sapereperfare

sapereperfareorticoltura
Estratti vegetali
per il controllo biologico
dei batteri dannosi su pomodoro
La possibilità di controllare le malattie batteriche
a carico del pomodoro mediante estratti vegetali è
di particolare interesse considerando la mancanza
di valide alternative ai composti rameici e la
mancanza commerciale di cultivar resistenti.
Giorgio M Balestra e Alessio Quattrucci, del Dip.
Protezione delle Piante, dell'Università della
Tuscia, hanno verificato l’efficacia degli estratti
ottenuti da Allium sativum e Ficus carica nel
controllo delle principali batteriosi del pomodoro.
I primi risultati sembrano incoraggianti sebbene
ulteriori studi siano in corso, in serra e in pieno
campo, per valutare gli effetti di queste sostanze
sulla crescita e sullo sviluppo quali-quantitativo
delle piante.
di Giorgio M. Balestra e
Alessio Quattrucci
Dipartimento di Protezione
delle Piante,
Università degli Studi
della Tuscia (VT)
[email protected]
Introduzione
I batteri fitopatogeni del pomodoro rappresentano un
serio problema sia per le coltivazioni in serra che per quelle in pieno campo; tra quelli
in grado di causare danni su
organi vegetali quali radici,
rametti, foglie, boccioli, fiori
e frutti. Tra questi si ricordano
Pseudomonas syringae pv.
tomato (Okabe) Young et al.,
agente causale della macchiettatura batterica (Figura
1), Xanthomonas vesicatoria
(ex Doidge) Dye, agente causale della maculatura batterica, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
(Smith) Davis et al., agente
causale del cancro batterico,
Pseudomonas corrugata (ex
Scarlett et al.) Roberts e Scarlett, agente causale della nenumero 121 maggio/giugno 2010
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crosi batterica del midollo
(Gardner e Kendrick, 1921;
Ciccarone et al., 1950) e Ralstonia solanacearum, agente
causale dell’avvizzimento batterico (Allen et al., 2005).
Attualmente, in Italia, la difesa biologica nei confronti
dei patogeni di natura batterica si basa esclusivamente
sull’utilizzo di prodotti rameici associati ad opportune
pratiche agronomico-colturali al fine di limitare i rischi
di insorgenza di malattie (Balestra et al., 1999; Varvaro et
al. 2001; Balestra, 2003). I
composti a base di rame
rappresentano, però, un problema a causa della loro fitotossicità e ai danni ambientali causati da un loro
accumulo nei terreni; pertanto, viste anche le restri-
zioni comunitarie di un loro
impiego in agricoltura biologica (Reg. UE n° 473/2002),
la possibilità di trovare valide
alternative nel controllo dei
batteri fitopatogeni sembra
quanto mai attuale ed importante soprattutto in agricoltura biologica.
Negli ultimi anni, la ricerca
scientifica si è indirizzata
verso la sperimentazione di
metodi di lotta alternativi a
quelli chimici, come l’individuazione di antagonisti naturali e di sostanze naturali che
possiedano attività antimicrobica (Varvaro et al., 2002).
Lo scopo di questo lavoro è
stato quello di valutare l’efficacia degli estratti di Allium
sativum e Ficus carica nel
controllo di P. s. pv. tomato,
X. vesicatoria e C. m. subsp.
michiganensis. Gli estratti ottenuti dai bulbi di A. sativum
hanno proprietà antimicrobiche note fin dall’antichità; la
loro attività è dovuta all’azione di inibizione enzimatica da parte di alcune
sostanze sulfuree, ed in particolare l’allicina risulta essere la sostanza con la
maggiore attività antimicrobica (Cavallito e Bailey,
1944; Obagwu e Korsten,
2003); i frutti di F. carica, invece, presentano un elevato
contenuto di polifenoli e flavonoidi con attività antibatterica (Ogungbamila et al.,
1997; Salameh et al., 2004).
Materiali e Metodi
I bulbi di A. sativum e i frutti
di F. carica, dopo esser stati
raccolti in impianti biologici,
venivano essiccati in stufa
per 48-72 ore ad una temperatura di 50°C; una volta
essiccati venivano triturati in
acqua utilizzando un twister
blender (Hamilton Beach,
16-speed-Twister blender) e
successivamente centrifugati
ad 8.000 g per 45 minuti in
modo da rimuovere le particelle grossolane. Il surnatante veniva prelevato e sterilizzato utilizzando un filtro
Nalgene (Ø 0.42 µm) (Fischer
Scientific). Gli estratti così ottenuti venivano utilizzati ad
una concentrazione finale di
10 g/l per quanto riguarda A.
sativum, e di 300 g/l per
quanto riguarda F. carica.
L’attività antibatterica veniva
inizialmente testata in vitro,
tramite il saggio degli spot,
su ceppi batterici ad elevata
virulenza appartenenti alla
collezione del Dipartimento
di Protezione delle Piante
dell’Università della Tuscia di
Viterbo; venivano impiegati
gli isolati Pseudomonas syringae pv. tomato 14 (Pst14),
Xanthomonas vesicatoria 697
(Xv697) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 21 (Cmm21). Venivano
preparate delle sospensioni
batteriche aventi una concentrazione di 108 e 106
ufc/ml; da queste venivano
prelevate aliquote di 100 µl
che erano distribuite uniformemente con una ansa di
vetro sterile su piastre Petri
contenenti ANS ed in cui,
successivamente, venivano
posti gli estratti (4 gocce da
30 µl ciascuna/piastra). Le
piastre così inseminate venivano poste ad incubare in
termostato a 25 ± 2 °C per
48-72 ore e gli eventuali aloni
di inibizione formatisi venivano osservati e misurati con
l’ausilio di uno stereoscopio
e di una apposita scala graduata (Klement et al., 1990).
Sulla base dei risultati ottenuti in vitro venivano allestite
prove sperimentali in serra
per valutare l’efficacia degli
estratti naturali nel controllo
delle batteriosi oggetto di indagine.
Venivano utilizzate piantine
di pomodoro, cv. Pullrex Bio,
di un mese poste in serra
con temperatura a 25 ± 2 °C
di giorno e 15 ± 2 °C di notte
ed umidità del 70-80%.
Gli estratti venivano utilizzati
alle stesse concentrazioni
impiegate per le prove in vitro mentre le sospensioni
batteriche avevano una concentrazione di 105 ufc/ml;
queste ultime venivano distribuite sulle piante di pomodoro con un vaporizzatore manuale fino ad ottenere
una completa ed uniforme
bagnatura delle pagine fogliari. Nelle due ore precedenti e nelle due successive
alla contaminazione, l'umidità relativa veniva portata al
90% per favorire l’apertura
stomatica e quindi la penetrazione delle cellule batteriche all’interno degli organi
vegetali.
I trattamenti fogliari con le
sostanze naturali venivano
effettuati, in via preventiva,
24 ore prima dell’inoculazione
con il patogeno; il controllo
negativo, veniva verificato
impiegando un agrofarmaco
a base di sali di rame (ossicloruro, 26%).
Dal primo giorno di inoculazione le piante sono state
monitorate giornalmente per
tutta la durata della prova al
fine di verificare e seguire la
comparsa e l’evoluzione dei
sintomi (Incidenza e Gravità
della malattia).
I dati ottenuti venivano analizzati statisticamente per ottenere l’indice di confidenza;
utilizzando il software GraphPad Prism 4 veniva effettuata l'analisi della varianza
(ANOVA), mentre la significatività dei risultati veniva determinata usando il Tukey’s
HSD test (P ! 0.05) (Kinkel
et al., 1996).
Risultati
Nel saggio degli spot sia A.
sativum che F. carica evidenziavano un’attività antimicrobica nei confronti dei tre
ceppi fitopatogeni testati (Tabella 1).
L’estratto ottenuto dai bulbi
di A. sativum ha mostrato attività antibatterica nei confronti di Pst14, Xv697 e
Cmm21; in particolare sono
39
Figura 1 - Colonie batteriche
di Pseudomonas syringae pv.
tomato (Pst14) osservate allo
stereomicroscopio cresciute
in termostato per 48 ore su
terreno nutritivo agarizzato
ANS.
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cace rispetto a quello effettuato con l’estratto di frutti di
F. carica; in particolare, è risultato efficace nel contenimento di Pst14 riducendone,
sempre rispetto al controllo
non trattato, l’incidenza della
malattia (n° di fogliole malate/pianta) del 58% e la gravità della malattia (n° di
necrosi/cm2 fogliole) del
68% (Tabella 2) (Figura 3). Altrettanto interessanti sono risultate le riduzioni della
gravità della malattia registrate nei confronti di Cmm21
(65%) e di Xv697 (56%).
Conclusioni
Figura 2 - Aloni d’inibizione
dello sviluppo di Clavibacter
michiganensis subsp.
michiganensis (Cmm21) (1x106
ufc/ml) ottenuti mediante
l’utilizzo dell’estratto di Allium
sativum (1%)
stati osservati aloni d'inibizione del diametro di 14 ±
1.2, 16 ± 1.3 e 23 ± 1.1 mm,
rispettivamente, utilizzando
una concentrazione dell’inoculo pari a 106 ufc/ml (Figura
2). L’estratto ottenuto dai
frutti di F. carica ha mostrato
una migliore inibizione verso
i tre batteri patogeni rispetto
a quello di A. sativum, risultando efficace in entrambe le
concentrazioni batteriche utilizzate (106 e 108 ufc/ml).
I risultati ottenuti nelle prove
in vitro sono stati confermati
nelle prove effettuate in serra
su piante di pomodoro inoculate con i tre batteri fitopatogeni (Tabella 2).
Rispetto al controllo non trattato, il trattamento effettuato
con l’estratto di bulbi di A.
sativum è risultato più effi-
La possibilità di controllare
le malattie batteriche a carico
del pomodoro in biologico
ed in ambiente protetto mediante estratti vegetali, appare di particolare interesse
considerando anche la mancanza di valide alternative ai
composti rameici e la mancanza commerciale di cultivar
resistenti.
Gli estratti vegetali testati nel
nostro studio si sono rivelati
efficaci per un loro eventuale
utilizzo nel controllo biologico
di P. s. pv. tomato, X. vesicatoria e C. m. subsp. michiganensis, riducendo con successo l’incidenza e la gravità
Tabella 1
Valori degli aloni di inibizione ottenuti, in vitro, mediante l’utilizzo degli estratti di Allium sativum e Ficus
carica sulla crescita dei batteri fitopatogeni selezionati
Estratti
vegetali
Diametro di inibizione (mm)1
P. s. pv. tomato 14
X. vesicatoria 697
C. m. subsp. michiganensis 21
106 ufc/ml
108 ufc/ml
106 ufc/ml
108 ufc/ml
106 ufc/ml
108 ufc/ml
A. sativum
14 ± 1.2 b
13 ± 1.3 b
16 ± 1.3 b
—
23 ± 1.1 a
—
F. carica
21 ± 1.8 a
15 ± 1.3 b
19 ± 1.7 a
13 ± 1.7 b
20 ± 1.5 a
16 ± 1.2 b
1
I valori mostrati sono la media di tre repliche. I valori all’interno delle righe seguiti da lettere diverse risultano
significativamente differenti (P ! 0.05; Tukey’s HSD test). — = Nessuna inibizione.
numero 121 maggio/giugno 2010
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Tabella 2
Efficacia dei trattamenti fogliari, in vivo, con estratti di Allium sativum e Ficus carica
nel contenimento dell’incidenza e della gravità della malattia su piante di pomodoro
Trattamenti
P. s. pv. tomato 14
X. vesicatoria 697
IM1
GM1
IM1
GM1
IM1
GM1
A. sativum
16 a
0.033 a
22 b
0.088 a
20 b
0.178 b
F. carica
31 b
0.079 a
28 b
0.126 b
28 b
0.343 c
Controllo
non trattato
38 c
0.102 b
40 c
0.200 b
37 c
0.514 d
Ossicloruro
di rame
8a
0.007 a
15 a
0.041 a
14 a
0.060 a
1
C. m. subsp. michiganensis 21
I valori mostrati sono la media di tre repliche. I valori all’interno delle colonne seguiti da lettere diverse risultano
significativamente differenti (P • 0.05; Tukey’s HSD test). IM = Incidenza della Malattia; GM= Gravità della Malattia.
della malattia. L’estratto di
bulbi di A. sativum è risultato
maggiormente efficace rispetto a quello di F. carica;
la sua migliore azione è stata
esplicata nei confronti di
Pst14 facendo registrare le
riduzioni dell’incidenza e della
gravità della batteriosi maggiori.
Entrambe le sostanze naturali, comunque, sono risultate
efficaci contro Pst, XV e
Cmm suggerendo un loro
potenziale utilizzo come alternativa ai composti rameici
o in combinazione ad essi.
Non sono stati registrati effetti fitotossici sulle piante
ed, inoltre, gli estratti risultano poco costosi, facilmente reperibili e non hanno effetti negativi per la salute
umana.
È interessante notare come
entrambi gli estratti sono risultati efficaci nei confronti
di due batteri Gram - (Pst,
Xv) e nei confronti di un batterio Gram + (Cmm), ed al
tempo stesso nei confronti
di patogeni che causano batteriosi parenchimatiche (Pst,
Xv) e vascolari (Cmm) su pomodoro.
L’ampio spettro di efficacia
degli estratti vegetali testati
in questa ricerca evidenzia
nuove opportunità di controllo
biologico nei confronti di diverse malattie batteriche su
pomodoro in grado, spesso,
di causare perdite nelle differenti fasi fenologiche della
pianta.
Altri studi sono in corso, in
serra e in pieno campo, per
valutare gli effetti di queste
sostanze sulla crescita delle
piante e sullo sviluppo qualiquantitativo dei frutti.
Figura 3 - Sintomi di P. s. pv.
tomato (Pst14) dopo 14 gg.
dalla contaminazione
artificiale (105 ufc/m) su
Ringraziamenti
piante di pomodoro: non
Gli Autori desiderano ringraziare per il supporto finanziario il Ministero delle Politiche Agricole, Agroalimentari
e Forestali (MiPAAF) (N°
893/2006).
sottoposte ad alcun
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trattamento fitosanitario (A),
e dopo trattamento con
Allium sativum (1%) (B), Ficus
carica (30 %) (C), ed
Ossicloruro di rame (26%) (D)