istruzione di lavoro il 5.7.03 campionamento: superfici

IL 5.7.03
Campionamento: Superfici
ISTRUZIONE DI LAVORO IL 5.7.03
CAMPIONAMENTO: SUPERFICI
Redatto da: RSQ
Firma
Verificato e Approvato da: RD
Firma
RSQ/RD Ed 05 del 24/03/2015
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Campionamento: Superfici
OGGETTO
La presente Istruzione Di Lavoro definisce le modalità operative cui dovrà attenersi il personale che esegue i campionamenti per conto del laboratorio Cinthianum Labac, al fine di ridurre gli errori e non vanificare la precisione delle successive determinazioni.
RESPONSABILITÀ:
I tecnici di campionamento sono tenuti alla scrupolosa applicazione di quanto esposto nella
presente Istruzione di Lavoro
DOCUMENTI DI RIFERIMENTO
ISO 18593
Horizonthal metods for sampling techniques from
surfaces using contact plates and swabs
ISO 17604
Carcass sampling for microbiological analysis
REG CE 2073
Sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimen-
Regione Lombardia
Linee Guida sull’applicazione del REG CE 2073
MOD 5.7.03
Verbale di campionamento
RSQ/RD Ed 05 del 24/03/2015
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ATTIVITÀ:
1 METODICHE DI CAMPIONAMENTO
•
Prelievo dei germi mediante tampone (o spugnetta), che viene strisciato sulla superficie, successivo trasferimento dei microrganismi presenti nel tampone a un liquido
diluente che viene esaminato mediante semine in piastra
•
Prelievo dei germi presenti con il ricorso a terreni di coltura solidi che vengono fatti
aderire alla superficie in esame, dopo incubazione si contano le colonie che si sviluppano sul terreno di coltura
•
Prelievo con metodo distruttivo. E’ applicabile soltanto ad alcune superfici biotiche e
prevede il distacco in sterilità di uno strato superficiale di circa 1 mm di spessore. Il
materiale prelevato viene sospeso in un diluente nel quale mediante agitazione vengono trasferiti i germi presenti nel campione.
•
NB: Per quanto riguarda i tamponi ambientali, non si accettano tamponi privi di liquido di trasporto o con terreno di trasporto solido; ove richiesto il laboratorio può
fornire il materiale necessario al campionamento.
•
il liquido di trasporto deve essere precisamente nella quantità di 10 ml;
•
poiché i conteggi sono effettuati sulla base di questo preciso volume e sull’area della
superficie campionata, dichiarata nel verbale di campionamento, è necessario seguire
le regole di seguito indicate, sia per campionamenti ambientali che di carcasse.
1.1 PRELIEVO MEDIANTE TAMPONE
Materiale necessario:
•
•
Tamponi in fibra ( rayon, dacron) o in alginato di calcio.
“Delimitatore di area” sterile
Determinazioni effettuabili:
•
Si possono effettuare sia determinazioni quantitative che qualitative,
•
utilizzare un tampone per ogni esame qualitativo richiesto (ad es. un tampone per ricerca Salmonella spp o ricerca Listeria monocytogenes).
•
per gli esami quantitativi con un solo tampone è possibile eseguire diverse determinazioni.
Tecnica di prelievo (Ricerche quantitative)
•
La porzione di superficie su cui viene eseguito il prelievo deve essere limitata da un
2
“delimitatore di area” costituito in genere da una mascherina sterile di 100 cm , op2
pure 20 cm (ISO 18593);
•
Una volta delimitata l’area da campionare si inumidisce il tampone con il liquido diluente facendo attenzione che non si imbibisca troppo, l’eventuale liquido in eccesso
viene eliminato comprimendo il tampone contro la parete della provetta che contiene
il diluente; (ISO 18593)
•
Il tampone deve essere strisciato sulla superficie compresa entro il “delimitatore di
area” in modo da raccogliere quanto più possibile della carica batterica presente;
•
E’ bene mantenere un angolo di incidenza dello stelo del tampone rispetto alla superficie di 30°,inoltre, mentre si striscia il tampone deve essere fatto ruotare in modo da
utilizzare per il prelievo tutta la parte disponibile;
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•
In genere lo striscio va effettuato in successione lungo due direzioni tra loro perpendicolari;
•
Il modo in cui vengono effettuate queste operazioni è critico e per poter confrontare i
risultati di prelievi diversi è opportuno che le modalità di prelievo siano uniformi
•
completate le operazioni di campionamento riporre il tampone nella provetta con il
diluente.
•
identificare il tampone e compilare il verbale di campionamento in tutte le sue parti
predisponendo per l’invio al laboratorio.
1.2 PRELIEVO MEDIANTE SPUGNETTA (SPONGE-BAG)
L’indicazione d’uso preferenziale per le spugnette è per le superfici di grandi dimensioni e/o
con maggiore presenza di materiale organico. L’unico svantaggio rispetto al tampone è costituito da una maggiore difficoltà nella “manualità” richiesta per eseguire il prelievo.
Materiale necessario:
•
Spugnette sterili disidratate di cellulosa contenute singolarmente in sacchetti di plastica sterili tipo “presto chiuso”
•
Soluzione sterile per reidratazione
•
Guanti sterili o pinza sterile
•
“Delimitatore di area” sterile
Tecnica di prelievo:
•
Utilizzare le spugnette per campionamento di superfici estese > 100 cm2 (ISO 18593) o
per campionamento su carcasse di ungulati (ISO 17604)
•
Le spugnette sterili prima dell’uso devono essere reidratate, si apre il sacchetto tirando
verso l’esterno le apposite linguette e si versano max 10 ml di soluzione reidratante; è’
importante non usare quantità maggiori di soluzione reidratante per evitare un eccesso
di imbibizione e il successivo gocciolamento;
•
Si richiude il sacchetto e lo si massaggia dall’esterno per favorire la reidratazione;
•
Quando la spugna è ben reidratata si sospinge dall’esterno verso l’imboccatura del sacchetto, si apre di nuovo il sacchetto tirando le linguette;
•
a questo punto si indossano i guanti sterili;
•
Si prende la spugna inumidita e la si striscia con sufficiente energia all’interno dell’area
precedentemente delimitata, prima in senso verticale poi in senso orizzontale;
•
Al termine del prelievo la spugna viene rimessa nel sacchetto in cui era contenuta si aggiunge un volume noto di soluzione dello stesso tipo di quella usata per la reidratazione,
si comprime il sacchetto per favorire l’uscita dell’aria e si chiude arrotolando più volte il
bordo superiore;
•
Per poter esprimere il risultato in UFC/cm2 bisognerà indicare sul verbale di campionamento sia l’estensione della superficie campionata che il volume complessivo di soluzione
reidratante utilizzata;
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•
Per poter esprimere il risultato come riferito ad una superficie “non determinata” bisognerà indicare nel verbale di campionamento soltanto il volume di soluzione reidratante
utilizzata;
•
Dopo il campionamento identificare il campione e compilare il verbale di campionamento
in tutte le sue parti predisponendo per l’invio al laboratorio.
1.3 PRELIEVO MEDIANTE PIASTRE A CONTATTO
Materiale necessario
•
Si impiegano piastre da contatto (ISO 18593), o slides flessibili,
Determinazioni effettuabili:
•
è possibile eseguire solo determinazioni quantitative su superfici piane, lisce e poco contaminate.
Tecnica di prelievo
•
Il prelievo si esegue appoggiando le piastre da contatto sulle superfici di cui si vuole misurare la carica batterica
•
I batteri presenti (o almeno una parte di essi) rimarranno adesi alla superficie del terreno
colturale ottenendo così una “impronta microbiologica” della superficie campionata
•
Il tempo di contatto terreno/superficie dovrà essere di circa 10 secondi (ISO 18593),
•
Il tempo di contatto tra piastra e superficie e la pressione esercitata sulla piastra costituiscono le due variabili principali che devono essere standardizzate per poter avere risultati
confrontabili
•
Per uniformare questi due parametri sono in commercio dispositivi che consentono di applicare sempre la stessa pressione per lo stesso tempo sulla piastra a contatto
•
Dopo il prelievo le piastre vengono chiuse e messe in termostato ad incubare alla temperatura voluta
•
Dopo incubazione si contano le colonie che si sono sviluppate esprimendo il risultato in
UFC/cm2
2
CAMPIONAMENTO DI SUPERFICI ABIOTICHE: AMBIENTALI
Rientrano in questa categoria tutte le superfici presenti negli ambienti di produzione, di trasporto, e di stoccaggio. Da un punto di vista pratico quelle più importanti sono le superfici
che entrano in contatto diretto con gli alimenti (piani di lavoro, coltelli, impastatrici, tritacarne , affettatrici, ecc).
2.1 DETERMINAZIONI QUANTITATIVE.
Consentono di ricercare il numero di microrganismi presenti per unità di superficie ovvero
per cm2. Le ricerche quantitative consentono di valutare la carica di germi “indicatori” e
l’efficacia delle operazioni di sanificazione.
2.2 DETERMINAZIONI QUALITATIVE.
Si utilizzano per la ricerca dei germi patogeni (ad es. Salmonella spp e Listeria monocytogenes). Il risultato viene espresso come presenza o assenza tali ricerche eseguite su superfici
di lavoro consentono di individuare eventuali serbatoi di contaminazione per l’alimento a contatto.
In ogni caso è importante, per quanto possibile, prelevare un campione rappresentativo,
campioni prelevati in zone diverse della stessa superficie possono dare risultati discordanti
tra loro. Come criterio generale più ampia è la superficie di prelievo maggiore è la probabilità
di ottenere un risultato che rispecchia il reale stato microbico della stessa.
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2.3 AREA CAMPIONATA.
Ove possibile applicare le indicazioni della ISO 18593, utilizzando le mascherine di delimitazio2
2
ne(§ 1.1), La dimensione della superficie di prelievo (20 cm ,100 cm )deve essere riportata
nel verbale di campionamento. In mancanza di questo dato sarà impossibile esprimere il ri2
sultato in UFC/cm e sarà espresso come ufc/tampone
INATTIVAZIONE RESIDUI DI DISINFETTANTI
Uno degli scopi principali, se non quello principale, del controllo microbiologico delle superfici
di lavoro è quello di verificare l’efficacia delle operazioni di detersione e disinfezione. E’ possibile che dopo le disinfezioni eseguite a fine lavoro rimangano sulle superfici tracce di disinfettante.
Gli eventuali residui possono esercitare un effetto negativo sulla crescita dei batteri prelevati
dalla superficie e per eliminare l’interferenza provocata dai residui di disinfettanti, che potrebbe portare a una sottostima della popolazione microbica presente, bisogna neutralizzare
gli effetti antibatterici dei disinfettanti:
•
Eseguire il prelievo, almeno 15 minuti dopo le operazioni di disinfezione. (ISO 18593)
•
Conoscere i disinfettanti utilizzati e, se del caso, aggiungere, al liquido diluente del tampone o al terreno agarizzato delle piastre da contatto, opportune quantità di inibente appropriato,
•
Esistono in commercio tamponi già pronti con le appropriate concentrazioni dei neutralizzanti più utilizzati, non può essere prescritto un neutralizzante per tutte le circostanze,
tuttavia: per neutralizzare i residui di Sali quaternari o i detergenti anfoterici, si usa la lecitina (concentrazione 3g/l) o il tween 80 (concentrazione 30/g/l); per i disinfettanti alogeni si usa il sodio tiosolfato (concentrazione 5g/l); (ISO 18593).
3 CAMPIONAMENTO SUPERFICI BIOTICHE: CARCASSE
Rientrano in questa categoria le superfici di carcasse animali o di parti anatomiche di questi.
Lo scopo principale dei prelievi effettuati su queste superfici è quello di valutare il livello di igiene della macellazione e/o delle operazioni di sezionamento. (ISO 17604- REG CE 2073)
3.1 METODO NON DISTRUTTIVO
a) siti di campionamento per conta delle colonie e delle enterobatteriacee :
Sono previsti 4 siti di prelievo scelti tra quelli indicati per gli ungulati nell’allegato A della
norma ISO 17604, tuttavia per dare continuità a quanto indicato nella Decisione 471/2001 è
consigliabile effettuare i campionamenti nei punti di seguito elencati:
bovini: collo, punta di petto, pancia e scamone
ovini e caprini: pancia, costato, punta del petto e petto
suini: lombo, guanciale, faccia mediale della coscia (prosciutto) e pancetta
equino: pancia, punta di petto, lombo, scamone
con la possibilità che l’operatore opti per altri siti in base alla tecnica di macellazione utilizzata nell’impianto, il REG 2073/2005 infatti lascia un margine di scelta all’operatore, che tuttavia deve validare il sistema proposto.
b) siti di campionamento per ricerca di salmonella
Il numero e l’esatta localizzazione dei siti di prelevo per la ricerca di Salmonella sulle carcasse di ungulati non sono stabiliti dal regolamento 2073/2005, in analogia con le modalità operative in atto presso gli impianti di macellazione che esportano verso gli USA, si possono utilizzare quelli previsti dalla norma ISO 17604 che indica i seguenti 3 siti:
coscia,
pancia,
gola;
se si scelgono aree di prelievo diverse, tra quelle indicate nella norma ISO 17604 l’operatore
dovrà fornire all’interno del piano di autocontrollo le ragioni alla base di questa scelta.
3.2 METODICA DI CAMPIONAMENTO:
Le metodiche di campionamento variano in base alla ricerca da eseguire: per la numerazione della carica batterica totale e delle enterobatteriacee, tampone secco e umido
o spugna abrasiva“sponge bag”; per ricerca Salmonella spp. spugna abrasiva“sponge
bag”
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Poiché per la ricerca di salmonella è previsto esclusivamente l’utilizzo delle sugnette è consigliabile uniformare la metodica di campionamento in modo tale da effettuare contemporaneamente sia la ricerca di Salmonella spp, sia il conteggio della carica microbica totale e delle
enterobatteriacee. È possibile utilizzare una sola spugnetta per carcassa sui quattro siti.
3.3 CAMPIONAMENTO
NON DISTRUTTIVO SU CARCASSE DI UNGULATI MEDIANTE L’IMPIEGO DI TAMPONI
SECCHI E UMIDI
Si rimanda alle regole generali riportate al precedente § 1.1 in particolare eseguire il campionamento con due tamponi per sito, uno secco e l’altro umido seguendo le seguenti operazioni.
•
Dopo avere identificato i siti di campionamento, delimitare la prima area di 100 cm2 (50
cm2 per le carcasse di piccoli ruminanti) da sottoporre a prelievo mediante l’impiego della maschera.
•
Inumidire il primo tampone in 10 ml di diluente sterile. Assicurarsi che il tampone sia adeguatamente imbevuto senza che lo stesso presenti un eccesso di liquido ed esercitare
una pressione sufficiente a causare la procidenza del muscolo sottostante.
•
Tamponare tutta l’area oggetto di prelievo esercitando una buona pressione (come se si
dovesse detergere la superficie della carcassa dai residui di sangue secco) avendo cura di
ruotare il tampone in modo che tutta la superficie del tampone entri in contatto con la
superficie da campionare. Il tampone deve essere strisciato sulla superficie da campionare orizzontalmente, verticalmente e in diagonale (circa 10 volte in ciascun senso). Se del
caso, il delimitatore può essere parzialmente ruotato durante il prelievo in modo da farlo
aderire in ogni punto alla superficie della carcassa ed essere certi che la superficie delimitata sia effettivamente di 100 cm2.
•
Riporre quindi il tampone nella provetta contenete il diluente sterile,.
•
Ripetere l’operazione precedentemente descritta impiegando un tampone perfettamente
asciutto (tampone secco) che deve essere strofinato sulla stessa superficie già sottoposta
a campionamento con il tampone umido. Riporre anche il secondo tampone nella stessa
provetta contenente il diluente nella quale è stata riposto il primo tampone.
•
Ripetere le operazioni di cui sopra per tutte le aree da campionare impiegando per ciascuna area un tampone inumidito e uno secco.
3.4
CAMPIONAMENTO NON DISTRUTTIVO SU CARCASSE DI UNGULATI MEDIANTE L’IMPIEGO DI SPU-
GNETTE
Si rimanda alle regole generali riportate al precedente § 1.2 aggiungendo quanto segue:
•
Strofinare la spugna esercitando una buona pressione (come se si dovesse detergere la
superficie della carcassa da residui di sangue secco) sull’area delimitata dalla maschera
sia in senso orizzontale che verticale (circa 10 volte in un senso e 10 nell’altro).
•
L’intera superficie racchiusa all’interno del delimitatore deve essere interessata dal campionamento. Se del caso, il delimitatore può essere parzialmente ruotato durante il prelievo con la spugna in modo da farlo aderire in ogni punto alla superficie della carcassa
ed essere certi che la superficie delimitata sia effettivamente di 100 cm2.
•
La spugna deve essere strofinata in successione su tutti i siti di campionamento identificati a partire da quello meno contaminato verso quello che si ritiene maggiormente contaminato. In linea di massima si può stimare che la sequenza dei campionamenti può
procedere dall’alto verso il basso della carcassa (dal quarto posteriore a quello anteriore).
•
L’assistente al prelievo può validamente aiutare nel contenere la mezzena durante il prelievo purché non entri in contatto direttamente o indirettamente con le aree soggette a
campionamento. Completate le attività di campionamento, riporre la spugna nella busta
di plastica. Sigillare il sacchetto e predisporre per l’invio al laboratorio dopo avere verificato la corretta identificazione del campione.
3.5 METODO DISTRUTTIVO
a) Carcasse di ungulati
Nelle carcasse di ungulati può essere eseguito solamente per la numerazione della carica
batterica totale e delle enterobatteriacee.
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I prelievi sono effettuati in quattro siti di ogni carcassa. Si prelevano con forbici e pinze sterili
quattro campioni di tessuto, dello spessore di circa 2 mm e della superficie di circa 5 cmq
ciascuno, che costituiscono un totale di 20 cmq.
Immediatamente dopo il prelievo il campione deve essere posto all’interno di sacchetti sterili.
b) Carcasse di pollame
Il metodo distruttivo si utilizza per la ricerca di Salmonella spp..
In ogni sessione di campionamento sono prelevate casualmente almeno 15 carcasse dopo
raffreddamento.
Da ciascuna carcassa sono prelevati campioni di pelle di collo del peso di circa 10 g. In ogni
occasione i campioni di pelle di collo prelevati da tre carcasse sono aggregati prima di essere
esaminati, in modo da formare 5 campioni finali di 25 g.
4 IDENTIFICAZIONE DEL CAMPIONE E COMPILAZIONE DEL VERBALE DI CAMPIONAMENTO
Per poter procedere all’accettazione di un campione è indispensabile la conoscenza di alcuni
dati che saranno significativi alla successiva interpretazione dei risultati, è pertanto indispensabile fornire al laboratorio, unitamente ai campioni, le seguenti informazioni:
luogo di campionamento
data di campionamento
descrizione della superficie campionata
dimensione dell’area campionata (con delimitatore 100cm2-20cm2, senza delimitatore)
condizioni della superficie (sanificata - non sanificata)
richiesta di analisi
5 TRASPORTO IN LABORATORIO
Il corretto trasporto è di fondamentale importanza affinché il campione arrivi al laboratorio
nelle stesse condizioni in cui si trova al momento del campionamento, i requisiti essenziali
perché questo possa avvenire sono il rispetto delle temperature e dei tempi di trasporto.
5.1 TEMPERATURE
E’ fondamentale che la catena del freddo sia rispettata scrupolosamente e che quindi venga
monitorata la temperatura di trasporto dal momento della raccolta a quello dell’arrivo al laboratorio.
campioni ambientali
• tamponi, sponge bag, piastre a contatto:
campioni di carcasse
• tamponi, sponge bag:
Tra 1°C e + 4°C
Tra 0°C e + 4°C (NON CONGELATI)
5.2 TEMPI
Il campione dovrebbe giungere al laboratorio nel minor tempo possibile. E’ evidente però che
esistono spesso motivi pratici che non consentono consegne rapide. E’ importante che non si
verifichi mai una interruzione della catena del freddo prima della consegna al laboratorio e
che comunque la consegna , avvenga:
Entro le 4 h o comunque in tempi utili per permettere al laboratorio di lavorarli entro le
24 h (ISO 18593, ISO 17604)
5.3 ATTREZZATURE PER IL TRASPORTO
Le attrezzature utilizzate per il trasporto del campione al laboratorio devono garantire il mantenimento della temperatura entro i valori indicati. La loro idoneità o meno si basa essenzialmente su questa caratteristica. Si utilizzano i seguenti contenitori:
• Frigorifero portatile elettrico
• Borse termiche coibentate con piastre refrigeranti
Nei contenitori coibentati con piastre refrigeranti è importante non mettere i campioni a diretto contatto con le piastre.
I frigoriferi portatili devono essere portati alla temperatura di esercizio prima di eseguire il
campionamento.
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