4 Descriptif de I`appareil
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4 Descriptif de I`appareil
Multiporator® Bedienungsanleitung Operating Manual Mode d'emploi Istruzioni d'impiego Manual de Instrucciones eppenclorf Bedienungsanleitung 4 Operating Manual 43 Mode d'emploi 82 Istruzioni d'impiego : 121 Manual de Instrucciones 160 EG-Konformitatserklarung EC Conformity Declaration Declaration de conformite Dichiarazione di conformita CE Declaracion de conformidad CEE 199 Nachdruck und Vervielfaltigung - auch auszugsweise - nur mit Genehmigung. No part of this publication may be reproduced without the prior permission of the copyright owner. Toute reproduction, complete ou partielle et quel que soit le proede est interdiete, sauf autorisation expresse de notre part. Ristampa e riproduzione - anche di estratti - solo con autorizzazione. Reimpresion y copia - incluso parciales - solo con autorizacion. Copyright® 2000 by Eppendorf AG, Hamburg B 4308 900.016-03/0800 Inhaltsverzeichnis 1 Allgemeines 5 2 Verwendungszweck 6 3 Sicherheitshinweise 7 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.7.1 4.8.5 4.8.6 4.9 Geratebeschreibung Lieferumfang Inbetriebnahme Kuvetteneinschub Tastatur Tasten und Tastenkombinationen Display Elektroporation eukaryotischer Zellen und Bakterien / Hefen Einschub (Elektroporation) zum Anschluss von externen Elektroden (Option) Zellfusion (Option) Optimierung der Zellfusion (Kontrolle unter dem Mikroskop) Reinigung der Mikro-Fusionskammer Helix-Fusionskammer BefCillen der Helix-Fusionskammer und Einsetzen in den Fusionseinschub Durchfiihren der Fusion und Entnahme der Zellsuspension. Reinigung und Desinfektion der Helix-Fusionskammer Druckeranschluss / Drucker (Option) 21 22 23 23 5 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 Arbeitstechniken Modus eukaryotische Zellen Modus Bakterien und Hefen (Option) Modus Zellfusion (Option) Funktion: Alignment (Zellausrichtung) Durchfuhrung der Zellfusion 27 27 29 31 31 33 6 Fehlermeldungen 36 7 7.1 7.2 Wartung, Service und Pflege Desinfektion Reinigung 38 38 38 8 Technische Daten 39 9 Bestellinformationen 41 4.8 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 9 10 11 11 12 12 15 16 17 18 18 19 20 1 Allgemeines Der Multiporator® ist fur die Elektroporation von eukaryotischen Zellen ausgelegt. Als Optionen besteht die Moglichkeit, mit weiteren Modulen die Elektroporation an Bakterien und Hefen sowie Zellfusion durchzufuhren. In dieser Anleitung wird auf alle Varianten der Bedienung des Multiporators eingegangen. Der Multiporator® zeichnet sich dadurch aus, dass bei der Elektroporation eukaryotischerZellen und bei derZellfusion die eingegebenen Parameter durch interne Berechnung der Entladungskurve exakt eingehalten werden. 2 Verwendungszweck Das Geratesicherheitsgesetz und die Industrienormen schreiben vor: - Gerat nur fur zelltechnologische Experimente verwenden Das Einsatzspektrum umfasst die Elektroporation von Hefen und Bakterien und eukaryotischen Zellen sowie die Zellfusion. - Nur original Eppendorf Zubehor verwenden Es durfen nur original Zubehorteile verwendet werden. Sie sind auf die optimale Funktion des Multiporators abgestimmt. Ausgenommen sind nur vom Hersteller empfohlene Zusatzgerate. Anderenfalls erloschen sofort samtliche Gewahrleistungs- und Haftungsanspriiche. 3 Sicherheitshinweise Die folgenden Bestimmungen sollten zur personlichen Sicherheit unbedingt beachtet werden! • Bedienungsanleitung beachten Nur nach der Bedienungsanleitung vorgehen! Das Gerat darf nur an Stromversorgungsnetzen mit Schutzleiter betrieben werden. Vor Inbetriebnahme mussen die Spannungsangaben auf dem Typenschild mit den Netzbedingungen verglichen werden! Vor dem Offnen des Gehauses den Netzstecker ziehen! Das Gerat darf nicht in explosionsgefahrdeten Raumen betrieben werden! • Es ist sicherzustellen, dass keine Flussigkeiten in das Gerat oder die Einschube gelangen! • Das Gerat ist nur fur in-vitro-Anwendungen vorgesehen! • Gerat nur fur die beschriebene Verwendung benutzen. Keine anderen Teile, Gerate, Werkzeuge etc. als von Eppendorf AG beschrieben in den Kuvetteneinschub bringen! Hochspannung! • Nur das aufgefuhrte Zubehor verwenden. Anderes Zubehor nur verwenden, wenn eine Bescheinigung zur sicherheitstechnisch unbedenklichen Verwendungsfahigkeit von der Eppendorf AG vorliegt! • Elektrische Kopplungen mit Geraten, die in dieser Bedienungsanleitung nicht erwahnt sind, sind nur nach RiJcksprache und Zustimmung des Herstellers erlaubt! 3 Sicherheitshinweise • Helix-Fusionskammer vorsichtig behandeln! Bei abgelosten oder beschadigten Elektroden ist ein gesicherter Vorgang nicht mehr gewahrleistet! In diesem Fall die Helix-Fusionskammer nicht mehr verwenden! Helix-Fusionskammer nicht wahrend der Fusion offnen, sondern das Ende der Fusion abwarten! • Mikro-Fusionskammer vorsichtig behandeln! Zellsuspension vorsichtig einfullen! Die Elektroden sollten nach Moglichkeit nicht mit der Pipettenspitze beruhrt Oder verschoben werden! Beschadigungsgefahr! Wahrend der Zellausrichtung/Fusion direkten Kontakt mit den Elektroden vermeiden! • Die Zellausrichtung/Fusion darf nur bei angeschlossener MikroFusionskammer erfolgen! Das Kabel ist nur zum Anschluss an die Mikro-Fusionskammer gedacht! Andere Anschliisse sind nicht zulassig! Den Stecker nicht in Flussigkeiten halten! • Die Haftung fur die Funktion des Gerats geht in jedem Fall auf den Eigentiimer oder Betreiber uber, soweit das Gerat von Personen, die nicht dem Eppendorf-Service angehoren, gewartet oder instandgesetzt wird und wenn eine Handhabung erfolgt, die nicht der bestimmungsgemaBen Verwendung entspricht. Fur Schaden, die durch Nichtbeachten der Hinweise eintreten, haftet die Eppendorf AG nicht. Gewahrleistungs- und Haftungsbestimmungen derVerkaufsund Lieferbedingungen der Eppendorf AG werden durch vorstehende Hinweise nicht erweitert. • Der Nachdruck der Bedienungsanleitung oderTeile daraus ist nur mit schriftlicher Genehmigung der Eppendorf AG erlaubt! • Die Eppendorf AG behalt sich das Recht vor, technische Anderungen an diesem Produkt vorzunehmen! 4 Geratebeschreibung Das Gerat wird in vier Ausbaustufen angeboten. Als Grundgerat zur Elektroporation von eukaryotischen Zellen, als Ausbaustufe mit der zusatzlichen Moglichkeit, Bakterien und Hefen zu elektroporieren. Als weitere Ausbaustufe steht ein integriertes Modul zurZeilfusion zurVerfugung. Diese beiden Ausbaustufen sind auch beide zusammen als vierte Variante erhaltlich. Der Multiporator® wird uber eine leicht verstandliche Tastatur mit Display bedient. Neben dem Tastaturblock befindet sich der Einschub fur die Elektroporationskuvette. fa P Abb. 1: Multiporator®, Vorderansicht 4 Geratebeschreibung 4.1 Lieferumfang Grundgerat: Multiporator® zur Elektroporation von eukaryotischen Zellen mit Netzkabel Einschub fur Elektroporationskuvetten Elektroporationskuvetten (2 mm, 4 mm Elektrodenabstand) Puffer Hypo- und Isoosmolar fur Elektroporation Bedienungsanleitung und Basis Applikations-Manual Option Bakterienmodul: Grundgerat inkl. Zubehor mit integriertem Bakterienmodul zusatzlich Elektroporationskuvetten (1 mm Elektrodenabstand) Option Zellfusionsmodul: Grundgerat inkl. Zubehor mit integriertem Zellfusionsmodul Helix-Fusionskammer (0,2 mm Elektrodenabstand)) Einschub fur Helix-Fusionskammer Mikro-Fusionskammer (0,2 mm Elektrodenabstand) mit speziellem Einschub Puffer Hypo- und Isoosmolar fur Zellfusion Option Fusions- und Bakterienmodul: Grundgerat inkl. entsprechendem Zubehor mit integriertem Fusions- und Bakterienmodul 10 4 Geratebeschreibung 4.2 Inbetriebnahme Auf der Ruckseite des Multiporators befindet sich die Netzeingangsbuchse mit Sicherung und Netzschalter. Zur Inbetriebnahme das Netzkabel in die Netzeingangsbuchse stecken und anschlieRend mit dem Netz verbinden. Das Gerat mit dem Netzschalter einschalten. Abb. 2: Multiporator®, Ruckseite linke Seite Netzanschluss rechte Seite Druckeranschluss 4.3 Kiivetteneinschub Der Einschub fur die Elektroporationskiivetten befindet sich vorn am Gerat neben dem Tastaturblock. Zum Entnehmen der Kuvette den Einschub herausziehen. Eine neue Kuvette wird so eingesetzt, dass die Nase der Kuvette in den hinteren Schiitz passt. Den Kuvetteneinschub mit der Kuvette ganz in das Gerat hineinschieben. Im Gerat befindet sich ein Sensor, der feststellt, ob sich eine Kuvette im Kuvetteneinschub befindet. Anmerkung: Soil das Gerat transportiert werden, sollte der Einschub mit einer leeren Kuvette bestuckt sein oder separat transportiert werden. Fur die Ausbaustufen Zellfusion werden andere Einschube verwendet. 11 4 Geratebeschreibung 4.4 Tastatur Uber die Tastatur werden Parameter eingegeben und die gewunschten Elektroporationsmodi angewahit sowie die Elektroporation gestartet. Je nach Ausbaustufe konnen 1 bis 4 Modi angewahit werden. UberTastenkombinationen konnen weiterhin das Datum und die Uhrzeit sowie die Lautstarke des akustischen Signales eingestellt werden. Multiporator eppendorf U 500V t 220 | n 1 UME 100% Abb. 3: Bedienoberflache mit Tasten und Display 4.5 Tasten und Tastenkombinationen SET Mit der Taste SET wird der gewunschte Parameter angewahit. Dargestellt wird dieser durch einen Unterstrich im Display. Urn einen weiteren Parameter anzuwahlen, wird entsprechend oft die SET-Taste betatigt. Urn eine SETSequenz zu beenden, kann entweder die SET-Taste so oft gedruckt werden bis der Unterstrich im Display nicht mehr vorhanden ist oder durch Drucken der Taste MODE oder START (Anmerkung: Taste MODE schaltet auf anderen Modus, wenn vorhanden). Uber die Pfeil-auf-, Pfeil-abTasten werden die entsprechenden Parameter verandert. Ist der niedrigste Wert erreicht, wird auf den hochsten Wert gesprungen. Entsprechendes gilt in der anderen Richtung. 12 4 Geratebeschreibung MODE Mit der Taste MODE wird der gewunschte Modus aktiviert, mit dem die Elektroporation ausgefiihrt werden soil. Es konnen nur die Modi angewahit werden, die der Gerateausbaustufe entsprechen. Das heiBt, dass bei der maximalen Ausbaustufe 3 Modi und bei der Basisversion der Modus fur eukaryotische Zellen zur Verfugung stehen. Im Display erscheint dann das entsprechende Symbol: 0 : Modus fur eukaryotische Zellen Ausbaustufe: Grundgerat Verwendeter Puls: Abklingende e-Funktion O : Modus fur Bakterien und Hefen Ausbaustufe: Bakterienmodul Verwendeter Puls: Abklingende e-Funktion (zS • Modus fur Zellfusion Ausbaustufe: Fusionsmodul Verwendeter Puls: Rechteckpuls Start START Mit der Taste START wird die entsprechende Anwendung ausgelost. Pfeiltasten Mit den Pfeiltasten werden die angewahlten (unterstrichenen) Parameter auf- oder absteigend verandert. 13 4 Geratebeschreibung n Datum einstellen Durch gleichzeitiges Drucken derTasten SET und MODE kann die Datums- und Uhrzeiteinstellung aktiviert werden. Durch weiteres Drucken der SETTaste springt der Unterstrich in der Datums- und Uhrzeitanzeige von links nach rechts. Auf diese Weise konnen so mit den Pfeiltasten die Einstellungen verandert werden. Um die Datumseinstellung zu beenden, kann entweder die SET-Taste so oft gedruckt werden bis der Unterstrich im Display nicht mehrvorhanden ist oder durch Drucken der Taste MODE oder START (Anmerkung: Taste MODE schaltet auf anderen Modus, wenn vorhanden). Start Lautstarke einstellen Durch gleichzeitiges Drucken derTasten MODE und START kann die Lautstarkeeinstellung fur die akustischen Signale aktiviert werden. Dadurch erscheint in der untersten Zeile des Displays die Anzeige "VOLUME" mit einer Prozentzahl. Diese Zahl gibt die Lautstarke an. Die Zahl kann uber die Pfeiltasten verandert werden. Um die Lautstarkeeinstellung zu beenden, konnen alternate die SET-, MODE- oder START-Taste gedruckt werden (Anmerkung:Taste MODE schaltet auf anderen Modus, wenn vorhanden). Die Anzeige "VOLUME" wird ausgeblendet. ffesef Soil ein Versuch abgebrochen werden, ist dies nur uber den Netzschalter moglich. Dieser dient ebenfalls als Reset-Schalter. 14 4 Geratebeschreibung 4.6 Display Im Display werden die fur das Experiment relevanten Parameter in den Zeilen 2 bis 4 fett und groBer dargestellt. Die Parameter und ihre Anzahl unterscheiden sich abhangig vom gewahlten Modus. In der obersten Zeile werden immer das Datum und die Uhrzeit dargestellt. In der untersten Zeile wird immer rechts der angewahlte Modus durch ein Zeichen symbolisiert: 0 : Modus fur eukaryotische Zeilen Gerateausbaustufe: Grundgerat O : Modus fur Bakterien und Hefen Gerateausbaustufe: Bakterienmodul O : Modus fur Zellfusion Gerateausbaustufe: Fusionsmodul In dieser Zeile konnen gegebenenfalls auch die Anzeige "VOLUME" Oder die verbleibende Zeit des Experimentes zusatzlich angezeigt werden. 13:37 12.AUG.00 U 500V T n VOLUME 100% 220MS 1 Beispiel des Displays zur Lautstarkeneinstellung 0 Wahrend und nach einem Experiment andert sich die Anzeige und gibt die entsprechenden Informationen aus. 15 4 Geratebeschreibung 4.7 Elektroporation eukaryotischer Zellen und Bakterien / Hefen Die jeweiligen Experimente werden in Einmalkiivetten durchgefiihrt. Das biologische Material wird im Spalt zwischen den Elektroden vorgelegt. Die auf den Kuvetten vorgeschriebene Menge ist einzuhalten. Ein Uberstand oberhalb der Elektroden beeinflusst das Experiment nicht, aber die Effizienz des Experimentes wird herabgesetzt. Ein mattiertes Fenster ermoglicht das Beschriften der Kuvette. Die an der Kuvette befindliche Kunststoffnase dient zum richtigen Einsetzen in den Kuvetteneinschub. Der Deckel verschlieBt die Kuvette. Als Schutz vor Uberdruck wird die Kuvette mit dem Deckel aber nicht hermetisch abgeschlossen. Deshalb sollte eine befullte Kuvette nur aufrecht transportiert werden, da sonst die Gefahr besteht, dass biologische Material austritt. Deckel Kunststoffkuvette Kunststoffnase Elektroden Spalt Abb. 4: Schematische Darstellung der Elektroporationskuvette Der Kuvetteneinschub wird an dem ausgebildeten Griff aus dem Multiporator® herausgezogen. Die Kuvette wird blasenfrei befullt. Die Kuvette wird in die hintere Vertiefung des Kuvetteneinschub so eingesetzt, dass die Kuvettennase in den langen Schlitz passt und die Kuvette auf dem Boden des Kuvetteneinschubs steht. Der Kuvetteneinschub wird mit der eingesetzten Kuvette bis zum Anschlag in das Gerat geschoben. Der Kuvetteneinschub kann gekiihlt aufbewahrt werden. Fur den Transport des Gerats ist zu beachten, dass der Kuvetteneinschub ohne Kuvette aus dem Gerat rutschen kann. 16 4 Geratebeschreibung 4.7.1 Einschub (Elektroporation) zum Anschluss von externen Elektroden (Option) Im nichtserienmaGigen Zubehor (siehe Bestellinformationen) gibt es einen Einschub fur die Elektroporation (Symbol 0 , Spannungsentladung (iber eine abklingende e-Funktion), an den externe Elektroden angeschlossen werden konnen. Dieses sollte uber4 mm-Laborstecker mit Beruhrungsschutz erfolgen! Dieser Einschub kann auch im Modus Zellfusion (Symbol (£3, Rechteckpuls) verwendet werden, wenn die Spannungseinstellung fur die Zellausrichtung ("alignment") auf "0" gesetzt wird. 1 Anschlussbuchse Masse (schwarz) 2 Anschlussbuchse Pluspol (rot) Beim Anschluss externer Elektroden sind die Sicherheitsbestimmungen (Hochspannung) und die EMV-Vorschriften des Landes maBgebend und einzuhalten (EMV: Elektromagnetische Vertraglichkeit)! Alle angeschlossenen Geratschaften unterliegen derVerantwortung des Anwenders! 17 4 Geratebeschreibung 4.8 Zellfusion (Option) 4.8.1 Optimierung der Zellfusion (Kontrolle unter dem Mikroskop) Urn die Parameter der Zellfusion fur die zu untersuchenden Zellen zu optimieren, konnen die Zellausrichtung und die Zellfusion mit einer speziellen Mikro-Fusionskammer unter dem Mikroskop verfolgt werden. Die Mikro-Fusionskammer wird uber das Kabel (ca. 1 m) mit dem Einschub verbunden. 1 2 Einschub der Mikro-Fusionskammer 1 Kontakte 2 Erdungsfedern Mikro-Fusionskammer 1 Koaxialanschluss Achtung: Mikro-Fusionskammer vorsichtig behandeln! Zellsuspension vorsichtig einfullen! Die Elektroden sollten nach Moglichkeit nicht mit der Pipettenspitze beruhrt oder verschoben werden! Beschadigungsgefahr! Wahrend der Zellausrichtung/Fusion direkten Kontakt mit den Elektroden vermeiden! Die Fusion darf nur bei angeschiossener Mikro-Fusionskammer erfoigen! 18 - Den Einschub der Mikro-Fusionskammer fest in den Multiporator® schieben. - Die mit ca. 50 ul der Zellsuspension gefullte Mikro-Fusionskammer auf das Mikroskop legen. Hinweis: Durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension auf den Bereich der Elektroden kann die Zahl der Zellen zwischen den Elektroden maximiert werden. - Zur Arretierung auf dem Mikroskoptisch konnen z. B. die Klammern genutzt werden, die auch zur Befestigung eines Objekttragers verwendet werden. ^ 4 Geratebeschreibung Die Mikro-Fusionskammer mit dem Kabel verbinden. Elektroden und Zellen fokussieren. Die eingestellten Parameter iiber die Taste START unter mikroskopischer Betrachtung ablaufen lassen. 200 urn Zellen zwischen den Elektroden in der Zellausrichtung (alignment) Zellen nach der Fusion und Fusionsprodukte Das maximale Fullvolumen der Mikro-Fusionskammer betragt ca. 200 ul. Die ermittelten und eingestellten Parameter sind direkt auf die HelixFusionskammer ubertragbar und anwendbar. 4.8.2 Reinigung der Mikro-Fusionskammer Der Inhalt der Mikro-Fusionskammer wird mit Aqua bidest. ausgespult (Spritzflasche), hartnackige Zellreste konnen mit einer weichen Zahnburste vorsichtig in Langsrichtung der Elektroden entfemt werden (Der Elektrodenabstand darf nicht verandert werden!). Ein Nachspulen mit Ethanol (70 %, unvergallt) beschleunigt den Trocknungsprozess. 19 4 Geratebeschreibung 4.8.3 Helix-Fusionskammer Die Zellfusion einer groBeren Zahl von Zellen wird in einer Helix-Fusionskammer durchgefiihrt. Schema der Helix-Fusionskammer Die Helix-Fusionskammer besteht aus einem Becher und einem Kern mit parallel gewickelten Platindrahten, den Elektroden. Sie sind als DoppelHelix urn den Kern gewickelt. Beide Teile werden miteinander verschraubt. Der Spalt zwischen Becher und Kern besitzt ein Fullvolumen von 250 |il. Die Helix-Fusionskammer wird uber den Koaxiaianschluss mit dem Einschub zur Zellfusion verbunden. 20 Becher Kern 1 Gewinde 1 Elektroden 2 Koaxiaianschluss HelixFusionskammer 1 Spalt fur Zellfusion Fusionseinschub 1 Kontakte 2 Koaxiaianschluss 4 Geratebeschreibung Der Abstand der gewickelten Platinelektroden betragt ca. 200 urn. Abb. 5: Mikroskopbild der Elektroden der Helix-Fusionskammer Achtung: Helix-Fusionskammer vorsichtig behandeln! Bei abgelosten oder beschadigten Elektroden ist ein gesicherter Vorgang nicht mehr gewahrleistet! In diesem Fall die Helix-Fusionskammer nicht mehr verwenden! 4.8.4 Befallen der Helix-Fusionskammer und Einsetzen in den Fusionseinschub Die Helix-Fusionskammer wird mit 250 ul Zellsuspension befullt. Zu beachten ist, dass die Flussigkeit exakt in die tiefste Stelle des Bechers pipettiert wird. Benetzungen am Rand oder der Wandung sind zu vermeiden. Sie fuhren zu einer schlechten Befiillung der Helix-Fusionskammer. Es bilden sich eventuell Luftblasen, die die Effektivitat des Experiments herabsetzen. In den stehenden Becher (im Stander) wird der Kern vorsichtig eingesetzt und vorsichtig in den Becher geschraubt. Durch das Schrauben wird die Zellsuspension in dem immer schmaler werdenden Spalt nach oben gedriickt. 21 4 Geratebeschreibung Beim Schrauben darauf achten, dass sich moglichst keine Luftblasen ausbilden. Bis zur DurchfiJhrung der Fusion die verschlossenen Helix-Fusionskammer uber Kopf auf dem Koaxialanschluss stehen lassen. 4.8.5 Durchfuhren der Fusion und Entnahme der Zellsuspension - Der Fusionseinschub wird test in das Gerat geschoben. 22 - Verschlossene Helix-Fusionskammer auf den Koaxialanschluss des Fusionseinschubes aufstecken und durch eine viertel Drehung einrasten. - Die Fusion wird mit den eingestellten Parametem (siehe Kap. 5.3) durchgefiihrt. - Die Helix-Fusionskammer vorsichtig durch eine viertel Drehung des Koaxialanschlusses losen und abnehmen. - Zum Offnen senkrecht stellen, z. B. in den Stander. - Den Kern vorsichtig aus dem Becher schrauben. - Die am Kern befindlich Zellsuspension mit einer geringen Menge des entsprechenden Mediums abspulen. - Die Zellsuspension aus dem Becher wird mit der abgespulten Zellsuspension vereinigt und entsprechend weiterbehandelt. 4 Gemtebeschreibung 4.8.6 Reinigung und Desinfektion der Helix-Fusionskammer Becher und Kern der Helix-Fusionskammer sollten direkt nach dem Experiment gut mit destilliertem Wasser gespult werden, um ein Eintrocknen zu verhindern. Bei starker Verschmutzung kann die Helix-Fusionskammer kurz im Ultraschallbad (eventuell mit Reinigungszusatz, z. B. Edisonite-Super) oder mit einersehr weichen (Zahn-)Burste gereinigt werden. Bei Reinigung mit der Burste ist zu beachten, dass in Richtung der Wicklung gebiirstet wird. Im anderen Fall konnen sich die Elektroden verschieben und die HelixFusionskammer unbrauchbar werden. AnschlieBend werden die Teile mit Ethanol (70 %, unvergallt) desinfiziert. Zum Trocknen im Stander unter sterilen Bedingungen staubfrei aufstellen. Nach dem Trocknen kann die Helix-Fusionskammer wieder eingesetzt werden. 4.9 Druckeranschluss / Drucker (Option) Der Multiporator® kann zu jedem Experiment ein Druckerprotokoll liefern, in dem die verwendeten Parameter, Datum und Uhrzeit eingetragen werden. Des weiteren konnen auf dem Druckerprotokoll weitere, das Experiment betreffende Daten wie Puffer, Konzentration, Zell-Linie etc. eingetragen werden. Auch werden im Fehlerfall die Fehlermeldungen gedruckt. Beispielhafte Ausdrucke fur die verschiedenen Anwendungen sind im folgenden dargestellt: 18.Aug.00 16:03:04 eppendorf Multiporator 4308 Higher Eucaryotic Cells U = 100 V, Cuvette Gap Width 1 mm x = 50 us, 2mm V4.00 n= 1 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 23 4 Geratebeschreibung 18.Aug.00 16:42:47 eppendorf Multiporator 4308 V4.00 Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, xa= 5.0 ms Cuvette Gap Width 1 mm 2mm 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature Fusion Chamber Strain / Cell Line A Cell Density A Strain / Cell Line B Cell Density B Buffer Temperature 24 U'_ = 8.0 V, U = 15 V, U"_ = 4.0 V, II Cell Fusion Multiporator 4308 n eppendorf II 18.Aug.00 16:17:49 20 s 100 us, 10s V4.00 n=3 4 Geratebeschreibung 18.Aug.97 15:59:08 eppendorf Multiporator 4308 V1.00 ******** ERROR 07 ******** ******** Short T ********* An die serielle Druckerschnittstelle auf der Ruckseite des Gerats konnen serielle Drucker angeschlossen werden. Ebenso ist es moglich, die Protokolle iiber ein PC-Terminalprogramm zur Dokumentation auszulesen. Hierfur wird ein Nullmodemkabel benotigt (9-polige Buchse / 9-polige Buchse, Bestell-Nr. 0013 610.525). Die Eppendorf AG bietet den folgenden Thermodrucker an. Beispielhaft ist zusatzlich die DIP-Schalterstellung fur einen IBM-kompatiblen Drucker beschrieben: Bestell-Nr. Druckertyp Thermoprinter DPU-414 0013 608.148 Zubehor Netzteil (230 V) 0013 608.172 Netzteil(115V) 0013 608.164 Thermopapier (10 Rollen) 6547 001.018 Anschlusskabel 9-polige Buchse / 9-poliger Stecker Kabelfuhrung 1:1 (fur Thermoprinter DPU-414) 0013 610.517 9-polige Buchse / 25-poliger Stecker 0013 610.533 Nullmodemkabel (IBM-kompatibel, z. B. fur Matrixdrucker Seikosha SP 2400 (Endlospapier) 25 4 Geratebeschreibung DIPSW settings Fiir Thermoprinter DPU-414 Z. B. fur Matrixdrucker Seikoshi1SP2400 (Endlospapier) Dip SW-1 Dip SW-1 1 (OFF): Input = Serial 2 (ON) : Printing Speed = High 3 (ON) : Auto Loading = ON 4 (ON) :AutoLF = ON 5 (ON) : Setting Command = Enable 6 (OFF): Printing 7 (ON) : Density 8 (ON) : = 1 0 0 % 1 (OFF) : USA 2 (OFF) : USA 3 (OFF) : USA 4 (ON) : IBM 5 (OFF) : Character Set 1 6 (ON) : 12 inches 7 (OFF) : LF only 8 (ON) : CR = CR + LF Dip SW-2 Dip SW-2 1 (OFF): Printing Columns = 80 2 (ON) : User Font Back-up = ON 3 (ON) : Character Select = Normal 4 (OFF): Zero = Slash 5 (ON) : International 6 (ON) : Character 7 (ON) : Set 8 (OFF): = USA 1 (ON) 2 (ON) 3 (ON) 4 (OFF) 5 (OFF) 6 (OFF) 7 (ON) 8 (OFF) Dip SW-3 1 (ON) : Data Length = 8 bits 2 (ON) : Parity Settings = No 3 (ON) : Parity Conditions = Odd 4 (OFF): Busy Control = XON/XOFF 5 (OFF): Baud 6 (ON) : Rate 7 (ON) : Select 8 (ON) : = 9600 bps 26 : 9600 Baud : 9600 Baud : XON/XOFF : No Parity : No Parity : 8 bits : Serial : No single sheet 5 Arbeitstechniken 5.1 Modus eukaryotische Zellen Dieser Modus wird im Display durch das Zeichen 0 symbolisiert. 1. Schritt - Parameter eingeben /andern - - Gegebenenfalls 12.AUG.00 fiber die Taste U 500V MODE auf eukaryotische Zellen urnschalten. Taste SET drucken, um den gewunschten Parameter anzuwahlen (Unterstrich). - Mit den Pfeiltasten die Parameter aufoder absteigend verandern. - Gegebenenfalls weitere Parameter mit SET- und Pfeiltasten andern. - Eingabe beenden. Die Parameter sind sofort wirksam und mussen nicht abgespeichert werden. Beispiel des Displays zur Elektroporation von 220MS eukaryotischen Zellen. 13:37 X n 2 Die relevanten Parame- © ter sind groB und fett dargestellt. U: Spannung, Einheit V (Volt), einstellbar im Bereich von 20-100 V in Einer-Schritten, von 100-1 000 V in Zehner-Schritten, von 1 000-1 200 V in EinhunderterSchritten. v. Zeitkonstante, Einheit us (Mikrosekunden), einstellbar im Bereich von 15-500 us in 5 |iS-Schritten. n: Anzahl der Pulse wahrend des Experimentes, einstellbar von 1-99. Zwischen den Pulsen wird jeweils eine Minute gewartet. Anmerkung: Die eingesteliten Parameter werden tatsachlich angewendet, Der Verlauf des Pulses wird intern berechnet, so dass der Verlauf der Entladungskurve (e-Funktion) entsprechend den eingegebenen Parametern eingehalten wird. Fur die Anwendung eines Rechteckpulses kann das Fusionsmodul verwendet werden (siehe hierzu Kap. 5.4). 27 5 Arbeitstechniken 2. Schritt - Elektroporation starten - Mitder Taste START die Elektroporation auslosen. - Im Display erscheint in der dritten Zeile die Information "Charge", die Ladung wird aufgebaut. - 12.AUG.00 U 500V 13:37 x 220|JS Charge 0 Nach Abschluss der Ladung kommt es zur Entladung, dargestellt durch einen Blitz in der dritten Zeile. 1st mehr als ein Puls ein- 12.AUG.00 13:37 gestellt, erscheint der U 500V X 220us Hinweis "Wait" mit der Wait noch zu wartenden Zeit. I\ 0:57 0 Nach Beendigung des 12.AUG.00 13:37 Experiments ertont ein U 500V X 220us akustisches Doppeln 2 signal und es erscheint wieder der Eingangsbild- READY SINCE 1:36 © schirm mit den eingestellten und verwendeten Parametern. Zusatzlich wird in der untersten Zeile die Zeit in Minuten und Sekunden seit Beendigung des Experiments angezeigt. Nach 99 Minuten oder bei Betatigung einer Taste erlischt diese Anzeige. 23 5 Arbeitstechniken 5.2 Modus Bakterien und Hefen (Option) Dieser Modus wird im Display durch das Zeichen O symbolisiert. 1. Schritt - Parameter eingeben /andern - - Gegebenenfalls 12.AUG.00 uber die Taste U 2000V MODE auf Bakterien und Hefen umschalten. Taste SET driicken, um den einstellbaren Parameter Spannung(U) anzuwahlen (Unterstrich). - Mit den Pfeiltasten die Parameter aufoder absteigend verandern. - Eingabe beenden. Die Parameter sind sofort wirksam und mussen nicht abgespeichert werden. X 13:42 Beispiel des Displays zur 5 ms Elektroporation von Bakterien und Hefen. Die relevanten Para- O meter sind groB und fett dargestellt. U: Spannung, Einheit V (Volt), einstellbarim Bereich von 200-1 000 V in Zehner-Schritten, von 1 000-2 500 V in EinhunderterSchritten. x: Zeitkonstante, Einheit ms (Millisekunden), auf 5,0 ms fest eingestellt. 29 5 Arbeitstechniken 2. Schritt - Elektroporation starten - Mitder Taste START die Elektroporation auslosen. - Im Display erscheint in der dritten Zeile die Information "Charge", die Ladung wird aufgebaut. - 12.AUG.00 U 2000V Charge O Nach Abschluss der Ladung kommt es zur Entladung, dargestellt durch einen Blitz in der dritten Zeile. Nach Beendigung des 12.AUG.00 Experimentes ertont ein U 2000V akustisches DoppelsiUa2003V gnal und es erscheint wieder der EingangsREADY SINCE bildschirm mit den eingestellten Parametern. In der dritten Zeile werden die tatsachlichen Parameter L)a und t a dargestellt. Zusatzlich wird in der untersten Zeile die Zeit in Minuten und Sekunden seit Beendigung des Experiments angezeigt. Nach 99 Minuten oder bei Betatigung einer Taste erlischt diese Anzeige. 30 13:42 5 ms x U a : Tatsachlich verwendete, gemessene Spannung, .1 ms EinheitV(Volt). 13:42 5 X \ 5 1:36 IDS O x : Tatsachlich verwena dete, gemessene Zeitkonstante, Einheit ms (Millisekunden), Werte < 0,8 werden als 0,8 ms dargestellt. 5 Arbeitstechniken 5.3 Modus Zellfusion (Option) 5.3.1 Funktion: Alignment (Zellausrichtung) Die Funktionen fur das Alignment werden durch die Symbole U'_ (vor dem Puls) und U"_ (nach dem Puls) in den Zeilen 2 und 4 des Displays dargestellt. 1. Schritt - Parameter eingeben /andern — Gegebenenfalls iiber die Taste MODE auf Fusion umschalten. XflQfp ^ F X Hn"ir*kpn urn die gewiinschten Parameter anzuwahlen (Unterstrich). - - Mit den Pfei Hasten die Parameter aufoder absteigend verandern. Wird ein Wert in den Zeilen U'_/U"_/Ur,auf "0" gesetzt, wird die jeweilige Funktion nicht ausgefiihrt. Dadurch konnen U'_ / U"_ einzeln oder nacheinander ohne Aktivierung des Fusionspulses ausgelost werden. Eingabe beenden, die Parameter sind sofort wirksam und mussen nicht abgespeichert werden. 12.AUG.00 U'_ Un U" 13:42 Beispiel des Displays zur Durchfiihrung des Align5V t 60s OV t 15s n2 ments U'_ ohne Aktivierung des Pulses Un und OV t 30s des Alignments U"_. €3 Die relevanten Parameter sind groB und fett dargestellt. U1 / U " : Wechselspannung, Einheit V (Volt), einstellbar: "0" und im Bereich von 1,0-10V in 0,1 V-Schritten. t: Dauer des Alignments 0-95 s, Einheit s (Sekunden) in 5 s-Schritten. Un: Spannung (Rechteckpuls), Einheit V (Volt), einstellbar: "0" und im Bereich von 5-100 V in 1 V-Schritten, von 100-300 V in 10 V-Schritten. t: Pulsdauer, Einheit us (Mikrosekunden), einstellbar 0-300 us in 5 |Js-Schritten. n: Anzahl der Pulse 0-99, einstellbar in Einer-Schritten. 31 5 Arbeitstechniken 2. Schritt - Alignment (Zellausrichtung) starten - - Mitder Taste START 12.AUG.00 13:42 das Alignment U'_ U'~ 5V t 60s auslosen. Un OV t 15s n2 In der vierten Zeile U"~ OV t 30s des Displays erscheint die Information / \ A / I die Wechselspannung liegt fur die gewahlte Dauer an. Nach Beendigung des Experiments ertont ein akustisches Doppelsignal und es erscheint wieder der Eingangsbildschirm mit den eingestellten und verwendeten Parametern. Zusatzlich wird in der untersten Zeile die verstrichene Zeit in Minuten und Sekunden seit Beendigung des Experimentes angezeigt. Nach 99 Minuten Oder bei Betatigung einer Taste erlischt diese Anzeige. 32 5 Arbeitstechniken 5.3.2 Durchfiihrung der Zellfusion 1. Schritt - Parameter eingeben / andern - Taste SET drucken, 12.AUG.00 13:42 Beispiel des Displays zur um die gewiinschDurchfuhrung der ElekU'_ 5V t 30s ten Parameter Up 30V t 15ps n2 trofusion mit aktivierten anzuwahlen Alignments U'_ / li\. U". 5V t 30s (Unterstrich). - Mit den Pfeiltasten Beispiel des Displays zur die Parameter auf13:42 Durchfuhrung der Elek12.AUG.00 oder absteigend t 30s trofusion mit inaktivierverandern. Je nach Up 30V t 15MS n2 tem Alignment U'_. Wahl der Parameter U"~ 5V t 30s fur U'_ und U"_ Die relevanten Parakann die Fusion meter sind groB und fett wahlweise ohne dargestellt. Alignment mit nur Un: Spannung, einer oder mit beiEinheit V (Volt), den Alignmenteinstellbar: Funktionen kom"0" und im Bereich biniert werden. von 5-100 V Eingabe beenden. in 1 V-Schritten, Die Parameter sind von 100-300 V sofort wirksam und in 10V-Schritten. mussen nicht abget: Pulsdauer, speichert werden. Einheit us (Mikrosekunden), einstellbar 0-300 us in 5 us-Schritten. u_ ov - Wechselspannung, Einheit V (Volt), einstellbar: "0" und im Bereich von 1,0-10 V in 0,1 V-Schritten. n: Anzahl der Pulse 0-99, einstellbar in Einer-Schritten. 33 5 Arbeitstechniken 2. Schritt - Zellfusion starten - Mit der Taste START die Zellfusion auslosen. - Im Display erscheint in der vierten Zeile kurz die Information "Charge", die Ladung wird aufgebaut. 12.AUG.00 (-3 12.AUG.00 34 13:42 U'_ 5V t 30s Un 30V t 15us n2 Charge 13:42 - Wan rend des LaU'_ 5V t 30s devorgangs liegt Un 30V t 15ps n2 schon die Wechselspannung U'_ § 0:23 £D fur die ausgewahlte Dauer an. Die Wechselspannung wird durch ~ (Sinusschwingung) angezeigt. - Nach der vorgezahlten Alignmentzeit (0-95 Sekunden) kommt es zur Entladung, dargestellt durch einen Blitz in der vierten Zeile. In Abhangigkeit von der eingegebenen Anzahl n erfolgt bei n >1 jeweils nach einer Sekunde eine weitere Entladung. 5 Arbeitstechniken - Nach Abschluss der Entladungenliegtfiir die eingestellte Dauer (0-99 Sekunden) die Wechselspannung U"_ an. Die verbleibende Gesamtzeit des Experiments wird in der unteren Zeile permanent angezeigt. Nach Beendigung des 13:42 12.AUG.00 Experimentes ertont U'_ 5V t 30s ein akustisches Doppel- U n 30V t 15MS n2 signal und es erscheint U"_ 5V t 30s wieder der EingangsREADY SINCE 1:36 bildschirm mit den eingestellten und verwendeten Parametern. Zusatzlich wird in der untersten Zeile die Zeit in Minuten und Sekunden seit Beendigung des Experiments angezeigt. Nach 99 Minuten oder bei Betatigung einer Taste erlischt diese Anzeige. Hinweis: Im Fall von U'_ / U"_ = 0 kann der sonst nur bei der Fusion zugangliche Rechteckpuls auch fur die Elektroporation verwendet werden. In diesem Fall erfolgt die Elektroporation mit dem Fusionsmodul und mit den entsprechenden Parametern. Der Rechteckpuls kann nicht ohne das Fusionsmodul verwendet werden. 35 6 Fehlermeldungen Im Fehlerfall gibt der Multiporator® ein akustisches Signal sowie eine Fehlermeldung uber das Display oder uber den angeschlossenen Drucker (Option) aus. Diese Fehlermeldungen beziehen sich auf Geratefehler oder auf Fehler, die sich durch die Anwendung ergeben. Die Fehler 1-4 und 9 konnen bei der Verwendung des Bakterienmoduls, 1-7 bei eukaryotischen Zellen und 1-8 bei der Zellfusion auftreten. FehlerNr. Fehlermeldung Ursache Behebung 01 No Display Display wird nicht angesteuert. Service benachrichtigen. 02 No RTC / NVRAM Elektronischer Bau- Service benachrichtigen. stein fur die interne Uhrdefekt. 03 High Current Die Stromstarke wahrend der Entladung (Puls) war zu groB. Die Leitfahigkeit der verwendeten Ldsung herabsetzen. Priifen, ob der richtige Kuvettentyp eingesetzt wurde. 04 No Cuvette Keine Kuvette eingesetzt. Kuvette einsetzen, erneut starten. Kuvetteneinschub ganz ins Gerat schieben. 36 05 Timeout Charge Der Kondensator Service benachrichtigen. konnte nicht in der vorgesehenen Zeit zum Ladebeginn aufgeladen werden. 06 Timeout Charge Bei MehrfachPulsung konnte zwischen den einzelnen Pulsen der Kondensator nicht rechtzeitig aufgeladen werden. Die Leitfahigkeit der verwendeten Losung herabsetzen. Priifen, ob der richtige Kuvettentyp eingesetzt wurde. 6 Fehlermeldungen FehlerNr. Fehlermeldung Ursache Behebung 07 Short x 08 Low Resistance Zu hoher Strom in der Kuvette. Die Wechselspannung kann nicht aufrecht erhalten werden. Die Leitfahigkeit der verwendeten Losung herabsetzen. 09 Timeout Measuring x Service benachrichtigen. Bakterienmodul x a = 0,8 ms, U a sehrviel kleiner als der eingestellte Parameter U Der Kondensator Die Leitfahigkeit der verwurde restlos entwendeten Losung herableert. Es kann nicht setzen. sichergestellt werden, dass das ein- Prufen, ob der richtige Kuvettentyp eingesetzt gegebene x auch wurde. ausgefuhrt wurde. Das begrenzende Glied war nicht die Puls-Regelung, sondern der Kondensator. Timeout bei der xMessung des Bakterienmoduls. - Funkenschlag in der Kuvette. - Kuvette mit groRerem Elektrodenabstand verwenden. - Die Stromstarke wahrend der Entladung (Puls) war zu hoch. - Die Leitfahigkeit der verwendeten Losung herabsetzen. - Technischer Fehler. - Service benachrichtigen. 37 7 Wartung, Service und Pflege Eine regelmaBige Wartung ist nicht erforderlich. Die Gewahrleistung und den Service ubernimmt der Lieferant. 7.1 Desinfektion Vor der Desinfektion des Multiporators den Netzstecker ziehen. AlleTeile des Multiporators, einschlieBlich Zubehor und der Verbindungskabel, sind einer Wischdesinfektion zu unterziehen. Der Kuvetteneinschub kann auch einer Spruhdesinfektion unterzogen werden. Eine Spruhdesinfektion des Gerats ist nicht zu empfehlen, da hierbei Desinfektionsmittel in das Innere des Multiporators gelangen kann. Die angewandte Desinfektionsmethode muss den geltenden gesetzlichen Bestimmungen und Richtlinien zur Desinfektion entsprechen. 7.2 Reinigung Vor der Reinigung des Multiporators den Netzstecker ziehen. Es ist darauf zu achten, dass keine Flussigkeiten in das Innere des Multiporators gelangen. Dadurch werden Kurzschliisse in der elektrischen Installation und Korrosion vermieden. Lackierte Teile und Aluminiumflachen mit einem Tuch und milden Reinigungsmitteln abwischen und mit einem trockenen Tuch nachreiben. Achtung: Keine atzenden, losenden oder schleifenden Reinigungs- Oder Poliermittel verwenden. 38 8 Technische Daten Spannung/Frequenz: Sicherungen: Leistungsaufnahme: Uberspannungkategorie: Schutzklasse: Verschmutzungsgrad: Einstellbare Spannung (Modul fur): Eukaryotische Zellen: 100-240 V ±10 %, 50-60 Hz TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 Stuck) 60 W II I 2 20- 100 V in 1 V-Schritten 100-1 000 V in 10 V-Schritten 1 000-1 200 V in 100 V-Schritten Pulsabstand: 1 Minute Zellfusion: 0, 5 - 100 V in 1 V-Schritten 100- 300 V in 10 V-Schritten Pulsabstand: 1 Sekunde Wechselspannung: 0, 1,010 V in 0,1 V-Schritten Bakterien: Kondensator: Widerstand: 200-1 000 V in 10 V-Schritten 1 000-2 500 V in 100 V-Schritten kein Mehrfachpuls 10 uF, 2 500 V Impulsentladung 600 Q. parallel 56 Q. vorgeschaltet <30 Sekunden Ladedauer: Anzahl der Pulse n: 0-99 Zeitkonstante x der Entladung: Eukaryotische Zellen: 15-500 us in 5 us-Schritten einstellbar, abklingende e-Funktion Bakterien: nominal 5 ms mit einer Impedanz der Probe von 3,3 k£2 Messung und Anzeige von 0,8-6,0 ms Dauer des Alignments (Zellausrichtung): 0-95 s in 5 s-Schritten einstellbar Dauer t des Pulses (Zellfusion): 0-300 us in 5 us-Schritten einstellbar, Rechteckpuls 9 600 Baud, 8 bit, keine Paritat, RS 232-Schnittstelle: 2 Stoppbits, XON/XOFF max. 40 °C Umgebungstemperatur: Umgebungsfeuchte relativ: max. 80 % 39 8 Technische Daten Gewicht: MaGe: Das Gerat besitzt das (cULE 158089). max. 5,5 kg (je nach Ausbaustufe) Breite: 25,2 cm Tiefe: 34,2 cm Hohe: 12,0 cm - -Zeichen und die UL- und CSA-Zulassung Technische Anderungen vorbehalten! 40 9 Bestellinformationen Bestell-Nr. 4308 000.015 4308 000.023 4308 000.031 4308 000.040 Multiporator® Basisversion fiir eukaryotische Zellen 100-240 V, 50-60 Hz Multiporator®, eukaryotische Zellen und Ausbaustufe Bakerienmodul Multiporator®, eukaryotische Zellen und Ausbaustufe Zellfusion Multiporator®, eukaryotische Zellen und Ausbaustufe Bakerienmodul und Zellfusion 4308 070.510 4308 070.528 4308 070.536 Zubehor Puffer Hypoosmolarer Puffer fur Elektroporation (PH), 100 ml Isoosmolarer Puffer fur Elektroporation (PI), 100 ml Hypoosmolarer Puffer fur Zellfusion (FH), 100 ml Isoosmolarer Puffer fur Zellfusion (Fl), 100 ml 4307 000.569 4307 000.593 4307 000.623 Elektropora tionskuve tten 1 mm Spaltbreite, Aluminium, steril, 50 Stuck 2 mm Spaltbreite, Aluminium, steril, 50 Stuck 4 mm Spaltbreite, Aluminium, steril, 50 Stuck 4308 070.501 4308 078.006 4308 070.072 4308 021.004 4308 012.005 4308 014.008 4308 4308 4308 0013 0013 0013 6547 030.003 024.003 017.007 608.148 608.172 608.164 001.018 Kuvettenstander fur 16 Elektroporationskuvetten Einschub fur Elektroporationskuvetten Einschub (Elektroporation/ Elektrofusion) zum Anschluss von externen Elektroden Einschub fur Helix-Fusionskammern Helix-Fusionskammer (0,2 mm Elektrodenabstand) Mikro-Fusionskammer (0,2 mm Elektrodenabstand) Einschub fiir Mikro-Fusionskammer Standerfur 10 Helix-Fusionskammern Thermodrucker DPU-414 Netzteil (230 V) fiir Thermodrucker DPU-414 Netzteil (115 V) fur Thermodrucker DPU-414 Thermopapier (10 Rollen) 41 9 Bestellinformationen 0013 610.517 0013 610.525 0013 610.533 4308 010.002 4308 011.009 42 Anschlusskabel (9-polige Buchse / 9-poliger Stecker, Kabelfuhrung 1:1) Nullmodemkabel fur PC-Anschluss (9-polige Buchse / 9-polige Buchse) Nullmodemkabel fiir Matrixdrucker (9-polige Buchse / 25-poliger Stecker) Nachrustsatz Bakterien (Einbau erfolgt durch Service) Nachrustsatz Zellfusion (Einbau erfolgt durch Service) Contents 1 General information 44 2 Area of application 45 3 Safety precautions 46 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.7.1 48 49 50 50 51 51 54 55 4.8.5 4.8.6 4.9 Device description Delivery package Startup Cuvette insert Keypad Keys and key combinations Display Electroporation of eukaryotic cells and bacteria / yeast . . . . Insert (electroporation) for connecting external electrodes (optional) Cell fusion (optional) Optimizing cell fusion (monitoring under a microscope) . . . . Cleaning the micro-fusion chamber Helix fusion chamber Filling the helix fusion chamber and loading into the fusion insert Fusion and cell suspension extraction Cleaning and disinfecting the helix fusion chamber Printer connection / printer (optional) 60 61 62 62 5 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 Mode of operation Mode for eukaryotic cells Mode for bacteria and yeast (optional) Mode for cell fusion (optional) Function: Cell alignment Procedure for cell fusion 66 66 68 70 70 72 6 Error messages 75 7 7.1 7.2 Maintenance and servicing Disinfection Cleaning 77 77 77 8 Technical data 78 9 Ordering information 80 4.8 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 56 57 57 58 59 43 1 General information The Multiporator® is designed for the electroporation of eukaryotic cells. With the aid of optional modules, it is also possible to perform electroporation on bacteria and yeast as well as cell fusion. This manual contains information on all possible uses of the Multiporator®. The outstanding feature of the Multiporator® is that the parameters entered for the electroporation of eukaryotic cells and for cell fusion are maintained exactly by means of internal calculation of the discharge curve. 44 2 Area of application Device safety regulations and industrial standards stipulate the following conditions: - Use the device for experiments in the field of cell technology only The range of application covers the electroporation of yeast and bacteria and eukaryotic cells as well as cell fusion. - Please use only original accessories from Eppendorf Original accessories only may be used. They are designed specifically to ensure optimum functioning of the Multiporator®. Additional devices may be used only if recommended by the manufacturer. Eppendorf does not honor any warranty or accept any responsibility for damage resulting from the use of incorrect or non-recommended equipment. 45 3 Safety precautions For reasons of personal safety, it is essential to observe the following! 46 • Observe the instructions contained in the operating manual It is essential to comply with the information given in the manual! • Only use the device with a power supply which has a grounding contact! • Before starting up the Multiporator®, please ensure that the power supply used corresponds to the voltage specifications on the identification plate! • Disconnect the device from the mains supply before opening the housing! • Do not operate the device in an explosive environment! • Do not allow any liquid to enter into the Multiporator® or the inserts! • The device should be used for in vitro applications onlyl • Use the device only for the purpose for which it is intended. Do not place parts, devices, tools or other objects into the cuvette insert which have not been recommended by Eppendorf AG. High voltage! • Use the listed accessories only. Other accessories may only be used if they are accompanied by a safety certificate from Eppendorf AG confirming their suitability for use! • Electrical connection to devices which are not mentioned in this operating manual is only permitted with the prior consent of the manufacturer! 3 Safety precautions The helix fusion chamber must be handled with care! Loose or damaged electrodes adversely affect operating procedures. In such cases, the helix fusion chamber must not be used! Do not open the helix fusion chamber until fusion has finished! The micro-fusion chamber must be handled with care! Take care when filling with cell suspension! Do not touch or move the electrodes with the pipette tip! This may cause damage! During cell alignment/fusion, avoid direct contact with the electrodes! Cell alignment/fusion may be performed only when the micro-fusion chamber is connected! The cable is designed for connection to the micro-fusion chamber only! No other connections are permitted! Do not place the plug into liquid! The owner or operator of the device is liable for the functioning of the device when the device is serviced or maintained by persons who are not members of the Eppendorf service personnel or when the device is not operated in accordance with the given regulations and precautions. Eppendorf AG accepts no liability for damage resulting from such action. Warranty and liability stipulations which form part of the terms of sale and delivery of Eppendorf AG are not affected by the above-mentioned conditions. This operating manual or parts of this operating manual may not be reproduced in any form without the prior written permission of Eppendorf AG! Eppendorf AG reserves the right to make technical alterations to this product! 47 4 Device description The device has four different modification levels: the basic device is used for the electroporation of eukaryotic cells. It can then be developed for the electroporation of bacteria and yeast, with an additional level offering the opportunity to perform cell fusion. These two levels can be combined to form the fourth level. The Multiporator® is operated using an easy-to-follow keypad with display. The insert for the electroporation cuvette is located next to the keypad. ... - ...,_..,_;.-- \. \ Fig. 1: Multiporator®, front view 48 4 Device description 4.1 Delivery package Basic device: Multiporator® for the electroporation of eukaryotic cells; with mains cable Insert for electroporation cuvettes Electroporation cuvettes (gap between electrodes: 2 mm / 4 mm) Hypo- and iso-osmolar buffers for electroporation Operating manual and basic applications manual "Bacteria module" optional: Basic device incl. accessories with integrated bacteria module Additional electroporation cuvettes (1-mm gap between electrodes) "Cell fusion module" optional: Basic device incl. accessories with integrated cell fusion module Helix fusion chamber (0.2-mm gap between electrodes) Insert for helix fusion chamber Micro-fusion chamber (0.2-mm gap between electrodes) with special insert Hypo- and iso-osmolar buffers for cell fusion "Fusion- and bacteria module" optional: Basic device incl. accessories with integrated fusion- and bacteria module. 49 4 Device description 4.2 Startup The main power socket with fuse and main power switch is located on the rear of the Multiporator®. To start the device, insert the power cable into the main power socket and connect it up to the main power supply. Turn on the device by pressing the main power switch. I IIIIIEII Fig. 2: Multiporator®, rear view Power connection (left) Printer connection (right) 4.3 Cuvette insert The insert for the electroporation cuvette is next to the keypad at the front of the device. To remove the cuvette, pull out the cuvette insert. When inserting a new cuvette, ensure that the nose of the cuvette fits into the rear slot. Push the cuvette insert containing the cuvette into the device up to the stop. A sensor in the device detects whether the cuvette insert contains a cuvette. Note: When transporting the device, please ensure that the insert contains an empty cuvette. Alternatively, transport the cuvette insert separately. Different inserts are used for the modification level "cell fusion". 50 4 Device description 4.4 Keypad The keypad is used to enter parameters, to select the electroporation mode and to start electroporation. Depending on the modification level, one to four modes can be selected. Key combinations can be used to set the date and time as well as the volume of the acoustic signal. Multiporator eppencJorf I2.OKT.97 13:37 U 500V T 220 MS n 1 /OLUME 100% S Fig. 3: Control panel with keys and display 4.5 Keys and key combinations SET The SET key is used to select the desired parameter. This parameter is underlined in the display. Further parameters are selected by pressing the SET key an appropriate number of times. A SET sequence is ended either by pressing the SET key repeatedly until the underlining disappears or by pressing the MODE or START key. (Note:Tbe MODE key switches to another mode if available.) Parameters are modified using the up/down arrow keys. When the lowest possible value has been reached, the display then moves to the highest value. Similarly, when the highest value has been reached, the display then moves to the lowest value. 51 4 Device description MODE The MODE key is used to activate the mode with which electroporation is to be performed. It is only possible to select modes in accordance with the modification level of the device. This means that three modes can be selected with the highest modification level and the mode for eukaryotic cells is available with the basic version. The corresponding symbol then appears in the display: © : Mode for eukaryotic cells Modification level: Basic device Pulse used: Decaying e-function O : Mode for bacteria and yeasts Modification level: Bacteria module Pulse used: Decaying e-function G 3 : Mode for cell fusion Modification level: Fusion module Pulse used: Square-wave pulse Start START The process required is started by pressing the START key. Arrow keys The arrow keys are used to modify the selected (i.e. underlined) parameters in the desired direction. 52 4 Device description Setting the date The procedure for setting the date and time can be activated by pressing the SET and MODE keys simultaneously. If the SET key is pressed again, the underlining in the display for the date and time moves from left to right. The arrow keys can thus be used to modify the settings. To end the process for setting the date, press the SET key repeatedly until the underlining is no longer visible in the display. Alternatively, the underlining disappears from the display when the MODE or START key is pressed. (Note:Jhe MODE key switches to another mode if available.) 1 Start Setting the volume of the acoustic signals The procedure for setting the volume of the acoustic signals can be activated by pressing the MODE and START keys simultaneously. "VOLUME" then appears in the bottom line of the display, together with a figure in percent. This figure indicates the volume and the tone type and can be modified using the arrow keys. To end the procedure for setting the volume of the acoustic signals, press the SET, MODE or START key. (Note: The MODE key switches to another mode if available.) "VOLUME" then disappears from the display. Reset An experiment can be terminated only by pressing the main power switch. This switch also functions as a reset switch. 53 4 Device description 4.6 Display The parameters which are relevant for the experiment appear in lines 2 to 4 in larger letters and in bold print. The parameters and the number of parameters differ according to the mode which has been selected. The date and time are permanently visible in the top Iine.The mode which has been selected is always represented by a symbol on the right of the bottom line: 0 : Mode for eukaryotic cells Modification level: Basic device O : Mode for bacteria and yeasts Modification level: Bacteria model G 3 : Mode for cell fusion Modification level: Fusion model "VOLUME" or the remaining time for the experiment can also appear in the display in this line. 12.AUG.00 U 500V 13:37 X n VOLUME 100% 220MS 1 Example of the display for setting the volume of the acoustic signal 0 During and after the experiment, the display changes to show the information relevant to the stage of the experiment which has been reached. 54 4 Device description 4.7 Electroporation of eukaryotic cells and bacteria /yeast Experiments are carried out in disposable cuvettes. The biological material is placed in the gap between the electrodes. Please use only the quantity of substance specified on the cuvette. Although a supernatant above the electrode does not drastically affect the experiment, it reduces the general efficiency. A matt window allows the cuvette to be inscribed. The plastic nose on the cuvette ensures that the cuvette is inserted correctly into the cuvette insert. The lid seals the cuvette. However, to safeguard against excess pressure, the cuvette is not hermetically sealed by the lid. A filled cuvette should therefore be transported in an upright position only in order to ensure that biological material does not leak out. Plastic cuvette Plastic nose Fig. 4: Schematic diagram of electroporation cuvette The cuvette insert is removed from the Multiporator® using the protruding grip. No bubbles are present when the cuvette is filled. When the cuvette is inserted into the inner recess of the cuvette insert, care must be taken to ensure that the cuvette nose is positioned in the long slit and that the cuvette is in contact with the base of the cuvette insert. The cuvette insert, complete with cuvette, is then pushed into the device up to the stop. The cuvette insert may be stored in a cool place. When transporting the device, please note that the cuvette insert may slip out of the device if no cuvette has been inserted. 55 4 Device description 4.7.1 Insert (electroporation) for connecting external electrodes (optional) The non-standard accessories (see "Ordering information") contain an insert for electroporation ( © symbol, voltage discharge via decaying efunction). It is possible to connect external electrodes to this insert. This should be performed using a protected 4-mm lab plug! This insert can also be used in the cell fusion mode ((H) symbol, squarewave pulse) when the voltage setting for cell alignment is set to "0". F 1 Connecting socket, earth (black) 2 Connecting socket, positive pole (red) When using external electrodes, observe the safety precautions (high voltage) and stipulations governing EMC (electromagnetic compatibility)! The user is responsible for all equipment that has been connected! 56 4 Device description 4.8 Cell fusion (optional) 4.8.1 Optimizing cell fusion (monitoring under a microscope) In order to optimize the cell fusion parameters for the cells that are to be examined, it is possible to monitor cell alignment and cell fusion under a microscope with the aid of a special micro-fusion chamber. The micro-fusion chamber is connected to the insert via the cable (which is approximately 1-meter-long). 1 - \ Insert of micro-fusion chamber 1 Contacts 2 Earthing springs Micro-fusion chamber 1 Coaxial connector Caution: The micro-fusion chamber must be handled with care! Take care when filling with cell suspension! Do not touch or move the electrodes with the pipette tip! This may cause damage! During cell alignment/fusion, avoid direct contact with the electrodes! Cell alignment/fusion may be performed only when the micro-fusion chamber is connected! - Slide the micro-fusionmicro-fusion chamber firmly into the Multiporator®. - Place the micro-fusion chamber (which is filled with approx. 50 ul cell suspension) onto the microscope. Note: Pipetting the cell suspension carefully onto the area around the electrodes can maximize the number of cells between the electrodes. - The brackets can be used to lock into place on the microscope table. They can also be used to fasten a glass slide. 57 4 Device description - Connect the micro-fusion chamber with the cable. - Focus the electrodes and cells. - Run through the parameters by pressing the START key. This can be monitored under the microscope. 200 um Cells between the electrodes in cell alignment Cells after fusion and fusion products The maximum filling volume of the micro-fusion chamber is approx. 200 Ml. The parameters that have been determined and set can be transferred directly to the helix fusion chamber and used there. 4.8.2 Cleaning the micro-fusion chamber The content of the micro-fusion chamber is rinsed out using bi-distilled water from a spray bottle. Cell residue that is particularly stubborn can be removed by carefully cleaning the electrodes with a soft toothbrush using vertical strokes. (The space between the electrodes must not be changed during this process!) The drying process can be accelerated by rinsing the chamber with 70 % non-denatured ethanol. 58 4 Device description 4.8.3 Helix fusion chamber Cell fusion of a large number of cells is carried out in a helix fusion chamber. Diagram of helix fusion chamber The helix fusion chamber consists of a cup and a core with parallel wound platinum wires, which are the electrodes. They are wound around the core as a double helix. Both parts are screwed together. The gap between the cup and the core has a filling volume of 250 u.1. The helix fusion chamber is linked to the insert for cell fusion via the coaxial connector. Cup 1 Thread Core 1 Electrodes 2 Coaxial connector Helix fusion chamber 1 Gap for cell fusion Fusion insert 1 Contacts 2 Coaxial connector 59 4 Device description The gap between the wound platinum electrodes is approx. 200 urn. Fig. 5: Microscope view of the electrodes of the helix fusion chamber Caution: Handle the helix fusion chamber with care! Loose or damaged electrodes adversely affect operating procedures. In such cases, the helix fusion chamber must not be used! 4.8.4 Filling the helix fusion chamber and loading into the fusion insert The helix fusion chamber is filled with 250 ul cell suspension. It is essential to ensure that the liquid is pipetted into the deepest possible position in the cup. The edge and the walls must not be wetted as this has an adverse effect on filling the helix fusion chamber. Air bubbles may form which reduce the effectivity of the experiment. A core is inserted into the upright cups in the stand and carefully screwed into place. As a result of this screwing action, the cell suspension in the ever-decreasing gap is forced upwards. 60 4 Device description When screwing the core, make sure that no air bubbles form. Mfl Leave the closed helix fusion chamber upside-down on the coaxial connector until the fusion process has been completed! 4.8.5 Fusion and cell suspension extraction - Slide the fusion insert firmly into the device. - Placed the closed helix fusion chamber onto the coaxial connector and lock it into place by rotating it a quarter-turn. - Fusion is performed using the parameters that have been set (see Sec. 5.3). - Loosen the helix fusion chamber carefully by rotating it a quarter-turn and then remove it. - To open the chamber, place it in a vertical position (e.g. in the stand). - Unscrew the core carefully from the beaker. - Using a small quantity of the appropriate medium, rinse off any cell suspension that may be on the core. - The cell suspension from the beaker is mixed with the cell suspension that has been rinsed off and is then treated further as required. 61 4 Device description 4.8.6 Cleaning and disinfecting the helix fusion chamber The beaker and core of the helix fusion chamber should be rinsed with distilled water directly after the experiment in order to prevent cell and buffer residue from drying up. If heavily contaminated, the helix fusion chamber should be cleaned briefly in an ultrasonic bath (possibly with a cleaning supplement, such as Edisonite Super) or with a very soft (tooth)brush. When cleaning is carried out using brushes, please ensure that brushing is carried out in the same direction as the windings, since the electrodes may otherwise move out of their correct position and thus render the helix fusion chamber unusable. Disinfect the parts using non-denatured 70 % ethanol.To dry the parts, place them in the stand under sterile, dust-free conditions. After drying, the helix fusion chamber may be re-used. 4.9 Printer connection /printer (optional) The Multiporator® can supply a printer protocol for each experiment. This protocol contains the parameters used as well as the date and time. Additional data pertaining to the experiment, such as buffer, concentration or cell line, can also be entered. In the event of an error occurring, the error message is also printed out. Examples of printouts for different applications are shown below: 18.Aug.00 16:03:04 eppendorf Multiporator 4308 Higher Eucaryotic Cells U = 100V, Cuvette Gap Width Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 62 1 mm x = 50 us, 2mm V4.00 n= 1 4mm 4 Device description 18.Aug.00 16:42:47 eppendorf Multiporator 4308 Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, Cuvette Gap Width 1mm 2mm V4.00 xa= 5.0 ms 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 18.Aug.00 16:17:49 eppendorf Cell Fusion U1 = 8.0 V, U = 15 V, U"_ = 4.0 V, Multiporator 4308 t = 20 s t = 1 0 0 MS, t = 10 s V4.00 n=3 Fusion Chamber Strain / Cell Line A Cell Density A Strain / Cell Line B Cell Density B Buffer Temperature 63 4 Device description 18.Aug.97 15:59:08 eppendorf Multiporator 4308 V1.00 * ERROR 07 ******** Short x " Serial printers can be connected to the serial printer interface at the rear of the device. It is also possible to read protocols for documentation purposes via a PC terminal program. This requires a zero-modem cable (9-pin socket / 9-pin socket, order no. 0013 610.525). The following thermal printers are available from Eppendorf AG.The DIP switch setting for an IBM-compatible printer is also described: Order no. Printer type Thermal printer DPU-414 0013 608.148 Accessories Power unit (230 V) 0013 608.172 Power unit (115 V) 0013 608.164 Thermal paper (10 rolls) 6547 001.018 9-pin socket / 9-pin plug cable guide 1:1 (for Thermal printer DPU-414) 0013 610.517 Connecting cable 9-pin socket / 25-pin plug 0013 610.533 zero-modem cable (EDP compatible e.g. for Matrix printer Seikosha SP 2400 (endless paper) 64 4 Device description DIPSW settings For Thermal printer DPU-414 e.g. for Matrix printer Seikosha SP 2400 (endless paper) Dip SW-1 Dip SW-1 1 (OFF): Input = Serial 2 (ON) : Printing Speed = High 3 (ON) : Auto Loading = ON 4 (ON) : Auto LF = ON 5 (ON) : Setting Command = Enable 6 (OFF) : Printing 7 (ON) : Density 8 (ON) : = 100% 1 (OFF) : USA 2 (OFF) : USA 3 (OFF) : USA 4 (ON) : IBM 5 (OFF) : Character Set 1 6 (ON) : 12 inches 7 (OFF) : LF only 8 (ON) : CR = CR + LF Dip SW-2 Dip SW-2 1 (OFF) : Printing Columns = 80 2 (ON) : User Font Back-up = ON 3 (ON) : Character Select = Normal 4 (OFF) : Zero = Slash 5 (ON) : International 6 (ON) : Character 7 (ON) : Set 8 (OFF) : = USA 1 (ON) 2 (ON) 3 (ON) 4 (OFF) 5 (OFF) 6 (OFF) 7 (ON) 8 (OFF) : 9600 Baud : 9600 Baud : XON/XOFF : No Parity : No Parity : 8 bits : Serial : No single sheet Dip SW-3 1 (ON) : Data Length = 8 bits 2 (ON) : Parity Settings = No 3 (ON) : Parity Conditions = Odd 4 (OFF) : Busy Control = XON/XOFF 5 (OFF): Baud 6 (ON) : Rate 7 (ON) : Select 8 (ON) : = 9600 bps 65 5 Mode of operation 5.1 Mode for eukaryotic cells This mode is represented in the display by the symbol 0 . Step 1 - Entering I modifying parameters - - If necessary, switch 12.AUG.00 to the mode for U 500V eukaryotic cells by pressing the MODE key. Press the SET key to select the parameter desired (the parameter will be underlined). - Use the arrow keys to modify the parameter in the direction required. - If necessary, modify other parameters using the SET key and the arrow keys. - Terminate the entering procedure. The parameters are effective immediately and do not have to be stored. X n 13:37 Example of a display for 220us the electroporation of eukaryotic cells. 2 The relevant parameters 0 appear in the display in larger letters and in bold print. U: Voltage, in V (volt). Can be set in increments of 1 V in the range 20-100 V; in increments of 10 V in the range 100-1,000 V; in increments of 100 V in the range 1,000-1,200 V. x: Time, in us (microseconds). Can be set in increments of 5 us in the range 15-500 us. n: Number of pulses during the experiment. Can be set between 1 and 99. A period of one minute elapses between each pulse. Note: The parameters which have been set are applicable. The course of the curve is calculated internally, so that the course of the discharge curve (e-function) is maintained according to the parameters which have been entered. The fusion module can be used for a square-wave pulse (see Sec. 5.4). 66 5 Mode of operation Step 2 - Starting electroporation - Trigger the electroporation process by pressing the START key. - "Charge" appears in 12.AUG.00 13:37 the third line of the U 500V X 220us display. Charging Charge commences. - After the charging procedure has ended, discharging occurs. This is indicated by a flash in the third line of the display. - If more than one 12.AUQ.00 13:37 pulse has been set, U 500V T 220us "Wait" appears in Wait the display, accompanied by the S 0:57 © remaining waiting time. © After the experiment has 12.AUG.00 13:37 ended, a double acoustic U 500V X 220us signal is emitted and the n 2 initial information READY SINCE 1:36 appears © in the display with the parameters which have been set and used. The time which has elapsed since the end of the experiment appears in the bottom line in minutes and seconds. After 99 minutes or after any key has been pressed, this information disappears from the display. 67 5 Mode of operation 5.2 Mode for bacteria and yeast (optional) This mode is represented in the display by the symbol O • Step 1 - Entering / modifying parameters - - 68 If necessary, switch 12.AUG.00 to the mode for U 2000V bacteria and yeast by pressing the MODE key. Press the SET key to select the Voltage (U) parameter (the parameter will be underlined). - Use the arrow keys to modify the parameter in the direction required. - Terminate the entering procedure. The parameters are effective immediately and do not have to be stored. Example of a display for the electroporation of 5 ms bacteria and yeast. 13:42 X The relevant parameters O appear in the display in larger letters and in bold print. U: Voltage, in V (volt). Can be set in increments of 10 V in the range 200-1,000 V; in increments of 100 V in the range 1,000-2,500 V. v. Time constant, in ms (milliseconds). Set to 5.0 ms. 5 Mode of operation Step 2 - Starting electroporation - Trigger the electroporation process by pressing the START key. - "Charge" appears in 12.AUG.00 13:42 the third line of the U 2000V 5 ms display. Charging Charge commences. - After the charging procedure has ended, discharging occurs. This is indicated by a flash in the third line of the display, accompanied by a double acoustic signal. O After the experiment has 12.AUQ.00 13:42 U a : Actual measured ended, a double acoustic U 2000V t 5 ms voltage used, in V signal is emitted and the (volt). Ua2003V x a 5.1 ms initial information and Actual time constant the set parameters READY SINCE 1:36 O xa: used, in ms appear in the display. (milliseconds). Values The actual parameters <0.8 are shown as U a and xa appear in the 0.8 ms. third line of the display. The time which has elapsed since the end of the experiment appears in the bottom line in minutes and seconds. After 99 minutes or after any key has been pressed, this information disappears from the display. 69 5 Mode of operation 5.3 Mode for cell fusion (optional) 5.3.1 Function: Cell alignment The functions for alignment are indicated by the symbols UL (before the pulse) and U"_ (after the pulse) in lines 2 and 4 of the display. Step 1 - Entering / changing parameters If necessary, switch 12.AUG.00 13:42 Example of the display for to the mode for cell alignment U'_ withU'_ 5V t 60s fusion by pressing Un OV t 15s n2 out activation of pulse Un the MODE key. and alignment U"_. U" OV t 30s €3 Press the SET key The relevant parameters to select the appear in larger letters parameter desired and in bold print. (the parameter will be underlined). Alternating voltage, in Use the arrow keys V (volts). Can be set to "0" and in increto modify the ments of 0.1 V beparameter in the tween 1.0 V and 10 V. direction required. If a value in lines t: Duration of alignment UL/U"_/Ur.are 0-95 s, in s (seconds). set to "0", the Can be set in increfunction in question ments of 5 seconds. is not carried out. This enables U'^ / U n : Voltage, U"_ to be triggered (square-wave pulse) individually or unit V (volts). consecutively Can be set to "0" and without the fusion in increments of 1 V pulse being between 5 V and activated. 100 V, and in increments of 10 V Terminate the between 100 V and entering procedure. 300 V. The parameters are effective t: Duration of pulse, immediately and Unit us do not have to be (microseconds). stored. Can be set in increments of 5 us between 0 us and 300 us. n: Number of pulses 0-99. Can be set in one-pulse increments. 70 5 Mode of operation Step 2 - Starting cell alignment - - Trigger alignment U'_ by pressing the START key. The information \ A » appears in the fourth line of the display; alternating voltage is applied for the duration selected. 12.AUG.00 13:42 U' 5V t 60s Up OV t 15s n2 U"_ OV t 30s / At the end of the experiment, an acoustic signal is emitted and an initial display appears with the parameters that have been set and used. In addition, the time that has elapsed (in minutes and seconds) since the end of the experiment is shown in the bottom line. This display disappears after 99 minutes or when any key is pressed. 71 5 Mode of operation 5.3.2 Procedure for cell fusion Step 1 - Entering I modifying parameters - Press the SET 12.AUG.00 13:42 Example of a display of key to select the electrofusion with activaU'_ 5V t 30s parameters desired Un 30V t 15us n2 ted alignments U'_ / U'L(the parameter will U"_ 5V t 30s be underlined). - Use the arrow keys to modify the 12.AUG.00 13:42 parameter in the U'_ OV t 30s direction required. Un 30V t 15|is n2 According to the 5V t 30s parameters selected U" © for U'_ and U"_ , fusion can be carried out without alignment or in combination with one or both alignment functions as required. - Terminate the entering procedure. The parameters are effective immediately and do not have to be stored. Example of the display for carrying out electrofusion with inactivated alignment U'_. The relevant parameters appear in the display in larger letters and in bold print. U n : Voltage, in V (volt). Can be set to "0" and in increments of 1 V between 5 V and 100 V, and in increments of 10 V between 100 V and 300 V. t: Duration of pulse, in us (microseconds). Can be set in increments of 5 us between 0 us and 300 us. U'_ / U"_: Alternating voltage, in V (volt). Can be set to "0" and in increments of 0.1 V in the range 1.0-10 V. n: Number of pulses 0-99. Can be set in onepulse increments. 72 5 Mode of operation Step 2 - Starting cell fusion - Trigger the cell fusion process by Pressing the START key. "Charge" appears briefly in the fourth line of the display. Charging commences. 12.AUG.00 13:42 U'_ 5V t 30s Up 30V t 15|js n2 Charge During the charging procedure, 12.AUG.00 13:42 alternating voltage U'~ 5V t 30s U'_ is applied for the Up 30V t 15|JS n2 A selected duration. r The alternating I 0:23 voltage is I represented by the symbol ~ (sine-wave oscillation). Discharge occurs after the precounted alignment time (0-95 seconds). This is indicated by a flash in the fourth line of the display. If the number n which has been entered is n >1, a further discharge occurs each time after one second. 73 5 Mode of operation - After the discharging procedure has ended, the alternating voltage U"_ is applied for the set duration (0-99 seconds). The overall time remaining for the experiment is constantly visible on the bottom line of the display. After the experiment has 12.AUG.00 13:42 ended, a double acoustic U'_ 5V t 30s signal is emitted and the Ur, 30V t 15MS n2 initial menu appears in U"_ 5V t 30s the display with the READY SINCE 1:36 parameters which have been set and used. The time which has elapsed since the end of the experiment appears in the bottom line in minutes and seconds. After 9 minutes or after any key has been pressed, this information disappears from the display. Note: With the setting U'_ / U"_ = 0 the square-wave pulse - which is normally only accessible for fusion - can also be used for electroporation. In this case, electroporation is carried out with the fusion module and the corresponding parameters. The square-wave pulse cannot be used without the fusion module. 74 6 Error messages In the event of an error, the Multiporator® emits an acoustic signal and an error message appears in the display or via the printer (optional). These error messages refer to device errors or to applicational errors. Errors 1-4 and 9 may occur in the mode for bacteria, errors 1-7 in the mode for eukaryotic cells and errors 1-8 in the mode for cell fusion. Error Error message Cause no. Solution 01 No Display Display is not controlled. Contact SERVICE. 02 No RTC / NVRAM Electronic module for the internal clock is defective. Contact SERVICE. 03 High Current The current was too high during the discharging process (pulse). Reduce the conductivity of the solution used. 04 No Cuvette Cuvette has not been inserted. Check whether the correct cuvette type has been inserted. Insert a cuvette. Restart the device. Push cuvette insert fully into the device. 05 Timeout Charge The capacitor was unable to be charged in within the allotted period of time. Contact SERVICE. 06 Reduce the conductivity Timeout Charge During repeated pulsing, the of the solution used. capacitor was Check whether the unable to be correct cuvette type has charged within the period between the been inserted. individual pulses. 75 6 Error messages 76 Error Error message Cause no. Solution 07 Reduce the conductivity of the solution used. Short x The capacitor was completely emptied; it is uncertain whether the x has been executed. The limiting element was the capacitor and not the pulse regulator. Check whether the correct cuvette type has been inserted. 08 Low Resistance The current in the cuvette is too high and the alternating voltage cannot be maintained. Reduce the conductivity of the solution used. 09 Timeout Measuring x Contact SERVICE. Bacteria module x a = 0.8 ms, U a is considerably lower than the parameter U which has been set. Timeout for the xmeasurement of the bacteria module. - Sparks in the cuvette. - Use a cuvette which has a greater distance between the electrodes. - The current during discharge (pulse) was too high. - Reduce the conductivity of the solution. - Technical error. - Contact SERVICE. 7 Maintenance and servicing The device does not require regular maintenance. Warranties and servicing are the responsibility of the distributor. 7.1 Disinfection Before disinfecting the Multiporator®, disconnect the device from the main power supply. All parts of the Multiporator®, including the accessories and the connecting cable, must undergo wipe disinfection. The cuvette insert can also undergo spray disinfection. However, it is not advisable to carry out spray disinfection on the entire device, as disinfectant may enter the device. 7.2 Cleaning Before cleaning the Multiporator®, disconnect the plug. Ensure that no fluids enter the Multiporator®, as this could cause shortcircuits in the electrical installation as well as corrosion. Wipe painted parts and aluminum surfaces using a cloth and mild detergent and then wipe with a dry cloth. Warning: Do not use any corrosive, solvent or abrasive detergents or polishes. 77 8 Technical data Voltage/frequency: Fuses: Power consumption: Excess-voltage category: Protection class: Degree of contamination: Voltage range for the following modules: Eukaryotic cells: 100-240 V ±10 %, 50-60 Hz TO, 1.0 A - 5 x 20 mm (2 pcs.) 60 W II I 2 20- 100 V, in increments of 1 V 100-1,000 V, in increments of 10V 1,000-1,200 V, in increments of 100 V Interval between pulses: 1 minute Cell fusion: 0, 5 - 100 V, in increments of 1V 100- 300 V, in increments of 10V Interval between pulses: 1 second Alternating voltage 0,1.010 V, in increments of 0.1 V Bacteria: Capacitor: Resistance: 200-1,000 V, in increments of 10V 1,000-2,500 V, in increments of 100 V No multiple pulse 10 uF, 2,500 V impulse discharge 600 Q. parallel 56 Q series Charging time: <30 seconds No. of pulses (n): 0-99 Time constant T of discharge: Eukaryotic cells: 15-500 us, in increments of 5 us, fading e-function Bacteria: Nominal 5 ms, with an impedance of the sample of 3.3 kil Measurement and display from 0.8-6.0 ms Duration of alignment: 0-95 s, in increments of 5 s Duration t of pulse: Cell fusion: 0-300 us, in increments of 5 us, square-wave pulse RS 232 interface: 9,600 baud, 8 bits, no parity, 2 stop bits, XON/XOFF Ambient temperature: max. 40 °C Relative ambient humidity: max. 80 % 78 8 Technical data Weight: Dimensions: max. 5.5 kg (according to modification level) Width: 25.2 cm Depth: 34.2 cm Height: 12.0 cm The device is -approved and has UL and CSA authorization ( c U L E 158089). Technical specifications subject to change! 79 9 Ordering information Order no. 4308 000.015 4308 000.023 4308 000.031 4308 000.040 4308 070.510 4308 070.528 4308 070.536 Accessories Buffer Hypo-osmolar buffer for electroporation (PH), 100 ml Iso-osmolar buffer for electroporation (PI), 100 ml Hypo-osmolar buffer for cell fusion (FH), 100 ml Iso-osmolar buffer for cell fusion (Fl), 100 ml 4307 000.569 4307 000.593 4307 000.623 Electroporation cuvettes 1 mm gap width, aluminum, sterile, 50 pcs. 2 mm gap width, aluminum, sterile, 50 pcs. 4 mm gap width, aluminum, sterile, 50 pcs. 4308 070.501 4308 078.006 4308 070.072 4308 021.004 4308 012.005 4308 014.008 4308 030.003 4308 4308 0013 0013 024.003 017.007 608.148 608.172 0013 608.164 80 Multiporator®, basic version, for eukaryotic cells, 100-240 V, 50-60 Hz Multiporator®, eukaryotic cells, and modification level "bacteria mode" Multiporator®, eukaryotic cells and modification level "cell fusion" Multiporator®, eukaryotic cells and modification level "bacteria mode" and "cell fusion" Cuvette stand for 16 electroporation cuvettes Insert for electroporation cuvettes Insert (electroporation / electrofusion) for connecting to external electrodes Insert for helix fusion chambers Helix fusion chamber (gap between electrodes: 0.2 mm) Micro-fusion chamber (gap between electrodes: 0.2 mm) Insert for micro-fusion chamber Stand for 10 helix fusion chambers Thermal printer DPU-414 Power unit (230 V) for thermal printer DPU-414 Power unit (115 V) for thermal printer DPU-414 9 Ordering information 6547 001.018 0013 610.517 0013 610.525 0013.610.533 4308 010.002 4308 011.009 Thermal paper (10 rolls) Connecting cable (9-pin socket, 9-pin plug, cable guide 1:1) Zero-modem cable for PC connection (9-pin socket, 9-pin socket) Zero-modem cable for matrix printer (9-pin socket / 25-pin plug) Conversion kit for mode for bacteria (to be installed by SERVICE) Conversion kit for mode for cell fusion (to be installed by SERVICE) 81 Sommaire 1 Generalites 83 2 Destination de I'appareil 84 3 Consignes de securite 85 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 Descriptifde I'appareil Envergure de livraison Mise en service Logette pour cuve Clavier a touches Touches et commandes de combinaison 87 88 89 89 90 90 4.6 Cadran 93 4.7 4.9 Electroporation de cellules d'eucaryotes et de bacteries / levures Module enfichable (electroporation) pour la connexion d'electrodes externes (option) Fusion cellulaire (option) Optimisation de la fusion cellulaire (controle sous microscope) Nettoyage de la micro-chambre de fusion Chambre de fusion helicoidale Remplissage de la chambre de fusion helicoidale et installation dans le module de fusion enfichable Realisation de la fusion et prelevement de la suspension cellulaire Nettoyage et disinfection de la chambre de fusion helicoidale Connexion de I'imprimante (option) 101 101 5 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 Techniques de travail Mode cellules d'eucaryotes Mode bacteries et levures (option) Mode fusion cellulaire (option) Fonction: Alignement (Orientation cellulaire) Execution de la fusion cellulaire 105 105 107 109 109 111 6 Messages d'erreurs 114 7 7.1 7.2 Maintenance, service apres-vente et entretien Disinfection Nettoyage 116 116 116 8 Specifications techniques 117 9 Nomenclature de commande 119 4.7.1 4.8 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 4.8.5 4.8.6 82 94 95 96 96 97 98 99 100 1 Generalites Le Multiporator® de base est destine a I'eiectroporation de cellules d'eucaryotes. Des modules complementaires en option permettent I'extension de son utilisation a I'eiectroporation sur bacteries et levures ainsi qu'a la fusion cellulaire. Le present mode d'emploi traite de I'ensemble des possibilites d'utilisation du Multiporator®. Le Multiporator® se caracterise par le fait qu'il permet, lors de I'eiectroporation sur cellules eucaryotes ou de la fusion cellulaire, de respecter scrupuleusement les parametres programmes grace a un calcul rigoureux de la courbe de decharge. 83 2 Destination de I'appareil La loi (allemande) sur la securite des instruments et les normes industrielles prescrivent que: 84 - Le present appareil ne doit etre utilise que pour /'experimentation cytotechnologique Le domaine d'utilisation inclut I'electroporation de levures, de bacteries et de cellules d'eucaryotes alnsi que la fusion cellulaire. - N'utiliser que des accessoires garantis d'origine, de marque Eppendorf Seule I'utilisation d'accessoires d'origine est autorisee. Ces elements sont adaptes a I'utilisation optimum du Multiporator®. Certains elements complementaires peuvent cependant etre autorises par le fabricant.Tout agissement contraire a ces regies entrame la nullite de la garantie et exclut tout recours en dommages et interets. 3 Consignes de securite II convient de respecter tres strictement les consignes ci-apres pour assurer la securite des personnes: • II convient de toujours respecter le mode d'emploi, et d'agir conformement a ses directives! • Le raccordement electrique au secteur doit toujours comporter une protection a la terre et la continuity doit etre assuree. • Avant d'effectuer la mise sous tension de Pappareil, il convient de verifier les indications portees sur la plaquette d'identification et de s'assurer de la compatibility des tensions avec celles du secteur. • Avant toute intervention a I'interieur de I'appareil, toujours retirer le cordon secteur! • L'utilisation de l'appareil dans des locaux comportant un risque explosif n'est pas autorisee! • Dans toute manipulation, s'assurer qu'aucun liquide ne puisse penetrer a I'interieur de l'appareil ou dans la logette du module enfichable! • L'appareil n'est destine qu'a ('experimentation in vitro\ • L'appareil doit etre utilise conformement a sa destination initiale. Les seuls appareils, accessoires et outils autorises sont dument listes et repertories par Eppendorf AG, a I'exclusion de tout autre, en particulier en ce qui conceme la logette de la cuve sous haute tension! • N'utiliser que les accessoires repertories. L'utilisation de tout autre accessoire doit etre sujet a caution s'il n'est pas expressement autorise par un document Eppendorf AG, certifiant son innocuite et I'absence de risque technique pour la securite des personnes! • Branchement electrique d'appareils. Tout branchement electrique qui n'est pas expressement mentionne dans le present mode d'emploi necessite I'autorisation explicite du fabricant! 85 3 Consignes de securite 86 • Traiter les chambres de fusion helicoi'dale avec douceur et precaution! Lorsque les electrodes sont endommagees ou detachees, la securite de la procedure n'est plus assuree. Dans ce cas, il convient de ne plus utiliser la chambre de fusion helicoidale en question. En cours de fusion, ne jamais ouvrir la chambre de fusion helicoidale: toujours attendre la fin de I'operation! • Traiter les chambres de micro-fusion avec douceur et precaution! Introduire la suspension cellulaire avec soin. Si possible, eviter de toucher ou de decaler les electrodes avec la pointe de la pipette, au risque de les endommager! Au cours de la manipulation de I'alignement ou de la fusion cellulaire, eviter tout contact direct avec les electrodes! • L'alignement cellulaire et la fusion ne doivent s'effectuer qu'avec une cellule de micro-fusion connectee. Le cable n'est prevu que pour sa connexion a la chambre de microfusion. Toute autre connexion est interdite. Ne jamais tremper le connecteur dans un liquide! • La responsabilite civile concernant le fonctionnement de I'appareil est reportee sur le proprietaire ou I'utilisateur. La responsabilite civile concernant le fonctionnement de I'appareil est le fait du proprietaire ou de I'utilisateur, dans la mesure ou cet appareil est maintenance ou repare par un personnel n'appartenant pas au Service Apres-Vente Eppendorf, ou encore s'il est utilise pour une manipulation qui ne correspond pas a la destination initiale de I'appareil. Eppendorf AG n'est pas tenu pour responsable pour les dommages causes par I'inobservation des instructions. Les presents propos n'ont pas pour objet une quelconque extension des conditions commerciales ou de garantie, ni des responsabilites civiles. • La reproduction partielle ou complete du present mode d'emploi est interdite, sauf autorisation expresse de la Societe Eppendorf AG! • La Societe Eppendorf AG se reserve le droit de proceder a toute modification technique qu'elle jugerait utile sur le present produit! 4 Descriptif de I'appareil L'appareil est presente en quatre versions qui se distinguent par leur equipement. La version de base est destinee a I'electroporation de cellules d'eucaryotes. Dotee d'equipements complementaires, la seconde version permet I'electroporation de levures et de bacteries. Un troisieme module integre permet la fusion cellulaire. La quatrieme variante est constitute par la synthese des deux precedentes. Le Multiporator® est pilote par un clavier simplifie en dialogue avec un ecran. La logette de la cuve d'electroporation est situee a cote du bloc de commande. IS Fig. 1: Multiporator®, vue de face 87 4 Descriptif de I'appareil 4.1 Envergure de livraison Appareil de base: Multiporator® pour I'electroporation de cellules eucaryotes, avec cordon secteur Module enfichable pour cuves d'electroporation Cuves d'electroporation (fente d'eiectrodes d'un ecart de 2 mm et 4 mm). Tampons hypo et isoosmolaire pour eiectroporation Mode d'emploi et manuel d'applications de base Option module bacterien: Appareil de base avec accessoires et module bacterien integre Cuves d'electroporation supplementaires; (ecart des fentes d'eiectrodes: 1 mm) Option fusion cellulaire: Appareil de base avec accessoires et module de fusion cellulaire integres Chambre de fusion helicoTdale (ecart de fente d'electrode de 0,2 mm) Module enfichable pour chambre de fusion helicoTdale Micro-chambre de fusion (ecart d'electrode de 0,2 mm) avec module enfichable special Tampons hypo et isoosmolaire pour fusion cellulaire Option fusion et module bacterien: Appareil de base avec accessoires specifiques et module fusion et bacterien integres 88 4 Descriptif de I'appareil 4.2 Mise en service A I'arriere du Multiporator® se trouvent le connecteur d'entree secteur avec ses fusibles et le bouton de mise sous tension. Brancher le cordon secteur a I'arriere de I'appareil et le raccorder a une prise pour la mise en service. Mettre en marche en actionnant le bouton secteur. 1 1 1 1 1 e 11 Fig. 2: Multiporator®, face arriere Cote gauche: branchement secteur Cote droit: branchement pour imprimante 4.3 Logette pour cuve La logette destinee a recevoir la cuve d'electroporation se trouve a I'avant, a cote du bloc de commande. Pour extraire une cuve, tirer sur la logette de la cuve. Pour enficher une cuve, veiller a bien engager le nez dans la fente qui se trouve au fond du receptacle.Toujours pousser a fond la cuve sur son portoir, dans son receptacle. L'appareil comporte un detecteur identifiant la presence d'un module enfichable pour cuve. Nota: Pour le transport de I'appareil, le module enfichable doit etre garni d'une cuve, sinon le transporter separement. L'extension pour fusion cellulaire utilise des modules enfichables differents. 89 4 Descriptif de I'appareil 4.4 Clavier a touches Les touches du clavier permettent de programmer les parametres, de choisir les differents modes d'electroporation et de demarrer une electroporation. Selon I'equipement de I'appareil, le nombre de modes disponibles peut aller jusqu'a quatre. Les touches permettent par ailleurs de programmer I'heure et la date, et de regler I'intensite sonore du signal acoustique. Multiporator eppendoif 12.OKT.87 13:37 U 500V T 220 us n 1 VOLUME 100% Fig. 3: Bloc de commande avec touches du clavier 4.5 Touches et commandes de combinaison SET La touche SET permet de choisir le parametre souhaite. Ce dernier est repere au cadran par un trait souligne. Pour passer d'un parametre a un autre, il convient d'actionner la touche SET autant de fois que necessaire. Pour terminer une sequence SET, on actionne la touche SET jusqu'a disparition du trait souligne au cadran, ou on actionne la touche MODE ou START. (Nota: la touche MODE fera basculer vers d'autres modes s'ils sont disponibles.) Les touches de fleches montantes ou descendantes permettent de modifier en boucle les parametres respectifs: arrive sur la valeur la plus faible, on passe a la valeur la plus forte pour en redescendre, et inversement. 90 4 Descriptif de I'appareil MODE La touche MODE permet d'activer le mode souhaite pour realiser I'electroporation. II n'est possible de selectionner que les seuls modes qui correspondent au degre d'equipement de I'appareil. Ceci revient a dire que I'appareil dont le degre d'equipement est le plus eleve comporte trois modes et la version de base ne comporte que le mode destine aux cellules d'eucaryotes. Le cadran indique alors les symboles correspondants: 0 : mode pour cellules d'eucaryotes: niveau d'equipement: appareil de base; impulsion utilisee: fonction e decroissante O : mode pour bacteries et levures: niveau d'equipement: module bacterien; impulsion utilisee: fonction e decroissante (J3: Start mode pour fusion cellulaire niveau d'equipement: module de fusion; impulsion utilisee: impulsion rectangulaire START La solicitation de la touche START provoque le declenchement de Papplication correspondante. Les touches flechees Les touches flechees permettent d'incrementer ou de decrementer les valeurs du parametre souligne. 91 4 Descriptif de I'appareil Reglage de la date La pression simultanee de la touche SET et de la touche MODE permet d'acceder au programme de reglage de la date et de I'heure. En actlonnant ensuite la seule touche SET, le trait de soulignement passe en boucle de la date a I'heure. Les touches flechees permettent alors de monter ou de descendre les valeurs des affichages. Pour terminer la mise a I'heure et le reglage de la date, soit on actionne la touche SET jusqu'a disparition du soulignement, soit on actionne la touche START ou MODE. (Nota: la touche MODE renvoie sur un autre mode le cas echeant). Start Reglage du son La pression simultanee des touches MODE et START permet de regler le son du signal acoustique. Sur la ligne inferieure apparait le message "VOLUME" avec une valeur en pourcentage. Ce chiffre represente Pintensite sonore du signal acoustique. La valeur peut etre augmentee ou diminuee a I'aide des touches flechees. Pour terminer cette programmation, on peut actionner au choix la touche SET, MODE ou START (Nota: la touche MODE renvoie sur un autre mode le cas echeant). Le message "VOLUME" disparaTt alors. Reset Si un essai devait necessiter une interruption, il convient d'actionner le bouton marche / arret sur position arret. Ce bouton sert par ailleurs de touche "reset" (remise a I'etat initial). 92 4 Descriptif de I'appareil 4.6 Cadran Sur les lignes 2 jusqu'a 4, le cadran indique en gras les parametres importants pour une experience donnee. Les parametres et leur nombre sont fonction du mode choisi. La ligne superieure indique toujours la date et I'heure. Sur la droite de la ligne inferieure figure un symbole qui indique le mode choisi: 0 : mode pour cellules d'eucaryotes: niveau d'equipement: appareil de base O : mode pour bacteries et levures: niveau d'equipement: module bacterien CD: mode pour fusion cellulaire: niveau d'equipement: module de fusion Surcette ligne pourra figurer le cas echeant le message "VOLUME" ou le residuel pour I'experience en cours. 12.AUG.00 U 500V 13:37 T n VOLUME 100% 220us 1 Presentation d'un ecran pour le reglage du son © Au cours et a la fin d'un essai, Paffichage change et donne les informations correspondant a chaque situation. 93 4 Descriptif de I'appareil 4.7 Electroporation de cellules d'eucaryotes et de bacteries /levures Les essais s'effectuent dans des cuves a usage unique. Le materiel biologique est introduit dans la fente inter-electrodes. II convient de respecter le volume de remplissage present pour chaque cuve. Un excedent de volume au-dessus des electrodes n'affecte pas I'essais en soi, mais en diminue I'efficacite. Une surface depolie permet le marquage. La cuve comporte une protrusion en plastique qui est destinee a faciliter son installation correcte sur le module enfichable. Le couvercle assure la fermeture de la cuve. Une fermeture hermetique de ce couvercle n'est pas prevue pour eviter d'eventuelles surpressions. En raison de cette absence d'etancheite, les cuves remplies seront toujours transportees en position debout pour eviter de repandre le materiel biologique de facon incontrolee. Couvercle Cuve en matiere plastique • It ) Protrusion en plastique Electrodes Fente Fig. 4: Illustration schematique de la cuve d'electroporation Saisir le module enfichable par sa poignee moulee et le retirer du Multiporator®. Remplir la cuve en evitant la presence de bulles d'air. Poser la cuve dans le renfoncement situe dans la partie arriere du module enfichable en I'orientant pour que sa protrusion s'engage dans la fente prevue a cet effet et que la cuve repose bien sur la base du module enfichable. Prendre le module enfichable et sa cuve, puis engager I'ensemble dans la logette de I'appareil pour le pousser ensuite jusqu'en butee. Le module enfichable peut etre conserve au froid. II est a noter que le module enfichable sans cuve n'est pas maintenu, et qu'il peut s'echapper de sa logette au cours d'un transfert de I'appareil. 94 4 Descriptif de I'appareil 4.7.1 Module enfichable (electroporation) pour la connexion d'electrodes externes (option) Les accessoires hors serie (voir nomenclature de commande) component un module d'electroporation enfichable qui permettent la connexion d'electrodes externes (symbole © , decharge de la tension par une fonction e decroissante). La connexion externe doit s'effectuer par une fiche de laboratoire classique de 4 mm comportant une protection isolante! Ce module enfichable peut egalement s'utiliser en mode fusion cellulaire (symbole G 3 ; impulsions rectangulaires) si le reglage de tension pour I'alignement cellulaire est en position "0". 1 Douille de connexion de masse (noir) 2 Douille de connexion du pole positif (rouge) Les consignes de securite (haute tension) et les directives de la compatibility electromagnetique (CEM) relatives au branchement d'electrodes externes sont soumises a la reglementation locale du pays utilisateur. II convient de les appliquer et de les respecter. Tous les appareils ainsi connectes relevent de la responsabilite exclusive de I'utilisateur! 95 4 Descriptif de I'appareil 4.8 Fusion cellulaire (option) 4.8.1 Optimisation de la fusion cellulaire (controle sous microscope) Une micro-chambre de fusion est specif iquement prevue pour optimiser, sous microscope, les parametres de la fusion cellulaire concernant les cellules a analyser. La micro-chambre de fusion est reliee au module enfichable par I'intermediaire d'un cable (1 m). 1 2 Module enfichable de la micro-chambre de fusion 1 Contacts 2 Ressort de mise a la terre Micro-chambre de fusion 1 connecteur coaxial Important: Manipuler les micro-chambres de fusion avec precaution! Charger la suspension cellulaire avec soin. II convient de veiller a ne pas toucher les electrodes avec la pointe de la pipette, de maniere a ne pas les decaler ni a les endommager. Les dommages peuvent etre irreversibles. Au cours de la manipulation de I'alignement ou de la fusion cellulaire, eviter tout contact direct avec les electrodes. La fusion ne doit s'effectuer qu'avec une micro-chambre de fusion dument connectee! 96 - Engager le module enfichable de la micro-chambre de fusion jusqu'a sa butee dans le Multiporator®. - Poser la micro-chambre de fusion contenant environ 50 ul de suspension cellulaire sur la platine du microscope. Observation: Si le depot de la suspension cellulaire s'effectue a I'aide de la pipette a proximite immediate des electrodes, on accroTt les chances de disposer d'un nombre maximum de cellules entre les electrodes. 4 Descriptif de I'appareil Pour bloquer le systeme sur la platine, on peut utiliser les griffes du microscope, qui s'utilisent habituellement, pour immobiliser les lames porte-objet. Connecter le cable de liaison a la micro-chambre de fusion. Assurer la mise au point sur les electrodes et les cellules. Declencher START de maniere a faire activer les parametres programmes et les observer sous microscope. 200 um Cellules en alignement entre les electrodes Cellules apres fusion et sous-produits de la fusion La capacite de remplissage maximum de la micro-chambre de fusion est d'env. 200 ul. Les parametres determines et programmes sont directement transmissibles a la chambre de fusion helicoidale pour y etre utilises. 4.8.2 Nettoyage de la micro-chambre de fusion Pour evacuer le contenu de la micro-chambre de fusion, utiliser une pissette d'eau bidistillee. Les depots cellulaires tenaces peuvent etre enleves a I'aide d'une brosse a dents douce, en ayant soin de pas endommager les electrodes. Passer sur les electrodes dans le sens de leur longueur. Leur ecart ne pas etre altere. Un ringage consecutif par une solution d'alcool non modifie a 70 % permet d'accelerer le sechage. 97 4 Descriptif de I'appareil 4.8.3 Chambre de fusion helicoi'dale Pour effectuer une fusion ceiluiaire d'un nombre important de cellules, on utilise la chambre de fusion helicoTdale. Schema de la chambre de fusion helicoi'dale La chambre de fusion helicoTdale est constituee d'une cuve et d'un noyau comportant des electrodes sous forme d'un enroulement parallele de fils de platine. Cet enroulement autour du noyau est en fait une double helice. Les deux composantes sont vissees en elements concentriques. L'espace entre le noyau et la cuve a une capacite de remplissage de 250 u.1. La chambre de fusion helicoTdale est connectee au module enf ichable par I'intermediaire d'un connecteur coaxial pour realiser la fusion ceiluiaire. 98 Cuve Noyau 1 Filetage 1 Electrode 2 Connecteur coaxial Chambre de fusion helicoTdale 1 Espace pour fusion ceiluiaire Module enfichable pour fusion 1 Contacts 2 Connecteur coaxial 4 Descriptif de I'appareil L'ecart entre les filaments de platine enroules parallelement est d'environ 200 urn. Fig. 5: Image microscopique des electrodes de la chambre de fusion helicoidale Important: Traiter la chambre de fusion helicoidale avec beaucoup de precaution! En effet, un fonctionnement normal et en securite de la procedure n'est pas garanti lorsque les filaments sont detaches ou endommages. Une telle chambre deterioree ne doit plus etre utiliseel 4.8.4 Remplissage de la chambre de fusion helicoidale et installation dans le module de fusion enfichable Introduire 250 ul de suspension ceilulaire dans la chambre de fusion helicoidale. II convient de veiller a ce que le depot de la suspension soit effectue dans la partie la plus basse de la cuve a I'aide de la pipette. Eviter de mouiller le col ainsi que les parois car ceci entrainerait un mauvais remplissage de la chambre de fusion helicoidale. II se formerait alors des bulles d'air qui jouent defavorablement sur le rendement de I'essai. La cuve etant placee verticalement dans un portoir, on y introduit doucement le noyau pour le visser ensuite. Le vissage a pour effet de repousser la suspension ceilulaire vers le haut, I'espace se reduisant de plus en plus par le vissage et I'enfoncement du noyau. 99 4 Descriptif de I'appareil Lors du vissage, veiller a eviter la formation de bulle d'air. En attendant de proceder a la fusion, poser la chambre de fusion helicoTdale a I'envers, debout sur la connexion coaxiale. 4.8.5 Realisation de la fusion et prelevement de la suspension cellulaire - Engager fermement le module enfichable de fusion dans I'appareil. 100 - Poser la chambre de fusion helicoTdale sur le connecteur coaxial du module de fusion enfichable, puis la bloquer en lui imprimant une rotation d'un quart de tour. - Realiser la fusion selon les parametres programmes (voir chap. 5.3). - Debloquer doucement la chambre de fusion helicoTdale par une rotation d'un quart de tour sur le connecteur coaxial puis la retirer. - Avant d'ouvrir, poser verticalement la chambre dans un portoir. - Devisser doucement le noyau et I'extraire de la cuve. - EntraTner la suspension cellulaire se trouvant collee contre le noyau par un petit volume du milieu utilise. - La suspension cellulaire de la cuve et celle recuperee sur le noyau sont reunies et utilisees pour la suite des operations. 4 Deschptif de I'appareil 4.8.6 Nettoyage et disinfection de la chambre de fusion helicoidale Immediatement apres chaque essai, il convient de bien rincer la cuve et le noyau de la chambre de fusion helicoidale a I'aide d'eau distillee pour eviter I'incrustation de depots sees. Lorsque les pieces se trouvent fortement souillees, on peut les decontaminer brievement dans un bain a ultrasons (avec ajout eventuel d'un detergent tel que I'Edisonite Super), ou les brosser delicatement avec une brossette (brosse a dents) douce. Dans la technique du brassage, toujours aller dans le sens des spirales, sous peine de deplacer les fils d'electrodes et de rendre ainsi la chambre de fusion helicoidale inutilisable. L'etape suivante consiste a desinfecter les pieces a I'aide d'alcool ethylique non denature a 70 %. Deposer ensuite les pieces traitees sur un support et laisser secher en conditions steriles a I'abri de la poussiere. Apres sechage, la chambre de fusion helicoidale est a nouveau prete a I'emploi. 4.9 Connexion de I'imprimante (option) Le Multiporator® est capable de livrer un protocole imprime relatif a chaque essai. Ce protocole comporte les parametres utilises, la date et I'heure. Par ailleurs, on peut faire figurer sur ce protocole d'autres parametres tels que le tampon, la concentration, la lignee cellulaire, etc. Les anomalies eventuelles y sont egalement enregistrees. Le protocole ciapres constitue un exemple d'impression pour les differentes applications: 18.Aug.00 16:03:04 eppendorf Multiporator 4308 Higher Eucaryotic Cells U = 100 V, Cuvette Gap Width 1 mm x = 50 us, 2mm V4.00 n= 1 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 101 4 Descriptif de I'appareil 18.Aug.00 16:42:47 eppendorf Multiporator 4308 V4.00 Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, xa= 5.0 ms Cuvette Gap Width 1mm 2mm 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 18.Aug.00 16:17:49 eppendorf Cell Density A Strain / Cell Line B Cell Density B Buffer Temperature 102 n Strain / Cell Line A II Fusion Chamber U'_ = 8.0 V, U = 15V, U"_ = 4.0 V, II Cell Fusion Multiporator 4308 20 s 100 us, 10s V4.00 n= 3 4 Descriptif de I'appareil 18.Aug.97 15:59:08 eppendorf Multiporator 4308 V1.00 * ERROR 07 ******** 1 Short x * L'interface serielle pour imprimante situee a I'arriere de I'appareil permet de connecter une imprimante serielle. II est egalement possible de connecter un ordinateur PC pourtraiter les donnees et les imprimer. Cette connexion s'effectue par un cable modem (douille 9 broches / douille 9 broches; code commande 0013 610.525). Eppendorf AG propose la thermo-imprimante ci-apres. Le descriptif ciapres donne egalement les positons des microcommutateurs pour une imprimante compatible IBM: Code commande Type imprimante Thermo-imprimante DPU-414 0013 608.148 Accessoires Bloc secteur (230 V) 0013 608.172 Bloc secteur (115 V) 0013 608.164 Papier thermoimprimable (les 10 rouleaux) 6547 001.018 douille 9 broches / fiche 9 broches cable brin a brin (pour thermo-imprimante DPU-414) 0013 610.517 Cable de raccordement douille 9 broches / 0013 610.533 fiche 25 broches cable de raccordement imprimante matricielle nullmodem (compatible avec IBM; pour imprimante matricielle Seikhosha SP 2400, papier en alimentation continue) 103 4 Descriptif de I'appareil DIPSW settings Pour thermo-imprimante DPU-414 Pour imprimante matricielle Seikosha SP 2400, papier en alimentation continue Dip SW-1 Dip SW-1 1 (OFF): Input = Serial 2 (ON) : Printing Speed = High 3 (ON) : Auto Loading = ON 4 (ON) : Auto LF = ON 5 (ON) : Setting Command = Enable 6 (OFF): Printing 7 (ON) : Density 8 (ON) : = 100% 1 (OFF) : USA 2 (OFF) : USA 3 (OFF) : USA 4 (ON) : IBM 5 (OFF) : Character Set 1 6 (ON) : 12 inches 7 (OFF) : LF only 8 (ON) : CR = CR + LF Dip SW-2 Dip SW-2 1 (OFF): Printing Columns = 80 2 (ON) : User Font Back-up = ON 3 (ON) : Character Select = Normal 4 (OFF): Zero = Slash 5 (ON) : International 6 (ON) : Character 7 (ON) : Set 8 (OFF): = USA 1 (ON) 2 (ON) 3 (ON) 4 (OFF) 5 (OFF) 6 (OFF) 7 (ON) 8 (OFF) Dip SW-3 1 (ON) : Data Length = 8 bits 2 (ON) : Parity Settings = No 3 (ON) : Parity Conditions = Odd 4 (OFF): Busy Control = XON/XOFF 5 (OFF): Baud 6 (ON) : Rate 7 (ON) : Select 8 (ON) : = 9600 bps 104 : 9600 Baud : 9600 Baud : XON/XOFF : No Parity : No Parity : 8 bits : Serial : No single sheet 5 Techniques de travail 5.1 Mode cellules d'eucaryotes Ce mode est symbolise par le signe 0 sur I'ecran. Premiere etape: programmation ou modification des parametres programmer le 12.AUG.00 MODE pour cellules U 500V d'eucaryotes si necessaire. Taper la touche SET pour choisir le parametre souhaite (souligne). Augmenter ou diminuer les parametres a I'aide des touches flechees. Au besoin, modifier d'autres parametres avec la touche SET et les touches flechees. Terminer la programmation. Les parametres sont a effet immediat et ne necessitent pas la mise en memoire. X n 13:37 Presentation de I'ecran 220us pour I'electroporation de cellules d'eucaryotes. 2 Les parametres 0 importants sont donnes en caracteres plus grands et en gras. U: Tension; unite: V (volt); programmable par increment de 1 volt sur la gamme de 20-100 V, par increment de 10 V sur la gamme de 100-1000 V, et par increment de 100 V sur la gamme de 1000-1200 V. x: Constante de temps; unite: us (microsecondes) reglable par increment de 5 us sur une gamme de 15-500 us. n: Nombre d'impulsions au cours de I'essai; reglable de 1-99; un temps d'attente de une minute est marque entre chaque impulsion. Nota: Les parametres programmes sont effectivement utilises. Le deroulement de I'impulsion est mis au point par un calcul interne, de telle sorte que la courbe de decharge (fonction e) respecte tous les parametres programmes. Pour I'application d'une impulsion rectangulaire, on peut utiliser le module pour fusion (voir chap. 5.4). 105 5 Techniques de travail Deuxieme etape: demarrage de I'electroporation - Declencher I'electroporation en tapant la touche START. - Le cadran indique 13:37 12.AUG.00 "Charge" sur la U 500V X 220|JS troisieme ligne: la Charge charge est en cours. - Au terme de la phase de charge, arrive la phase de decharge, symbolisee par un eclair sur le cadran (3e ligne). 0 Si le nombre 12.AUG.00 13:37 d'impulsions programme U 500V x 220us est superieur a un, le Wait cadran fait apparaitre le message "Wait" I 0:57 0 (attendre) avec le compte a rebours de ce temps d'attente jusqu'a Pimpulsion suivante. Lorsque I'essai est 12.AUG.00 13:37 definitivement termine, U 500V X 220|iS I'appareil emet un n 2 double signal sonore. L'ecran se remet a sa READY SINCE 1:36 © position de depart avec la mention des differents parametres programmes et utilises. Dans la ligne inferieure, un chronometre indique le temps ecoule depuis la fin de I'essai. Ce message disparait apres 99 minutes ou apres sollicitation d'une touche. 106 5 Techniques de travail 5.2 Mode bacteries et levures (option) Le mode est symbolise par le signe OPremiere etape: programmation ou modification des parametres - - Programmer le 12.AUG.00 MODE pour U 2000V bacteries et levures, si necessaire. Taper la touche SET pour choisir le parametre tension (U) (souligne). - Augmenter ou diminuer les parametres a I'aide des touches flechees - Terminer la programmation. Les parametres sont a effet immediat et ne necessitent pas la mise en memoire. X 13:42 Presentation de I'ecran 5 ms pour I'electroporation de cellules bacteriennes ou de levures. O Les parametres importants sont donnes en caracteres plus grands et en gras. U: Tension; unite: V (volt); programmable par increment de 10 V sur la gamme de 200-1000 V, et par increment de 100 V sur la gamme de 1000-2500 V. t : Constante de temps; unite: ms (millisecondes) Valeur fixe de 5,0 ms. 107 5 Techniques de travail Deuxieme etape: demarrage de I'electroporation - Declencher I'electroporation en tapant la touche START. - 13:42 12.AUG.00 Le cadran indique "Charge" sur la U 2000V % 5 ms troisieme ligne: la Charge charge est en cours. - Lorsque la phase de charge est terminee, elle est sulvie par la phase de decharge, symbolisee par un eclair sur le cadran (3e ligne). O Lorsque I'essai est 13:42 U a : Tension mesuree, 12.AUG.00 termine, I'appareil emet U 2000V X 5 ms effectivement utilisee; un double signal sonore. unite: V (volt). Ua2003V X a 5.1 ms L'ecran se remet a sa Constante de temps position de depart avec READY SINCE 1:36 O xa: mesuree et la mention des differents effectivement utilisee; parametres programmes unite: ms et utilises. Sur la 3e ligne (milliseconde); les figurent les valeurs valeurs < 0,8 sont effectives U a et x a . representees par Dans la ligne inferieure, 0,8 ms. un chronometre indique le temps ecoule depuis la fin de I'essai. Ce message disparait apres 99 minutes ou apres sollicitation d'une touche. 108 5 Techniques de travail 5.3 Mode fusion ceilulaire (option) 5.3.1 Fonction: Alignement (Orientation ceilulaire) Les fonctions de I'alignement sont representees par les symboles U'_ (avant I'impulsion) et U"_ (apres Pimpulsion) aux lignes 2 et 4 du cadran. Premiere etape: programmation ou modification des parametres Si necessaire, programmer la fonction Fusion a I'aide de la touche MODE. 13:42 Presentation de I'ecran pour I'alignement U'_ 5V t 60s Un OV t 15s n2 sans activation de I'impulsion Un et de U"_ OV t 30s I'alignement U"_: 12.AUG.00 U'_. Taper la touche SET pour choisir les parametres souhaite (souligne). Les parametres importants sont donnes en caracteres gras de grande taille. Augmenter ou diminuer les parametres a I'aide des touches flechees. Si une valeurest regleesur "0" dans les cellules U L / U ' ^ / U n , la fonction concernee n'est pas executee. U'_ / U"_ peuvent de cette maniere etre declenches individuellement ou I'un apres I'autre sans activation de I'impulsion de fusion. U'_/U'L: Tension alternative, unite V (volt); programmable : "0" et une gamme de1,0a10Vpar increments de 0,1 V. Terminer la programmation. Les parametres sont a effet immediat et ne necessitent pas la mise en memoire. t: Duree de I'alignement de 0-95 s, unite: s (secondes) par increment de 5 s. Un:Tension, (impulsion rectangulaire), unite: le Volt (V) programmable: "0" et sur la gamme de5-100Vpar increment de 1 V, sur la gamme d e l 00-300 V par increment de 10 V. t: Duree de I'impulsion, unite: useconde (us) programmable sur la gamme de 0-300 u.s par increment de 5 us. n: Nombre d'impulsions 0-99, programmable par increment de 1. 109 5 Techniques de travail Deuxieme etape: Demarrage de I'alignement - - Declencher I'alignement U'_ en appuyant sur la touche START. La quatrieme ligne de I'afficheur fait apparaitre le message / \A/! la tension alternative est activee pour la duree programmee. Au terme de I'essai apparatt un double message sonore et I'afficheur revient a sa presentation d'entree de base avec les parametres programmes et utilises. De plus, la ligne inferieure indique le temps, en minutes et secondes, ecoule depuis la fin de I'essai. Cette information disparaft apres 99 minutes ou des la sollicitation d'une touche. 110 12.AUG.00 13:42 U'_ 5V t 60s Un U\_ OV t 15s n2 OV t 30s 5 Techniques de travail 5.3.2 Execution de la fusion ceiiulaire Premiere etape: programmation ou modification des parametres - Taper la touche S ET 12.AUG.00 13:42 pourchoisir U'_ 5V t 30s les parametres Un 30V t 15|JS n2 souhaite (souligne). U"~ 5V t 30s Augmenter ou diminuer les parametres a I'aide 12.AUG.00 13:42 des touches U' t 30s ov flechees. En un 30V t 15MS n2 fonction de la U"~ 5V t 30s programmation des parametres UL et U"_, la fusion peut etre associee, au choix, sans alignement, avec une seule fonction d'alignement ou avec les deux fonctions d'alignement. Terminer la programmation. Les parametres sont a effet immediat et ne necessitent pas la mise en memoire. Illustration du cadran pour Pexecution de I'electrofusion avec activation de I1alignementl)1_/U"_. Illustration du cadran pour I'execution de I'electrofusion sans activation de I'alignement Les parametres importants sont donnes en caracteres gras de grande taille. Un: Tension; unite: V (volt); programmable: "0" et sur la gamme de5-100Vpar increment de 1 V, sur la gamme d e l 00-300 V par increment de 10 V. t: Duree d'impulsion; unite: us (microsecondes), programmable sur la gamme de 0-300 us par increment de 5 us. U'^/U"^: Tension alternante; unite: le V (volt); programmable: "0" et sur la gamme de 1,0 a 10 V par increment de 0,1V. n: Nombre d'impulsions 0-99, programmable par increment de 1. 111 5 Techniques de travail Deuxieme etape: demarrage de la fusion cellulaire - Declencher la fusion cellulaire en tapant la touche START. - Le cadran indique 12.AUG.00 13:42 brievement "Charge" sur la U'_ 5V t 30s quatrieme ligne: la Un 30V t 15|is n2 charge est en cours. Charge - Au cours du 12.AUG.00 13:42 processus de charge, la premiere U'_ 5V t 30s alternance de Un 30V t 15MS n2 tension U'^ est deja presente 2 0:23 G5 pour la duree programmee. L'altemance de tension est indiquee par le signe ~ (oscillations sinusoidales). - 112 Au terme de la duree d'orientation programmee (0-95 secondes), la decharge intervient, representee par un eclairalaquatrieme ligne. En fonction du nombre n programme, et si n >1, la decharge suivante aura lieu une seconde apres. 5 Techniques de travail - Au terme des decharges, I'altemance de tension U"_ est presente pour la duree programmee (0-99 secondes). Dans la ligne inferieure, un chronometre indique en permanence le temps ecoule depuis le debut de I'essai. A la fin de I'essai, 13:42 12.AUG.00 I'appareil emet un U'_ 5V t 30s double signal sonore. U n 30V t 15MS n2 L'ecran se remet a sa U'~ 5V t 30s position de depart avec READY SINCE 1:36 la mention des differents parametres programmes et utilises. Dans la ligne inferieure, un chronometre indique le temps ecoule depuis la fin de I'essai. Ce message disparait apres 99 minutes ou apres sollicitation d'une touche. Nota: Dans le cas d'une programmation U'_/ U"_ = 0, on peut utiliser une impulsion rectangulaire pour I'electroporation, alors que ce type d'impulsion n'est habituellement accessible que dans la fusion. Dans ce cas d'espece, I'electroporation a lieu avec le module de fusion ainsi que tous les parametres y afferents. L'utilisation de Pimpulsion rectangulaire n'est pas possible en dehors du module pour fusion. 113 6 Messages d'erreurs En cas de constat d'anomalie, le Multiporator® emet un signal sonore et indique un message d'erreur a I'ecran ou sur I'imprimante branchee en option. Ces messages d'anomalie se rapportent soit a une anomalie technique de I'appareil ou concernent son utilisation. Les messages 1-4 et 9 peuvent se presenter avec le module bacterien, les messages 1-7 avec les cellules d'eucaryotes, et 1-8 avec la fusion cellulaire. Anomalie N° Message d'erreur Origine Remede 01 No Display Le cadran est hors commande. Faire appel au service apres-vente. 02 No RTC / NVRAM Composant electronique de Phorloge interne defectueux. Faire appel au service apres-vente. 03 High Current Le courant de decharge (impulsion) a ete trap fort. Diminuer la conductivity de la solution, Verifier si le type de cuve convenait a cette utilisation. 04 No Cuvette Absence de cuve. Mettre en place une cuve et rectemarrer I'essai. Bien engager la logette. 114 05 Timeout Charge Le condensateur Faire appel au service n'a pas reussi la apres-vente. charge au cours du temps imparti depuis le debut de la charge. 06 Timeout Charge Le condensateur n'a pas reussi sa charge au cours du temps imparti dans le cas compulsions multiples. Diminuer la conductivity de la solution, Verifier si le type de cuve convenait a cette utilisation, 6 Messages d'erreurs Anomalie N° Message d'erreur Origine Remede 07 Short x Le condensateur s'est completement decharge. II n'est pas sur que le x programme ait ete realise. Le facteur limitant n'a pas ete la programmation de I'impulsion, mais le condensateur. Diminuer la conductivite de la solution. Verifier si le type de cuve convenait a cette utilisation. 08 Low Resistance Courant trop fort dans la cuve; la tension alternative n'a pas pu etre maintenue. Diminuer la conductivite de la solution utilisee. 09 Timeout Measuring x Faire appel au service apres-vente. Module xa= 0,8 ms, bacte- U a notablement trop faible par rien rapport au parametre U programme Depassement de temps lors de la mesure de x sur le module bacterien. - Saut d'etincelle dans la cuve. - Le courant a ete trop fort lors de la decharge (impulsion). - Anomalie technique. - Utiliser une cuve avec une fente d'electrode plus grande. - Diminuer la conductivite de la solution utilisee. - Faire appel au service apresvente. 115 7 Maintenance, service apres-vente et entretien L'appareil ne necessite pas de maintenance reguliere. La prise en charge de la garantie et de I'apres-vente est assuree par votre revendeur. 7.1 Disinfection Avant de proceder a la disinfection du Multiporator®, retirer le cordon secteur. Toutes les parties du Multiporator® sont a desinfecter en frottant avec un produit disinfectant, y compris les accessoires et les cables de raccordement. Le module enfichable peut etre desinfecte par pulverisation. La disinfection par pulverisation de I'ensemble de l'appareil n'est pas recommandee, le produit disinfectant pouvant penetrer a I'interieur de l'appareil. Le produit disinfectant doit etre conforme a la reglementation et les directives en vigueur. 7.2 Nettoyage Avant de proceder au nettoyage du Multiporator®, retirer le cordon secteur. II convient de bien veiller a ce qu'aucun produit de nettoyage ne penetre a I'interieur du Multiporator®. Cette precaution permet d'eviter les courtscircuits electriques ainsi que la corrosion. Les parois peintes et les surfaces en aluminium peuvent etre essuyees a I'aide d'un chiffon et d'un produit nettoyant doux. Finir le nettoyage en passant un chiffon sec. Attention: Ne jamais utiliser de produits corrosifs ou abrasifs, ou encore de produits a polir. 116 8 Specifications techniques Tension d'alimentation et frequence: Fusibles: Puissance: Categorie surtension: Classe de protection: Degre de pollution: Tensions programmables Module pour cellules d'eucaryotes: 100-240 V ±10 %, 50-60HZ TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 fusibles) 60 W II I 2 20- 100 V par increment de 1 V 100-1000 V par increment de 10V 1000-1200 V par increment de 100 V Intervalle entre impulsions: 1 minute Fusion cellulaire: 0, 5 - 100 V par increment de 1V 100- 300 V par increment de 10 V Intervalle entre impulsions: 1 seconde Tensions alternatives : 0, 1,0- 10 V par increment de 0,1 V 200-1000 V par increment de 10V Bacteries: 1000-2500 V par increment de 100 V Pas d'impulsions multiples Condensateur: 10 uF, 2500 V decharge de I'impulsion 600 Q. parallele Resistance: 56 £2 precedente < 30 secondes Duree de charger: 0-99 Nombre d'impulsions n: Constante de temps x de la decharge: cellules d'eucaryotes: 15-500 us par increment de 5 us, fonction decroissante, 5 ms (nominal), bacteries: avec une impedance de 3,3 kQ de Pechantillon, mesure et affiche de 0,8-6,0 ms Duree de I'alignement (Orientation cellulaire): Programmable sur la gamme 0-95 s par increment de 5 s Duree t de I'impulsion 0-300 us par increment de 5 us, (fusion cellulaire): impulsion rectangulaire 9600 baud, 8 bit, sans parite, Interface RS 232: 2 bit stop, XON/XOFF 117 8 Specifications techniques Temperature ambiante: Humidite relative ambiante: Poids: Dimensions: 40 CC max. 80 % max. 5,5 kg, max.; selon equipement largeur: 25,2 cm profondeur: 34,2 cm hauteur: 12,0 cm L'appareil comporte marquage •(* £ et I'homologation UL et CSA (cUL E 1 8089). Toutes modifications reservees! 118 9 Nomenclature de commande Code commande 4308 000.015 4308 000.023 4308 000.031 4308 000.040 4308 070.501 4308 070.510 4308 070.528 4308 070.536 4307 000.569 4307 000.593 4307 000.623 4308 078.006 4308 070.072 4308 021.004 4308 012.005 4308 014.008 4308 030.003 4308 024.003 4308 017.007 Multiporator® version de base pour cellules d'eucaryotes 100-240 V, 50-60 Hz Multiporator®, pour cellules d'eucaryotes et module bacterien Multiporator®, pour cellules d'eucaryotes et module fusion Multiporator®, pour cellules d'eucaryotes, module bacterien et fusion cellulaire Accessoires Tampons Tampon hypo-osmolaire pour electroporation (PH), les 100 ml Tampon iso-osmolaire pour electroporation (PI), les 100 ml Tampon hypo-osmolaire pour fusion cellulaire (FH), les 100 ml Tampon iso-osmolaire pour electroporation (Fl), les 100 ml Cuve d'electroporation Cuve aluminium, sterile, fente de 1 mm, (50 pieces) Cuve aluminium, sterile, fente de 2 mm, (50 pieces) Cuve aluminium, sterile, fente de 4 mm, (50 pieces) Porte-cuve pour 16 cuves d'electroporation Module enfichable pour electroporation Module enfichable (electroporation / electrofusion) pour connexion d'electrodes extemes Module enfichable pour chambre de fusion helicoidale Chambre de fusion helicoidale fente d'electrode de 0,2 mm Micro-chambre de fusion cellulaire, fente d'electrode de 0,2 mm Module enfichable pour micro-chambre de fusion cellulaire Portoir pour 10 chambre de fusion helicoidale 119 9 Nomenclature de commande 0013 608.148 0013 608.172 0013 608.164 6547 001.018 0013 610.517 0013 610.525 0013 610.533 4308 010.002 4308 011.009 120 Thermo-imprimante DPU-414 Bloc secteur pour thermo-imprimante DPU-414; 230 V Bloc secteur pour thermo-imprimante DPU-414; 115V Papier thermoimprimable (les 10 rouleaux) Cable de raccordement (9 broches, douille, 9 broches fiche, brin a brin) Cable de raccordement PC nullmodem (9 broches, douille, 9 broches douille) Cable de raccordement imprimante matricielle nullmodem (9 broches, douille, 25 broches fiche) Module complementaire pour bacteries (installation par service apres-vente) Module complementaire pour fusion cellulaire (installation par service apres-vente) Indice 1 Generality 122 2 Uso secondo destinazione 123 3 Avvertenze di sicurezza 124 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.7.1 126 127 128 128 129 129 132 133 4.8.6 4.9 Descrizione dell'apparecchio Dotazione di fornitura Messa in esercizio Camera portacuvetta Tastiera Tasti e combinazioni di tasti Display Elettroporazione di cellule eucariotiche e batteri / lieviti . . . Modulo (di elettroporazione) per il collegamento di elettrodi esterni (optional) Fusione cellulare (optional) Ottimizzazione della fusione cellulare (controllo al microscopio) Pulizia della micro-camera di fusione Camera di fusione elicoidale Riempimento della camera di fusione elicoidale ed impiego nel modulo di fusione Esecuzione della fusione e rimozione della sospensione di cellule Pulizia e disinfezione della camera di fusione elicoidale... Collegamento della stampante / Stampante (optional) . . . . 139 140 140 5 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 Metodologie di lavoro Modalita per cellule eucariotiche Modalita per batteri e lievito (optional) Modo fusione cellulare (opzionale) Funzione: Alignment (orientamento delle cellule) Esecuzione della fusione cellulare 144 144 146 148 148 150 6 Messaggi di errore 153 7 7.1 7.2 Manutenzione, assistenza e pulizia Disinfezion Pulizi 155 155 155 8 Dati tecnici 156 9 Informazioni per I'ordinazione 158 4.8 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 4.8.5 134 135 135 136 137 138 121 1 Generality II Multiporator® e stato appositamente costruito per I'elettroporazione di cellule eucariotiche con la possibility optional di eseguire I'elettroporazione di batteri e lievito nonche la fusione cellulare applicandovi moduli supplementari. Nelle presenti istruzioni per I'uso vengono illustrate tutte le possibility di impiego del multiporatore. II Multiporator® si distingue dagli altri apparecchi per il fatto che i parametri impostati per I'elettroporazione di eucarioti e la fusione cellulare vengono mantenuti con estrema precisione grazie al calcolo interno della curva di scarica. 122 2 Uso secondo destinazione Conformemente a quanto prescritto dalla legge sulla sicurezza delle apparecchiature e dalle normative industriali: - L'apparecchio pud essere utilizzato unicamente per gli esperimenti di tecnologia cellulare Lo spettro di applicazione comprende Pelettroporazione di lievito e batteri e cellule eucariotiche nonche la fusione cellulare. - Si devono utilizzare esclusivamente accessor! originali Eppendorf Si devono utilizzare esclusivamente accessori originali, poiche soltanto questi sono stati appositamente costruiti per garantire il funzionamento ottimale del multiporatore. Le uniche eccezioni sono costituite dalle apparecchiature supplementari consigliate dal produttore. In caso contrario si estinguono immediatamente qualsiasi garanzia e responsabilita dovesse derivare da eventuali danni. 123 3 Avvertenze di sicurezza Per garantire la sicurezza personale degii operatori e assolutamente necessario osservare le seguenti avvertenze! • Osservare le istruzioni per I'uso Intervenire unicamente dopo aver letto attentamente le istruzioni per I'uso! • L'apparecchiatura puo essere collegata unicamente a reti di alimentazione di corrente dotate di conduttore di protezione. • Prima della messa in esercizio e necessario controllare che la tensione indicata sulla targhetta di identificazione dell'apparecchio corrisponda a quella della rete di alimentazione! Prima di aprire I'alloggiamento, staccare la spina dalla presa di corrente! • Uapparecchiatura non deve essere utilizzata in ambienti in cui sussista il pericolo di esplosione! • Assicurarsi sempre che nell'apparecchio e nei moduli non possano penetrare liquidi! L'apparecchiatura puo essere utilizzata unicamente per applicazioni in vitro! Utilizzare I'apparecchio soltanto conformemente alia sua destinazione! Non introdurre nella camera portacuvetta component!, apparecchi, utensili ecc. diversi da quelli descritti dalla Eppendorf AG! Alta tensione! 124 • Utilizzare unicamente gli accessori indicati. Accessori di altri produttori possono essere utilizzati unicamente dietro rilascio di un nullaosta di compatibilita di impiego dal punto di vista della sicurezza tecnica da parte della Eppendorf AG! • Collegamenti elettrici con apparecchiature non citate nelle presenti istruzioni per I'uso sono consentiti unicamente dietro colloquio ed autorizzazione del produttore! 3 Avvertenze di sicurezza Manipolare con cautela la camera di fusione elicoidale! Qualora gli elettrodi si fossero staccati o danneggiati, non e piu garantita alcuna sicurezza di funzionamento! In questo caso, non utilizzare piu la camera di fusione elicoidale! Non aprire mai la camera di fusione elicoidale durante la fusione stessa, bensl attendere il termine della fusione! Manipolare con cautela la micro-camera di fusione! Riempire con cautela la sospensione contenente cellule! Se possibile, non toccare e non spostare gli elettrodi con il puntale della pipetta! Pericolo di danneggiamento! Evitare il contatto diretto con gli elettrodi durante I'allineamento/la fusione cellulare! L'allineamento/la fusione cellulare possono avvenire unicamente se la micro-camera di fusione e collegata! II cavo e previsto soltanto per il collegamento della micro-camera di fusione! Non sono consentiti altri tipi di collegamento! Non immergere la spina in liquidi! La responsabilita per il funzionamento dell'apparecchio viene sempre trasmessa al proprietario o alPutente dello stesso, purche I'apparecchio venga sottoposto a manutenzione o riparato da personale non facente parte del servizio assistenza eppendorf e venisse impiegato non conformemente alia sua destinazione. La ditta Eppendorf AG non e responsabile per i danni derivanti dall'inosservanza delle avvertenze. Le disposizioni previste dalle condizioni di vendita e consegna della Eppendorf AG riguardanti garanzia e responsabilita non vengono ampliate dalle precedenti avvertenze. La ristampa delle istruzioni per I'uso oppure di parte di esse e consentita unicamente dietro autorizzazione scritta della Eppendorf AG! La ditta Eppendorf AG si riserva il diritto di apportare modifiche tecniche al presente prodotto! 125 4 Descrizione dell'apparecchio II multiporatore e disponibile in quattro versioni, e cioe nella versione di base per I'elettroporazione di cellule eucariotiche, nella prima versione ampliata con la possibility di effettuare I'elettroporazione di batteri e lievito, come modulo integrate per la fusione cellulare e nella quarta versione ampliata, costituita da una combinazione delle altre due. II multiporatore viene pilotato tramite una tastiera di semplice utilizzo, accanto alia quale e installata la camera o modulo per la cuvetta da elettroporazione. ... \ Fig. 1: Multiporator®, vista anteriore 126 I 4 Descrizione deli'apparecchio 4.1 Dotazione di fornitura Apparecchio di base: Multiporator® per I'elettroporazione di cellule eucariotiche con cavo di alimentazione Camera per le cuvette da elettroporazione Cuvette da elettroporazione (distanza inter-elettrodo 2 mm, 4 mm) Sistema tampone iposmolare ed isosmolare per I'elettroporazione Istruzioni d'impiego e manuale di applicazioni base Modulo batteri optional: Apparecchio di base compresi gli accessori con modulo batteri integrato Cuvette da elettroporazione (distanza inter-elettrodo 1 mm) Modulo fusione cellulare optional: Apparecchio di base compresi gli accessori con modulo fusione cellulare integrato Camera di fusione elicoidale (distanza interelettrodo 0,2 mm)) Modulo per camera di fusione elicoidale Micro-camera di fusione (distanza interelettrodo 0,2 mm) con vano speciale Sistema tampone iposmolare ed isosmolare per la fusione cellulare Modulo fusione e batteri optional: Apparecchio di base compresi gli accessori con modulo fusione e batteri integrato 127 4 Descrizione dell'apparecchio 4.2 Messa in esercizio Sul retro del multiporatore e installato un connettore dotato dl fusibile integrato e I'interruttore generale. Per la messa in funzione dell'apparecchio occorre collegare il cavo di alimentazione a questo connettore ed, infine, collegarlo alia rete di corrente. Per accendere I'apparecchio basta azionare I'interruttore generale. I 1 1 1 1 1 e 11 Fig. 2: Multiporator®, retro a sinistra collegamento alia rete a destr connettore per la stampante 4.3 Camera portacuvetta II modulo che alloggia le cuvette per elettroporazione si trova sul lato frontale dell'apparecchio, accanto alia tastiera. Per estrarre la cuvetta occorre sfilare il modulo, mentre per inserirne una nuova e necessario introdurre la punta della cuvetta nella fessura posteriore, quindi si dovra spingere completamente la camera portacuvetta nell'apparecchio. Inoltre, nel multiporatore e installato un sensore che rileva la presenza di una cuvetta nella camera portacuvetta. Osserva: se occorre spostare I'apparecchio, nella camera portacuvetta dovra essere inserita una cuvetta vuota oppure la camera dovra essere trasportata separatamente. Per le versioni ampliate per la fusione cellulare si utilizzano camere diverse. 128 4 Descrizione dell'apparecchio 4.4 Tastiera Tramite la tastiera e possibile impostare i parametri necessari, selezionare la modalita di elettroporazione desiderata nonche avviare il procedimento di elettroporazione. A seconda della versione di cui si dispone, si possono selezionare sino a 4 modalita operative. Inoltre, attivando alcune combinazioni di tasti si possono impostare la data e I'orario nonche regolare il volume del segnale acustico. Multiporator eppendorf 12.OKT.97 13:37 U 500V T 220 MS 1 n VOLUME 100% © Fig. 3: Pannello utente con tasti e display 4.5 Tasti e combinazioni di tasti SET Con il tasto SET e possibile selezionare il parametro desiderato che verra rappresentato sul display con una sottolineatura. Per selezionare un altro parametro si dovra premere piu volte il tasto SET sino al parametro desiderato. Per terminare una sequenza SET, si pud premere ripetutamente il tasto SET finche la sottolineatura sul display non scompare oppure si puo premere il tasto MODE o START (Osserva: il tasto MODE attiva un'altra modalita, se presente). Con i tasti direzionali, cioe le frecce su e giu, e possibile modificare corrispondentemente i parametri desiderati. Una volta raggiunto il valore minimo, si passa al valore massimo. Lo stesso accade nella direzione opposta. 129 4 Descrizione deU'apparecchio MODE Con il tasto MODE si pud attivare la modalita operativa con cui si desidera effettuare I'elettroporazione. Si possono selezionare soltanto tre modalita, a seconda della versione di cui si dispone. Cio significa che con il modello piu avanzato si possono selezionare 3 modalita e con la versione di base sara disponibile soltanto la modalita di elettroporazione per cellule eucariotiche. Sul display verra visualizzato il simbolo corrispondente: O : Modalita per cellule eucariotiche Versione: apparecchio di base Impulso utilizzato: funzione esponenziale decrescente O : Modalita per batteri e lievito Versione: modulo batteri Impulso utilizzato: funzione esponenziale decrescente (£•): Modalita per fusione cellulare Versione: modulo fusione Impulso utilizzato: impulso rettangolare Start START Con il tasto START si attiva la corrispondente funzione. Tasti direzionali Con i tasti direzionali, ovvero a freccia, modificano i parametri selezionati (sottolineati) aumentandoli o diminuendoli. 130 4 Descrizione dell'apparecchio Impostazione della data Premendo contemporaneamente i tasti SET e MODE e possibile attivare la funzione di impostazione della data e deH'orario. Premendo ancora il tasto SET, il trattino che sottolinea la data e I'orario si sposta da sinistra a destra. In questo modo si possono modificare le impostazioni utilizzando i tasti direzionali. Per uscire dalla modalita di impostazione della data si puo premere ripetutamente il tasto SET finche il trattino sul display non scompare oppure si puo premere il tasto MODE o START {Osserva: il tasto MODE attiva un'altra modalita, se presente). Start Regolazione del volume Premendo contemporaneamente i tasti MODE e START e possibile attivare la funzione di regolazione del volume dei segnali acustici. Premendo questi tasti, neH'ultima riga in basso sul display viene visualizzato "VOLUME" con una percentuale. Questa percentuale indica il volume e puo essere modificata con i tasti direzionali. Per uscire dalla modalita di regolazione del volume si puo premere il tasto SET, MODE oppure START (Osserva: il tasto MODE attiva un'altra modalita, se presente). L'indicazione "VOLUME" scompare dal display. Reset Per annullare un tentativo di impostazione si puo soltanto agire sulPinterruttore generate, che funge anche da tasto di reset. 131 4 Descrizione dell'apparecchio 4.6 Display Nel display i parametri di rilievo per I'esperimento vengono rappresentati dalla riga 2 alia 4 in scrittura piu grande e in grassetto. I parametri stessi ed il loro numero dipendono dalla modalita operativa selezionata. Nella riga piii in alto vengono costantemente visualizzati la data e I'orario, mentre a destra nella riga piu bassa viene visualizzato il simbolo che contraddistingue la modalita operativa selezionata: 0 : Modalita per cellule eucariotiche Versione: apparecchio di base O : Modalita per batteri e lievito Versione: modulo batteri <£•): Modalita fusione cellulare Versione: modulo fusione In questa riga si possono visualizzare anche la funzione "VOLUME" oppure il tempo residuo dell'esperimento. 12.AUG.00 U 500V 13:37 X n VOLUME 100% 220us 1 Esempio di visualizzazione per la regolazione del volume 0 Durante e dopo resperimento, il display cambia visualizzando di volta in volta tutte le informazioni necessarie. 132 4 Descrizione dell'apparecchio 4.7 Elettroporazione di cellule eucariotiche e batteri/lieviti I relativi esperimenti vengono eseguiti in cuvette monouso predisponendo il materiale biologico nella fessura presente tra gli elettrodi, denominata distanza inter-elettrodo. Non e consentito superare il volume indicato sulla cuvetta, poiche un livello di riempimento superiore all'altezza degli elettrodi non compromette I'esperimento di per se, ma ne riduce notevolmente I'efficacia. Su un riquadro satinato e possibile scrivere per contrassegnare la cuvetta. La punta in plastica sulla cuvetta consente di introdurre la cuvetta correttamente nella camera portacuvetta. II tappo chiude la cuvetta. Per proteggere la cuvetta da un'eventuale sovrappressione, il tappo non e a chiusura ermetica; pertanto, una cuvetta piena dovrebbe essere trasportata soltanto in verticale, altrimenti potrebbe fuoriuscire materiale biologico. r-A-x Tappo Cuvetta in plastica Punta in plastica Elettrodi Fessura Fig. 4: Rappresentazione schematica della cuvetta per elettroporazione La camera portacuvetta viene estratta dal multiporatore tirandola dall'apposita impugnatura. La cuvetta viene riempita senza la formazione di bolle. La cuvetta viene introdotta nella cavita posteriore della camera portacuvetta in modo che la punta della cuvetta si inserisca nella fessura allungata e la cuvetta poggi sul fondo della camera portacuvetta. Dopodiche, quest'ultima viene spinta nell'apparecchio con la cuvetta cosi applicata sino alia battuta di arresto. La camera portacuvetta puo essere conservata refrigerata. Durante il trasporto dell'apparecchio occorre ricordare che una camera portacuvetta senza cuvette potrebbe scivolare fuori dall'apparecchio. 133 4 Descrizione dell'apparecchio 4.7.1 Modulo (di elettroporazione) per il collegamento di elettrodi esterni (optional) Tra gli accessori non di serie (si vedano le informazioni per I'ordinazione) vi sono un modulo di elettroporazione (simbolo © , scarica di tensione tramite una funzione esponenziale decrescente) a cui possono essere collegati elettrodi esterni. Gli elettrodi devono essere collegati tramite una spina da laboratorio da 4 mm con protezione contra le scariche! Questo modulo pud essere utilizzato anche nella modalita di fusione cellulare (simbolo £ • ) , impulso rettangolare) se la tensione alternata per Pallineamento ("alignement") cellulare viene impostata su "0". 1 Presa di terra (nera) 2 Presa polo positivo (rossa) Per il collegamento di elettrodi esterni occorre osservare le avvertenze di sicurezza (alta tensione) e le normative di compatibilita elettromagnetica nazionali vigenti in material Tutte le apparecchiature collegate rientrano nella sfera di responsabilita dell'utente! 134 4 Descrizione dell'apparecchio 4.8 Fusione cellulare (optional) 4.8.1 Ottimizzazione delta fusione cellulare (controllo al microscopio) Per ottimizzare i parametri della fusione cellulare per le cellule da analizzare, con una speciaie micro-camera di fusione e possibile seguire al microscopio sia I'allineamento che la fusione delle cellule. La micro-camera di fusione viene collegata al modulo con I'apposito cavo (ca. 1 m). 1 2 Modulo della micro-camera di fusione 1 Contatti 2 Mode di terra micro-camera di fusione 1 Connettore coassiale Attenzione: manipolare con cautela la micro-camera di fusione! Riempire con cautela la sospensione contenente cellule! Se possibile, non toccare ne spostare gli elettrodi con il puntale della pipetta! Pericolo di danneggiamento! Evitare il contatto diretto con gli elettrodi durante rallineamento/la fusione cellulare! La fusione puo avvenire unicamente se la micro-camera di fusione e collegata! - Inserire saldamente la micro-camera di fusione nel Multiporator®. - Collocare la micro-camera di fusione riempita con ca. 50 ul di sospensione di cellule sul microscopio. Avvertenza: pipettando con cautela la sospensione contenente cellule sugli elettrodi e possibile massimizzare il numero di cellule tra gli elettrodi. 135 4 Descrizione dell'apparecchio Per fissare la sospensione al banco del microscopio, si possono utilizzare, ad esempio, le clip che vengono utilizzate anche per il fissaggio di un vetrino. Collegare la micro-camera di fusione con il cavo. Mettere a fuoco gli elettrodi e le cellule. Attivare i parametri impostati con il tasto START continuando I'osservazione al microscopio. 200 Cellule tra gli elettrodi nell'allineamento cellulare (alignement) Cellule dopo la fusione e prodotti della fusione La capacita massima della micro-camera di fusione e di ca. 200 uj. I parametri calcolati ed impostati possono essere impostati ed applicati direttamente sulla camera di fusione elicoidale. 4.8.2 Pulizia della micro-camera di fusione Per rimuovere il contenuto della micro-camera di fusione si effettua un lavaggio con acqua bidistillata (flacone spray), mentre i residui piu resistenti potranno essere eliminati passando delicatamente uno spazzolino da denti a setole morbide in direzione longitudinale rispetto agli elettrodi (attenzione a non modificare la distanza inter-elettrodol). Per accelerare il processo di asciugatura si puo effettuare un risciacquo supplementare con alcool etilico (70 %, non denaturato). 136 4 Descrizione dell'apparecchio 4.8.3 Camera di fusione elicoidale La fusione cellulare di un numero maggiore di cellule viene effettuata in una apposita camera di fusione elicoidale. Schema delta camera di fusione elicoidale La camera di fusione elicoidale si compone di un contenitore e di un nucleo con fili di platino ad avvolgimento parallelo, gli elettrodi. Questi fili sono avvolti a doppia elica intorno al nucleo. Entrambi i componenti sono awitati e la fessura tra il contenitore ed il nucleo presenta una capacita di 250 ul. La camera di fusione elicoidale viene collegata al modulo di fusione cellulare tramite un connettore coassiale. Contenitore Nucleo 1 Filettatura 1 Elettrodi 2 Connettore coassiale Camera di fusione elicoidale 1 Fessura per fusione cellulare Modulo di fusione 1 Contatti 2 Connettore coassiale 137 4 Descrizione dell'apparecchio La distanza tra gli elettrodi in platino avvolti e di ca. 200 |im. Fig. 5: Immagine al microscopio degli elettrodi della camera di fusione elicoidale Attenzione: manipolare con cautela la camera di fusione elicoidale! Qualora gli elettrodi si fossero staccati o danneggiati, non e piu garantita alcuna sicurezza di funzionamento! In questo caso, non utilizzare piu la camera di fusione! 4.8.4 Riempimento della camera di fusione elicoidale ed impiego nel modulo di fusione La camera di fusione elicoidale viene riempita con 250 ul di sospensione contenente cellule. II liquido deve essere pipettato esattamente nella parte piu profonda del contenitore. Inoltre occorre evitare sempre di bagnare il bordo o la parete del contenitore, poiche cio potrebbe causare un riempimento scorretto della camera di fusione elicoidale e si potrebbero formare bolle d'aria che riducono Pefficacia deH'esperimento. Tenendo il contenitore in posizione verticale (nel supporto), introdurre con cautela il nucleo ed awitarlo con cautela nel contenitore. Awitando il nucleo, la sospensione di cellule viene spinta verso I'alto nella fessura che diventa sempre piu sottile. 138 4 Descrizione dell'apparecchio Quando si avvita il nucleo occorre assicurarsi che non si formino bolle d'aria. Lasciare la camera di fusione elicoidale chiusa e capovolta sul connettore coassiale sino al momento dell'esecuzione della fusione. 4.8.5 Esecuzione della fusione e rimozione della sospensione di cellule - Spingere saldamente il modulo di fusione nell'apparecchio. - Applicare la camera di fusione elicoidale (camera elicoidale) chiusa al connettore coassiale del modulo di fusione e bloccaria ruotandola di un quarto di giro. - La fusione viene eseguita con i parametri impostati (vedi Cap. 5.3). - Allentare con cautela la camera di fusione elicoidale ruotando il connettore coassiale di un quarto di giro e rimuovere la camera. - Per aprire, posizionare la camera in verticale, ad esempio nel supporto. - Svitare con cautela il nucleo dal contenitore. - Rimuovere la sospensione di cellule dal nucleo sciacquandola con una piccola quantita di mezzo idoneo. - Aggiungere la sospensione di cellule del contenitore alia sospensione di cellule cosl risciacquata e procedere idoneamente. 139 4 Descrizione dell'apparecchio 4.8.6 Pulizia e disinfezione della camera di fusione elicoidale Subito dopo I'esperimento, il contenitore ed il nucleo della camera di fusione elicoidale devono essere lavati con acqua distillata per evitare che i residui possano essiccarsi. In caso di forte imbrattamento, la camera di fusione elicoidale puo essere lavata brevemente in un bagno ad ultrasuoni (eventualmente con aggiunta di un detergente, p.e. Edisonite-Super) oppure con uno spazzolino (da denti) a setole estremamente morbide. Se si utilizza uno spazzolino, spazzolare in direzione dell'awolgimento, altrimenti si potrebbero spostare gli elettrodi rendendo inutilizzabile la camera di fusione elicoidale. Infine, i componenti dovranno essere disinfettati con alcool etilico (70 %, non depurato). Per I'asciugatura, collocare la camera in condizioni di sterilita sul supporto assicurandosi che non vi sia polvere. Una volta asciutta, la camera di fusione elicoidale potra essere riutilizzata. 4.9 Collegamento della stampante /Stampante (optional) Per ogni esperimento condotto, il Multiporator® pu6 stampare un protocollo riportante tutti i parametri applicati, la data e I'orario. Inoltre, nel protocollo possono essere registrati anche altri parametri riguardanti resperimento, ad esempio il tampone, la concentrazione, la linea cellulare ecc, ed in caso di errore vengono stampati sul protocollo anche i relativi messaggi. Di seguito sono riportati alcuni esempi di protocolli stampati per le diverse applicazioni: 18.Aug.00 16:03:04 eppendorf Multiporator 4308 Higher Eucaryotic Cells U = 100 V, Cuvette Gap Width Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 140 1 mm T = 50 US, 2mm V4.00 n= 1 4mm 4 Descnzione dell'apparecchio 18.Aug.00 16:42:47 eppendorf Multiporator 4308 Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, Cuvette Gap Width 1mm 2mm V4.00 xa = 5.0 ms 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 18.Aug.00 16:17:49 eppendorf nn U"_ = 8.0 V, U = 15 V, U"_= 4.0 V, II Cell Fusion Multiporator 4308 20 s 100 us, 10 s V4.00 n=3 Fusion Chamber Strain / Cell Line A Cell Density A Strain / Cell Line B Cell Density B Buffer Temperature 141 4 Descrizione dell'apparecchio 18.Aug.97 15:59:08 eppendorf Multiporator 4308 V1.00 * ERROR 07 ******** Short T * AH'interfaccia seriale della stampante sul retro dell'apparecchio si possono collegare stampanti seriali ed, inoltre, e possibile stampare i protocolli con un programma terminale PC per la documentazione. Per questo programma e necessario un cavo per modem nullo (presa a 9 poli / presa a 9 poli, codice 0013 610.525). La Eppendorf AG fornisce le seguenti stampanti termiche. A titolo esemplificativo e riportata anche la configurazione DIP per una stampante IBM compatibile: Codice Tipo di stampante ThermoprinterDPU-414 0013 608.148 Accessor! Alimentatore (230 V) 0013 608.172 Alimentatore(115V) 0013 608.164 Carta termica (10 rotoli) 6547 001.018 Cavo Presa a 9 poli / spina a 9 poli di allacciamento Guidacavo 1:1 (perThermoprinter DPU-414) 0013 610.517 Presa a 9 poli / spina a 25 poli 0013 610.533 Cavo per modem nullo (IBM compatibile) ad esempio per stampante a matrice Seikosha SP 2400 (moduli continui) 142 4 Descrizione deU'apparecchio DIPSW settings Per Thermoprinter DPU-414 p.e. per stampante a matrice Seikoshi1SP2400 (moduli continui) Dip SW-1 Dip SW-1 1 (OFF): Input = Serial 2 (ON) : Printing Speed = High 3 (ON) : Auto Loading = ON 4 (ON) : Auto LF = ON 5 (ON) : Setting Command = Enable 6 (OFF) : Printing 7 (ON) : Density 8 (ON) : = 100% 1 (OFF) : USA 2 (OFF) : USA 3 (OFF) : USA 4 (ON) : IBM 5 (OFF) : Character Set 1 6 (ON) : 12 inches 7 (OFF) : LF only 8 (ON) : CR = CR + LF Dip SW-2 Dip SW-2 1 (OFF) : Printing Columns = 80 2 (ON) : User Font Back-up = ON 3 (ON) : Character Select = Normal 4 (OFF): Zero = Slash 5 (ON) : International 6 (ON) : Character 7 (ON) : Set 8 (OFF) : = USA 1 (ON) 2 (ON) 3 (ON) 4 (OFF) 5 (OFF) 6 (OFF) 7 (ON) 8 (OFF) : 9600 Baud : 9600 Baud : XON/XOFF : No Parity : No Parity : 8 bits : Serial : No single sheet Dip SW-3 1 (ON) : Data Length = 8 bits 2 (ON) : Parity Settings = No 3 (ON) : Parity Conditions = Odd 4 (OFF) : Busy Control = XON/XOFF 5 (OFF): Baud 6 (ON) : Rate 7 (ON) : Select 8 (ON) : = 9600 bps 143 5 Metodologie di lavoro 5.1 Modalita per cellule eucariotiche Questa modalita viene visualizzata sul display con II slmbolo © . Fase 1 - Impostazione e modifica dei parametri Se necessario, commutare sulle cellule eucariotiche con il tasto MODE. Premere il tasto SET per selezionare il parametro desiderato (sottolineatura). Aumentare o diminuire i valori dei parametri per mezzo dei tasti freccia. All'occorrenza, modificare altri parametri con il tasto SET e i tasti direzionali. Terminare I'impostazione. I parametri sono immediatamente attivi e non e necessario memorizzarli. 12.AUG.00 U 500V 13:37 t n 2 Esemplo di visualizzazione per I'elettroporazione di cellule eucariotiche. 0 I parametri rilevanti vengono visualizzati in grassetto e a caratteri grandi. U: Tensione, unita di misura V (Volt), regolabile nel range da 20 a 100 V a passi di uno, da 100 a 1000 V a passi di dieci e da 1000 a 1200 V a passi di cento. v. Costante di tempo, unita di misura us (microsecondi), regolabile nel range da 15 a 500 us a passi di 5 us. n: Numero di impulsi durante I'esperimento, regolabile nel range da 1 a 99. Tra gli impulsi vi e un intervallo di attesa di un minuto. Osserva: i parametri impostati vengono effettivamente adottati. Landamento deH'impulso viene calcolato internamente in modo che I'andamento della curva di scarica (funzione esponenziale) venga mantenuto in funzione dei parametri impostati. Per I'utilizzo di un impulso rettangolare e possibile impiegare il modulo di fusione (a tale proposito, si veda il Cap. 5.4). 144 5 Metodologie di lavoro Fase 2 - Avvio dell'elettroporazione - Avviare I'elettroporazione premendo il tasto START. - Nella terza riga del display viene visualizzata I'informazione "Charge", la carica viene avviata. - 12.AUG.00 U 500V 13:37 x 220|JS Charge © Al termine della carica ha luogo la scarica, rappresentata da un fulmine nella terza riga. Se e stato impostato piu 12.AUG.00 13:37 di un impulso, sul display U 500V x 220us viene visualizzato il Wait messaggio "Wait" (Attendi) con il tempo di g 0:57 © attesa rimasto. Al termine 13:37 12.AUG.00 delPesperimento si U 500V X 220us inserisce un segnale 2 n acustico doppio e viene nuovamente visualizzata READY SINCE 1:36 0 la videata iniziale con i parametri impostati ed applicati. Inoltre, nella riga piu in basso del display viene indicato il tempo in minuti e secondi trascorso dalla fine delPesperimento. Dopo 99 minuti oppure dopo aver attivato un tasto, questa indicazione sparisce. 145 5 Metodologie di lavoro 5.2 Modalita per batteri e lievito (optional) Questa modalita viene visualizzata sul display con il simbolo OFase 1 - Impostazione e modifica dei parametri Se necessario, commutare su batteri e lieviti con il tasto MODE. Premere il tasto SET per selezionare il parametro desiderato Tensione (U) (sottolineatura). Aumentare o diminuire i valori dei parametri per mezzo dei tasti freccia. Terminare I'impostazione. I parametri sono immediatamente attivi e non e necessario memorizzarli. 146 U 2000V Esempio di visualizzazione per 5 ms Pelettroporazione di batteri e lievito. 13:42 12.AUG.00 T O I parametri rilevanti vengono visualizzati in grassetto e a caratteri grandi. U: Tensione, unitadi misuraV (Volt), regolabile nel range da 200 a 1000 V a passi di dieci e a 1000 a 2500 V a passi di cento. T: Costante di tempo, unita di misura ms (millisecondi), regolazione fissa su 5,0 ms. 5 Metodologie di lavoro Fase 2 -Avvio dell'elettroporazione - Avviare I'elettroporazione premendo il tasto START. - Nella terza riga del display viene visualizzata Pinformazione "Charge", la carica viene avviata. - 12.AUG.00 U 2000V 13:42 x 5 ms Charge O Al termine della carica ha luogo la scarica, rappresentata da un fulmine nella terza riga. 12.AUG.00 13:42 U : Tensione misurata Al termine a effettivamente dell'esperimento si U 2000V t 5 ms inserisce un segnale applicata, unita di misura V (Volt). acustico doppio e viene Ua2003V Ta5.1 ms O nuovamente visualizzata READY SINCE 1:36 xa: Costante di tempo la videata iniziale con i misurata parametri impostati ed effettivamente applicati. Nella terza riga applicata, unita del display vengono visualizzati i parametri QI misura ms effettivi LL e T~ (millisecondi), i valori < 0,8 vengono visualizzati come Inoltre, nella riga piu in 0,8 ms. basso del display viene indicato il tempo in minuti e secondi trascorso dalla fine dell'esperimento. Dopo 99 minuti oppure dopo aver attivato un tasto, questa indicazione sparisce. ^J I 1 x^ I I I V1 %^ r% ^ ^ rt B 147 5 Metodologie di lavoro 5.3 Modo fusione cellulare (opzionale) 5.3.1 Funzione: Alignment (orientamento delle cellule) Le funzioni per I'alignment vengono rappresentate con i simboli U'_ (prima dell'impulso) e U"_ (dopo I'impulso) nelle righe 2 e 4 del display. Fase 1 - Impostazione e modifica dei parametri Se necessario commutare su fusione per mezzo del tasto MODE. Premere il tasto SET perselezionare i para-metri desiderato (sottolineatura). Aumentare o diminuire i valori dei parametri per mezzo dei tasti freccia. Se nelle righe U 1 ../IT./ Un un valore viene impostato su "0", la relativa funzione non viene eseguita. In tale maniera e possibile attivare U'_ / U"_ singolarmente 0 in successione senza dover attivare I'impulso di fusione. Terminare I'impostazione. 1 parametri sono immediatamente attivi e non e necessario memorizzarli. 13:42 Esempio del display per I'esecuzione 5V t 60s OV t 15s n2 dell'alignment U'_ senza attivazione dell'impulso OV t 30s CD Un e dell'alignment U"_. 12.AUG.00 U'_ Un U". I parametri rilevanti vengono visualizzati in grassetto e a caratteri grandi. UL / U"_: Tensione alternata, unita di misura V (Volt), regolabile: "0" e nel range da1,0a10V apassi di 0,1 V. t: Durata dell'alignment 0-95 s, unita s (secondi) a passi di 5. U n : Tensione, (impulso rettangolare), unita di misura V (Volt), regolabile: "0" e nel campo 5-100 V in passi da1 V, da 100-300 V in passi da 10 V. t: Durata dell'impulso, unita di misura us (microsecondi) regolabile 0-300 us in passi da 5 us 0-99. n: Numero di impulsi 0-99, regolabile in passi singoli. 148 5 Metodologie di lavoro Fase 2 - Partenza dell'alignment (orientamento delle cellule) - - Provocare Pallineamento U'_ premendo il tasto START. 12.AUG.00 13:42 U'_ 5V t 60s un OV t 15s n2 U"_ OV t 30s Nella quarta riga del display viene visualizzata I'informazione / \ A / ! la tensione alternata verra applicata per la durata selezionata. Al termine deU'esperimento si inserisce un segnale acustico doppio e viene nuovamente visualizzata la videata iniziale con i parametri impostati ed applicati. Inoltre, nella riga piu in basso del display viene indicato il tempo in minuti e secondi trascorso dalla fine deU'esperimento. Dopo 99 minuti oppure dopo aver attivato un tasto, questa indicazione sparisce. 149 5 Metodologie di lavoro 5.3.2 Esecuzione della fusione cellulare Fase 1 - Impostazione e modifica dei parametri Premere il tasto 12.AUG.00 13:42 SET perselezionare U'_ 5V t 30s i para-metri Ur, 30V t 15|js n2 desiderato U",. 5V t 30s (sottolineatura). CD Aumentare o diminuire i valori dei parametri per mezzo dei tasti freccia. A seconda dei parametri selezionati per U'_ e U"_ la fusione pud avvenire a scelta senza alignment, con solo una o con entrambe le funzioni di alignment. Terminare I'impostazione. I parametri sono immediatamente attivi e non e necessario memorizzarli. 12.AUG.00 U'_ OV t 30s Un 30V t 15MS U". 5V t 30s Esempio del display per I'esecuzione dell'elettrofusione con alignment U1.. / U\ attivato. Esempio del display per I'esecuzione dell'elettrofusione con alignment n2 U'_ disattivato. 13:42 I parametri rilevanti CD vengono visualizzati in grassetto e a caratteri grandi. UrfTensione, unita di misuraV(Volt), regolabile: "0" e nel campo 5-100 V in passi da 1V, da 100-300 V in passi da 10 V. t: Durata dell'impulso, unita di misura us (microsecondi), regolabile 0-300 u.s in passi da 5 us. U'_ / U"j. Tensione alternata, unita di misura V (Volt), regolabile: "0" e nel range da1,0a10V a passi di 0,1 V. n: Numero di impulsi 0-99, regolabile in passi singoli. 150 5 Metodologie di ilavoro Fase 2 - Avvio delta fusione eellulare - Avviare la fusione cellulare premendo il tasto START. - 13:42 Nella quarta riga del 12.AUG.00 display compare U'_ 5V t 30s brevemente Up 30V t 15|JS n2 Pinformazione Charge "Charge", la carica viene generata. - 13:42 Durante il processo 12.AUQ.00 di carica per la U'_ 5V t 30s durataselezionatae U n 30V t 15|/s n2 gia applicata la tensione altemata § 0:23 <S3 I L . La tensione alternata viene mostrata anche tramite ~ (oscillazione sinusoidale). - Dopo il tempo di alignment conteggiato (0-95 secondi) avviene la scarica, rappresentata da un fulmine nella quarta riga. A seconda del numero n inserito, nel caso n >1 ogni volta dopo un secondo avviene una ulteriore scarica. 151 5 Metodologie di lavoro - Al termine delle scariche, per la durata impostata (0-99 secondi) e presente la tenslone alternata U"_. II tempo complessivo rimasto per I'esperimento vlene visualizzato costantemente nella riga piu In basso del display. Al termine 13:42 12.AUG.00 dell'esperimento si U'_ 5V t 30s inserisce un segnale Un 30V t 15|js n2 acustico doppio e viene U"_ 5V t 30s nuovamente visualizzata READY SINCE 1:36 la videata iniziale con i parametri impostati ed applicati. Inoltre, nella riga piii in basso del display viene indicato il tempo in minuti e secondi trascorso dalla fine delPesperimento. Dopo 99 minuti oppure dopo aver attivato un tasto, questa indicazione sparisce. Awertenza; se UL / U"_ e impostato su "0", per I'elettroporazione si potra utilizzare anche l'impulso rettangolare altrimenti accessibile soltanto per la fusione. In questo caso, I'elettroporazione awiene con il modulo di fusione adottando i rispettivi parametri. L'impulso rettangolare non puo essere utilizzato senza il modulo di fusione. 152 6 Messaggi di errore In caso di anomalie di funzionamento, il Multiporator® emette un segnale acustico e visualizza un messaggio di errore sul display oppure lo stampa tramite la stampante eventualmente collegata (optional). Questi messaggi si riferiscono ad anomalie di funzionamento dell'apparecchio oppure ad errori che si verificano in seguito ad un impiego errato. Gli errori 1-4 e 9 possono presentarsi durante I'impiego del modulo batteri, mentre gli errori 1-7 con le cellule eucariotiche e 1-8 per la fusione cellulare. Errore Messaggio n. Causa 01 No Display II display non viene Avvisare il servizio attivato. assistenza tecnica. 02 No RTC / NVRAM II modulo Avvisare il servizio elettronico del timer assistenza tecnica. interno e difettoso. 03 High Current L'amperaggio durante la scarica (impulso) era eccessivo. 04 No Cuvette Non e stata inserita Inserire la cuvetta, la cuvetta. avviare di nuovo. Rimedio Ridurre la conduttivita della soluzione utilizzata. Assicurarsi di aver inserito il tipo di cuvetta idoneo. Spingere la camera portacuvetta completamente nell'apparecchio. 05 Timeout Charge Non e stato possibile caricare i condensatore nel tempo di carica previsto. Avvisare il servizio assistenza tecnica. 06 Timeout Charge Con I'impostazione Ridurre la conduttivita ad impulsi multipli, della soluzione utilizzata. non e stato Assicurarsi di aver possibile caricare inserito il tipo di cuvetta per tempo il idoneo. condensatore tra i singoli impulsi. 153 6 Messaggi di errore Errore Messaggio n. Causa Rimedio 07 II condensatore si e completamente scaricato. Non e possibile stabilire se il valore x impostato e stato effettivamente applicato. II componente di limitazione non era la regolazione degli impulsi, bensi il condensatore. Ridurre la conduttivita della soluzione utilizzata. Short x 08 Low Resistance Corrente eccessiva Ridurre la conduttivita della soluzione nella cuvetta. Non utilizzata. e possibile mantenere costante ia tensione alternata. 09 Timeout Measuring x Modul x a = 0,8 ms, o Ua batteri notevolmente inferiore al parametro U impostato Time-out nella misurazione di x del modulo batteri. Avvisare il servizio assistenza tecnica. Scintille nella cuvetta. Utilizzare una cuvetta con una distanza interelettrodo maggiore. L'amperaggio durante la scarica (impulso) era eccessivo. Ridurre la conduttivita della soluzione utilizzata. Guasto di natura tecnica. 154 Assicurarsi di aver inserito il tipo di cuvetta idoneo. - Avvisare il servizio assistenza tecnica. 7 Manutenzione, assistenza e pulizia Non e indispensabile sottoporre I'apparecchio ad una manutenzione regolare. La garanzia e I'assistenza sono di competenza del fornitore. 7.1 Disinfezion Prima di procedere alia disinfezione del multiporatore occorre staccare la spina dalla presa di corrente. Tutti i componenti del multiporatore, compresi gli accessori ed il cavo di collegamento devono essere sottoposti ad una disinfezione superficiale. La camera portacuvetta puo essere sottoposta ad una disinfezione a spruzzo. La disinfezione a spruzzo non e consigliabile per I'apparecchio, poiche all'interno del multiporatore potrebbe penetrare disinfettante II metodo di disinfezione applicato deve essere conforme alle normative ed alle disposizioni vigenti in materia di disinfezione sul luogo di utilizzo. 7.2 Pulizi Prima di procedere alia pulizia del multiporatore occorre staccare la spina dalla presa di corrente. Assicurarsi che non penetrino liquidi all'interno del multiporatore, poiche si potrebbero verificare cortocircuiti nell'installazione elettrica e si potrebbe provocare la corrosione. I componenti vemiciati e le superfici in alluminio dovranno essere strofinati con un panno morbido ed un detergente delicato ed asciugati con un panno asciutto. .Attenzione: non utilizzare detergenti o prodotti lucidanti corrosivi, solventi o abrasivi. 155 8 Datitecnici Tensione/Frequenza: Fusibili: Potenza assorbita: Categoria di sovratensione: Classe di protezione: Grado di imbrattamento: Tensione regolabile (Modulo per): Cellule eucariotiche: 100-240 V ±10 %, 50-60 Hz TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 pezzi) 60 W II I 2 2 0 - 100 V a passi di 1V 100-1 000 V a passi di 10 V 1000-1 200 V a passi di 100 V Intervallo di impulso: 1 minuto Fusione cellulare: 0, Batteri: 200-1 000 V a passi di 10 V 1 000-2 500 V a passi di 100 V Nessun impulso multiplo 10 uF, 2 500 V scarica impulsi 5- 100 V a passi di 1V 100- 300 V a passi di 10 V Intervallo di impulso: 1 secondo Tensione alternata: 0, 1,010 V a passi di 0,1V Condensatore: Resistenza: 600 LI parallela 56 Q a monte Durata di carica: <30 secondi Numero di impulsi n: 0-99 Costante di tempo x della scarica: Cellule eucariotiche: 15-500 us regolabile a passi di 5 us, funzione esponenziale decrescente Batteri: nominale 5 ms con un'impedenza del campione di 3,3 ka Misurazione e visualizzazione di 0,8-6,0 ms Durata delPalignment (orientamento delle cellule): 0-95 s regolabile in passi da 5 s Durata t dell'impulso (Fusione cellulare): 0-300 us regolabile a passi di 5 us, impulso rettangolare Interfaccia RS 232: 9 600 baud, 8 bit, nessuna parita, 2 bit di stop, XON/XOFF max. 40 °C Temperatura ambiente: Umidita ambiente relativa: max. 80 % 156 8 Datitecnici Peso: Dimensioni: max. 5,5 kg Larghezza: Profondita: Altezza: L'apparecchio e dotato del marchio ( c l I L E 158089). (a seconda della versione) 25,2 cm 34,2 cm 12,0 cm e della certificazione UL e CSA Con riserva di modifiche tecniche! 157 9 Informazioni per I'ordinazione Codice 4308 000.015 4308 000.023 4308 000.031 4308 000.040 4308 070.501 4308 070.510 4308 070.528 4308 070.536 4307 000.569 4307 000.593 4307 000.623 4308 078.006 4308 070.072 4308 021.004 4308 012.005 4308 014.008 4308 030.003 158 Multiporator® Versione base per cellule eucariotiche 100-240 V, 50-60 Hz Multiporator®, per cellule eucariotiche ed ampliamento con modulo batteri Multiporator®, per cellule eucariotiche ed ampliamento con modulo fusione cellulare Multiporator®, per cellule eucariotiche ed ampliamento con modulo batteri e fusione cellulare Accessori Tamponi Tampone iposmolare per elettroporazione (PH), 100 ml Tampone isosmolare per elettroporazione (PI), 100 ml Tampone iposmolare per fusione cellulare (FH), 100 ml Tampone isosmolare per fusione cellulare (Fl), 100 ml Cuvette per elettroporazione Distanza inter-elettrodo 1 mm, alluminio, sterile, 50 pezzi Distanza inter-elettrodo 2 mm, alluminio, sterile, 50 pezzi Distanza inter-elettrodo 4 mm, alluminio, sterile, 50 pezzi Supporto per 16 cuvette per elettroporazione Camera per cuvette per elettroporazione Modulo (di elettroporazione / elettrofusione) per il collegamento di elettrodi esterni Modulo per la camera di fusione elicoidale Camera di fusione elicoidale (distanza inter-elettrodo 0,2 mm) Micro-camera di fusione (distanza inter-elettrodo 0,2 mm) 9 Informazioni per I'ordinazione 4308 4308 0013 0013 024.003 017.007 608.148 608.172 0013 608.164 6547 001.018 0013 610.517 0013 610.525 0013 610.533 4308 010.002 4308 011.009 Modulo per micro-camera di fusione Supporto per 10 camera di fusione elicoidale Stampante termica DPU-414 Alimentatore (230 V) per stampante termica DPU-414 Alimentatore (115 V) per stampante termica DPU-414 Carta termica (10 rotoli) Cavo di allacciamento (presa a 9 poli / spina a 9 poli, guidacavo 1:1) Cavo per modem nullo di collegamento PC (presa a 9 poli / presa a 9 poli) Cavo per modem nullo per stampante a matrice (presa a 9 poli / spina a 25 poli) Kit di ampliamento batteri (installazione a cura del servizio assistenza tecnica) Kit di ampliamento fusione cellulare (installazione a cura del servizio assistenza tecnica) 159 Contenido 1 Generates 161 2 Aplicaciones 162 3 Avisos de seguridad 163 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 165 166 167 167 168 168 171 4.8.5 4.8.6 4.9 Description del aparato Volumen de suministro Puesta en servicio Unidad 'plug-in' de cubeta Teclado Teclas y combinaciones de teclas Display Electroporacion de celulas eucariotas y de bacterias / levaduras Unidad 'plug-in' (Electroporacion) para la conexion de electrodos externos (Opcion) Fusion celular (Opci6n) Optimacion de la fusion celular (Control bajo el microscopio) Limpieza de la micro-camara de fusion Camara de fusion Helix Llenar la camara de fusion Helix y colocar en la unidad 'plug-in' de fusion Realizar la fusion y toma de la suspension celular Limpieza y desinfeccion de la camara de fusion Helix . . . . Conexion de impresora / Impresora (Opcion) 177 178 179 179 5 5.1 5.2 5.3 5.3.1 5.3.2 Tecnicas de trabajo Modo Celulas eucariotas Modo Bacterias y levaduras (Opcion) Modo fusion celular (Opcion) Funcion: alineacion celular (alineamiento) Ejecucion de la fusion celular 183 183 185 187 187 189 6 Mensajes de error 192 7 7.1 7.2 Mantenimiento, servicio y cuidado Desinfeccion Limpieza 194 194 194 8 Datos tecnicos 195 9 Informaciones depedido 197 4.7.1 4.8 4.8.1 4.8.2 4.8.3 4.8.4 160 172 173 174 174 175 176 1 Generales El Multiporator® esta concebido para la electroporacion de celulas eucariotas. Como option existe la posibilidad de realizar la electroporacion en bacterias y levaduras asf como la fusion celular con otros modulos. En estas instrucciones se tratan todas las variantes del uso del Multiporator®. El Multiporator® se caracteriza porque en la electroporacion de celulas eucariotas y en la fusion celular los parametros programados deben cumplirse exactamente mediante calculo interno de la curva de descarga. 161 2 Aplicaciones La ley sobre seguridad de aparatos y las normas industriales prescriben: 162 - Usar el aparato solo para experimentos tecnologico celulares El espectro de aplicaciones comprende la electroporacion de levaduras y de bacterias y de celulas eucariotas asf como la fusion celular. - Usar solo accesorios originales Eppendorf Solo deben usarse piezas accesorios originales. Estan adaptadas al funcionamiento optimo del Multiporator. Solo se excluyen los aparatos complementarios recomendados por el fabricante. De lo contrario se pierden inmediatamente todos los derechos de garanti'a y de responsabilidad. 3 Avisos de seguridad jLas normas siguientes deben cumplirse necesariamente por seguridad personal! • Observar las instrucciones de uso jProceder solamente segun las instrucciones de uso ! • El aparato solo debe ponerse en servicio en redes de abastecimiento con toma de tierra. jAntes de la puesta en servicio deben compararse los datos de tension indicados en la placa de caracterfsticas con las condiciones de la red! • jAntes de abrir la carcasa desconectar el enchufe de red! • jEl aparato no debe ponerse en servicio en locales sujetos a explosion! • jHa de garantizarse que no penetren Ifquidos en el aparato o en las unidades 'plug-in'! • |EI aparato esta previsto solamente para aplicaciones invitro! • Usar el aparato solo para el uso descrito. jNo meter en la unidad 'plug-in' de la cubeta otras piezas, aparatos, herramientas etc. que las descritas por Eppendorf AG! jAlta tension! • Usar solo los accesorios indicados. jUsar solamente otro tipo de accesorios, si se dispone de un certificado de aplicacion sin problemas desde el punto de vista de la tecnica de seguridad de Eppendorf AG! • jSolo se permiten acoplamientos electricos con aparatos que no esten mencionados en esas instrucciones de uso, tras consulta previa y autorizacion del fabricante! 163 3 Avisos de seguhdad jTratar con sumo cuidado la camara de fusion Helix! i Estando los electrodos sueltos o deteriorados, no puede garantizarse mas un proceso seguro! jEn este caso no usar mas la camara de fusion Helix! jNo abrir la camara de fusion Helix durante la fusion sino esperar a que finalice esta! jTratar con sumo cuidado la micro-camara de fusion! iLlenar con cuidado suspension celular! jA ser posible, no tocar ni mover los electrodos con la punta de la pipeta! jPeligro de lesion! iEvitar el contacto directo con los electrodos durante la alineacion celular/fusion! 164 • jLa alineacion celular/fusion solo debe tener lugar estando conectada la micro-camara de fusion! |EI cable esta concebido solamente para la conexion a la microcamara de fusion! jProhibidas todas las demas conexiones! jNo meter el enchufe en li'quidos! • En cualquier caso, la responsabilidad del aparato pasa a! propietario o cliente, en caso de que el aparato sea mantenido o reparado por personas, que no pertenezcan al servicio tecnico de Eppendorf, y si se maneja de una manera que no corresponda con el uso adecuado. La empresa Eppendorf AG no se responsabiliza de danos resultantes del incumplimiento de las indicaciones. Las reglas de garanti'a y de responsabilidad de las condiciones generales de venta y de suministro de la empresa Eppendorf AG no seran complementadas con las indicaciones anteriores. • jSolo se permite la reproduction total de las instrucciones de uso o de partes de ellas con autorizacion escrita de Eppendorf AG! • j Eppendorf AG se reserva el derecho de realizar modificaciones tecnicas en bien del producto! 4 Description del aparato El aparato se ofrece en cuatro fases de capacidad. Como aparato base para la electroporacion de celulas eucariotas, como fase con la posibilidad adicional de electroporar bacterias y levaduras. Como fase siguiente se dispone de un modulo integrado para la fusion celular. Estas dos fases tambien pueden adquirirse juntas como cuarta variante. El Multiporator® se maneja con un teclado bien compresible equipado con display. Junto al bloque del teclado se encuentra la unidad 'plug-in' para la cubeta de electroporacion. Fig. 1: Multiporator®, vista frontal 165 4 Description del aparato 4.1 Volumen de suministro Aparato base: Multiporator® para la electroporacion de celulas eucariotas con cable de red Unidad 'plug-in' para cubetas de electroporacion Cubetas de electroporacion (distancia de electrodos 2 mm, 4 mm) Amortiguacion hiposmolar e isosmolar para electroporacion Manual de Instrucciones y manual de aplicacion basico Opcion modulo de bacterias: Aparato base incl. accesorios con modulo de bacterias integrado adicionalmente cubetas de electroporacion (distancia de electrodos 1 mm) Opcion modulo de fusion celular: Aparato base incl. accesorios con modulo de fusion celular integrado Camara de fusi6n Helix (distancia de electrodos 0,2 mm)) Unidad 'plug-in' para camara de fusidn Helix Micro-camara de fusion (distancia de electro dos 0,2 mm) con unidad 'plug-in' especial Amortiguacion hiposmolar e isosmolar para fusion celular Opcion mddulo de fusion y de bacterias: Aparato base incl. accesorios con modulo de fusion y de bacterias integrado 166 4 Description del aparato 4.2 Puesta en servicio En el trasero del Multiporator® se encuentra la clavija de entrada de red con fusible e interruptor de red. Para la puesta en servicio, insertar el cable de red en la clavija de entrada de red y unir a continuacion con la red. Conectar el aparato con el interruptor de red. IIIIMII •;:,'? Fig. 2: Multiporator®, trasero Lado izquierdo conexion de red Lado derecho conexion de impresora 4.3 Unidad'plug-in'de cubeta La unidad 'plug-in' para las cubetas de electroporacion se encuentra en el frente del aparato junto al bloque del teclado. Para quitar la cubeta, sacar la unidad 'plug-in'. Una nueva cubeta se coloca de tal modo que la pestana de la cubeta ajusta en la ranura trasera. Introducir la unidad de cubetas 'plug-in' completamente en el aparato con la cubeta. En el aparato se encuentra un sensor, que comprueba si hay una cubeta en la unidad de cubetas 'plug-in'. Anotacion: Si se debe transportar el aparato, deberia estar equipada la unidad 'plug-in' con una cubeta vacfa o transportarse por separado. Para la fase de capacidad Fusion celular se usan otras unidades 'plug-in1. 167 4 Description del aparato 4.4 Teclado A traves del teclado se introducen parametros y se seleccionan los modos deseados de electroporacion y se arranca tambien la electroporacidn. Segun la fase de capacidad pueden seleccionarse de 1 a 4 modos. Mediante combinaciones de teclas se pueden ajustar ademas la fecha y la hora asi como el volumen de la serial acustica. Multiporator eppendoif U 500V x 220 us /PLUME n 1 100% Fig. 3: Superficie de manejo con teclas y display 4.5 Teclas y combinaciones de teclas SET Con la tecla SET se selecciona el parametro deseado. Se representa este con una subraya en el display. Para seleccionar otro parametro, se pulsa a menudo la tecla SET. Para finalizar una secuencia SET, se puede pulsar la tecla SET tan a menudo hasta que la subraya en el display no este mas o pulsando la tecla MODE o START (Anotacion: la tecla MODE conmuta a otro modo, si esta disponible). Con las teclas de fecha arriba/abajo se cambian los parametros correspondientes. Una vez alcanzado el valor mmimo, se salta al valor maximo. Lo mismo ocurre en el otro sentido. 168 4 Description del aparato MODE Con la tecla MODE se activa el modo deseado, con el que se debe realizar la electroporacion. Solo se pueden seleccionar Ios modos que corresponden a la fase de capacidad del aparato. Es decir, para la fase maxima de ampliation se encuentran disponibles de 3 modos y para la version base, el modo para celulas eucariotas. En el display aparece entonces el sfmbolo correspondiente: 0 : Modo para celulas eucariotas Fases de capacidad: aparato base Impulso empleado: funcion - e de decrecimiento O : Modo para bacterias y levaduras Fases de capacidad: modulo de bacterias Impulso empleado: funcion - e de decrecimiento G 3 : Modo para la fusion celular Fases de capacidad: Modulo de fusion Impulso empleado: impulso rectangular Start START Con la tecla START se dispara la aplicacion correspondiente. Teclas de flecha Con las teclas de flecha se cambian creciente o decrecientemente Ios parametros seleccionados (subrayados). 169 4 Description del aparato Ajustar la fecha Pulsando simultaneamente las teclas SET y MODE se puede activar el ajuste de fecha y de hora. Pulsando de nuevo la tecia SET, la subraya salta de izqulerda a derecha en la indicacion de fecha y hora. De este modo pueden cambiarse los ajustes con las teclas de flechas. Para finalizar el ajuste de la fecha, se puede pulsar la tecia SET tantas veces hasta que la subraya no aparezca mas en el display o pulsando la tecia MODE o START (Anotacion: La tecia MODE conmuta a otro modo, si esta disponible). Start Regular el volumen Pulsando simultaneamente las teclas MODE y START se puede activar la regulaci6n de volumen para las senales acusticas. Con ello aparece en la Imea inferior del display la indicacion "VOLUME" con un porcentaje. Esta cifra indica el volumen. La cifra se puede cambiar con las teclas de flecha. Para finalizar la regulacion de volumen, se pueden pulsar alternativamente la tecia SET, MODE o START (Anotacion: La tecia MODE conmuta a otro modo, si esta disponible). Se apaga la indicacion "VOLUME". Reset Si se debe interrumpir un ensayo, s6lo es posible con el interruptor de red. Este sirve tambien como interruptor Reset. 170 4 Description del aparato 4.6 Display En el display estan representados los parametros relevantes para el experimento en las Ifneas 2 a 4, en grande y en negrita. Los parametros y su numero se diferencian en dependencia del modo seieccionado. En la li'nea superior se representan siempre la fecha y la hora. En la h'nea inferior, el modo seieccionado se simboiiza siempre a la derecha con un si'mbolo: 0 : Modo para celulas eucariotas Fases de capacidad del aparato: aparato base O : Modo para bacterias y levaduras Fases de capacidad del aparato: modulo de bacterias (z3: Modo para fusion celular Fases de capacidad del aparato: Modulo de fusion En esta li'nea se pueden mostrar adicionalmente tambien la indicacion "VOLUME" o el tiempo restante del experimento. 13:37 12.AUG.00 U 500V X n VOLUME 100% 220us 1 Ejemplo del display para la regulacion de volumen © Durante y despues de un experimento la indicacion cambia y emite las informaciones correspondientes. 171 4 Description del aparato 4.7 Electroporacion de celulas eucariotas y de bacterias/levaduras Los experlmentos respectlvos se ejecutan en cubetas desechables. El material biologico se coloca en la hendldura entre los electrodos. Ha de mantenerse la cantidad prescrita en las cubetas. Un exceso por encima de los electrodos no influyen en el experimento, pero se reduce la eficacia del experimento. Una ventana mate permite rotular la cubeta. La masa de plastico que se encuentra en la cubeta sirve para la colocacion correcta en la unidad de cubetas 'plug-in'. La tapa cierra la cubeta. Como proteccion contra el exceso de presion, la cubeta no se cierra hermeticamente con la tapa. Por consiguiente solo debe transportarse verticalmente una cubeta llena pues de lo contrario existe el peligro de que el material biologico se saiga. Tapa Cubeta de plastico y • Pestana de plastico I Electrodos y& / Hendidura Fig. 4: Representacion esquematica de la cubeta de electroporacion La unidad de cubetas 'plug-in' se saca del Multiporator® de la empuhadura representada. La cubeta se llena sin burbujas. La cubeta se pone en la cavidad trasera de la unidad 'plug-in' de tal modo que la pestana de la cubeta encaje en la ranura larga y la cubeta se encuentre en el fondo de la unidad 'plug-in1. La unidad 'plug-in' se mete hasta el tope en el aparato con la cubeta instalada. La unidad 'plug-in' se puede guardar fn'a. Para el transporte del aparato ha de tenerse en cuenta que la unidad 'plug-in' puede resbalar del aparato sin cubeta. 172 4 Description del aparato 4.7.1 Unidad 'plug-in' (Electroporacion) para la conexion de electrodos externos (Opcion) En el accesorio no de serie (ver informaciones de pedido) hay una unidad 'plug-in' para la electroporacion (simbolo 0 , descarga de tension a traves de una funcion e decreciente), a la que se pueden conectar electrodos externos. jEsto debe ocurrir con un enchufe de laboratorio de 4 mm con proteccion de contacto! Esta unidad 'plug-in' tambien se puede usar en modo de Fusion celular (Si'mbolo G 3 , impulso rectangular), si el ajuste de tension se pone a "0" para la alineacion celular ("alineamiento"). 1 Conector para masa (negro) 2 Conector para polo positivo (rojo) j En la conexion de electrodos externos, son decisivas y deben respetarse las normas de seguridad (alta tension) y las normas EMV del pafs (EMV: compatibilidad elect romagnetica)! jTodos los aparatos conectados estan bajo la responsabilidad el usuario! 173 4 Description del aparato 4.8 Fusion celular (Option) 4.8.1 Optimacion de la fusion celular (Control bajo el microscopio) Para optimar los parametros de la fusion celular para las celulas a examinar, la alineacion celular y la fusion celular pueden seguirse bajo el microscopio con una micro-camara especial de fusion. La micro-camara de fusion se une con la unidad 'plug-in' con el cable (aprox. 1 m). 1 Unidad 'plug-in' de la micro-camara de fusion 1 Contactos 2 Muelles de tierra Micro-camara de fusion 1 Conexion coaxial Atencion: iTratar la micro-camara de fusion con cuidado! jLlenar con cuidado la suspension celular! A ser posible, no tocar ni mover los electrodos con la punta de la pipeta! jPeligro de lesion! jEvitar el contacto directo con los electrodos durante la alineacion celular/fusion! jLa fusion solo debe tener lugar con micro-camara de fusion conectada! 174 - Meter bien fiia la unidad 'plug-in' de la micro-camara de fusion en el Multiporator®. - Poner la micro-camara de fusion llena con aprox. 50 uJ de suspension celular en el microscopio. Indication: Mediante un pipeteo cuidadoso de la suspension celular en la zona de los electrodos puede maximarse la cifra de las celulas entre los electrodos. - Para el bloqueo en la mesa del microscopio se puede usar por ejemplo pinzas, que se usan tambien para sujetar un portaobjetos. Q 4 Description del aparato Unir la micro-camara de fusion con el cable. Enfocar los electrodos y las celulas. Pasar los parametros ajustados con la tecia START bajo observacion microscopica. 200 urn Celulas entre los electrodos en la alineacion celular (alineamiento) Celulas despues de la fusion y productos de fusion El volumen de llenado maximo de la micro-camara de fusion es de aprox. 200 ul. Los parametros calculados y ajustados son transmisibles y aplicables directamente en la camara de fusion Helix. 4.8.2 Limpieza de la micro-camara de fusion El contenido de la micro-camara de fusion se lava con Aqua bidest. (botella pulverizadora), los restos difi'ciles de celulas pueden quitarse con cuidado con un cepillo de dientes suave en sentido longitudinal de los electrodos (jNo debe cambiarse la separacion de electrodos!). Un enjuagado con etanol (70 %, sin desnaturalizar) acelera el proceso de secado. 175 4 Description del aparato 4.8.3 Camara de fusion Helix La fusion celular de una gran cifra de celulas se ejecuta en una camara de fusion Helix. •Jr. • Esquema de la camara de fusion Helix La camara de fusion Helix se compone de un vaso y de un nucieo con alambres de platino bobinados en paralelo, los electrodos. Estan bobinados como Helix doble alrededor del nucieo. Las dos partes se atornillan entre si. La hendidura entre vaso y nucieo tiene un volumen de llenado de 250 ul. La camara de fusion Helix se une con la unidad 'plug-in' para la fusion celular mediante una conexion coaxial. 1 —EJ 176 Vaso Nucieo 1 Rosca 1 Electrodos 2 Conexibn coaxial Camara de fusion Helix 1 Hendidura para la fusion celular Unidad 'plug-in' de fusion 1 Contactos 2 Conexibn coaxial 4 Description del aparato La separacion de los electrodos de platino bobinados es de aprox. 200 urn. Fig. 5: Vista de microscopio de los electrodos de la camara de fusion Helix Atencion: jTratar con cuidado la camara de fusion Helix! i Estando los electrodos sueltos o deteriorados, no puede garantizarse mas un proceso seguro! jEn este caso no usar mas la camara de fusion Helix! 4.8.4 Llenar la camara de fusion Helix y colocar en la unidad 'plug-in' de fusion La camara de fusion Helix se llena con 250 uJ de suspension celular. Ha de tenerse en cuenta que el li'quido se pipetee exactamente en el punto mas profundo del vaso. Evitar las humectaciones en el borde o en la pared. Ello Neva a un mal llenado de la camara de fusion Helix. Se forman eventualmente burbujas de aire, que reducen la efectividad del experimento. El nucleo se pone con cuidado en el vaso de pie (en el soporte) y se enrosca con cuidado en el vaso. Con el movimiento roscante la suspension celular se comprime hacia arriba en la hendidura, que es cada vez mas estrecha. 177 4 Description del aparato Al enroscar cuidar de que no se formen posibles burbujas. Hasta la realizacion de la fusion dejar la camara de fusion Helix cerrada cabeza abajo en la conexion coaxial. 4.8.5 Realizar la fusion y toma de la suspension celular - La unidad 'plug-in' de fusion se mete bien fija en el aparato. 178 - Insertar la camara de fusion Helix cerrada en la conexion coaxial de la unidad 'plug-in' de fusion y encastrar con un cuarto de vuelta. - La fusion se realiza con los parametros ajustados (ver cap. 5.3). - Soltar la camara de fusion Helix con cuidado con un cuarto de giro de la conexion coaxial y quitar. - Para abrir mantener vertical, p. ej. en el soporte. - Desenroscar el nucleo con cuidado del vaso. - Lavar la suspension celular que se encuentra en el nucleo con una cantidad mfnima del medio correspondiente. - La suspension celular del vaso se limpia con la suspension celular lavada y tratada de forma correspondiente. 4 Description del aparato 4.8.6 Limpieza y desinfeccion de la camara de fusion Helix Los vasos y el nucleo de la camara de fusion Helix deben lavarse bien directamente despues del experimento con agua destilada para evitar un secado. Ante una fuerte suciedad, la camara de fusion Helix puede limpiarse brevemente en un bano de ultrasonido (eventualmente con aditivo de limpieza, p. ej. Edisonite-Super) o con un cepillo de dientes muy suave. En la limpieza con el cepillo ha de cuidarse de que se cepille en sentido del bobinado. En otro caso los electrodos pueden moverse y no servir para nada la camara de fusion Helix. A continuacion se desinfectan las piezas con etanol (70 %, sin desnaturalizar). Para secar colocar en el soporte sin polvo bajo condiciones esteriles. La camara de fusion Helix se puede usar de nuevo despues de secar. 4.9 Conexion de impresora / Impresora (Opcion) El Multiporator® puede suministrar un protocolo de impresion para cada experimento, en el que se introducen los parametros empleados, la fecha y la hora. Ademas se pueden introducir en el protocolo de impresion otros datos afectantes al experimento tales como solucion tampon, concentracion, linea de celula etc. En caso de error tambien se imprimen los mensajes de error. A continuacion se representan impresiones ejemplares para las diferentes aplicaciones: 18.Aug.00 16:03:04 eppendorf Multiporator 4308 Higher Eucaryotic Cells U = 100 V, Cuvette Gap Width 1 mm x = 50 us, 2mm V4.00 n= 1 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 179 4 Descripcion del aparato 18.Aug.00 16:42:47 eppendorf Multiporator 4308 Bacteria and Yeast U = 1000 V, Ua= 992 V, xaCuvette Gap Width 1 mm 2mm V4.00 5.0 ms 4mm Strain / Cell Line Cell Density Transfer Substance Concentration Buffer Temperature 18.Aug.00 16:17:49 eppendorf Cell Fusion Fusion Chamber Strain / Cell Line A Cell Density A Strain / Cell Line B Cell Density B Buffer Temperature 180 UL = 8.0 V, U = 15 V, U"_= 4.0 V, Multiporator 4308 t = 20 s t=100us, t = 10 s V4.00 n=3 4 Description del aparato 18.Aug.97 15:59:08 eppendorf Multiporator 4308 V1.00 ' ERROR 07 Short x En la interface de serie de impresora en el trasero del aparato pueden acoplarse impresoras de serie. Tambien se pueden clasificar los protocolos con un programa de terminal de PC para la documentacion. Para ello se necesita un cable de modem cero (clavija de 9 polos / clavija de 9 polos, N° de pedido 0013 610.525). Eppendorf AG le ofrece las siguientes termoimpresoras. Como ejempio esta descrita adicionalmente la posicion de selectores DIP para una impresora compatible IBM: N° pedido Tipo de impresora Termoimpresora DPU-414 0013 608.148 Accesorios Equipo de red (230 V) 0013 608.172 Equipo de red (115 V) 0013 608.164 Papel termo (10 rollos) 6547 001.018 Clavija de 9 polos / conector de 9 polos pasacables 1:1 (para termoimpresora DPU-414) 0013 610.517 Clavija de 9 polos / conector de 25 polos cable de modem cero (compatible IBM, p. ej. para impresora de matrices Seikosha SP 2400 (papel sin fin) 0013 610.533 Cable de conexion 181 4 Descripcion del aparato Ajustes DIP SW Para termoimpresora DPU-414 P. ej. para impresora de matrices Seikosha SP 2400 (papel sin fin) Dip SW-1 Dip SW-1 1 (OFF): Input = Serial 2 (ON) : Printing Speed = High 3 (ON) : Auto Loading = ON 4 (ON) :AutoLF = ON 5 (ON) : Setting Command = Enable 6 (OFF): Printing 7 (ON) : Density 8 (ON) : = 1 0 0 % 1 (OFF) 2 (OFF) 3 (OFF) 4 (ON) 5 (OFF) 6 (ON) 7 (OFF) 8 (ON) Dip SW-2 Dip SW-2 1 (OFF): Printing Columns = 80 2 (ON) : User Font Back-up = ON 3 (ON) : Character Select = Normal 4 (OFF): Zero = Slash 5 (ON) : International 6 (ON) : Character 7 (ON) : Set 8 (OFF): =USA 1 (ON) 2 (ON) 3 (ON) 4 (OFF) 5 (OFF) 6 (OFF) 7 (ON) 8 (OFF) Dip SW-3 1 (ON) : Data Length = 8 bits 2 (ON) : Parity Settings = No 3 (ON) : Parity Conditions = Odd 4 (OFF): Busy Control = XON/XOFF 5 (OFF): Baud 6 (ON) : Rate 7 (ON) : Select 8 (ON) : = 9600 bps 182 : USA : USA : USA :IBM : Character Set 1 : 12 inches : LF only :CR = CR + LF : 9600 Baud : 9600 Baud : XON/XOFF : No Parity : No Parity : 8 bits : Serial : No single sheet 5 Tecnicas de trabajo 5.1 Modo Celulas eucariotas Este modo se simboliza en el display con el caracter © . 1. Paso - Introducir / cambiar parametros - - Conmutar en caso necesario con la tecla MODE a celulas eucariotas. Pulsar la tecla SET para seleccionar el parametro deseado (subraya). - Cambiar los parametros, de forma creciente o decreciente, con las teclas de flecha. - Cambiar igualmente otros parametros con las teclas SET y de flecha. - Finalizar la entrada. Los parametros tienen efecto rapido y no tienen que memorizarse. 13:37 12.AUG.00 U 500V X n 220|JS 2 Ejemplo del display a la electroporacion de celulas eucariotas. Los parametros © relevantes estan representados en grande y en negrita. U: Tension, unidad V (voltio), regulable en la gama de 20-100 V en pasos de uno, d e l 00-1000 V en pasos de diez, d e l 000-1200 V en pasos de cien. x: Constante de tiempo, unidad us (microsegundos), regulable en la gama de 15-500 us en pasos de 5 \xs. n: Numero de los impulsos durante el experimento, regulable de 1-99. Entre los impulsos se espera un minuto respectivamente. Anotacion: Los parametros configurados se aplican realmente. El desarrollo del impulso se calcula internamente de modo que el desarrollo de la curva de descarga (funcion e) se mantiene de acuerdo con los parametros entrados. Para la aplicacion de un impulso rectangular se puede usar el modulo de fusion (ver para ello cap. 5.4). 183 5 Tecnicas de trabajo 2. Paso - Iniciar la electroporacion - Activar la electroporacion con la tecla START. - En el display aparece la informacion "Charge" en la tercera Ifnea, la carga se genera. - 12.AUG.00 U 500V 13:37 x 220us Charge © Despues de concluida la carga se pasa a la descarga, representada con un relampago en la tercera Ifnea. Si se ha ajustado mas de un impulso, aparece el aviso "Wait" con el tiempo a esperar todavfa. 12.AUG.00 U 500V 13:37 T Wait ! 0:57 220ns © Despues de acabado el 12.AUG.00 13:37 experimento se da una U 500V T 220MS serial acustica doble y n 2 aparece de nuevo la READY SINCE 1:36 pantalla inicial con los © parametros conf igu rados y utilizados. Adicionalmente en la linea inferior aparece el tiempo en minutos y segundos desde que ha acabado el experimento. Despues de 99 minutos o al accionar una tecla se borra esta indicacion 184 5 Tecnicas de trabajo 5.2 Modo Bacterias y levaduras (Opcion) Este modo se simboliza en el display con el caracter O1. Paso - Introducir / cambiar parametros - - Conmutar en caso necesario con la tecla MODE a bacterias y levaduras. Pulsar la tecla SET para seleccionar el parametro ajustable Tension (U) (subraya). - Cambiar los parametros, de forma creciente o decreciente, con las teclas de flecha. - Finalizar la entrada. Los parametros tienen efecto rapido y no tienen que memorizarse. 12.AUG.00 U 2000V Ejemplo del display a la electroporacion de 5 ms bacterias y levaduras. 13:42 X Los parametros O relevantes estan representados en grande y en negrita. U: Tension, unidad V (voltio), regulable en la gama de 200-1 000 V en pasos de diez, de 1 000-2 500 V en pasos de cien. x: Constante de tiempo, unidad ms (milisegundos), ajustada fija a 5,0 ms. 185 5 Tecnicas de trabajo 2. Paso - Iniciar la electroporacion - Activar la electroporacion con la tecla START. - En el display aparece la informacion "Charge" en la tercera Ifnea, la carga se genera. - 12.AUG.00 U 2000V 13:42 x 5 ms Charge O Despues de concluida la carga se pasa a la descarga, representada con un relampago en la tercera Ifnea. Despues de acabado 12.AUG.00 13:42 U a : Tension medida el experimento se da realmente usada, U 2000V X 5 ms una senal acustica doble unidad V (voltios). Ua2003V 1^5.1 ms y aparece de nuevo la Constante de tiempo pantalla inicial con los READY SINCE 1:36 O t a : medida realmente parametros usada, unidad ms configurados. En la (milisegundos), tercera Ifnea se valores < 0,8 se representan los representan como parametros reales U a 0,8 ms. Adicionalmente en la linea inferior aparece el tiempo en minutos y segundos desde que ha acabado el experimento. Despues de 99 minutos o al accionar una tecla se borra esta indicacion. 186 5 Tecnicas de trabajo 5.3 Modo fusion celular (Opcion) 5.3.1 Funcion: alineacion celular (alineamiento) Las funciones para el alineamiento se representan mediante los si'mbolos U'_ (antes del impulso) y U"_ (despues del impulso) en las lineas 2 y 4 del display. 1. Paso - Introducir / cambiar parametros - En caso necesario, se puede conmutar a fusion mediante la tecla MODE. - Pulsar la tecla SET para marcar los parametros deseados (subraya). - - Cambiar los parametros, de forma creciente o decreciente, con las teclas de flecha. Si un valor en las lineas U L / I T . / U r , se situa en "0", la funcion correspondiente no se ejecuta. De esta forma es posible activar U'_/U'L,de forma individual o consecutivamente, sin activar el impulso de fusion. Finalizar la entrada. Los parametros tienen efecto rapido y no tienen que memorizarse. 12.AUG.00 13:42 Ejemplo del display para la ejecucion del alineamiento U'_ 5V t 60s U n OV t 15s n2 U'~ sin activar el impulso U n y para la ejecucion del U"_ OV t 30s alineamiento U"~. Los parametros relevantes estan representados en grande y en negrita. U'_/U"_: Tension alterna, unidad V (voltios), regulable: "0" y en lagamade 1,0-10 V en pasosdeO,1 V. t: Duracion del alineamiento 0-95 s, unidad s (segundos) en pasos de 5 s. Un: Tension, (impulso rectangular), unidad V (voltios), regulable: "0" y en la gama de 5-100 V en pasos de 1 V; de 100-300 V en pasos de 10 V. t: Duracion de impulsos, unidad us (microsegundos), regulable para 0-300 u.s en pasos de 5 us. n: Numero de los impulsos 0-99, regulable en pasos de uno. 187 5 Tecnicas de trabajo 2. Paso - Iniciar la alineacion celular (alineamiento) - - Activar el alineamiento U'_ con la tecla START. En la cuarta Ifnea del display aparece la informacion ' W ; hay tension alterna para la duracion seleccionada. Despues de acabado el experimento se da una serial acustica doble y aparece de nuevo la pantalla inicial con los parametrosconfigurados y usados. Adicionalmente en la Knea inferior aparece el tiempo en minutos y segundos desde que ha acabado el experimento. Despues de 99 minutos o al accionar una tecla se borra esta indicacion. 188 12.AUG.00 13:42 5V t 60s Un OV t 15s n2 U"_ OV t 30s 5 Tecnicas de trabajo 5.3.2 Ejecucion de la fusion celular 1. Paso - Introducir / cambiar parametros 13:42 Ejemplo del display para la ejecucion de la 5V t 30s electrofusion con 30V t 15MS n2 un alineamientos U'~ / U"~ 5V t 30s U" activados. 12.AUG.00 - Pulsar la tecla SET para marcar los parametros deseados (subraya). - Cambiar los Ejemplo del display parametros, de 13:42 para la ejecucion de 12.AUG.00 forma creciente o Mi n\l + UV I ous la electrofusion con decreciente, con Up 30V t 15MS n2 alineamiento U '~ no las teclas de flecha. activado. Segun la seleccion U"_ 5V t 30s ae los parametros para U'_ y U"_, la fusion opcionalmente sin alineamiento puede combinarse unicamente con una o con las dos funciones de alineamiento. - Finalizar la entrada. Los parametros tienen efecto rapido y no tienen que memorizarse. Los parametros relevantes estan representados en grande y en negrita. Un: Tension, unidad V (voltios), regulable: "0" y en la gama de 5-100 V en pasos d e l V;del00-300V en pasos de 10 V. t: Duracion de impulso, unidad [is (microsegundos), regulable para 0-300 (JS en pasos de 5 [is. Tension alterna, unidad V (voltios), regulable: "0" y en la gama de 1,0-10 V en pasos de 0,1 V. n: Numero de los impulsos, 0-99, regulable en pasos de uno 189 5 Tecnicas de trabajo 2. Paso - Iniciar la fusion celular 190 - Activar la fusion celular con la tecla START. - En el display aparece brevemente la informacion "Charge" en la cuarta Ifnea, la carga se genera. - Durante el proceso de carga, la tension alterna U'_ se mantiene para la duracion seleccionada. La tension alterna se indica mediante ~ (oscilacion sinusoidal). - Transcurrido el tiempo contado de alineamiento (0-95 segundos) se procede a la descarga, representada mediante un relampago en la cuarta Ifnea. Dependiendo del numero n introducido se produce, en el caso de n >1, una descarga adicional transcurrido un segundo. 5 Tecnicas de trabajo - Una vez concluidas las descargas, la tension alterna U"_ se mantiene para la duracion establecida (0-99 segundos). El tiempo total restante del experimento se muestra permanentemente en la Ifnea inferior. Despues de acabado el 12.AUG.00 13:42 experimento se da una U'_ 5V t 30s serial acustica doble y U n 30V t 15|JS n2 aparece de nuevo la U"_ 5V t 30s pantalla inicial con los READY SINCE 1:36 G3 parametros configurados y utilizados. Adicionalmente en la Ifnea inferior aparece el tiempo en minutos y segundos desde que ha acabado el experimento. Despues de 99 minutos o al accionar una tecla se borra esta indicacion. Indication: En el caso de U'_ / U"_ = 0 se puede usar el impulso rectangular solo accesible en la fusion tambien para la electroporacion. En este caso tiene lugar la electroporacion con el modulo de fusion y con los parametros correspondientes. El impulso rectangular no puede usarse sin el modulo de fusion. 191 6 Mensajes de error En caso de error, el Multiporator® emite una serial acustica asi como un mensaje de error a traves del display o de la impresora acoplada (opcion). Estos mensajes de error se refieren a fallos del aparato o a fallos, que se dan por la aplicacion. Los fallos 1-4 y 9 pueden aparecer al usar el modulo de bacterias, 1-7 en celulas eucariotas y 1-8 en la fusion celular. Mensaje Causa Solucion 01 No Display El display no se activa. Llamar al servicio tecnico. 02 NoRTC/ NVRAM Componente electronico para reloj interno defectuoso. Llamar al servicio tecnico. 03 High Current La potencia Reducir la conductibilidad electrica durante la de la solucion usada. descarga (impulso) Controlar si se empleo el era muy grande. tipo de cubeta correcto. 04 No Cuvette No hay puesta una cubeta. fallo Poner cubeta, arrancar de nuevo. Meter completamente la unidad de cubeta 'plug-in' en el aparato. 192 05 Timeout Charge El condensador no puede cargarse en el tiempo previsto para el inicio de carga. Llamar al servicio tecnico. 06 Timeout Charge Ante una pulsacion varia no pudo cargarse el condensador a tiempo entre cada uno de los impulsos. Reducir la conductibilidad de la solucion usada. Controlar si se empleb el tipo de cubeta correcto. 6 Mensajes de error N° fallo Mensaje Causa 07 Short T El condensador Reducir la conductibilidad se vacio de la solucion usada. completamente. No puede asegurarse Controlar si se empleo el tipo de cubeta correcto. que tambien se realizo la x introducida. El elemento limitador no era la regulation de impulso, sino el condensador. 08 Low Resistance Demasiada corriente en la cubeta. La tension alterna no puede mantenerse. Reducir la conductibilidad de la solucion usada. 09 Timeout Measuring x Llamar al servicio tecnico. Modulo de bacterias x a = 0,8 ms, U a mucho menor que el parametro ajustad U. Timeout en la medicion x del modulo de bacterias. Solution - Golpe de chispas en la cubeta. - Usar una cubeta con una separation mayor de electrodos. - La potencia electrica durante la descarga (impulso) era muy alta. - Reducir la conductibilidad de la solucion usada. - Fallo tecnico. - Llamar al servicio tecnico. 193 7 Mantenimiento, servicio y cuidado No es necesario un mantenimiento regular. El proveedor asume la garantfa y el servicio. 7.1 Desinfeccion Antes de realizar la desinfeccion del Multiporator®, sacar el enchufe de red. Deben someterse a una desinfeccion de lavado todas las partes del Multiporator®, inclusive los accesorios y el cable de union. La unidad 'plug-in' tambien se puede someter a una desinfeccion pulverizadora. No se recomienda una desinfeccion pulverizadora del aparato, ya que el agente desinfectante podrfa penetrar al interior del Multiporator®. El metodo de desinfeccion aplicado debe corresponder con las normas y directrices legales vigentes para la desinfeccion. 7.2 Limpieza Antes de realizar la limpieza del Multiporator®, sacar el enchufe de red. Cuidar de que no penetren li'quidos en el interior del Multiporator®. Con ello se evitan cortocircuitos en la instalacion electrica y la corrosion. Limpiar las partes bamizadas y las superficies de aluminio con un pano y detergentes suaves y frotar con un pano seco. Atencion: No usar detergentes ni pulidores causticos, solventes o esmerilantes. 194 8 Datos tecnicos Tension/Frecuencia: Fusibles: Consumo: Categorfa de sobretension: Clase de proteccion: Grado de suciedad: Tension regulable (Modulo para): Celulas eucariotas: Fusion celular: Tension alterna: Bacterias: Condensador: Resistencia: 100-240 V ±10%, 50-60 Hz TO, 1,0 A - 5 x 20 mm (2 unidades) 60 W II I 2 20- 100 V en pasos de 1 V 100-1 000 V en pasos de 10V 1 000-1 200 V en pasos de 100 V Separacion de impulso: 1 minuto 0, 5 100 V en pasos de 1 V 100- 300 V en pasos de 10V Separacion de impulso: 1 segundo 0,1,010 V en pasos de 0,1 V 200-1 000 V en pasos de 10V 1 000-2 500 V en pasos de 100 V sin impulso multiple 10 u.F, 2 500 V descarga de impulso 600 Q. paralela 56 Q. preconectada Duracion de carga: <30 segundos Numero de impulsos n: 0-99 Constante de tiempo x de la descarga: Celulas eucariotas: 15-500 us regulable en pasos de 5 us, Funcion e decreciente nominal 5 ms Bacterias: con una impendancia de muestra de 3,3 k£2 Medicion e indicacion 0,8-6,0 ms Duracion de la alineacion celular 0-95 s regulable en pasos de 5 s (alineamiento): Duracion t del impulso 0-300 us regulable en pasos de 5 us, (Fusion celular). Impulso rectangular 9 600 Baudios, 8 bit, sin paridad, Interface RS 232: 2 Stopbits, XON/XOFF max. 40 °C Temperatura ambiente: max. 80 % Humedad relativa: 195 8 Datos tecnicos Peso: Medidas: max. 5,5 kg (segun fases de capacidad) Anchura: 25,2 cm Fondo: 34,2 cm Altura: 12,0 cm El aparato Neva el sfmbolo f f y la autorizacion UL y CSA (cULE 158089). i Reservados los cambios tecnicos! 196 9 Informaciones de pedido N°pedido 4308 000.015 4308 000.023 4308 000.031 4308 000.040 4308 070.501 4308 070.510 4308 070.528 4308 070.536 4307 000.569 4307 000.593 4307 000.623 4308 078.006 4308 070.072 4308 021.004 4308 012.005 4308 014.008 4308 030.003 4308 024.003 4308 017.007 Multiporator® Version base para celulas eucariotas 100-240 V, 50-60 Hz Multiporator®, celulas eucariotas y fase de capacidad Modulo de bacterias Multiporator®, celulas eucariotas y fase de capacidad Fusion celular Multiporator®, celulas eucariotas y fase de capacidad Modulo de bacterias y Fusion celular Accesorios Amortiguacion Amortiguacion (PH), 100 ml Amortiguacion (PI), 100 m! Amortiguacion (FH), 100 ml Amortiguacion 100 ml hiposmolar para la electroporacion isosmolar para la electroporacion hiposmolar para la fusion celular isosmolar para la fusion celular (Fl), Cubetas de electroporacion 1 mm hendidura, aluminio, esteril, 50 unidades 2 mm hendidura, aluminio, esteril, 50 unidades 4 mm hendidura, aluminio, esteril, 50 unidades Portacubetas para 16 cubetas de electroporacion Unidad 'plug-in' para cubetas de electroporacion Unidad 'plug-in' (Electroporacion / Electrofusion) para la conexion de electrodos externos Unidad 'plug-in' para camara de fusion Helix Camara de fusion Helix (0,2 mm de separacion de electrodos) Micro-camara de fusion (0,2 mm de separacion de electrodos) Unidad 'plug-in' para micro-camara de fusion Soporte para 10 camara de fusion Helix 197 9 Informaciones de pedido 0013 608.148 0013 608.172 0013 608.164 6547 001.018 0013 610.517 0013 610.525 0013 610.533 4308 010.002 4308 011.009 198 Termoimpresora DPU-414 Equipo de red (230 V) para termoimpresora DPU-414 Equipo de red (115 V) para termoimpresora DPU-414 Papel termico (10 rollos) Cable de conexion (Clavija de 9 polos / conector de 9 polos, pasacables 1:1) Cable de m6dem cero para conexion a PC (Clavija de 9 polos / clavija de 9 polos) Cable de modem cero para impresora de matrices (Clavija de 9 polos / conector de 9 polos) Equipo de reequipamiento Bacterias (Montaje por medio del servicio tecnico) Equipo de reequipamiento Fusion celular (Montaje por medio del servicio tecnico) EG-Konforrnitatserklarung EC Conformity Declaration Das bezeichnete Gerat entspricht den einschlagigen grundlegenden Anforderungen der aufgefuhrten EG-Richtlinien und Normen. Bei einer nicht mit uns abgestimmten Anderung des Gerates verliert diese Erklarung ihre Gultigkeit. The device named below fulfills the relevant fundamental requirements of the EC directives and standards listed. In the case of unauthorized modifications to the device, this declaration becomes invalid. Geratebezeichnung, Device name: Multiporator 4308 Geratetyp, Device type' Elektroporator / electroporator Einschlagige EQ-Rlchtlinien/Normen, Relevant EC directives/standards: * 73/23/EWG, EN 61010-1 89/336/EWG, EN 55011, EN 50082-1, EN 61000-3-2, EN 61000-3-3 &• Vorstand, Board of Management: A ProjektmanagGment, Project Management; 25.09.2000 Hamburg, Date: eppenclorf Eppendorf AG • Barkhausenweg 1 • 22339 Hamburg • Germany 0015 0033 509 0) 4308 900 997-00 Eppendorf AG 22331 Hamburg • Germany Phone: +49 40-5 38 01-0 Fax: +49 40-5 38 01-556 e-mail: [email protected] eppendorf home page: http://www.eppendorf.com Application Hotline: Phone: +49 180-3 66 67 89 e-mail: [email protected] Printed in Germany eppendorf eppendorf'11 is a registered trademark