variazioni morfologiche cellulari nella diagnosi delle intolleranze

VARIAZIONI MORFOLOGICHE
CELLULARI NELLA DIAGNOSI DELLE
INTOLLERANZE ALIMENTARI
Dott. K. Carr
Università di Sunderland - GB
Traduzione a cura di: Dott.ssa Rossella Cafuoti
E-mail: [email protected]
Università di Sunderland
Inghilterra
Cytotoxic Test
I cambiamenti morfologici delle cellule
nella diagnosi delle intolleranze alimentari
ARU - Unità di Ricerca sull’Autismo presso l’Università di Sunderland (Regno Unito)
09/08/2007
1
Unità di Ricerca sull’Autismo (ARU).
• La ARU ha sede presso l’Università di Sunderland, nel
Regno Unito.
• E’ stata fondata nel 1982.
• La ARU ha un ruolo essenziale nell’ambito della ricerca
sulle cause dell’autismo.
• Le ricerca si basa principalmente sull’analisi delle urine e
sulla verifica dell’efficacia di diete prive di glutine/caseina.
09/08/2007
2
Cos’è il Cytotoxic Test?
• Nel 1956 Black propose l’utilizzo delle reazioni
citotossiche come sistema di diagnosi delle intolleranze
alimentari.
• Conosciuto inizialmente come Bryan test, Test sulle
intolleranze metaboliche, o test di sensibilità.
• Il Cytotoxic test consiste nell’aggiunta di allergeni
alimentari al sangue o leucociti.
09/08/2007
3
Perchè il Cytotoxic Test?
• Per determinare l’efficacia degli studi basati sul test
citotossico.
• Per studiare i meccanismi di reazione.
• Per verificare l’esistenza di legami fra intolleranze
alimentari ed autismo.
09/08/2007
4
Come si esegue il Cytotoxic test?
• Mescolare 5cm3 di sangue intravenoso con 3.8%w/v di
citrato di sodio.
• Centrifugare per separare i globuli bianchi (leucociti).
• Mescolare con plasma e acqua distillata.
• Disporre su vetrini da laboratorio trattati con estratti di
sostanze alimentari.
• Esaminare i cambiamenti morfologici in atto.
09/08/2007
5
Quali alimenti?
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
09/08/2007
Farina (frumento)
Lievito
Riso
Mais
Soia
Latte
Bovini
Uova
Pollo
Maiale
Coniglio
Zucchero
Pomodoro
Patate
Carciofi
Fagioli
Piselli
Oliva
Aglio
Trota
Salmone
Merluzzo
Cicoria
Tonno
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Gamberi
Carote
Caffè
Tè
Cacao
Mela
Banana
Arancia
Limone
Ananas
Uva
Fragola
Ciliegia
Pesca
Mandorla
Noce
Camomilla
Orzo
Grano Saraceno
Lenticchia
Tacchino
Cipolla
Peperone
Cavolfiore
6
Reazione negativa
09/08/2007
7
Reazione positiva
09/08/2007
8
Gradi di reazione
Esistono 4 gradi di reazione.
• 1° grado – Nessun cambiamento nella struttura dei
leucociti, globuli rossi impilati.
• 2° grado – Leucociti rigonfi, globuli rossi impilati.
• 3° grado –Leucociti vacuolizzati, nessun impilamento dei
globuli rossi.
• Grade 4 – Disgregazione dei leucociti, nessun
impilamento dei globuli rossi.
09/08/2007
9
Reazione di 1° grado
09/08/2007
10
Reazione di 2° grado
09/08/2007
11
Reazione di 3° grado
09/08/2007
12
Reazione di 4° grado
09/08/2007
13
Risultati a confronto
Confronto di una reazione di 1° grado
• Vetrino in alto: Natural S.r.l.
• Vetrino in basso: ARU
09/08/2007
14
Risultati a confronto
Confronto di una reazione di 2° grado
• Vetrino in alto: Natural S.r.l.
• Vetrino in basso: ARU
09/08/2007
15
Risultati a confronto
Confronto di una reazione di 3° grado
• Vetrino in alto: Natural S.r.l.
• Vetrino in basso: ARU
09/08/2007
16
Risultati a confronto
Confronto di una reazione di 4° grado
• Vetrino in alto: Natural S.r.l.
• Vetrino in basso: ARU
09/08/2007
17
Variazioni nella metodica citotossica
• Perchè sperimentare dei cambiamenti?
• Per verificare l’efficacia del metodo
• Per verificare le cause delle reazioni
• Quali cambiamenti?
09/08/2007
18
Variazioni nella metodica citotossica
• Temperatura
I test erano effettuati ad una temperatura compresa fra 0, 10
e 25°C
• Volume dell’acqua distillata aggiunta
Il volume dell’acqua distillata aggiunta variava fra 0 e 100 µl
• Velocità della centrifuga
Da 1000 a 2000 rpm per 10 minuti
09/08/2007
19
Variazioni nella metodica citotossica
• Tempo di analisi del campione: entro 72 ore dal
prelievo
• Rapporti fra globuli rossi e plasma
• pH
09/08/2007
20
Variazioni nella metodica citotossica
• Concentrazione del citrato di sodio
La concentrazione utilizzata era da 1%w/v a 5%w/v
• Tempo di analisi dei vetrini coprioggetto sigillati
I vetrini coprioggetto erano sigillati al vetrino usando
materiale sigillante ed i risultati osservati dopo 10 ore.
• Colorazione delle cellule
09/08/2007
21
Perchè colorare le cellule di sangue
•
•
•
•
•
Per far risaltare le cellule differenti.
Per identificare più facilmente le cellule nel campione.
Globuli rossi impilati – grigio.
Citoplasma – rosa/arancio.
Granulociti neutrofili – porpora.
09/08/2007
22
Colorazione del sangue
09/08/2007
23
Come abbiamo eseguito i test?
• I pazienti hanno compilato un questionario prima di
sottoporsi alle analisi.
• I medici che hanno analizzato i pazienti non hanno avuto
accesso ai risultati dei test.
• I risultati delle analisi sono stati valutati
indipendentemente e sono stati in seguito comparati con i
risultati dei questionari.
• I risultati sono stati discussi insieme ai pazienti.
09/08/2007
24
Test senza acqua
• Eseguiti su vetrini puliti
senza aggiunta di antigeni.
• Globuli rossi impilati
integri.
• Nessun cambiamento
nella struttura dei
leucociti.
09/08/2007
25
Test con acqua
• Eseguiti su vetrini puliti
senza aggiunta di antigeni.
• Aggiunta di 50µl di acqua.
• Nessuna disgregazione
dei globuli bianchi.
• Struttura dei leucociti
inalterata.
09/08/2007
26
Test con aggiunta di una maggiore
quantità di acqua
• Eseguiti su vetrini puliti
senza aggiunta di antigeni.
• Aggiunta di 100µl di acqua.
• Disgregazione dei globuli
rossi.
• Struttura dei leucociti
inalterata.
09/08/2007
27
Risultati
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Temperatura
Volume dell’acqua distillata aggiunta
Velocità della centrifuga
Tempo intercorso fra il relievo di sangue e la sua analisi
Rapporto fra globuli rossi e plasma
pH
Concentrazione della soluzione
Concentrazione del citrato di sodio
Tempo di analisi dei vetrini
Colorazione delle cellule
09/08/2007
28
Confronto fra i risultati dei test e le
risposte al questionario
• I pazienti che avevano dichiatato di percepire una
maggiore sensibilità verso certi alimenti hanno
manifestato anche risultati positivi al test.
• Alcuni alimenti hanno avuto risultati positivi, anche se i
risultati non coincidevano con quelli del questionario.
09/08/2007
29
Risultati inaspettati
Soggetti che mangiavano quotidianamente quantità
esagerate di un determinato cibo hanno riscontrato
risultati positivi.
Alcuni alimenti hanno riscontrato risultati positivi, anche
se i pazienti hanno dichiarato di non farne uso.
09/08/2007
30
Studi futuri
•
•
•
•
•
Controllo dei pazienti dopo l’eliminazione dei cibi tossici.
Analisi del sangue negli adulti autistici.
Analisi delle singole proteine.
Esecuzione del test soltanto con globuli bianchi.
Verifica sui globuli bianchi maggiormente reattivi al test.
09/08/2007
31