Materiale

Consulente tecnico
e
prova scientifica
Carlo Robino
Laboratorio di Scienze Criminalistiche
Dipartimento di Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale
Università di Torino
Tutto quello che avreste voluto sapere dal test del DNA*
* Ma non dovreste osare chiedere
9 il test del DNA è un esame comparativo
• identificazione individuale
• consanguineità
Che si
mangia,
pà?
Cicogna
Identificazione individuale
9 tutte le cellule di un individuo recano il medesimo patrimonio
genetico (DNA nucleare, DNA mitocondriale citoplasmatico)
9 il 99,9% della sequenza di DNA è identica in tutti gli esseri umani
9 nel restante 0,1% sono possibili delle differenze inter-individuali
(polimorfismi)
9 lo studio di un numero cospicuo di polimorfismi (13-15 per i
marcatori “STR” correntemente in uso in ambito forense) consente di
ricostruire combinazioni di varianti che identificano in maniera
pressoché esclusiva il singolo soggetto (frequenza del profilo
genetico 1 X 10-17, un individuo ogni cento milioni di miliardi)
9 lo sviluppo delle tecniche consente di ricostruire profili genetici
identificativi anche a partire da tracce minuscole (<100 picogrammi
di DNA, pari a 16 cellule nucleate)
9 apparenti incompatibilità genotipiche
campioni biologici di un medesimo individuo
tra
diversi
1) Artefatti di PCR
9 Il DNA che andiamo ad identificare e comparare non è quello
originario contenuto nella traccia, ma un insieme di milioni di sue
copie ottenute artificialmente mediante una tecnica detta
polymerase chain reaction (PCR)
9 la PCR può generare degli artefatti!
Low copy number DNA (LCN DNA) – Low template DNA (LT DNA)
9 Gill P et al (Forensic Sci Int 2001): < 100 pg di DNA iniziali nella
reazione di PCR
9 Caddy et al (2008 Report to the UK Home Office a seguito del
caso Hoey): < 200 pg di DNA iniziali nella reazione di PCR
9 Gill P e Buckleton J (Forensic Sci In Genet 2009): impossibile
definire LT DNA; in generale, è possibile riferirsi a condizioni nelle
quali la quantità assoluta o le caratteristiche molecolari del DNA
introdotto nella PCR (degradazione) rendono altamente
verosimile la comparsa di effetti stocastici della reazione di PCR
LCN DNA – LT DNA
Comparsa di
alleli sovrannumerari
(allelic drop-in)
Perdita di
un allele
(allelic drop-out)
drop-out
Sbilanciamento
allelico
9 > cicli di PCR (da 28 a 34)
• replica dei dati
• ogni genotipo omozigote potenzialmente eterozigote (modelli
matematici)
9 il Forensic Science Service britannico,
che ha introdotto le tecniche LCN-DNA e
le ha applicate ad oggi in oltre 21.000
casi, si rifiuta di rivelare nel dettaglio le
procedure analitiche
9 FBI nel 2001 ha raccomandato di farne
uso solo in casi particolari (identificazione
di resti scheletrici di persone scomparse)
9 A seguito del caso Hoey l’uso di LCNDNA è stato sospeso dal 2007. Uno studio
condotto da un comitato d’esperti per
conto del Ministero degli Interni britannico
ha tuttavia ritenuto la metodica “robusta”
e “adatta allo scopo” e dunque essa è
stata reintrodotta dal 2009
Nature 2010 9 Negli Stati Uniti sono state pronunciate
numerose sentenze discordanti riguardo
all’ammissibilità in processo di LCN-DNA
quale prova scientifica, mancando un
accordo nella comunità scientifica
riguardo a procedure e interpretazione
statistica
DNA degradato
9 gli agenti ambientali (umidità, temperatura, radiazioni solari,
nucleasi batteriche e fungine) frammentano progressivamente i
filamenti di DNA contenuti nelle tracce
9 a fronte di una quantità di DNA anche cospicua nella traccia, le
regioni polimorfiche ancora integre suscettibili di amplificazione
mediante PCR possono essere poche: condizioni analoghe a LCNDNA/LT-DNA
2) Discrepanze tra diversi kit di PCR (primer binding site mutations)
Heterozygous
alleles are well
balanced
6
8
8
*
Allele 6
amplicon has
“dropped out”
9 in un campione di popolazione filippina (n=140) tredici
incosistenze per il locus D8S1179 tra PP16 (genotipi eterozigoti) e
ProfilerPlus (genotippi omozigoti): mutazione nel binding site di
ProfilerPlus con dropout allelico
9 inclusione di un secondo reverse primer per D8S1179 in Identifiler
Leibelt et al Forensic Sci Int 2003
3) Fenomeni biologici che mettono in crisi l’assioma secondo il quale
tutte le cellule di un individuo hanno il medesimo DNA
• instabilità di microsatelliti (MSI) e perdita di eterozigosità (LOH) in
tessuti neoplastici
≈ drop out
≈ drop in
9 campione presunto padre: biopsia inclusa in paraffina (1992) con dx
istologica di “adenocarcinoma del colon…”
STR
TH01
TPOX
FES/FPS
CSF1PO
D8S1179
D13S317
Presunto padre
6-8
11-11
11-11
10-11
12-17
11-12
Figlio
6-8
8-11
10-11
11-12
13-17
11-11
Madre
8-9.3
9-11
10-11
12-12
13-13
11-11
9 LOH?
9 mutazione germinale?
9 CTU esclude TPOX dal calcolo della probabilità di paternità (PP) e conclude
per “forte indicazione di sussistenza della paternità biologica (PP=99.52%)”
9 se si esclude TPOX perché “non affidabile”, perché non escludere anche gli
altri STR (possibili false compatibilità dovute a MSI)?
9 PP includendo nei calcoli TPOX si riduce a 1.7%!
9 alcuni
soggetti
presentano
diverse
popolazioni
di
DNA
mitocondriali,
con
diverese
distribuzioni nei singoli tessuti
9 il fenomeno è particolarmente
evidente in tessuti composti da
poche cellule con un’origine
pressoché clonale (cellule del
follicolo pilifero)
9è possibile osservare in singoli
peli aplotipi mitocondriali diversi
da quello di un campione di
riferimento
del
medesimo
individuo (sangue, saliva) per
mutazioni avvenute nel follicolo o
per segregazione nel pelo di una
sola variante eteroplasmica
9 la frequenza relativa di due
sequenze eteroplasmiche varia
all’interno del fusto di uno stesso
pelo
• eteroplasmia mtDNA
Tully et al. Forensic Sci Int 2004
4) Discrepanze di nomenclatura
“dicano i consulenti, previo esame della documentazione in atti e
acquisita eventualmente ogni altra documentazione presso enti
pubblici e privati, se il DNA estratto dai reperti e analizzato nell’ambito
del procedimento avente ad oggetto l’omicidio commesso nei
confronti di xxx, risulti o meno compatibile con il profilo genetico
dell’indagato yyy”
Caso A
Caso B
STR
SGM plus
Powerplex 16
D3S1358
15;15
15;15
TH01
6;9
6;9
D21S11
59;61*
27;28**
D18S51
14;20
Amel
X;Y
X;Y
vWA
17;17
17;17
D8S1179
12;15
12;15
* Urquhart et al Int
FGA
20;24
J Legal Med 1994
D16S539
11;12
11;12
D19S433
13;15
** Moller et al Int
J Legal Med 1994
D2S1338
-
9 apparenti identità genotipiche tra individui diversi
1) DNA degradato
9 amplificazione esclusiva di polimorfismi di minore lunghezza
9 riduzione del numero di marcatori che compongono il profilo
genetico, con conseguente aumento del rischio di match, in
special modo se un profilo parziale ignoto viene confrontato con
quelli archiviati in vasti database
9riduzione
del
numero
di
marcatori che compongono il
profilo
genetico,
con
conseguente aumento del rischio
di match, in special modo se un
profilo parziale ignoto viene
confrontato con quelli archiviati
in vasti database
Lancet, 2003
2) Ricerca entro database
9 i singoli database nazionali di profili di DNA presentano un
numero limitato di marcatori in comune
7 marcatori condivisi (il trattato di
Pruem, ne prevede almeno 6, per lo
scambio dei dati)
UK
9 Per 6 STR, la chance di condivisione
casuale del genotipo è di circa 1 ogni
5 milioni
Enfsi Germania 9 al giugno del 2009 i database
europei contengono i DNA di oltre 7
milioni di persone
9 per ogni nuova traccia sconosciuta
archiviata, ci attendiamo, pertanto, di
trovare
almeno
un
soggetto
compatibile per ragioni meramente
casuali!
3) Contaminazione del materiale usato per repertamento o indagini di
laboratorio
9 la storia del “fantasma di Hellbronn”
http://news.bbc.co.uk/2/hi/europe/7966641.stm
4) Marcatori aploidi del DNA (cromosoma Y, DNA mitocondriale)
9 Contenuti in singola copia nel patrimonio genetico dell’individuo
(gli altri cromosomi sono presenti in due copie, l’una ereditata dal
padre l’altra dalla madre)
9 Trasmessi in forma invariata dal padre a tutti i figli maschi (Y) e
dalla madre a tutti i figli (DNA mitocondriale, mtDNA)
9 Tutti i soggetti maschi con un comune antenato paterno recente
condividono il medesimo cromosoma Y e non sono quindi
distinguibili sulla base di esso
9 Tutti i soggetti con un comune antenato materno recente
condividono il medesimo mtDNA e non sono quindi distinguibili sulla
base di esso
9 Inoltre, per ragioni evolutive, vi è un elevata percentuale di
soggetti non imparentati con cromosoma Y o mtDNA identici (il 7%
degli Europei, ad esempio, ha lo stesso mtDNA!) → Basso potere
identificativo
9 circostanze che rendono difficoltoso affermare o
escludere con fondata certezza che il DNA di un
deteminato soggetto sia presente nel profilo ottenuto dalla
traccia
• LCN-DNA / LT-DNA
• DNA degradato
• DNA misto
Non solo i criminali depositano il proprio DNA! Le tracce repertate
spesso contengono anche quello della vittima, o di altri
soggetti che erano venuti a contatto con il reperto in
maniera innocente in tempi precedenti al delitto
La società scientifica internazionale dei genetisti forensi (ISFG) ha
recentemente prodotto delle linee guida per l’interpretazione di
tracce miste, tuttavia rimane grande disaccordo sia riguardo a
9 modelli matematici di interpretazione dei dati
• definizione del numero di contributori
• utilizzo delle aree dei picchi elettroforetici
9 modalità di definizione dei profili
• trattamento degli “stutter”
• definizione di una soglia minima
elettroforetici
di
inclusione
dei
picchi
In generale, l’interpretazione di un profilo misto è relativamente
semplice quando la proporzione tra DNA di due contributori è più o
meno paritaria. Per rapporti relativi oltre 1:5, l’identificazione corretta
del profilo minoritario è molto difficile; per rapporti oltre 1:10 gli alleli
del cotributore minoritario diventano di fatto invisibili
Stutter
Deletion caused by slippage
on the copied (bottom) strand
True allele
(tetranucleotide repeat)
1
2
3
5’
GATA
GATA
GATA
GATA
3’
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
1
2
3
5
6
5
C
T A
T
4
n-4
Typically 5-15% of true stutter
allele in tetranucleotide product
repeats STR loci
stutter?
stutter?
stutter?
stutter?
stutter?
Schneider et al. Forensic Sci Int 2004
Quale soglia minima per includere un picco nell’analisi?
9 in uno studio interlaboratorio (Duewer et al. J Forensic Sci
2001) solo il 69% dei laboratori estrapola correttamente il
profilo maschile in una traccia M/F 3:1 (con genotipi femminili
noti)
9 la
percentuale
di
successo
scende
al
10%
nell’estrapolazione di un profilo maschile ignoto da una traccia
contenente tre diversi DNA, F/M1/M2 2:1:1 (profilo femminile e
M1 noto)
“If you show 10 colleagues a mixture, you will
probably end up with 10 different answers” (Peter Gill)
Che altro il test del
DNA ci può dire
“a priori”?
Il sesso dell’individuo che ha depositato la traccia biologica
F
Gene dell’
M
Amelogenina
9 Possibili mutazioni nel primer binding site
9 In
alcune
popolazioni
percentuale relativamente alta
di soggetti di sesso maschile il
cui cromosoma Y presenta
delezioni in corrispondenza del
locus dell’Amelogenina:
• nepalesi 6.5% (Cadenas et al Forensic Sci
(M)
(M)
M F
F
Int 2007)
• indiani 3.6%; malesi 0.9%
et al J Forensic Sci 2003)
(Chang
M
Scorretta identificazione del genere del soggetto che ha lasciato la
traccia!
Per ora, di serio, nient’altro…almeno utilizzando
marcatori STR convenzionali
9 l’origine etnica del soggetto che ha depositato la traccia
Probabilità d’assegnare
un profilo genetico alla
corretta popolazione,
in base alla variabilità
interetnica di
STR autosomici
Lowe et al Forensic Sci Int 2001
“Vista la particolarità del profilo genetico maschile, deducibile dalle
basse frequenze di apparizione di taluni genotipi rispetto al nostro
campione della popolazione italiana (profilo 1000-10000 volte più raro
come frequenza di apparizione), si può arguire che il suddetto profilo
non appartenga ad un soggetto caucasico”
Il serial killer era
genovese
…
nel frattempo
fece altre due
vittime
Una più precisa assegnazione etnica è possibile mediante marcatori
a più lento tasso di mutazione (SNP) di cr. Y, mtDNA o autosomi
Y-SNP
Africa
aut-SNP
Europa
mtDNA
Joblin et al Nature Rev Genet 2003
Asia orientale
www.mitomap.org
Phillips at al
FSI Genetics 2007
Genotipo
Vs.
Fenotipo
Il 20% della popolazione
algerina
urbana
(Orano)
possiede un cromosoma Y
europeo o subsahariano (Robino
et al Int J Legal Med 2008)
Il 45% della popolazione
urbana di Buenos Aires
possiede un aplogruppo
mitocondriale tipicamente
amerindio (Martinez et al Hum Biol
2004)
9 Caratteri antropometrici a determinazione genetica semplice
capelli rossi
9 8 SNP di MC1R (il gene
regolatore della sintesi della
melanina) responsabili del colore
rosso dei capelli
9 100% dei soggetti omozigoti
per un SNP hanno capelli rossi
9 94% dei soggetti eterozigoti per
due SNP hanno capelli rossi
9 12% dei soggetti eterozigoti per
un SNP hanno i capelli rossi
Grimes et al. Forensic Sci Int 2001
9 studi di associazione genome wide e individuazione di geni
candidati per:
• colore degli occhi (90% di corretta identificazione di occhi
azzurri/marroni; Walsh et al FSI Genet 2010)
• colore della pelle, peso, altezza, …
9 Epoca di deposizione di una traccia
“…dicano i periti, esaminati gli atti e compiuto ogni accertamento che
sarà ritenuto opportuno, l’arco temporale entro il quale tracce
biologiche aventi le caratteristiche riscontrate sui fazzolettini in sequestro
possano permanere all’aria aperta ed all’esposizione degli agenti
atmosferici e, comunque, nel luogo in cui furono rinvenuti i reperti
stessi…”
9 la qualità di un profilo genetico dipende dal grado di integrità delle
molecole di DNA estraibili da una traccia; la degradazione del DNA non
è però un fenomeno correlato al tempo, bensì alle condizioni ambientali
di conservazione del reperto (temperatura, umidità, azione di
microorganismi, etc…)
mozzicone di sigaretta fumato 5 anni prima dell’analisi
mozzicone di sigaretta fumato 1 giorno prima dell’analisi
A meno che…
Indagato Indagato
vittima vittima
#3
Indagato
#3
#5
Vittima
Vittima
#5
#7
#6
#3
#5
Vittima
Vittima
#5
9 Modo di deposizione di una traccia per contatto
(Lowe et al Forensic Sci Int 2002)
Tendenza a depositare il proprio DNA
• buoni depositatori (“BD”)
• cattivi depositatori (“CD”)
• Phipps et al (FSI 2006): impossibile distinguere BD e CD (differenze
nell’ estrazione di DNA? nell’allestimento dell’esperimento?)
9 Tempo di persistenza di una traccia depositata per contatto
Macchia secca allestita
con globuli bianchi su
vetrino, conservata al
chiuso e a t ambiente
Raymond et al FSI Genet 2009
Macchia secca allestita
con globuli bianchi su
borsa
di
plastica,
conservata all’aperto e
protetta da sole e
pioggia
Macchia secca allestita
con globuli bianchi su
superficie esterna di una
casa, esposta a sole e
pioggia
9 Trasferimento secondario mediante contatto
DNA dell’individuo A (“BD”)
Individuo B (“CD”)
Oggetto
(Lowe et al Forensic Sci Int 2002)
9 Trasferibilità di tracce (Goray et al, FSI Genet 2009)
Trasferimento di sangue secco tra due
superfici non assorbenti (plastica)
• per semplice contatto (60 sec):
1,45%
• per contatto (60 sec) e pressione (1
kg): 0,25%
• per sfregamento (60 sec): 44,5%
“Friction contact increased the transfer of dry biological materials relative to passive
and pressured contact with the greatest transfer evident for samples deposited on
plastic. This could in part be explained by the fact that a dry sample becomes more
powdery after friction, and could thus be more easily dislodged from a non-porous
substrate. Additionally, any of the powder transferred could then also be easily lost
from thesecondary substrate.”
• meno di 10 passi che hanno
intercettato tracce di sangue secco
con area inferiore a 64 mm2
• scarpe sequestrate a 20 h dai fatti, nel
corso delle quali l’imputato ne ha fatto
comune uso
“L’imputato non poteva
non sporcarsi le scarpe
di sangue”
?!
9 Tempi relativi di deposizione
delle componenti di una
traccia
A e B?
A e poi B?
A
B e poi A?
B
9 Attribuzione
individuale
delle componenti di una
traccia
A e B?
A e B?
A
B
Natura della traccia biologica
9 metodi chimico-enzimatici:
• di semplice esecuzione
• molto sensibili
• poco specifici
9 Violenza sessuale su minore
• slip con tracce positive al test per α
amilasi
• profilo genetico misto vittima (F) /
indagato (M)
• saliva?
• urina e sudore?
• saliva di F o di M?
Aree picchi M/F
Attività α amilasi
Barni et al J Forensic Sci 2006
“…il sangue rinvenuto nel letto…è risultato
frammisto a saliva e relativo alla vittima”
sulla base di positività a test enzimatico per
amilasi
tampone vaginale della vittima
prelevato in corso di autopsia
“In addition, the presence of bacterial
amylase in and on the human body,
for example in the vaginal cavity (as
well as amylase from vaginal
secretion) can lead to measurable
amylase activity on swabs taken from
sexual assault victims”
Quarino et al J Forensic Sci 2005
9 Metodi immunologici
• Ab anti HB, PSA, α-amilasi
• Specie-specifici (primati)
• Falsi positivi (altri liquidi biologici umani)
• Falsi negativi (high dose hook effect)
• Meno sensibili
• Positivi su macchie secche di antica data
• Possibili negativi: trattamento con detergenti ionici, candeggina
9 Metodi biomolecolari (RT-PCR con sonde per mRNA tessuto-specifici)
• callicreina 3 specifico per liquido seminale (Nussbaumer et al Forensic Sci Int 2006)
• oltre 54.000 mRNA saggiati (Zubakov et al Int J Legal Med 2007)
• 5 geni saliva-specifici e 9 geni sangue-specifici
Idem con miRNA!
Zubakov et al Int J Legal Med 2010
• risultati positivi in tracce fino a 180 gg
• impossibile identificare mRNA specifici per saliva vs. secrezioni vaginali
Sperma
Espressione nel
Tessuto target
Espressione nel
Tessuto
non-target
Secrezioni
vaginali
Molto spesso non è possibile stabilire con certezza la natura del
materiale cellulare dal quale si estrae il DNA, in particolar modo
quando si effettuano campionature casuali da indumenti o dalla
superficie di oggetti (si può ipotizzare che si tratti in genere di
cellule epidermiche di sfaldamento)
“dica il C.T.…se gli indumenti
siano utilmente indagabili al fine
di reperire tracce biologiche
segnatamente di urina- e, in caso
positivo, se le stesse siano riferibili
a … o ad altri soggetti”
non ci sono test certi per la
diagnosi di natura di urina (PSA
?, urobilinogeni ?)
la traccia “gialla”
è della vittima?
Profilo della vittima
Tracce di urina secca
non sono certamente
campioni ideali da
cui estrarre DNA!
9 Omicidio: indagato un convivente della vittima
• su un indumento rinvenuto nell’abitazione “sottoposto ad un più
approfondito esame … e successiva analisi al microscopio binoculare
… traccia verosimilmente ematica”
• “… effettuato test con benzidina … confermandone la natura
ematica”
• “gli
accertamenti
…
consentono di affermare
che la traccia evidenziata
sull’indumento corrisponde
ad una commistione tra
indagato e vittima, che
contiene sangue umano
riconducibile alla vittima”