolati devono essere
conservati in condizioni vitali fino al ricevimento del referto finale dal Laboratorio di Riferimento. Se
i risultati sono utilizzati per prove forensi la “concatenazione dell’evidenza” deve essere
ineccepibile. Si tratta di una registrazione formale del progredire delle procedure eseguite sul
campione dal prelievo all’emissione del referto finale. Questa dovrebbe includere la successione
completa degli eventi (tempo, data, luogo e firme) delle persone che hanno manipolato il campione
ed eseguito ed interpretato le prove, segnalando inoltre la registrazione delle condizioni di
conservazione del campione.
I metodi molecolari eseguiti al di fuori del STBRL includono metodi locali per il rilievo del DNA
specifico di N. gonorrhoeae con amplificazione dei geni cppB e ompIII per l’identificazione del
genotipo con NG-MAST28, 29.
Prove di sensibilità24
La maggior parte dei laboratori esegue la prova di sensibilità su tutti gli isolati di N. gonorrhoeae
secondo le linee guida della British Society of Antimicrobial Chemotherapy (BSAC). Si raccomanda
di saggiare ogni agente antimicrobico utilizzabile per la terapia. Se si utilizza acido nalidixico come
screening per evidenziare isolati resistenti alla ciprofloxacina, si deve ricordare che sono stati
descritti ceppi occasionalmente sensibili a questo composto ma resistenti alla ciprofloxacina. L’Etest con ciprofloxacina è un metodo alternativo, utile per laboratori con numero ridotto di prove.
Tutti gli isolati che presentano una diminuzione della sensibilità alle cefalosporine di terza
generazione, ceftriaxone, cefixime o azitromicina, devono essere inviati per conferma allo STBRL.
3.5.2
Nesisseria meningitidis
Per informazioni sullo screening dei Meningococchi consultare BSOP 51 – Screening per
Meningococchi.
La presenza di Neisseria meningitidis in sedi normalmente sterili quali il LCR (liquor
cefalorachidiano) o nel sangue è considerata definitiva per la diagnosi di malattia
meningococcica31. Nel caso di sospetta malattia meningococcica di solito si raccomanda il prelievo
di due campioni, uno per l’esame colturale e l’altro per la PCR (ricerca del DNA). Nei casi sospetti
di meningite i campioni di LCR ricevuti dai laboratori di microbiologia sono saggiati di routine per
conteggio delle cellule (conteggio differenziale) e spesso, per ottenere una rapida conferma con la
colorazione Gram. La ridotta sensibilità dell’esame microscopico e la sempre più frequente
somministrazione di antibiotici prima del ricovero riducono le probabilità di un esame microscopico
o colturale positivo. Queste condizioni hanno determinato un aumento dell’importanza dei metodi
di ricerca del DNA quali la PCR. L’agglutinazione con lattice, sebbene utile in alcuni casi, non è
sensibile come la PCR per la conferma e caratterizzazione del sierogruppo dei meningococchi. La
PHE Meningococcal Reference Unit mette a disposizione un servizio per la conferma di malattia
meningococcica ed un’accurata determinazione e caratterizzazione del sierogruppo con metodo
PCR; ciò consente l’aggiornamento epidemiologico in Inghilterra e nel Galles. I metodi di ricerca
del DNA consentono, qualora richieste, successive sottotipizzazioni molecolari.
La malattia a carattere invasivo della Neisseria meningitidis è di solito associata a specifici
sierogruppi. I ceppi di meningococco sono presenti nella cavità orale e nell’orofaringe di portatori
asintomatici e sono spesso isolati in sede urogenitale nell’uomo e nella donna. Tranne che per la
resistenza ai sulfonamidi (non utilizzati in terapia), i meningococchi conservano la sensibilità agli
antibiotici utilizzati di solito nel trattamento e nella chemioprofilassi. A partire dal 1985 è stata
osservata una diminuzione della sensibilità alla penicillina causata da una modificazione dei siti
della proteina che lega la penicillina. La ridotta sensibilità è ascritta a microrganismi con MIC delle
penicillina > = 0.1mg/L: si deve fare attenzione a non indurre la resistenza perché i meningococchi
sono clinicamente sensibili ai livelli terapeutici raggiungibili nei pazienti. Sono stati identificati alcuni
rari ceppi di meningococchi portatori di plasmidi che producono beta-lattamasi. Sono state talvolta
osservate resistenze alla rifamipicina successiva a chemioprofilassi in casi di contatto e ciò si
riscontra occasionalmente in cluster di casi secondari. Per la tipologia dell’infezione è
particolarmente importante che i laboratori conseguano risultati accurati sia per iltrattamento sia a
fini epidemiologici. Localmente questa condizione è meglio ottenuta utilizzando gli E-test32. Il
personale deve essere addestrato al loro utilizzo per ottenere risultati validi. E’ inoltre opportuno
che tutti gli isolati siano saggiati con un ampio spettro di sostanze con metodo di disco diffusione
per confermare la sensibilità agli agenti antimicrobici utilizzati localmente.
Una volta che l’isolato è stato identificato utilizzando i metodi specificati al punto 3.0, la loro conferma deve
essere eseguita nel modo seguente:
•
Confezioni per prove biochimiche. E’ importante notare che è stato segnalato un certo numero
di meningococchi glucosio e maltosio negativi22.
•
Confezioni commerciali rapide
•
Caratterizzazione a livello di sierogruppo se richiesta, con utilizzo di confezione commerciale di
lattice o di reattivi di agglutinazione su vetrino. Le confezioni commerciali di lattice sono
progettate per uso diretto su LCR o siero, ma possono essere utilizzate anche sulle colture. I
sieri per l’agglutinazione su vetrino sono da usare esclusivamente sulle colture. Per ridurre la
formazione di aerosol i campioni clinici trattati con calore o le sospensioni delle colture trattate
con formalina devono essere manipolati in cabina microbiologica.
Differenziazione di N. meningitidis da fenotipi simili
N. meningitidis può essere identificata per la produzione di acido da glucosio e maltosio e non da
lattosio o saccarosio, e per la produzione di gamma-glutamilaminotransferasi. Sono stati descritti
ceppi di N. meningitidis maltosio negativi che possono essere differenziati da N. gonorrhoeae per
la capacità di produrre gamma-glutamilaminotransferasi. Possono essere riscontrate varianti di N.
meningitidis glucosio negative.
3.5.3 Altre Specie Neisseria
Possono essere identificate utilizzando confezioni commerciali disponibili dopo la loro validazione.
L’accuratezza di queste non è stata completamente definita per specie diverse da N. gonorrhoeae
e N. meningitidis e pertanto i risultati ottenuti devono essere valutati con cautela.
3.6
Conservazione e Invio
A breve termine – gli isolati devono essere mantenuti in condizioni vitali su becchi di clarino di
sangue cotto (cioccolato).
A lungo termine – Gli isolati devono essere congelati a -20 - 80°C.
4
5
Refertazione
5.1
Identificazione Preliminare
N. gonorrhoeae
Se rilevate appropriate caratteristiche di crescita, aspetto delle colonie, colorazione Gram della
coltura e prova dell’ossidasi.
N. meningitidis
Se sono dimostrate appropriate caratteristiche di crescita, aspetto delle colonie, colorazione Gram
della coltura, prova dell’ossidasi e risultati sierologici.
Devono essere soddisfatte almeno quattro condizioni per tutti gli isolati di Neisseria:
1.
Sviluppo sui terreni selettivi per le specie patogene di Neisseria.
Nota: Se il ceppo di Neisseria gonorrhoeae in accertamento è sensibile alla
vancomicina non si svilupperà su questo terreno.
2
Morfologia della colonia in accordo con questo terreno
3
Presenza della morfologia tipica alla colorazione Gram
4
5.2
Ossidasi positiva
Conferma Identificazione
Utilizzare i risultati delle procedure di identificazione biochimica/immunologica come specificato in
questo documento e/o nel referto del Laboratorio di Riferimento.
5.3
Medico Microbiologo
Informare il medico microbiologo di tutti gli isolamenti sospetti o confermati di N. meningitidis e di
tutte le specie Neisseria isolate da sedi normalmente sterili o da casi di infezione invasiva.
Il medico microbiologo deve essere informato se il documento di richiesta contiene informazioni
quali:
•
Casi di meningite, setticemia (specialmente con esantema color porpora)
•
Ricerche di N. meningitidis in corso di epidemia o per stato di portatore
Informare il medico microbiologo di tutti gli isolamenti sospetti o confermati di N.
gonorrhoeae, e di tutte le Neisseria da campioni di:
•
Minori
•
Casi di violenza sessuale, stupro o abuso
•
Tutte le persone non in cura presso un ambulatorio medico per malattie genitourinarie
Sedi extragenitali (gola, anorettale, per la particolare attenzione richiesta nelle
procedure di identificazione)
•
Fare riferimento ai protocolli locali per la refertazione al clinico
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione
5.5
Public Health England33
Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV
5.6
Gruppo Controllo Infezione
Informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati sospetti e confermati di N. meningitidis
6
Invio
6.1
Laboratorio di Riferimento
Per informazioni sugli accertamenti disponibili, i tempi di risposta, le procedure di trasporto ed
altre informazioni riguardanti il laboratorio di riferimento rivolgersi a: http://www.hpa.org.uk/cfi/rsil
Inviare a:
Sexually Transmitted Bacteria Reference Laboratory
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London
NW9 5EQ
Contattare il Centralino: Tel. +44 (0) 20 8327 6464
http://www.hpa.org.uk/cfi/Reference Laboratory/default.htm
Meningococcal Reference Unit (MRU)
Manchester Medical Microbiology Partnership
PO Box 209
Clinical Sciences Building 2
Manchester Royal Infirmary
Oxford Road
MANCHESTER
M13 9WZ
Tel. +44 (0) 0161 276 6757
Contattare il centralino della PHE: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
Contattare l’appropriato laboratorio nazione di riferimento per le informazioni sulle prove disponibili,
tempi di risposta, procedure di trasporto ed eventuali altri requisiti per l’invio del campione
Inghilterra e Galles
http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=11
58313434370
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.belfasttrust.hscni.net/Laboratory-MortuaryServices.htm
7
Notifica al PHE33,34 o Equivalente35-38-
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva, Le denuncie devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per HIV & STIs, HCAIs e CJD da includere nel ‘Notification Duties of Registered Medical
Practitioners’, e non nel ‘Notification Duties of Diagnostic Laboratories’.
Esistono accordi diversi in Scozia35,36, nel Galles37 e Irlanda del Nord38..
Bibliografia
1. Holt JG. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. In: Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT,
Williams ST, editors. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins; 1994. p. 34-540.
2. Knapp JS. Historical perspectives and identification of Neisseria and related species. Clin Microbiol Rev
1988;1:415-31.
3. European Parliament. UK Standards for Microbiology Investigations (SMIs) use the term "CE marked
leak proof container" to describe containers bearing the CE marking used for the collection and transport
of clinical specimens. The requirements for specimen containers are given in the EU in vitro Diagnostic
Medical Devices Directive (98/79/EC Annex 1 B 2.1) which states: "The design must allow easy handling
and, where necessary, reduce as far as possible contamination of, and leakage from, the device during
use and, in the case of specimen receptacles, the risk of contamination of the specimen. The
manufacturing processes must be appropriate for these purposes".
4. Official Journal of the European Communities. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the
Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. 7-12-1998. p. 1-37.
5. Health and Safety Executive. Safe use of pneumatic air tube transport systems for pathology specimens.
9/99.
6. Department for transport. Transport of Infectious Substances, 2011 Revision 5. 2011.
7. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances 20132014. 2012.
8. Home Office. Anti-terrorism, Crime and Security Act. 2001 (as amended).
9. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The Approved List of Biological Agents. Health and
Safety Executive. 2013. p. 1-32
10. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Infections at work: Controlling the risks. Her Majesty's
Stationery Office. 2003.
11. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological agents: Managing the risks in laboratories and
healthcare premises. Health and Safety Executive. 2005.
12. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. Biological Agents: Managing the Risks in Laboratories
and Healthcare Premises. Appendix 1.2 Transport of Infectious Substances - Revision. Health and
Safety Executive. 2008.
13. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal
Medical Diagnostic Laboratories. MMWR Surveill Summ 2012;61:1-102.
14. Health and Safety Executive. Control of Substances Hazardous to Health Regulations. The Control of
Substances Hazardous to Health Regulations 2002. 5th ed. HSE Books; 2002.
15. Health and Safety Executive. Five Steps to Risk Assessment: A Step by Step Guide to a Safer and
Healthier Workplace. HSE Books. 2002.
16. Health and Safety Executive. A Guide to Risk Assessment Requirements: Common Provisions in Health
and Safety Law. HSE Books. 2002.
17. Health Services Advisory Committee. Safe Working and the Prevention of Infection in Clinical
Laboratories and Similar Facilities. HSE Books. 2003.
18. British Standards Institution (BSI). BS EN12469 - Biotechnology - performance criteria for microbiological
safety cabinets. 2000.
19. British Standards Institution (BSI). BS 5726:2005 - Microbiological safety cabinets. Information to be
supplied by the purchaser and to the vendor and to the installer, and siting and use of cabinets.
Recommendations and guidance. 24-3-2005. p. 1-14
20. Ison CA. Neisseria gonorrhoeae. In: Gillespie SH, Hawkey PM, editors. Principles and Practice of
Clinical Microbiology. Chichester: John Wiley and Sons; 2005. p. 215-24.
21. Ison CA, Davies AJ, Hawkey PM. Bacteriology of the genital tract. In: Hawkey PM, Lewis D, editors.
Medical Microbiology. 2nd ed. Oxford University Press; 2004. p. 93-120.
22. D'Amato RF, Eriquez LA, Tomfohrde KM, Singerman E. Rapid identification of Neisseria gonorrhoeae
and Neisseria meningitidis by using enzymatic profiles. J Clin Microbiol 1978;7:77-81.
23. Alexander S, Ison C. Evaluation of commercial kits for the identification of Neisseria gonorrhoeae. J Med
Microbiol 2005;54:1-5.
24. British Society for Antimicrobial Chemotherapy. BSAC Disc diffusion method for antimicrobial
susceptibility testing. 2005.
25. Whittington WL, Rice RJ, Biddle JW, Knapp JS. Incorrect identification of Neisseria gonorrhoeae from
infants and children. Pediatr Infect Dis J 1988;7:3-10.
26. Turner A, Gough KR, Jephcott AE. Comparison of three methods for culture confirmation of Neisseria
gonorrhoeae strains currently circulating in the UK. J Clin Pathol 1995;48:919-23.
27. Boyce JM, Mitchell EB, Jr. Difficulties in differentiating Neisseria cinerea from Neisseria gonorrhoeae in
rapid systems used for identifying pathogenic Neisseria species. J Clin Microbiol 1985;22:731-4.
28. Ho BS, Feng WG, Wong BK, Egglestone SI. Polymerase chain reaction for the detection of Neisseria
gonorrhoeae in clinical samples. J Clin Pathol 1992;45:439-42.
29. Liebling MR, Arkfeld DG, Michelini GA, Nishio MJ, Eng BJ, Jin T, et al. Identification of Neisseria
gonorrhoeae in synovial fluid using the polymerase chain reaction. Arthritis Rheum 1994;37:702-9.
30. Martin IM, Ison CA, Aanensen DM, Fenton KA, Spratt BG. Rapid sequence-based identification of
gonococcal transmission clusters in a large metropolitan area. J Infect Dis 2004;189:1497-505.
31. Yazdankhah SP, Caugant DA. Neisseria meningitidis: an overview of the carriage state. J Med Microbiol
2004;53:821-32.
32. Vazquez JA, Arreaza L, Block C, Ehrhard I, Gray SJ, Heuberger S, et al. Interlaboratory comparison of
agar dilution and Etest methods for determining the MICs of antibiotics used in management of Neisseria
meningitidis infections. Antimicrob Agents Chemother 2003;47:3430-4.
33. Public Health England. Laboratory Reporting to Public Health England: A Guide for Diagnostic
Laboratories. 2013. p. 1-37.
34. Department of Health. Health Protection Legislation (England) Guidance. 2010. p. 1-112.
35. Scottish Government. Public Health (Scotland) Act. 2008 (as amended).
36. Scottish Government. Public Health etc. (Scotland) Act 2008. Implementation of Part 2: Notifiable
Diseases, Organisms and Health Risk States. 2009.
37. The Welsh Assembly Government. Health Protection Legislation (Wales) Guidance. 2010.
38. Home Office. Public Health Act (Northern Ireland) 1967 Chapter 36. 1967 (as amended).

Ricerche Microbiologiche: Procedure Standard del Regno

Transcript

Documenti analoghi

N. meningitidis N gonorrheae

ricerca di personale medico - Ordine dei Medici di Bologna

n`assemblea di medici a Catania

Meningite a Cracovia

scheda tecnica : chiarello frc

BBL Chocolate II Agar Slants (GC II Agar with Hemoglobin and

Neisseria gonorrhoeae

PROCEDURA NEGOZIATA Acquisto terna gommata nell`ambito dei

Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito