Sistema a componenti in fase solida per il

Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
http://www.diagnostics.com
Sistema a componenti in fase solida
per il dosaggio dell
'Ormone Tireotropo [125I]
Catalog No.:
06B-264125 (100 Tube)
06B-264130 (200 Tube)
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-431-1237
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erhältlich
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Per qualsiasi informazione o esigenza si prega di rivolgersi agli uffici locali della ICN
Pharmaceuticals
Para información y soporte técnico dirijase a las oficinas locales de ICN Pharmaceuticals
SISTEMA A COMPONENTI IN FASE SOLIDA
PER IL DOSAGGIO DEL’ORMONE TIREOTROPO [125I]
Per la determinazione quantitativa dell'ormone tireotropo umano (TSH) nel siero o plasma.
Generalità e Metodologia di Dosaggio
L'ormone tireostimolante (tireotropo, TSH) è una glicoproteina prodotta dall'ipofisi anteriore che stimola
la produzione e la secrezione di tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) da parte della ghiandola tiroide. Le
forme circolanti libere di T4 e T3, a loro volta, regolano la secrezione di TSH tramite un'azione inibitoria
diretta sulle cellule tireotrope dell'ipofisi. Quando la secrezione tiroidea è troppo bassa, la secrezione
di TSH risulta stimolata; quando la secrezione tiroidea è troppo alta, la secrezione di TSH risulta inibita.
Ne risulta pertanto che le concentrazioni di T4 e T3 sono normalmente mantenute entro limiti ristretti.
Concentrazioni elevate di TSH si riscontrano in pazienti con ipotiroidismo primario. Ciò accade non solo
in pazienti con manifesta malattia clinica, ma anche in pazienti con lieve ipotiroidismo. Livelli elevati di
TSH possono essere presenti in pazienti con varie malattie, sebbene permangano normali i livelli di
ormoni tiroidei, indicando quindi che l'innalzamento della concentrazione di TSH costituisce il più
prococe indice misurabile di comparsa del declino della secrezione tiroidea.1-4 Livelli bassi o non
dosabili di TSH possono riscontrarsi in caso di ipertiroidismo.
Il maggior valore clinico del TSH consiste nella diagnosi di ipotiroidismo primario, dovuto cioè a
disfunzione tiroidea. L'ipotiroidismo comunque può originare a livello ipofisario o ipotalamico ed il TSH
può pertanto essere basso o normale. In aggiunta alla determinazione basale di TSH, la valutazione
delle concentrazioni di TSH dopo somminis-trazione endovenosa di TRH (Ormone rilasciante il
tireotropo) può fornire utili informazioni cliniche.5-8 E' stato riportato che il TSH plasmatico costituisce
un mezzo diagnostico più affidabile del T4 plasmatico e dell'indice di tiroxina libera (FTI) per
l'individuazione della malattia tiroidea in pazienti gravemente malati.9
Principio di Dosaggio
In un dosaggio immunoradiometrico (IRMA), l'anticorpo marcato viene posto a reagire con l'analita in
presenza di anticorpo adeso ad un supporto solido. Il sistema IRMA è anche detto "a due siti" o
dosaggio "sandwich". Una volta separata, la radioattività del complesso "anticorpo-analita-anticorpo
in fase solida" si presenta in relazione diretta con la concentrazione dell'antigene nel campione o nello
standard.
Reagenti
Per uso diagnostico in vitro
1.
Tracciante. Catalogo nE 06B264903; preparazione pronta per l'uso contenente meno di 10 FCi
(370 kBq) di TSH-MAb-[125I] (topo) in tampone con albumina bovina, siero di capra, siero di topo,
colorante, sodio azide allo 0,1%** ed altri conservanti. 25 ml. Conservazione: refrigerare a 2 8EC. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
2.
Provette sensibilizzate con anticorpo anti-TSH (coated tubes). Catalogo nE 06B264901.
Provette in polistirene ricoperte con anticorpo purificato peraffinitá diretto contro il TSH (capra).
Conservazione: refrigerare a 2-8EC, chiuse nella confezione originale. Stabilità: vedi la data
di scadenza sulla confezione.
1
3.
1
TSH Calibratori - Livelli A-G. Catalogo nE 06B263893; contenenti TSH umano in siero umano*
con sodio azide allo 0,1%** ed altri conservanti. I valori sono riportati sulle etichette dei flaconi.
Questi calibratori sono stati calibrati per il TSH contro lo standard WHO/MRC 80/558 Medical
Research Council, World Health Organization (equivalente allo St. WHO/MRC 68/38).
Conservazione: refrigerare a 2-8EC. Stabilità: vedi la data di scadenza sul flacone.
Calibratori
Catalogo nE
E
Volume per flacone,
ml
A
B
C
D
E
F
G
06B263711
06B263729
06B263737
06B263745
06B263753
06B263761
06B263770
8
4
4
4
4
4
4
NOTE:
Valori nominali di
TSH(F
FU/ml)1
0
0,2
1
4
10
40
80
I valori di TSH variano da lotto a lotto. Utilizzare i valori indicati sullétichetta del
flacone.
*
ATTENZIONE: MANEGGIARE COME SE FOSSE CAPACE DI TRASMETTERE INFEZIONE.
Il materiale da cui e derivato questo prodotto é stato trovato non reattivo per HBsAg é negativo
per l'anticorpo Anti-HIV quando testato con reagenti autorizzati. Nessun test puo offrire garanzia
che i prodotti derivati da sangue umano non siano infettivi. Fare riferimento alla pubblicazione
CDC/NIH sulla Biosicurezza nei Laboratori di Microbiologia e Biomedica (Pubblicazione HHS n.
CDC 84-8395).
**
ATTENZIONE: i reagenti contengono sodio-azide. Il sodio-azide può reagire con il piombo e il
rame delle tubature idrauliche formando composti metallici altamente esplosivi. All'atto dello
scarico, far fluire grandi volumi d'acqua così da prevenire l'accumulo. Altamente tossico per
ingestione. A contatto con acidi libera gas altamente tossico. In caso di contatto con la pelle
lavarsi immediatemente ed abbondante-mente cond'acqua.
IMPIEGO DI MATERIALE RADIOATTIVO: AVVERTENZE
L'acquisto, la ricezione, la detenzione, l'uso, il trasferimento e lo smaltimento di materiale radioattivo,
sono soggetti ai regolamenti ed ai permessi previsti dalle autorità legislative. Nella manipolazione di
sostanze radioattive devono essere osservate le seguenti precauzioni:
Il materiale radioattivo deve essere conservato e manipolato in un'area del laboratorio specificamente
designata a tale uso. L'ambiente di lavoro deve essere ben illuminato e arieggiato. Le superfici di
lavoro devono essere non porose in modo da ridurre al minimo la contaminazione dovuta allo
spargimento di liquidi radioattivi. Considerata la piccola radioattività contenuta nel flacone del tracciante
(circa* uCi), l'uso del kit non pone alcun problema di pericolo di radiazioni. Tuttavia per evitare
inalazione o ingestione di materiale radioattivo è necessario rispettare le buone norme generali di
laboratorio. In particolare si raccomanda di: non pipettare con la bocca soluzioni radioattive; non
2
mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell'area di lavoro designata; pulire immediatamente le
superfici di lavoro dei materiali radioattivi eventualmente versati; raccogliere il materiale contaminato
solido e liquido in appositi contenitori ed effettuarne lo smaltimento secondo le procedure previste;
lavarsi accuratamente le mani dopo l'uso di materiale radioattivo.
Attrezzature e reagenti richiesti ma non forniti
1.
Acqua distillata
2.
Pipetta semiautomatica per la dispensazione di 200 Fl, 500 Fl e 2,0 ml. E' sconsigliato l'impiego
di pipettatori/diluitori per evitare la possibilità di contaminazioni.
3.
Portaprovette
4.
Agitatore tipo vortex
5.
Bagno termostatico in grado di mantenere 37 ± 1EC
6.
Contatore a scintillazione per la rilevazione delle radiazioni gamma dello [125I]
7.
Materiale appropriato per controllo quolitá.
Raccolta dei Campioni
Non è necessario alcun particolare accorgimento per la preparazione del paziente. Si raccomanda
comunque di verificare l'evenienza di precedenti trattamenti recenti del paziente con sostanze
radioattive a scopo scintigrafico o terapeutico.
1.
Preparazione del campione per l'analisi: raccogliere il campione in una provetta (con EDTA
se si desidera il plasma) da 5 o 10 ml. Si raccomanda di non sottoporre ad analisi campioni
emolizzati, fortemente lipemici o itterici. Qualora si utilizzi il siero, attendere la coagulazione a
temperatura ambiente. Centrifugare e raccogliere il siero o il plasma.
2.
Conservazione: Dopo la raccolta, il siero puó essere conservato a 2-8EC fino a 8 giorni, oppure
congelato fino a 30 giorni. Non sgelare e ricongelare ripetutamente. Dopo lo scongelamento,
il siero dovrebbe essere mantenuto a 2-8EC e dosato entro 7 giorni.
3.
Spedizione dei campioni: il siero dovrebbe essere spedito a 2-8EC. Qualora il tempo di
spedizione dovesse superare le 48 ore, si raccomanda il congelamento.
Procedimento di Dosaggio
Portare i reagenti e i campioni a temperatura ambiente prima dell'uso. Al fine comunque di ridurre il
deteriora-mento, evitare di mantenerli non refri-gerati se non per il tempo necessario al loro uso.
L'allestimento delle provette dei campioni e dei calibratori, così come dei controlli, deve essere effettuato
simultaneamente. Per il lavaggio, si raccomanda l'uso di acqua distillata.
1.
Se il procedimento d'elaborazione dei dati richiede l'Attività Totale, numerare la provette in
polistirene e tenere da parte.
3
2.
Numerare una quantità appropriata di provette per la curva standard e per I campione.
3.
Aggiungere 200 Fl di TSH calibratori campioni secondo lo schema di pipettamento più avanti
riportato.
4.
Aggiungere 500 µl di tracciante ad ogni provetta, mescolare breve-mente. Coprire le provette.
5.
Incubare tutte le provette in bagno termostatico a 37 ± 1EC per 3 ore.
6.
Togliere tutte le provette dal bagno e scoprirle.
7.
Aspirare o decantare. Aggiungere 2,0 ml di acqua distillata.
8.
Ripetere il passaggio 7. Aspirare o decantare un'ultima volta.
9.
Contare la radioattività delle provette e dell'Attività Totale in un contatore gamma per un minuto.
SISTEMA A COMPONENTI IN FASE SOLIDA TSH-MAb-[125I]
Provetta
Calibratori
(F
Fl)
Siero
(F
Fl)
Tracciante
(F
Fl)
200 A
200 B
200 C
200 D
200 E
200 F
200 G
---------------
500
500
500
500
500
500
500
200
500
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
13,14
Controlli
e campioni
Incubazione
Lavaggio
--Agitare e
incubare tutte
le provette a
37EC per 3
ore
Aspirare e
lavare tutte le
provette 2
volte ad
esclusione
dell'Attività
Totale, se
richiseta
Calcolo dei Risultati
La Tabella 1 mostra dati tipici. Fare riferimento alle singole etichette dei flaconi per le concentrazioni
dei calibratori di TSH.
Calcolo automatico
I procedimenti di elaborazione automatica dei dati possono essere impiegati per il calcolo dei risultati
di TSH. Possono essere usati l'inter-polazione punto a punto, la trasforma-zione logistica a quattro
parametri o altri metodi di interpolazione matematica.
Calcolo manuale
1.
Calcolare la media dei cpm per le provette 1 e 2. Calibratore A.
2.
Sottrarre la media dei cpm delle provette 1 e 2 da ogni altro conteggio ottenendo i cpm corretti.
4
3.
La curva standard può essere riportata su grafico riportando sull'asse y i cpm corretti per ogni
livello di calibratore in funzione delleconcentrazioni di calibratori di TSH sull'asse x su grafico loglog.
4.
Vedi un esempio in fig. 1. I dati riportati nella tabella sono a titolo rappresentativo e non devono
essere usati al posto della curva standard ottenuta per ogni dosaggio.
Esempio di calcolo per il TSH
Media cpm per il calibratore A
Cpm per il campione 1
Cpm corretti per il campione 1
Dal grafico in fig. 1, 5797 cpm
=
=
=
=
271
6068
5797
4,6 uU TSH/ml
Calibrazione
I calibratori di TSH sono stati calibrati contro lo Standard WHO/MRC 80/558del Medical Research
Council, World Health Organization.
Dosare i calibratori in duplicato ad ogni dosaggio. La curva di calibrazione puó essere generata con
metodi manuali o automatici, come descritto nalla sezione Calcolo dei Risultati. Quando si passa ad
un nuovo numero di lotto di tubi o tracciante deve essere dosata una nuova curva. Non scambiare
reagenti di lotti diversi nello stesso dosaggio.
Controllo Qualita
Dosare almeno due livelli di sieri di controllo (normale e patologico) in duplicato ad ogni dosaggio. Se
i risultati non incontrano i criteri di accettabilitá stabiliti dal laboratorio, i dati dovrebbero essere
riesaminati e se necessario, ridosati in accordo con le procedure del laboratorio. Per qualsiasi
informazione o esigenza si prega di rivolgersi agli uffici locali della ICN Pharmaceuticals.
Considerazioni Procedurali
1.
Poichè il tracciante radioattivo decade, possono rendersi necessari tempi superiori di conteggio,
ma ciò non è probabilmente necessario se l'attrezzatura è efficiente.
2.
Il tempo totale di pipettamento quando campione e tracciante sono aggiunti separatamente deve
essere limitato a 2 ore in caso di pipettamento manuale e in caso di pipettamento automatico a
dispensazione sequenziale. Se si utilizza una stazione di pipettamento che dispensa campione
e tracciante simultaneamente, il tempo di pipettamento deve essere limitato ad 1 ora.
3.
La curva standard copre il range approssimativo: 0 - 80 FU TSH/ml. Vedere le etichette dei
flaconi per le concentrazioni esatte di TSH. Lo standard A rappresentà il legame non specifico
del sistema TSH-IRMA e può essere usato per correggere i conteggi per la quota di
radioattività di fondo e per quella quantità di tracciante assorbito o co
munque legato non specifica-mente alle pareti della provetta.
5
4.
Per quei campioni che risultino a concentrazione superiore allo calibratori G, si consiglia di diluire
con calibratori A come segue: aggiungere 400 Fl di calibratori A a 50 Fl di campione. Mescolare
e dosare 200 Fl del diluito. Leggere il valore sulla curva standard e moltiplicarlo per il fattore di
diluizione 9, ottenendo così il valore corretto.
5.
Non é stato osservato effetto fancio a dosi di TSH fino a 500 FU/mL.6. Non mescolare reagenti
di lotti diversi. Qualora si debbano usare due flaconi dello stesso reagente per lo stesso
dosaggio, il contenuto dei flaconi dovrebbe essere miscelato prima di iniziare il procedimento.
7.
La presenza di radioattività nel campione può interferire sul dosaggio.
8.
Gli intervalli di normalità determinati possono non essere applicabili in gravidanza.
9.
Questo dosaggio non é stato convalidato per il dosaggio o lo screening neonatale.
Valori Attesi
Sono stati dosati sieri di 132 individui apparentemente eutiroidei (65 uomini e 67 donne) cora il kit TSH
della ICN Pharmaceuticals. El Rango de TSH representa un análisis del 95%.
intervallo di normalità
media
0,54 - 3,70 uU/ml (mU/l)
1,53 uU/ml (mU/l)
Ogni laboratorio dovrebbe comunque stabilire il proprio intervallo di normalità su di una popolazione di
soggetti normali.
I campioni serici di 66 pazienti clinicamente ipertiroidei e 61 pazienti clinicamente ipotiroidei sono stati
dosati con il sistema ICN Pharmaceuticals TSH-SPCS
Intervallo ipertiroidismo:
Intervallo ipotiroidismo :
# 0,06 uU/ml (mU/l)
> 9,0 uU/ml (mU/l)
Qualora il dato laboratoristico non si accordi con il giudizio clinico, quest'ultimo dovrebbe essere seguito
ed ulteriori indagini dovrebbero essere eseguite.
Caratteristiche Tecnologiche
Prestazioni Cliniche: Studi di Correlazione
Trecentocinquantacinque (355) campioni di siero umano sono stati dosati con il kit TSH MAb. I risultati
sono stati comparati per regressione lineare e riassunti nelle tarole seguenti.
6
Regressione Lineare: correlazione del kit TSH con il kit TSH MAb (Tutti i campioni).
Kit TSH (y) versus Kit TSH MAb (x)
Pendenza
0,92
Intercetta (FU/ml)
-0,12
Coefficiente di correlazione
(r)
0,991
Intervallo di Valori (FU/ml)
Kit TSH
Kit TSH MAb
# 0,06 - 69,7
# 0,06 - 70,3
n
355
Regressione Lineare: Correlazione del kit TSH con il kit TSH MAb assay (Campioni < 6 FU/mL.
Kit TSH (y) versus Kit TSH MAb (x)
Pendenza
0,86
Intercetta (FU/ml)
0,02
Coefficiente di correlazione
(r)
0,980
Intervallo di valori (FU/ml)
Kit TSH
Kit TSH MAb
# 0,06 - 4,47
# 0,06 - 5,33
n
294
Precisione:
Quattro sieri commerciali di controllo, sottoposti a dosaggi ripetuti (almeno 20 determinazioni) hanno
fornito i seguenti risultati:
fra i saggi
Campione
Media, FU/ml
D.S.
CV %
nel saggio
1
2
3
4
1
2
3
4
0,52
0,08
16,2
1,10
0,10
9,4
4,69
0,23
4,8
25,6
1,3
5,0
0,43
0,06
13,3
1,11
0,07
6,0
4,76
0,23
4,9
27,0
1,13
4,2
7
Recupero:
Un siero umano è stato arricchito con quantità variabili di TSH (WHO MRC 80/558). Sono stati ottenuti
i seguenti recuperi:
Recupero percentuale
Aggiunto
Atteso
Trovato
0
0,5
1,0
5,0
10,0
25,0
50,0
--1,58
2,08
6,08
11,08
26,08
51,08
1,08
1,44
1,90
5,17
10,3
24,0
53,2
--91
91
85
93
92
104
Sensibilità:
La sensibilità, definita in termini di +2D.S. su venti determinazioni di standard zero, è risultata
essere: 0,06 FU TSH/ml.
Linearitá:
La linearitá é stata valutata diluendo un campione ipotiroideo con lo standard zero.
TSH (F
FU/ml)
Valore alteso
Recupero percentuale
Diluizione
TSH (F
FU/ml)
Valore trovato
Toto
53,2
---
---
1:2
27,1
26,6
102,1
1:4
13,0
13,3
97,8
1:8
6,62
6,65
99,6
1:16
3,27
3,32
98,4
1:32
1,60
1,66
96,3
1:64
0,76
0,83
91,5
8
Specificità:
Il kit ICN Pharmaceuticals TSH-MAb-SPCS prevede l'impiego di anticorpi monoclonali per il TSH
intatto. Le reazioni crociate con altri ormoni proteici sono riportate qui di seguito:
TSH (F
FU/ml)
Suero Normal
50 mU/ml LH
200 mU/ml LH
1000 mU/ml LH
1,90
2,04
1,91
1,86
50 mU/ml FSH
200 mU/ml FSH
1000 mU/ml FSH
1,91
1,62
1,06
1,000 mU/ml hCG
10,000 mU/ml hCG
100,000 mU/ml hCG
1,95
1,74
0,78
9
TSH [
Tube No.
Total
Total
Calibrator A
Calibrator A
Calibrator B
Calibrator B
Calibrator C
Calibrator C
Calibrator D
Calibrator D
Calibrator E
Calibrator E
Calibrator F
Calibrator F
Calibrator G
Calibrator G
Sample 1
Sample 1
125
TABLE 1
I] Solid Phase Component System
Tabulated Data
Counts per minute
242905
248233
280
261
592
608
1654
1600
5387
5349
12375
12335
38367
38303
60359
61005
6054
6082
Average cpm
245569
Corrected cpm
271
321
327
1383
1329
5116
5078
12104
12064
38096
38032
60088
60734
5783
5811
10
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Immunoradiometric Assay in Severely Ill Patients, Lancet, II, 1036-1037, 1986.
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