E. coli - Biomerieux

Milano 11 novembre 2010
La sorveglianza delle infezioni
trasmesse
da alimenti in Europa e in
Italia
Ida Luzzi
Dipartimento di Malattie Infettive, Parassitarie e Immunomediate
Istituto Superiore di Sanità, Roma
www.iss.it
MTA nei paesi industrializzati
•
Alta morbilità (L’OMS stima che il 30% della popolazione
ogni anno soffra di un episodio di infezione trasmessa da
alimenti)
•
In alcuni casi costi umani gravi:
•
•
•
E.coli O157
Salmonella e Listeria per soggetti a richio (anziani,
gestanti, neonati………)
Sempre alti costi socio-sanitari
•
inferiori solo a tumori e malattie cardiovascolari
(stime WHO)
MTA nei paesi industrializzati
•
Sempre alti costi socio-economici
•
•
•
•
Forte impatto sull’opinione pubblica
Danni economici e di immagine
Settore alimentare
Turismo
Sviluppare programmi di sorveglianza per
indirizzare e verificare le misure di prevenzione e
controllo
Sorveglianza e controllo delle MTA nella UE
Settore Medico
DG - SANCO
Stati
Membri
Programme on Food Warterborne Diseases
and Zoonoses
Task Force
Zoonosi
Settore Veterinario
- Alimenti
Direttiva Zoonosi
(99/2003)
Monitoraggio Zoonosi
FWD surveillance network
– Six priority diseases
• Salmonellosis
• Campylobacteriosis
• STEC/VTEC infection
• Listeriosis
• Shigellosis
• Yersiniosis
Disease specific epidemiologists and
microbiology experts designated by Member
States
International surveillance
network for human infections
with Salmonella, VTEC, and
Campylobacter.
Since 2007
Foodborne and
Waterborne
Diseases Network
General FWD surveillance objectives
• Enhance
– detection of international food-borne clusters and
outbreaks
– exchange of information on causative
agents/strains
• Strengthen
– integrated surveillance in humans, food and
animals
– laboratory capacity in MSs
FWD surveillance network
Standard EU case definitions
www.ec.europa.eu/health/ph_threats/com/docs/1589_2008_en.pdf
Notification of cases in the TESSy database
External laboratory quality assurance
Urgent inquiries
Annual meetings
FWD-2008
Infezioni da:
• Salmonella
• Campylobacter
• E.coli VTEC
• Yersinia
• Listeria
(casi x 100.000 ab)
26,4
40,7
0,7
1,8
0,3
Soggetta a notifica obbligatoria
Foodborne and Waterborne Diseases Network
Foodborne and Waterborne Diseases Network
O157
52.7 %
O26
6.5 %
O103
3.8 %
O91
2.8 %
O145
2.3 %
O111
O146
1.3 %
0.9 %
VTEC infections by
serogroup
2006 - 2008
N = 9,421
The “Zoonoses Directive” 2003/99/CE
Directive 2003/99/CE of 17 november 2003 on
measures for monitoring and surveillance of
zoonoses and zoonotic agents
• Art 4.1: MS shall collect relevant and comparable
data in order to identify and characterise hazards…
• Art 4.2: Monitoring shall take place at the stages of
the food chain most appropriate to the zoonosis
concerned
The “Zoonoses Directive” 2003/99/CE
Monitoring an surveillance of zoonotic
agents in animals and food
Annex I A, First rank priority
•
•
•
•
•
•
•
•
Salmonella
Escherichia coli VTEC
Campylobacter
Brucella
Listeria monocytogenes
Mycobacterium bovis
Echinococco
Trichinella
Laboratori diagnostici
Laboratori regionali di
riferimento
ISS
Ministero del Lavoro,
Della Salute e
delle Politiche Sociali
1980-2009
I Centri
Lombardia
CEPIS Università Milano
Ospedali Riuniti Bergamo
Lab Sanità Pubblica Brescia
AO S.Anna Como
Lab Sanità Pubblica Cremona
Laboratorio Milano (MI-Lodi)
Laboratorio Prevenzione Milano
Smatteo Pavia
Lab Sanità Pubblica Sondrio
Laboratorio Medico Varese
ARPA Isernia
IZS Me zzogiorno Portici
Tecniche di subtipizzazione
Profilo di antibioticoresistenza
Fagotipizzazione
Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)
Pulsenet Europe
Isolamenti di Salmonella per Regione per anno
2007-2008- 2009
Agenti patogeni notificati alla rete Enter net Italia
*
Numero casi di Salmonella e Campylobacter x 100.000 ab.
Distribuzione sierotipi di Salmonella di isolamento umano
2007-2008- 2009
S. 4,5,12:i:- variante monofasica di S. Typhimurium (4,5,12:i:1,2)
mancante della 2a fase flagellare (gene fljB).
Determinazione Antibiotico Resistenza
Pannello Enter Net, 12 antibiotici
% ceppi di Salmonella
Percentuale di ceppi di Salmonella spp.,
Typhimurium, 4,5,12:i:- ed altri sierotipi,
multiresistenti
Tipizzazione fagica in ceppi di Salmonella Enteritidis e
Typhimurium di isolamento umano nel 2007-2008-2009 e di
S. 4,5,12:i:- nel 2009
88
84.3
92.9
91.9
96.3
89
87
73%
85.8
91.7
89.7
96.6
83.1
92.4
96.6
94.6
81.4
80.3
85.7
* Profili di PFGE di ceppi ASSuT ma appartenenti al cluster B.
** Profili di PFGE presenti in entrambi gli R-types.
Dionisi AM et al., Foodborne Pathog Dis 2009;6:711-717
20
Kb
80
60
40
1 50
400
350
300
250
200
500
PFGE-XbaI
700
600
1 000
100
95
90
85
80
75
Genetic similarity
(%)
1 500
Profili di PFGE in ceppi ASSuT e ACSSuT
(2003-2006)
STYMXB.0080**
STYMXB.0339
STYMXB.0079**
STYMXB.0132
STYMXB.0010**
STYMXB.0083
STYMXB.0022
STYMXB.0020
STYMXB.0260
STYMXB.0015
STYMXB.0114
STYMXB.0058 *
STYMXB.0233
STYMXB.0179
STYMXB.0013
STYMXB.0061
STYMXB.0067
STYMXB.0086 *
STYMXB.0051 *
STYMXB.0115
Cluster A
ASSuT
Cluster B
ACSSuT
EPIS
Grazie !
Indagini su episodi epidemici
1. Indagine epidemiologica
2. Indagini microbiologiche
3. Indagini ambientali
Il ruolo del laboratorio nelle indagini su episodi
epidemici
Conoscere il sistema di sorveglianza
•
Chi contattare?
–
–
–
–
–
Laboratori locali
Laboratori regionali
Laboratori ospedalieri
Laboratori di riferimento
Laboratori della rete internazionale
Allerte comunitarie ECDC/2009
S. Goldcoast
Aumento casi di infezione in Ungheria
Ceppi con identico profilo PFGE
ECDC/ Urgent inquiry
Epidemic curve of S. Goldcoast outbreak (update 10/06/2010)
S. Goldcoast outbreaks
ECDC alert
12
other region
N. cases
10
lombardia
8
6
4
01/01/2009
week
Study period
• Investigation refers to 66 cases, reported in Italy
between 01/06/2009 and 28/02/2010
• 13 cases were linked to point-source foodborne
outbreaks
• 53 cases were classified as sporadic
15
13
11
9
7
5
3
1
51
49
47
45
43
41
39
37
35
33
31
29
27
25
23
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
0
1
2
100
98
96
94
92
Typing
PFGE-XbaI
of S.Goldcoast
PFGE-XbaIstrains from human, food and animals
09BG 02-42513045
Goldcoast bg 2009
83671/4
Goldcoast rm 2009
12734
Goldcoast rm 2009
471/3
suino
Goldcoast pd 2008
09BG 01-42513753
Goldcoast bg 2009
09BG 01-42927317
Goldcoast bg 2009
09BG 01-42927332
Goldcoast bg 2009
09BG 01-42927367
Goldcoast bg 2009
09BG 012-11331
Goldcoast bg 2009
09BG 08-160
Goldcoast bg 2009
1055/2
suino
Goldcoast pd 2008
11156
Goldcoast rm 2008
14179/12
Goldcoast rm 2008
2742/14
suino
31520/3
Goldcoast pd 2008
Goldcoast rm 2008
S.Goldcoast Hun.
Strains from pig production chain
Strains from Italian outbreak
Strains from Hungary outbreak
38431
suino
Goldcoast pg 2009
41437/3
suino
Goldcoast pg 2009
2010
suino
Goldcoast pd 2008
PFGE-XbaI
100
98
96
94
92
90
88
86
84
82
80
PFGE-Xba I
Key
Sourc e and notes
R-type
Isolati on date
Country
11156P
human
susc ept
24/04/08
IT
14179/12P
human
susc ept
15/05/08
IT
1444/09_SP
pig
27/04/09
ES
1055/2P
pork
Suscept
2008
IT
2742/14P
pork
S
2008
IT
91849
human
Suscept
11/11/08
IT
93571
HU -03_Hun
human
44 human st rains w ith the s ame profi le
susc ept
SuSxt
06/03/09
10/02/09
IT
HU N
2353/09_SP
human
22/06/09
ES
99765
human
I:T*
22/01/10
IT
38431P
pork
susc ept
2009
IT
H094200443_UK
trav el to spai n
susc ept
02/10/09
UK
41437/3P
pork
susc ept
2009
IT
94883
human
Suscept
20/06/09
IT
95301
human
Suscept
16/06/09
IT
95586
human
Suscept
01/07/09
IT
96270
human
Suscept
16/07/09
IT
96671
95584
human
human
Suscept
Suscept
02/10/09
23/06/09
IT
IT
98845
human
Suscept
06/10/09
IT
95155
human
Suscept
03/07/09
IT
108/10/FC P
human
susc ept*
15/02/09
IT
susc ept
30/03/09
UK
9 7.8
9 5.0
94 .3
9 3.1
99 .0
9 0.0
9 5.4
H091500285_UK
88 .5
Cluster
A
>87%
96 .3
2580/09_SP
5 human s trains w ith the same profile
14/07/09
ES
5485/09_SP
row beef
20/08/08
ES
3866/09_SP
human
11/09/09
ES
H094260571_UK
susc ept
30/09/09
UK
H094660253_UK
susc ept
06/11/09
UK
ACS SuT
13/10/09
HU N
ES
IT
8 7.6
92 .9
9 0.5
86 .9
HU -35_Hun
human
0920/09_SP
2010P
human
pork
ASSuTK
17/03/09
2008
93206
human
I.: T
14/02/09
IT
471/3P
pork
ASSuT
2008
IT
0909M59959_D K
trav el to spai n
susc ept
15/09/09
UK
95 .2
DK
96 .3
H093900419_UK
93 .9
8 6.4
HU -N K1_Hun
human
Suscept
15/10/09
HU N
H094620545_UK
trav el to spai n
susc ept
04/11/09
UK
H093820446_UK
trav el to spai n
susc ept
10/09/09
UK
H094620484_UK
trav el to spai n
susc ept
04/11/09
UK
0909H 37977_DK
trav el to spai n
DK
0909M60797_D K
trav el to spai n
DK
0910F46870_D K
0910T40030_D K
trav el to spai n
trav el to spai n
DK
DK
0910T41551_D K
trav el to spai n
HU -19_Hun
human
HU -31_Hun
human
H093880723_UK
trav el to spai n
0244/09_SP
human
H093940694_UK
trav el to spai n
H094220667_UK
DK
27/08/09
HU N
SuSxt
14/09/09
HU N
susc ept
08/09/09
UK
04/02/09
ES
susc ept
16/09/09
UK
trav el to spai n
susc ept
07/09/09
UK
H094400328_UK
trav el to spai n
susc ept
14/10/09
UK
H094620483_UK
trav el to spai n
susc ept
03/11/09
UK
susc ept
02/08/09
UK
9 7.8
92 .9
Cluster B
>90%
82 .2
H093280351_UK
9 0.0
7 9.0
9 5.7
H094220658_UK
H093700694_UK
trav el to spai n
trav el to spai n
susc ept
susc ept
06/10/09
07/09/09
UK
UK
H094420530_UK
trav el to spai n
susc ept
22/10/09
UK
H093780261_UK
trav el to spai n
ACS SuTSpFu
11/09/09
UK
susc ept
29/09/09
UK
SuSxt*
10/02/09
HU N
H094020650_UK
HU 21_H un
human
4895/09_SP
human
13/11/08
ES
HU -20_Hun
human
25/08/09
HU N
1313/09_SP
human limph node bi opsy
06/01/09
ES
Convegno bioMèrieux
Sicurezza microbiologica degli alimenti:
l’evoluzione tecnologica al servizio del Laboratorio.
Il sistema TEMPO nei Lab. di controllo ufficiale.
Importanza della validazione delle prove,
con esempi per i prodotti ittici freschi e conservati.
Claudio Pellegrino, Patrizia Guerci-Lena
Milano 11/11/2010
IZS di Genova
Laboratori ufficiali di controllo
I Laboratori ufficiali per i controlli alimentari,
individuati nell’art 12 del Reg.CE 882/2004 ,
devono operare conformemente alla norma EN ISO/IEC
17025 e come tali devono esser valutati da Ente terzo e le
loro prove accreditate .
Sistema rapido di allerta RASFF
Inoltre i Laboratori che operano a tutela degli scambi
internazionali di alimenti devono esser inseriti nel
sistema di allerta rapida europea RASFF, istituito dal
Reg. CE 178/2002
Esigenze dei Lab. internazionali di controllo
1)
N° elevato di campioni
2)
Riduzione dei tempi di risposta (spese di stoccaggio containers )
3)
Riduzione delle manualità e (automatizzazione prove)
contenimento n° operatori
(n° aliquote x container da 10-25 ton.)
necessità di utilizzo di metodi rapidi alternativi
a condizione che
si mantenga la stessa affidabilità per le prove.
Metodi alternativi
Nel campo della ricerca di batteri indicatori d’igiene i
metodi alternativi semi e/o automatici si sono evoluti con
le seguenti tecnologie:
Semina in microgoccia, Petrifilm, Spiralsystem,
Bioluminescenza, TEMPO.
Sistema TEMPO
Il sistema TEMPO si basa su
un metodo MPN esteso e semiautomatico che utilizza :
16 pozzetti x 3 diluizioni scalari logaritmiche x totale 48 pozzetti e
lettura automatica con lampada a fluorescenza.
In un sistema che usa un numero quadruplo di pozzetti, rispetto
al metodo tradizionale MPN, la incertezza di misura della prova
si dimezza (cresce in funz. √ n° pozzetti)
Il sistema TEMPO è quindi potenzialmente più preciso.
Il Reg. 2073 ed i metodi alternativi
Il Reg. CE 2073/2005, che ha individuato i criteri
microbiologici di salubrità ed igienicità, degli alimenti
prevede all’art. 5 che i metodi alternativi a quelli
standard possano esser utilizzati dai Lab. a condizione
che siano validati vs. i metodi ISO, secondo le norme
internazionali e siano accreditati.
Prodotti ittici e importazioni.
I prodotti ittici (pesci, crostacei e molluschi)
costituiscono la categoria di derrata alimentare
maggiormente importata nella U.E. specie dai Paesi
terzi emergenti, che non garantiscono con costanza la
loro salubrità ed igienicità.
(Cina, Bangladesh, Vietnam ecc.)
Evoluzione delle importazioni in Italia
per tipo prodotti e n° container
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
, P el
Lana
.n
pr od
i
r
lt
A
i
.
me st
m
o
c
on
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
a
pesc
la
l
e
ot ti d
Prod
Pelli
N° segnalazioni RASFF per tipo di prodotto 2009 e 2008
N° segnalazioni RASFF per tipo di prodotto. trimestri 2010
Validazione prove con TEMPO.
Al nostro Lab., che opera a supporto del PIF del porto di
Genova, i metodi rapidi TEMPO erano potenzialmente
interessanti per vari prodotti .
Tuttavia i lavori pubblicati con questo sistema sono ancora
pochi e non comprendono varie tipologie di matrici ittiche
importate nel nostro Paese.
Abbiamo deciso di validare alcune prove per indicatori di igiene
con prodotti ittici variamente conservati.
Campioni di validazione
Le nostre prove hanno riguardato un totale di 229
campioni naturalmente contaminati di cui 41 pesci, 16
crostacei e 32 molluschi.
Le tipologie dei prodotti sono risultate :
80 % congelati, 15 % freschi, 1% disidratati,
4% salinati/affumicati.
Metodi
Tutti i campioni sono stati esaminati in doppio
con metodo standard e metodoTEMPO.
Metodi standard
Total viable count
Total Coliform
E. coli:
EN ISO 4833-03
NF V08-050/99
EN ISO16649.2/01
___________________________________________________________________
PCA Medium
VRBL Medium
TBX agar Medium
Time 72h ± 3h
Time 24h ± 2h
Time 18-24h
Temp. 30°C ± 1°C
Temp. 30°C ± 1°C
Temp. 42°C ± 1°C
Metodi TEMPO
Total viable count
Total Coliform
E. coli
_________________________________________________
TVC Medium
TC Medium
EC Medium
Time 40 - 48 h
Time 22 – 27 h
Time 22 – 27 h
Temp. 30°C ± 1°C
Temp. 30°C ± 1°C
Temp. 37°C ± 1°C
Criteri di valutazione dei risultati
Tutti i risultati dei conteggi per entrambi i
metodi sono stati normalizzati in log.10.
Campioni “in range”.
La funzione di trasformazione log.10 non è
applicabile a risultati < 10, in quanto non può
esser attribuito un preciso valore al dato MPN.
Campioni “out of range”.
Concordanza e discordanza
Se la trasformazione log. dei dati ottenuti con
i due metodi risulta compresa tra log.10 1 e -1,
è possibile misurare una significatività vera e
i risultati sono considerati concordanti e utili.
Dati normalizzati log.10 < -1 e > 1 danno
origine a risultati discordanti e non utili.
Controlli di qualità : strumentazione e terreni.
1) Controllo performance lettura in fluorescenza
QC Card, Reader Check : 1 volta al mese
2) Controllo di efficienza dei terreni colturali
Ceppi titolati certificati HPA e Bioball : 3 - 4 mesi
QC Card Control per fluorescenza
Controllo di Efficienza terreni colturali “E”
Ceppi titolati e certificati : HPA e Bioball
Seminare 0,1 ml. della sospensione a103 ufc del ceppo titolato e
certificato in 3,9 ml. terreno TEMPO TVC e su piastra di PCA
Esempi risult. prove
Risultato TEMPO TVC
635 ufc/gr.
“E” =
------------------------------------------= ------N° colonie su terreno PCA X 10
505 0 ufc/gr.
“E” deve esser compreso tra 0,1 e 10 X TVC = 0,12
******************************************************
in TEMPO EC e su piastra di TBX
“E” deve esser compreso tra 0,01 e 10 X EC = 0,16
Controlli di qualità : Personale di Lab.
3) Controllo di ripetibilità stretta di Operatori Lab.
Trend pluriennale di “r”
4) Controllo di ripetibilità intermedia o
riproducibilità intraLaboratorio.
Trend pluriennale di “R”.
Controllo di ripetibilità stretta degli Operatori Lab.
(valore ripetibilità metodo TVC r = 0,53.)
Trend di ripetibilità "r"
TVC TEMPO
Oper. n° 1
0,2
0,18
Valori di "r" ra
0,18
0,16
0,15
0,14
0,12
0,1
0,1
0,1
0,08
0,06
0,04
0,04
0,03
0,02
0
Prove dal 2007 al 2010
Controllo di riproducibilità intralaboratorio
(valore riproducibilità metodo TVC r = 0,51)
Trend di riproducibilità "R" TVC Tempo
0,16
0,15
Valori di "R "R"
0,14
0,12
0,12
0,11
0,1
0,1
0,08
0,06
0,04
0,03
0,02
0,02
0
Prove negli anni 2007 - 2010
Controlli di qualità inter-Laboratorio
5) Prove di confronto esterne (Proficiency test ) Z-score
Campioni dei circuiti QMS e QMAS : 2 volte all’anno
6) Controllo di riproducibilità interLaboratorio.
Non effettuato per mancanza di Lab. disponibili
Performances : valori e significato dello Z-score
Lo Z-score esprime la performance del Lab., in
relazione alla variazione del proprio risultato rispetto
al valore medio calcolato sui risultati di tutti i
partecipanti al circuito.
Lo Z quantifica il numero di deviazioni standard dalla
media totale calcolata.
Z=
dato Lab. – media
---------------------dev. standard
/Z/ < 2
soddisfac.
2</Z/ <3 discutibile
/Z/ > 3
insoddisfac.
Z-score (TVC TEMPO · ) vs. ( PCA + )
Rounds trend 07-10.
1°Oper. Lab. rosso, 2° nero
Z-score (EC TEMPO · ) vs. ( TBX + )
Rounds trend 07-10.
1°Oper. Lab. rosso, 2° nero
Conclusioni : significatività e ripetibilità
delle prove di validazione
Nei prodotti ittici freschi e conservati,
i risultati delle prove per TVC, TC, EC
hanno evidenziato un livello di significatività
eccellente in raffronto ai metodi tradizionali ,
presentando inoltre dati ripetibili e riproducibili.
. e tempi di esecuzione
Conclusioni :performances
L’utilizzo del sistema TEMPO ha fornito
performances elevate nelle prove di confronto ed ha
evidenziato una sensibile riduzione di tempi di
preparazione (diluizioni e semine) e di lettura dei
campioni.
Incremento N° analisi a garanzia di sicurezza
Questo aspetto permette di aumentare i campioni
esaminabili nei lotti, con il medesimo personale,
fornendo un numero più ampio di risultati e di
conseguenza una maggior garanzia di sicurezza degli
alimenti esaminati.
Grazie per l’attenzione
Valutazione della crescita di Cronobacter spp in
alimenti in polvere per l'infanzia
ALFONSINA FIORE
ALESSANDRA VILMERCATI
Dipartimento Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Rep. Pericoli Microbiologi
ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’- Roma
SICUREZZA MICROBIOLOGICA DEGLI ALIMENTI:
L’EVOLUZIONE TECNOLOGICA AL SERVIZIO DEL LABORATORIO
M ilano, 11 novembre 2010
CRONOBACTER spp
(già Enterobacter sakazakii)
•
2008 Creazione del nuovo genere Cronobacter spp
include 5 specie
•
•
•
•
•
C. sakazakii
C. malonaticus
C. turicensis
C. muytjensii
C. dublinensis
COMMISSION REGULATION (EU) No 365/2010 of 28 April 2010
Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii)
Criteri microbiologici applicabili agli alimenti
Entrati in vigore in Italia e nel resto d’Europa il 5 Dicembre 2007, in
accordo con il Regolamento CEE n. 1441/2007
prevedono per il Cronobacter spp
l’assenza in 10 grammi di prodotto su di un totale di 30 campioni
analizzati (alimenti in polvere per l’infanzia ed alimenti in
polvere dietetici per neonati al di sotto dei 6 mesi aventi
particolari necessità mediche).
VEICOLO ALIMENTARE
SOGGETTI A RISCHIO
Adulti
Nati a termine
Soggetti compresi tra 0 e 12 mesi di vita
Nati pre-termine (a meno di 36 sett. di gestazione)
Nati con basso peso (< 2,5 kg )
Immunocompromessi
Nati da madri HIV positive
MANIFESTAZIONI CLINICHE
Cronobacter spp
Sepsi
Infezioni
nosocomiali
Enterocolite
necrotizzante
Meningite
Fattori che contribuiscono al rischio di infezione
Susce ttibilità del
paziente
Livello di
contaminazione
dell’alimento
Fattori di rischio
Velocità di crescita
del microrganismo
Te rmotolle ranz a del
microrganismo
PROVE SPERIMENTALI
1.
VALUTAZIONE DELLA CRESCITA DI CRONOBACTER SPP IN
ALIMENTI IN POLVERE PER L’INFANZIA
2.
VALUTAZIONE DELLA PERFORMANCE DEL CRONOBACTER
ENRICHMENT BROTH
3.
VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA’: CEB Vs BPW
1- VALUTAZIONE DELLA CRESCITA DI CRONOBACTER SPP IN
ALIMENTI IN POLVERE PER L’INFANZIA
IN FUNZIONE DI
COMPOSIZIONE
TEMPO E TEMPERATURA DI STOCCAGGIO
UTIL IZZANDO 4 TERRENI CROMOGENI
-latte in polvere per lattanti fino a 6 mesi
-semolino per lattanti e bambini oltre i 4
mesi
- idrolisato, alimento a base di soia
per lattanti fino a 6 mesi
•
MATRICI:
•
CEPPI BATTERICI : pool di 4 ceppi of Cronobacter spp (ATCC 12868, ATCC 29004,
ATCC BAA 894 and ATCC 29544)
ALLESTIMENTO PROVE SPERIMENTALI
Matrice
ricostituita
3,6 ufc/ml
0,036 ufc/ml
0,0036ufc/ml
3,6 ufc/ml
0,036ufc/ml
0,0036ufc/ml
3,6 ufc/ml
0,036ufc/ml
0,0036ufc/ml
4°C
4°C
4°C
10°C
10°C
10°C
TA
TA
TA
Monitoraggio della crescita di Cronobacter spp
•
al momento dell’inoculo (D0)
•
dopo 2h, 24h, 48h, 72h
•
semina per spatolamento su 4 terreni cromogeni
disponibili in commercio:
1.
2.
3.
4.
ESIA (Biolife)
Compass agar (Biokar Diagnostic)
RAPID sakazakii (BIO-RAD)
Agar chromoID Sakazakii-ESPM (Biomerieux)
Tab. 1 Variazione della popolazione 1 di Cronobacter spp in un campione di IDROL ISATO contaminato
sperimentalmente (3 diverse concentrazioni) e convervato a TEMPERATURA AMBI ENTE
ufc/ml a
DO^
ufc/ml dopo
2h
ufc/ml dopo
24h
ufc/ml dopo
48h
ufc/ml dopo
72h
3,6 ufc/ml
2
2
2,1x108
1,7x109
5.0x109
0,036 ufc/ml
neg
neg
9,0x105
6,4x108
6,5x109
0,0036 ufc/ml
neg
neg
neg
neg
neg
Livello iniziale di
contaminazione
^D0: valutazione al momento dell’ inoculo;
1 Ogni risultato è la meddia di tre esperimenti usando 4 terreni cromogeni
Tab. 2 Variazione della popolazione 1 di Cronobacter spp in un campione di IDROL ISATO contaminato
sperimentalmente (3 diverse concentrazioni) e convervato a 10 °C
ufc/ml a
DO^
ufc/ml dopo
2h
ufc/ml dopo
24h
ufc/ml dopo
48h
ufc/ml dopo
72h
3,6 cfu/ml
4
4
10
137
1900
0,036 cfu/ml
neg
neg
neg
neg
32
0,0036 cfu/ml
neg
neg
neg
neg
neg
Livello iniziale di
contaminazione
^D0: valutazione al momento dell’ inoculo;
1 Ogni risultato è la meddia di tre esperimenti usando 4 terreni cromogeni
Tab. 3 Variazione della popolazione 1 di Cronobacter spp in un campione di IDROL ISATO contaminato
sperimentalmente (3 diverse concentrazioni) e convervato a 4 °C
ufc/ml a
DO^
ufc/ml dopo
2h
ufc/ml dopo
24h
ufc/ml dopo
48h
ufc/ml dopo
72h
3,6 cfu/ml
2
2
2
2
2
0,036 cfu/ml
neg
neg
neg
neg
neg
0,0036 cfu/ml
neg
neg
neg
neg
neg
Livello iniziale di
contaminazione
D0: valutazione al momento dell’ inoculo;
1 Ogni risultato è la meddia di tre esperimenti usando 4 terreni cromogeni
2 - Valutazione della performance del Cronobacter
Enrichment Broth (CEB)
vs Buffered Peptone Water (BPW)
•
Matrice latte in polvere 10g
•
1.
Ceppi batterici:
Ceppo E 632 concentrazione iniziale: 4,1 ufc/ml
2.
pool di 4 ceppi Cronobacter spp ATCC concentrazione iniziale: 4,1 ufc/ml
•
•
•
Diluenti
BPW
CEB
•
Condizioni di incubazione: 37 °C x 18 +/- 2h
•
Conta batterica su terreno cromogeno dopo allestimento delle opportune
diluizioni scalari
90ml
90 ml
RISULTATI 1
CAMPIONE
Latte in polve re
+
E632 (conc. iniziale 4,1ufc/ml)
DILUENTI
BPW
CEB
6,0 x104 ufc/ml
6,7x108 ufc/ml
RISULTATI 2
CAMPIONE
Latte in polve re
+
Pool (conc. iniziale
4,1ufc/ml)
DILUENTI
BPW
CEB
4,1 x105 ufc/ml
5,6 x108 ufc/ml
3 - VALUTAZIONE DELLA SPECIFICITA’:
CEB Vs BPW
•
Matrice latte in polvere 10g
•
•
•
•
Ceppi batterici:
pool di 4 ceppi Cronobacter spp (ATCC 12868, ATCC 29004, ATCC BAA 894, ATCC 29544)
S. aureus ATCC 25923
E. coli ATCC 25922
Per
•
•
•
ogni ceppo sono state considerate 3 concentrazioni finali:
pool di 4 ceppi Cronobacter spp: 3,2 ufc/ml – 0,32 ufc/ml – 0,032 ufc/ml
S. aureus 1,0 ufc/ml – 0,1 ufc/ml – 0,01 ufc/ml
E. coli 2,6 ufc/ml – 0,26 ufc/ml – 0,026 ufc/ml
•
•
•
Diluenti
BPW
CEB
•
Condizioni di incubazione: 37 °C x 18 +/- 2h
•
Valutazione della crescita
90ml
90 ml
su terreno cromogeno
TAB. 4 Risultati relativi alle prove sperimentali condotte utilizzando BPW come diluente
(metodo ISO)
Livello di contaminazione iniziale
Risultati semina diretta
su terreno cromogeno
Risultati semina dopo
arricchimento in mLST
1
Pool 0,032 ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
2
Pool 0,032ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
E coli 0,026ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
S. aureus 0,01ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
3
Pool 0,32ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
4
Pool 0,32ufc/ml
Crescita debole
Crescita debole
E coli 2,6ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
S. aureus 1,0ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
5
Pool 3,2ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
6
Pool 3,2ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
E coli 0,26ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
S. aureus 0,1ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
TAB. 5 Risultati relativi alle prove sperimentali condotte utilizzando CEB come diluente
Livello di contaminazione iniziale
Risultati semina diretta
su terreno cromogeno
Risultati semina dopo
arricchimento in mLST
10
Pool 0,032 ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
7
Pool 0,032ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
E coli 0,026ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
S. aureus 0,01ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
8
Pool 0,32ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
11
Pool 0,32ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
E coli 2,6ufc/ml
Crescita debole
Crescita debole
S. aureus 1,0ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
9
Pool 3,2ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
12
Pool 3,2ufc/ml
Crescita buona
Crescita buona
E coli 0,26ufc/ml
Crescita debole
Crescita debole
S. aureus 0,1ufc/ml
Crescita assente
Crescita assente
SVILUPPI FUTURI
• Confronto tra metodi rapidi per la ricerca di Cronobacter spp
• Valutazione della crescita di Cronobacter spp in presenza di
batteri lattici produttori di batteriocine
CONVEGNO
Sicurezza Microbiologica degli Alimenti:
l’evoluzione microbiologica al servizio del laboratorio
Milano 11 novembre 2010
“Virus enterici in diverse matrici alimentari:
l'esperienza del progetto Europeo BIOTRACER
per la determinazione del virus dell’epatite A e dei norovirus
in acque (minerali) imbottigliate”.
Simona Di Pasquale
[email protected]
Dip. Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
Virus Enterici
120 differenti specie
I virus si presentano come particelle inerti sferiche con diametro che variano:
da 25-35 nm (Picornavirus-Epatite A, e Calicivirus-Norovirus) a 75 nm (Rotavirus)
I virus presentano una superficie esterna costituita da un rivestimento che protegge il filamento di RNA.
Classificazione dei Virus Enterici trasmessi con gli alimenti e le acque
Virus che provocano gastroenteriti:
Calicivirus enterici umani: Norovirus e i Saporovirus
Virus dell'epatite a trasmissione oro-fecale:
Virus dell’epatite A (HAV)
Virus dell’epatite E (HEV);
Virus che replicano nell'intestino umano ma provocano patologie in altri organi, quali il
sistema nervoso centrale o il fegato
Enterovirus
Alimenti che veicolano i virus enterici
Acqua (minerale) imbottigliata
Acqua (minerale) imbottigliata
La crescente domanda mondiale di acqua in bottiglia ha comportato il consumo totale di 154
miliardi di litri nel 2004 (Gleick, 2008).
Anche se epidemie virali legate all’acqua in bottiglia non sono state mai documentate, è
stato però segnalato che i livelli di carica batterica spesso risultano più elevati di quelli relativi
all’acqua di rubinetto
La presenza di microrganismi patogeni nelle aree di captazione idrica rappresenta un serio
problema per la salute del consumatore, per questa ragione monitoraggi microbiologici delle
acque vengono effettuati sia alla fonte che dopo l’imbottigliamento.
Nelle analisi di routine, però, la determinazione di virus enterici non viene ancora effettuata
perché non prevista nella normativa vigente.
Acque Minerali
Circ. Min. n. 17
del 13/09/1991
Acque Destinate al consumo
Umano Dec. Leg 2 febb.
2001 n.31
Per i virus enterici non sono previsti a causa della mancata disponibilità di
metodi analitici di riferimento
Ma……….
Gruppo di lavoro: CEN/TC275 WG6/TAG 4 “Detection of Viruses in food"
Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for detection of
hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. Version 8 February 2010
Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for
detection of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.
Version 8 February 2010
Acque (minerali)
imbottigliate
Concentrazione delle
particelle virali con
Filtrazione/Ultrafiltrazione
Prodotti Vegetali
Estrazione e Concentrazione
delle particelle virali con
TGBE/PEG
Molluschi
Estrazione delle
particelle virali con
Proteinasi k
Estrazione dell’RNA virale mediante silica magnetica (Biomerieux)
Determinazione del genoma virale mediante Real-Time rt-PCR
Progetto Europeo BIOTRACER
Obiettivo principale era quello di implementare sia le conoscenze sul comportamento
microbico che lo sviluppo di metodi rapidi per fronteggiare eventi di contaminazione
Nell’ambito del BIOTRACER c’era un’area di ricerca (RA5) che riguardava principalmente la
determinazione di virus enterici in acque imbottigliate, al fine di sviluppare metodologie
appropriate da utilizzare in caso di sospette attività bioterroristiche che potrebbero
coinvolgere le risorse idriche (compresa l'acqua in bottiglia).
Le metodologie sviluppate potranno essere utilizzate dalle autorità di controllo per le analisi
di routine, mentre i dati ottenuti sulla presenza e diffusione dei virus nella catena di
produzione dell’acqua in bottiglia potranno essere utilizzati per definire un’eventuale
scenario di contaminazione.
Progetto Europeo BIOTRACER
Step I:
Sviluppare nuovi metodi per il recupero dei virus enterici (HAV e calicivirus) da
acqua (minerale) imbottigliata (1.5 L PET) contaminata sperimentalmente.
Step II:
Valutare l’efficienza dei nuovi metodi ciascuno confrontato con il metodo di
riferimento, per la concentrazione delle particelle virali da acqua (minerale)
imbottigliata (1.5 L PET) contaminata sperimentalmente da HAV, Norovirus GI,
Norovirus GII e Calicivirus Felino.
Step III: effettuare uno studio collaborativo tra cinque laboratori europei al fine di validare il
metodo più promettente per il recupero dei virus enterici da acqua in bottiglia. I
criteri di validazione sono stati:
- limite di rilevazione,
- percentuale di recupero,
- riproducibilità,
- rapidità e semplicità.
Step I: Sviluppo di nuovi metodi
U. O. 1 Istituto Nazionale per
L‘alimentazione-Danimarca
U.O. 2 ISS
U.O. 3 ANSES
Ex AFSSA
U.O. 4 Università di
Lubiana, Slovenia
Ruolo di coordinamento e pianificazione del progetto
Step II: Valutazione dell’efficienza dei nuovi metodi ciascuno confrontato con il
metodo di riferimento (proposta metodo CEN)
Metodo A
Metodo di Riferimento
Ultracentrifugation
QIAamp
 RNA kit (Qiagen)
Ultrafiltration
NucliSens MiniMAG
(BioMerieux) Gilgen et al.
(1997) modificato
Di Pasquale et al., 2010
Metodo B
NucliSens easyMAG
platform (BioMerieux)
Perelle et al., 2009
Metodo C
8-mL Convective
Interaction Media (CIM)
QA tube monolithic column
QIAamp
 RNA kit (Qiagen)
Kovac et al., 2009
Metodo di Riferimento
Ultrafiltration
NucliSens MiniMAG
(BioMerieux)
Metodo di Riferimento
Ultrafiltration
NucliSens
MiniMAG(BioMerieux)
Step II:
Per ciascun metodo 5 bottiglie di acqua minerale “Monte Cimone” (1.5L) venivano contaminate ciascuna
con 100 µL di diluizioni scalari di HAV e FCV (range 10 a 105 TCID50).
Metodo Riferimento
Metodo A
Metodo B
Concentrazione mediante filtrazione utilizzando membrane cariche
positivamente
Metodo C
Concentrazione
mediante CIM
Eluizione con (Tris) Glicine Beef Extract Buffer
Eluizione con PBS
Ultrafiltrazione a
4000xg per 15 min
Ultracentrifugazione
a 165 000xg per 4 h
Ultracentrifugazione
a 85 750xg per 1 h
Estrazione RNA con
NucliSens MiniMAG
(BioMerieux)
Estrazione RNA con
QIAamp RNA kit
(Qiagen)
Estrazione RNA con
NucliSens easyMAG
platform (BioMerieux)
Real-Time rt-PCR
Estrazione RNA con
QIAamp RNA kit
(Qiagen)
Risultati Step II:
LOD50 Metodo A
LOD50 Metodo C
Metodo D
LOD50 Metodo C
LOD50 Metodo B
LOD50 Metodo B
LOD50 Metodo A
Metodo A
LOD per HAV: 3607 TCID 50
LOD per FCV: 9 TCID 50
Recupero di
HAV/FCV: 0.3 % / 0.5 %
Metodo B
LOD per HAV: 361 TCID50
LOD per FCV: 9 TCID50
Recupero di
HAV/FCV: 32 % / 25 %
Metodo C
LOD per HAV: 45 TCID50
LOD per FCV: 9 TCID 50
Recupero di
HAV/FCV: 34 % / 6 %
Tutti i metodi esaminati (A, B, C) sono stati, in misura diversa, più efficienti rispetto al metodo di riferimento
(Metodo D) per recuperare HAV e FCV.
Tutti i metodi esaminati (A, B, C, ) sono stati in grado di determinare la conc. dell’FCV pari a 9 TCID50/1.5L
L’ultracentrifugazione (A) rispetto ai metodi CIM (C) e all’estrazione diretta dei virus dalla membrana (B), ha
dimostrato costantemente valori superiori di Ct per i livelli rilevati sia di FCV che di HAV. Ciò ha determinato
una minore percentuale dei recuperi per FCV e HAV e un limite di sensibilità più alto rispetto al metodo C e B
Risultati Step II:
Il metodo C pur raggiungendo un LOD 50 inferiore di quasi un log10 rispetto al metodo B,
per il rilevamento dell’ HAV, non è stato scelto per lo studio collaborativo in quanto:
- il metodo B ha mostrato valori di Ct più bassi sia per il recupero dell’HAV che
dell’FCV rispetto al metodo di riferimento, e rispetto agli altri metodi (A, C).
- inoltre il metodo B è stato in grado di recuperare il 20% in più per l’FCV rispetto sia
al metodo di riferimento che e agli altri metodi (A, C);
Metodo B richiede solo alcune fasi di manipolazione dopo il processo di filtrazione:
- l'estrazione diretta RNA virale dalla membrana;
- applicazione di sistemi (semi-) automatici per estrazione di RNA virale.
Inoltre, durante questa valutazione, abbiamo dimostrato che il metodo B (NucliSENS
easyMAG) può essere sostituito dal NucliSENS MiniMag, procedura meno costoso,
senza compromettere l'efficienza dell’estrazione di RNA.
Per queste ragioni, il metodo B è stato scelto per lo studio collaborativo tra cinque
laboratori europei al fine di valutare la sua robustezza e facilità d'uso .
Step III: studio collaborativo tra cinque laboratori europei
Contaminazione di acqua minerale “Monte Cimone” in bottiglie di PET da 1.5 L
(fornita da COOP, Bologna).
6 bottiglie di acqua minerale venivano contaminate ciascuna con 100 µ L di diluizioni scalari di:
HAV (ATCC H M175/18f) (range 1 a 10 5 TCID50)
Feline Caliciviruses “FCV” (VR-782, strain F9) (range 1 a 10 5 TCID50)
NoV GI.4.
(range 10 a 10 6 TCID50)
NoV GII.4
(range 10 a 10 6TCID50)
Filtrazione di acqua minerale contaminata
Determinazione dei virus enterici con il metodo B
La membrana veniva incubata direttamente per 20 min in una piastra petri contenente 3 mL di
Lisi Buffer (BioMerieux).
Il lisato ottenuto veniva sottoposto dal:
Laboratorio n.1
Laboratorio n.2
Laboratorio n.3
Laboratorio n.4
Laboratorio n.5
sistema automatico NucliSens easyMAG platform (BioMerieux)
sistema semi-automatico NucliSens miniMAG (BioMerieux)
sistema semi-automatico NucliSens miniMAG
sistema semi-automatico NucliSens miniMAG
sistema semi-automatico NucliSens miniMAG
Per ciascun virus allestimento di curve standard a partire da soluzioni virali
Risultati Step III: I dati ottenuti dallo studio collaborativo mostrano che il metodo B ha:
buona efficienza di estrazione;
buon recupero dell’ RNA virale dal 34% al 61%
4 / 5 Lab
1 / 5 Lab
1 / 5 Lab
Media LOD: 211 TCID 50
Slope : -3.17±
± 0.20
2
R 0.98 ± 0.03
Recupero: 51 %
Media LOD: 66 TCID50 valore sottostimato
Slope : -3.28±
± 0.65
R2 0.97 ± 0.04
Recupero: 34 %
Solo 2 Lab
Media LOD: 9 URT-PCR valore sottostimato
Slope : -3.27±
± 0.07
R2 0.99 ± 0.00
Recupero: 61 %
Media LOD: 286 URT-PCR
Slope : -3.27±
± 0.07
2
R 0.99 ± 0.01
Recupero: 35 %
Conclusioni
Il migliore recupero virale da parte del metodo C e B rispetto al metodo A e metodo di
riferimento è dovuto all’eliminazione della fase di eluizione con il tampone (T)GBE. Questo
step è stato messo in evidenza come punto critico dalla U.O.dell‘ISS nella procedura di
concentrazione (Di Pasquale et al. 2010A) perché non in grado di eluire completamente le
particelle virali dalla membrana causando una considerevole perdita di virus.
Metodo B richiede solo alcune fasi di manipolazione dopo il processo di filtrazione e
l'estrazione dell’RNA virale avviene direttamente sulla membrana riducendo notevolmente la
perdita dell’RNA virale.
Una variazione del LOD 50 e della percentuale di recuperi per quanto riguarda l’HAV, FCV e
NoV GII sono stati ottenuti tra i laboratori, nonostante la semplicità del metodo B ,
l’armonizzazione del campione costituito da bottiglie di acqua minerale, stesso virus
distribuito alle U.O. e stessi reagenti. Questa osservazione enfatizza la necessità di
standardizzare i controlli positivi.
Conclusioni
Nel presente studio, le soluzioni virali di HAV e FCV utilizzate per l’inoculo sono state
espresse come unità di virus infettanti mentre le soluzioni virali di NoV GGI e GGII sono
state espresse come genomi virali ( RT-PCRU/1.5 L). Vi è una mancanza di correlazione
tra la quantità di virus infettivo e genomi virali nelle soluzioni virali di virus di HAV (Hewitt e
Greening, 2006) e FCV (Gassillou det al., 2003),dove la presenza di particelle virali non
infettanti si tradurrà in maggiore concentrazione in termini di genoma virale rispetto al titolo
virale
In conclusione i dati ottenuti dallo studio collaborativo dimostrano che il metodo B ha una
buona efficienza di estrazione e un buon recupero dell’RNA virale, inoltre è riproducibile e
robusto.
Queste caratteristiche possono essere utile per l’analisi di routine nei laboratori di
virologia che analizzano acqua (minerale) imbottigliata, in quanto si può ridurre al minimo il
rischio di contaminazione crociata tra campioni.
Prospettive future
Applicazione del metodo su altri tipi di acque minerali in bottiglia al fine di valutare
come le diverse composizioni possono influenzare le prestazioni del metodo.
Applicazione del metodo a campioni d’acqua (minerale) imbottigliati naturalmente
contaminati.
Applicazione del metodo anche ad acque potabili e di irrigazione.
Ringraziamenti
Jeffrey Hoorfar
Katerina Kovac
Anna Charlotte Schultz
Peter Raspor
Sylvie Perelle
Martino Barbanera
Patrick Fach
Sonia Scaramagli
Mara Paniconi
Bruna Auricchio
Dario De Medici
VALUTAZIONE DI
METODICHE ALTERNATIVE
PER IL RILEVAMENTO DI
VTEC O157 IN ALIMENTI
Dott.ssa Claudia Picozzi
Dott.
DiSTAM
RICERCA E STUDIO DI ESCHERICHIA COLI
VEROTOSSICI
Progetto PRIN2007 (Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale)
MINISTERO DELL’UNIVERSITÀ E DELLA RICERCA
Milano: latte di capra crudo e filtri di mungitura
Parma: latte vaccino crudo
Bologna: campioni prelevati da macelli e stalle
Padova: latte vaccino crudo, colostro e latte di bufala
Sassari: campioni prelevati da macelli e da stalle di ovini
ESCHERICHIA COLI
Microflora dell’intestino dell’uomo e degli animali a sangue
caldo
Mantenimento della fisiologia intestinale
Gram negativi, forma di bastoncini, mobili o non mobili
Anaerobi facoltativi, sono in grado di utilizzare carbonio e azoto
come fonti di energia
Optimum temperatura: 37°C; neutrofilo
La maggior parte dei ceppi di E. coli non è dannosa
La classificazione sierologica in base al tipo di antigene:
somatico (O), capsulare (K) e flagellare (H)
ESCHERICHIA COLI PATOGENI
Kaper et al., 2004. Nature Reviews Microbiology
ESCHERICHIA COLI VEROTOSSICI
(VTEC)
Potenti tossine attive sulle cellule Vero (VT1 e VT2 e
varianti)
Nell’uomo i recettori funzionali si trovano nelle cellule
del tessuto renale, nei linfociti, negli eritrociti e nelle
cellule endoteliali
Patologie: HC e HUS
Più di 100.000 casi di infezione all’anno dovuti al
consumo di alimenti contaminati
ATTACHING AND EFFACING
• Intima aderenza (attaching) tra il batterio e cellule epiteliali
• L’intimina, codificata dal gene eae, determina l’accumulo di microfilamenti
di actina
•Distruzione (effacing) dei microvilli intestinali
IL LATTE DI CAPRA
crescente valorizzazione del settore
capacità dell’animale di adattarsi a condizioni climatiche e ad
ambienti mutevoli
oltre l’80% della popolazione caprina in Asia e in Africa
in Europa, Oceania, Nord e Sud America la produzione lattiero
casearia da capre è soprattutto un’operazione commerciale
composizione estremamente variabile (lattosio 4,1%)
dimensione dei globuli di grasso inferiore rispetto al latte
vaccino(∼80% <5µm)
elevata proporzione di acidi grassi a media catena (C6:0, C8:0,
C10:0)
bassi livelli di αS1-caseina
Silanikove et al., 2010. Small Ruminant Research
PIANO SPERIMENTALE
Campioni di
latte e filtri
di mungitura
Prearricchimento campioni
16-24 ore a 41,5°C ± 1°C
VIDAS® UP E. coli O157
(including H7)
Estrazione del DNA
Determinazione di
E. coli Verotossici
con tecnica PCR
Isolamento di colonie
dai campioni positivi
Caratterizzazione
isolati attraverso
Multiplex PCR
VIDAS®UP E. COLI O157 (INCLUDING H7) TEST
(ECPT)
Tamponi di lavaggio
Coniugat o
Campione
Diluente
(Risciacquo)
Substr ato
0
45
nm
PIANO DI CAMPIONAMENTO
99 campioni di latte
181 campioni
82 filtri di mungitura
acqua peptonata tamponata +
vancomicina (8mg/l) + cefixime
(0,05mg/l) + cefsulodina (10mg/l) (VCC)
pre-riscaldata a 41,5 ± 1°C
16-24ore a 41,5 ± 1°C
VIDAS®UP
181 arricchimenti
6 positivi
(3.3%)
5 filtri
1 latte
(nessuna corrispondenza con i filtri)
PIANO SPERIMENTALE
Campioni di
latte e filtri
di mungitura
Prearricchimento campioni
16-24 ore a 41,5°C ± 1°C
VIDAS® UP E. coli O157
(including H7)
Estrazione del DNA
Determinazione di
E. coli Verotossici
con tecnica PCR
Isolamento di colonie
dai campioni positivi
Caratterizzazione
isolati attraverso
Multiplex PCR
AMPLIFICAZIONE PCR
181 arricchimenti
Primer
Sequenza (5’-3’)
MK1
TTT ACC TTA GAC TTC TCG AC
MK2
CAC ATA TAA ATT ATT TCG CTC
M
Dimensione
amplificato
224-227 bp
M
230 bp
Karch H. & Meyer T. 1989 Journal of Clinical Microbiology
RISULTATI APPLICAZIONE METODICHE
ALTERNATIVE
Totale
campioni
analizzati
Campioni di
latte di
capra
Campioni di
filtro di
mungitura
181
Totale
campioni
positivi
21
99
Campioni di
latte
positivi
3
82
Campioni di
filtro
positivi
18
Incidenza: 11,6%
Positivi al
VIDAS®UP
Positivi all’analisi
PCR
6
20
PIANO SPERIMENTALE
Campioni di
latte e filtri
di mungitura
Prearricchimento campioni
16-24 ore a 41,5°C ± 1°C
VIDAS® UP E. coli O157
(including H7)
Estrazione del DNA
Determinazione di
E. coli Verotossici
con tecnica PCR
Isolamento di colonie
dai campioni positivi
Caratterizzazione
isolati attraverso
Multiplex PCR
MULTIPLEX PCR
Isolamento colonie
Estrazione DNA
MULTIPLEX PCR
M
M
779
bp
614
bp
M
M
890
bp
779
bp
614
bp
CONCLUSIONI
La metodica VIDAS® UP vista l’elevata sensibilità, la sicurezza d’uso e
la velocità di esecuzione si è dimostrata una valida procedura di screening
per l’identificazione di E. coli O157
La tecnica PCR si è dimostrata valida per l’identificazione dei ceppi
VTEC
La Multiplex PCR ha permesso di ottenere maggiori informazioni sulla
presenza di geni che codificano per l’intimina e per le verocitotossine
La capra è un importante serbatoio naturale di VTEC
Il consumo di latte crudo di capra e i prodotti ottenuti da latte crudo
sono una possibile fonte di rischio per la salute del consumatore
E’ importante sottoporre in misura sempre maggiore anche questo
prodotto alla determinazione di VTEC e nello specifico di E. coli O157,
secondo il Regolamento CE 1441/2007