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 LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF Azione A2 ‐ Messa a punto delle migliori strategie per l’identificazione degli ibridi Relazione tecnica IBRIDAZIONE CON IL CANE COME MINACCIA PER LA CONSERVAZIONE DEL LUPO: STATUS DELLE CONOSCENZE E CRITERI PER L’IDENTIFICAZIONE DEGLI IBRIDI Paolo Ciucci Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin” Università di Roma “La Sapienza” Maggio 2012 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF Azione A2 ‐ Messa a punto delle migliori strategie per l’identificazione degli ibridi Relazione tecnica: Ibridazione con il cane come minaccia per la conservazione del lupo: status delle conoscenze e criteri per l’identificazione degli ibridi Paolo Ciucci Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin” Università di Roma “La Sapienza” “In science, misunderstanding or false acceptance of hypotheses may lead to confusion and retard progress; however, further research typically corrects the errors. In the case of conservation biology, such errors have disastrous and irreversible impacts” (Dowling et al. 1992) Contenuto p. Indice ...................................................................................................................................................... i Introduzione .......................................................................................................................................... 1 1. Ibridazione, ibridazione introgressiva e ibridazione antropogenica: concetti e definizioni ................... 5 1.1 Definizioni di base......................................................................................................................... 5 1.2 Ibridazione naturale ..................................................................................................................... 7 1.3 Ibridazione antropogenica ............................................................................................................ 8 2. Ibridazione con le specie domestiche .................................................................................................. 10 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi e la quantificazione dell’ibridazione ................................... 13 3.1 Criteri morfologici ....................................................................................................................... 14 3.2 Criteri genetici ............................................................................................................................ 16 3.2.1 DNAmt .................................................................................................................................. 18 3.2.2 Marcatori nucleari biparentali .............................................................................................. 18 3.2.3 Marcatori genetici sui cromosomi sessuali ........................................................................... 20 3.2.4 Test di assegnazione ............................................................................................................. 20 3.2.5 Limiti dei marcatori genetici tradizionali .............................................................................. 23 3.2.6 Test di assegnazione e rappresentatività del campionamento ............................................. 24 3.2.7 SNP e tecniche genomiche ................................................................................................... 26 3.3 Approccio integrato .................................................................................................................... 26 4. Ibridazione nel genere Canis ............................................................................................................... 28 i Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi 4.1 Ibridazione antropogenica nel genere Canis .............................................................................. 28 4.2 Asimmetria degli accoppiamenti e direzionalità dell’introgressione .......................................... 29 4.3 Comportamento e fisiologia riproduttiva negli ibridi ................................................................. 31 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane .......................................................................................... 35 5.1 Rischio teorico, tecniche d’indagine e prospettive ..................................................................... 35 5.2 Ibridazione tra lupo e cane come problema di conservazione ................................................... 36 5.3 Evidenze recenti d’ibridazione: cronologia e sintesi critica ........................................................ 38 5.3.1 Dai riscontri di campo alle indagini su larga scala con il DNAmt .......................................... 38 5.3.2 Applicazioni genetiche con marcatori biparentali ................................................................ 40 5.3.3 Applicazioni genetiche a elevata efficienza .......................................................................... 42 5.3.4 Sintesi, implicazioni gestionali e prospettive ........................................................................ 45 5.4 Fattori facilitanti l’introgressione e implicazioni gestionali ........................................................ 47 5.4.1 Rischio di introgressione antropogenica tra lupo e cane ...................................................... 47 5.4.2 Fattori condizionanti l’ibridazione tra lupo e cane ............................................................... 48 5.4.3 Ibridazione e zone periferiche dell’areale ............................................................................. 51 6. Metodi e criteri per l’identificazione degli ibridi lupo/cane ................................................................ 53 6.1 Errori d’identificazione degli ibridi e contesto gestionale .......................................................... 53 6.2 Metodi e procedure per l’identificazione degli ibridi ................................................................. 55 6.2.1 Metodi genetici ..................................................................................................................... 59 6.2.2 Metodi fenotipici .................................................................................................................. 65 6.2.3 Raccomandazioni.................................................................................................................. 78 Referenze ................................................................................................................................................... 82 i Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi – Introduzione Introduzione L’ibridazione tra il cane domestico ed il lupo, suo progenitore selvatico, non è certamente un fenomeno recente e si è probabilmente verificato in più occasioni durante la lunga storia della domesticazione del cane (Lorenz 1954, Clutton‐Brock 1995, 1999, Schwartz 1997, Vilà et al. 1997, Anderson at al. 2009). È tuttavia a seguito della frammentazione, rarefazione e riduzione delle popolazioni di lupo che il fenomeno dell’ibridazione con il cane domestico viene visto come potenziale minaccia per l’integrità genomica e quindi conservazionistica della specie, ed in particolare in quei paesi dove popolazioni di lupo numericamente ridotte si trovano a convivere con un elevato numero di cani vaganti (sensu Boitani et al. 1995). In queste condizioni, infatti, l’esiguità delle popolazioni locali di lupo, congiunta all’alterazione della coesione sociale della specie conseguente agli elevati livelli di persecuzione antropica, può corrispondere ad un aumento delle interazioni affiliative con il cane domestico e quindi ad una accresciuta frequenza dei casi di accoppiamento misti (Boitani 1983, 2003, Bibikov 1985, Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011). Sebbene oggi non sia possibile quantificare frequenza e ricorrenza dei casi di ibridazione tra lupo e cane nella recente storia evolutiva, è presumibile che i rapporti numerici tra le popolazioni di lupo ed i cani domestici dal primo neolitico all’epoca recente fossero tali da rendere gli eventuali casi di ibridazione ininfluenti a livello popolazionistico e genomico (ma vedi Anderson et al. 2009); questo sia perché le opportunità di accoppiamento misto avrebbero avuto una probabilità relativamente trascurabile, sia perché gli eventuali ibridi sarebbero stati rapidamente diluiti all’interno della popolazione parentale lupina, numericamente superiore e dall’ampissima distribuzione. Questa situazione, del resto, non è necessariamente realistica nel caso cambino i rapporti numerici tra le popolazioni di lupo e di cani: laddove popolazioni di lupo numericamente ridotte convivono con elevate densità di cani vaganti aumenta potenzialmente la frequenza di interazioni affiliative e di eventuali accoppiamenti misti, nonché la possibilità che eventuali varianti genetiche introgresse si fissino all’interno della popolazione parentale di lupo. In queste circostanze, anche se dal punto di vista evolutivo l’ibridazione lupo/cane non è fenomeno nuovo, lo potrebbe diventare nella storia recente la frequenza con cui i casi di ibridazione di manifestano, con il rischio di un impatto genomico, e quindi adattativo, di proporzioni ben più rilevanti rispetto al passato. Nelle condizioni attuali il fenomeno si va quindi ad associare alle altre minacce che già gravano sulla specie lupo, con l’importante differenza che la perdita di biodiversità, in questo caso rappresentata dall’integrità genomica originaria della specie, sarebbe irreversibile (Rhymer e Simberloff 1996; Allendorf et al. 2001, Randi 2008). Affrontare il problema dell’ibridazione in chiave gestionale non è tuttavia cosa semplice e scontata. La gestione del fenomeno è complessa, ricca di problemi tecnici ed incertezze normative; è indissolubilmente legata alla gestione del randagismo canino e le soluzioni prospettate, qualsiasi esse siano, rischiano di alimentare accese controversie di parte. A differenza di problemi più tradizionali di conservazione, come ad esempio la frammentazione dell’habitat o il rischio di estinzione demografica di una specie, che essendo di più immediata comprensione sono ampiamente accettati e condivisi, l’ibridazione è argomento poco noto e maggiormente controverso, culturalmente scomodo ed i cui fondamenti etici non sono affatto scontati al grande pubblico e non solo. Il risultato, come esemplificato dalla situazione creatasi in Italia negli ultimi 40 anni, non solo è una negligenza generalizzata, sia a livello istituzionale che pubblico, nell’affrontare razionalmente e tecnicamente il problema, lo è soprattutto il 1 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi – Introduzione fatto che a livello istituzionale esso ha rappresentato fino ad oggi un vero e proprio tabù e prova ne è, non solo in Italia, l’assenza di strategie o di normative specifiche al riguardo, nonostante i vari richiami del mondo scientifico (Boitani 1984, Boitani e Ciucci 1993, Boitani 2003, Randi 2008). Conseguentemente, anche i casi più evidenti e conclamati di ibridazione riportata per anni all’interno delle aree protette (p. es. Caniglia et al. in prep.) non hanno suscitato la benché minima reazione gestionale, né da parte degli enti e delle amministrazioni preposte, né tantomeno da parte delle associazioni ambientaliste o del pubblico in generale. Tutto questo, come spesso accade nel nostro paese, in barba alle leggi comunitarie, nazionali ed a precisi documenti tecnici di riferimento e di indirizzo (p. es., Genovesi 2002, AA.VV 2009). Appare quindi chiaro che affrontare il problema in chiave gestionale vuole dire soprattutto aumentare la consapevolezza a livello sociale della natura e della entità dei rischi che esso comporta e, con queste premesse, cercare consolidare un consenso ed una strategia di controllo e prevenzione del fenomeno che possa contare su una condivisione di intenti, di mezzi e di finalità. In seguito ad un’accresciuta frequenza dei casi d’ibridazione tra lupo e cane recentemente accertati in Italia (Randi 2008; vedi anche § 5.3), ed alle problematiche tecniche, sociali e politiche che caratterizzano l’argomento e ritardano una decisa risposta a livello istituzionale, il progetto Life ‘Ibriwolf’ intende quindi affrontare il fenomeno e la complessità gestionale e culturale che lo circonda. Lo scopo è quello di esplorare le possibili soluzioni gestionali, sondare ed eventualmente documentare la loro applicabilità su vasta scala. Infatti, nonostante la complessità del problema sia chiara a tutti, due documenti su scala nazionale ribadiscono la necessità e l’urgenza di affrontare in maniera consapevole e possibilmente risolutiva la questione: il Piano d’Azione Nazionale per la Conservazione del Lupo (Genovesi 2002), ed il documento di sintesi recentemente siglato da diversi tecnici ed amministrazioni in occasione del IV workshop sui Cantieri della Biodiversità (AA.VV. 2009). A tal fine, tra le azioni previste dal progetto, l’azione A2 (“Messa a punto delle migliori strategie per l’identificazione degli ibridi”) mira in particolare ad una sintesi e valutazione critica dei criteri diagnostici ad oggi disponibili e alla promozione di un loro impiego ottimale ai fini di una verifica attendibile del fenomeno; la presente relazione intende quindi rappresentare il prodotto finale di quest’azione. È infatti chiaro che qualsiasi possa e debba essere la risposta gestionale al problema, questa non può prescindere da una conoscenza e quantificazione accurata del fenomeno, della sua diffusione, frequenza e dalla conseguente valutazione dell’effettivo stato di rischio. Tuttavia, alla base di questo processo di acquisizione di conoscenze risiede la nostra capacità di identificare gli individui ibridi o in qualche modo introgressi, ovvero reincrociati all’interno della popolazione parentale (in questo caso di lupo), e questo è un passaggio particolarmente complesso e le cui difficoltà tecniche non sono alla portata di tutti; sebbene negli ultimi 20 anni si siano fatti enormi progressi nello sviluppo di tecniche diagnostiche sempre più affidabili, prime tra tutte le analisi di genetica molecolare, ed i laboratori dell’attuale ISPRA (ex INFS) siano tra i primi a livello mondiale ad aver padroneggiato l’applicazione di queste tecniche allo studio dell’ibridazione tra lupo e cane in Italia (Randi e Lucchini 2002, Verardi et al. 206, Randi 2008), molte rimangono ancora le difficoltà ancora presenti e che rallentano uno sviluppo altrettanto dignitoso in termini gestionali (vedi sopra). Inoltre, un grave problema nel contesto nazionale è che sono pochi gli attori che realmente partecipano al dibattito tecnico che riguarda l’identificazione degli ibridi e la quantificazione del fenomeno dell’ibridazione, come si trattasse di argomento di mero interesse accademico e non bensì centrale nella 2 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi – Introduzione pianificazione e realizzazione di strategie di conservazione di una tra le più importanti specie della nostra fauna. È dunque importante in quest’ottica allargare gli orizzonti del dibattito, coinvolgendo direttamente i tecnici delle amministrazioni ed istituzioni che a vari livelli si devono occupare di gestione e conservazione della fauna, e questa relazione intende essere un primo, importante passo in questa direzione. Oltre al problema dell’identificazione degli ibridi, e quindi di riflesso della quantificazione dell’ibridazione su scala della popolazione nazionale di lupo, esiste inoltre un problema di definizioni, problema che con ogni probabilità è alla base di continue incomprensioni e fraintendimenti tra i tecnici del settore e non solo. In questa relazione si è quindi voluto affrontare anche questo aspetto, inquadrando il problema nel più ampio contesto dell’ibridazione naturale e dettagliando cosa caratterizza quest’ultima da fenomeni di ibridazione antropogenica e per quale motivo questi sono da ritenere una seria minaccia non solo al lupo o ad altre determinate specie, ma alla biodiversità in generale. Scopo di questa relazione, tuttavia, non è solamente fare il punto dei criteri e degli elementi tecnici critici per una descrizione, quantificazione e monitoraggio affidabili dell’ibridazione tra lupo e cane, ma anche contestualizzare queste informazioni all’interno di un’etica di conservazione che funga da stimolo e riferimento per strategie di gestione che possano essere, speriamo in prossimo futuro, largamente supportate e condivise. A tal fine, il presente rapporto verrà fatto circolare tra i tecnici con esperienza specifica nel settore per stimolare una sua revisione critica e possibile integrazione, nonché tra i principali enti e istituzioni che si occupano di gestione e conservazione della fauna; l’auspicio è che la relazione possa inoltre rappresentare utile fonte di informazione per programmi di divulgazione e sensibilizzazione, di fondamentale importanza per ampliare la consapevolezza del problema ed il consenso sugli interventi gestionali che con ogni probabilità dovranno essere al più presto messi in atto. La relazione è strutturata in 6 capitoli; i primi due capitoli introducono le definizioni ed i concetti di base relativi all’ibridazione naturale, antropogenica e con le specie animali domestiche; il terzo capitolo è una introduzione generale alle tecniche fenotipiche e genetiche che ad oggi sono state e vengono utilizzate per l’identificazione degli ibridi e la quantificazione del fenomeno a livello di popolazione, dove particolare attenzione è stata posta nell’illustrare non solo i punti di forza di tali tecniche ma soprattutto i punti di debolezza e i tanti assunti che le tecniche diagnostiche oggi a nostra disposizione devono comunque rispettare al fine di produrre risultati robusti ed affidabili, è infatti nostra opinione che tali concetti non debbano essere di esclusiva pertinenza dei tecnici che applicano tali tecniche, ma anche se non soprattutto di coloro che si trovano a dovere interpretare i risultati in chiave gestionale. Nel quarto capitolo si ripercorre una sintesi dello stato attuale delle conoscenze del fenomeno dell’ibridazione introgressiva nelle diverse specie selvatiche e non del genere Canis, al fine di inquadrare meglio il fenomeno dell’ibridazione tra lupo e cane e non solo in chiave gestionale. Il quinto capitolo affronta direttamente ed in maniera esaustiva il problema dell’ibridazione antropogenica tra lupo e cane, sia dal punto di vista teorico che con diretti riferimenti allo stato delle conoscenze nel nostro paese; in questo capitolo si sintetizzano inoltre le tecniche ad oggi maggiormente utilizzate per lo studio del fenomeno in Italia e altrove, nuovamente ponendo l’accento sui problemi tecnici e come questi possono essere superati; vengono infine illustrati quali sembrano essere, alla luce delle attuali conoscenze, i fattori ecologici ed antropici che sembrano facilitare insorgenza e mantenimento del fenomeno, argomenti chiaramente di estrema rilevanza in chiave gestionale. Infine, nell’ultimo capitolo (capitolo 6) si illustrano esaustivamente e criticamente le procedure che vengono suggerite per la messa a 3 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi – Introduzione punto di procedure particolarmente affidabili ai fini dell’identificazione degli ibridi, introducendo il capitolo con una breve trattazione di quali possono essere gli errori di identificazione ed il loro peso in chiave gestionale; è in seguito a queste considerazioni che vengono inoltre forniti gli spunti essenziali per una strategia gestionale ed il relativo percorso decisionale alla base della risoluzione del problema (§ 6.1). Sempre nell’ambito del sesto capitolo, infine, si cerca di promuovere una maggiore attenzione verso strategie di campionamento mirate e maggiormente rappresentative, nonché verso una rivalutazione dei criteri fenotipici all’interno di un approccio integrato e basato su tecniche di genetica molecolare ad elevata efficienza; a tal fine, vengono presentate una serie di fotografie scattate da amici, colleghi o appassionati del lupo e della fotografia naturalistica (e che ringrazio caldamente per la loro pronta disponibilità a collaborare) a testimonianza della diffusione di forme anomale in gran parte dell’Appennino e che in alcuni non sembrano affatto supportare la classificazione fatta su base genetica. Tornando infatti al problema delle difficoltà tecniche per l’identificazione degli ibridi, è nostra opinione che molto ancora rimane da fare ma le prospettive sono senza dubbio promettenti, specialmente se saremo in grado di combinare in maniera più funzionale di quanto non sia accaduto finora criteri genetici e fenotipici all’interno di un approccio integrato. Si ringrazia Ettore Randi e Luigi Molinari, che hanno fornito commenti su una prima versione della relazione, ed i vari amici, colleghi e fotografi che hanno contribuito con le loro fotografie ad integrare l’esposizione dell’ultimo capitolo.
4 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 1. Concetti e definizioni 1. Ibridazione, ibridazione introgressiva e ibridazione antropogenica: concetti e definizioni L’ibridazione è un argomento particolarmente difficile e controverso da trattare, sia sul piano teorico (Stone 2000) che della conservazione (Allendorf et al. 2001; Allendorf e Luikart 2007). Oltre alla distinzione fondamentale che deve essere fatta tra ibridazione naturale e di natura antropogenica, ed essere in grado di distinguere gli eventuali individui ibridi e classificarli in base alle varie generazioni di appartenenza, è necessario sapere interpretare la moltitudine di casistiche che si possono riscontrare in natura in un unico contesto gestionale di riferimento. Da un punto di vista pratico della conservazione, inoltre, non sono secondari gli aspetti etici e legali, in quanto qualsiasi intervento gestionale deve essere valutato in riferimento al quadro normativo e, oltre ad essere realizzabile da un punto di vista tecnico, deve possibilmente risultare socialmente accettabile; al fine di affrontare tale complessità, è inoltre fondamentale che ci sia chiarezza dei concetti di base e delle loro implicazioni in termini di conservazione, motivo per cui nel presente capitolo si procede con la trattazione esaustiva delle definizioni ritenute più rilevanti. 1.1 Definizioni di base Sebbene con il termine ibridazione si sia fatto tradizionalmente riferimento alla riproduzione tra individui appartenenti a specie diverse (ibridazione interspecifica), più recentemente questa definizione è stata riconosciuta eccessivamente restrittiva dal punto di vista tassonomico, condizione che ne riduceva fortemente il significato e la valenza operativa. Di conseguenza, prendendo spunto da Harrison (1990), il concetto di ibridazione viene oggi esteso all’incrocio tra “individui di due o più popolazioni, o insiemi di popolazioni, che sono distinguibili sulla base di uno o più caratteri ereditabili” (Allendorf e Luikart 2007:423), includendo quindi anche casi di ibridazione intraspecifica. Eventuali incroci tra individui appartenenti a specie o sottospecie diverse, o anche popolazioni geneticamente distinte, vengono quindi tutti considerati casi di ibridazione, indistintamente dallo stato tassonomico delle singole popolazioni (Simberloff 1996; Rhymer e Simberloff 1996; Allendorf e Luikart 2007). L’ibridazione interspecifica porta spesso alla produzione di ibridi sterili, come nel caso del mulo (femmina di cavallo x maschio di asino) la cui sterilità è dovuta ad incompatibilità cromosomica all’atto della produzione dei gameti; in questi casi si riscontrano solo ibridi di prima generazione (F1). Nel caso in cui gli ibridi siano invece fertili, questi possono accoppiarsi tra loro dando origine a generazioni successive di ibridi (F2, F3, etc.), oppure reincrociarsi con individui di una o entrambe la popolazioni parentali (B1, B2, etc.). Laddove specie o popolazioni parentali distinte, trovandosi in condizioni di simpatria, si accoppiano e producono ibridi almeno parzialmente fertili si possono venire a creare zone di ibridazione, spesso in seguito ad un contatto secondario tra taxa evolutisi come entità distinte in condizioni di allopatria. Nonostante gli ibridi siano spesso contro selezionati rispetto alle popolazioni parentali, diversi meccanismi possono interagire per assicurare la stabilità delle zone di ibridazione, alcune delle quali permangono nel lungo periodo; in questi casi si suppone che esse possano fungere da filtro per la diffusione esclusivamente degli alleli o delle varianti genetiche che assicurano vantaggi adattativi (Martinsen et al. 2001). 5 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 1. Concetti e definizioni La fitness degli ibridi può variare radicalmente rispetto a quella delle rispettive popolazioni parentali, variando da una fitness superiore (eterosi, o vigore dell’ibrido), ad una fitness inferiore o compromessa (depressione da esoincrocio). L’eterosi è dovuta in gran parte alla scomparsa dell’effetto degli alleli deleteri recessivi, ma anche alla superiorità dello stato eterozigote di determinati caratteri rispetto a condizioni di omozigosi; per gli stessi motivi, l’eterosi si riscontra nella maggior parte dei casi essenzialmente a livello della prima generazione di ibridi, mentre nelle generazioni successive la depressione da esoincrocio può prendere il sopravvento (Allendorf e Luikart 2007). A livello di popolazione, l’eterosi tende anche a spiegare la rapida diffusione di alleli veicolati da individui provenienti da popolazioni geneticamente distinte, nonché l’importanza che tali eventi, anche se rari, possono avere in termini evolutivi. La depressione da esoincrocio può dipendere a sua volta da meccanismi intrinseci, dovuti ad incompatibilità genetiche tra due taxa che si accoppiano, e da meccanismi estrinseci, dovuti alla perdita negli ibridi di adattabilità alle condizioni ambientali locali dovuta alla perdita dei complessi genici coadattati (Harrison 1993; Allendorf et al. 2002; Allendorf e Luikart 2007). L’ibridazione può avvenire con o senza introgressione, la quale è definita come flusso genico tra popolazioni che si ibridano e si verifica allorché gli esemplari ibridi sono fertili e si reincrociano all’interno di una od entrambe le popolazioni parentali (Anderson 1949; Rhymer e Simberloff 1996). Dal momento che non tutte le specie o popolazioni che si ibridano producono ibridi fertili, non necessariamente l’ibridazione si traduce automaticamente in introgressione; con il termine di ibridazione introgressiva si vuole quindi evidenziare quei casi di ibridazione che danno seguito a fenomeni introgressivi, in cui le varianti geniche degli ibridi si possono diffondere, con entità variabile, all’interno delle popolazioni parentali. Se l’introgressione progredisce in maniera sostanziale, una o entrambe le popolazioni parentali possono arrivare a contenere un’elevata proporzione di individui ibridi e/o di loro reincroci di varie generazioni, rappresentando quello che è stato definito uno sciame ibrido (Rhymer e Simberloff 1996; Simberloff 1996). Diversi meccanismi possono interagire per limitare l’introgressione tra popolazioni distinte e la mancata espansione di alcune zone di ibridazione non è necessariamente interpretabile solo in termini di barriere (geografiche, comportamentali o fisiologiche) al flusso genico tra le popolazioni parentali (Rhymer e Simberloff 1996). D’altra parte, l’eterosi non sembra essere l’unico meccanismo tramite il quale spiegare la diffusione di fenomeni introgressivi e, come suggerito da simulazioni a livello di popolazione, gli ibridi introgressi possono diffondersi all’interno delle popolazioni parentali anche se mostrano fitness minore o sono contro selezionati (Allendorf et al. 2001; Epifanio e Phillips 2001; Allendorf e Luikart 2007). Un’erronea quanto diffusa interpretazione dell’ibridazione riconosce solo all’ibridazione introgressiva la possibilità di impattare la popolazione parentale, ma è fondamentale invece sottolineare che anche l’ibridazione senza introgressione può avere effetti demografici sostanziali a livello delle popolazioni parentali, specialmente se il rapporto tra le due è fortemente sbilanciato (Simberloff 1996; Allendorf et al. 2001; Allendorf e Luikart 2007). Infatti, anche se in presenza di ibridi sterili o parzialmente tali, l’ibridazione senza introgressione può generare competizione per i riproduttori a livello della popolazione parentale, riducendone quindi il potenziale riproduttivo ed il tasso di accrescimento demografico nel lungo periodo, con effetti che possono essere sostanziali specialmente nel caso di popolazioni parentali di dimensioni ridotte. All’estremo opposto, l’ibridazione introgressiva con estesa introgressione (sciame ibrido) può essere causa di estinzione 6 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 1. Concetti e definizioni genomica, ovvero la perdita di tutte le varianti genetiche (alleli e insiemi di genotipi) accumulatesi a livello genomico nel corso dell’evoluzione (Allendorf e Luikart 2007). A sottolineare l’importanza che entrambi i processi hanno in termini di conservazione per la persistenza delle popolazioni parentali, essi sono stati definiti rispettivamente ‘diluizione demografica’ e ‘diluizione genetica’ (Allendorf e Luikart 2007). È inoltre importante sottolineare che anche nel caso gli ibridi mostrino una fitness particolarmente ridotta rispetto ad una o entrambe le popolazioni parentali questo di per sé potrebbe non essere sufficiente a prevenire la diffusione degli ibridi nella popolazione, specialmente se in assenza di efficaci barriere prezigotiche (Wolf et al. 2001). Nel caso di ibridazione naturale, ovvero determinata da processi naturali che si apprezzano su scala ecologica, biogeografia ed evolutiva ed indipendentemente dall’azione dell’uomo, gli ibridi e le zone di ibridazione sono espressione di un processo evolutivo in atto e come tale da tutelare (Allendorf e Luikart 2007); la prospettiva invece cambia nel caso di ibridazione antropogenica, ovvero determinata o facilitata dall’azione diretta o indiretta dell’uomo. 1.2 Ibridazione naturale L’ibridazione di origine naturale è stata da lungo tempo riconosciuta come importante forza evolutiva e meccanismo all’origine di nuovi taxa e novità genomiche ed adattative (Lewontin & Birch 1966, Barton et al. 1989, Arnold 1997). Oltre il 70% delle angiosperme potrebbe essersi evoluto attraverso la comparsa di specie poliploidi in seguito ad ibridazione (Masterson 1994), e anche a livello di molti taxa animali l’ibridazione potrebbe avere avuto un ruolo più importante di quanto storicamente creduto (Dowling e Secor 1997; Grant e Grant 1998; Allendorf et al. 2001). Specialmente a livello delle piante, l’ibridazione, determinando nuove combinazioni genotipiche, può corrispondere a espressioni fenotipiche estreme ed oltre la variabilità osservata nelle specie parentali e, nel caso queste risultino particolarmente adattative, può quindi contribuire a fenomeni di divergenza evolutiva (Rieseberg et al. 2003). L’ibridazione sembra avere avuto un ruolo importante anche nell’evoluzione degli insetti (Rhymer e Simberloff 1996), ed è stata recentemente riscontrata in molte specie di vertebrati, in particolare tra i pesci; forme introgressive sono state anche riscontrate tra gli anfibi, i rettili, gli uccelli e i mammiferi (Allendorf et al. 2001), sebbene molti di questi casi potrebbero essere ascritti a fenomeni di ibridazione antropogenica (Rhymer e Simberloff 1996; Simberloff 1996). Contrariamente a quanto spesso ritenuto, e in linea con quanto sopra sintetizzato, l’ibridazione naturale non rappresenta quindi una minaccia per la conservazione, specialmente laddove una ridotta fertilità o sopravvivenza degli ibridi si associa ad un elevato tasso di incrocio con le popolazioni parentali (Simberloff 1996). L’ibridazione naturale è al contrario ritenuta un importante meccanismo di novità evolutiva, e le zone di ibridazione più o meno stabili rilevate nelle zone di simpatria tra diverse specie animali dovrebbero essere tutelate alla stregua delle specie parentali (Harrison 1993). In caso di ibridazione introgressiva, diversi modelli sono stati proposti per spiegare la presenza di zone di ibridazione stabili e l’assenza di individui ibridi al di fuori di esse. Questi modelli contemplano un diverso ruolo degli ibridi (maggiore o minore fitness degli ibridi rispetto agli individui parentali), una relazione tra la pressione di dispersal di individui parentali nelle zone di ibridazione e la contro selezione degli ibridi, o differenze nelle condizioni ecologiche degli habitat in cui vivono gli ibridi e gli individui delle popolazioni parentali (Arnold 1997). Dal 7 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 1. Concetti e definizioni momento che, dipendentemente dal modello, nelle zone di ibridazione ci si attende di osservare diverse proporzioni di F1, F2 e loro reincroci, l’analisi della loro frequenza e diffusione degli ibridi di varia generazione può fornire indicazioni sulla dinamica dell’introgressione e sul ruolo (fitness) degli ibridi. 1.3 Ibridazione antropogenica Se l’ibridazione, in quanto fenomeno naturale, è un meccanismo che va attentamente tutelato, la prospettiva cambia radicalmente nei casi in cui essa viene di fatto determinata e facilitata dall’attività dell’uomo (Allendorf e Luikart 2007). L’alterazione degli ecosistemi, la frammentazione e la degradazione degli habitat, la rarefazione delle specie selvatiche, l’introduzione di specie aliene e invasive su scala globale, o la traslocazione di specie al di fuori degli areali originari sono tutti interventi ad opera dell’uomo, intenzionali o accidentali, che hanno creato condizioni generalizzate di facilitazione dell’ibridazione tra linee evolutive altrimenti distinte (Rhymer & Simberloff 1996). In particolare, gli interventi dell’uomo hanno l’effetto di alterare o ridurre la funzionalità dei meccanismi (geografici, ecologici, comportamentali) di isolamento riproduttivo propri di molte specie, creando quindi le condizioni per cui taxa altrimenti distinti danno luogo a fenomeni di ibridazione. Nel caso più ovvio, un simile scenario si può venire a verificare nel caso in cui venga a mancare una barriera geografica tra specie distinte ma interfertili, ad esempio in seguito ad interventi di introduzione o traslocazione; oppure in seguito a modificazioni dell’habitat (quantità, qualità, accessibilità delle risorse, etc.) che hanno l’effetto di alterare l’ecologia ed il comportamento di alcune specie le cui barriere riproduttive, fondate su differenti requisiti di habitat o ritmi di attività, vengono quindi a mancare. L’ibridazione antropogenica, con o senza introgressione, rappresenta una grave minaccia per il mantenimento di specie o popolazioni distinte, problema con ogni probabilità ampiamente sottovalutato in epoca recente (Rhymer & Simberloff 1996). Il fenomeno sembra essere rilevante sia per le specie vegetali che animali, tra le quali molte specie di pesci, uccelli e mammiferi. Inoltre, rispetto ai tradizionali strumenti morfologici, le più recenti tecniche diagnostiche molecolari hanno messo più frequentemente in evidenza come l’impatto dell’ibridazione antropogenica sia tutt’altro che trascurabile a livello di molte specie (Simberloff 1996). È stato stimato che l’ibridazione antropogenica sia stata causa di estinzione per diverse specie di pesci d’acqua dolce (Allendorf et al. 2001:614) e si teme, proprio per la scarsità d’indagini di genetica molecolare a oggi realizzate, che il suo impatto sia stato ampiamente sottovalutato per molte altre specie animali (Rhymer & Simberloff 1996; Allendorf et al. 2001). Analogamente ai casi di ibridazione naturale, anche l’ibridazione antropogenica, con e senza introgressione, può portare alla rarefazione ed all’estinzione delle popolazioni parentali (Rhymer & Simberloff 1996). Laddove l’ibridazione senza introgressione può determinare uno spreco di potenziale riproduttivo e aumentare quindi i rischi di persistenza demografica, l’ibridazione introgressiva ad opera dell’uomo può essere causa di estinzione genomica attraverso la formazione di sciami ibridi (Simberloff 1996:146). Nel caso di specie minacciate o a rischio di estinzione, l’ibridazione antropogenica rappresenta un ulteriore problema, comportato seri rischi di estinzione genomica (p. es., cavallo di Przewalski: Van Dierendonck e Wallis de Vries 1996; anatra delle Hawaii: Browne et al. 1993; lupo etiope: Gottelli et al. 1994; lupo rosso: Adams et al. 2007; ma vedi anche Roy et al. 1994, 1996, Wilson et al. 2000). 8 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 1. Concetti e definizioni A differenza dell’ibridazione naturale, i rischi dell’ibridazione antropogenica devono essere puntualmente affrontati in un’ottica di conservazione e varie strategie gestionali devono essere messe in campo per contrastare le conseguenze a livello demografico e genetico nelle popolazioni parentali (Allendorf et al. 2001). Benché la distinzione tra i casi di ibridazione naturale e antropogenica sia difficile e spesso controversa, è comunque un passo irrinunciabile e cruciale in un’ottica di conservazione (Allendorf e Luikart 2007); tralasciare o sottovalutare tale distinzione corrisponde, da una parte, al rischio di trascurare la tutela gli ibridi naturali e, dall’altra, a quello di tutelare ibridi di origine antropogenica che potrebbero avere un serio impatto demografico o genomico sulle rispettive popolazioni parentali (Allendorf et al. 2001; Allendorf e Luikart 2007). Va infine ricordato che, in rari casi, l’ibridazione antropogenica introgressiva può anche essere consapevolmente adottata come strumento estremo di conservazione. Laddove la persistenza di una popolazione autoctona appare ormai compromessa da condizioni demografiche e/o genetiche precarie, l’introduzione di individui provenienti da popolazioni geneticamente distinte può avere il risultato di aumentare il vigore demografico e la variabilità genetica, assicurando alla popolazione condizioni minime di persistenza (p. es., puma in Florida: Simberloff 1996, Rhymer & Simberloff 1996). Tuttavia, per motivi analoghi a quelli che vedono nell’ibridazione un rischio per la persistenza delle popolazioni parentali, ricorrere a questo strumento di conservazione rappresenta un approccio potenzialmente rischioso le cui conseguenze devono essere attentamente valutate a priori. Innanzitutto, deve essere dimostrato con evidenze empiriche che la depressione da inincrocio (p. es. fertilità e sopravvivenza ridotta) sia effettivamente un problema nella popolazione autoctona oggetto d’intervento; in secondo luogo, deve essere preventivamente esclusa l’insorgenza potenziale di depressione da esoincrocio, attraverso meccanismi intrinseci o estrinseci, pena la perdita definitiva degli arrangiamenti genetici adattativi a livello locale tramite ibridazione con individui provenienti da popolazioni differenti (Allendorf et al. 2001). Trascurare queste valutazioni comporterebbe il rischio di ricorrere a interventi di conservazione il cui effetto sulla popolazione autoctona sarebbe peggiore del male originario (p. es., Simberloff 1996:147).
9 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 2. Ibridazione con le specie domestiche 2. Ibridazione con le specie domestiche Un caso particolare di ibridazione antropogenica, particolarmente eclatante e nefasto per la biodiversità su scala globale, è rappresentata dall’ibridazione tra gli animali domestici ed i loro conspecifici selvatici (Rhymer & Simberloff 1996; Ward et al. 1999; Allendorf et al. 2001; Garant et al. 2003; McGinnity et al. 2003; Nijman et al. 2003; Kidd et al 2009). Questo fenomeno, che coinvolge sia il mondo vegetale che animale (Levin 2002), può verificarsi quando individui di specie allevate e selezionate in condizioni di cattività o domestiche tornano in contatto con i loro conspecifici selvatici venendo meno l’effetto di barriere riproduttive pre‐ e/o postzigotiche. Sebbene si tratti di un fenomeno probabilmente antico quanto il processo di domesticazione stesso (Ward et al. 1999; Nijman et al. 2003; Vilà et al. 2005), l’enorme diffusione di animali domestici, e lo stato precario in cui attualmente versano molte specie selvatiche, lo rendono oggi un problema particolarmente insidioso e potenzialmente nefasto per la persistenza stessa delle popolazioni selvatiche e per la loro integrità evolutiva (Ward et al. 1999; Williams et al. 2002; Latch et al. 2006; Hutchings & Fraser 2008; Kidd et al 2009). Per quanto concerne le specie animali, l’ibridazione con animali domestici o d’allevamento è stata ampiamente riscontrata in molte specie di pesci, negli anuri, nelle anatre, negli ungulati e nei carnivori (Rhymer & Simberloff 1996; Simberloff 1999; Ward et al. 1999; Williams et al. 2002; Kidd et al 2009). Limitatamente ai mammiferi, le forme domestiche implicate nei casi di ibridazione più eclatanti originano solitamente da specie d’allevamento, come nel caso di puzzole, volpi, visoni o cinghiali che sono rilasciati, accidentalmente o intenzionalmente, al di fuori del loro areale originario (Simberloff 1996; Davison et al. 1999, Norén et al. 2005; Hampton et al. 2004; Kidd et al 2009); animali domestici destinati alla produzione o al lavoro come maiali, vacche, asini e cavalli e che sono gestiti in assenza di strette forme di controllo (Simberloff 1996; Ward et al. 1999; Nijman et al. 2003; Vernesi et al. 2003); e animali d’affezione, come cani e gatti, anch’essi lasciati liberi di circolare ampiamente al di fuori del contesto domestico (Hubbard et al. 1992, Daniels et al. 2001; Daniels e Corbett 2003; Pierpaoli et al. 2003; Kitchener et al. 2005; Elledge et al. 2006; Oliveira et al. 2008; Godinho et al. 2011). L’abbondanza e la diffusione delle specie domestiche in natura, contrapposta alla rarità delle loro forme selvatiche, creano condizioni numeriche che possono facilitare l’insorgenza di ibridazione (Hubbard et al. 1992, Gottelli et al. 1994, Davison et al. 1999, Godinho et al. 2011). Inoltre, il perdurare generazionale delle forme domestiche in uno stato di affrancamento da condizioni di domesticità, e che trova piena espressione nei fenomeni del randagismo e dell’inselvatichimento (Price 1984, Boitani et al. 1995, Ward et al. 1999), può ulteriormente facilitare l’abbattimento delle barriere riproduttive con i conspecifici selvatici. Ad eccezione dei rari casi in cui l’ibridazione con le forme selvatiche è intenzionalmente operata dall’uomo per rinvigorire le razze domestiche (Nijman et al. 2003; Vilà et al. 2005), il comune denominatore di tutte le casistiche sopra elencate consiste nella simpatria tra forme domestiche e selvatiche e nell’abbattimento delle barriere riproduttive di natura ecologica e comportamentale. Laddove le forme domestiche sono proporzionalmente più frequenti ed abbondanti dei loro conspecifici selvatici, le cui popolazioni sono spesso esigue e frammentate, si possono venire a creare condizioni, se gli ibridi sono fertili, che facilitano l’insorgenza di introgressione (Hubbard et al. 1992, Rhymer & Simberloff 1996; Simberloff 1996; Davison et al. 1999, Kidd et al. 2009). Inoltre, al pari di altri tipi di ibridazione, anche se gli ibridi di uno o entrambi i sessi sono sterili, o mostrano comunque fitness ridotta rispetto ai conspecifici selvatici, le forme domestiche possono avere un impatto rilevante grazie al potenziale 10 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 2. Ibridazione con le specie domestiche riproduttivo più elevato (età precoce di prima riproduzione, fertilità maggiore, cicli riproduttivi più brevi rispetto ai selvatici) che è una delle caratteristiche selezionate per eccellenza negli animali domestici (Price 1984; Allendorf e Luikart 2007). L’ibridazione con le forme domestiche rappresenta un caso specifico ed emblematico di ibridazione antropogenica. Come in altri tipi di ibridazione, essa può verificarsi con o senza introgressione, comportando in entrambi casi effetti negativi sulla persistenza e integrità genomica delle forme selvatiche: in assenza di introgressione, la competizione per i riproduttori e riduzione del potenziale riproduttivo; in presenza di introgressione, la diffusione di uno sciame ibrido con la perdita dell’integrità genomica ed evolutiva della forma selvatica. A differenza di altri casi di ibridazione antropogenica, tuttavia, il coinvolgimento delle forme domestiche comporta l’ulteriore rischio di trasmissione alle forme selvatiche di varianti genetiche accumulatesi nel corso della selezione artificiale e che sono poco o nulla adattative in condizioni di selvaticità. L’allevamento in cattività, la selezione e la propagazione mirata di linee particolarmente produttive di animali domestici avvengono infatti tramite selezione direzionale ed intensiva, in parte o del tutto svincolata dai processi di selezione naturale. L’allevamento avviene in ambienti costanti e controllati, in assenza di competitori e predatori, con disponibilità costante di cibo e di altre risorse e con accesso continuo ai riproduttori: in queste condizioni vengono selezionati caratteri che risultano particolarmente funzionali in un contesto antropico (taglia, mantello, produttività, capacità riproduttive e di crescita, versatilità, comportamento) ma che sono estremamente differenti da quelli che verrebbero selezionati in natura (Price 1984; Snyder et al. 1996; Belliveau et al. 1999; Kidd et al. 2009). Quindi, oltre agli effetti negativi dovuti alla scomparsa di complessi genici coadattati (vedi § 1.1), la propagazione dei caratteri ereditari delle forme domestiche potrebbe determinare nelle specie selvatiche una riduzione del vigore demografico, delle capacità adattative e del potenziale evolutivo (Price 1984; Simberloff 1996; Ward et al. 1999; Allendorf et al. 2001; Hutchings & Fraser 2008; Kidd et al. 2009). Va inoltre tenuto presente che la selezione artificiale, mirata all’amplificazione e mantenimento di specifici caratteri, determina spesso la comparsa di caratteri correlati, anch’essi con ogni probabilità di scarso valore adattativo in condizioni naturali, nonché la fissazione a livello genomico di alleli deleteri (Price 1984; Rauw et al. 1998; Lynch e O’Hely 2001) che verrebbero quindi propagati all’interno delle forme selvatiche. Anche se, paradossalmente, alcuni casi di introgressione di caratteri di origine domestica potrebbero risultare di un certo valore adattativo alle popolazioni parentali selvatiche (p. es., il melanismo nei lupi; Anderson et al. 2009, ISPRA 2009), ciò non deve essere associato ad un valore positivo in termini di conservazione, in quanto le implicazioni gestionali apparirebbero in questo caso in netto contrasto con gli indirizzi prevalenti (p. es., Ward et al. 1999, Allendorf et al. 2001, Daniels e Corbett 2003, Allendorf & Luikart 2007, Randi 2008, Kidd et al. 2009). Il rischio è infatti confondere il valore intrinseco dell’evoluzione biologica con quello presunto della selezione artificiale, nonché sottovalutare i danni che l’ibridazione antropogenica, tra l’altro veicolata da una specie domestica, può comportare in un’ottica di conservazione. Al di là delle implicazioni teoriche e pratiche che l’ibridazione tra forme domestiche e selvatiche comporta, mantenere distinti gli ambiti ed il valore relativo dei processi di selezione artificiale ed evoluzione biologica rappresenta, piuttosto che un ‘dogma’, il fondamento etico stesso della conservazione dei sistemi naturali, ed è importante che questo messaggio non rimanga di pertinenza dei tecnici del settore, ma venga veicolato senza ambiguità alla sfera amministrativa e sociale. 11 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi e la quantificazione dell’ibridazione Alla luce delle importanti implicazioni di conservazione dei casi di ibridazione antropogenica, due elementi cruciali alla base di qualsiasi strategia gestionale sono: i.
l’identificazione degli eventuali individui ibridi all’interno delle popolazioni parentali, e ii. la quantificazione, e possibilmente monitoraggio, della diffusione degli ibridi all’interno della popolazione. Mentre il primo aspetto è fondamentale per verificare occorrenza e natura dell’ibridazione (se introgressiva o meno), ed eventualmente permettere interventi selettivi di controllo e/o rimozione, il secondo fornisce informazioni critiche sulla diffusione di eventuali fenomeni introgressivi all’interno della/e popolazione/i parentali e quindi determina l’orientamento tra scenari di gestione alternativi (Allendorf et al. 2001). Riuscire a distinguere, quantificare e monitorare in maniera affidabile la diffusione degli ibridi all’interno delle popolazioni parentali è inoltre fondamentale per accrescere le nostre conoscenze nel campo dell’ibridazione, e in particolare per comprendere meglio come e quali fattori influenzano i tassi di ibridazione e la dinamica delle zone di ibridazione, quale sia la direzionalità dell’ibridazione e quale il ruolo (fitness) degli ibridi di varie classi, quale la natura delle loro interazioni con le popolazioni parentali e quali le condizioni ecologiche che facilitano l’ibridazione; tutti fronti di ricerca che hanno finora sofferto delle varie difficoltà riscontrate nella determinazione oggettiva ed affidabile degli ibridi e degli eventuali reincroci nelle varie generazioni. Da un punto di vista metodologico è importante sottolineare che mentre il riconoscimento degli ibridi si deve basare sull’adozione di criteri diagnostici affidabili, la quantificazione dell’ibridazione a livello di popolazione dipende sia dalla funzionalità dei criteri diagnostici utilizzati che dalle strategie adottate per campionare gli individui all’interno di una o entrambe le popolazioni parentali. Mentre esiste una teoria consolidata e diversi testi di riferimento per quanto concerne l’applicazione delle strategie di campionamento alle popolazioni naturali (p. es., Krebs 1999; Thompson et al. 1998; Williams et al. 2002), ad oggi si discute ancora su quali e quanto siano affidabili i criteri per l’individuazione di ibridi. Idealmente, la distinzione tra individui ibridi e forme parentali si dovrebbe basare su caratteri diagnostici ed ereditabili e, date le importati implicazioni gestionali, affidabili e di elevato valore pratico. In altre parole, i caratteri diagnostici ideali dovrebbero poter: •
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tenere traccia in maniera univoca delle forme parentali nelle varie classi di ibridi; essere trasmessi alle varie generazioni di ibridi e loro reincroci; garantire un margine di errore trascurabile, sia esso di Tipo‐I (classificare erroneamente come ibrido un individuo che non è tale) che di Tipo‐II (non riconoscere un ibrido in quanto tale; vedi anche § 6.1); risultare di facile applicazione sul capo per l’immediato riconoscimento degli individui ibridi o introgressi. I caratteri potenzialmente utilizzabili in questo senso si possono classificare in marcatori morfologici, o più in generale fenotipici, e marcatori genetici. In realtà, la maggiore parte dei marcatori ad oggi utilizzati non rispetta uno o più delle caratteristiche ideali di sui sopra, motivo per cui esistono in ogni caso alcuni importanti limiti interpretativi o applicativi. Mentre attraverso ricerche mirate si potrà affinare sempre più l’affidabilità e il potere diagnostico dei 12 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi criteri adottati (p. es., Andersone et al. 2002, Elledge et al. 2006, Godinho et al. 2011), ad oggi l’uso integrato di diversi criteri sembra offrire le migliori garanzie di affidabilità e risoluzione, e quindi risultati più attendibili in un’ottica gestionale (Daniels e Corbett 2003; Kitchener et al. 2005; Elledge et al. 2006, Adams et al. 2007). In questo capitolo si procede con l’illustrazione dei criteri diagnostici a oggi ritenuti più affidabili per l’identificazione degli ibridi da una prospettiva generale, mentre si rimanda al § 6.2 per il caso specifico degli ibridi tra lupo e cane. 3.1 Criteri morfologici Caratteristiche morfologiche, tra cui colore, peso, proporzioni corporee o la presenza di tratti fenotipici particolari, a inclusione quindi di espressioni comportamentali, vocali, sociali, etc., possono essere considerati diagnostici dei casi di ibridazione solo se sono geneticamente determinate e non subiscono alterazione in seguito ad effetti ambientali o epigenetici. Poiché l’ibridazione produce fenotipi ‘misti’ alterando la concordanza tra caratteri parentali, ci si attende di conseguenza una maggiore variabilità fenotipica negli ibridi (F1 e F2) e nei loro reincroci. Così, come il fenotipo del mulo è di fatto un mosaico delle caratteristiche fenotipiche delle due specie parentali (cavalla x asino), ci si attende che anche in altre specie o popolazioni geneticamente e fenotipicamente distinte gli ibridi siano caratterizzati da un insieme eterogeneo dei caratteri fenotipici delle popolazioni parentali (p. es., Pitt 1921; Mengel 1971; Rhymer et al. 1994; Daniels et al. 1998; Corbett 2001; Riga et al. 2001; Haig et al. 2004; Robinson et al. 2005; Elledge et al. 2006). Con il progredire dell’introgressione, soprattutto se i reincroci avvengono preferenzialmente con una delle due popolazioni parentali, le differenze fenotipiche tendono a diluirsi secondo un gradiente meno discontinuo e la cui diagnosi ed interpretazione diventa più difficile ed altamente soggettiva (Allendorf et al. 2001; Kitchener et al. 2005). Sebbene spesso di dubbia interpretazione, i marcatori fenotipici possono essere di grande valore pratico per il riconoscimento immediato di individui ibridi in natura; come tali, fino alla metà degli anni ’60 ovvero prima dell’avvento dei marcatori genetici, sono stati ampiamente utilizzati per individuare i casi di ibridazione. I criteri fenotipici, del resto, soffrono di sostanziali problemi teorici e pratici, motivo per cui la loro affidabilità è stata messa più volte in discussione, specialmente di chi oggi adotta un approccio genetico per la diagnosi dell’ibridazione (Allendorf et al. 2001). Sono molteplici infatti i fattori che limitano l’interpretabilità dei marcatori fenotipici di ibridazione (Rhymer et al. 1994; Leary et al. 1995; Boecklen e Howard 1997; Allendorf et al. 2001; Haig et al. 2004; Kitchener et al. 2005; Allendorf e Luikart 2007): •
non tutta la variabilità fenotipica ha base genetica, avendo le interazioni con l’ambiente in particolare durante le fasi di sviluppo effetti anche significativi sulle espressioni fenotipiche; •
solo parte della variabilità morfologica complessiva, sia a livello intra‐ che inter‐
popolazionistico, è stata descritta in maniera esaustiva per la maggior parte delle specie; potrebbe quindi risultare erroneo interpretare estremi fenotipici in termini di ibridazione, in quanto potrebbe trattarsi di adattamenti locali o di polimorfismo; •
l’idea che generalmente si ha dell’omogeneità fenotipica di una data specie è un concetto piuttosto astratto e che si basa su un confronto soggettivo con uno standard, 13 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi spesso anch’esso ideale, di riferimento; lo standard viene spesso descritto utilizzando pochi esemplari provenienti da collezioni e campioni parziali, non contempla la variabilità fenotipica attesa nelle popolazioni naturali e difficilmente rappresenta la totalità del polimorfismo che caratterizza una data specie; laddove descritto su base quantitativa, lo standard fenotipico può infine risentire di problemi di natura campionaria, analitica e descrittiva; •
nel caso di popolazioni introgresse probabilmente da lungo tempo (p. es., gatto selvatico in Scozia: Kitchener et al. 2005; dingo in Australia: Elledge et al. 2006), la descrizione del fenotipo ‘puro’ proprio delle popolazioni parentali è poco realistica e comunque limitata al numero esiguo delle collezioni di riferimento e dalla loro ristretta rappresentatività geografica; •
sebbene negli ibridi di prima (F1) o seconda (F2) generazione ci si può aspettare un fenotipo intermedio o a ‘mosaico’ rispetto alle forme parentali, i marcatori fenotipici non permettono di distinguere oggettivamente tra ibridi di prima (F1) o successive generazioni, o loro reincroci all’interno delle popolazioni parentali; •
nel caso l’introgressione si diffonda prevalentemente all’interno di una delle due popolazioni parentali, i reincroci diventano spesso indistinguibili su sola base fenotipica; in questo caso non è possibile inoltre stabilire una relazione quantitativa tra la variabilità fenotipica e il livello di introgressione, informazione che è invece critica per valutare le opzioni di gestione. In definitiva, sebbene alcuni caratteri fenotipici possano suggerire fortemente la presenza di ibridi o individui introgressi all’interno della popolazione parentale, la distinzione di tali individui non sempre è fattibile o particolarmente affidabile; inoltre, anche se apparentemente possibile come nel caso di caratteristiche particolarmente anomale o devianti, essa non permetterebbe comunque la distinzione del livello di introgressione, specialmente in caso di reincrocio all’interno della popolazione parentale. Questi limiti sono stati da tempo messi in evidenza in diverse specie di pesci interessate da introgressione, laddove sono state simultaneamente impiegate tecniche diagnostiche di genetica molecolare (Ryhmer 1996): su ben 42 casi di ibridazione ipotizzati su base morfologica solo 2 sono stati confermati tali con tecniche di genetica molecolare; ma le tecniche genetiche, tuttavia, hanno evidenziato altri 24 casi di introgressione che non erano stati altrimenti individuati ad una valutazione fenotipica (Rhymer e Simberloff 1996). Nonostante questi limiti, la possibilità di identificare gli individui ibridi in base alle loro caratteristiche fenotipiche risulta di indubbio valore pratico dal punto di vista delle applicazioni gestionali. Non prevedendo, al pari di altri marcatori fenotipici o dei marcatori genetici (vedi § 3.2), la cattura dal vivo o la detenzione in cattività degli individui per una loro valutazione, il valore pratico dei marcatori fenotipici è la loro facile ed immediata interpretazione. Specialmente nei casi di ibridazione che interessano le specie domestiche, alcuni autori propongono ancora oggi la valutazione integrata di diversi indici fenotipici ritenuti in parte o del tutto diagnostici: questi, nel loro insieme, non solo aumentano la probabilità di identificare gli ibridi, ma permettono anche di stimare la loro classe di introgressione (Daniels e Corbett 2003, Kitchener et al. 2005, Elledge et al. 2006). Chiaramente queste procedure non eliminano del tutto il rischio di valutazioni soggettive; tuttavia, la maggiore standardizzazione, facilitata dall’elaborazione quantitativa e accurata dei pattern di variazione fenotipica, assicura 14 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi comunque una sostanziale riduzione della componente soggettiva. Ad esempio, pattern diversi della colorazione del mantello vengono fatti corrispondere ad una scala di punteggi, che saranno maggiori o minori dipendentemente dal livello di similitudine con uno standard di riferimento (la popolazione parentale o geneticamente integra). Ai fini del riconoscimento degli ibridi, il valore diagnostico di questi indici viene supportato attraverso l’applicazione di procedure statistiche di classificazione e ordinamento (p. es., analisi delle componenti principali, analisi delle corrispondenze, analisi dei cluster), le quali possono essere calibrate includendo esemplari di origine nota (popolazioni parentali e ibridi di diversa generazione; p. es., gatto selvatico in Scozia: Daniels et al. 1998, Kitchener 1998, Daniels e Corbett 2003, Kitchener et al. 2005; dingo in Australia: Corbett 1995, 2001; Daniels e Corbett 2003; Elledge et al. 2006). È chiaro del resto che molti di questi indici, sebbene di valore diagnostico superiore, non sono di immediata applicazione; tuttavia, potendo disporre di un numero sufficientemente rappresentativo di esemplari delle popolazioni parentali (o ancestrali, nel caso di sciame ibrido), una o più caratteristiche fenotipiche di immediata interpretazione (p. es., struttura e colorazione del mantello, proporzione corporee) possono essere confrontate con altri indici fenotipici di più complessa valutazione (p. es., morfometria del cranio, proporzioni degli organi interni) per una loro validazione sperimentale; ovviamente, lo stesso approccio può essere alternativamente impiegato ai fini della validazione utilizzando tecniche di genetica molecolare, che in ogni caso restituiscono una maggiore affidabilità (vedi § 3.3). La stessa logica può essere applicata anche ad altre specie ed è potenzialmente valida anche nel caso dell’ibridazione tra lupo e cane, laddove diverse sono le caratteristiche fenotipiche sospettate di essere un segnale di ibridazione (vedi § 6.2.3). 3.2 Criteri genetici Il ricorso a tecniche genetiche ha enormemente semplificato il processo di identificazione degli ibridi, in quanto l’analisi prende direttamente in esame i caratteri ereditari stessi e non la loro presunta espressione fenotipica; ciò facilita non solo la determinazione più oggettiva di eventuali individui ibridi, ma potenzialmente anche la quantificazione dei livelli di introgressione nelle generazioni; inoltre, è divenuto possibile identificare quale tra i due generi è maggiormente implicato nel propagare l’introgressione all’interno delle popolazioni parentali, con importanti riflessi sia teorici che gestionali. È bene ricordare, tuttavia, che sebbene i marcatori genetici permettano l’identificazione degli individui introgressi anche oltre gli ibridi di prima generazione (F1), la genetica non può offrire valutazioni di per sé oggettive in riferimento a cosa effettivamente sia un ‘ibrido’ ai fini gestionali (Rhymer e Simberloff 1996); questa valutazione attiene infatti ad una sfera decisionale di carattere prettamente gestionale e che tiene conto anche di valutazioni tecniche complementari alla genetica (Allendorf et al. 2001), oltre che di una scala di valori. Tuttavia, nell’ambito di questo complesso percorso decisionale, la genetica molecolare, attraverso analisi adeguate, può fornire informazioni oggettive e di elevato valore gestionale sul livello di introgressione che caratterizza gli individui all’interno della popolazione (p. es., Miller et al. 2003). Inoltre, grazie alle recenti tecniche di genetica non invasiva, è possibile applicare questi 15 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi strumenti su ampia scala anche per il monitoraggio dell’ibridazione senza prevedere la cattura e manipolazione diretta degli individui (Adams et al. 2003a, Schwartz et al. 2004)1. I primi marcatori genetici individuati verso la metà degli anni ’60 si basavano su applicazioni di elettroforesi enzimatica (allozimi) ma, anche a seguito dello sviluppo della PCR (Polymerase Chain Reaction), le tecniche molecolari hanno preso il sopravvento portando ed hanno determinato la proliferazione dei marcatori per l’analisi dell’ibridazione (Allendorf e Luikart 2007). Il recente sviluppo delle tecniche di genetica non‐invasiva (Taberlet et al. 1999, Waits e Paetkau 2005), inoltre, ha enormemente aumentato le potenzialità di campionamento l’applicazione delle tecniche genetiche per l’analisi dell’ibridazione anche a popolazioni numericamente ridotte ed altrimenti difficili da studiare (p. es., Adams et al. 2007). Anche utilizzando tecniche genetiche, l’identificazione degli ibridi presuppone l’individuazione di marcatori le cui caratteristiche siano diagnostiche delle rispettive popolazioni parentali; queste ultime, in altri termini, devono differire per gli alleli o per le frequenze alleliche in determinati loci (loci diagnostici). Nel caso di specie e/o popolazioni geneticamente affini, e per le quali non esistono loci sufficientemente diagnostici, i casi di ibridazione potrebbero comunque essere evidenziati da frequenze alleliche intermedie in più loci, ammesso che la variabilità genetica delle popolazioni parentali sia stata sufficientemente descritta e rappresentata (Engel et al. 2006). Diversi marcatori genetici vengono impiegati negli studi sull’ibridazione, alcuni dei quali trovano applicazione più frequente: il DNA mitocondriale (DNAmt) e i marcatori biparentali a livello dei geni nucleari (Allendorf e Luikart 2007). Potendo disporre di informazioni relative a diversi loci diagnostici, è stata recentemente sviluppata una suite di tecniche e programmi statistici in grado di identificare gli individui ibridi e caratterizzare le popolazioni d’appartenenza; tra queste tecniche, i test di assegnazione sono quelli ad oggi più frequentemente utilizzati a tal fine (Vähä e Primmer 2006). Nonostante gli enormi sviluppi compiuti nel campo della genetica molecolare e nelle tecniche di quantificazione dei relativi dati, permangono tuttavia una serie di problemi teorici ed applicativi che limitano il valore interpretativo dei risultati ottenuti; non ultima è la rappresentatività degli individui campionati nel riflettere la reale variabilità genetica delle popolazioni parentali e la diffusione/frequenza dei casi di ibridazione: non prendere in debita considerazione tali limiti, potrebbe comportare gravi conseguenze in termini di gestione e conservazione dei casi di ibridazione antropogenica (Allendorf et al. 2001, Olsen et al. 2004, DeYoung e Honeycutt 2005). 1
Anche se, in questo caso, gli errori di tipizzazione dei genotipi multilocus (vedi sotto) potrebbero rappresentare un serio limite al numero di loci da considerare, riducendo quindi sostanzialmente il potere diagnostico dei testi di assegnazione (Adams et al. 2007). 16 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi 3.2.1 DNAmt Il DNA mitocondriale, generalmente ereditato per via materna e caratterizzato da un elevato tasso di mutazione, viene da tempo utilizzato per distinguere specie tra loro affini ed identificare eventuali casi di ibridazione (Ward et al. 1999, Rohwer et al. 2001, Saetre et al. 2001). Proprio in virtù dell’ereditarietà per via materna, il DNAmt è un marcatore utile per un approccio preliminare allo studio dell’ibridazione: se le popolazioni parentali mostrano aplotipi diagnostici, è allora possibile verificare se l’aplotipo di individui ipotizzati come ibridi (p. es. sula base di indicazioni fenotipiche) corrisponde o meno a quello della popolazione parentale di appartenenza. Ad esempio, per rintracciare eventuali eventi di ibridazione antropogenica in quattro specie selvatiche di bovidi, il DNAmt è stato confrontato tra quattro specie selvatiche di Bos (gaur e yak) e Bison (bisonte europeo e bisonte nordamericano) e 14 razze di bovini domestici, rilevando la diffusione di aplotipi domestici sia nello yak che in entrambe le specie di bisonte (Ward et al. 1999). Va tuttavia sottolineato che il DNAmt, sebbene sia stato spesso impiegato negli studi sull’ibridazione, rispecchia esclusivamente il flusso genico per via materna e non tiene quindi conto dell’apporto paterno; limite, questo, particolarmente grave nel caso gli eventi di ibridazione fossero unidirezionali (p. es., femmina lupo per maschio di cane), in quanto il DNAmt da solo non sarebbe in grado di evidenziarli. Per questo motivo il DNAmt non è ad oggi ritenuto sufficiente per un’analisi esaustiva dell’ibridazione e non si può prescindere dall’impiego di marcatori genetici (nucleari) di origine biparentale (p. es., Haig et al. 2004, Elledge et al. 2006). Nel caso dell’ibridazione tra dingo e cane domestico, per esempio, l’ibridazione è altamente unidirezionale, vedendo sistematicamente coinvolta la femmina di dingo con il maschio del cane: nonostante la porzione di DNAmt analizzata (D‐loop) sia altamente variabile nel cane e quindi potenzialmente diagnostica con il dingo, non è in questo in grado di identificare eventuali individui ibridi poiché questi mostrano comunque il DNAmt tipico del dingo. Discorso analogo vale nel caso dell’ibridazione tra lupo e cane (vedi § 5.3.1). 3.2.2 Marcatori nucleari biparentali Dal momento che il DNAmt non è da solo in grado di tracciare inequivocabilmente tutti i casi di ibridazione, è necessario integrare le analisi con marcatori genetici che rispondono a pattern di eredità biparentale, e quindi di origine nucleare; tra questi hanno trovato applicazione negli studi sull’ibridazione gli allozimi, il DNA microsatellite, il DNA polimorfico ad amplificazione casuale (RAPD), o i nucleotidi singoli polimorfici (SNPs) (Raymer e Simberloff 1996, Allendorf e Luikart 2007). L’uso combinato con il DNAmt di uno di questi marcatori è in grado di offrire un quadro più completo degli eventuali processi di ibridazione in atto anche se, è bene ricordarlo, esistono limiti informativi ed interpretativi anche con questo approccio (vedi § 3.2.3). La proprietà ideale di un marcatore genetico è un alto tasso di variabilità, in base alla quale è lecito attendersi discreti livelli di polimorfismo tra popolazioni geneticamente distinte (Bruford e Wayne 1993, Queller et al. 1993). I microsatelliti (o DNA microsatellite) risultano in questo senso particolarmente polimorfici, ed in quanto tali sono attualmente tra i più utilizzati marcatori genetici. Ciascun locus microsatellite è caratterizzato da una breve sequenza composta da 1 a 6 nucleotidi (p. es. il trinucleotide cgt), che viene ripetuta un numero variabile di volte (cgtcgtcgtcgtcgt, o ctg5). L’elevato polimorfismo di questi loci dipende dal loro elevato tasso di mutazione (10‐3 – 10‐4 per generazione), laddove una mutazione solitamente consiste nella perdita o nell’aggiunta di una ripetizione della sequenza 17 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi caratterizzante. Con l’ausilio di primer specifici, ciascun locus viene individuato ed amplificato tramite PCR e quindi analizzato tramite lettura elettroforetica dei prodotti di amplificazione (Allendorf e Luikart 2007). Prendendo in considerazione non uno ma un numero sufficientemente elevato di loci diversi, ciascun individuo può essere riconosciuto dalla combinazione unica di alleli in ciascun locus che rappresenta il suo genotipo individuale (genotipo multilocus), in base al quale è possibile stimare la probabilità di appartenere ad una delle popolazioni parentali o di riflettere un’origine mista (Pritchard et al. 2000). Dato l’elevato polimorfismo riscontrato a livello del DNA microsatellite, questo marcatore permette anche di evidenziare differenze tra popolazioni distinte anche laddove queste siano particolarmente ridotte e depauperate di variabilità genetica (Bruford e Wayne 1993). Analogamente ad altri marcatori genetici, i loci microsatellite che risultano particolarmente utili per l’identificazione dei casi di ibridazione sono quelli i cui rispettivi alleli e/o frequenze alleliche sono sufficientemente diversificate (loci diagnostici) nelle popolazioni parentali. Tuttavia, anche utilizzando i microsatelliti, gli ibridi vengono individuati con relativa sicurezza solo se si tratta di ibridi di prima generazione (F1) e nel caso venga utilizzato un numero sufficientemente elevato di loci diagnostici (Boecklen e Howard 1997); anche in questo caso, del resto, è comunque problematico distinguere generazioni successive di ibridi (≥F2) o i reincroci di prima o successiva generazione (Allendorf et al. 2001, Vähä e Primmer 2006). Anche se le popolazioni parentali fossero altamente divergenti, riuscire a distinguere con certezza i reincroci dagli individui delle popolazioni parentali presuppone l’utilizzazione di un numero particolarmente elevato di loci (≥48 loci: Vähä e Primmer 2006; 50 – 100 loci: Randi 2008)2. Considerando più loci simultaneamente, l’ibridazione tra specie o popolazioni viene evidenziata nei modelli di struttura genetica delle popolazioni, rilevando l’assortimento non casuale degli alleli in due o più loci (linkage disequilibrium); infatti, congiuntamente ad altre possibili cause (esiguità numerica della popolazione, effetto della selezione naturale, strutturazione geografica), l’ibridazione è un processo che determina una deviazione delle frequenze alleliche rispetto a quelle attese in condizioni di equilibrio neutrale (Hardy‐
Weinberg; Allendorf e Luikart 2007). In questo caso, del resto, il modello assume che il mancato riscontro dell’equilibrio (il segnale dell’ibridazione) sia comunque una condizione temporanea destinata a regredire velocemente, ovvero a dissolversi in poche generazioni. Ciò è vero in particolar modo se i loci presi in esame sono di fatto indipendenti (unlinked), così che i rispettivi alleli si ricombinano effettivamente in maniera casuale (Boecklen e Howard 1997, Goodman et al. 1999). In queste condizioni, sono quindi elevate le probabilità di non riuscire a identificare eventi più o meno recenti di introgressione anche nel caso venisse utilizzato un numero di loci elevato (Verardi et al. 2006). Tuttavia, la probabilità di rilevare casi di introgressione aumenta considerevolmente se vengono utilizzati loci associati (linked), ovvero posizionati su segmenti cromosomali non indipendenti e la cui ricombinazione non avviene in maniera casuale (Falush et al. 2003). In questo caso, infatti, il segnale di disequilibrio nelle frequenze alleliche (linkage disequilibrium) non si diluisce con le generazioni alla stessa velocità dei loci indipendenti ma può anche perdurare per molte generazioni in coppie di loci tra loro strettamente associati (Allendorf et al. 2001). 2
È alla luce di questo tipo di evidenze che la conclusioni e le interpretazioni gestionali di molti studi genetici realizzati nel recente passato sull’ibridazione devono essere attentamente riconsiderati. 18 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi In base a quanto illustrato, quindi, anche se i marcatori genetici biparentali offrono garanzie superiori per l’analisi dell’ibridazione e l’identificazione degli individui ibridi, è elevata la probabilità che l’introgressione non venga rilevata oltre la prima generazione di reincrocio o sia comunque ampiamente sottostimata. Per fare fronte a queste limitazioni, Randi (2008) suggerisce di adottare alcuni importanti accorgimenti, tra cui: •
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valutare, tramite simulazioni, qual è il potere diagnostico che il panel di marcatori genetici adottato ha nel rilevare ibridi di prima (F1) e seconda (F2) generazione, nonché i reincroci di prima generazione; utilizzare un numero superiore di 20 loci indipendenti per aumentare le probabilità di rilevare reincroci di generazioni successive; integrare i marcatori biparentali con altri marcatori genetici in grado di fornire prospettive complementari dei casi di ibridazione (p. es. DNAmt); usare simulazioni al computer per calibrare ed interpretare meglio i risultati dei test di assegnazione (vedi sotto); laddove disponibili, utilizzare loci non indipendenti (associati) per aumentare la tracciabilità di eventi di introgressione pregressi. 3.2.3 Marcatori genetici sui cromosomi sessuali La determinazione del sesso si basa, per uccelli e mammiferi, su una coppia di cromosomi sessuali (XY nei mammiferi, WZ negli uccelli) che, in stato di eterogamia, corrispondono al genere maschile nei mammiferi ed al femminile negli uccelli (cromosoma Z e cromosoma W). Nei mammiferi, in particolare, gran parte del cromosoma Y non è omologo al cromosoma X e non ricombina quindi alla meiosi; questo è il motivo per cui nei maschi il cromosoma Y è un marcatore genetico equivalente, in termini di ereditarietà, al DNAmt per le femmine (cfr. § 3.2.1). Nonostante la variabilità nelle sequenze nucleotidiche dei cromosomi Y e W sia piuttosto scarsa, sono stati comunque trovati marcatori sufficientemente variabili da utilizzare ad integrazione dei marcatori nucleari biparentali. Nei casi di ibridazione unidirezionale che vedono coinvolto il maschio (p. es. cane maschio x lupo femmina), i marcatori sui cromosomi sessuali (loci ipervariabili sul cromosoma Y) sono quindi particolarmente validi da utilizzare ad integrazione degli altri marcatori genetici (DNAmt, marcatori nucleari biparentali) al fine di una comprensione più esaustiva dei meccanismi di ibridazione e sua propagazione nelle popolazioni parentali (p. es., Sunquist et al. 2001, Vilà et al. 2003, Iacolina et al. 2010, Godinho et al. 2011). 3.2.4 Test di assegnazione In termini di ibridazione, la tipizzazione di un numero sufficiente di loci polimorfici (p.es., microsatelliti) permette applicazioni che vanno dalla stima del grado di commistione all’interno della popolazione, all’individuazione degli individui ibridi o introgressi. È rimarchevole il recente sviluppo di strumenti e modelli statistici utilizzabili con i marcatori genetici di ultima generazione rispetto a quanto fosse reso possibile da marcatori meno informativi (allozimi) (Hansen et al. 2001). Le tecniche statistiche contemplano strumenti di classificazione (p. es., analisi delle corrispondenze, analisi dei componenti principali), nel caso si conoscano le popolazioni parentali, o di ordinamento (p. es., analisi dei cluster, clusterizzazione Bayesiana) nel caso queste non siano accuratamente definite o non siano note. In queste applicazioni, 19 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi l’approccio frequentista viene sempre più spesso sostituito da tecniche basate sulla massima verosimiglianza e implementate tramite simulazioni o modelli Bayesiani (Manel et al. 2005). In questo caso, del resto, è fondamentale rispettare gli assunti di tali modelli, ed in particolare quelli legati al campionamento ed alla eventuale strutturazione delle popolazioni (Miller et al. 2003, Vähä e Primmer 2006). I test di assegnazione prevedono che un campione rappresentativo di una determinate area geografica o popolazione venga utilizzato per stimarne le frequenze alleliche a livello dei loci considerati, laddove popolazioni distinte sono caratterizzate da distribuzioni alleliche differenti; è quindi con queste premesse che un dato individuo viene assegnato ad una popolazione d’appartenenza in base alla probabilità (frequenza attesa) di derivazione del suo genotipo multilocus rispetto alle popolazioni (distribuzioni) individuate (Paetkau et al. 1995). In altri termini i test di assegnazione valutano l’ipotesi che un determinato genotipo multilocus derivi da una popolazione in particolare tra quelle caratterizzate dal campione esaminato (Manel et al. 2005). Esiste del resto la possibilità, in comune con altre procedure di classificazione (p. es. Garcia‐Moreno et al. 1996), che la popolazione di appartenenza di un determinato individuo potrebbe non essere stata campionata affatto. Per questo motivo, oltre a dover porre attenzione particolare alla strategia di campionamento adottata (vedi § 3.2.6), sono stati proposti tesi di assegnazione che si basano piuttosto su criteri di esclusione, ovvero eliminando tra le popolazioni potenziali d’appartenenza quelle per le quali il genotipo in questione appare particolarmente raro o improbabile (Cornuet et al. 1999). Diverse sono le procedure Bayesiane che sono state sviluppate per le analisi di assegnazione (p. es., Pritchard et al . 2000, Anderson e Thompson 2002), e tutte sono particolarmente funzionali per lo studio dell’ibridazione: esse contemplano infatti la possibilità che un determinato individuo non appartenga ad un’unica popolazione parentale ma che possa derivare da entrambe, ovvero che sia di origine mista (Miller et al., 2003). Due metodi in particolare appaiono specificamente adeguati per l’identificazione di individui ibridi, ed entrambi sono implementati in programmi di facile acquisizione: STRUCTURE (Pritchard et al . 2000; Falush et al . 2003) e NEWHYBRIDS (Anderson e Thompson 2002). Il primo, più comunemente utilizzato, assegna i genotipi individuali a popolazioni (cluster) che non vengono definiti a priori dall’utente ma che corrispondono alla minima differenza tra le frequenze alleliche osservate e quelle attese in base a condizioni di equilibrio di Hardy‐Weinberg (Pritchard et al. 2000); una volta definiti i cluster, il programma assegna le probabilità di appartenenza di genotipi individuali in base alla loro composizione, laddove i genotipi la cui frequenze alleliche hanno probabilità non trascurabili di appartenere a due o più cluster sono identificati come potenziali ibridi. Differentemente da quest’approccio, NEWHYBDIRS è stato specificamente sviluppato per l’identificazione degli ibridi e stima direttamente la probabilità di un genotipo individuale di appartenere ad una popolazione parentale o ad un gruppo ibrido, in questo caso distinguendone le varie classi d’appartenenza (F1, F2 e reincroci) (Anderson e Thompson 2002). Sebbene alcuni autori vedano nel metodo di Anderson e Thompson (2002) un approccio più versatile per distinguere le varie classi di ibridi (Manel et al. 2005), un confronto formale tra i due programmi non mette in evidenza differenze rilevanti: mentre l’efficienza di identificare gli ibridi è paragonabile tra i due metodi, STRUCTURE sembra essere più robusto a proporzioni variabili di ibridi nel campione, e NEWHYBRIDS più efficiente qualora diverse classi di ibridi (F1, F2 e reincroci) siano contemporaneamente presenti nel campione (Vähä e Primmer 2006; ma vedi anche Adams et al. 2007). Alcuni autori ritengono comunque che l’approccio Bayesiano implementato in NEWHYBRIDS sia più appropriato dal punto di vista 20 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi pratico per l’individuazione degli ibridi a fini gestionali, in quanto fornisce una stima a posteriori della probabilità di appartenenza degli ibridi alle varie classi (F1, F2, B1, B2 etc.) piuttosto che assegnare questi individui ad una categoria di ibridi (Elledge et al. 2006). Qualsiasi sia l’approccio modellistico, comunque, emerge la difficoltà di distinguere i reincroci dalle rispettive popolazioni parentali, anche nel caso queste siano particolarmente divergenti, a meno che non venga utilizzato un numero particolarmente proibitivo di loci polimorfici (≥48; Vähä e Primmer 2006; vedi anche § 3.2.2). Ad esempio, nel caso degli ibridi tra lupo rosso (Canis rufus) e coyote, utilizzando 8 loci al posto di 18 si riducono sensibilmente le possibilità di distinguere gli ibridi tramite test di assegnazione, nonché di determinare la categoria di introgressione d’appartenenza (Adams et al. 2007). Il rischio di sottostimare eventuali ibridi o i loro reincroci può essere comunque valutato attraverso la stima del potere statistico del sistema diagnostico adottato, utilizzando a tal fine simulazioni che tengano conto del numero dei loci impiegati, del livello di differenziazione genetica delle popolazioni parentali e della classe di ibridi in questione (Vähä e Primmer 2006; Randi 2008). Un motivo di ulteriore preoccupazione per l’individuazione di ibridi o introgressi utilizzando il metodo di Pritchard et al. (2000) è che il modello Bayesiano di riferimento assume che le condizioni di equilibrio (Hardy‐Weinberg e assortimento casuale degli alleli, linkage equilibrium) siano misurate utilizzando marcatori tra loro indipendenti (unlinked; Manel et al. 2005, Verardi et al. 2006; vedi § 3.2.2). Presupponendo marcatori indipendenti, STRUCTURE rileva quindi una struttura del campione in seguito ad un mancato riscontro delle condizioni di equilibrio, ma in caso di reincrocio l’assortimento non casuale degli alleli (linkage disequilibrium) è un segnale che tende a diluirsi velocemente e non essere più rilevabile in pochissime generazioni (Randi e Lucchini 2002). Il rischio quindi è che, utilizzando loci indipendenti, eventi di ibridazione pregressa possono essere ampiamente sottostimati (Verardi et al. 2006). Tuttavia, questo problema risulta oggi in parte superato dall’implementazione nella versione 2.1 di STRUCTURE di un modello teoricamente superiore e che prevede la possibilità di associazione tra loci (linked loci), utilizzando l’informazione che deriva dalla loro correlazione per rilevare con maggiore efficienza eventi introgressivi pregressi (Falush et al. 2003). Un’importante considerazione in merito alla risoluzione dei testi di assegnazione nel caso di ibridazione tra lupo e cane va fatta in relazione alla caratterizzazione delle popolazioni parentali, inclusa quella canina. La variabilità genetica relativamente ridotta nelle popolazioni di lupo rispetto alle razze canine in un certo senso semplifica la caratterizzazione delle frequenze alleliche nel lupo, a patto che il campionamento abbia contemplato la strutturazione geografica della popolazione; nel caso del cane, al contrario, la definizione delle frequenze alleliche ai fini del test può essere più problematica in conseguenza dell’elevata frammentazione genetica e relativo isolamento tra le varie razze: la differenziazione genetica tra queste può essere infatti relativamente elevata da comportare una minore efficienza dei test di assegnazione. Per questo motivo il campionamento delle razze o tipologie di cane che a livello locale si presume siano più probabilmente coinvolte nei casi di ibridazione può quindi aumentare sensibilmente il potere diagnostico del test e la probabilità di rilevare ibridi o reincroci di generazioni successive (Vilà et al. 2003). 3.2.5 Limiti dei marcatori genetici tradizionali 21 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi Essere in grado di identificare in maniera affidabile gli individui ibridi e introgressi all’interno di una popolazione è fondamentale per impostare correttamente una strategia di gestione ed eventualmente attuare programmi di rimozione o sterilizzazione (p. es., Miller et al. 2003). Ai fini di una corretta identificazione degli ibridi, i marcatori genetici garantiscono una maggiore efficienza di diagnosi e sono sicuramente più attendibili rispetto ai marcatori fenotipici. Ed è proprio in seguito a questo loro maggiore potere diagnostico che con la diffusione dei marcatori genetici è parallelamente aumentata la frequenza con cui i casi d’ibridazione antropogenica vengono identificati (Simberloff 1996). Nonostante ciò, i metodi genetici ad oggi utilizzati per lo studio dell’ibridazione non devono essere considerati necessariamente infallibili e, al pari di molte altre tecniche, presentano alcuni importanti limiti interpretativi (DeYoung e Honeycutt 2005). Dall’insieme delle informazioni sintetizzate nei paragrafi precedenti, si evince infatti che l’adozione dei criteri genetici per l’analisi dell’ibridazione deve tenere conto di una serie di problemi, nel loro insieme riconducibili a: a) numero e tipo di marcatori genetici, che corrispondono ad un diverso potere diagnostico nel rilevare casi di ibridazione e nel distinguere diverse classi di ibridi e reincroci di varia generazione (F1, F2, B1, B2, etc.); b) criteri e resa del campionamento, ovvero l’entità e le modalità spazio‐temporali di selezione degli individui campionati, che influenzano entrambi la rappresentatività della variabilità genetica intra‐ e interpopolazionistica originaria e quindi l’attendibilità stessa delle analisi di strutturazione e dei test di assegnazione (vedi § 3.2.4); c) i modelli statistici utilizzati, che sono basati sul rispetto di determinati assunti (caratteristiche del campione, struttura delle popolazioni parentali, caratteristiche dei marcatori genetici) e di importanti premesse metodologiche; dal rispetto di questi assunti dipende in ultima analisi l’affidabilità dei risultati conseguiti. Nel caso i problemi di cui sopra non siano attentamente considerati negli studi sull’ibridazione, il rischio principale in termini pratici è analogo a quello potenzialmente derivante dall’impiego dei soli marcatori fenotipici: confondere l’ibridazione con la variazione naturale all’interno di un determinato taxon, oppure non determinare correttamente l’ibridazione o non riuscire a distinguere individui ibridi e/o introgressi (Miller et al. 2003). Nel secondo caso, e per quanto concerne l’ibridazione antropogenica in particolare, va ricordato che tale rischio comporta ricadute a volte gravi in termini di conservazione (Allendorf et al. 2001). Si tratta inoltre di un’eventualità non del tutto remota, non solo in funzione dei marcatori genetici che vengono utilizzati, ma dello stesso contesto sociale e gestionale di applicazione: i criteri genetici, proprio in virtù della loro superiorità diagnostica rispetto ai più tradizionali marcatori fenotipici, esercitano un peso assolutamente rilevante e preponderante all’interno dei processi decisionali che sottintendono la gestione, ma in questi contesti non tutti sono in grado di valutarne appieno i limiti, spesso a discapito di evidenze di carattere fenotipico piuttosto eclatanti (I. Rinhardt, com. pers.). In talune situazioni, infatti, le indicazioni genetiche possono essere in contrapposizione con le evidenze di carattere fenotipico, ma sono solitamente le prime ad assumere peso decisionale. Mentre prima dell’avvento dei marcatori genetici le indicazioni fenotipiche d’ibridazione potevano avere un certo peso nella sfera gestionale, anche se soggettivo, discutibile e privo di riprove sperimentali (p. es., Lawrence e Bossert 1967, Ridley e McBride 1972, Lariviere e Crete 1993, Garcia‐Moreno et al. 1996, Miller et al. 2003, Kyle et al. 2006; vedi § 3.1), oggi in assenza di un riscontro genetico esse non vengono 22 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi più considerate segnali attendibili di ibridazione (p. es., Apollonio et al. 2004). Il rischio insito in tale approccio risiede appunto nel fatto che le evidenze di carattere genetico non sono sempre affidabili o di elevata risoluzione e potere diagnostico, motivo per cui è sempre consigliabile procedere con analisi integrate che tengano conto di marcatori di diversa natura (p. es., Dowling et al. 1992; vedi anche § 3.3). Oltre all’uso integrato di diversi marcatori genetici e di marcatori di diversa natura, questo problema può essere affrontato attraverso la puntuale valutazione dell’effettivo potere diagnostico dei marcatori genetici e del sistema di analisi impiegato (Vähä e Primmer 2006; vedi anche § 3.2.4). I metodi diagnostici genetici, inoltre, anche se sono superiori ai metodi fenotipici in termini di affidabilità e potere diagnostico, non sono comunque particolarmente pratici per il riconoscimento e la gestione di eventuali ibridi in natura (rimozione o sterilizzazione; Daniels e Corbett 2003, Elledge et al. 2006). Associare un dato profilo genetico a un determinato individuo presuppone infatti la sua cattura, manipolazione e detenzione in cattività per un periodo sufficientemente lungo per completare le analisi genetiche; ciò aumenta i costi e la complessità logistica dell’operazione e può essere venire meno a principi di benessere animale. I due ordini di problemi di cui sopra (limiti interpretativi e scarso valore pratico dei criteri genetici) possono essere in parte ridotti dall’uso integrato di: a) marcatori genetici di diversa natura (p. es. DNAmt, loci ipervariabili biparentali, loci ipervariabili sessuali) che, dipendentemente dai meccanismi di propagazione dell’introgressione, possono individuare gli ibridi ed evidenziare casi d’introgressione con più efficacia rispetto ai soli loci biparentali; b) marcatori genetici e marcatori fenotipici (cfr. § 3.3), specialmente laddove questa integrazione sia stata verificata sperimentalmente e nell’ottica di validare l’affidabilità di alcuni caratteri fenotipici come indici di ibridazione (p. es., Ciucci et al. 2003, Elledge et al. 2006). 3.2.6 Test di assegnazione e rappresentatività del campionamento Sebbene sia stato in parte già discusso come il campionamento sia rilevante per garantire l’affidabilità dei test di assegnazione (§§ 3.2.4, 3.2.5), in questa sede è opportuno ribadire quali i criteri di campionamento che devono essere rispettati per la piena affidabilità dei modelli statistici ad oggi utilizzati. Nel caso in cui l’individuazione di ibridi viene fatta sulla base di frequenze alleliche intermedie tra quelle delle popolazioni parentali (p. es., STRUCTURE, Pritchard et al. 2000), è essenziale disporre di un appropriato disegno di campionamento per escludere l’ipotesi alternativa che i genotipi intermedi rappresentino in realtà una parte non campionata della variabilità totale della popolazione parentale (Engel et al. 2006). Un disegno di campionamento appropriato dovrebbe quindi prevedere non solo un numero sufficientemente elevato di individui selezionati casualmente all’interno della popolazione, ma anche un’adeguata rappresentazione della possibile strutturazione geografica delle popolazioni parentali (Engel et al. 2006). In uno studio sull’ibridazione tra lupo e coyote, ad esempio, il campione è stato stratificato in base a zone di allopatria, dove gli areali di lupi e coyote non si sovrapponevano, e zone di simpatria, quest’ultime a loro volte suddivise in aree con assenza nota di ibridazione ed aree in cui il fenomeno era stato precedentemente rilevato (Roy et al. 1994). 23 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi Proprio perché uno degli aspetti più critici delle procedure di assegnazione (§ 3.2.4) è la definizione delle frequenza alleliche e della struttura riproduttiva che caratterizzano le popolazioni parentali; diverse procedure statistiche vengono utilizzate per caratterizzare le frequenze alleliche di riferimento, ma esse assumono che: (i) gli individui si accoppino casualmente all’interno della popolazione (deme); (ii)
gli individui analizzati siano un campione casuale dell’intera popolazione, e (iii) gli individui campionati rappresentino tutta l’informazione genetica (frequenze alleliche) disponibile della popolazione/i parentali (Miller et al. 2003; vedi anche § 3.2.4). In particolare, tutti i modelli Bayesiani alla base delle procedure di assegnazione (p. es., Pritchard et al. 2000) assumono che ciascun genotipo analizzato sia stato estratto casualmente dalla popolazione d’appartenenza: un criterio che, al pari degli assunti propri delle procedure statistiche utilizzate (cfr. § 3.2.5), può influire in maniera consistente sull’affidabilità dei modelli stessi (Manel et al. 2005). Va infine ricordata la dimensione temporale del campionamento, specialmente considerando che la struttura (genetica, geografica) delle popolazioni parentali, e/o gli eventuali fenomeni di ibridazione in atto, sono entrambi parametri che possono evolvere rapidamente, specialmente in risposta a fattori di disturbo antropogenico. In tali circostanze, un campione ideale dovrebbe fare riferimento a un unico intervallo temporale di campionamento, ovvero rappresentare un’istantanea della totale variabilità genetica delle popolazioni in un determinato momento. Laddove questo non sia possibile per motivi logistici, l’intervallo temporale di campionamento dovrebbe comunque essere limitato rispetto ai tempi generazionali della specie in questione. Prendendo in considerazione intervalli temporali di campionamento eccessivamente lunghi, c’è il rischio di confondere la suddivisione (caratterizzazione) genetica delle popolazioni parentali, ed eventuali fenomeni introgressivi, lungo una dimensione temporale poco o nulla rappresentativa delle condizioni attuali in cui si trovano le popolazioni. Un discorso diverso va fatto laddove è necessario distinguere diverse classi di individui introgressi in riferimento a popolazioni ancestrali (p. es., sciame ibrido), perché in questo caso gli esemplari immuni dall’ibridazione, che rappresentano la popolazione di riferimento, sono campionati da nuclei in cattività (p. es., Garcia‐Moreno et al. 1996, Miller et al. 2003) o appartengono a popolazioni pregresse (p. es. collezioni museali; Elledge et al. 2006). I problemi di campionamento qui elencati sono particolarmente stringenti nel caso in cui l’obiettivo delle analisi non sia solo quello di rilevare o meno introgressione ma di quantificarne frequenza e diffusione all’interno di una o più delle popolazioni parentali. Al pari di altre applicazioni campionarie, infatti, le quantificazioni fatte a livello del campione possono essere estrapolate all’intera popolazione solo qualora questo sia realmente rappresentativo, e nel caso dell’ibridazione in particolare, della strutturazione genetica e geografica delle popolazioni parentali. Laddove in applicazioni di questo tipo si disponga di un campionamento parziale, opportunistico o comunque non sufficientemente intensivo ed opportunamente stratificato, è difficile e discutibile stimare parametri come frequenza e diffusione dell’ibridazione a livello dell’intera popolazione (Lehman et al. 1991). 3.2.7 SNP e tecniche genomiche 24 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi In conclusione di questo paragrafo è d’obbligo menzionare la recente scoperta e applicazione di tecniche genomiche allo studio dell’ibridazione. In particolare, già dagli anni ’80 sono state scoperte brevi sequenze, immediatamente prima e dopo mutazioni che coinvolgono un singolo paio di basi, che sembrano rappresentare nel loro insieme la forma prevalente di variabilità genetica ed in base alle quali si può disporre di un elevato numero di loci diagnostici (Brumfield et al. 2003). Tali sequenze, denominate SNP (Single Nucleotide Polymorphism) rappresentano quindi marcatori genetici biallelici e, nel genoma umano, si trovano con frequenza di 0,5 – 10 ogni 1000 paia di basi (Collins et al. 1997). L’elevata frequenza nel genoma di questo tipo di marcatori permette di analizzarne più di uno anche in un singolo locus di poche centinaia di paia di basi, e la brevità di queste sequenze corrisponde inoltre ad una maggiore efficienza e affidabilità di amplificazione dal momento che ci si attende un tasso minore degli errori che altrimenti affliggono la tipizzazione dei marcatori microsatellite (drop out allelico e falsi alleli), motivo per cui la tecnica si può potenzialmente applicare con successo anche a campioni non invasivi (Seddon et al. 2005). Inoltre, grazie alle recentissime tecniche di microarray migliaia di sequenze geniche (SNP) diverse possono essere analizzate simultaneamente fornendo una visione genomica del campione a partire da quantità minime di DNA. In questo senso, i SNP sono marcatori di ultima generazione con cui sarà sempre più possibile integrare o sostituire del tutto i marcatori tradizionali ad oggi maggiormente utilizzati nello studio dell’ibridazione (vedi sopra). Applicazioni simili sono state recentemente fatte anche per il lupo in Italia (Seddon et al. 2005, Andersen et al. 2006). 3.3 Approccio integrato Riuscire a combinare la maggiore affidabilità dei marcatori genetici con quelli fenotipici permette di aumentare il potere e l’efficacia nella diagnosi dell’ibridazione. Inoltre, comprovare l’eventuale concordanza o discordanza tre le due tipologie di marcatori può contribuire a verificarne l’affidabilità stessa. Ad esempio, laddove un marcatore fenotipico, fortemente sospettato di essere un segnale di ibridazione, viene rilevato ad un livello di introgressione non più leggibile da marcatori genetici tradizionali o con potere diagnostico particolarmente scarso (vedi § 3.2.4), ciò può indurre a considerarne un numero maggiore (Ciucci et al. 2003) o ricercarne di più specifici ed affidabili (p. es., locus‐K; Anderson et al. 2009). Al contrario, l’identificazione su base genetica di individui ibridi o introgressi permette un esame e una valutazione più oggettivi dei pattern fenotipici rispetto agli standard parentali, e se emergessero differenze sistematiche e significative sarebbe lecito in questo caso addurre l’ibridazione come causa della variabilità fenotipica osservata. Infine, utilizzando marcatori genetici affidabili è utile tentare di comprovare l’affidabilità di caratteri fenotipici in virtù del loro maggiore valore pratico, in quanto sono quelli che risultano più immediati nelle applicazioni gestionali che prevedono la rimozione (o sterilizzazione) degli ibridi in natura. Alcuni casi di ibridazione antropogenica, e che prevedono la rimozione o la cattura di individui ibridi e/o introgressi a livello di popolazioni altamente commiste (sciami ibridi), contemplano l’uso integrato di marcatori genetici e fenotipici al fine di aumentare le capacità di diagnosi e verificare l’affidabilità di alcuni caratteri morfologici come indici di ibridazione. Ad esempio, nel caso del dingo, diversi autori suggeriscono l’uso integrato di tecniche molecolari e morfologiche (morfometria del cranio) per ridurne relativi limiti e discrepanze (Baker e Gatesy 2002, Elledge et al. 2006), e un obiettivo pratico di questo approccio è quello di individuare pattern di colorazione del mantello che siano in grado di discriminare efficacemente gli 25 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 3. Tecniche per l’identificazione degli ibridi individui ibridi dai dingo originari (Daniels e Corbett 2003, Elledge et al. 2006); questi autori infatti sostengono che il colore ed il pattern del mantello, peraltro storicamente ipotizzati essere indici di ibridazione, sono di valore pratico ai fini gestionali. In questo senso, la genetica può essere utile per confermare l’appartenenza di alcuni esemplari di riferimento (collezioni museali) alle popolazioni ancestrali geneticamente integre, in modo che questi possano poi essere considerati di riferimento per descrizioni quantitative e più oggettive dei pattern originari di colorazione del mantello (Elledge et al. 2006). Simili considerazioni sono state fatte nel caso delle popolazioni di gatto introgresse in Ungheria e in Scozia, dove analisi di carattere genetico possono contribuire alla diagnosi degli individui ibridi e/o introgressi ed alla validazione di criteri fenotipici di immediata applicazione in natura (Daniels e Corbett 2003, Kitchener et al. 2005). Nel caso del lupo, molti sono i caratteri fenotipici sospettati di essere un segnale di ibridazione con il cane (Duman 2010; vedi anche § 6.2.2), sebbene solo alcuni di questi siano stati ad oggi verificati su base genetica (Ciucci et al. 2003, Anderson et al. 2009, Greco 2009). 26 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis 4. Ibridazione nel genere Canis Includendo il dingo, sono 8 le specie selvatiche di aspetto ‘lupoide’ (genere Canis3), e sono tutte filogeneticamente molto affini rappresentando un clade monofiletico (Wayne et al. 1997). Queste specie condividono lo stesso cariotipo e si possono accoppiare e produrre ibridi, come riscontrato sia in cattività (Iljin 1941, Mengel 1971, Kolenosky 1971, Silver e Silver 1969) che in natura quando in condizioni di simpatria (Wayne et al. 1995). La possibilità che queste specie hanno di ibridarsi in natura è nota da tempo, rappresentando un classico esempio dei limiti del concetto di specie biologica (Templeton 1989). 4.1 Ibridazione antropogenica nel genere Canis Utilizzando tecniche morfologiche o genetiche, casi di ibridazione in natura sono stati rilevati tra lupo e coyote (Schmitz e Kolenosky 1985, Lehman et al. 1991, Wayne e Jenks 1991, Wayne e Lehman 1992, Wayne et al. 1992, Roy et al. 1994, 1996), tra coyote e cane (Wetzel e Lawrence 1962, Gipson et al. 1974, Gipson e Sealander 1976, Mahan et al. 1978, Adams et al. 2003b), tra lupo rosso, coyote e/o cane (Gipson et al. 1974, Adams et al. 2003a), tra lupo e cane (Teruelo e Valverde 1992, Garcia‐Moreno et al. 1996, Andersone et al. 2002, Vilà et al. 1997, 2003, Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011; vedi anche § 5.3), e tra dingo e cane (Jones 1990, Woodall et al. 1999, Daniels e Corbett 2003, Elledge et al. 2006). Sebbene le applicazioni di genetica molecolare, considerate più affidabili per l’identificazione dell’ibridazione, siano relativamente recenti, da diversi studi emerge che laddove le specie o le popolazioni selvatiche sono integre ed abbondanti, le barriere riproduttive di tipo ecologico e comportamentale sembrano essere funzionali, e l’ibridazione è assente o rara (Wayne et al. 1997). Tuttavia, molti casi di ibridazione tra specie del genere Canis sono di fatto di origine antropogenica, e non si tratta esclusivamente dei casi che coinvolgono forme domestiche o allevate in cattività; le condizioni in cui le barriere riproduttive di natura ecologica e comportamentale possono risultare meno efficaci si riscontrano laddove una specie è particolarmente abbondante e l’altra particolarmente rara (Lehman et al. 1991; Roy et al. 1994, Adams et al. 2003b); e ciò si può verificare come conseguenza sia della persecuzione diretta di una delle due specie da parte dell’uomo (p. es., lupo: Lehman et al. 1991, Garcia‐
Moreno et al. 1996; lupo etiope: Gottelli et al. 1994; lupo rosso: Adams et al. 2007), sia della proliferazione e dell’abbondanza dell’altra specie in risposta a modificazioni sostanziali dell’habitat da parte dell’uomo (p. es., coyote: Lehman et al. 1991, Wayne e Lehman 1992; cane: Adams et al. 2003b). A volte l’ibridazione a livello intraspecifico è anche dovuta al rilascio intenzionale o accidentale da parte dell’uomo di individui detenuti ed allevati in cattività o comunque prelevati da popolazioni geograficamente e geneticamente distinte: una volta rilasciati al di fuori del loro areale originario, e trovandosi in simpatria con altre specie affini o conspecifici di popolazioni distinte, possono dare luogo a fenomeni di ibridazione. Tale meccanismo è stato invocato per spiegare l’ampia diffusione geografica di ibridi tra lupo e coyote negli Statu Uniti orientali (Lehman et al. 1991) o la presenza di aplotipi in individui selvatici al di fuori del loro areale 3
C. lupus, C. rufus o C. lycaon (cf. Wilson et al. 2000), C. latrans, C. mesomelas, C. aureus, C. adustus, C. simensis, C. familiaris dingo. 27 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis originario; ad esempio, 5 dei 99 campioni raccolti nella popolazione di lupo delle Alpi svizzere e francesi hanno rilevato aplotipi di appartenenza a popolazioni di lupi nordamericane o di origine europea sudorientale, indicando che si trattava con ogni probabilità di individui detenuti in cattività e poi rilasciati (Valiére et al. 2003). Analogamente, in un survey della popolazione di lupo nel Parco Nazionale d’Abruzzo Lazio e Molise sono stati rilevati 3 individui il cui aplotipo è stato fin’ora rilevato solo nella popolazioni dell’Europa orientale (Boggiano et al. 2010). Diversi casi d’ibridazione vedono implicato il cane domestico (vedi § 5.3). Questo sembra accadere accade laddove le popolazioni canine sono abbondanti e libere di circolare in natura (p. es., lupo etiope: Gottelli et al. 1994; lupo europeo: Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011) o dove le condizioni di simpatria tra canidi selvatici e cane domestico sono di lunga durata (lupo rosso: Adams et al. 2003a; coyote: Adams et al. 2003b, dingo: Daniels e Corbett 2003, Elledge et al. 2006). Sebbene a oggi non siano stati rilevati casi di sciami ibridi tra lupo e cane analogamente a quanto rilevato tra gatto selvatico e domestico in Scozia o in Ungheria o tra dingo e cane in alcune regioni dell’Australia, l’ibridazione con il cane domestico rappresenta in alcune specie una grave minaccia di estinzione genomica (p. es., lupo etiope: Gottelli et al. 1994). Come in altre specie, l’ibridazione all’interno genere Canis può determinare modificazioni morfologiche, fisiologiche e comportamentali (p. es., Silver e Silver 1969, Mengel 1971, Kolenosky 1971) ed esistono indicazioni sperimentali, anche se estremamente limitate ed aneddotiche, di una ridotta fertilità degli ibridi in natura (Mengel 1971, Gipson et al. 1975). Diverse osservazioni sperimentali sono state condotte in cattività su individui ibridi, essenzialmente tra cane e coyote (p. es., Kennelly e Roberts 1969, Silver e Silver 1969, Mengel 1971) o cane e lupo (Iljin 1941, Kolenosky 1971). Questi studi rimangono ancora oggi di particolare rilevanza per ipotizzare quale possa essere la fisiologia riproduttiva degli ibridi in natura o per suggerire quali le caratteristiche morfologiche che, più di altre, si prestano a essere valutate su base genetica come indici affidabili d’ibridazione (vedi § 6). In alcuni casi d’ibridazione accertata tra specie del genere Canis in natura, è stata anche ipotizzata (su base morfologica) o certificata (su base genetica) la presenza di reincroci nella popolazione parentale, ad indicazione quindi di ibridazione introgressiva (Lehman et al. 1991, Roy et al. 1994, Randi et al. 2000, Andersone et al. 2002, Adams et al. 2003b). 4.2 Asimmetria degli accoppiamenti e direzionalità dell’introgressione Nonostante i riscontri diretti in natura siano estremamente carenti, indicazioni di carattere genetico tendono a suggerire un’asimmetria tra i sessi negli accoppiamenti misti tra specie del genere Canis, o perlomeno per quanto concerne gli effetti che questi accoppiamenti hanno in termini di introgressione; questa è infatti spesso unidirezionale, con direzione prevalente funzione delle specie coinvolte nell’ibridazione e delle condizioni locali (p. es., Lehman et al. 1991, Roy et al. 1994, Vilà e Wayne 1999). Molte indicazioni in tal senso derivano dall’utilizzo del DNAmt, in quanto questo marcatore genetico è ereditato per via materna e non è soggetto a ricombinazione (vedi § 3.2.1), e in alcuni casi sono state confermate da marcatori genetici biparentali (p. es., Roy et al. 1994, 1996). 28 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis Come originariamente ipotizzato (Mengel 1971), recentemente è stato geneticamente confermato che l’ibridazione tra lupo e coyote coinvolge essenzialmente il maschio di lupo e la femmina di coyote (Lehman et al. 1991, Roy et al. 1994): gli ibridi risultanti da questi accoppiamenti vengono poi reintegrati all’interno della popolazione di lupo, mentre questo non sembra avvenire per le popolazioni di coyote. L’introgressione appare quindi in questo caso altamente unidirezionale, procedendo dal coyote al lupo e non viceversa, e ciò può essere dovuto sia ad una marcata asimmetria negli accoppiamenti che alla mancata integrazione nelle popolazione di coyote degli individui ibridi. Situazione analogamente asimmetrica è stata riscontrata nei casi d’ibridazione tra coyote e cane in natura che, sebbene rari, sono stati rilevati su larga scala negli Stati Uniti sudorientali recentemente interessati dall’espansione geografica della specie (Adams et al. 2003b); diagnosticati per la presenza di un aplotipo di origine canina (la24) nelle popolazioni di coyote, questi casi sembrano essere ascrivibili a pochi eventi di ibridazione pregressa tra maschio di coyote e femmine di cane, a partire dai quali alcuni ibridi F1 di sesso femminile si sono poi reintegrati con successo all’interno della popolazione di coyote (Adams et al. 2003b). Anche in questo caso, la direzionalità dell’ibridazione sembra essere stata facilitata da un effetto densità, dovuto al fatto che nei loro movimenti dispersivi a lungo raggio oltre i margini dell’areale i maschi non abbiano trovato facilmente femmine con specifiche con cui accoppiarsi, rendendo quindi più probabile l’accoppiamento con femmine di cane, specialmente in contesti ambientali maggiormente antropizzati (Adams et al. 2003b). Asimmetria è stata inoltre rilevata nell’ibridazione tra lupo etiope (Canis simensis) e cane domestico (femmina di lupo x cane maschio), dove sia il DNAmt che i marcatori nucleari sembrano confermare l’unidirezionalità dell’ibridazione introgressiva (Gottelli et al. 1994); anche in questo caso gli ibridi F1 sembrano sopravvivere ed essere integrati all’interno della popolazione lupina determinando elevati livelli di introgressione di geni canini (Gottelli et al. 1994). Una situazione analoga si riscontra nei casi d’ibridazione introgressiva tra dingo e cane domestico, dal momento che gli ibridi solitamente mostrano DNAmt originario del dingo e mai viceversa (Savolainen et al. 2004), ad indicazione che tutti gli ibridi sopravvissuti e successivamente integrati nella popolazione di dingo hanno come madri di dingo e non di cane; ciò potrebbe dipendere, oltre che dall’asimmetria degli accoppiamenti, anche dal maggiore successo che le femmine di dingo avrebbero nell’allevare i cuccioli nell’ambiente selvatico (Elledge et al. 2006), sebbene i pochi i riscontri diretti in natura non permettono di confermare quest’ipotesi. Tutti gli altri casi di individui ibridi o introgressi tra lupo e cane che sono stati evidenziati per via genetica che gli accoppiamenti che avvengono in natura sono asimmetrici, coinvolgendo preferenzialmente la femmina di lupo e il cane maschio (Italia: Randi et al. 2000, Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003, Verardi et al. 2006, Iacolina et al. 2010; Latvia: Andersone et al. 2002; Svezia e Norvegia: Vilà et al. 2003; Penisola iberica: Godinho et al. 2011). Sono state tuttavia riportate due eccezioni, anch’esse rilevate geneticamente, dalle quali sembrerebbe in prima istanza che si possano verificare anche accoppiamenti in direzione inversa (lupo maschio x femmina di cane), sebbene tali evidenze non sembrino essere conclusive: i casi originariamente diagnosticati in Bulgaria (Randi et al. 2000) sono infatti risultati corrispondere, ad una successiva indagine, a campioni di cane catalogati erroneamente come lupi (Lucchini et al. 2004), mentre il caso rilevato in Latvia non si riferisce ad un ibrido di prima generazione, ma con ogni probabilità ad un ibrido maschio reincrociato con cane femmina, o più semplicemente ad un cane (Andersone et al. 2002:85). Questo evento, anche se è l’unico a essere stato 29 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis attualmente riportato, è quindi coerente con l’asimmetria sessuale negli accoppiamenti tra lupo e cane come ad oggi descritta e dimostra che l’introgressione può comunque verificarsi potenzialmente anche nella direzione del cane, come già illustrato in un caso in Spagna (C. Vilà com. pers., citato in Vilà e Wayne 1999). Va tuttavia sottolineato che l’assenza di riscontri genetici di accoppiamenti in senso inverso (femmina di cane x maschio di lupo) non vuole necessariamente dire che tali accoppiamenti in natura non avvengano affatto; potrebbe infatti trattarsi di eventi che hanno una probabilità di verificarsi sensibilmente inferiore rispetto alla situazione inversa, per esempio in seguito alla brevità della stagione riproduttiva del maschio di lupo rispetto a quella del cane (Asa 1997); congiuntamente, anche la probabilità di essere evidenziati geneticamente potrebbe essere proporzionalmente minore, considerato lo sforzo di campionamento proporzionalmente minore a livello delle popolazioni di cani vaganti su scala locale; o ancora, gli F1 allevati dalla femmina di cane potrebbero mostrare un tasso di sopravvivenza proporzionalmente più basso rispetto agli F1 allevati da una femmina di lupo o, per ragioni di inserimento sociale, da adulti potrebbero comunque avere maggiori difficoltà di reinserimento all’interno della popolazione di lupo. La direzionalità prevalente dell’ibridazione rilevata nella maggioranza dei casi finora riportati (lupo o dingo femmina x cane maschio) sottolinea come il DNAmt, nonostante sia un marcatore estremamente variabile nel cane domestico e quindi potenzialmente diagnostico, non sia da solo valido per evidenziare e tracciare la presenza di ibridi nella popolazione lupina (vedi anche § 5.3). Questo problema è messo chiaramente in evidenza da un caso di ibridazione riportato nella popolazione scandinava di lupo: rispecchiando l’asimmetria negli accoppiamenti finora riportata (femmina di lupo x cane), l’evento è stato evidenziato grazie all’uso integrato di diversi marcatori genetici, ma non sarebbe stato rilevato utilizzando esclusivamente il DNAmt (Vilà et al. 2003). 4.3 Comportamento e fisiologia riproduttiva negli ibridi Sebbene le diverse specie del genere Canis siano in grado di accoppiarsi e generare ibridi fertili, alcuni autori hanno suggerito che in natura ciò è un fenomeno piuttosto raro (p. es., Lehman et al. 1991, Adams et al. 2003b); ciò può essere dovuto ad una serie di motivi, tra i quali l’azione di possibili meccanismi fisiologici di isolamento riproduttivo o una ridotta fitness a livello degli ibridi. Lo sfasamento del periodo riproduttivo negli ibridi, ad esempio, è stato da tempo argomentato come possibile spiegazione della diffusione tutto sommato contenuta delle zone di ibridazione specie affini del genere Canis, incluso il cane domestico. A oggi, purtroppo, sono ancora scarsissime le evidenze dirette di campo per avvalorare le varie ipotesi su quali meccanismi di isolamento riproduttivo siano effettivamente funzionanti ed in quali circostanze; ed è per questo motivo che le poche indicazioni disponibili in tal senso continuano a provenire da osservazioni condotte tra gli anni ’40 ed ’80 del secolo scorso su individui ibridi (coyote, cane e/o lupo) in cattività (Iljin 1941, Dice 1942, Kennelly and Roberts 1969, Silver & Silver 1969, Mengel 1971, Kolenosky 1971, Schmitz and Kolenosky 1985). Sulla base delle predizioni fornite da questi esperimenti, diverse applicazioni di campo, mirate alla definizione tassonomica di individui ipotizzati ibridi su base morfologica, hanno successivamente cercato riscontri fisiologici riproduttivi (p. es., Gipson et al. 1974, 1975, Freeman 1976, Mahan et al. 1978). Le valutazioni scaturite da questi studi, sebbene datate e condotte su un numero particolarmente limitato di individui e di generazioni di ibridi, sono ancora oggi di particolare valore sia per argomentare la discussione teorica della dinamica dell’ibridazione nelle specie 30 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis del genere Canis in natura, sia per istruire la formulazione di ipotesi di ricerca per eventuali studi futuri. Già Iljin (1941) notò che gli ibridi tra cane e lupo mostrano recettività sessuale una sola volta l’anno esattamente come nel lupo, ma con una stagionalità anticipata di circa 2‐3 mesi rispetto al normale periodo riproduttivo. Sebbene in base a tale osservazione il reincrocio degli ibridi all’interno della popolazione di lupo sembrerebbe quindi un evento improbabile, altri autori hanno tuttavia osservato che lo sfasamento del periodo riproduttivo si verificherebbe solo nel caso di incrocio tra femmina di cane e lupo; nel caso opposto, la stagionalità riproduttiva degli ibridi risulterebbe sovrapponibile con quella del lupo, e permetterebbe quindi agli ibridi di reincrociarsi all’interno della popolazione lupina (Ryabov e Bibikov 1982). Ed è interessante notare che è proprio questo tipo di accoppiamento che risulta indirettamente verificato su base genetica (vedi § 4.2), a conferma della possibilità che gli ibridi femmina di lupo x cane hanno di reincrociarsi all’interno della popolazione di lupo. Lo sfasamento riproduttivo è stato confermato anche in esperimenti di ibridazione che hanno coinvolto coyote e cane, i cui ibridi mostrano il picco della fase riproduttiva con un’anticipazione di circa 3 mesi del periodo degli accoppiamenti rispetto al progenitore selvatico (Gier 1957, Silver e Silver 1969, Kennely e Roberts 1969, Mengel 1971). Sulla base di queste indicazioni, è stato quindi ipotizzato che lo sfasamento riproduttivo degli ibridi fosse la causa principale dell’assenza di una massiccia introgressione da parte del cane nelle popolazioni di coyote nonostante una presenza piuttosto diffusa degli ibridi F1 (Mengel 1971:328). Tuttavia, quest’ipotesi non sembra essere stata poi confermata dall’analisi degli organi riproduttivi di diversi canidi in natura, identificati su base morfometrica come coyote, cani e relativi ibridi (Gipson et al. 1974, 1975). Probabilmente a causa dell’elevata variabilità individuale riscontrata negli ibridi, la stagione riproduttiva non risultava sfasata al punto da rendere improbabile l’effettivo reincrocio degli ibridi nelle popolazioni di coyote, mettendo quindi in dubbio l‘ipotesi dello sfasamento riproduttivo come meccanismo efficace di barriera introgressiva (Gipson et al. 1975). Inoltre, mentre l’ipotesi originaria di Mengel (1971) era fondata sull’apparente scarsità di reincroci nelle popolazioni di coyote (sempre valutata su base morfologica), quest’osservazione è stata successivamente confutata da analisi morfometriche di maggior dettaglio condotte su esemplari provenienti da diverse popolazioni di coyote degli Stati Uniti centro‐meridionali (Gipson et al. 1974, Freeman 1976, Mahan et al. 1978). In assenza quindi di una spiegazione che contemplasse una barriera riproduttiva di natura fisiologica, è stato quindi ipotizzato che la relativa stabilità e la mancata diffusione delle zone d’introgressione tra coyote e cane fosse essenzialmente dovuta alla scarsa diffusione delle condizioni ecologiche (abbondanza relativa e integrità sociale) che facilitano l’ibridazione (Gipson et al. 1975). A supporto di ciò, in uno studio in cattività è stata rilevata riluttanza da parte di una femmina di coyote ad accoppiarsi con un cane, se non in assenza della possibilità di accoppiamento con un coyote (Silver e Silver 1969). Nonostante lo sfasamento della stagione riproduttiva non sembrerebbe quindi rappresentare una sufficiente barriera all’introgressione, resta un dato di fatto che negli ibridi si nota un’alterazione della stagionalità rispetto alle forme parentali selvatiche, e questo può a sua volta riflettersi in una maggiore variabilità della data di parto osservata nelle popolazioni introgresse; il fenomeno non sembra essere limitato al coyote, in quanto anche negli ibridi tra femmina di dingo e cane si osserva un’anticipazione della stagione riproduttiva (Jones and Stevens 1988). Situazione analoga è stata riscontrata in un caso d’ibridazione geneticamente confermato in Latvia, dove un ibrido di sesso femminile, probabilmente un F1 come da test di 31 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis assegnazione, ha partorito 7 cuccioli alla fine di febbraio, con almeno un paio di mesi di anticipo rispetto alla regolare data di parto del lupo (Andersone et al. 2002). Altra differenza importante in termini riproduttivi è la presunta ridotta fecondità degli ibridi (coyote x cane: Mengel 1971, Gipson et al. 1975, Fox 1978), possibile indicazione di una loro minore fertilità o di un’accresciuta mortalità prenatale (Mengel 1971); qualsiasi siano le cause, la presunta riduzione nella fecondità degli ibridi potrebbe rappresentare un ulteriore meccanismo per limitare l’introgressione del cane nelle specie selvatiche del genere Canis (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000). Mentre tale ipotesi resta ancora da confermare in natura, sono stati riportati casi in cui anche una presunta riduzione di fertilità degli ibridi non sembra essere stata sufficiente nel prevenire livelli di introgressione massicci (p. es., lupo etiope: Gottelli et al. 1994) o comunque diffusi su larga scala (coyote: Adams et al. 2003b). Dal momento che gran parte del comportamento nel cane è ereditato per via genetica (Scott e Fuller 1965) è lecito attendersi che anche questa espressione fenotipica possa tradire in qualche misura l’origina mista dei ibridi. Sebbene sia difficile apprezzare queste differenze in natura, alcuni studi in cattività su ibridi tra cane e coyote hanno messo in luce una serie di interessanti indizi e che potrebbero essere pertinenti anche agli ibridi lupo/cane; tali indicazioni vanno del resto attentamente interpretate alla luce dell’esiguità delle repliche sperimentali originarie e della mancata valutazione dell’effetto che le razze di cane coinvolte negli esperimenti possono avere avuto sul comportamento delle progenie di origine ibrida. Innanzitutto, nel caso degli ibridi maschi derivanti dagli incroci cane x coyote non si sono osservate cure parentali da parte del maschio (Mengel 1971, Silver e Silver 1969); il comportamento del maschio ibrido durante la stagione riproduttiva differisce inoltre marcatamente da quello dei progenitori selvatici per l’assenza pressoché totale di contatti con la femmina fino a dopo il parto (Silver e Silver 1969), e questo può avere ovviamente un effetto sulle probabilità di sopravvivenza dei cuccioli di ibridi in natura. Un simile comportamento è stato sistematicamente rilevato nei maschi riproduttori dei cani inselvatichiti, ed è una probabile concausa dell’elevata mortalità postnatale dei cuccioli (Boitani et al. 1995, Boitani e Ciucci 1995). Anche in questo caso, quindi, il comportamento riproduttivo del maschio di cane, o di eventuali ibridi maschi, potrebbe essere ulteriore causa di limitata introgressione nel lupo, in quanto una femmina di lupo, riprodottasi con un cane o con un ibrido, avrebbe da sola maggiori difficoltà ad allevare con successo l’intera cucciolata. Anche in questo caso, del resto, tale eventualità non sembra poi essere improbabile così come originariamente postulato (cfr. Vilà e Wayne 1999). Gli ibridi appaiono inoltre mediamente più aggressivi sia dei coyote che del cane (Silver e Silver 1969, Mengel 1971, Fox 1978, Mahan et al. 1978), cosa peraltro già notata in chiave aneddotica sugli ibridi tra lupo e cane in condizioni di sinantropia (Bibikov 1985), anche se i pattern di dominanza e leadership si sviluppano negli ibridi più lentamente (Silver e Silver 1969). Infine, mentre i coyote non sembrano abbaiare, gli ibridi lo fanno prontamente come i cani, mentre tendono ad ululare meno e acquisiscono questa vocalizzazione più tardi durante la crescita (Silver e Silver 1969). In sostanza, in base ai pattern d’ibridazione e introgressione tra coyote e cane precedentemente illustrati, il fenomeno dell’ibridazione tra cane e lupo è interpretabile in base a due ipotesi alternative e che implicano meccanismi di isolamento riproduttivo differenti: da una parte, i meccanismi fisiologici (essenzialmente lo sfasamento della stagione riproduttiva) e, dall’altra, meccanismi ecologici e comportamentali atti a limitare la 32 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 4. Ibridazione nel genere Canis disponibilità e le opportunità di accoppiamenti misti. In seguito alla carenza di ulteriori riprove sperimentali e di campo in tal senso, il peso relativo di queste due ipotesi resta una questione aperta, sebbene casi piuttosto evidenti di introgressione, sia tra lupo e coyote (p. es. Lehman et al. 1991) che tra lupo e cane (p. es. Gottelli et al. 1994, Godinho et al. 2011, Greco 2009, Caniglia et al. in prep.) dimostrino che, qualsiasi essi siano, tali meccanismi di isolamento riproduttivo non sembrano essere sempre funzionali. In una prospettiva gestionale, è bene sottolineare che le due ipotesi sottintendono implicazioni nettamente divergenti: nel primo caso l’isolamento riproduttivo sarebbe garantito dall’integrità genetica stessa della specie selvatica (coyote o lupo che sia) e, finché questa viene preservata dal punto di vista genomico, i meccanismi fisiologici di isolamento riproduttivo agiranno indipendentemente dal contesto ambientale; differentemente, nel secondo caso, l’isolamento riproduttivo sembrerebbe dipendere dal contesto ecologico e dalle condizioni demografiche in cui la specie selvatica ha finora vissuto. Quest’ultimo scenario, rapportato alla situazione recentemente riscontrata in Italia (p. es., Verardi et al. 2006, Greco 2009, Caniglia et al. in prep.) ed altrove (p. es. Gottelli et al. 1994, Godinho et al. 2011), potrebbe suggerire che la mancata diffusione di introgressione ad oggi osservata non necessariamente possa essere garantita nel futuro ed a fronte della graduale espansione del lupo in aree caratterizzate da un maggior livello di sinantropia (vedi § 5.4.2). 33 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane 5.1 Rischio teorico, tecniche d’indagine e prospettive Diversamente da quanto ritenuto in precedenza (cfr. Darwin 1868, Lorenz 1954), il lupo viene oggi considerato con un buon margine di certezza l’unico progenitore selvatico del cane (Okumura et al. 1996, Tsuda et al. 1997, Vilà et al. 1997, Savolainen et al. 2002, Savolainen 2007). Per tale motivo, nonostante il cane venga solitamente distinto come fosse una specie a sé stante (Canis familiaris), esso in realtà viene tassonomicamente considerato al pari di una sottospecie di lupo (Canis lupus familiaris). Come conseguenza delle sue origini, e nonostante la variabilità morfologica delle 400 e più razze canine sia di gran lunga superiore della variabilità riscontrabile all’interno dell’intera famiglia dei Canidi, il cane è geneticamente molto affine al lupo, con differenze a livello del DNAmt paragonabili a quelle che mediamente si riscontrano tra le diverse razze di cane (Savolainen 2007). Non è un caso quindi se l’ibridazione tra cane e lupo si sia verificata più volte nel corso della storia evolutiva del cane domestico, sia accidentalmente, sia verosimilmente intenzionale ed al fine di rinvigorire alcune razze canine (Schwartz 1997, Clutton‐Brock 1999, Ardalan et al. 2012). L’enorme differenza morfologica tra le razze di cane, e tra alcune di queste e il lupo stesso, non deve quindi trarre in inganno sull’origine monofiletica del cane e sull’elevato grado di affinità genetica con il lupo: non si tratta infatti di differenze genetiche di tipo quantitativo o qualitativo, quanto piuttosto di variazioni, indotte dal processo di selezione artificiale, nell’intensità e nei tempi di espressione dei programmi genetici originari del lupo e della conseguente alterazione dei pattern di sviluppo nel cane (Clutton‐Brock 1999, Coppinger e Coppinger 2001). L’elevata similitudine genetica, tra l’altro, è lo stesso motivo per cui non è semplice né immediato rilevare geneticamente individui ibridi o introgressi (Godinho et al. 2011). L’elevata similitudine genetica rende l’ibridazione tra lupi e cani (di taglia simile) un evento teoricamente plausibile, forse più che tra il lupo e altre specie selvatiche del genere Canis. Tuttavia, diversamente da quanto atteso, non esistono a oggi evidenze di introgressione diffusa su scala globale, perlomeno per quanto attiene alle indagini svolte tramite DNAmt (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000); ciò è probabilmente indice del fatto che il lupo allo stato selvatico e il cane domestico hanno occupato nel corso della loro storia evolutiva nicchie ecologiche profondamente diverse. Si tratta comunque di un risultato rilevante, considerato che la coesistenza tra lupo e cane in Eurasia data oltre 15.000 anni (Clutton‐Brock 1999, Savolainen et al. 2002, Ardalan et al. 2012) ed in Nord America 9.000 anni (Schwartz 1997); tuttavia, un risultato forse non ancora del tutto rappresentativo delle profonde modificazioni ambientali ed ecologiche operate dall’uomo in epoca recente e che potrebbero contribuire, tramite meccanismi di ibridazione antropogenica, ad aumentare il tasso di introgressione (p. es., Lehman et al. 1991, Gottelli et al. 1994, Godinho et al. 2011). È infatti utile ricordare, sempre in un’ottica di conservazione, che le analisi ad oggi condotte sulle popolazioni di lupo a larga scala hanno utilizzato essenzialmente il DNAmt, che non è un marcatore valido nel diagnosticare e tracciare casi di ibridazione asimmetrica (vedi § 4.2) come quelli ad oggi riscontrati nel lupo (Vilà e Wayne 1999, Randi e Lucchini 2002, Elledge et al. 2006; vedi anche § 3.2.1). Conseguentemente, è possibile che gli effetti dell’ibridazione tra lupo e cane siano stati in parte sottostimati da queste indagini, le cui conclusioni rassicuranti (p. es., Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000) non appaiono ad oggi avvalorate da dati sufficientemente robusti. Ad esempio, per supportare le conclusioni tratte dalla loro indagine tramite DNAmt su scala 34 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane globale, Vilà e Wayne (1999:197) citano due studi (Randi et al. 1993, Lorenzini e Fico 1995) che convergono su simili conclusioni utilizzando però marcatori biparentali (allozimi), e menzionano inoltre l’assenza di riscontri morfologici di ibridazione su un campione di 600 lupi in Spagna: mentre la variabilità a livello degli allozimi oggi non è considerata diagnostica tra lupo, cane e relativi ibridi (vedi §§ 3.2 e 5.3), le valutazioni morfologiche d’insieme sono in realtà soggettive e poco affidabili e potrebbero risentire di un vizio di valutazione e campionamento (Godinho et al. 2011). Studi successivi, condotti sia in Italia (Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Verardi et al. 2006, Randi 2008) che in Spagna (Godinho et al. 2011) utilizzando marcatori genetici affidabili e procedure di analisi di crescente potere diagnostico, hanno infatti rilevato localmente una situazione diversa da quella inizialmente pronosticata da Vilà e Wayne (1999). Nel valutare la situazione a livello dell’areale globale del lupo (Vilà et al. 1997), bisogna quindi tenere presente la scarsità di studi specifici effettuati utilizzando tecniche genetiche di elevata affidabilità e marcatori più informativi del DNAmt, come ad esempio quelli nucleari biparentali, sessuali paterni, o SNP a livello genomico (vedi § 3.2). Laddove effettuati, questi studi hanno del resto rivelato casi di ibridazione e introgressione precedentemente rimasti inosservati dall’uso del solo DNAmt (p. es., Randi e Lucchini 2002, Verardi et al. 2006, Greco 2009, Godinho et al. 2011), illustrando come con l’aumentare del potere diagnostico delle procedure di indagine (p. es., numero e tipo dei marcatori, modelli statistici) aumenta la frequenza dei casi di introgressione effettivamente rilevati4. Tutto ciò, oltre a servire da stimolo per ulteriori indagini su vasta scala, deve mettere in guardia sulla possibilità che il fenomeno sia stato in parte sottovalutato negli studi pregressi (Godinho et al. 2011); inoltre, esiste anche l’eventualità concreta che il mutare delle condizioni ambientali ed ecologiche ad opera dell’uomo possa determinare un aumento nella frequenza e nella diffusione dell’ibridazione rispetto ai livelli recentemente osservati, e quindi il peso che questo fenomeno può avere per la conservazione e l’integrità genetica del lupo, sia su scala locale che globale. 5.2 Ibridazione tra lupo e cane come problema di conservazione Anche se rara (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000), l’ibridazione con il cane può compromettere l’integrità genomica d’intere popolazioni di lupo (Gottelli et al. 1994); e i casi di ibridazione, anche se rari, si possono diffondere velocemente e su larga scala qualora si verifichino a carico di individui e popolazioni in fase di espansione (Adams et al. 2003b). Fermo restando che le caratteristiche demografiche, espansive e genetiche delle popolazioni selvatiche sono altamente dinamiche, e che l’ibridazione tra lupo e cane può essere significativamente influenzata dalle condizioni ecologiche dominanti, l’assenza ad oggi rilevata di introgressione diffusa a livello delle popolazioni di lupo su scala globale (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000) non deve essere necessariamente considerata una rassicurazione sulle condizioni future; una riflessione, questa, che ci sembra doveroso fare alla luce di tre condizioni che, rispetto al recente passato, caratterizzano la situazione attuale: i. in molti paesi europei e nordamericani le popolazioni locali di lupo sono in fase di espansione e ricolonizzazione dei loro areali pregressi (Boitani 2003), e questo processo di 4
Confronta, ad esempio, Randi e Lucchini 2000 con Verardi et al. 2006 per l’Italia, e Ramirez et al. 2006 con Godinho et al. 2011 per la penisola Iberica. 35 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane crescita comporta paradossalmente il fatto che, rispetto al passato, una maggiore proporzione della popolazione di lupo si trovi a vivere in condizioni sinantropiche; date una serie di condizioni (p. es. livelle elevati di persecuzione, abbondanza di cani vaganti), tali contesti potrebbero corrispondere a maggiori opportunità di ibridazione con il cane domestico e rischi di introgressione (p. es., Andersone et al. 2002). Essendo il lupo inoltre specie altamente vagile, eventuali fenomeni d’ibridazione e/o introgressione a livello locale rischiano di diffondersi su larga scala tramite processi di dispersione che potrebbero andare ad interessare anche le zone più integre e stabili dell’areale; d’altra parte, laddove la dispersione da parte di individui introgressi corrispondesse a fenomeni espansivi dell’areale, ciò comporterebbe la propagazione di sottopopolazioni sostanzialmente introgresse tramite un effetto fondatore. ii. in diversi paesi dell’Europa meridionale e orientale si rilevano elevati numeri di cani liberi di circolare sul territorio, siano essi di proprietà che randagi (Andersone et al. 2002, Randi e Lucchini 2002). Il rischio associato ad un’elevata abbondanza di cani vaganti nelle zone sinantropiche di compresenza con il lupo è alto, poiché aumentano le opportunità di ibridazione tra le due forme, specialmente laddove il contesto ecologico ed antropico non è tale da garantire l’integrità sociale dei branchi di lupo (elevata persecuzione, scarsità di prede di grosse dimensioni, zone ai margini dell’areale consolidato). iii. negli ultimi decenni si è assistito ad un incremento nel commercio di ibridi tra lupo e cane in seguito all’aumentata richiesta da parte di privati (Hope 1994). Si suppone che negli anni ’90 circolassero in Nord America tra i 10.000 (Garcia‐Moreno et al. 1996) ed i 400.000 (Hope 1994) ibridi tra lupo e cane, venduti per lungo tempo senza regolamentazioni di sorta ad un prezzo variabile tra i 250 e 1.500 dollari a cucciolo. Successivamente, in risposta alle crescenti segnalazioni di pericolosità degli esemplari ibridi, ed all’azione congiunta di movimenti per la protezione animale ed associazioni ambientaliste, la vendita degli ibridi è oggi considerata illegale in molti degli Stati Uniti (B. Duman, com. pers.). Tuttavia, la fuga o l’abbandono di questi ibridi in natura è stata e continua a rappresentare prassi frequente e conseguente alle difficoltà che molti proprietari hanno nel gestire questi ibridi come fossero animali d’affezione (Hope 1994). Per l’Europa o per l’Italia il problema non sembra assumere queste dimensioni e, sebbene non si disponga di stime analoghe, non esistono comunque vincoli normativi in merito alla vendita o al possesso di ibridi tra lupo e cane. Sono almeno due le razze di cane commercializzate su scala europea, Italia inclusa, che vantano ibridazione recente con il lupo: il cane cecoslovacco e il cane lupo di Saarlos, razze originariamente derivate da incroci tra il pastore tedesco e lupi di varia origine. A questi si aggiunge in Italia il cane lupo italiano, di cui è vietata la commercializzazione e la riproduzione fuori dall’Ente di tutela, ma che viene dato in dotazione ad enti che si impegnano per la protezione civile. Sebbene si tratti in questi casi di ibridi con una bassa proporzione di componente lupina, è lecito comunque ipotizzare che, laddove questi esemplari vengano lasciati liberi di circolare sul territorio, le loro caratteristiche genetiche e fenotipiche potrebbero corrispondere a maggiori probabilità di ibridazione con il lupo rispetto ad altre razze canine. È bene infine ricordare che, indipendentemente dalle implicazioni di carattere genetico, la sorprendente similitudine morfologica con il lupo di tali ‘razze’ potrebbe creare situazioni in cui vengono addebitati al lupo eventi o comportamenti considerati anomali per la specie (aggressività 36 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane nei confronti dell’uomo, assenza di reazioni di fuga, presenza nei centri urbani, etc.), ma che rientrerebbero nella norma per esemplari ibridi e cresciuti in condizioni domestiche. Al pari di altri casi d’ibridazione, con o senza introgressione, che coinvolgono specie domestiche (vedi § 2), l’ibridazione con il cane può avere effetti particolarmente deleteri per la sopravvivenza e l‘integrità genetica delle popolazioni di lupo attraverso: •
la perdita di frequenze alleliche coadattate, presumibilmente responsabili di adattamenti ecologici e comportamentali del lupo su scala locale; •
un aumento dei rischi di depressione da esoincrocio (Randi 2008) •
la diffusione, tramite introgressione, di varianti geniche del cane domestico poco o affatto adattative allo stato selvatico (cfr. Boitani e Ciucci 1995), con l’effetto di ridurre significativamente la fitness delle popolazioni di lupo su scala locale. Come già illustrato nel capitolo sull’ibridazione antropogenica con le specie domestiche, si riscontrerebbero inoltre effetti negativi anche se l’ibridazione avviene in assenza d’introgressione (competizione per i riproduttori, riduzione del potenziale demografico, diffusione di malattie, etc.). Inoltre, nel caso del lupo, la presenza più o meno diffusa di ibridi, siano essi F1 o reincroci di generazioni successive, potrebbe contribuire in maniera non trascurabile alle problematicità di natura gestionale, economica e sociale che caratterizzano la coesistenza tra lupo ed attività antropica, già sufficientemente esasperate dall’annoso problema dei cani vaganti. Nell’ottica sopra delineata appare importante procedere con una sintesi delle evidenze ad oggi riportate sull’ibridazione tra lupo e cane, nonché con una disamina dei fattori ecologici o di altra natura che sembrano facilitare il verificarsi dei casi di ibridazione rilevati. Questa sintesi, inoltre, è propedeutica a una rivisitazione e valutazione critica delle tecniche e dei criteri diagnostici ad oggi disponibili per l’identificazione degli ibridi (vedi § 6). 5.3 Evidenze recenti d’ibridazione: cronologia e sintesi critica 5.3.1 Dai riscontri di campo alle indagini su larga scala con il DNAmt In seguito all’eccessiva frammentazione e riduzione delle popolazioni di lupo in Europa, ed a fronte di numerose schiere di cani liberi di vagare sul territorio (Genovesi e Duprè 2000), verso la fine del secolo scorso l’ibridazione con il cane domestico veniva paventata come una grave minaccia per le popolazioni residue di lupo (p. es., Boitani 1984, Butler 1994). In particolare, questo scenario prendeva spunto da alcune osservazioni condotte in natura (Petrucci‐Fonseca 1982, Boitani 1986, Blanco et al. 1992) e da un numero crescente di esemplari catturati o recuperati morti il cui fenotipo sembrava particolarmente anomalo (p. es., Boitani e Ciucci 1993). Osservazioni simili venivano contestualmente fatte anche in atre zone dell’areale globale del lupo (p. es., Ryabov 1973, 1978, Mendelssohn 1982, Bibikov 1985), mentre in Nord America, nonostante l’ampia diffusione di ibridi a scopo commerciale (Hope 1994), il problema non sembrava assumere particolare rilevanza per il lupo allo stato selvatico. Tuttavia, laddove venivano fatte segnalazioni su campo di presunti ibridi, queste erano fondate su valutazioni morfologiche, la cui soggettività e debolezza diagnostica è stata precedentemente discussa (vedi § 3.1). Di conseguenza, sebbene si siano istituiti localmente 37 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane programmi di riproduzione del lupo in cattività (Italia: Ciucci e Boitani 1991; Spagna: Ramirez et al. 2006), la percezione del problema non è stata in quegli anni tale da stimolare specifiche azioni gestionali, se non un generale richiamo alla necessità di controllare più efficacemente le popolazioni di cani vaganti (Blanco et al. 1992, Boitani 1993, Boitani e Fabbri 1983a, 1983b, Butler 1994). È a partire dall’ultima decade degli anni ’90 che vengono realizzate le prime indagini genetiche sulle popolazioni di lupo a scala globale, utilizzando il DNAmt come marcatore genetico delle diverse popolazioni (Wayne e Jenks 1991, Wayne et al. 1992, Randi et al. 1993). Oltre alla caratterizzazione della struttura geografica del lupo su larga scala, queste indagini ambivano a fornire indicazioni più attendibili in merito alla diffusione ed entità dell’ibridazione con il cane. I risultati ottenuti ebbero tuttavia l’effetto di ridimensionare il fenomeno rispetto a quanto originariamente ipotizzato: ad eccezione di qualche caso d’introgressione rilevato nelle popolazioni dell’Europa orientale e della Russia occidentale (Vilà et al. 1997, Randi et al. 20005), tutte le altre popolazioni di lupo esaminate, sia in Nord America che in Europa, non mostravano segni di introgressione (Wayne et al. 1992, Vilà et al. 1997, Randi et al. 2000). Sulla base di quelle indicazioni preliminari, quindi, venne ipotizzato che l’ibridazione tra lupo e cane non fosse un fenomeno diffuso, bensì si manifestasse con frequenza scarsa e localizzata e senza conseguenze introgressive degne di nota (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000). A spiegazione di ciò è stata ipotizzata la presenza, tra lupo e cane, di barriere riproduttive di natura fisiologica e comportamentale evidentemente efficaci nel prevenire fenomeni introgressivi (Vilà e Wayne 1999). L’unica importante eccezione, rilevata già da allora tramite l’impiego congiunto di DNAmt e marcatori molecolari biparentali, vedeva alcune popolazioni di lupo etiope (Canis simensis) ampiamente introgresse con il cane domestico, anche in questo caso tramite accoppiamenti asimmetrici tra femmina di lupo e cane (Gottelli et al. 1994); proprio le differenze riscontrate rispetto al lupo nel comportamento riproduttivo e sociale delle femmine di C. simensis avrebbe rappresentato secondo alcuni autori la conferma che il mancato riscontro di introgressione in C. lupus fosse dovuto all’esistenza di barriere riproduttive efficaci tra lupo e cane (Vilà e Wayne 1999). 5.3.2 Applicazioni genetiche con marcatori biparentali Le indagini genetiche preliminari, ed in base alle quali la problematicità dell’introgressione venne agli inizi degli anni 2000 ridimensionata, utilizzarono il DNAmt come marcatore genetico (Wayne et al. 1992, Vilà et al. 1997, Randi et al. 2000). Tuttavia, dal momento che questo marcatore non è in grado di identificare l’eventuale introgressione per via paterna (vedi §§ 3.2.1, 4.2, e 5.1), le conclusioni a cui tali indagini sono pervenute si riferiscono quindi essenzialmente all’introgressione per via materna e non contemplano la possibilità opposta di ibridazione o introgressione per via paterna (Andersone et al. 2002, Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Godinho et al. 2011). È quindi con la disponibilità di marcatori genetici più informativi, ed in particolare quelli biparentali, che vengono avviati dall’inizio dagli anni 2000 in poi studi per la caratterizzazione genetica di alcune popolazioni di lupo, riuscendo in questo caso a mettere in evidenza diversi 5
Vedi anche Lucchini et al. (2004) per la possibilità che i campioni provenienti dalla Bulgaria fossero stati erroneamente etichettati ed appartenessero in realtà a cani 38 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane casi di introgressione, sia Europa occidentale (Italia: Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003, Lucchini et al. 2004, Verardi et al. 2006; Svezia e Norvegia: Vilà et al. 2003; penisola Iberica: Godinho et al. 2011) che altrove (Latvia: Andersone et al. 2002; Croazia e Israele: Lucchini et al. 2004). Tuttavia, alla luce delle informazioni e delle tecniche di analisi genetica attualmente disponibili, anche l’interpretazione dell’introgressione fornita da questi primi studi basati su marcatori nucleari biparentali rischia di semplificare la reale portata del problema. Contestualmente, le indicazioni prodotte dai biologi di campo su base morfologica continuavano a suggerire la presenza non trascurabile di casi di ibridazione e/o introgressione in diverse popolazioni di lupo, sia in Europa occidentale (Italia: L. Boitani, in litteris; Germania orientale: I. Reinhardt, com. pers.) che altrove (Russia, Ucraina, Bielorussia, Latvia: Andersone et al. 2002; Serbia: Milenković 2006). Si è andata quindi delineando nei primi anni del 2000 una diversità di opinioni tra biologi di campo e genetisti che, a nostro avviso, piuttosto che riflettere visioni pregiudiziali o posizioni dogmatiche, dipendeva da difficoltà intrinseche nel coniugare i criteri morfologici con quelli genetici al fine di una valutazione del fenomeno più convincente, sintetica e condivisibile. Mentre in Nord America una simile disparità di vedute aveva come oggetto ipotesi alternative in merito all’origine del lupo rosso (C. rufus), e quindi all’interpretazione gestionale dell’ibridazione tra C. rufus, C. latrans e C. lupus (p. es., Dowling et al. 1992a, 1992b, Wayne et al. 1992), in Europa essa verteva, sebbene con toni molto più ridotti ed essenzialmente circoscritti ad un ambito prettamente tecnico, sul grado di affidabilità delle diagnosi genetiche e sulla relativa quantificazione del livello di introgressione a livello di popolazione. In sostanza, i biologi di campo non erano rassicurati dal fatto che esemplari con caratteri morfologici da loro considerati palesemente anomali, e quindi a loro dire possibile indice di introgressione, risultassero poi appartenere geneticamente alle popolazioni di lupo; questo anche perché, dato l’innegabile peso che i più affidabili criteri genetici assumono in un contesto gestionale, la presenza e diffusione di individui fenotipicamente anomali non sembrava in alcun modo stimolare una discussione o una reazione gestionale consona ai tempi di reazione indicati per questo tipo di problema (cfr. Allendorf et al. 2001), essenzialmente in virtù del mancato riscontro su base genetica. Il caso della recente diffusione di forme melaniche nei lupi in Italia è emblematico in questo senso: mentre alcuni ritenevano che la presenza di varianti melaniche fosse un chiaro indizio di ibridazione (L. Boitani, in litteris; G. Boscagli, in litteris) altri, in assenza di riprove genetiche che indicassero il contrario, non si pronunciavano a favore di questa ipotesi rispetto a quella alternativa di una comparsa e successiva fissazione di una mutazione spontanea all’interno della popolazione italiana di lupo (Randi e Lucchini 2002, Apollonio et al. 2004). Le differenti valutazioni su base fenotipica e genetica non sono di facile conciliazione e tanto meno sono questioni di mero interesse accademico: al contrario, esse hanno implicazioni gestionali di fondamentale rilevanza pratica (vedi § 6.1). Come in tutti i casi di ibridazione antropogenica, infatti, il tempismo con il quale si è in grado di interviene non solo può determinare quali siano gli interventi più idonei e fattibili da realizzare, ma il loro stesso margine di successo (Allendorf et al. 2001); di conseguenza, trascurare eventuali errori di identificazione può avere peso e conseguenze drammatiche in termini di gestione. Tornando per esempio al caso dei lupi melanici in Italia (vedi sopra), oggi, quando ormai disponiamo della prova genetica che il melanismo nel lupo è un segnale di ibridazione con il cane (Schmutz et al. 2007, Anderson et al. 2009, ISPRA 2009), gli individui melanici si sono nel frattempo 39 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane ampiamente diffusi in molte zone dell’Appennino centro‐settentrionale e tutti portano una firma genetica della loro origine introgressa con il cane (Greco 2009); appare ovvio che in queste circostanze, rispetto a quando vennero fatte le prime segnalazioni di individui melanici, le opzioni gestionali sono ormai molto più limitate, costose e di difficile attuazione dal punto di vista logistico e sociale. In definitiva, sebbene le indagini condotte nei primi anni 2000 utilizzando marcatori nucleari biparentali hanno evidenziato casi di introgressione con maggiore efficienza di quanto fosse stato fatto dalle indagini precedenti in base al solo DNAmt, i casi di introgressione sono stati rilevati con frequenza scarsa o comunque minore rispetto a quanto atteso in base a valutazioni fenotipiche. Ribadendo comunque l’ambiguità intrinseca delle valutazioni fenotipiche, una possibile spiegazione di quanto osservato risiede a nostro avviso, oltre che in motivazioni di carattere campionario, nel relativamente basso potere diagnostico delle indagini genetiche condotte con un numero limitato di marcatori (Godinho et al. 2011; vedi anche §§ 3.2.5 e 3.2.6): mentre oggi viene suggerito che un numero di loci inferiore a 48 non offre probabilità adeguate di identificare individui ibridi o introgressi, la maggior parte degli studi genetici effettuati sul lupo nella prima decade degli anni 2000 non si è spinto oltre i 18 loci, e molti programmi di monitoraggio genetico sono stati tradizionalmente basati su un numero di loci variabile tra 6 e 12 (Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Randi et al. 2005). È quindi lecito ipotizzare che alcuni individui introgressi siano stati probabilmente originariamente assegnati alla popolazione italiana di lupo, portando ad una sottostima del fenomeno (Godinho et al. 2011). Il rischio di sottostima è tanto maggiore quanto minore è la probabilità di campionare ibridi di prima generazione (F1), situazione che infatti sembra essere rivelata da studi più recenti basati su tecniche genetiche ad elevata efficienza: molti individui ibridi ad oggi rilevati in Italia sono reincroci di varia generazione all’interno della popolazione parentale di lupo (come indicato dagli aplotipi del DNAmt e del cromosoma Y, entrambi caratteristici del lupo; Caniglia et al in prep.), individui quindi particolarmente difficili da evidenziare con test di assegnazione basati su uno scarso numero di loci microsatellite. 5.3.3 Applicazioni genetiche ad elevata efficienza È ormai risaputo noto che i marcatori microsatellite e i metodi di assegnazione basati sulle frequenze alleliche dei genotipi multilocus sono scarsamente diagnostici dei casi di introgressione se il numero di marcatori utilizzati non è sufficientemente elevato (vedi § 3.2.5)6. In questi casi, specialmente se si utilizzano loci indipendenti, il segnale di ibridazione si perde velocemente attraverso le generazioni di reincrocio, a meno che non venga utilizzato un numero elevato di loci (≥48; Vähä e Primmer 2006). Questo è un dato di fatto oggi ampiamente riconosciuto (p. es., Manel et al. 2005, Vähä e Primmer 2006, Godinho et al. 2011) e che potrebbe di fatto riconciliare quanto rilevato dalle prime applicazioni con marcatori genetici biparentali con la percezione dell’introgressione su base morfologica (vedi § 5.2.2). In altri termini, se è vero che le applicazioni genetiche che hanno utilizzato da 16 (Andersone et al. 2002) a 18 (Randi e Lucchini 2002, Vilà et al. 2003, Lucchini et al. 2004) loci microsatellite hanno buone probabilità di rilevare ibridi o reincroci di prima generazione, è del 6
È da sottolineare tuttavia come questo concetto sia ancora oggi rimasto di essenzialmente di pertinenza dei tecnici addetti ai lavori e non sia stato sufficientemente divulgato all’interno delle amministrazioni che si occupano a vario titolo di gestione e conservazione della fauna. 40 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane resto molto probabile che individui introgressi di generazioni pregresse rimangano criptici ai test di assegnazione basati su questo numero di loci (Vähä e Primmer 2006, Greco 2009); potrebbe questo rappresentare un problema piuttosto rilevante se consideriamo che gli esemplari ibridi all’interno della popolazione di lupo (in Italia come altrove) possano essere in larga parte reincroci di varie generazioni (ovvero quelli di difficile identificazione con tecniche genetiche tradizionali), mentre gli ibridi di prima generazione sono rari e corrispondono a probabilità piuttosto scarse di essere campionati. Nella prospettiva sopra delineata, è del resto probabile che alcuni segnali fenotipici, sebbene più difficili ed ambigui da interpretare, perdurino per più tempo e siano quindi maggiormente rintracciabili attraverso le generazioni (vedi § 6.3). È altresì vero che, utilizzando un numero limitato di loci microsatellite, il mancato riscontro d’introgressione in individui con caratteristiche fenotipiche considerate anomale non necessariamente vuole dire che quelle caratteristiche non possano effettivamente essere segno di introgressione. Questo potrebbe spiegare, ad esempio, come mai diversi individui melanici nella popolazione italiana di lupo siano risultati lupi in base ai test di assegnazione in analisi precedenti (Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004), mentre la stessa caratteristica fenotipica sia stata successivamente riconosciuta, tramite sequenziamento diretto dei geni implicati, essere un segnale di ibridazione con il cane domestico (Schmutz et al. 2007, Anderson et al. 2009). Analogamente, nonostante sia stato dimostrato che il quinto dito sulle zampe posteriori (lo sperone) è un chiaro segno di introgressione (Ciucci et al. 2003), diversi esemplari di lupo recuperati morti nell’Appennino centro‐settentrionale e che presentano questa caratteristica fenotipica continuano ad essere geneticamente riconosciuti, tramite test di assegnazione (evidentemente basati su un numero di loci insufficiente), come appartenenti a tutti gli effetti alla popolazione italiana di lupo (L. Rigacci, com. pers; C. Esposito, com. pers.). Applicazioni genetiche più recenti hanno mostrato come, con l’ulteriore sviluppo di strumenti, tecniche e marcatori diagnostici più sofisticati a disposizione, i limiti delle indagini basate su un numero insufficiente di loci biparentali possono essere superati e quindi fornire una panoramica qualitativamente e quantitativamente più accurata e gestionalmente informativa del fenomeno dell’introgressione. In Italia, per esempio, recenti indagini condotte dall’ISPRA hanno riconosciuto come un numero di loci microsatellite limitato abbia effettivamente uno scarso potere nell’identificazione di individui introgressi (Verardi et al. 2006, Randi 2008), dimostrando altresì come l’impiego di marcatori più affidabili come gli SNP (p. es., locus‐k) risulti essere più affidabile per l’identificazione di individui introgressi altrimenti criptici alle analisi genetiche tradizionali (Greco 2009). Un efficace esempio di approccio genetico particolarmente innovativo ed affidabile è quello del sequenziamento genico diretto di caratteri (mutazioni) di origine canina (p. es., Schmutz et al. 2007, Anderson et al. 2009; vedi anche § 3.2.7). Ad esempio, l’individuazione delle mutazioni di origine canina A82S, R83H e R96C del gene Agouti (Schmutz et al. 2007), implicato nella colorazione del pelo nei mammiferi, o della variante CBD103ΔG23 del locus‐K (KB; Anderson et al. 2009, Greco 2009), unitamente alla comprensione del ruolo che queste mutazioni hanno nella colorazione melanica del cane rispetto alle varianti alleliche ancestrali, hanno portato all’individuazione di marcatori genetici che fungono da indicazione diretta di introgressione con il cane. Utilizzando questi stessi marcatori, ad esempio, in Nord America sono state trovate indicazioni di introgressione pregressa con il cane in un lupo proveniente dall’Alberta (Schmutz et al. 2007), e in 117 lupi su 265 campionati provenienti dall’artico canadese e dallo 41 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane Yellowstone (Anderson et al. 2009). Anche in Italia, il sequenziamento genomico di questa mutazione ha permesso di concludere che il melanismo nel lupo è un segno di ibridazione con cani portatori di questa variante genetica, sebbene il fenomeno sia in questo caso molto più recente che in Nord America (Greco 2009). Come atteso, anche in questo caso l’affinamento delle tecniche sembra corrispondere ad un potere maggiore di identificazione degli ibridi. Nei laboratori ISPRA sono stati recentemente individuati altri SNP potenzialmente utili per l’identificazione dei casi di introgressione (variazioni dei complessi genici Agouti e Mc1r) e messi a punto 70 altri SNP per una più accurata caratterizzazione della popolazione italiana di lupo (Greco 2009). L’applicazione di tecniche genomiche apre quindi interessanti prospettive sulle possibilità future di indagare con maggiore accuratezza occorrenza e diffusione degli individui introgressi, e quindi fornire indicazioni più affidabili, rispetto al recente passato, in chiave gestionale. Le tecniche genomiche sono del resto ancora piuttosto costose e richiedono fasi di analisi piuttosto elaborate, motivo per cui ad oggi si delineano ancora più come tecniche integrative piuttosto che sostitutive dei marcatori utilizzati correntemente. In questa prospettiva è bene sottolineare che sono state recentemente realizzate indagini genetiche che hanno portato a risultati più informativi ed affidabili sull’introgressione; queste hanno contemplato l’impiego di un numero significativamente superiore di loci microsatellite (p. es., ≥ 42; Godinho et al. 2011), oppure di loci di tipo differente (linked; p. es., Verardi et al. 2006). Questi ultimi loci, associati tra loro fisicamente all’interno dei cromosomi, non assortiscono infatti in maniera indipendente e quindi tengono traccia degli eventi di introgressione per un numero maggiore di generazioni (vedi §§ 3.2.2 e 3.2.4). Ad esempio, utilizzando un panel di 16 loci associati e 4 non associati, Verardi et al. (2006) hanno rilevato nella popolazione di lupo in Italia livelli di introgressione superiori rispetto alle indagini precedenti (Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004). Analogamente, un’indagine svolta recentemente nella penisola iberica utilizzando un panel di 42 loci (Godinho et al. 2011) ha rivelato livelli di introgressione superiori rispetto a studi precedenti in cui erano stati utilizzati 13‐18 loci (Lucchini et al. 2004, Ramirez et al. 2006). In sostanza, quanto sopra illustra che nelle applicazioni genetiche precedenti, da quelle basate sul DNAmt (Vilà et al. 1997, Randi et al. 2000) a quelle basate su un numero limitato di loci microsatellite (Randi e Lucchini 2002, Andersone et al. 2002, Lucchini et al. 2004), sia evidente la possibilità che esemplari introgressi non siano riconosciuti geneticamente come tali, e che quindi frequenza e diffusione dei fenomeni introgressivi siano state ampiamente sottostimate (Godinho et al. 2011). Questi stessi autori, inoltre, mettono in luce come anche i criteri di selezione degli esemplari dai quali prelevare i campioni per le analisi genetiche possano influenzare significativamente la quantificazione dell’ibridazione a livello dell’intera popolazione; esiste infatti la possibilità che individui fenotipicamente devianti dallo standard atteso siano sistematicamente scartati in fase di recupero o nelle collezioni di riferimento in quanto ritenuti cani o comunque esemplari potenzialmente ibridi, contribuendo in tal modo a sottostimare ulteriormente l’effettiva prevalenza e diffusione degli individui ibridi o introgressi nella popolazione (Godinho et al. 2011). A tal fine, si ricorda che un’adeguata strategia di campionamento non solo è funzionale alla corretta interpretazione delle procedure di assegnazione (vedi § 3.2.6), ma anche a garantire la rappresentatività del campione a livello dell’intera popolazione. Nel caso il campione analizzato non corrisponda a criteri di campionamento statisticamente validi (numericamente, geograficamente e temporalmente; vedi § 3.2.6) la proporzione d’individui ibridi e/o 42 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane introgressi rilevata non può essere considerata rappresentativa in quanto molti vizi di campionamento potrebbero inficiare la validità del processo di inferenza all’intera popolazione di origine. In questa prospettiva, condividendo i commenti di Godinho et al. (2011) in merito ai limiti dei metodi di campionamento opportunistico da loro stessi adottate, a maggior ragione crediamo che tali limiti siano altrettanto evidenti in studi simili condotti altrove (Andersone et al. 2002, Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Verardi et al. 2006): tutti questi studi sono infatti basati su tecniche di ‘campionamento’ passive, ovvero opportunistiche e probabilmente filtrate da criteri di selezione fenotipica a priori. In questa prospettiva, sembra infine importante ribadire che l’entità numerica del campione ha un peso non indifferente nella quantificazione dell’introgressione, in quanto campioni relativamente esigui non potrebbero essere rappresentativi del tasso di introgressione reale a livello di popolazioni su scala locale. Ad esempio, nel lavoro di Lucchini et al. (2004) è interessante notare che, sebbene i campioni relativi ad individui introgressi fossero 21 sui 383 analizzati (5.5%) e la loro diffusione interessasse 5 delle 10 popolazioni di lupo campionate (50%), quest’ultima proporzione aumenta radicalmente (80%) prendendo in considerazione le sole popolazioni per le quali sono stati analizzati almeno 20 campioni, vale a dire le popolazioni per le quali esiste una minima probabilità di campionare individui introgressi (4 popolazioni su 5 campionate: Italia, Latvia, Croazia, Bulgaria7). 5.3.4 Sintesi, implicazioni gestionali e prospettive A circa 30 anni dalle prime richieste di attenzione gestionale che intravvedevano nell’ibridazione con il cane una possibile minaccia per le popolazioni ridotte e frammentate di lupo in Europa (Boitani 1984, Butler 1994), si è assistito ad una proliferazione di tecniche, strumenti e di conseguenti applicazioni genetiche per l’analisi del fenomeno (Randi 2008); ciò ha senza dubbio permesso una descrizione più affidabile del fenomeno di quanto permesso dalla sola diagnosi fenotipica, fornendo indicazioni potenzialmente utili in chiave gestionale (p. es., Vilà et al. 2003). Dalle prime applicazioni a larga scala degli anni ’90, in cui si utilizzava il DNAmt come marcatore di ibridazione per via materna (Vilà et al. 1997, Randi et al. 2000), si è passati agli studi che hanno visto l’impiego di marcatori biparentali e l’uso integrato di due o più marcatori genetici (Andersone et al. 2002, Randi e Lucchini 2002, Vilà et al. 2003, Lucchini et al. 2004, Iacolina et al. 2010), o l’impiego delle più recenti tecniche genomiche (Anderson et al. 2009, Greco 2009). L’immagine generale che emerge dagli studi effettuati nel corso degli ultimi due decenni è che, sebbene alcuni casi d’introgressione siano stati occasionalmente rilevati in Europa occidentale (Italia, Svezia), e con maggiore frequenza sia in Europa orientale (Bulgaria, Latvia, Ucraina) che nella Russia occidentale, il fenomeno sembra essere localizzato e relativamente contenuto; alcuni autori hanno inoltre ipotizzato che questa situazione potrebbe rispondere a meccanismi di isolamento riproduttivo sufficientemente efficaci ed operanti in popolazioni di lupo ecologicamente e demograficamente integre (Vilà e Wayne 1999). Tuttavia, queste conclusioni risentono in una certa misura delle tecniche genetiche ed analitiche utilizzate, nonché della limitata generalizzabilità dei risultati, essendo questi basati 7
È inoltre interessante notare che la quinta popolazione campionata (Spagna; n=32 campioni di lupo), che risulta essere esente da ibridi nello studio di Lucchini et al. (2004), viene invece caratterizzata da un’elevata proporzione di individui introgressi nello studio successivo di Godinho et al. (2011) basato su un numero molto superiore di esemplari campionati (n=214 lupi e potenziali ibridi) e di loci microsatellite. 43 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane su strategie di campionamento opportunistiche. Esistono oggi ampi margini di miglioramento in entrambe le direzioni al fine di individuale esemplari introgressi e produrre stime di introgressione sempre più informative ed attendibili. Tuttavia, con l’importante ed emblematica eccezione riportata per la Norvegia (cfr. Vilà et al. 2003), alla luce delle indicazioni scaturite dagli studi genetici sopra menzionati non sono stati attivati, né a livello nazionale né Europeo, interventi o iniziative gestionali atte ad un controllo attivo del fenomeno. Non solo in Italia ma anche in altri paesi europei (Spagna, Germania, Latvia) si andavano nel frattempo accumulando segnalazioni di lupi considerati fenotipicamente anomali, con frequenza e distribuzione tali da apparire in contrasto con l’interpretazione del fenomeno che nel frattempo stava emergendo su base genetica (Boitani & Ciucci 1993, Butler 1994, Andersone et al. 2002, Vilà et al. 2003, I. Reinherdt, com pers.). Tuttavia, il considerevole sviluppo delle tecniche genetiche da una parte, e l’affinamento delle procedure statistiche per l’analisi delle frequenze alleliche dall’altra, hanno recentemente permesso la diversificazione dei marcatori genetici ed una maggiore affidabilità delle procedure di identificazione degli ibridi (Randi e Lucchini 2002, Verardi et al. 2006, Randi 2008, Anderson et al. 2009, Iacolina et al. 2010). I più recenti studi di carattere genetico sull’ibridazione tra cane e lupo sia in Italia che altrove (Verardi et al. 2006, Randi 2008, Iacolina et al. 2010, Godinho et al. 2011), inclusi quelli basati sulle più recenti tecniche genetiche (Anderson et al. 2009, Greco 2009), tendono oggi a descrivere il fenomeno dell’introgressione con frequenza e diffusione maggiori di quanto precedentemente rilevato (vedi anche Randi 2008 per una sintesi). Ciò richiama l’attenzione su una serie di implicazioni tecniche e gestionali particolarmente rilevanti: •
è plausibile che le precedenti indagini genetiche, per una serie di aspetti metodologici, analitici e di campionamento possano avere sottostimato l’effettivo livello di introgressione nelle popolazioni di lupo finora studiate (Godinho et al. 2011); •
mentre è difficile al momento valutare l’effetto che questa sottostima ha avuto in termini di conservazione (cfr. Godinho et al. 2011), è tuttavia nostra opinione che, facendo riferimento al contesto gestionale delineato da Allendorf et al. (2001) in merito all’introgressione antropogenica, una percezione ridotta del fenomeno possa avere causato un pericoloso ritardo nella valutazione, discussione, pianificazione ed eventuale attuazione di adeguate misure di intervento cautelativo e di controllo (vedi anche § 5.1); •
i risultati dei più recenti studi genetici (Verardi et al. 2006, Anderson et al. 2009, Iacolina et al. 2010, Godinho et al. 2011, Caniglia et al. in prep.) tendono ad una maggiore riconciliazione con i riscontri diretti (fenotipici, ecologici) di ibridazione sul campo accumulatisi dagli anni ’80 in poi. Di conseguenza, le apparenti incongruenze tra le indicazioni fenotipiche ed i risultati delle precedenti applicazioni genetiche possono aver originato in larga misura dallo scarso potere diagnostico di studi basati su marcatori genetici insufficienti in numero e tipologia, soprattutto se confrontato con la possibilità che caratteristiche fenotipiche anomale perdurino invece attraverso le generazioni di reincrocio (Ciucci et al. 2003, Anderson et al. 2009). La necessità di operare un’ulteriore sintesi tra criteri genetici e fenotipici per diagnosi ad elevata efficienza appare quindi un elemento fondamentale per il controllo e monitoraggio del fenomeno nell’immediato futuro. 44 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane Quanto sopra, se da una parte porta alla (ri)considerazione di prospettive gestionali finora non ritenute prioritarie, dall’altra pone dei quesiti critici sulla necessità di monitorare più efficacemente presenza, frequenza e diffusione dell’introgressione canina nelle popolazioni di lupo. Quest’attività di monitoraggio necessita oggi di approcci d’indagine più rigorosi e affidabili e, possibilmente, concilianti le informazioni relative ai marcatori genetici, di tipo e numero adeguati, con valutazioni di carattere fenotipico, pur sempre soggettive ma comunque integrative e di estremo valore pratico (Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003). Infatti, a differenza di casi d’ibridazione antropogenica che vedono coinvolte altre specie domestiche, nel caso del lupo non sono stati a oggi effettuati tentativi degni di nota per descrivere in maniera più accurata e oggettiva la variabilità fenotipica osservata, né tantomeno per confrontare questa variabilità con evidenze di carattere genetico; un passaggio, questo, importante non solo per supportare ed integrare le diagnosi condotte su base genetica (p. es., Andersone et al. 2002, Ciucci et al. 2003), ma soprattutto per individuare quelle caratteristiche fenotipiche potenzialmente utilizzabili come segnali pratici ed affidabili dei casi di introgressione per l’attuazione di interventi gestionali (Randi e Lucchini 2002, Randi 2008; vedi anche § 6.3). Infine, gli studi genetici ad oggi realizzati sull’ibridazione tra cane e lupo, nonché supportati da studi simili condotti su altre specie del genere Canis (vedi § 4.2), hanno apportato informazioni innovative per una migliore comprensione dei meccanismi d’ibridazione e di propagazione dell’introgressione, informazioni che appaiono comunque critiche in un’ottica gestionale. Contrariamente alle predizioni su base teorica (Vilà e Wayne 1999), oggi possiamo affermare che l’introgressione da parte del cane avviene all’interno delle popolazioni selvatiche di lupo e con frequenza e distribuzione tutt’altro che irrilevanti; secondariamente, che il fenomeno è caratterizzato da due aspetti particolarmente rilevanti in chiave gestionale: 1. la direzionalità dell’introgressione, che sembra essenzialmente procedere per via paterna dal cane a lupo tramite accoppiamenti asimmetrici (femmina di lupo e cane maschio) o sopravvivenza/reincrocio preferenziale degli ibridi che scaturiscono da questi accoppiamenti (vedi § 4.2); e 2. le condizioni ecologiche e di antropizzazione che, più di altre, sembrano facilitare insorgenza e diffusione del fenomeno (vedi § 5.4). 5.4 Fattori facilitanti l’introgressione e implicazioni gestionali 5.4.1 Rischio di introgressione antropogenica tra lupo e cane Il cane e lupo, sebbene geneticamente molto affini, sono e rimangono due forme la cui ecologia è profondamente diversa, motivo per il quale la distinzione si è mantenuta tale per gli oltre 15.000 anni. Da ciò si desume che gli eventi d’ibridazione spontanei in natura rappresentano comunque un evento raro e che, in condizioni naturali, ciò dipende molto probabilmente da barriere riproduttive di natura ecologica, fisiologica e comportamentale tali da minimizzare eventuali contatti riproduttivi tra lupo e cane ed i conseguenti effetti introgressivi (Mengel 1971, Vilà e Wayne 1999). Tuttavia, è nel corso degli ultimi decenni che si 45 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane stanno creando situazioni nuove dal punto di vista ambientale in quanto ad intensità e scala geografica degli effetti delle attività antropiche; contestualmente, molte popolazioni di lupo sono interessate da una vivace dinamica espansiva, peraltro all’interno di un territorio in cui sono presenti numeri elevati di cani vaganti e ciò potrebbe corrispondere a maggiori opportunità di ibridazione tra le due forme di quanto non si sia finora verificato (vedi anche § 5.2). In sostanza, l’ipotesi è che l’attività antropica, attraverso meccanismi diretti ed indiretti, possa ridurre l’efficacia delle barriere riproduttive esistenti tra lupo e cane e che sembrano avere garantito fino ad epoche recenti la distinzione tra le due forme; peraltro, su tratta di un’ipotesi a oggi avvalorata dagli studi sull’ibridazione finora condotti anche su altre specie del genere Canis (p. es., lupo e coyote: Lehman et al. 1991, Roy et al. 1992, 1994; Adams et al. 2003b, Adams e Waits 2007). Da una parte, è indubbio che: (i) fertilità e sopravvivenza possono essere ridotte negli ibridi rispetto alle forme parentali selvatiche; (ii) gli ibridi possano mostrare uno sfasamento della stagione riproduttiva; (iii) questi e altri fattori possano contribuire a limitare l’introgressione anche in presenza di ibridazione sostanziale (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000, Randi e Lucchini 2002). Tuttavia, d’altra parte è anche vero che questi meccanismi potrebbero non essere più sufficienti laddove le occasioni di ibridazione siano particolarmente diffuse e frequenti, o laddove si verificano interazioni particolari tra condizioni che facilitano la diffusione dell’introgressione (Adams et al. 2003b, Anderson et al. 2009; vedi anche § 4.3). Da una disamina degli studi effettuati sui casi d’ibridazione di cui alla presente relazione, ed in particolare da quelli concernenti l’ibridazione tra lupo, cane e altre specie del genere Canis (p. es., Dingo e cane, lupo e coyote), emergono infatti alcune condizioni che sembrano facilitare l’insorgenza e la diffusione dell’introgressione: sebbene si tratti di deduzioni basate su evidenze correlative piuttosto che sperimentali, da esse emergono comunque alcuni concetti considerati particolarmente critici ed indicativi in prospettiva gestionale. 5.4.2 Fattori condizionanti l’ibridazione tra lupo e cane Diversi fattori sembrano contribuire alla probabilità d’ibridazione e introgressione nelle popolazioni locali di lupo (Silver e Silver 1969, Lehman et al. 1991, Gottelli et al. 1994, Daniels e Corbett 2003, Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011, Caniglia et al. in prep.): nell’illustrazione che segue questi fattori vengono discussi singolarmente, sia per facilitarne l’esposizione, sia perché inquadrano il livello funzionale rispetto al quale gli interventi gestionali devono essere calibrati e messi in atto. Tuttavia, ciascuno tra i fattori esaminati non rappresenta da solo condizione sufficiente per un aumento significativo del rischio di introgressione; è piuttosto l’interazione tra i vari fattori che, a livello locale, può determinare situazioni particolarmente favorevoli al verificarsi del fenomeno. In un’ottica gestionale, maggiore è il numero di fattori di rischio, maggiori saranno le probabilità locali di introgressione. L’introgressione può interessare varie generazioni d’ibridi e di loro reincroci all’interno della popolazione parentale, e ciascuno di questi passaggi generazionali (F1, F2, B1, B2, etc.) si verificherà con probabilità differenti a seconda delle condizioni locali e in base all’ecologia e comportamento della specie. In particolare, nel caso specifico dell’ibridazione introgressiva tra lupo e cane, riteniamo che, tra i vari passaggi generazionali della diffusione introgressiva, la produzione e la sopravvivenza degli ibridi di prima generazione (F1) rappresenti l’evento che ha minori probabilità di verificarsi (vedi anche Mallet 2005): l’evento d’ibridazione iniziale 46 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane comporta infatti una serie di condizioni, ciascuna delle quali risulta piuttosto improbabile in contesti ecologici relativamente integri: i.
l’instaurarsi di relazioni affiliative tra una femmina di lupo ed un cane maschio; ciò presuppone la mancata funzionalità dei meccanismi altrimenti atti a garantire l’integrità dell’unità sociale propria del lupo (il branco) ed un contesto sociale (e riproduttivo) tale per cui la relazione del lupo con il cane muta da un rapporto antagonista e di predazione ad un rapporto affiliativo; ii. un successivo atto riproduttivo tra femmina di lupo e cane; ciò presuppone che i cani presenti siano, oltre che in condizioni riproduttive, di tipologia e taglia adeguata per il verificarsi di relazioni affiliative sufficientemente prolungate e funzionali ad un successivo accoppiamento misto; altro presupposto critico è anche l’assenza di lupi riproduttori, o comunque una loro eventuale inferiorità fisica e sociale rispetto a competitori riproduttivi tra i cani contendenti; iii. l’allevamento della cucciolata di ibridi da parte della femmina di lupo in condizioni di mancata assistenza alleloparentale (vedi § 4.2); processo questo probabilmente facilitato da risorse trofiche di adeguata disponibilità e facile accessibilità, nonché dalla presenza di siti riproduttivi idonei e sufficientemente segregati dalle attività antropiche in modo da garantire un’adeguata tranquillità per periodi prolungati; iv. la sopravvivenza degli ibridi fino alla maturità sessuale; ciò presuppone un’elevata accessibilità di risorse trofiche entro il raggio di un home range medio per la specie (ca. 100 – 150 km2) e, presumibilmente, una scarsa tensione territoriale con branchi di lupi adiacenti (bassa densità intraspecifica). Rispetto alla (scarsa) probabilità iniziale che un cane può avere nell’instaurare relazioni affiliative e quindi accoppiarsi con un lupo, gli ibridi F1, laddove non siano affetti da problemi fisiologici che ne limitano sopravvivenza o potenzialità riproduttive e una volta allevati in natura dalla femmina di lupo, avranno maggiori probabilità di integrarsi all’interno popolazione parentale di lupo ed eventualmente riprodursi a loro volta. Rispetto a un cane, ci si attende che gli eventuali ibridi allevati in natura siano dal punto di vista ecologico e comportamentale molto più affini al lupo. Inoltre, mentre l’evento d’ibridazione iniziale coinvolge essenzialmente una femmina di lupo ed un cane maschio (vedi § 4.2), è presumibile che la reintegrazione degli ibridi F1 all’interno della popolazione parentale lupina avvenga indipendentemente dal sesso8. È vero che, nel caso degli ibridi, ci si può attendere un’anticipazione della stagione riproduttiva (Vilà e Wayne 1999, Randi et al. 2000, Randi e Lucchini 2002; vedi § 4.3); ma questo fenomeno, ad oggi sperimentalmente verificato in pochissimi studi realizzati in cattività, non sembra comunque rappresentare un elemento ostativo al propagarsi dell’introgressione (p. es., Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011, Caniglia et al. in stampa), probabilmente in funzione dell’elevata variabilità individuale, sia negli ibridi maschi che femmine, nell’insorgenza e durata dei periodi di attività e recettività riproduttiva (p. es., Gipson et al. 1974, 1975). 8
Va inoltre considerata la possibilità che gli ibridi, attraverso meccanismi di eterosi, o perché portatori di variazioni geniche selezionate positivamente (cfr. Anderson et al. 2009), possano mostrare vantaggi riproduttivi nella popolazione di lupo, meccanismo che faciliterebbe ulteriormente il reincrocio e la diffusione dell’introgressione. 47 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane In una prospettiva di operatività gestionale, è opportuno riconoscere che i fattori i‐iv elencati poc’anzi sono caratteristici di contesti sinantropici in cui: 1. nuclei di lupo a basse densità e dalla struttura sociale alterata si trovano in condizioni di simpatria con un numero elevato di cani vaganti; e 2. le condizioni ambientali, seppure alterate in varia misura dalle attività antropiche, risultano comunque sufficientemente idonee per garantire la sopravvivenza su scala locale di esemplari isolati o piccoli nuclei di lupo (Lehman et al. 1991, Blanco et al. 1992, Godinho et al. 2011). Tali condizioni possono essere ulteriormente scorporate come di seguito, e il valore euristico di un tale approccio, oltre ad enfatizzare i livelli di applicazione gestionale, risiede nella possibilità di produrre mappe del rischio di introgressione su larga scala. In particolare, si evidenzia: •
Presenza non occasionale di cani vaganti a elevate densità. Chiaramente si tratta di cani di grossa taglia, in condizioni riproduttive (ovvero non sterilizzati) e la cui presenza del contesto rurale e selvatico è frequente, come nel caso dei cani da lavoro (guardiania, caccia, etc.) o da guardia e/o compagnia dei residenti; un rapporto numerico fortemente sbilanciato a favore dei cani in grado di incrociarsi con il lupo è una delle condizioni più frequentemente ricorrenti nei casi accertati di ibridazione nel genere Canis (Lehman et al. 1991, Gottelli et al. 1994, Daniels e Corbett 2003). Nel caso del cane, non si tratta necessariamente di esemplari inselvatichiti o randagi (sensu Boitani et al. 1995) ma di cani vaganti nel senso lato, ovvero di proprietà ma lasciati liberi di vagare sul territorio al di fuori della proprietà privata. Anche se le specie del genere Canis, lupo incluso, sono generalmente riluttanti ad accopparsi con specie e/o forme diverse (Silver e Silver 1969:31), questo può essere inevitabile laddove riproduttori conspecifici siano scarsi o assenti (effetto di Allee; Lehman et al. 1991). •
Livelli sufficienti d’idoneità ambientale per la specie. L’ibridazione deve prevedere la presenza più o meno stabile del lupo sul territorio. Quindi, nonostante l’eventuale impatto antropico nelle aree in questione, questo deve comunque almeno corrispondere ai valori minimi di idoneità ambientale per la specie: densità antropica e di infrastrutture al di sotto di determinati valori soglia, copertura forestale sufficientemente estesa (anche se frammentata), elevata disponibilità di prede domestiche e/o selvatiche o risorse trofiche di altra natura (p. es., rifiuti). Ai fini della stabilizzazione spaziale della specie è necessaria la presenza di tratti di copertura vegetazionale arborea od arbustiva che, anche se non estesi, non siano accessibili o comunque frequentati dall’uomo, in quanto tali aree possono fungere da zone di ricovero diurno per il lupo e per la localizzazione dei siti riproduttivi. Condizioni minime di idoneità, dove altre caratteristiche sinantropiche corrispondono ad elevati rischi di ibridazione, si riscontrano spesso in prossimità delle aree maggiormente antropizzate (Lehman et al. 1991, Blanco et al. 1992, Godinho et al. 2011) o, su scala del paesaggio, in comprensori naturali di estensione piuttosto limitata ed immersi all’interno di una matrice fortemente antropizzata (cfr. Ciucci et al. 2003, Caniglia et al. in prep.). Tuttavia, in paesi altamente popolati come l’Italia, sarebbe un errore considerare le zone caratterizzate da una maggiore idoneità ambientale (p. es., parchi nazionali) svincolate dal rischio di ibridazione: anche all’interno di queste aree si possono comunque riscontrare fattori condizionanti l’ibridazione. Le condizioni marginali o subottimali di idoneità ambientale sembrano quindi rappresentare una condizione minima ma non esclusiva per il verificarsi dell’ibridazione, in quanto condizioni di elevata idoneità non sembrano essere affatto indenni da questo rischio (vedi sotto). •
Impatto rilevante della mortalità antropica a livello della popolazione locale di lupo. In condizioni ecologicamente pristine, l’integrità demografica e sociale delle popolazioni locali di lupo, congiuntamente alla funzionalità di barriere ecologiche e comportamentali, fanno si che il cane venga visto come un antagonista se non come una preda dal lupo. Tuttavia, livelli consistenti e persistenti di prelievo, siano essi programmi legali di controllo dei predatori (p. es., Lehman et al. 1991, Andersone et al. 2002), o attività di bracconaggio (p. es., Gotelli et al. 1994, Godinho et al. 2011, I. Reinhardt in litteris), possono localmente determinare drastiche riduzioni della densità del lupo e lo sfaldamento della struttura, della coesione e della funzionalità sociale dei branchi. Questo, a sua volta, può essere causa 48 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane dell’allentamento delle barriere riproduttive e dell’alterazione delle relazioni ecologiche e comportamentali con il cane, creando opportunità per relazioni di tipo affiliativo laddove le opportunità di incontro con i cani vaganti sono elevate. Il caso estremo è rappresentato da una femmina di lupo in età riproduttiva che, in assenza di conspecifici di sesso opposto con cui riprodursi, può deviare le proprie attenzioni riproduttive verso cani vaganti di taglia e comportamento confacenti. •
Disponibilità di risorse trofiche facilmente accessibili. Una variabile essenziale che determina l’idoneità di un’area per una specie come il lupo è la presenza di fonti trofiche accessibili per tutto l’arco dell’anno; queste possono essere rappresentate da complessi preda multispecifici di prede selvatiche e/o domestiche, oppure da altri fonti alimentari puntiformi ed altamente predicibili (p. es. rifiuti, carcasse). Aree densamente popolate da complessi preda multispecifici, in particolare erbivori di grandi dimensioni, e/o interessate da allevamenti zootecnici diffusi e poco tutelati dai predatori, corrispondono a condizioni di elevata disponibilità ed accessibilità alimentare per il lupo. Tuttavia, la caratteristica che più di altre potrebbe facilitare il successo nell’allevamento di cucciolate di ibridi di prima generazione è l’ampia disponibilità di fonti trofiche altamente remunerative e predicibili come discariche, cumuli di rifiuti abusivi, o carcasse di animali di grossa mole (pecore, vacche, cavalli) abbandonate sul territorio: queste condizioni, più di altre, risultano infatti funzionali alla permanenza di nuclei ridotti e socialmente alterati di lupo (vedi sopra), ed in particolare sembrano garantire il successo riproduttivo di cucciolate di ibridi in assenza di cure alleloparentali, proprio come ci si aspetterebbe nei casi di ibridazione che coinvolgono la femmina di con il cane (p. es., Andersone et al. 2002). Di contro, laddove le risorse trofiche potenziali fossero limitate alle sole prede selvatiche, la loro piena accessibilità sarebbe appannaggio di branchi di lupo numericamente consistenti e pienamente funzionali, condizioni che corrispondono ad un minore rischio di ibridazione. •
Prossimità ad aree con presenza stabile e densità elevate di lupo. Il lupo è una specie altamente vagile ed i cui individui danno sistematicamente luogo a fenomeni dispersivi nel corso della loro esistenza. Le zone che, rispetto alle aree che ospitano popolazioni sorgente, ricadono entro un raggio medio dei movimenti di dispersal saranno quindi periodicamente interessate da tentativi di espansione e stabilizzazione spaziale da parte di esemplari della specie in dispersione. Maggiore è la prossimità a popolazioni sorgente, e maggiore la connettività ambientale per canalizzare i movimenti di dispersal, maggiori saranno le occasioni di insediamento a livello locale delle unità in dispersione, qualora le condizioni ambientali locali siano sufficientemente idonee; se la zona in questione presenta elementi di sinantropia particolarmente indicati per il verificarsi dell’ibridazione, è probabile che le femmine di lupo stabilizzate localmente siano particolarmente soggette al fenomeno (Gipson et al. 1975, Lehman et al. 1991, Caniglia et al. in prep.). Su base teorica, questo rischio appare minore in zone egualmente caratterizzate da elementi sinantropici ma più distanti da nuclei di lupo sorgente o la cui diffusione appare inficiata da una inferiore connettività ambientale, oppure in zone che godono di condizioni ambientali più pristine e quindi dove gli eventi di ibridazione sembrano essere meno probabili. 5.4.3 Ibridazione e zone ‘periferiche’ dell’areale Diversi autori affermano che le probabilità d’ibridazione introgressiva si osservano maggiormente a livello delle porzioni periferiche dell’areale del lupo (p. es., Verardi et al. 2006, Randi 2008, Godinho et al. 2011, Caniglia et al. in stampa). Mentre, in base a quanto osservato nel paragrafo precedente, la valenza di una tale generalizzazione dipende chiaramente dal contesto geografico ed ecologico che caratterizza l’areale di una data specie, la si ritiene poco indicativa delle condizioni mediamente riscontrate nei paesi europei; sebbene sia lecito attendersi nelle zone affette da introgressione un maggiore livello di sinantropia rispetto alle porzioni più centrali o storiche dell’areale, dove le condizioni ambientali si presume siano più pristine, non sempre questo è vero, né questa tendenza è stata ad oggi sufficientemente indagata. Il concetto stesso di ‘periferico’ può inoltre lasciare adito a interpretazioni ambigue o eccessivamente semplicistiche in chiave gestionale. 49 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 5. Ibridazione antropogenica tra lupo e cane Per quanto concerne l’Italia, in particolare, la conformazione dell’areale del lupo rispetto all’ampiezza teorica attesa delle zone d’ibridazione (50 volte la distanza di dispersione; Barton e Hewitt 1989, Lehman et al. 1991) determina il fatto che praticamente non esistano zone dell’areale chiaramente periferiche in termini introgressivi. Mentre è vero che in base alle condizioni ecologiche le zone in cui i casi d’introgressione si verificano possono considerarsi marginali rispetto alle condizioni ottimali per la specie, in Italia contesti sinantropici tali da corrispondere ad elevati rischi di ibridazione si riscontano anche nelle porzioni centrali dell’areale, come ad esempio, in diversi parchi nazionali in posizione centrale rispetto all’areale appenninico del lupo (Boitani 1986, Randi et al. 2006, W. Reggioni in litteris). Si deve inoltre considerare che, anche qualora le istanze di introgressione si verifichino con maggiore probabilità e frequenza nelle porzioni geograficamente periferiche dell’areale, nel caso del lupo individui introgressi in dispersione potrebbero raggiungere facilmente qualsiasi porzione dell’areale, incluse quelle centrali, facilitando quindi la diffusione del fenomeno indipendentemente dalla località di origine. In altri contesti che riguardano la diffusione dell’introgressione tra lupo rosso e coyote, è stato infatti dimostrato che anche rari casi di introgressione possono poi diffondersi facilmente su larga scala grazie a movimenti di dispersal (Adams et al. 2003b). Infine, è importante ribadire (vedi anche §§ 3.2.6 e 5.3.3) che, laddove l’introgressione venga quantificata in base a strategie di campionamento che non possono essere considerate valide e rappresentative, come appunto negli studi su larga scala ad oggi effettuati in Europa (p. es., Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011), le stime con cui il fenomeno viene quantificato non possono essere considerate rappresentative dell’intera popolazione di lupo, ma sono limitate al campione analizzato. Qualsiasi ulteriore generalizzazione non appare quindi lecita, sia in termini quantitativi che di diffusione geografica del fenomeno (vedi anche § 3.2.6), e la portata gestionale di queste informazioni risulta quindi seriamente compromessa. In questa prospettiva, la caratterizzazione qualitativa delle zone a rischio d’ibridazione di cui alla presente sezione offre a nostro avviso elementi importanti per stratificare futuri campionamenti su larga scala ai fini di una maggiore rappresentatività dei diversi livelli di rischio (p. es., Lehman et al. 1991, Roy et al. 1996). 50 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane 6. Metodi e criteri per l’identificazione degli ibridi lupo/cane 6.1 Errori d’identificazione degli ibridi e contesto gestionale La valutazione dell’affidabilità delle varie tecniche per l’identificazione degli individui ibridi tra lupo e cane (vedi § 5.3), così come la messa a punto di strategie d’indagine e diagnosi pienamente affidabili, non possono considerarsi avulse dal contesto gestionale di riferimento. Come in altri casi simili, ed in cui l’esito della diagnosi ha una precisa ricaduta in termini gestionali (p. es., lupo rosso e coyote: Adams et al. 2007), si deve infatti valutare con attenzione quali potrebbero essere le conseguenze gestionali degli eventuali errori di identificazione. Infatti, sia nel caso vengano utilizzati criteri fenotipici o genetici, oppure una combinazione di entrambi, esiste comunque la possibilità di commettere errori d’identificazione e quindi di assegnazione alle tre categorie di base (lupo, cane, ibrido): da una parte, si può assegnare erroneamente alla categoria degli ibridi un esemplare di lupo che ibrido non è (errore di Tipo‐I); dall’altra si può fare l’errore opposto, ovvero non riconoscere un esemplare ibrido in quanto tale, assegnandolo erroneamente alla popolazione parentale di lupo9 (Tipo‐II; vedi § 3) (Tabella 1). Assegnazione Lupo Ibrido/introgresso Natura dell’esemplare Lupo Ibrido/introgresso nessun errore Ibrido criptico (errore Tipo‐II) Falso ibrido (errore Tipo‐I) nessun errore Tabella 1. – Schematizzazione degli errori potenziali di identificazione (assegnazione) degli ibridi tra lupo e cane nei quali si può incorrere sia utilizzando tecniche di diagnosi fenotipiche che genetiche. Mentre utilizzando criteri fenotipici si può incorrere in entrambi gli errori di assegnazione, nel caso di applicazioni genetiche basate su tipo e numero di marcatori genetici considerati parziali o insufficienti si può incorrere nell’errore di assegnazione di Tipo‐II, specialmente per esemplari introgressi di seconda o successiva generazione. Le implicazioni e le conseguenze gestionali dei due tipi di errore differiscono sostanzialmente, ed è alla luce di queste implicazioni che le analisi genetiche, considerate più attendibili di quelle fenotipiche, vanno calibrate ed interpretate con particolare attenzione. Un uso congiunto di criteri fenotipici e genetici appropriati riduce globalmente la possibilità di incorrere in errori di assegnazione. 9
Questo problema, che riguarda sostanzialmente un possibile errore di assegnazione rispetto a categorie predefinite (lupi, cani, ibridi), è altra cosa rispetto a definire quale il livello di introgressione minimo al di sotto del quale un determinato esemplare non viene più considerato ibrido ma bensì appartenente a tutti gli effetti alla popolazione parentale del lupo. Sebbene anche quest’ultimo aspetto sia in parte funzione del metodo (i.e., livello di risoluzione e potere diagnostico delle tecniche utilizzate), esso concerne più esplicitamente un processo decisionale alla base dei criteri di gestione adottati. È in base a questo processo decisionale che si deve quindi determinare il livello di risoluzione e il potere diagnostico minimo delle tecniche utilizzate per l’individuazione ed il monitoraggio dei casi di ibridazione. 51 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Chiaramente i due errori avranno conseguenze gestionali differenti e, dipendentemente dallo status della popolazione parentale selvatica, i metodi, i criteri e gli strumenti di diagnosi dovranno essere quindi calibrati di conseguenza. In altre parole, i metodi di diagnosi dovranno essere selezionati e perfezionati in modo da ridurre preferenzialmente uno o l’altro dei due possibili errori, dipendentemente dal contesto e dagli indirizzi gestionali. Ad esempio, se gli individui della popolazione parentale selvatica sono ridotti ai minimi termini, per cui la rimozione erronea di un individuo parentale potrebbe essere deleteria per la popolazione stessa, allora risulta prioritario minimizzare questa eventualità (errore di I Tipo); in termini pratici, questo vuole dire che non sarà necessaria un’elevata risoluzione d’indagine ed un elevato potere diagnostico, in quanto è preferibile correre il rischio di non riconoscere un individuo introgresso in quanto tale piuttosto che fare l’errore opposto, specialmente se la popolazione parentale è ormai ampiamente introgressa (p. es., lupo etiope e cane: Gottelli et al. 1994). D’altra parte, laddove la popolazione parentale è demograficamente più robusta e l’obiettivo è eliminare il rischio di diffusione dell’introgressione, allora è d’obbligo adottare un sistema diagnostico a elevata efficienza: il fine deve essere quello di minimizzare l’eventualità di commettere errori di Tipo‐II (non essere in grado di riconoscere gli individui introgressi come tali), in modo da permettere l’individuazione degli ibridi ai fini di una loro pronta rimozione. Operativamente, questo comporta il rischio di rimuovere dalla popolazione individui che non sono introgressi o lo sono solo in minima parte, ma lo stato della popolazione parentale è tale che una simile eventualità non avrebbe conseguenze sostanziali (p. es., lupo rosso e coyote: Adams et al. 2007). Facendo specifico riferimento alla situazione recente del lupo in Italia, sebbene l’ibridazione con il cane sia stata riconosciuta da più parti come una minaccia per il lupo degna di particolare attenzione (Genovesi 2002, AA.VV. 2009), non esistono a oggi indicazioni specifiche che riguardano le tecniche di diagnosi, né è stata mai avviata in tal senso una consultazione tecnica sui margini d’errore e le loro implicazioni gestionali. Questo, a sua volta, è probabilmente conseguenza del fatto che non è stato mai avviato un processo decisionale mirato a definire una strategia operativa per la gestione e risoluzione del fenomeno. Tant’è, che a differenza di casi analoghi in altri paesi (cfr. Vilà et al. 2003, Adams et al. 2007), in Italia i casi d’ibridazione tra lupo e cane sono stati riportati con frequenza crescente dipendentemente dalle tecniche genetiche utilizzate, e nonostante il fenomeno sia stato recentemente rilevato all’interno dell’intero areale appenninico (cfr. Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Verardi et al. 2006, Randi 2008, Caniglia et al. in prep.) ciò non ha dato adito ad alcun intervento gestionale, né ha destato particolare attenzione o discussione a livello tecnico, governativo e ministeriale. A fronte della grave carenza di tali indicazioni, appare quindi doveroso affrontare al più presto la questione e fornire indirizzi gestionali che possano essere di riferimento per: (i) standardizzare l’efficienza delle tecniche diagnostiche, (ii) ottimizzare le stesse rispetto al contesto gestionale locale e nazionale, nonché (iii) promuovere, anche a livello amministrativo e pubblico locale, una più consapevole interpretazione dei risultati dei test di assegnazione, dei loro potenziali limiti (possibilità di errore; cfr. Tabella 1) e delle relative conseguenze gestionali. 52 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Considerata la recente storia e lo status di conservazione del lupo in Italia, e a fronte di un perdurante ed elevato numero di cani vaganti sul territorio, il fatto che la popolazione di lupo è tuttora in fase di espansione e che il fenomeno dell’ibridazione, perlomeno su scala appenninica, sembrerebbe rilevarsi con frequenza e diffusione maggiori rispetto al recente passato, qualsiasi intervento gestionale deve essere prioritariamente mirato ad eliminare o limitare fortemente il fenomeno su scala locale e nazionale rispetto alle tendenze attuali. Quest’obiettivo si può ottenere solo attraverso interventi realizzati su scala locale ed atti alla rimozione (effettiva o riproduttiva) e controllo sia dei cani che degli individui ibridi, introgressi o sospetti tali. Sebbene siano chiaramente molte altre le misure gestionali da adottare in maniera complementare all’interno di una strategia integrata, il controllo effettivo del randagismo e la rimozione puntuale degli ibridi rappresentano comunque un intervento centrale ed insostituibile per una risoluzione puntuale, radicale e duratura del problema. Quanto sopra ha chiaramente riflessi diretti sulle tecniche diagnostiche da adottare per il riconoscimento degli ibridi: lo status della popolazione di lupo in Italia suggerisce infatti che l’approccio da perseguire sia preferenzialmente quello di minimizzare un errore di Tipo‐II, ovvero di utilizzare sistemi diagnostici ad elevata efficienza al fine di aumentare le probabilità di riconoscere gli individui introgressi e ridurre le possibilità di trascurare ibridi criptici. Infatti, come in altri casi analoghi (p. es., Adams et al. 2007), sembra più accettabile assegnare erroneamente un lupo alla categoria degli ibridi, e quindi correre il rischio di rimuoverlo erroneamente dalla popolazione, piuttosto che fare l’errore opposto di assegnare un ibrido alla popolazione parentale di lupo e non rispondere quindi immediatamente con un intervento gestionale di rimozione. Quindi, l’indirizzo gestionale qui suggerito prevede di impiegare esclusivamente tecniche diagnostiche altamente efficienti e implica l’accettazione di un maggiore margine di rischio nel rimuovere ingiustificatamente un lupo dalla popolazione nel caso questo venisse erroneamente classificato come ibrido, rispetto al rischio opposto di non identificare un ibrido come tale. Questo approccio comporta una più alta probabilità ed efficienza di rimozione degli esemplari ibridi dalla popolazione di lupo con il vantaggio di eliminare o comunque limitare la diffusione dell’introgressione. A tal fine, è importante sottolineare che minimizzare un errore di Tipo‐II in questo caso non vuole dire solo utilizzare diagnosi genetiche altamente efficienti (numero e tipologia dei marcatori) ma anche prendere in debita considerazione i caratteri fenotipici a corollario e supporto delle indicazioni genetiche (p. es., Andersone et al. 2002, Ciucci et al. 2003, Anderson et al. 2009). È doveroso infine sottolineare che, con riferimento al contesto sopra delineato, la discussione su quale e come debba essere valutata l’affidabilità delle tecniche genetiche e/o fenotipiche affinché producano evidenze di ibridazione e/o introgressione gestionalmente coerenti non può essere oggetto della presente relazione, dove ci si limita a dare indicazioni tecniche in tal senso. Questo argomento dovrebbe essere piuttosto oggetto di dovute attenzioni a livello istituzionale ed essere posto al centro di un confronto e di un processo decisionale a carico delle amministrazioni, degli organi e degli enti istituzionalmente deputati alla conservazione e gestione della fauna. 6.2 Metodi e procedure per l’identificazione degli ibridi In base alle considerazioni metodologiche riportate nel capitolo 3, e più specificamente in riferimento al caso del lupo nel paragrafo 5.3, appare evidente che i marcatori genetici 53 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane risultano oggi di gran lunga più affidabili ed informativi per l’identificazione degli ibridi tra lupo e cane rispetto ai soli caratteri fenotipici. È tuttavia fondamentale sottolineare due aspetti critici che condizionano significativamente la portata di questa affermazione: i.
l’affidabilità dei metodi genetici non è scontata né universale. Il potere diagnostico degli strumenti genetici è infatti strettamente dipendente dal materiale biologico a disposizione (campioni invasivi e non invasivi), dal tipo e dal numero di marcatori genetici utilizzati, nonché dalle procedure statistiche dei test di assegnazione e dai software di analisi adottati. A livello di popolazione, struttura e composizione del campione analizzato influenzano anch’esse enormemente la valenza dei risultati conseguiti e la loro effettiva rappresentatività. Nel caso tali aspetti non vengano debitamente tenuti da conto, il sistema diagnostico adottato per l’identificazione degli ibridi non risulterà altamente efficiente, con un elevato il rischio di commettere errori di Tipo‐II (non riconoscere come tali individui introgressi); di riflesso, una sottostima dell’effettiva diffusione dell’introgressione potrebbe tradursi nella negazione di interventi gestionali laddove invece necessari. ii. sebbene l’informazione veicolata dai caratteri fenotipici sia più soggettiva e di difficile quantificazione, essa è comunque altamente indicativa qualora vengano individuati caratteri morfologici palesemente devianti dallo standard selvatico (p. es., Andersone et al. 2002, Ciucci et al. 2003, Anderson et al. 2009, Greco 2009). Tali caratteri, specialmente laddove la loro validità venga supportata da riscontri di carattere genetico, rappresentano segnali di ibridazione di elevato valore pratico e che potrebbero perdurare più a lungo attraverso le generazioni di reincrocio di quanto non lo facciano altri marcatori genetici (p. es., Anderson et al. 2009). Alcuni marcatori fenotipici sarebbero quindi in grado di fornire segnali di introgressione anche laddove non è più realistico o possibile leggerli con i marcatori genetici attualmente a disposizione. Di conseguenza, indipendentemente dal numero e dal tipo di marcatori genetici impiegati, una valutazione fenotipica dovrebbe essere presa comunque in considerazione (Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003). A nostro avviso, è dunque un errore trascurare l’informazione veicolata da caratteri fenotipici anomali solo perché l’introgressione non viene rilevata su base genetica, specialmente se ciò avviene sulla base di un numero di marcatori insufficienti, o perché la validità di alcuni caratteri fenotipici non sia stata ancora comprovata da un riscontro di natura genetica (Figure 1 e 2). 54 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Figura 1. – Il genoptipo di questo canide di grosse dimensioni (45 kg), trovato morto nel novembre del 2008 in provincia di Parma (Tizzano Val Parma) era stato rilevato tramite campionamento non invasivo oltre 11 volte nel periodo 2002 – 2004 e, sulla base di 12 loci microsatellite, assegnato alla popolazione italiana di lupo (come genotipo WRE10M; Randi et al. 2006). Alla luce del fenotipo riscontrato al momento del ritrovamento, successive analisi genetiche effettuate su un campione muscolare e ricalibrate utilizzando un numero maggiore di loci e marcatori genetici hanno identificato l’esemplare come un individuo introgresso, coerentemente con il suo fenotipo (Foto: M. Andreani). Figura 2. – Esemplare di sesso maschile, trovato morto sul ciglio di una strada in località Riotorto di Piombino (Livorno) il 10/05/2011. Sulla base di 12 loci microsatelliti autosomici, 4 sessuali (cromosoma Y) e del DNAmt, l’esemplare è stato assegnato alla popolazione italiana di lupo sebbene presentasse “tracce di non recente ibridazione con il cane domestico a livello dei marcatori bi‐parentali” (Prot. ISPRA n. 4542 del 01/02/2012). Per quanto complicato possa essere il processo, valutazioni congiunte basate anche su elementi fenotipici, laddove possibile, potrebbero fornire in questi casi diagnosi alternative (vedi § 6.1) (Per gentile concessione del Centro per lo Studio e la Documentazione sul Lupo: www.canislupus.it) (Foto: G. Milano). 55 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Figura 3. – Esemplare di sesso maschile rinvenuto in data 13/03/2010 in seguito a collisione con automezzo nel territorio del comune di Segni (RM). In seguito a prelievo di un campione di tessuto, l’esemplare è stato geneticamente assegnato alla popolazione italiana di lupo (Prot. IZS Lazio e Toscana n. 10018163). Come per l’esemplare in Figura 2, la diagnosi non ha tenuto conto delle indicazioni fenotipiche, nel caso specifico coincidenti con una colorazione del mantello particolarmente chiara, una lunghezza del pelo eccessiva lungo i fianchi e l’addome e, soprattutto, la presenza dello sperone sulle zampe posteriori (vedi Fig. 7 per dettaglio) (Foto Domenico Tucci, Provincia di Roma). Alla luce delle considerazioni di cui sopra, ed in base al contesto gestionale che caratterizza la popolazione di lupo in Italia (vedi § 6.1), una strategia ottimale per l’identificazione dei casi di introgressione si dovrebbe basare sull’uso integrato e concertato di strumenti genetici e fenotipici: mentre i primi devono essere diversificati e ad elevata efficienza diagnostica (vedi § 5.3.3), i secondi, anche se non ancora formalmente validati da riscontri di natura genetica, devono prendere in considerazione le caratteristiche morfologiche che più di altre sembrano essere anomale nel lupo e di possibile derivazione canina (vedi § 6.2.2). Attraverso l’uso congiunto di criteri genetici e fenotipici è anche possibile che nell’immediato futuro un numero maggiore di caratteri fenotipici possa essere considerato un attendibile segnale di ibridazione tramite riscontri più oggettivi di natura genetica (p. es., Ciucci et al. 2003); di conseguenza, aumenterebbe non solo il livello di confidenza con cui tali caratteristiche fenotipiche potranno essere interpretate come segnali di ibridazione, ma soprattutto il potere diagnostico dei casi sospetti tramite un approccio diagnostico integrato (Randi e Lucchini 2002). Infine, una strategia ottimale per la quantificazione e il monitoraggio dell’ibridazione introgressiva deve necessariamente considerare anche l’intensità e le modalità di campionamento a livello delle popolazioni parentali, sia su scala locale che su vasta scala (p. es., regionale e nazionale); se la diagnosi è basata su loci microsatellite e procedure di assegnazione, inoltre, deve prendere in considerazione le popolazioni locali di cavi vaganti al fine di aumentare l’efficienza dei test di assegnazione, una pratica ad oggi forse particolarmente sottovalutata (vedi § 3.2.4). Nel caso del lupo come di altre specie altamente vagili, va sottolineato infine che la messa in pratica di interventi gestionali su scala locale può 56 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane risultare inutile nel medio‐lungo periodo se non vengono parallelamente adottate misure analoghe nel resto dell’areale su scala nazionale. 6.2.1 Metodi genetici Le tecniche di genetica molecolare sono state spesso utilizzate per l’individuazione degli ibridi tra lupo e cane sia in Italia che altrove (vedi § 5.3), sebbene le applicazioni siano tra loro estremamente variabili nei metodi e nei marcatori utilizzati; in generale, si può affermare che il costante affinamento delle tecniche, con il conseguente aumento di complessità e del potere diagnostico, sembra corrispondere ad una percezione del fenomeno in aumento (Italia: Dolf et al. 2000, Randi et al. 2000, Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003, Lucchini et al. 2004, Scandura 2004, Randi et al. 2006, Verardi et al. 2006, Randi 2008, Greco 2009, Caniglia et al. 2010, Iacolina et al. 2010, Caniglia et al. in prep; Spagna: Vilà et al. 1997, Lucchini et al. 2004, Ramirez et al. 2006, Godinho et al. 2011; paesi scandinavi: Vilà et al. 2003; Europa dell’est: Vilà et al. 1997, Randi e Lucchini 2002, Andersone et al. 2002; Nord America: Garcia‐Moreno et al. 1996, Anderson et al. 2009). Applicazioni simili riguardano inoltre la valutazione dell’ibridazione in Nord America tra coyote e cane (Adams et al. 2003b) e tra lupo rosso e coyote (Adams et al. 2003a, Miller et al. 2003, Adams e Waitts 2007, Adams et al. 2007); in Etiopia tra lupo etiope e cane (Gottelli et al. 1994), ed in Australia tra dingo e cane (Elledge et al. 2006). L’insieme di questi studi dimostra come siano oggi disponibili marcatori genetici e metodi di analisi che, se adeguatamente utilizzati ed interpretati, sono in grado di aumentare la risoluzione delle analisi e fornire quindi indicazioni affidabili, seppure ulteriormente perfezionabili, ai fini gestionali. Mentre è stato da tempo dimostrato che i marcatori biparentali basati sugli allozimi non sono efficaci, in virtù della scarsa variabilità riscontrata tra le specie del genere Canis10 (Ferrel et al. 1978, Shields et al. 1988, Kennedy et al. 1991), altri marcatori genetici sono comunque in grado di offrire indicazioni utili per identificare i casi di ibridazione tra lupo e cane (vedi § 3.2). Tuttavia, mentre il DNAmt, se utilizzato da solo ed in virtù della direzionalità dell’ibridazione tra lupo e cane, non sarebbe in grado di rilevare livelli anche sostanziali d’introgressione (Randi e Lucchini 2002), i loci ipervariabili biparentali perdono traccia degli eventi d’introgressione dopo poche generazioni di reincrocio (Elledge et al. 2006). Alcuni accorgimenti importanti possono comunque aumentare il potere diagnostico dei loci ipervariabili e dei relativi test di assegnazione (Falush et al. 2003, Vähä e Primmer 2006, Godinho et al. 2011), sebbene risultati più informativi e affidabili si possano comunque conseguire ricorrendo all’uso integrato di diversi marcatori genetici (vedi § 3.3) o alle più recenti tecniche di genomica. Un discorso a parte merita l’impiego di tecniche di campionamento non‐invasivo, ovvero basate sulla raccolta di campioni biologici come feci, escrementi, peli, tracce di sangue o di saliva, dove qualità e quantità ridotte di DNA rendono difficile se non impossibile l’uso di un elevato numero di loci diagnostici (vedi sotto). ‐ Uso integrato dei marcatori genetici Da studi recenti atti a valutare la risoluzione e il potere diagnostico dei marcatori genetici per l’individuazione degli ibridi (p. es., Boecklen e Howard 1997, Falush et al. 2003, Miller et al. 10
Risultato atteso in base al basso tasso di mutazione di questi loci (10‐8 per generazione; Nei 1987) e il tempo relativamente limitato di divergenza filogenetica. 57 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane 2003, Vilà et al. 2003, Vähä e Primmer 2006, Verardi et al. 2006, Adams et al. 2007, Godinho et al. 2011), si evince che per quanto concerne gli ibridi tra lupo e cane l’impiego ottimale delle tecniche di genetica molecolare debba prevedere l’uso integrato dei seguenti marcatori: •
loci ipervariabili (microsatellite) biparentali; questi, se non associati (unlinked), debbono essere possibilmente in numero uguale o superiore a 24 per identificare con ragionevole certezza individui ibridi di prima generazione (Vähä e Primmer 2006), e in numero uguale o superiore a 42‐48 (Vähä e Primmer 2006, Godinho et al. 2011) per distinguere gli individui reincrociati (B1, B2, etc.) da quelli della popolazione parentale, anche in caso di introgressione recente (Vähä e Primmer 2006). Queste indicazioni, sebbene siano indicative poiché dipendono dal livello di differenziazione genetica (frequenze alleliche) tra le popolazioni parentali a rischio di ibridazione, rispecchiano orientativamente la situazione attesa tra la popolazione di lupo e di cane. L’impiego di un numero di loci inferiore rischierebbe dunque di corrispondere ad una sottostima significativa dell’effettiva frequenza e diffusione dell’introgressione (Godinho et al. 2011). Una simile efficienza di diagnosi si potrebbe ottenere con un numero minore di loci nel caso questi siano di associati tra loro (linked; Falush et al. 2003, Verardi et al. 2006), sebbene in questo caso non siano a oggi disponibili indicazioni quantitative analoghe a quelle fornite da Vähä e Primmer (2006) per i loci indipendenti. Nel caso venga utilizzato un numero di loci minore rispetto a quanto teoricamente suggerito (p. es., Randi e Lucchini 2002, Lucchini et al. 2004, Verardi et al. 2006), ci si deve quindi attendere un potere di risoluzione minore per l’identificazione degli ibridi e, di conseguenza, un maggior rischio di commettere errori di Tipo‐II (vedi § 6.1); in questo caso è quindi consigliabile ricorrere a simulazioni ad hoc (Randi 2008, Godinho et al. 2011) per valutare appieno il potere di risoluzione del sistema di analisi impiegato e meglio interpretare i risultati del test di assegnazione (vedi § 3.2.4). Il potere dei test di assegnazione dipende inoltre dalla caratterizzazione genetica delle due popolazioni parentali (lupo e cane) che viene fatta sulla base delle frequenze alleliche a partire dagli individui campionati: nel caso del cane, in particolare, è quindi consigliabile procedere con il campionamento delle razze, tipologie ed individui presenti localmente e che hanno maggiori probabilità di accoppiarsi con i lupi; questo ha l’effetto di aumentare sensibilmente la risoluzione del test di assegnazione ed il potere diagnostico delle analisi, ad inclusione quindi dei reincroci di generazioni successive (Vilà et al. 2003). •
DNAmt; ereditato per via materna e in assenza di ricombinazione, l’aplotipo mitocondriale conferma l’appartenenza del campione alla specie o alla forma (lupo o cane), in quanto è unico per il lupo in Italia (W14: Randi et al. 2000) e differente dai vari aplotipi rilevati nel cane; nel caso di individui ibridi, il DNAmt rivela la derivazione materna della coppia parentale, contribuendo quindi a comprendere la direzionalità dell’ibridazione (Andersone et al. 2002, Vilà et al. 2003, Ciucci et al. 2003, Godinho et al. 2011). •
loci microsatellite sul cromosoma Y; essendo di derivazione paterna e anch’essi non soggetti a ricombinazione, gli alleli di tali loci risultano spesso sufficientemente differenti tra la popolazione locale di lupo ed i cani (Sundqvist et al. 2001, Vilà et al. 2003, Caniglia et al. in prep.). Essi sono quindi utili per avere una conferma del sesso 58 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane (ovviamente nelle femmine non vengono tipizzati) e, nel caso di individui ibridi di sesso maschile, per rivelare la derivazione paterna della coppia parentale (lupo o cane) e quindi contribuire, congiuntamente al DNAmt, a comprendere la direzionalità dell’ibridazione. Nel caso di individui identificati come ibridi/introgressi in base ai loci biparentali, la presenza di alleli Y di origine canina o lupina può rivelare l‘appartenenza alla classe degli ibridi di prima o successiva generazione (F1, F2, etc.) o dei reincroci (B1, B2, etc.) con la popolazione lupina o canina (Vilà et al. 2003, Godinho et al. 2011, Caniglia et al. in prep.). •
nucleotidi singoli polimorfici (SNP); variazioni puntiformi in complessi genici come il locus‐K (Anderson et al. 2009, Greco 2009, Caniglia et al. in prep.) o come le mutazioni A82S, R83H e R96C del gene Agouti (Schmutz et al. 2007) sono considerati di probabile origine canina e sono entrambi implicati nella colorazione del mantello; rilevati tramite tecniche genomiche di sequenziamento diretto segnalano eventi pregressi di introgressione ad opera di cani portatori di tali alleli (Schmutz et al. 2007, Greco 2009, Caniglia et al. in prep.). Utilizzando tecniche genomiche al fine di indagare il fenomeno del melanismo nel lupo in Italia, Greco (2009) ha inoltre individuato, all’interno dei complessi genici Agouti e Mc1r, altri SNP diagnostici tra lupo e cane e quindi potenzialmente utili nell’identificazione degli ibridi; nella stessa indagine sono stati inoltre messi a punto 70 loci SNP altamente polimorfici nella popolazione italiana di lupo ed il loro impiego è stato considerato superiore ai loci ipervariabili (microsatellite) ai fini dell’individuazione degli ibridi. Se l’analisi di tali varianti geniche viene associata alla presenza di caratteristiche fenotipiche considerate anomale (ad esempio, colorazioni peculiari del mantello; Schmutz et al. 2007, Anderson et al. 2009), il sequenziamento diretto di questi marcatori potrebbe fungere anche da convalida sperimentale del valore diagnostico dei caratteri fenotipici in questione (p. es., melanismo nei lupi: Anderson et al. 2009). Le recenti tecniche di microarray permettono l’analisi simultanea di ampie porzioni del genoma (decine di migliaia di SNP), sebbene tali analisi siano ad oggi ancora piuttosto costose e comunque limitate a campioni di elevata qualità (Greco 2009). In sintesi, mentre un panel adeguato (tipo e numero) di loci biparentali ipervariabili, o se possibile l’impiego di SNP diagnostici, permettono di evidenziare con una certa affidabilità eventuali casi di ibridazione e/o introgressione e di stimare la classe d’appartenenza degli ibridi, la caratterizzazione degli aplotipi a livello del DNAmt e del cromosoma Y contribuisce a completare il quadro delle conoscenze chiarendo il contributo materno e paterno degli ibridi in questione; questa, a sua volta, è una informazione critica in quanto permette si risalire ai meccanismi ed alla direzionalità degli eventi di ibridazione riscontrati. Ad esempio, tutti gli ibridi ad oggi rilevati in Italia mostrano l’aplotipo mitocondriale del lupo (vedi § 4.2), indicando la forte direzionalità dell’introgressione, nonché aplotipi Y rilevati ad oggi solo nella popolazione di lupo, il che suggerisce non solo che gli individui ibridi identificati sono in realtà tutti reincroci (B1, B2, etc.), ma che il campionamento di individui ibridi (F1, F2, etc.) è un evento particolarmente raro (Greco 2009). Diversi software sono attualmente a disposizione per l’individuazione degli ibridi (vedi § 3.2.4), e questi prevedono una robusta caratterizzazione delle frequenze alleliche delle popolazioni parentali (lupo e cane in questo caso) per procedere con test di assegnazione basati su modelli Bayesiani. Sono due i programmi più frequentemente utilizzati: STRUCTURE (Pritchard et al. 59 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane 2000) e NEWHYBRIDS (Anderson e Thompson 2002); sebbene entrambi producano risultati in larga misura confrontabili, essi sono differentemente sensibili alla proporzione attesa di individui ibridi e/o introgressi nel campione e differiscono nella capacità di identificare ibridi appartenenti a diverse classi (Vähä e Primmer 2006, Adams et al. 2007). Da alcuni autori il programma NEWHYBRIDS è riconosciuto di maggiore valore pratico ai fini gestionali in quanto stima con più affidabilità la probabilità di appartenenza degli ibridi alle varie classi (F1, F2, B1, B2, etc.) (Elledge et al. 2006). In ogni caso, va ricordato che i modelli implementati in questi software prevedono alcuni assunti (vedi § 3.2.5), tra i quali il campionamento casuale degli individui in base ed in base al quale vengono caratterizzate le frequenze alleliche delle popolazioni parentali di riferimento; qualora il campionamento invece non rispecchiasse modalità realmente casuali, ciò limiterebbe l’affidabilità dei risultati ottenuti dai test di assegnazione (Godinho et al. 2011). ‐ Campionamento genetico ‘non invasivo’ Ai fini dell’applicazione ottimale degli strumenti genetici per la diagnosi dell’ibridazione tra lupo e cane, sono d’obbligo due considerazioni d’importanza sostanziale: (ι) la natura dei campioni biologici dai quali si intende estrarre il DNA, e (ιι) la possibilità di applicare tecniche di campionamento non invasivo. Nel caso di campioni ‘invasivi’, ovvero che prevedono la cattura dell’animale o il recupero di carcasse, si dispone solitamente di DNA in quantità e qualità sufficiente per permettere l’impiego di tutti i marcatori genetici elencati sopra e, in particolare, l’utilizzazione di un elevato numero di loci microsatellite (p. es., Godinho et al. 2011). Tuttavia, nel caso della raccolta di campioni biologici ‘non invasivi’ (escrementi, peli, saliva, etc.), quantità e qualità del DNA spesso non sono tali da permettere l‘uso integrato di tutti i marcatori genetici, né tantomeno l’impiego di un numero elevato di loci micro satellite; in questo caso, infatti, sarebbe troppo elevato il tasso di errore di tipizzazione (McKelvey e Schwartz 2005, Adams et al. 2007). Di conseguenza, negli studi sull’ibridazione basati su campioni non invasivi solitamente ci si deve accontentare di un numero di loci minore, il che limita fortemente la risoluzione dei test di assegnazione (Adams e Waits 2007, Adams et al. 2007). Nel caso di campionamento non invasivo, questo problema deve essere quindi riconosciuto in chiave gestionale, e si deve quindi prevedere sia il ricorso a tecniche diagnostiche integrative, sia la possibilità di integrare e modulare tecniche di campionamento complementari in fasi successive. In quest’ottica, è importante sottolineare che il ricorso a tecniche genomiche (p. es., SNP) potrebbe risultare nell’immediato futuro maggiormente efficiente e promettente, in quanto la brevità delle sequenze da amplificare si presta particolarmente a campioni il cui DNA potrebbe di scarsa qualità o frammentato. ‐ Strategie complementari per la raccolta dei campioni genetici Come già illustrato (§ 6.2), nel caso di specie altamente vagili come il lupo, interventi gestionali risolutivi del fenomeno dell’ibridazione introgressiva si devono articolare simultaneamente su larga scala ed a livello delle popolazioni maggiormente problematiche, onde evitare che interventi su scala locale vengano successivamente inficiati da fenomeni dispersivi a carico di 60 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane altre popolazioni introgresse. A tal fine è importante attivare programmi di campionamento su larga scala, al fine di individuare le popolazioni maggiormente problematiche ed a livello delle quali procedere quindi con indagini più accurate, volte ad una verifica e quantificazione più accurata del fenomeno e ad una identificazione a livello individuale ad anticipazione degli interventi gestionali. Appare chiaro che, in base agli strumenti d’indagine ad oggi disponibili ed ai relativi costi, è opportuno modulare tecniche di campionamento e di analisi in base alla scala di riferimento ed alla risoluzione necessaria ai fini gestionali (Tabella 2). Considerato quanto sopra, al fine di ottimizzare gli sforzi e la resa di campionamento a fini gestionali su ampia scala, è suggeribile prevedere a una fase estensiva di campionamento su larga scala, basata sia su criteri fenotipici che genetici, in cui questi ultimi verranno basati sull’analisi di campioni non invasivi raccolti in gran numero su larga scala. Laddove questa prima fase fornisca indicazioni (genetiche e/o fenotipiche) di introgressione nella popolazione, si deve quindi prevedere una successiva fase intensiva di raccolta di campioni biologici ‘invasivi’ (campioni ematici, di tessuto) su scala locale, in modo da permettere analisi genetiche di più elevata risoluzione e una loro correlazione con il fenotipo su base individuale (Tabella 2). Le tecniche di campionamento genetico non invasivo si dovrebbero adottare nell’ambito di programmi di monitoraggio dell’ibridazione su larga scala, poiché sono logisticamente più realistiche e in grado di fornire una grande quantità di campioni in breve tempo e su vaste aree. Tuttavia, dal momento che questa tecnica procura campioni la cui qualità non è in grado di sostenere analisi genetiche ed elevata risoluzione11, diventa particolarmente importante integrare in questi casi l’approccio genetico con una valutazione delle caratteristiche fenotipiche della popolazione di lupo a livello locale; mentre alcune di queste possono oggi essere considerate di certa derivazione canina (vedi § 6.2.2), altre sono da considerarsi ancora ampiamente soggettive ma possono comunque fungere da ulteriori segnali di possibili casi di ibridazione e/o introgressione. Successivamente, laddove il monitoraggio estensivo produca indicazioni di possibile ibridazione e/o introgressione, è opportuno del resto intensificare a livello locale gli sforzi di campionamento tramite tecniche dirette (cattura dal vivo) per la raccolta di campioni biologici (tissutali) di maggiore qualità; questi sono in grado di sostenere analisi genetiche basate sull’insieme dei marcatori genetici a oggi disponibili ai fini di un’elevata efficienza di diagnosi, permettono il riconoscimento e la manipolazione degli ibridi a livello individuale, e facilitano tra l’altro una convalida dei criteri diagnostici di natura fenotipica. Non da ultimo, la cattura dal vivo può essere fatta coincidere con gli interventi gestionali previsti (p. es., sterilizzazione e rilascio o detenzione in cattività) qualora la diagnosi genetica e/o fenotipica confermasse l’appartenenza dell’individuo alla categoria degli ibridi. Nello scenario illustrato, il campionamento diretto tramite cattura dal vivo e il prelievo ematico della popolazione di cani su scala locale appare comunque un passo critico al fine di una migliore caratterizzazione genetica della popolazione canina, e quindi potere diagnostico dei testi di assegnazione; analogamente, un adeguato campionamento dell’intera popolazione di lupo su scala nazionale o interregionale è fondamentale per una corretta caratterizzazione genetica della popolazione, per una maggiore affidabilità dei testi di assegnazione, e per 11
Qualità e quantità del DNA disponibile in campioni non invasivi non permettono infatti la tipizzazione di un numero sufficiente di loci biparentali da garantire un’elevata efficienza dei test di assegnazione (Vähä e Primmer 2006, Adams et al. 2007). 61 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane rendere le stime di introgressione rappresentative ed estrapolabili all’intera popolazione (vedi §§ 3.2.6). Scala di applicazione Ampia scala (interregionale, nazionale) Scala locale (sottopopolazione) Obiettivo Individuare popolazioni introgresse Identificare individui ibridi e/o introgressi all’interno di popolazioni introgresse Metodi/strategia di raccolta campioni ‐ raccolta estensiva di campioni non invasivi Valutazione ‐
risoluzione genetica medio/bassa a ‐
rilevanza dei criteri fenotipici b ‐
risoluzione genetica elevata c ‐
rilevanza dei criteri fenotipici d ‐ foto‐video trappolaggio ‐ raccolta intensiva di campioni invasivi ‐ raccolta centralizzata degli esemplari morti ‐ campionamento genetico popolazioni canine locali ‐ corrispondenza criteri diagnostici genetici e fenotipici su base individuale a
: in virtù della scarsa quantità/qualità del DNA, ovvero del limitato numero di marcatori potenzialmente utilizzabili, è scarso il potere di diagnosi di individui introgressi dopo alcune generazioni di reincrocio b
: conformazione e caratteristiche esterne generali (proporzioni, colore del mantello, coda, etc.; vedi Tabella 3) c
: l’impiego di un numero elevato di marcatori genetici, e l’uso integrato di marcatori diversi (p. es., loci microsatellite, SNP) corrisponde ad un elevato potere di diagnosi d
: in questo caso, oltre all’aspetto generale, si possono considerare anche caratteristiche di dettaglio (p. es., speroni, unghie, dentizioni, etc.; vedi Tabella 3) Tabella 2. – Scenari e tecniche complementari per la raccolta di campioni utili ai fini della quantificazione e gestione dell’ibridazione introgressiva tra lupo e cane. Per motivi essenzialmente logistici e di costi, è bene una diversificazione delle tecniche, della natura dei campioni (non invasivi e invasivi) e della risoluzione delle informazioni acquisite dipendentemente dalla scala e dall’obiettivo dell’indagine. La complementarità delle strategie di indagine (vedi testo) e dettata dall’esigenza di pianificare gli interventi gestionali su scala locale all’interno di una strategia di ampia scala. 6.2.2 Metodi fenotipici Come illustrato nel paragrafo 3.1, la valutazione fenotipica dell’ibridazione soffre potenzialmente di un’elevata componente di soggettività nel valutare quali siano effettivamente le deviazioni da considerare anomale rispetto allo standard della specie in questione. Conseguentemente, il valore diagnostico delle valutazioni fenotipiche ha ad oggi offerto uno scarso supporto alla gestionale del fenomeno, sia in Italia che altrove (vedi § 5.3.1). Per questo motivo, con l’avvento delle tecniche genetiche, i criteri fenotipici sono stati tradizionalmente trascurati nelle indagini più o meno recenti sull’ibridazione, sebbene in linea generale esistano alcune importanti eccezioni dettate dalla natura del contesto gestionale in questione e dallo status delle popolazioni parentali selvatiche (p. es., lupo in Messico: Miller et al. 2003; gatto in Scozia: Kitchener et al. 2005; dingo in Australia: Elledge et al. 2006). Alla luce 62 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane dell’apparentemente crescente diffusione del fenomeno che coinvolge il lupo su scala nazionale, e della possibilità di supportare i criteri di diagnosi fenotipici sulla base di evidenze genetiche, riteniamo tuttavia che i criteri fenotipici siano comunque da rivalutare per la diagnosi degli esemplari ibridi e/o introgressi tra lupo e cane, nonché da tenere debitamente da conto all’interno di programmi di gestione e monitoraggio del fenomeno (Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003; questo per i seguenti sostanziali motivi: i.
anche se soggettiva, una valutazione fenotipica d’insieme può comunque essere di supporto alle analisi genetiche su base individuale, specialmente laddove queste sono basate su sistemi diagnostici di scarso potere e risoluzione (vedi § 6.2.1; Figure 1‐3); ii. anche se soggettiva, una valutazione fenotipica potrebbe coadiuvare tecniche di rilevamento genetico a bassa risoluzione in indagini estensive e mirate all’individuazione di popolazione problematiche su larga scala (Tabella 2); in particolare, le tecniche di foto‐video cattura si prestano efficacemente a questo tipo di indagini, anche se raramente permettono di valutare caratteristiche morfologiche di dettaglio e più spesso si limitano all’apparenza generale degli individui; iii. il grado di incertezza proprio delle valutazioni fenotipiche, entro livelli ragionevoli ed in base ad evidenze empiriche, può essere comunque contemplato all’interno di una strategia gestionale che miri a minimizzare errori di Tipo‐II nell’identificazione degli ibridi (assegnare erroneamente un individuo ibrido e/o introgresso alla popolazione parentale di lupo) errore che, alla luce dell’attuale situazione del lupo in Italia, viene considerato più grave dell’errore opposto (vedi § 6.1); iv. la soggettività nella valutazione di determinate caratteristiche fenotipiche può essere ridotta attraverso una descrizione più accurata e possibilmente quantitativa delle caratteristiche stesse; questo approccio, ampiamente utilizzato per altre specie oggetto di ibridazione con le rispettive forme domestiche (p. es., Kitchener et al. 2005, Elledge et al. 2006) non è stato mai applicato al lupo, né tantomeno al lupo in Italia, mentre tecniche di ordinamento e classificazione appaiono particolarmente promettenti in questa direzione; v. il valore che alcuni caratteri fenotipici possono effettivamente avere come segnali di ibridazione con il cane può essere oggi sperimentalmente verificato con tecniche di genetica molecolare (p. es., Andersone et al. 2002, Randi e Lucchini 2002, Ciucci et al. 2003, Anderson et al. 2009); in seguito a una tale verifica, non solo alcuni di questi caratteri assumerebbero valore diagnostico pieno per le indagini sull’ibridazione, ma permetterebbero soprattutto diagnosi più accurate qualora le tracce dell’ibridazione pregressa non fossero più rilevabili a livello genetico12; vi. alcuni caratteri fenotipici (p. es., colore del mantello, forma, proporzioni), qualora fossero ritenuti sufficientemente affidabili come indice di ibridazione, risulterebbero rispetto alle analisi genetiche di estremo valore pratico ai fini gestionali (Daniels & Corbett 2003, Elledge et al. 2006). 12
Il sequenziamento diretto delle varianti geniche che sono responsabili dei caratteri fenotipici in questione permetterebbe ovviamente di isolarne i relativi marcatori genetici (p. es., Anderson et al. 2009), anche se rimane comunque indubbio il maggiore valore pratico dei caratteri fenotipici ai fini degli interventi gestionali. 63 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Rispetto ad altri casi d’ibridazione che coinvolgono specie selvatiche del genere Canis (p. es., lupo/coyote: Lehman et al. 1991, Garcia‐Moreno et al. 1996; lupo rosso/coyote: Miller et al., 2003, Adams et al. 2007), un’importante peculiarità dell’ibridazione tra lupo e cane è che quest’ultimo non rappresenta un’entità fenotipicamente omogenea. A differenza di altri canidi selvatici (p. es., coyote), il cui fenotipo è relativamente uniforme all’interno di ciascuna specie, nel cane è infatti evidente la grande diversità fenotipica tra le razze (p. es., colorazione e caratteristiche del mantello, proporzioni corporee, caratteristiche craniometriche, etc.) e ciò rende meno predicibili gli effetti attesi a livello fenotipico negli ibridi e nei loro reincroci con il lupo. Conseguentemente, alcune indicazioni di massima che possono essere avanzate sui caratteri fenotipici attesi in caso d’ibridazione tra lupo e cane (vedi sotto) devono essere attentamente valutate alla luce delle razze o tipologie di cane che si sospetta siano implicate negli eventi d’ibridazione. Nell’elaborare un elenco di caratteri fenotipici che, con livello di attendibilità variabile, possano fungere da indici di effettiva o presunta ibridazione con il cane (Tabelle 2 e 3) si è tenuto conto di quelli: •
la cui origine canina è stata dimostrata geneticamente; ciò può avvenire sia direttamente, ovvero tramite sequenziamento diretto, quando lo stato di un determinato carattere viene associato ad una precisa variante genetica con sequenziamento genomico (p. es., Schmutz et al. 2007, Anderson et al. 2009, Greco 2009), oppure indirettamente o tramite corrispondenza, laddove individui con uno o più caratteri fenotipici anomali vengono confermati essere ibridi o introgressi tramite tecniche di assegnazione su base genetica (p. es., Ciucci et al. 2003, Greco 2009); •
osservati e descritti qualitativamente in ibridi noti (lupo/cane, dingo/cane e coyote/cane), sia in cattività che in natura, ma che non sono stati ancora validati tramite supporto genetico, diretto o indiretto. È importante inoltre sottolineare che, mentre il riscontro di taluni caratteri su un dato esemplare può essere letto come indicazione d’ibridazione, non necessariamente è vero il contrario: l’assenza dei caratteri che possono essere considerati indice d’ibridazione non può essere interpretata come assenza d’ibridazione. Alcuni caratteri possono essere infatti trasmessi solo da alcune razze canine, oppure, al pari di alcuni marcatori genetici, possono diluirsi attraverso le generazioni di reincrocio e non essere più evidenti nell’esemplare esaminato. Del resto, dal momento che l’effetto fenotipico atteso dell’ibridazione è un mosaico delle caratteristiche parentali, solitamente è lecito attendersi che più di un carattere tradirà la composizione dell’esemplare in questione (Dunam 2010). In quest’ottica, va anche ribadito che gli individui che mostrano caratteri fenotipici considerati indice di ibridazione/introgressione (p. es., sperone nelle zampe posteriori: Ciucci et al. 2003; unghie depigmentate: Greco 2009) non necessariamente risultano essere sempre tali ad un esame genetico: ciò è possibile qualora le analisi genetiche vengono basate su marcatori in numero o tipologia insufficiente ai fini dell’individuazione di reincroci di generazione avanzata rispetto all’evento di ibridazione originario (cfr. Figure 1‐3). Per questo motivo è ancora di più impellente ed importante riuscire a determinare, con un numero sufficiente di casistiche, l’associazione tra caratteristiche fenotipiche considerate anomale e profilo genetico degli esemplari ibridi e/o introgressi. 64 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Dato il loro potenziale valore operativo, nell’elenco di caratteri qui presentato vengono anche incluse variabili fenotipiche la cui affidabilità come indice d’ibridazione non è stata ancora verificata su base genetica, sebbene lo si supponga fortemente sulla base di osservazioni di altra natura (p. es., riscontro in ibridi in cattività, deviazioni consistenti e ricorrenti rispetto al fenotipo standard). Ci si augura che questi caratteri diventino presto oggetto di riscontro su base genetica e che altri indici fenotipici, specialmente a livello anatomico sia esterno che interno, possano essere presto sviluppato basandosi su descrizioni accurate di carcasse la cui appartenenza (lupi, cani o ibridi) sia stata verificata geneticamente con marcatori e procedure altamente affidabili. ‐ Caratteri fenotipici esterni In virtù del mosaico fenotipico atteso negli esemplari ibridi, solitamente ci si attende di poter rilevare più di una caratteristica diagnostica che ne segnali l’origine, sebbene pochi siano i tratti morfologici o più in generale fenotipici di facile ed immediata distinzione rispetto alla variabilità attesa della popolazione parentale. Ad esempio, in uno studio in cattività su ibridi tra coyote e diverse razze canine (Silver & Silver 1969), gli autori notarono negli ibridi caratteristiche intermedie alle due forme parentali e che l’apparenza generale degli ibridi variava a seconda delle razze dei cani implicate nell’incrocio: le differenze più marcate si rilevavano a livello delle dimensioni e lunghezza del muso, del pattern di colorazione del mantello, dello spessore e consistenza del pelo, della lunghezza della coda e dei peli che la ricoprono, della forma e dimensione delle orecchie (Silver & Silver 1969: 33‐34). Ovviamente, il potere diagnostico di tali caratteri, o meglio di un insieme di essi, aumenta considerevolmente nel caso sia stato precedentemente descritto in maniera esaustiva in entrambe le popolazioni parentali; processo che, nel cane, è reso particolarmente arduo e forse privo di significato dalla mancanza di quell’omogeneità morfologica che caratterizza altrimenti le specie selvatiche (p. es., Lawrence & Bossert 1967). Partendo comunque dalla considerazione che molti individui introgressi non sono di fatto morfologicamente distinguibili, alcuni caratteri possono essere efficacemente considerati per avvalorare l’individuazione di esemplari potenzialmente ibridi e/o introgressi (Tabelle 3 e 4). Tra questi risaltano ad oggi la colorazione melanica (Anderson et al. 2009, Greco 2009), gli speroni sulle zampe posteriori (Ciucci et al. 2003) e le unghie depigmentate (Greco 2009), in quanto si tratta di caratteristiche fenotipiche il cui significato come segnale di ibridazione è stato validato da riprove di carattere genetico; ovviamente, tali caratteristiche non sono sempre rilevabili negli individui ibridi e/o introgressi tra cane e lupo, in quanto la loro presenza dipende dalla tipologia canina coinvolta nell’incrocio e dal livello di reincrocio degli ibridi all’interno della popolazione parentale. Per esempio, gli speroni (il 5° dito) sulle zampe posteriori sembra essere una caratteristica limitata ai soli incroci con alcune razze canine di grosse dimensioni (Ciucci et al. 2003), ed è stata ad oggi rilevata in diversi esemplari nelle province di Roma, Latina, l’Aquila, Siena e Grosseto. Oltre alle tre caratteristiche appena elencate, altre indicazioni morfologiche potenzialmente utili per identificare potenziali casi di ibridazione si basano sul riscontro di anomalie a livello di (Tabella 3): ‐
dimensioni e proporzioni corporee (testa, zampe, coda, lunghezza del corpo); 65 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane ‐
pattern di colorazione del mantello (melanismo, tonalità isabelline, macchie melaniche più estese e marcate; macchie bianche su piedi, zampe e petto); ‐
bandeggi sul capo e sul corpo (colorazione del ventre, del dorso, delle zampe anteriori e della coda); ‐
lunghezza eccessiva (testa, collo, ventre, coda) e consistenza (sottile, ondulata) del pelo; ‐
dentizione di dimensioni e proporzioni particolarmente ridotte rispetto alla dimensione del cranio; ‐
anomalie dentali (accostamento eccessivo di premolari e molari superiori, asimmetrie, mancanza o posizione anomala dei premolari; cfr. anche Mengel 1971); ‐
occhi di colore più scuro (Jones 1990, Elledge et al. 2006, Dunam 2010). Il melanismo nel lupo, ad oggi riconosciuto su base genetica anche in Italia come indicazione di introgressione con il cane (Anderson et al. 2009), era stato già ipotizzato come tale negli anni ’70 in Nord America per i casi di ibridazione tra coyote e cane (‘coydogs’; Mengel 1971, Gipson 1976, Mahan et al. 1978). Analogamente, molti altri tra i caratteri fenotipici qui considerati come potenziali segnali di ibridazione tra lupo e cane erano stati già ritenuti tali in studi di ibridazione in cattività ed allo stato selvatico tra il coyote ed il cane o lupo e coyote (Kennelly and Roberts 1969, Silver & Silver 1969, Mengel 1971, Kolenosky 1971, Schmitz and Kolenosky 1985), supportando quindi il potenziale valore diagnostico delle caratteristiche qui elencate. Altri caratteri meno frequentemente riportati, in quanto rilevati più occasionalmente o solo recentemente, sono comunque di interesse particolarmente rilevante e necessitano di un’accresciuta attenzione e valutazione (Dunam 2010): ‐
la depigmentazione totale o parziale del tartufo, dei cuscinetti plantari, e delle gengive; ‐
la minore consistenza e lunghezza delle vibrisse nasali; ‐
la coda con pelo eccessivamente lungo o portata in posizione arcuata o a bandiera; ‐
la mascherina facciale, assente o dai confini cromatici più contrastati, netti e definiti; ‐
l’assenza di labiale e sottogola color crema; ‐
macchie cromatiche oculari assenti o particolarmente marcate. Si presume che, più di altri, questi caratteri nel loro insieme possano contribuire all’identificazione degli ibridi, ma tutti dovrebbero essere sistematicamente controllati, descritti, quantificati, nonché verificati con riprove genetiche in tutti gli esemplari catturati o recuperati morti al fine di aumentarne l’affidabilità in quanto come segni di ibridazione. Una più recente attenzione alle caratteristiche fenotipiche degli ibridi ha portato in alcuni casi a confermare la presenza simultanea di più caratteri fenotipici diagnostici, tra l’altro in individui confermati geneticamente essere introgressi (p. es. sperone e unghie depigmentate; Greco 2009). Ciò dimostra come l’affidabilità, in quanto segni di ibridazione, di questi e altri potenziali tratti fenotipici possa aumentare nel prossimo futuro qualora si presti la dovuta attenzione, negli individui catturati per scopo di ricerca o negli esemplari recuperati morti, ai dettaglio morfologici, specialmente laddove si evidenzi, tramite analisi genetiche, la loro natura introgressa degli individui esaminati. Tra gli altri, Corbett 1995 e Elledge et al. 2006 riportano 66 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Caratteri 5° dito nelle zampe posteriori (sperone)
Unghie biancastre o depigmentate (solitamente non tutte) a Melanismo Ibridazione
lupo/cane
lupo/cane
Riscontro
natura
natura
Verifica genetica
di corrispondenza di corrispondenza Cfr. Figure
Figg. 3, 6
Figg. 4, 7
Referenze
Andersone et al. 2002, Ciucci et al. 2003
Andersone et al. 2002, Greco 2009
lupo/cane
sequenziamento diretto (locus‐K)
di corrispondenza di corrispondenza n.a.
Figg. 4, 5, 6
coyote/cane
natura
natura
natura
cattività
Anderson et al. 2009, Greco 2009
Andersone et al. 2002
Verardi et al. 2006, Godinho et al. 2011
Mengel 1971, Gipson 1976, Mahan et al. 1978 lupo/cane
coyote/cane
lupo/coyote
coyote/cane
lupo/cane
coyote/cane
lupo/cane
coyote/cane
lupo/coyote
natura
cattività
cattività
cattività
natura
cattività
natura
cattività
cattività
di corrispondenza n.a.
n.a.
n.a.
di corrispondenza n.a.
n.a.
n.a.
n.a.
Figg. 2, 4, 7 Andersone et al. 2002, Godinho et al. 2011
c
Silver e Silver 1969, Mahan et al. 1978
Kolenosky 1971
Mahan et al. 1978
Godinho et al. 2011
Silver e Silver 1969
d
e
Ciucci et al. 2003 , M. Andreani com. pers. Silver e Silver 1969, Mengel 1971, Mahan et al. 1978 Schmitz e Kolenosky 1985
b Caratteristiche del mantello
‐ colorazione e/o bandeggio più variabili
‐ mantello maculato ‐ densità, tessitura e lunghezza del pelo
b Dimensioni corporee Fig. 4 Figg. 3, 4
Figg. 6, 7
b
Proporzioni corporee ‐ lunghezza delle zampe coyote/cane
cattività
n.a.
Fig. 4
Mengel 1971
lupo/coyote
cattività
n.a.
Kolenosky 1971
‐ dimensione dei piedi lupo/coyote
cattività
n.a.
Kolenosky 1971
‐ lunghezza della coda coyote/cane
cattività
n.a.
Silver e Silver 1969
‐ lunghezza e forma delle orecchie
coyote/cane
cattività
n.a.
Fig. 7
Silver e Silver 1969
Caratteristiche craniometriche lupo/cane
natura
di corrispondenza Andersone et al. 2002
coyote/cane
cattività
n.a.
Mahan et al. 1978
lupo/coyote
cattività
n.a.
Schmitz e Kolenosky 1985
Dentizione
coyote/cane
cattività
n.a.
Mengel 1971
lupo/coyote
cattività
n.a.
Schmitz e Kolenosky 1985
a
: individui scuri, con possibili macchie bianche sulla gola, all’altezza del petto, nei piedi e/o sulla punta della coda b
: variazione rispetto allo ‘standard’ del lupo (o del coyote), in funzione della dimensione relativa della tipologia di razza canina implicata nell’incrocio c
: gli autori specificano che la variazione di colore negli ibridi F1 rifletteva la colorazione del mantello della razza canina parentale (Mahan et al. 1978:410) d
: peso (32 kg) considerato eccessivo per un individuo (introgresso) di 6 mesi; si tratta di uno dei 3 individui introgressi che mostravano lo sperone nelle zampe posteriori e
: esemplare introgresso di 45 kg (parzialmente disidratato; vedi Figura 1). Tabella 3. – Caratteristiche fenotipiche che, come da riprove sperimentali o osservazioni dirette, in natura o in cattività, su ibridi noti tra lupo (o coyote) e cane, sono attese variare negli ibridi rispetto allo standard fenotipico del lupo. Direzione ed entità delle variazioni morfologiche attese negli ibridi dipendono dalla tipologia di cane con il quale avviene l’ibridazione. 67 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane tecniche semiquantitative e/o di ordinamento atte ad una trattazione più quantitativa ed oggettiva di caratteri altrimenti considerati qualitativi. Caratteri Lupo
Cane/ibridi
Cfr. Figure
Tartufo nasale nero a chiazze o depigmentato
Vibrisse nasali spesse e nere fine e/o arricciate o depigmentate Pigmentazione delle gengive lungo la linea dei denti scura e continua assente o discontinua (a macchie) Cuscinetti plantari neri depigmentati o a macchie Coda a pennello con punta nera eccessivamente lunga, arricciata o a bandiera Mascherina facciale grigio‐marrone che sfuma verso il bianco crema intorno sotto la gola colori più forti e contrastati con confini cromatici più netti e demarcati; manca spesso la lima labiale scura ed il sottogola chiaro Fig. 7 Macchie intorno agli occhi giallo‐crema occhi assenti, o più chiare e ampie e dai margini più marcati sopra agli Fig. 6 Tabella 4. – Possibili caratteristiche fenotipiche in attesa di riscontro sperimentale o su base genetica e che sono state suggerite come possibile indicazione di ibridazione tra lupo e cane (o dingo e cane). Come per le caratteristiche morfologiche in Tabella 3, la direzione ed entità delle variazioni attese negli ibridi dipendono dalla tipologia di cane con il quale avviene l’ibridazione. ‐ Caratteri craniometrici A livello anatomico sono pochi i caratteri diagnostici finora descritti, tra i quali spiccano quelli craniometrici, dal momento che il cranio ha storicamente rappresentato materiale di studio tassonomico per il lupo, e molti ibridi o presunti tali tra lupo, coyote e/o cane sono stati storicamente analizzati su base craniometrica (p. es, Wetzel e Lawrence 1962, Lawrence e Bossert 1967, 1969, 1975, Mengel 1971, Gipson et al. 1974, Mahan et al. 1978, Schmitz e Kolenosky 1985). Tuttavia, anche in questo caso in funzione della grande variabilità morfologica esistente tra le diverse tipologie e razze di cane, le caratteristiche attese negli ibridi non sono necessariamente diagnostiche e si possono ampiamente soprapporre con quelle delle forme parentali (Lawrence e Bossert 1967); tuttavia alcuni caratteri possono essere indicativi, al pari delle caratteristiche fenotipiche sopra elencate, e servire da integrazione o supporto ad altri caratteri diagnostici genetici e fenotipici, ovviamente avendo in questo caso necessità di accedere alla carcassa dell’esemplare in questione13. In particolare, nel cranio del lupo le bulle auricolari sono ben sviluppate e convesse, le creste nucali e saggittali particolarmente sviluppate e, come atteso anche da un confronto tra crani di dingo e di ibridi (dingo/cane domestico), nel lupo il muso dovrebbe essere più lungo e sfinato, corrispondendo ad una maggiore distanza alveolare tra P1 e P4 (Newsome et al. 1980, Newsone e Corbett 1982), con denti canini e ferini di più grandi dimensioni (Newsome et al., 1980; Newsome e Corbett, 1982; Corbett, 1995; Walters, 1995). Punteggi di verosimiglianza possono essere assegnati a ciascuna 13
Motivo questo per cui è importante conservare il cranio di esemplari sospetti o per i quali si intende comunque realizzare analisi di verifica genetica. 68 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane caratteristica e trattati quantitativamente in vario modo, ad esempio tramite semplice addizione per consolidare un indice cumulativo (Newsone e Corbett 1985), oppure integrando varie classi di punteggio in modelli specifici in base ai quali procedere ad una assegnazione su base probabilistica (ad es., equazione canonica; Corbett 1995, Elledge et al. 2006). In molti casi, caratteristiche craniometriche anomale sono accompagnante da anomalie nelle altre caratteristiche morfologiche (p. es., Mahan et al. 1978), aumentando il valore diagnostico delle caratteristiche fenotipiche nel loro complesso. 69 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Ibridi catturati in natura e detenuti negli anni ’70 presso lo zoo di Pescasseroli. Si notano le zampe corte e tozze, il colore particolarmente chiaro del mantello e altre proporzioni anomale che interessano il collo, la testa e le orecchie (Foto: Luigi Boitani). Uno dei tre ibridi (F1) prodotti dall’accoppiamento tra una lupa ed un cane in Majella negli anni ’70 (Boitani 1986). Si notano le orecchie particolarmente lunghe ed il bandeggio fortemente anomalo del mantello (Foto: Luigi Boitani). Gli altri due esemplari della cucciolata ibrida (F1) rilevata in Majella negli ani ’70 (Boitani 1986). Si nota il mantello particolarmente chiaro di uno dei cuccioli, e la forma melanica dell’altro, con macchie bianche su gola, petto e zampe (Foto: Luigi Boitani). Esemplare ibrido recuperato morto in Salamanca (Spagna). Si tratta di uno degli individui risultati geneticamente ibridi di cui al lavoro di Godinho et al. (2011). Si notano la colorazione chiara, le orecchie lunghe, zampe e piedi sottili, bandeggi scuri anomali e pelo eccessivamente lungo in posizione ventrale (Foto: Juan‐Carlos Blanco). Esemplare recuperato morto in provincia di Firenze e Esemplare ibrido (F1) tra lupa e cane (pastore tedesco) in risultato ibrido alle analisi genetiche effettuate dall’ISPRA. Germania. Si notano le zampe ed il petto sottili, il muso Si noti il pelo eccessivamente lungo su tutto il corpo e sulla corto e sottile e le orecchie di dimensioni eccessive (Foto: zampe. L’esemplare mostrava anche alcune unghie depigmentate (Foto: Duccio Berzi; www.canislupus.it). Ilka Reinhardt). Figura 4. – Immagini di ibridi noti tra cane e lupo.
70 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Foreste Nazionale delle Foreste Casentinesi (Foto: Graziano Parco Regionale Suviana‐Brasimone (BO) (Foto: Antonio Tortelli). Iannibelli; www.provediemozioni.it). Parco Regionale Suviana‐Brasimone (BO) (Foto: Fabbri Renato). Appennino toscano (FI) 2002 (Foto Massimo del Guasta). Appennino toscano www.canislupus.it). (FI) (Foto Duccio Provincia di Modena (Foto: Riccardo Fontana). Berzi; Figura 5. – Immagini di esemplari melanici. Le forme melaniche sono oggi riconosciute tipiche di esemplari ibridi e/o introgressi (Anderson et al. 2009). Alcuni di questi esemplari sono stati analizzati geneticamente, risultano risultati eterozigoti per il locus‐k (Anderson et al. 2009, Greco 2009). 71 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Parco Appennino Tosco‐Emiliano (RE) (Foto Giovanni Grossi). Cucciolata recuperata nell’Appennino parmense nella primavera del 2009. Si nota il colore particolarmente scuro del mantello, le macchie bianche sul petto e sulle zampe, e la presenza di alcune unghie depigmentate (Foto: Mario Andreani). Appennino tosco‐romagnolo (Foto: Duccio Berzi). Unico esemplare melanico all’interno di uno dei branchi studiati in Galizia (Spagna). Ad oggi, sono rarissimi i casi di canidi melanici in Spagna (Foto: Juan Carlos Blanco). Figura 5. (continua) 72 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Esemplare di colore particolarmente chiaro e con tessitura del pelo particolarmente arruffata e spoglia sulla coda. Parco Appennino Tosco‐Emiliano (Villa Minozzo, RE) (Foto: Giovanni Grossi). Esemplare particolarmete scuro fotografato nel Parco Naturale Monte Sole (BO) (foto: Antonio Iannibelli; ww.provediemozioni.it). Esemplare melanico con ampie macchie bianche fotografato nell’Appennio in provincia di Parma (vedi anche Figura 1). Le dimensioni di questo individuo (peso da morto e parzialmente disidratato: 45 kg) erano anche superiori allo standard del lupo in Italia (Foto: Mario Andreani). Esemplare recuparato decapitato in provincia di Grosseto (Monte Amiata) dal colore particolarmente rossiccio e pelo eccessivamente folto. L’esemplare presentava inoltre lo sperone sulle zampe posteriori (dettaglio) e corrisponde al campione W587 geneticamente classificato come introgresso di seconda generazione (in Ciucci et al. 2003) (Foto: Niso Cini). Esemplare dal mantello chiaro recuperato ferito nell’Appennino pesarese e successivamente deceduto. Tartufo e mucose buccali erano completamente privi di pigmentazione (Foto: M. Landi, M. Pandolfi). Esemplare dal mantello isabellino recuperato morto in provincia di Livorno (vedi anche Figura 2) (Foto: Giovanni Milano). Figura 6. – Esempi di colorazioni del mantello anomale che, a giudizio dell’autore della presente relazione, sono forte indicazione fenotipica di ibridazione tra cane e lupo. 73 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Esemplare con lo sperone sulle zampe posteriori (dettaglio) catturato nelle Crete Senesi a scopo di ricerca. Corrisponde al campione W535 geneticamente classificato come reincrocio (Ciucci et al. 2003). Si nota anche la mascherina facciale particolarmente pronunciata e le dimensioni (peso) notevoli per un cucciolo di 6 mesi (Foto: Paolo Ciucci) Esemplare recuperato morto in seguito ad incidente con veicolo in provincia di Roma. Anch’esso presenta lo sperone sulle zampe posteriori (dettaglio), e la colorazione del mantello è eccessivamente chiara, con pelo particolarmente lungo ed arruffato su testa, fianchi e ventre (vedi anche figura 3) (Foto: Domenico Tucci). Immagine da foto‐trappola professionale scattata nel Parco Esemplare femmina recuparata morta nel Parco Appennino Appennino Tosco‐Emiliano (PR) in cui l’esemplare presenta Tosco‐Emiliano (PR) in cui si notano alcune unghie alcune unghie depigmentate (vedi anche foto successiva) depigmentate (Foto: Mario Anderani). (Foto: Davide e Isacco Zerbini). Dettaglio dell’immagine precedente in cui si notano le unghie depigmentate. Questo livello di risoluzione è difficilmente raggiungibile con le trappole fotografiche di largo uso commerciale (Foto: Davide e Isacco Zerbini). Figura 7. – Esempi di alcune caratteristiche fenotipiche peculiari e ritenute devianti rispetto allo standard fenotipico del lupo; alcune di esse rappresentano segni di ibridazione comprovati su base genetica (melanismo, sperone sulle zampe posteriori, unghie bianche) mentre altre, di valutazione più soggettiva, meritano nell’immediato futuro un’attenta valutazione, specialmente a carico degli esemplari risultati geneticamente ibridi (vedi testo). 74 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Esemplare fotografato con foto trappola nel Parco Appennino Immagine scattata con foto trappola nel Parco Appennino Tosco‐Emiliano (PR) in cui si notano orecchie pendule, Tosco‐Emiliano (PR): si tratta probabilmente dello stesso associate ad una colorazione particolarmente scura e zampe individuo della foto accanto (Foto: Luigi Molinari). esili (Foto: Luigi Molinari). Questo esemplare fotografato nell’Appennino tosco Foto scattata nella stessa zona dell’Appennino tosco romagnolo romagnolo (BO) presenta alcuni bandeggi scuri piuttosto (BO) della foto di lato in cui anche in questi due individui si atipici (testa, gola, fianchi) e soprattutto una mascherina notano le medesime caratteristiche (Foto: A. Tovoli). facciale eccessivamente demarcata (Foto: A. Tovoli) Esemplare fotografato a Vergato (BO) nell’autunno 2011. Diversi esperti hanno opinioni differenti sul grado di difformità rispetto agli standard fenotipici del lupo, sottolineando la natura soggettiva delle valutazioni fenotipiche. Il comportamento di quest’esemplare era del resto altamente anomalo, dimostrando in un’occasione aggressività nei confronti delle persone (Foto: Lorenzo Rigacci). Quest’esemlare ha recentemente creato alarmismo sociale nell’abitato di Barrea (l’Aquila), nal Parco Nazionale d’Abruzzo Lazio e Molise, in quanto girava indisturbato nelle strade del paese. In seguito a cattura, del resto, è risultato essere un cane lupo cecoslovacco. Si noti la mascherina facciale particolarmente demarcata (Foto: Luciano Sammarone) Figura 7. – (continua). 75 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane ‐ Altri caratteri fenotipici In seguito ad una serie di studi in cattività, essenzialmente basati su ibridi tra coyote cane e lupo (vedi sopra), anche a livello di alcune caratteristiche fisiologiche, anatomiche, comportamentali ed ecologiche ci si potrebbe aspettare, entro certi limiti, di caratterizzare gli esemplari ibridi (specialmente negli F1 e F2) rispetto alle popolazioni parentali di lupo. Nonostante tali differenze siano particolarmente difficili da evidenziare, e ancor di più utilizzare in chiave diagnostica per applicazioni gestionali, è comunque importante sintetizzarle per fornire spunti di ulteriori ricerche ed al fine di facilitare un più ampio spettro d’indagine; in particolare a livello degli F1 e F2 sono stati riscontrati: ‐
anomalie anatomiche (criptorchidismo e forme devianti del baculum) e fisiologiche (spermatogenesi stagionalmente più estesa) a livello riproduttivo negli F1 (Kennelly & Roberts 1969, Mahan et al. 1978); ‐
dimensioni delle cucciolate ridotte negli F2, come indicazione di una ridotta fertilità (Mengel 1971, Gipson et al. 1975); ‐
sfasamento del periodo riproduttivo negli ibridi (Iljin 1941, Mahan et al. 1978), sebbene la variabilità individuale non sembri comportare un effettivo isolamento riproduttivo con le popolazioni parentali (Gipson et al. 1974, 1975) (vedi anche § 4.3); ‐
diete a maggiore composizione di alimenti antropogenici (Mahan et al. 1978, Gipson & Sealander 1976); ‐
accresciuta aggressività e atteggiamento di dominanza (Silver & Silver 1969, Mengel 1971, Gipson 1972, Fox 1975); ‐
assenza di cure parentali nei maschi e di contatti con la femmina durante il periodo di allevamento dei cuccioli (Silver and Silver 1969, Mengel 1971). Queste ed altre caratteristiche meriterebbero particolare attenzione di studio in nuclei noti di ibridi, sia in condizioni di cattività che allo stato selvatico; ad oggi solo Andersone et al. (2002), in Latvia, hanno riportato per il lupo una data di parto anomala (fine febbraio) in una cucciolata di origine ibrida. Anche se si tratta di un singolo caso, esso conferma comunque quanto precedentemente riportato per ibridi di diverse specie nel genere Canis, ovvero che è lecito attendersi anche a livello fisiologico, e presumibilmente comportamentale, variazioni sensibili rispetto ai pattern tipici delle popolazioni parentali. 6.2.3 Raccomandazioni A chiusura del presente capitolo, è opportuno elencare una serie di raccomandazioni che fungano da sintesi di quanto precedentemente esposto e di indirizzo per la messa a punto delle migliori tecniche e strategie per l’analisi dell’ibridazione introgressiva tra cane e lupo. Il fine è facilitare l’attivazione di indagini e programmi di monitoraggio del fenomeno che siano efficienti, ben strutturati, affidabili e soprattutto informativi per gli interventi di gestione che devono essere necessariamente contemplati: •
le analisi genetiche offrono i criteri di identificazione degli ibridi di maggiore affidabilità, ma il loro potere diagnostico può essere fortemente limitato dal tipo e dal 76 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane numero di marcatori genetici utilizzati e, a livello di popolazione, dalle strategie di campionamento adottate; •
si possono commettere due errori opposti in fase di identificazione di individui potenzialmente ibridi (vedi § 6.1): le analisi genetiche, ed in particolare quelle basate su un numero e tipo di marcatori non particolarmente diagnostici, sono maggiormente suscettibili ad errori di Tipo‐II, ovvero l’erronea assegnazione alla popolazione di lupo di individui che in realtà sono ibridi. Un errore, questo, che ha importanti conseguenze in termini gestionali e che necessita quindi di maggiore e particolare attenzione da parte di tecnici ed amministratori in considerazione della specifica situazione e contesto gestionale del lupo in Italia; •
esistono accorgimenti tecnici e di campionamento per ovviare ai limiti dei criteri genetici e rendere il processo di identificazione degli ibridi e di quantificazione dell’introgressione a livello popolazionistico sempre più affidabile; questi prevedono: o l’impiego di un numero (e tipo) di marcatori biparentali adeguato (≥ 42‐48) all’identificazione degli individui ibridi reincrociati all’interno della popolazione di lupo (B1, B2, etc.) e non solo degli ibridi F1 e F2 (peraltro rari); il numero prescelto dei marcatori dovrà tenere conto, oltre che della qualità del DNA a disposizione, delle recenti indicazioni bibliografiche e di analisi di simulazione realizzate ad hoc ed atte a quantificare il potere diagnostico del sistema utilizzato (p. es., Randi 2008, Godinho et al. 2011); o l’uso integrato di marcatori genetici tra loro complementari (DNAmt, marcatori sessuali, marcatori biparentali (loci microsatellite e/o SNP), sia a sostegno delle evidenze relative ai marcatori biparentali, sia per aumentare interpretabilità e ricostruzione dei casi di introgressione identificati; o l’adozione di strategie di campionamento ben strutturate e stratificate sia geograficamente che temporalmente, sia della popolazione di lupo che di cani, non solo al fine di aumentare l’efficacia dei test di assegnazione, ma anche di permettere inferenze del fenomeno introgressivo a livello dell’intera popolazione; •
sebbene i criteri fenotipici e morfologici per l’identificazione degli ibridi soffrano di un elevato livello di soggettività, esistono alcune caratteristiche ad oggi riconosciute essere un’oggettiva indicazione di ibridazione (melanismo, sperone sulle zampe posteriori, unghie depigmentate); altre se ne potrebbero identificare nell’immediato futuro attraverso esami fenotipici attenti ed accurati, specialmente se condotti a livello degli individui riconosciuti ibridi su base genetica; •
seppure con gli attuali limiti, la valutazione fenotipica dei casi sospetti di ibridazione è reputata un’integrazione critica ed essenziale dei criteri di identificazione genetici, specialmente laddove questi ultimi sono basati su un numero (e tipologia) di marcatori con scarso potere diagnostico (vedi sopra); l’integrazione di una valutazione fenotipica appare peraltro giustificata nel caso la strategia di gestione dell’ibridazione introgressiva tra cane e lupo in Italia intenda (come qui suggerito; vedi § 6.1) perseguire una logica conservativa, ovvero limitare il rischio di assegnare alla popolazione di lupo individui altrimenti ibridi o introgressi; •
dal momento che il monitoraggio (e la gestione) dell’ibridazione introgressiva nel lupo ha senso se realizzato su larga scala, considerazioni di carattere logistico dettano la 77 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane necessità di ricorrere a strategie di raccolta dei dati (campioni) complementari e integrative (vedi § 6.2.1 ‐ Strategie complementari per la raccolta dei campioni genetici); tenendo inoltre conto che qualità e quantità del DNA differisce tra campioni biologici non invasivi (strategia estensiva) ed invasivi (strategia intensiva), così come la possibilità di esaminare nel dettaglio i fenotipi individuali varia dal foto‐video trappolaggio alla cattura dal vivo, è opportuno tenere presente che la complementarità di monitoraggio su scale e con tecniche diverse corrisponda ad una differente affidabilità genetica e fenotipica di identificazione degli individui potenzialmente ibridi. Di conseguenza, laddove indicazioni genetiche e/o fenotipiche su larga scala indichino la probabile presenza di casi di ibridazione, è poi necessario attivare su scala locale indagini intensive e che possano sostenere analisi genetiche e fenotipiche di maggiore affidabilità (Figure 7 e 8). Campione non invasivo
≤ 12 loci
>12 loci
W
H
W
H
locus‐k
locus‐k
W
H
W
H
fenotipo?
fenotipo?
fenotipo?
fenotipo?
si
anomalo?
si
no
B≥1
W o B≥1
no
si
W o B≥1
anomalo?
si
desctivere caratteristiche
anomale
no
si
H anomalo?
no
W o B≥2
no
si
no
H B≥2
W si
no
anomalo?
H si
desctivere caratteristiche
anomale
no
H Figura 8. – Conclusioni ritenute attendibili (riquadri continui, in grassetto) o parziali (riquadri tratteggiati) secondo un approccio integrato (3 livelli di analisi genetica ed uno fenotipico) mirato all’assegnazione di un genotipo tipizzato da campione non invasivo (escrementi, peli, saliva) alla categoria lupo (W) o ibrido (H), nel caso tale assegnazione fosse basata su un numero di loci microsatellite ≤12 o 12‐20. In alcuni casi (≤12 loci e/o assenza di riscontri fenotipici) l’assegnazione finale alla popolazione di lupo non può essere considerata certa, in quanto è elevata la probabilità che individui introgressi reincrociati nella popolazione di lupo (B≥1) non vengano riconosciuti come tali. Il flusso delle evidenze in questo schema assume che: (a) ci sia stato un primo livello di analisi basato sul DNAmt e sui loci sessuali che rivelano aplotipi della popolazione italiana di lupo (altrimenti l’individuo risulterebbe introgresso indipendentemente dagli altri marcatori); (b) venga analizzato un SNP (locus‐k o altri) diagnostico di alcuni casi di ibridazione; (c) la valutazione fenotipica possa essere effettuata sull’esemplare a cui corrisponde il fenotipo analizzato (condizione rara nel caso del campionamento non invasivo). 78 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ 6. Identificazione degli ibridi lupo/cane Campione invasivo
24 ‐ 40 loci
>42 loci
W
H
W
H
locus‐k
locus‐k
W
H
W
H
fenotipo?
fenotipo?
fenotipo?
fenotipo?
si
anomalo?
si
no
B≥n
W o B≥n
no
si
no
si
no
si
no
W o B≥n
anomalo?
H anomalo?
W
anomalo?
H si
desctivere caratteristiche
anomale
no
si
no
si
no
H W*
W H H Figura 9. – Conclusioni ritenute attendibili (riquadri continui, in grassetto) o parziali (riquadri tratteggiati) secondo un approccio integrato (3 livelli di analisi genetica ed uno fenotipico) mirato all’assegnazione di un genotipo tipizzato da campione invasivo (campione ematico o di tessuto) alla categoria lupo (W) o ibrido (H), nel caso tale assegnazione fosse basata su un numero di loci microsatellite ≤40 o ≥42. Con un numero di loci inferiore a 42, ed in assenza di riscontri fenotipici, l’assegnazione finale alla popolazione di lupo potrebbe non essere considerata certa, in quanto la probabilità che individui reincrociati di successiva generazione (B≥n) non vengano riconosciuti come tali non è trascurabile. Il flusso delle evidenze in questo schema assume che: (a) ci sia stato un primo livello di analisi basato sul DNAmt e sui loci sessuali che rivelano aplotipi della popolazione italiana di lupo (altrimenti l’individuo risulterebbe introgresso indipendentemente dagli altri marcatori); (b) venga analizzato un SNP (locus‐k o altri) diagnostico di alcuni casi di ibridazione; (c) la valutazione fenotipica possa essere effettuata sull’esemplare a cui corrisponde il fenotipo analizzato. * ipoteticamente, nella rara eventualità si riscontrino caratteristiche fenotipiche anomale in esemplari considerati appartenere alla popolazione di lupo con criteri genetici di elevato potere diagnostico, si presume queste indicazioni siano trascurabili ai fini gestionali. 79 Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF ‐ Azione A2 Ibridazione tra lupo e cane e identificazione degli ibridi ‐ Referenze Referenze AA.VV. 2009. Ibridazione tra animali selvatici e domestici: una minaccia per la biodiversità. Documento finale, 4° Workshop dei Cantieri della Biodiversità. Provincia di Siena e ISPRA, Siena 10‐11 dicembre 2009. Adams, J.R., B.T. Kelly, L.P. Waits. 2003a. Using faecal DNA sampling and GIS to monitor hybridization between red wolves (Canis rufus) and coyotes. (Canis latrans). Molecular Ecology 12:2175– 2186. Adams, J.R., J.A. Leonard, L.P. Waits. 2003b. Widespread occurrence of a domestic dog mitochondrial DNA haplotype in southeastern US coyotes. Molecular Ecology 12:541‐
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