Toxocara canis IgG ELISA

Transcript

Userś Manual
Toxocara canis IgG
ELISA
Enzyme Immunoassay for the qualitative screening of serum IgG
antibodies to Toxocara
HZ-3518
96 wells
Toxocara canis IgG ELISA HZ-3518
Version 5.0
Effective, June 2011
(rB 12-28-10)
(It-KJ-2004)
Please use only the valid version of the package insert provided with the kit.
Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Arbeitsanleitung.
Si prega di usare la versione valida dell'inserto del pacco a disposizione con il kit.
Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit.
Table of Contents / Tabella die Contenuti
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INTENDED USE ....................................................................................................................................... 3
SUMMARY ................................................................................................................................................ 3
PRINCIPLE OF PROCEDURE ................................................................................................................. 3
REAGENTS .............................................................................................................................................. 3
PRECAUTIONS ........................................................................................................................................ 4
STORAGE CONDITIONS ......................................................................................................................... 4
PREPARATION ........................................................................................................................................ 4
COLLECTION AND PREPARATION OF SERUM ................................................................................... 4
PROCEDURE ........................................................................................................................................... 4
READING OF RESULTS .......................................................................................................................... 5
TEST LIMITATIONS ............................................................................................................................. .... 5
QUALITY CONTROL ................................................................................................................................ 5
TROUBLESHOOTING .............................................................................................................................. 5
INTERPRETATION OF RESULTS ........................................................................................................... 6
EXPECTED RESULTS ............................................................................................................................. 6
PERFORMANCE DATA ........................................................................................................................... 6
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REAGENZIEN ........................................................................................................................................... 7
VORSICHTSMAßNAHMEN ...................................................................................................................... 7
LAGERBEDINGUNGEN ........................................................................................................................... 7
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN .................................................................................................... 7
PROBENGEWINNUNG ............................................................................................................................ 8
TESTVERFAHREN............................................................................................................................. ...... 8
ABLESEN DER ERGEBNISSE ................................................................................................................ 9
GRENZEN DES TESTVERFAHRENS ..................................................................................................... 9
QUALITÄTSKONTROLLE ........................................................................................................................ 9
FEHLERBEHEBUNG................................................................................................................................ 9
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE ................................................................................................. 9
ERW ARTETE ERGEBNISSE ................................................................................................................. 10
LEISTUNGSKENNZEICHEN .................................................................................................................. 10
Hölzel Diagnostika GmbH, Hansaring 10, 50670 Köln, Germany
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APPLICABILITÀ ...................................................................................................................................... 11
RIASSUNTO ........................................................................................................................................... 11
PRINCIPIO DEL TEST ........................................................................................................................... 11
REAGENTI .............................................................................................................................................. 11
PRECAUZIONI........................................................................................................................................ 12
MAGAZZINAGGIO ............................................................................................................................. ..... 12
PREPARAZIONE .................................................................................................................................... 12
COLLEZIONE E PREPARAZIONE DEI SIERI ....................................................................................... 12
MATERIALI ............................................................................................................................................. 12
ATTUAZIONE DEL TEST ....................................................................................................................... 13
RILEVAMENTO DEI RISULTATI............................................................................................................ 13
LIMITI DEL TEST.................................................................................................................................... 13
CONTROLLO QUALITÀ ......................................................................................................................... 13
POSSIBILI ERRORI................................................................................................................................ 13
INTERPRETAZIONE ............................................................................................................................. . 14
VALORI ASPETTATI ............................................................................................................................. . 14
STUDI EFFETTUATI .............................................................................................................................. 14
18
REFERENCES / LITERATURE / BIBLIOGRAFIA ................................................................................ 15
SYMBOLS USED W ITH HÖLZEL ASSAYS.................................................................................................... 16
2
1 INTENDED USE
For the qualitative screening of serum IgG antibodies to Toxocara using an Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay (ELISA) technique.
For In Vitro Diagnostic Use
2 SUMMARY
Toxocariasis is the infection caused by roundworm of the genus Toxocara (usually T. canis, rarely T. cati) and is
acquired by ingesting soil contaminated with embryonated eggs from an animal’s feces. These eggs become
embryonated after 2 to 5 weeks after being passed by the animal. Thus, human infection does not occur by
6
contact with fresh feces. In addition, infected humans cannot pass the infection to other humans.
The disease manifests itself as visceral larval migrans (VLM) and ocular larval migrans (OLM). Signs and
symptoms of VLM may vary from an asymptomatic state with mild eosinophilia to a severe and potentially fatal
disorder.Patients with OLM also vary widely in presentation, from acute lesions in the eye to asymptomatic
infections. Toxocara larva migrans is believed to be the second most common helminth infection in developed
1,2
countries.
There is no definitive method to diagnose Toxocara infections, thus true sensitivity and specificity of serologic
tests cannot be accurately determined. The diagnosis is further complicated by the fact that the antibody
response varies depending on worm burden and location. However, numerous studies have shown that
immunoassays using a purified excretory antigen from the larval stage, as in this ELISA, have shown
1-6
dramatically improved sensitivities and specificities when compared to assays using crude antigens.
3 PRINCIPLE OF PROCEDURE
The micro test wells are coated with an excretory/secretory antigen from the Toxocara larvae. During the first
incubation with the diluted patients’ sera, any antibodies which are reactive with the antigen will bind to the
coated wells. After washing to remove the rest of the sample, the Enzyme Conjugate is added. If antibodies
have been bound to the wells, the Enzyme Conjugate will then bind to these antibodies. After another series of
washes, a chromogen (tetramethylbenzidine or TMB) is added. If the Enzyme Conjugate is present, the
peroxidase will catalyze a reaction that consumes the peroxide and turns the chromogen from clear to blue.
Addition of the Stop Solution ends the reaction and turns the blue color to a bright yellow color. The reaction
may then be read visually or with an ELISA reader.
4
REAGENTS
Item
Description
Test Strips
Microwells containing Toxocara antigens – 96 test wells in a
test strip holder.
Enzyme Conjugate
One (1) bottle containing 11 ml of Protein A conjugated to
peroxidase.
Positive Control
One (1) vial containing 1 ml of diluted positive rabbit serum.
Negative Control
One (1) vial containing 1 ml of diluted negative human
serum.
Chromogen
One (1) bottle containing 11 ml of the chromogen
tetramethylbenzidine (TMB).
Wash Concentrate
(20X)
One (1) bottle containing 25 ml of concentrated buffer and
surfactant.
Dilution Buffer
Two (2) bottles containing 30 ml of buffered protein solution.
Stop Solution
One (1) bottle containing 11 ml of 0.73 M phosphoric acid.
Symbol
3
5 PRECAUTIONS
Do not use solutions if they precipitate or become cloudy.
Wash concentrate may show crystallization upon storage at 2 – 8 ºC. Crystallization will disappear after dilution
to working strength.
Do not use serum that may have supported microbial growth, or is cloudy due to high lipid content. Samples
high in lipids should be clarified before use.
Treat all sera as if capable of being infectious. Negative control has been tested and found negative for
Hepatitis B surface antigen and for the antibody to HIV by required test methods. This product should be used
under appropriate safety conditions that would be used for any potentially infectious agent.
Do not add azides to the samples or any of the reagents.
6 STORAGE CONDITIONS
Reagents, strips and bottled components:
Store between 2 – 8 ºC.
Squeeze bottle containing diluted wash buffer may be stored at room temperature.
7 PREPARATION
Wash Buffer
Remove cap and add contents of bottle to 475 ml of reagent grade water. Place diluted wash buffer into a
squeeze bottle with a narrow tip opening.
Note: Washings consist of filling to the top of each well, shaking out the contents and refilling.
Avoid generating bubbles in the wells during the washing steps.
8 COLLECTION AND PREPARATION OF SERUM
Serological specimens should be collected under aseptic conditions. Coagulate blood and remove serum.
Hemolysis is avoided through prompt separation of the serum from the clot.
Serum should be stored at 2 – 8 °C if it is to be analyzed within a few days.
Serum may be held for 3 to 6 months by storage at -20 °C or lower.
Lipemic and strongly hemolytic serum should be avoided.
Do not heat inactivate serum and avoid repeated freezing and thawing of samples
Test samples:
Make a 1:64 dilution of patients’ sera using the dilution buffer
(e.g. 5 µL sera and 315 µL dilution buffer).
9
9.1
PROCEDURE
Materials Provided
 Toxocara canis IgG ELISA Kit
9.2





9.3
Materials Required But Not Provided
Pipettes
Squeeze bottle for washing strips (narrow tip is recommended)
Reagent grade water and graduated cylinder
Tubes for sample dilution
Absorbent paper
Suggested Materials
 ELISA plate reader with a 450 nm and a 650 to 620 nm filter (optional if results are read visually)
4
9.4 Performance of Test
1. Break off number of wells needed (two for controls plus number of samples) and place in strip holder.
2.
Add 100 µL (or two drops) of the negative control to well #1,
100 µL of the positive control to well #2 and
100 µL of the diluted (1:64) test samples to the remaining wells.
Note: Negative and positive controls are supplied prediluted. Do not dilute further.
3.
Incubate at room temperature (15 to 25 °C) for 10 minutes.
4.
Shake out contents and wash 3 times with the diluted wash buffer.
5.
Add 2 drops of Enzyme Conjugate to each well.
6.
Incubate at room temperature for 5 minutes.
7.
Shake out contents and wash 3 times with wash buffer. Slap plates against paper toweling to remove
excess moisture.
8.
Add 2 drops of the Chromogen to every well.
9.
Incubate at room temperature for 5 minutes.
10. Add 2 drops of the Stop Solution and mix by tapping strip holder.
10 READING OF RESULTS
Visually:
Look at each well against a white background (e.g. paper towel) and record as clear or +, ++ or +++ reaction.
ELISA Reader:
Zero reader on air. Set for bichromatic readings at 450/650-620 nm.
11 TEST LIMITATIONS
Serologic results are an aid in diagnosis but cannot be used as the sole method of diagnosis.
12 QUALITY CONTROL
The use of controls allows validation of kit stability. The kit should not be used if any of the controls are out of
range.
Expected values for the controls are:
Negative - 0.0 to 0.3 OD units
Positive - 0.5 OD units and above
13 TROUBLESHOOTING
Negative control has excessive color after development.
Reason: inadequate washings.
Correction: wash more vigorously. Remove excessive liquid from the wells by tapping against an absorbent
towel. Do not allow test wells to dry out.
5
14 INTERPRETATION OF RESULTS
14.1 Interpretation of Results - ELISA Reader
Zero ELISA reader on air. Read all wells at 450/650-620 nm.
Positive - Absorbance reading equal to or greater than 0.3 OD units.
Negative - Absorbance reading less than 0.3 OD units.
A negative OD reading indicates that the patient has no detectable level of antibodies. This may be due to lack
of infection or poor immune response by the patient.
14.2 Interpretation of Results -Visual
Compare results to the controls.
A sample should be interpreted as positive if the degree of color development is significant and obvious.
15 EXPECTED RESULTS
The number of individuals showing positive results can vary significantly between populations and geographic
regions. If possible, each laboratory should establish an expected range for its patient population.
16 PERFORMANCE DATA
Study #1 – Canadian Reference Center
Compared HÖLZEL ELISA to another commercial ELISA. Found concordance of 84% (n=82).
Study #2 – Mayo Clinic
Reference Method
HÖLZEL
+
-
+
21
1
-
3
14
Sensitivity of 87.5% (21/24)
Specificity of 93.3% (14/15)
6
Nur zur Verwendung bei der In-vitro-Diagnostik.
1
REAGENZIEN
Item
Description
Eine Mikrotiterplatte
Eine Mikrotiterplatte (12 x 8 Abbrechkavitäten)
beschichtet mit Toxocara Antigen
Enzym-Konjugat
1 Fläschchen, 11 ml Protein A konjugiert an Peroxidase.
Positive Kontrolle
1 Fläschchen, 1 ml
verdünntes positives Kaninchenserum.
Negative Kontrolle
1 Fläschchen, 1 ml
verdünntes negatives Humanserum.
Chromogen
1 Fläschchen, 11 ml
Chromogen Tetramethylbenzidine (TMB).
Waschkonzentrat (20X)
Pufferkonzentrat und Netzmittel.
Verdünnungspuffer
Gepufferte Proteinlösung.
Stopplösung
0.73 M Phosphorsäurelösung
Symbol
2 VORSICHTSMAßNAHMEN
Verwenden Sie die Lösungen nicht, wenn sich ein Niederschlag oder eine Trübung gebildet hat.
Wenn das Waschkonzentrat bei 2 - 8 ºC gelagert wird, können sich Kristalle darin bilden. Beim Verdünnen auf die
Arbeitskonzentration lösen sich die Kristalle auf.
Serum, in dem möglicherweise Bakterien gewachsen sind oder das aufgrund eines hohen Lipidgehalts trüb
erscheint, darf nicht verwendet werden. Aus Proben mit hohem Lipidgehalt muss vor der Verwendung das Lipid
entfernt werden.
Behandeln Sie alle Seren als infektiöses Material. Die Standards wurden getestet und mit den erforderlichen
Testmethoden als negativ für Hepatitis-B-Oberflächenantigen und Antikörper gegen HIV befunden. Bei
Verwendung dieses Produkts müssen die im Fall von infektiösem Material erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen
eingehalten werden.
Fügen Sie den Proben oder den Reagenzien kein Azid zu.
3 LAGERBEDINGUNGEN
Reagenzien, Teststreifen und Komponenten in Flaschen: Zwischen 2 °C - 8 °C lagern.
Die Spritzflasche mit dem verdünnten Waschpuffer kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
4 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Waschpuffer:
Entfernen Sie den Deckel und geben Sie den Inhalt der Flasche in 475 ml deionisiertes Wasser. Füllen Sie den
verdünnten Waschpuffer in eine Spritzflasche mit enger Spitze.
Hinweis: Bei den einzelnen Waschschritten werden die Wells bis zum oberen Rand gefüllt, geleert und noch
einmal gefüllt.
Achten Sie darauf, dass sich beim Waschen keine Luftblasen in den W ells bilden.
7
5 PROBENGEWINNUNG
Lassen Sie Blut koagulieren und entnehmen Sie das Serum.
Proben können vor Testbeginn für 3 bis 5 Tage bei 2 °C bis 8 °C gelagert werden.
Für eine längere Aufbewahrung (3 bis 6 Monaten) sollten die Proben eingefroren bei ≤ –20°C gelagert werden.
Lipämische und stark hämolytische Proben sollen nicht verwendet werden.
Die Proben dürfen nicht hitzeinaktiviert werden. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen und wieder Einfrieren der
Proben.
Vorbereitung der Proben
Stellen Sie mit dem Verdünnungspuffer eine 1:64-Verdünnung der Patientenseren her:
z.B. 5 µL Serum + 315 µL Verdünnungspuffer (SPECM DIL)
6
6.1






TESTVERFAHREN
Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Materialien:
Pipetten
Spritzflasche mit enger Spitze
Destilliertes oder entionisiertes Wasser
Probenverdünnungsröhrchen
saugfähige Tücher
Mikrotiterplattenlesegerät mit Ablesung bei 450 nm und 650 - 620 nm
6.2 Testdurchführung
1. Brechen Sie die benötigte Anzahl Wells ab (zwei für die Kontrollen und eines für jede Probe) und setzen Sie
sie in den Streifenhalter.
2.
Geben Sie 100 µl negative Kontrolle in Well 1,
100 µl positive Kontrolle in Well 2 und
100 µl der verdünnten (1:64) Proben in die verbliebenen W ells.
Negative und positive Kontrollen werden vorverdünnt geliefert. NICHT weiter verdünnen.
3.
Bei Raumtemperatur(15 °C bis 25 ºC) 10 Minuten lang inkubieren.
4.
Den Inhalt herausschütteln. 3-mal mit verdünntem Waschpuffer waschen.
5.
2 Tropfen Enzym-Konjugat zu jedem Well hinzufügen.
6.
Bei Raumtemperatur(15 °C bis 25 °C) 5 Minuten lang inkubieren.
7.
Den Inhalt herausschütteln. 3-mal mit verdünntem Waschpuffer waschen.
Klopfen Sie nach dem letzten Waschschritt die Wells auf einem sauberen, saugfähigen Tuch aus, um
überschüssigen W aschpuffer zu entfernen.
8.
2 Tropfen Chromogen zu jedem Well hinzufügen.
9.
Bei Raumtemperatur(15 °C bis 25 °C) 5 Minuten lang inkubieren.
10. 2 Tropfen Stopplösung zu jedem Well hinzufügen.
Den Inhalt der W ells vorsichtig mischen, indem Sie etwa 15 Sekunden lang mit dem Zeigefinger an die
Seite des Streifenhalters klopfen.
8
7 ABLESEN DER ERGEBNISSE
Visuell:
Betrachten Sie jedes Well vor einem weißen Hintergrund und notieren Sie, ob die Farbe klar ist bzw. eine
Reaktion der Stärke +, ++ oder +++ vorliegt.
ELISA Reader:
Stellen Sie den Nullpunkt des ELISA-Readers mit Luft auf Null.
Messen Sie die Absorption in den W ells bei 450 nm mit einem Referenzfilter bei 650 - 620 nm
8 GRENZEN DES TESTVERFAHRENS
Serologische Resultate sollen die Diagnose unterstützen, dürfen aber nicht als alleinige Methode zur
Diagnosestellung eingesetzt werden.
9 QUALITÄTSKONTROLLE
Die Verwendung von Kontrollen ermöglicht eine Überprüfung der Stabilität des Kits. Der Kit sollte nicht
verwendet werden, wenn eine der Kontrollen außerhalb des entsprechenden Bereichs liegt.
Die für die Kontrollen erwarteten W erte sind:
Negativ:
0.0 bis 0.3 OD-Einheiten.
Positiv:
0.5 OD-Einheiten und darüber.
10 FEHLERBEHEBUNG
Die negative Kontrolle zeigt nach dem Entwickeln eine starke Farbreaktion.
Ursache:
ungenügendes W aschen.
Abhilfemaßnahme:
Intensiveres Waschen, Entfernen überschüssiger Flüssigkeit aus den W ells durch
Ausklopfen auf einem saugfähigen Tuch. Lassen Sie die Wells nicht austrocknen.
11 INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Interpretation der Ergebnisse:- ELISA Readers
Stellen Sie den Nullpunkt des ELISA-Readers mit Luft auf Null, messen Sie die Absorption in den W ells bei
450/650 - 620 nm
Positiv:
Die Absorption ist höher als Oder gleichen Sie zu 0.3 OD-Einheiten.
Negativ:
Die Absorption ist geringer als 0.3 OD-Einheiten.
Ein negativer OD-Wert zeigt an, dass bei dem Patienten kein Antikörper nachgewiesen werden kann. Dies kann
auf das Nichtvorhandensein einer Infektion oder auf eine schwache Immunreaktion beim Patienten
zurückzuführen sein.
Interpretation der Ergebnisse: Visuell
Vergleichen Sie die Kontrollen. Eine Probe sollte als positiv interpretiert werden, wenn eine Farbentwicklung
deutlich erkennbar ist.
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12 ERWARTETE ERGEBNISSE
Die Anzahl der Personen, für die ein positives Ergebnis ermittelt wird, kann zwischen einzelnen Populationen
bzw. geografischen Regionen stark variieren. W enn möglich, sollte jedes Labor einen Bereich erwarteter W erte
für seine Patientenpopulation ermitteln.
13 LEISTUNGSKENNZEICHEN
Studie #1 – Canadian Reference Center
Vergleich des HÖLZEL ELISA mit einem anderen gewerblichen ELISA. Gefundene Übereinstimmung von 84 %
(n=82)
Studie #2 – Mayo Clinic
Referenzmethode
HÖLZEL
+
-
+
21
1
-
3
14
Empfindlichkeit: 87.5% (21/24)
Spezifität: 93.3% (14/15)
10
1 APPLICABILITÀ
Per lo screening qualitativo di anticorpi IgG nel siero diretti contro Toxocara mediante l’uso di enzimi ancorati su
un substrato immunologico in fase solida (ELISA).
Soltanto per l’uso diagnostico in vitro.
2 RIASSUNTO
Toxocariasi é ina infezione causata da ascaridi del genere Toxocara (normalmente T. canis, raramente T. cati)
che si contrae dall’ingestione di uova fecondate presenti in feci animali. Queste uova sviluppano embrioni 2-5
settimane dopo aver lasciato l’animale. Una infezione non occorre pertanto dal contatto con feci freschi. Inoltre
l’infezione non passa dall’uomo all’uomo (6).
La malattia si manifesta sia come stato di larvi migrans viscerali (VLM) sia come stato di larvi migrans oculari
(OLM). I sintomi di VLM possono variare da stati asintomatici con una leggera eosinofilia a una condizione
grave e potenzialmente fatale. Anche pazienti con OLM possono variare molto nella severità dei sintomi; da
asintomatici fino al presentare acute lesioni dell’occhio. Le larve migranti di Toxocara sono al secondo posto
delle infezione di elminti in paesi sviluppati (1,2).
Non esiste alcun metodo definitivo e univoco per la diagnosi di una infezione di Toxocara. Pertanto la vera
specificità e sensitività di test sierologici non può essere determinata. La diagnosi e anche complicata dal fatto
che la risposta anticorporale immunologica dipende fortemente dal sito dell’infezione e dal numero di embrioni
assunti. Nonostante queste limitazioni, numerosi studi mostrano che test immunologici che usano un antigene
escreto purificato delle larve, come lo fa questo ELISA, portano ad una sensitività e specificità enormemente
incremenata comparati a test basati su un antigene non purificato (1-6).
3 PRINCIPIO DEL TEST
I micropozzetti sono ricoperti con l’antigene escreto dalle larve di Toxocara. Durante la prima incubazione con il
siero diluito di patienti, gli anticorpi reattivi con l’antigene rimaranno legati ai pozzetti. Dopo il lavaggio
necessario per rimuovere il restante siero, il coniugato enzimatico è aggiunto. Se si trovano anticorpi legati ai
pozzetti, il coniugato enzimatico si legherà a sua volta a questi anticorpi. Dopo una ulteriore serie di lavaggi, un
cromogeno (benzidine tetrametilico, TMB) è aggiunto. Se il coniugato enzimatico è presente, la perossidasi del
coniugato catalizzerà la reazione che consuma perossido d’idrogeno e il cromogeno vira dall’incolore al blu.
L’aggiunta della soluzione d’arresto termina la reazione enzimatica e il colore blu vira ad un giallo chiaro. La
reazione può essere letta otticamente o con uno spettrometro ELISA.
4
REAGENTI
Item
Description
Test Strips
micropozzetti contenenti antigeni contro Toxocara – 96 pozzetti in
un contenitore.
Enzyme Conjugate
Coniugato enzimatico: Un (1) flacone contenente 11 ml di una
proteina A coniugata alla perossidasi.
Positive Control
Siero di controllo positivo: Una (1) fiala contenente 1 ml di siero di
coniglio positivo.
Negative Control
Siero di controllo negativo: Una (1) fiala contenente 1 ml di siero
umano diluito.
Chromogen
Cromogeno: Un (1) flacone contenente 11 ml del cromogeno
TMB.
Wash Concentrate
(20X)
Soluzione di lavaggio concentrato (20X): Un (1) flacone
contenente 25 ml un concentrato di una soluzione tamponante e
tensioattiva.
Dilution Buffer
Tampone di diluizione: Due (2) flaconi contenenti 30 ml di una
soluzione proteica tamponata.
Stop Solution
Soluzione d’arresto: Un (1) flacone contenente 11 ml di una
soluzione 0,73 M di acido fosforico.
Symbol
11
5 PRECAUZIONI
Non utilizzare le soluzioni se queste sono torbide o precipitate. Il concentrato di lavaggio può presentare
cristalizzazzioni se mantenuto a temperature tra 2 °C – 8 °C. I cristalli si dissolveranno se diluito alla
concentrazione di lavoro.
Non utilizzare sieri contaminati microbiologicamente o che presentano torbidità per un elevato contenuto
lipidico. Campioni iperlipidici devono essere chiariti prima dell’uso.
Trattare ogni siero come possibilmente infettato. Controlli negativi sono stati analizzati e trovati negativi per
l’antigene dell’epatite B e per l’anticorpo a HIV. Questo prodotto dovrebbe comunque essere trattato con le
opportune precauzioni come ogni potenziale materiale infettivo.
Non aggiungere acidi o uno dei reagenti ai campioni di siero.
6 MAGAZZINAGGIO
Reagenti, pozzetti e flaconi:
mantenere a 2 °C – 8 °C.
La soluzione di lavaggio diluita può essere mantenuta a temperatura ambiente.
7 PREPARAZIONE
Soluzione di lavaggio
Aprire il tappo e aggiungere il contenuto del flacone a 475 ml di acqua pura. Versare la soluzione così diluita in
una bottiglia a spruzzo con una stretta apertura.
NOTA: il lavaggio si attua riempendo ogni pozzetto con la soluzione. Poi si vuota capovolgendo i pozzetti per
riempirli nuovamente.
8 COLLEZIONE E PREPARAZIONE DEI SIERI
Coagulare il sangue e rimuovere il siero.
I campioni dovrebbero essere magazzinati ben chiusi fino a 3-5 giorni a 2 °C a 8 °C.
Campioni magazzinati per un periodo più lungo (3-6 mesi) dovrebbero essere congelati a ≤ 20°C.
Non riscaldare campioni inattivati ed evitare di congelare e scongelare ripetutamente i campioni.
Campioni:
Diluire i sieri dei pazienti con un rapporto 1:64 usando il tampone di diluizione
(p.es. 5 µL siero e 315 µL tampone).
9
MATERIALI
9.1 Materiali e strumenti richiesti ma non contenuti nel kit
Micropipette
Bottiglia a spruzzo per i lavaggi
Acqua pura da analisi e cilindro calibrato
Tubetti per la diluizione dei campioni
Carta assorbente
Fotometro ELISA calibrato per microtiter-piastre con un filtro per 450 nm e uno da 650 a 620 nm (non
necessario se i risultati sono determinati otticamente)
12
10 ATTUAZIONE DEL TEST
1. Staccare il numero di pozzetti richiesti (due per I controlli piu’ il numero dei campioni) e posizionare
nell’aposito supporto.
2.
Aggiungere 100 µL (o due gocce) del controllo negativo al pozzetto #1,
100 µL del controllo positivo al pozzetto #2 e
100 µL dei campioni diluiti (1:64) ai rimanenti pozzetti.
NOTA: controlli positivi e negativi sono gia’ diluiti. Non diluire ulteriormente.
3.
Lasciar incubare a temperatura ambiente (15-25°C) per 10 minuti.
4.
Vuotare i pozzetti capovolgendoli con una leggera scossa e lavare tre volte con il tampone di lavaggio.
5.
Aggiungere due gocce del coniugato enzimatico in ogni pozzetto.
6.
Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
7.
Vuotare i pozzetti e lavare tre volte con il tampone di lavaggio. Rimuovere le gocce d’acqua rimanenti
rivoltando il supporto sulla carta assorbente con una leggera scossa.
8.
Aggiungere due gocce del cromogeno ad ogni pozzetto.
9.
Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
10. Aggiungere due gocce della soluzione d’arresto a agitare bene
11 RILEVAMENTO DEI RISULTATI
 con il fotometro
 ottica
12 LIMITI DEL TEST
Risultati sierologici sono un aiuto per la diagnosi ma non possono mai costituire l’unico metodo per la diagnosi
differenziale.
13 CONTROLLO QUALITÀ
L’utilizzo di controlli permette di controllare la stabilità del kit. Il kit non deve essere utilizzato se uno di questi
parametri sono fuori dall’intervallo di confidenza.
Valori aspettati per i controlli sono:
negativo:
0.0 a 0.3 unità di densità ottica
positivo:
0.5 unità e più
14 POSSIBILI ERRORI
I controlli negativi hanno un colore troppo intenso.
Causa: lavaggi insufficienti
Rimedio: lavare con più cura. Rimuovere le gocce d’acqua rimanenti rivoltando il supporto sulla carta
assorbente con una leggera scossa. Non far seccare i pozzetti.
13
15 INTERPRETAZIONE
15.1 Interpretazione dei risultati con il fotometro ELISA
Calibrare il fotometro contro l’aria. Misurare i pozzetti a 450/650 a 620 nm.
Positivo - Assorbanze maggiori di 0.3 unità di densità ottica (DO)
Negativo - Assorbanze minori di 0.3 unità di densità ottica (DO)
Un valore negativo indica che il paziente non ha valori rilevabili di anticorpi. Questo può essere dovuto o ad una
mancata infezione o a una risposta immunologica insufficiente.
15.2 Interpretazione ottica dei risultati
Confrontare i risultati con i controlli. Un campione è da considerare positivo se lo sviluppo del colore è
obiettivamente significante.
16 VALORI ASPETTATI
Il numero degli individui con risultati positivi può variare significatamente tra popolazioni diversi e regioni
geografiche diversi. Possibilmente ogni laboratorio dovrebbe costruire il proprio intervallo di valori aspettati per
la propria popolazione di pazienti.
17 STUDI EFFETTUATI
Studio #1 – Canadian Reference Center
Il centro ha comparato il HÖLZEL ELISA con un altro ELISA test commerciabile e ha trovato una concordanza
del 84% (n = 82).
Studio #2 – Mayo Clinic
Reference Method
HÖLZEL
+
-
+
21
1
-
3
14
Specificita’ del 87.5% (21/24)
Sensitivita’ del 93.3% (14/15)
14
18 REFERENCES / LITERATURE / BIBLIOGRAFIA
1. Glickman, L., P. Schantz, and R. Grieve. “Toxocariasis”. Immunodiagnosis of Parasitic Diseases. Vol.1,
Helminthic Diseases. Ed. Walls and Schantz. Academic Press, 1986. pp. 201-231.
2. Schantz, P. “Toxocara Larva Migrans Now.” Am J Trop Med Hyg. Vol. 41 (Sup 3), 1989, pp. 21-34.
3. Jacquier, P. et. al. “Immunodiagnosis of Toxocarosis in Humans: Evaluation of a New Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay Kit.” J Clin Micro. Vol. 29 #9, Sept. 1991, pp. 1831-1835.
4. Carlier, Y. et. al. “The Use of an Excretory-Secretory Antigen for an ELISA Specific Serodiagnosis of
Visceral Larva Migrans.” Biomedicine. Vol. 36, 1982, pp. 39-42.
5. Brunello, F., P. Falagiani, and C. Genchi. “Enzyme Immunoassay (ELISA) for the Detection of Specific IgG
Antibodies to Toxocara canis ES Antigens.” Boll. Ist. sieroter. Milan. Vol. 65 #1, 1986, pp. 54-60.
6. Josephson, S.L., “Toxocariasis”, Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases – Principles and Practices,
Vol. 1, 1988, pp. 993-997.
15
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Toxocara canis IgG ELISA

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