coloranti - Estrazione solido liquido
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coloranti - Estrazione solido liquido
ALIMENTARI AROMI - ADDITIVI - SEMILAVORATI Poste Italiane spa • Sped. in A.P. - D.L.353/2003 (Conv. in L. 27/02/2004 no 46) art. 1, comma 1, DCB TO - N.4/2004 Luglio/Agosto 2004 anno 3 - numero 15 CHIRIOTTI EDITORI 10064 PINEROLO - Tel. 0121 393127 - Fax 0121 794480 - E-mail: [email protected] ISSN 1594 - 0543 INGREDIENTI COLORANTI SUMMARY Since ancient times, colours have been given particular meaning: black rapresents the pain, red the strength or the war, white the happiness or the noble ideals. The colours applications are various: as means for identification, for decorative and ornamental use, to improve the look of any alimentary or pharmaceutical products, for dying clothes and dresses.The colours can be extracted from mineral substances, from animals, from vegetables: for long time leaves and flowers have been the principal source for dyes. In this work a rapid and economic method for extraction is described: Naviglio Extractor. In particular, blue from Isatis tinctoria and yellow from Crocus sativus have been extracted and examined. SOMMARIO Fin dall’antichità ai colori era legata una particolare simbologia: il nero rappresentava il dolore, il rosso la forza o la guerra, il bianco la felicità o nobili ideali. L’uso dei colori è molto vario: esso serve come mezzo di identificazione, per scopi decorativi, ornamentali, per migliorare l’aspetto di alcuni prodotti sia in campo alimentare che farmaceutico, per colorare i diversi tessuti e capi di abbigliamento. I colori avevano origini diverse perché potevano essere estratti da sostanze minerali, da animali, ma soprattutto da vegetali: foglie e fiori hanno per lungo tempo costituito la fonte principale delle materie coloranti. Il nostro studio è stato rivolto alla ricerca di un metodo estrattivo rapido e poco costoso; a tal fine è stato utilizzato il Naviglio estrattore e sono stati esaminati i coloranti provenienti da due specie diverse: un colore blu ottenuto dall’Isatis tinctoria ed un colore giallo dal Crocus sativus. 14 L. FERRARA - D. MONTESANO Dipartimento di Chimica Farmaceutica e Tossicologica - Facoltà di Farmacia Università di Napoli Federico II - Via D. Montesano 49 - 80131 Napoli - Italia D. NAVIGLIO Dipartimento di Scienze degli Alimenti - Facoltà di Agraria - Università di Napoli Federico II Via Università 100 - 80065 Portici (Na) - Italia Estrazione e attività biologica di indaco e zafferano Extraction and biological activity of Isatis tinctoria and Crocus sativus Parole chiave: coloranti naturali, Isatis tinctoria, Crocus sativus Key words: natural dyes, Isatis tinctoria, Crocus sativus INTRODUZIONE Fino alla fine del 19° secolo il colore per i tessuti veniva ottenuto da prodotti naturali per la maggior parte di origine vegetale, piante, radici, licheni, ma anche da insetti e molluschi. Dalle centinaia di anni in cui sono stati usati coloranti naturali, solo una decina di questi hanno ancora un qualche uso pratico, a causa della instabilità del colore e l’elevato costo di estrazione. Fu Perkin, un allievo di Hofmann, che con la scoperta della Malveina nel 1856 diede origine alla “rivoluzione dei coloranti”, aprendo la via per la produzione sintetica. Tuttavia negli ultimi decenni due nuovi problemi hanno condizionato la crescita dell’industria chimica e coloristica in particolare: l’esponenziale crescita del costo dell’energia ed i vincoli tossicologici e ambientali. Come risultato, il numero dei tipi di coloranti prodotti ha subito un drastico ridimensionamento negli anni recenti e la strategia dei produttori è stata indirizzata Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto verso l’utilizzo di tecnologie a maggior risparmio energetico e con minore inquinamento. Si tende quindi a migliorare la resa e la purezza dei coloranti noti piuttosto che sintetizzare nuovi coloranti. In campo alimentare e farmaceutico i coloranti svolgono un’azione particolare perché, conferendo colore ad un alimento, incrementano l’interesse per il prodotto e ne aumentano la vendita; una pillola o una capsula colorata rendono l’assunzione meno sgradevole. PARTE SPERIMENTALE In questo lavoro viene riportata una metodica estrattiva semplice ed esauriente per due coloranti naturali, Indaco e Zafferano e l’identificazione analitica dei componenti principali Indigotina e Croceina. L’Indigofera tinctoria era la pianta anticamente usata per l’estrazione dell’indaco, ma in seguito alla produzione industriale dell’indaco la COLORANTI Fig. 1 - Isatis tinctoria L. - Guado. sua coltivazione è stata quasi del tutto abbandonata. Attualmente l’estrazione del blu d’indaco si effettua dall’Isatis tinctoria o Guado (fig. 1), pianta molto comune in Europa e in Italia coltivata estesamente in Umbria, appartenente alla famiglia delle Crucifere. In medicina popolare è stata impiegata nella cura delle anemie iposideremiche, nelle gravi debilitazioni fisiche con dimagrimento e come stimolante della crescita; per uso esterno veniva usata su varie dermatosi nonché per la cura e la cicatrizzazione di piaghe e ferite. Recenti studi hanno evidenziato attività farmacologiche degli estratti di Isatis tinctoria quali attività inibitoria sulle COX in particolare sulla COX-2 (1), attività insetticida, fungicida (2) attività nei confronti di particolari dermatofiti (3). L’estrazione è stata eseguita mediante il “Naviglio Estrattore” secondo la metodica precedentemente illustrata (4). Le varie fasi dell’estrazione sono riportate nello schema I. Nelle fig. 2 e 3 sono riportate le analisi HPLC ed EI-MS per l’identificazione del principio attivo. Crocus sativus (fig. 4) è una pianta erbacea, perenne i cui fiori sono molto preziosi perché dagli stimmi (fig. 5) si ricava lo zafferano. Da una superficie terriera di 15.000 m2 coltivata a zafferano si ottiene una produzione di 13 kg di prodotto finito,il cui costo è molto elevato perché tutte le operazioni culturali vengono eseguite rigorosamente a mano, dalla messa a dimora dei bulbi, alla raccolta dei fiori alla separazione degli stimmi dal fiore, al confezionamento. Le operazioni più delicate sono: 1) la sfioratura, cioè la separazione dal fiore degli stimmi, filamenti rossi che una volta essiccati costituiscono lo zafferano. È necessaria particolare attenzione durante questa fase, perché gli stimmi sono di colore rosso solo nella parte che fuoriesce dal calice, mentre la restante parte è di colore bianco e la sua presenza nel prodotto finito ne diminuisce la purezza ed il pregio. 2) L’altra operazione è la tostatura o essiccazione durante la quale i filamenti sono portati alla temperatura di 50°-55°C per un periodo di tempo determinato di volta in volta a seconda dell’umidità presente nel prodotto iniziale. Solo l’esperienza permette di valutare il giusto punto di essiccamento per garantire la miglior resa e la migliore conservabilità. Diverse sono le adulterazioni dello zafferano, sia con fiori provenienti dal Carthamus tinctorius o dall’Arnica montana che con fibre colorate in giallo mediante safranina o nitrofenoli (5) per cui è essenziale una standardizzazione e quantizzazione del maggior componente, la crocetina. Schema I - Estrazione e purificazione. Fig. 2 - Spettrometria di massa. Sorgente: Electron Impact - Temperatura della sorgente: 190°C Direct: 75 eV Indigo m/z = 262 Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto 15 COLORANTI Fig. 4 - Crocus sativus. in concentrazione del 15%. L’intenso colore è dovuto alla presenza di carotenoidi, in particolare esteri della crocetina, ma sono presenti anche α- e β-carotene. Lo zafferano noto presso i popoli orientali per le sue proprietà afrodisiache, veniva utilizzato sotto forma di infuso e di decotto per curare patologie quali asma, artrite, tosse, acne, malattie della pelle, infertilità. Esso mostra attività antiossidante (6, 7), antibatterica ed antivirale oltre che diuretica, ipoglicemizzante ed ipocolesterolemizzante. A dosi elevate agisce sul SNC come narcotico, è nefrotossico provoca allergie ed in alcuni casi è perfino letale (8). L’estrazione dello zafferano con il Naviglio Estrattore è riportato nello schema II. In fig. 6 e 7 sono riportate le analisi HPLC ed EI-MS per l’identificazione della crocetina. Fig. 3 - Analisi HPLC indaco. Colonna IB-Sil NH2 Sistema eluente: Esano/ MeCN 99:1 - λ = 220 nm Inject: 10 µL del campione solubilizzato in CH2Cl2 - RT Indigo = 2,04 MATERIALI E METODI L’interesse verso questa pianta risale al XIX secolo durante il quale molti ricercatori tra cui Vogel, Meyer, si interessarono all’estrazione del colore giallo e ne stabilirono la natura glicosidica. Lo zucchero è un componente naturale dello zafferano ed è presente - Naviglio Estrattore, Estrattore rapido solido-liquido. - HPLC Sunicom-Oy (Lab-Service) con detector UV/VIS Model 500 a lunghezza d’onda variabile corredato con Degasser ERCTT. - Spettrometro di massa a impatto di elettrone (EI-MS) Api 2000 Applied Biosystem. - Colonna IB-sil NH2 5 µm e Ultracarb 16 Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto C18 5 µm ODS(20) (Phenomenex, USA) 250 x 4,6 mm. - Solventi usati: Esano, Acetonitrile, Alcool Metilico, Acido Trifluoroacetico (TFA), Cloroformio, Etile acetato puri per HPLC (Sigma). Nelle fig. 1 e 2 sono riportati i risultati analitici relativi al campione di Isatis tinctoria. Il residuo proveniente dal processo estrattivo è stato solubilizzato in diclorometano e 10 µL sono stati iniettati in HPLC utilizzando una colonna IB-Sil NH con sistema eluen2 te: Esano/MeCN 99:1 per 20’ con un Fig. 5 - Zafferano. flusso di 1,5 mL/min rivelando alla λ = 220 nm. Il RT dell’indigo è 2,04 in accordo con i dati della letteratura (9). Nelle fig. 6 e 7 sono riportate le analisi eseguite sul campione di zafferano Schema II - Estrazione zafferano. COLORANTI Fig. 6 - HPLC Crocus sativus. Colonna Ultracarb C18 Phenomenex Sistema eluente a gradiente CH3OH: H2O/TFA0,1% (Da 30:70° a 50:50 in 3’; a 70:30 in 20’; a 30:70 in 30’) Flusso 1 mL/min - λ = 440 nm ottenuto dopo estrazione. Il cromatogramma ottenuto iniettando 10 µL di campione solubilizzato in metanolo in HPLC utilizzando una colonna Ultracarb C18 (Phenomenex) con sistema eluente a gradiente CH3OH: H2O/TFA 0,1% (da 30: 70° a 50:50 in 3’; a 70:30 in 20’; a 30:70 in 30’), flusso 1 mL/min, λ = 440 nm, ha evidenziato 4 picchi principali che sono stati sottoposti ad ulteriore indagine. Il picco con un RT 14,42 è stato identificato come dimetilcrocetina. La crocina è l’estere di-genziobiosilico dell’acido dicarbossilico crocetina. Questa è un caro- tenoide con sette doppi legami e quattro gruppi metilici nella catena laterale (fig. 8) ed è responsabile del caratteristico colore arancione dello zafferano. evidenziato spesso gli effetti nocivi per la nostra salute. Se pur lentamente si sta promuovendo un ritorno all’impiego di sostanze naturali, anche se dal punto di vista economico non risulta vantaggioso. Inoltre, la scoperta di interessanti attività farmacologiche ha dato nuovo impulso alla ricerca delle sostanze coloranti, anche se ha riproposto alcune problematiche legate all’estrazione quantitativa dei componenti principali ed alla loro successiva determinazione. Il metodo di estrazione impiegato permette di ottenere numerosi vantaggi, legati soprattutto alla buona riproducibilità dei risultati grazie alla possibilità di eseguire una standardizzazione della metodica estrattiva. Inoltre, confrontata con altre metodiche, sia a freddo che a caldo, permette una estrazione esaustiva in tempi molto più ridotti mostrando caratteristiche migliori dell’estratto ottenuto. I principi attivi non vengono degradati, e non si riscontrano perdite di molecole volatili in conseguenza della tecnica estrattiva in recipiente perfettamente chiuso. In conclusione volendo ipotizzare un’applicazione industriale di tale metodica, essa risulterebbe particolarmente vantaggiosa permettendo di eseguire un’analisi in tempi brevi, con notevole abbattimento dei costi di produzione. BIBLIOGRAFIA Il controllo sempre più attento sugli additivi utilizzati negli alimenti ed in particolare sui coloranti artificiali ha 1) Danz H., Stoyanova S., Wippich P., Battstrom A., Hamburger M. Planta Med. 67, 2001, p. 411-16. 2) Seifert K., Unger W. Insecticidal and fungicidal compounds from Isatis tinctoria. Z. Naturforsch. 49, 2000 p. 44-48. 3) Honda G., Tosiriruk V., Tabata M. Isolation and antidermatophytic tryptanthrin from indigo plant: Polygonum tinctorium and Isatis tinctoria. Planta Med. 38, 1980, p. 275-27. 4) Ferrara L., Montesano D., Naviglio D. Metodo rapido di estrazione per i coloranti naturali. Piante medicinali, vol. n. 3, 2002, p. 142144. Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto 17 RISULTATI E DISCUSSIONE COLORANTI Fig. 7 - EIMS Crocus sativus. Sorgente: Electron Impact Temperatura della sorgente: 190°C Direct: 75 eV – Dimetilcrocetina - m/z = 358 Fig. 8. 18 Ingredienti Alimentari - III (2004) agosto 5) Alonso G.L., Salinas MR., Garijo J. Method to determine the authenticity of aroma of saffron (Crocus sativus L.). J. Food Prot. 1998 61, p. 1525-8. 6) Verma S.K., Bordia A. Antioxidant property of Saffron in man. Indian J. Med. Sci. 1998, 52, p. 205-7 7) Martinez Tome M., Jimenez A.M., Ruggieri S., Frega N., Strabbioli R., Murcia M.A. Antioxidant properties of Mediterranean spices compared with common food additives. J. Food Prot., 2001, 64, p. 1412-9. 8) Feo F., Martinez J., Martinez A., Galindo P.A., Cruz A., Garcia R., Guerra F., Palacios R. Occupational allergy in saffron workers. Allergy 76, 1997, 52, p. 633-41. 9) Hasan A., Watermsan P., Iftikhar N. The use of new chromatographic techniques for the isolation and purification of phenolic acids from Indigofera heterantha. J. of Chromatography, 1989, 466, p. 399-402.