lezione9-real time
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Quantitative Real-time PCR Tecnica che consente la simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza QUANTIFICAZIONE: emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato Real-Time PCR: la reazione COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1) DNA target 2) DNA polimerasi 3) Due oligonucleotidi 4) dNTPs 5) Fluorocromo APPLICAZIONI Diagnosi malattie infettive Quantificazione patogeno RICERCA Espressione genica OGM Perché Real-Time? Misura l amplificazione in tempo reale nella fase esponenziale Target copy number Curva di amplificazione PCR Exponential phase Pateau phase cycle number RT-PCR quantitativa La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione viene rilevata e analizzata tramite computer Incremento di fluorescenza Plot lineare Cicli di PCR Plot di amplificazione Fluorescenza Curve di amplificazione Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di templato iniziale Curva di amplificazione PCR 96 replicati di uno stesso campione danno quantità finali di c-DNA molto diverse Differenze quantificazione PCR convenzionale/Real-time PCR PCR conv. Real-time PCR ♦ End-point ♦ Fase esponenziale ♦ No monitoraggio ♦ Monitoraggio ♦ < Sensibilità ♦ > Sensibilità ♦ Post-PCR ♦ No post-PCR Strumentazione Real-time ♦ Termociclizzatore ♦ Sorgente laser ♦ Detector Strumentazione Real-time Strumentazione Real-time Q F 5’ 3’ Tubulin Q H 5’ 3’ GapdH Q TX 5’ 3’ β-actin Q Cy5 5’ 3’ Cyclophilin ANALISI REAL-TIME PCR Dopo ogni rilevamento, i segnali di fluorescenza sono processati da un software e la cinetica di formazione dell amplificato è visualizzata graficamente come incremento dei segnali di fluorescenza in ordinata (ΔRn) per cicli di reazione in ascissa ΔRn = Rn + - Rn - Rn + = int. fluor. R/int. fluor. Q al mom. rilev. Rn - = int. fluor. R/int. fluor. Q prima dell amplif. CICLO THRESHOLD Il ciclo threshold (CT) è il ciclo della reazione di amplificatione nel quale il segnale di fluorescenza supera il valore di threshold Il threshold rappresenta quel valore di fluorescenza pari a 10 volte la ds della fluorescenza registrata nei primi cicli di amplificazione (background) 2 T h re s h o l d B a se lin e Sa m p le 1 .6 1 .2 0 .8 0 .4 CT 0 0 10 20 21 30 40 CICLO THRESHOLD Il Ct di 96 replicati dello stesso campione mostra valori di fluorescenza quasi identici perché è calcolato in fase esponenziale CICLO THRESHOLD È strettamente correlato al numero di copie iniziali del target Un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il Ct di un ciclo Un numero iniziale di copie pari a metà posticipa il Ct di un ciclo Due campioni che possiedono q di target diverse di 1 log hanno un DCt di 3,3 Si mantiene lineare con log di numero di copie iniziali che superano i 6-8 ordini di grandezza Which one The least? has the most? QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA: i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una curva standard) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una curva standard) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro ΔCT con quello del controllo endogeno QUANTITATIVA ASSOLUTA Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (b-actina, GAPDH, ATPs, b2 etc) CICLO THRESHOLD Il Ct è un indicatore del numero di copie iniziali CURVA STANDARD Amplificando in parallelo ai campioni a conc. non nota (unknown) degli standard esterni (a conc. nota) a diverse diluizioni, è possibile costruire una retta di regressione (curva di taratura o curva standard) Conoscendo il valore di Ct, la conc. degli UKN si può ricavare per interpolazione ponendo il Ct in ordinata e la conc. iniziale in ascissa CURVA STANDARD CURVA STANDARD Il sistema consente di valutare l efficienza di amplificazione mediante l analisi di tre parametri: 1.Slope (s): indica il n° di cicli che intercorrono tra due diluizioni dello standard che differiscono di 1 log (teorico -3,3) esprime le correlazioni esistenti tra i 2.Coeff. correlazione (R): diversi segmenti che compongono la retta di regressione (teorico 1) 3. Intercetta nell asse (y): definisce il n° di cicli necessari per rilevare 1 copia di DNA target STANDARD Virus: ac. nucleico estratto da diluizioni log di sosp. virale titolata su cellule (TCID50/50ml, PFU) Per DNA: Per RNA: plasmide contenente il target, la cui conc. è stata determinata allo spettrofotometro (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie plasmide trascritto in vitro; la conc. di RNA standard è determinata allo SF (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie QUANTITATIVA RELATIVA ΔCT Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il cambiamento di espressione di un gene target in un campione rispetto ad un altro campione scelto come calibratore QUANTITATIVA RELATIVA Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario: • TARGET – La sequenza di DNA da analizzare. • CALIBRATORE – Il campione da usare come riferimento per l analisi comparativa • CONTROLLO ENDOGENO – Un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (ΔCT) Comparare ciascun ΔCT così ottenuto con il ΔCT di un calibratore (cb) (ΔΔCT) 2 -(ΔCT,r- ΔCT,cb) = 2 –ΔΔCT Il valore così ottenuto permette di determinare la Concentrazione relativa del target Step per il calcolo del 2- DDCT 1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK) Ct gene interesse – Ct HK = ΔCt 2. Normalizzazione con il calibratore ΔCt Campione – ΔCt Calibratore = ΔΔCt 3. Applicare la formula 2 -ΔΔCt ESEMPIO Di quanto varia l espressione dell IL-10 tra Liver e Brain? 1. ΔCt Brain = 18 ΔCt Liver = 12 2. ΔCt campione – ΔCt calibratore = 12-18 = -6 3. 2 -ΔΔCT = 26 = 64 L IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain! Chimiche Real-time PCR Tutte le chimiche fanno uso di fluorocromi che emettono fluorescenza se eccitati da una luce a determinata λ Coloranti intercalanti " SYBR green " Etido bromuro Sonde specifiche ad ibridizzazione " TaqMan (sonde di ibridazione con idrolisi) " FRET " Molecular beacons (sonde di ibridazione senza idrolisi) " Scorpion (sonde incorporate nei primers) COLORANTI INTERCALANTI EtBr SYBR Green emette fluorescenza 25 volte più intensa se legato a dsDNA emette fluorescenza 200 volte più intensa se legato a dsDNA SYBR GREEN: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA SYBR GREEN L’intercalante emette una bassa fluorescenza quando non è legato a dsDNA Durante l’estensione SYBR Green si lega a dsDNA: il segnale aumenta Durante la denaturazione SYBR Green torna in soluzione: il segnale dimunisce SYBR Green E un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza SYBR Green Primer ANNEALING L intensità della fluorescenza comincia ad aumentare Luce emessa ALLUNGAMENTO L intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento Polimerasi L AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E REGISTRATO A 530nm SYBR GREEN 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs Primers Intercalation Dyes Thermal Stable DNA Polymerase Add Master Mix and Sample Reaction Tube 3’ Taq λ 5’ Denaturation ID 3’ 5’ Annealing SYBR GREEN 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Extension 3’ 5’ ID Taq ID 5’ ID Taq ID 3’ 5’ ID Taq λ 3’ λ ID ID 5’ ID λ λ 5’ Taq 5’ ID ID λ Repeat 5’ 3’ Extension Continued Apply Excitation Wavelength SVANTAGGI ♦ Specificità è data solo dai primers ♦ La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers ♦ È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici VANTAGGI Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa Curva di melting alla fine della reazione Misurazione della fluorescenza durante il progressivo aumento T > Tm target Alla T alla quale i filamenti di DNA si separano, il segnale precipita Il modo più semplice di programmare una curva di melting consiste nell aumentare gradatamente la temperatura (0.5°C per ciclo) SYBR GREEN Due modi per analizzare la curva di melting la diminuzione della fluorescenza con l’aumentare della temperatura il tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo SYBR GREEN Diminuzione della fluorescenza con l’aumentare della temperatura SYBR GREEN Tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo specifico aspecific o SONDE DI IBRIDAZIONE • Sonde di ibridazione con idrolisi – TaqMan • Sonde di ibridazione senza idrolisi – Molecular Beacons – Dual oligo FRET probes • Sonde incorporate nei primers – Amplifluor – Scorpions TAQMAN PROBES Il sistema TaqMan è costituito da 2 primers + 1 sonda (probe) Sfrutta l attività 5 -3 esonucleasica di alcune polimerasi (Taq, Tth, Tfl) Il probe è costituito da un oligonucleotide marcato con fluorocromi alle estremità 5 e 3 • Fluorocromo 5 REPORTER • Fluorocromo 3 QUENCHER Quando la sonda non è ibridata, Q assorbe la fluorescenza di R ed il sistema è silente TAQMAN PROBES Principio di Forster del trasferimento dell energia R Q Q R TAQMAN PROBES 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs Primers Add Master Mix and Sample Thermal Stable DNA Polymerase R Probe 5’ Q 3’ Reaction Tube 3’ 5’ Taq Denaturation 3’ λ 5’ R 5’ Annealing Q 3’ TAQMAN PROBES Q R 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Extension Step R Q R Taq 3’ 1. Strand Displacement 5’ 5’ 3’ R Q 3’ Taq 2. Cleavage 5’ 5’ 3’ R Taq 3. Polymerization Complete 5’ 3’ 5’ 3’ λ R Taq 3’ 5’ 5’ 3’ 4. Detection TAQMAN PROBES Vantaggi • Il sistema TaqMan produce un robusto segnale cumulativo • Chimica più utilizzata in real-time • Mix precostituite per molti saggi TaqMan Svantaggi • Il quencher emette fluorescenza • Elevato background • Specificità alta, ma inferiore rispetto a beacon TAQMAN PROBES Disegno di primers e probe º Amplicone di 70-150 bp (+ facile denaturazione) º Tm probe = 68-70°C (10°C > Tm primers) º Tm primers = 58-60 °C º No G all’estremità 5’ del probe TAQMAN PROBES Effetto della lunghezza dell’amplicone sull’efficienza di reazione Stessa sonda, stesso DNA-target, stessa [ ] di DNA TC = 19.4 TC = 20.9 Primers studiati per RealTime PCR: I primers amplificano un segmento di 79 basi del transgene TSWV-N Primers utilizzati in PCR tradizionale: I primers amplificano un segmento di 273 basi del transgene TSWV-N File termico • Poiché l’idrolisi della sonda avviene solo se questa è ibridata al target, l’estensione dovrebbe avvenire a T compatibili con la Tm della sonda • Molti sistemi TaqMan utilizzano due soli step: 1. denaturazione a 94°C 2. annealing/extension a 60°C SONDE MINOR GROOVE BINDER (MGB) • Aumento della stabilita termodinamica • Riduzione della lunghezza della sonda (12-18 basi) • Incremento della specificita snps diidrociclopirroloindolocarbossilato tripeptide, CDPI3 PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2) VARIAZIONE NEL GENE DELLA PROTEINA DEL CAPSIDE PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2) DISEGNO DI PRIMERS E SONDE MGB Test 2a/2b Test 2b/2c CPVa/b-For CPVb/c For CPVa/b-Rev CPVb/c Rev CPVa-Pb (marcata con VIC) (marcata con FAM) CPVb1-Pb (marcata con FAM) (marcata con VIC) 4062A G CPVb2-Pb CPVc-Pb 4064T A MOLECULAR BEACONS • Possiedono una struttura stem and loop • Il loop è costituito da una regione complementare alla sequenza target • Lo stem è costituito da due braccia complementari tra di loro, marcate rispettivamente con reporter e quencher MOLECULAR BEACONS Lungh. braccia = 4-7 bp Tm loop = 68-70°C Tm braccia =2-5°C<Tm loop Tm primers=58-60°C MOLECULAR BEACONS • In soluzione il beacon assume una forma a forcina (hairpin), a causa della elevata complementarietà tra le basi delle braccia QUENCING • Quando è ibridato al target, il beacon assume conformazione lineare FLUORESCENZA MOLECULAR BEACONS 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ d.NTPs Primers Thermal Stable DNA Polymerase Molecular Beacon R Reaction Tube Add Master Mix and Sample Q 3’ 5’ Taq Denaturation 3’ R 5’ 5’ Annealing Q 3’ MOLECULAR BEACONS λ Q R 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Q 3’ Detection Extension Step R 5’ Taq 5’ 5’ 3’ 1. Strand Displacement Molecular Beacon 2. Polymerization Complete Probe Silent Taq R Q 3’ 5’ 5’ 3’ MOLECULAR BEACONS Vantaggi • Alta specificità (1 nt) • Basso background Svantaggi • I beacon non producono un robusto segnale cumulativo • Difficoltà nel disegno del beacon FRET PROBES • Utilizzano due sonde diverse che ibridizzano al target in modo che l estremità 5 della prima sia vicina alla estremità 3 della seconda (ibridazione testa-coda) • La prima sonda reca alla estremità 5 un fluoroforo (donatore) la cui emissione è silente, ma capace di eccitare il fluoroforo presente alla estremità 3 dell altra sonda • Solo l emissione del secondo fluoroforo è captata dal detector Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte dell'accettore che viene rilevato donatore accettore FRET PROBES l R D 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 1-5 bases D 3’ 5’ Extension Step R Taq Detection 5’ 5’ 3’ 1. Strand Displacement System Silent R 2. Polymerization Complete System Silent Taq 3’ 5’ 5’ 3’