giulianini p.g., mettulio r., lorenzon s., ferrero e.a., edomi

Biol. Mar. Medit. (2003), 10 (2): 367-373
P.G. Giulianini, R. Mettulio, S. Lorenzon, E.A. Ferrero, P. Edomi
BRAIN - Centro per le Neuroscienze, Dipartimento di Biologia, Università di Trieste,
Via L. Giorgieri, 9 - 34127 Trieste, Italia.
GLI ORMONI CHH (IPERGLICEMIZZANTI DEI CROSTACEI) E GIH
(GONADO-INIBITORIO) NEL CICLO RIPRODUTTIVO DEI DECAPODI:
UN APPROCCIO MOLECOLARE
THE CHH (CRUSTACEAN HYPERGLYCAEMIC HORMONES) AND GIH
(GONAD INHIBITING HORMONE) HORMONES IN THE DECAPOD REPRODUCTIVE CYCLE: A MOLECULAR APPROACH
Abstract
In order to study the complex role of the neuropeptides crustacean hyperglycaemic hormone (cHH) and
gonad inhibiting hormone (GIH) hormones in physiology of the crustaceans, we adopted a molecular approach.
We cloned the cHH and GIH cDNAs of the Norway lobster Nephrops norvegicus and produced in bacteria the
relative recombinant protein. With specific polyclonal antibodies immunocytochemical studies were carried out
in N. norvegicus and in other crustaceans. Mutagenesis of conserved amino acids impaired the hyperglycaemic
activity of recombinant cHH.
Key-words: marine crustaceans, hormone, reproduction, cloning, molecular biology.
Introduzione
L’importanza delle strutture neuroendocrine, situate all’interno dei peduncoli oculari
dei crostacei, sullo sviluppo delle gonadi è stata rilevata per la prima volta da Panouse
nel lontano 1946 in Palaemon serratus. Negli ultimi anni l’approccio biochimico è
stato affiancato da metodologie molecolari che hanno portato al clonaggio dei cDNA
dei geni espressi nel principale sistema neuroendocrino presente nel peduncolo oculare:
il complesso organo X - ghiandola del seno. La letteratura recente ha messo in evidenza
il ruolo degli ormoni iperglicemizzanti (cHH) e gonado-inibitorio (GIH) sul ciclo riproduttivo biennale dell’astice Homarus americanus: l’isoforma cHH-B ha effetto gonadotropico contrapposto al GIH (de Kleijn et al., 1998; de Kleijn e van Herp, 1998). Gli
ormoni cHH sono inoltre implicati nelle reazioni allo stress dei decapodi (Lorenzon et
al., 1997; Chang et al., 1998; Stentiford et al., 2001). Questi neurormoni sono costituiti
da un peptide segnale, un peptide precursore (nel caso del cHH) e dal peptide maturo di
circa 8 KDa. Gli ormoni appartenenti alla famiglia cHH/MIH/GIH presentano un’omologia di sequenza del 70-90%; in particolare, tutti gli ormoni possiedono, a livello del
peptide maturo, 6 cisteine in posizioni conservate (Lacombe et al., 1999). Le differenze
di sequenza tra i singoli neuropeptidi riflettono una diversa funzione biologica; quelle
maggiori si riscontrano tra cHH e GIH che hanno un ruolo antagonista nella maturazione delle gonadi. La nostra ricerca si è focalizzata su Nephrops norvegicus, specie di
notevole interesse economico. E’ stata descritta l’ultrastruttura funzionale della ghiandola del seno (Giulianini et al., 1998), sono stati clonati i cDNA parziale del cHH-A
(Giulianini et al., 2002) e completo del GIH (Edomi et al., 2002) e sono stati prodotti
anticorpi specifici a partire dalle rispettive proteine ricombinanti. Le proteine ricombinanti e i loro anticorpi hanno il vantaggio di essere prodotti in grande quantità e di
essere funzionali e cross-reattivi con i corrispettivi neuropeptidi di altri taxa di crosta-
368
P.G. Giuliani, R. Mettulio, S. Lorenzon, E.A. Ferrero, P. Edomi
cei. Essi, dunque, permettono lo studio dell’espressione e della funzionalità di questi
importanti modulatori della riproduzione, della crescita e delle reazioni agli stressogeni
ambientali anche in altre specie.
Materiali e metodi
Mediante tecniche di retrotrascrizione e reazione di amplificazione a catena della
polimerasi (RT-PCR) e amplificazione rapida dell’estremità di cDNA (RACE) sono
stati clonati i cDNA degli ormoni iperglicemizzante, NencHH, e inibitore delle gonadi,
NenGIH, dello scampo N. norvegicus (Fig. 1). Mediante FASTA (Embl) sono state
calcolate le percentuali di omologia aminoacidica con neurormoni della stessa famiglia
di altre specie. Le percentuali più elevate si riscontrano con i peptidi della specie filogeneticamente più vicina, H. americanus. Le porzioni degli ormoni relative al peptide
maturo sono state espresse in batteri fuse alla proteina glutatione S transferasi (GST);
queste proteine ricombinanti sono state utilizzate per la produzione di antisieri policlonali di coniglio che sono stati purificati mediante cromatografia di affinità (Fig. 1).
Gli anticorpi policlonali ottenuti sono stati utilizzati per analizzare l’espressione dei
neurormoni cHH e GIH in N. norvegicus con tecniche immunoistochimiche (Edomi
et al., 2002; Giulianini et al., 2002). L’anticorpo anti-GIH mostra una localizzazione
più dispersa nell’organo di accumulo, la ghiandola del seno (GS) (Edomi et al., 2002).
L’anticorpo anti-cHH invece evidenzia una distribuzione massiva dell’ormone cHH a
livello della GS ed individua i neuroni che lo sintetizzano nell’organo X (OX, Fig. 2)
(Giulianini et al., 2002). Per valutare il riconoscimento di peptidi cHH anche in altre
specie di decapodi, l’anticorpo è stato saggiato su Astacus leptodactylus, Munida
rugosa, Palaemon elegans e lo stomatopode Squilla mantis, individuando in tutti casi
una reattività specifica e senza rumore di fondo (Giulianini et al., 2002).
Fig. 1 – Metodologia di produzione e purificazione degli anticorpi anti-NencHH e anti-NenGIH a
partire dal tessuto neuroendocrino peduncolare di Nephrops norvegicus.
Method of production and purification of anti-NencHH and anti-NenGIH antibodies from the neuroendocrine eyestalk tissue of Nephrops norvegicus.
Gli ormoni cHH e GIH nel ciclo riproduttivo dei crostacei decapodi
369
Fig. 2 – a) Sezione longitudinale di peduncolo oculare di Nephrops norvegicus. Barra di calibrazione = 500 µm, ematossilina-eosina. Sono presenti i gangli visivi (lamina ganglionaris,
LG; medulla externa, ME; medulla intermedia, MI; medulla terminalis, MT) e il complesso
neuroendocrino organo X (OX) – ghiandola del seno (GS). b) Ingrandimento dell’organo X
(indicato incorniciato in a) in cui sono evidenziati, con colorazione immunoperossidasica, i
neuroni reattivi all’anticorpo anti-NencHH. Barra di calibrazione = 100 µm.
a) Longitudinal section of the eyestalk of Nephrops norvegicus. Calibration bar = 500 µm, haematoxylin-eosin. The eye ganglia (lamina ganglionaris, LG; medulla externa, ME; medulla intermedia,
MI; medulla terminalis, MT) and the X organ (OX) – sinus gland (GS) complex are present. b)
Higher magnification of X organ (boxed in a) showing perikarya positive to anti-NencHH antibody
by means of immuno-peroxidase staining. Calibration bar = 100 µm.
Per identificare altri neurormoni della famiglia cHH/MIH/GIH abbiamo costruito una
genoteca di cDNA a partire dai gangli del peduncolo oculare. Il vaglio di 500.000 cloni
della genoteca con il cDNA parziale del cHH ha portato all’isolamento di due cloni
positivi: uno (di 1489 bp) codifica per il preproormone cHH-A e l’altro (di 1874 bp)
codifica per il preprormone cHH-B di N. norvegicus. Si sta inoltre procedendo ad
esperimenti di mutagenesi del NencHH, cioè di sostituzione di residui aminoacidi in
posizioni ritenute chiave per la funzionalità dell’ormone. I mutanti puntiformi ottenuti
vengono espressi in batteri e la proteina ricombinante saggiata in vivo su esemplari
di Palaemon elegans (ad una concentrazione finale nell’emolinfa di 10-8M) precedentemente epeduncolati per eliminare la sorgente endogena di cHH. Gli animali sono
stati mantenuti durante la fase sperimentale in vaschette da 20 L con acqua di mare
sintetica al 36‰ di salinità, 16 °C di temperatura e fotoperiodo naturale. Il prelievo
di emolinfa è stato eseguito dal seno pericardico con una siringa da 1 mL. 50 µL di
emolinfa sono stati prelevati a 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 24 h dopo l’iniezione del neuropeptide ricombinante. Per ogni gruppo sperimentale sono stati utilizzati 10 animali
ependucolati. La misura della glicemia è stata eseguita con il reflettometro OneTouch®
II Meter (Lifescan) e kit di test strips commerciali. Nei risultati, le variazioni di glicemia sono espresse come media di: (valore sperimentale rilevato/valore rilevato nello
P.G. Giuliani, R. Mettulio, S. Lorenzon, E.A. Ferrero, P. Edomi
370
stesso animale al tempo 0 h) –1. In seguito tali valori sono definiti come incrementi (o
decrementi se al di sotto del valore 0).
Risultati
Saggi in vivo
La proteina ricombinante GST-NencHH è stata utilizzata per saggiare in vivo la sua
attività iperglicemica. A seguito dell’iniezione dell’ormone in animali epeduncolati si
sono misurati i valori della glicemia. La specie P. elegans è stata scelta come modello
animale. In particolare, in questa specie l’anticorpo anti-NencHH è in grado di immunoprecipitare un fattore iperglicemico presente negli estratti dei peduncoli oculari che
una volta iniettati in vivo non sono più in grado di provocare un innalzamento della
glicemia a dimostrazione della specificità dell’anticorpo e della somiglianza di almeno
alcuni epitopi dei cHH delle due specie (Giulianini et al., 2002).
Mutagenesi
E’ nota la notevole importanza che i ponti disolfuro hanno nella struttura e, quindi,
nella funzione dei polipeptidi. La famiglia di neuropeptidi cHH/MIH/GIH è caratterizzata da 6 cisteine altamente conservate (Lacombe et al., 1999). Si è proceduto alla
generazione di forme mutanti dell’ormone cHH: tramite mutagenesi per PCR sono state
P. G. Giulianini,
Mettulio,
S. eLorenzon,
A. Ferrero,
P.altrettante
Edomi
sostituite
le cisteine inR.
posizione
26 e 43
l’asparagina E.
in posizione
28 con
serine nonché l’aspartico in posizione 12 con una asparagina, e gli ormoni mutanti sono
stati ottenuti per via ricombinante fusi a GST. Nella Fig. 3 vengono messe a confronto
Fig.
3 (sopra)
e Fig. 4 (sotto)
le
sequenze
aminoacidiche
del NencHH selvatico e quelle dei mutanti (rcHHasp12,
rcHHcys3, rcHHasn28, rcHHcys5) saggiati in vivo.
NencHH
asp12
asn28
cys3
cys5
1
10
20
30
40
50
60
70
QVFDQACKGVYDRNLFKKLDRVCEDCYNLYRKPFVATTCRENCYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
QVFDQACKGVYNRNLFKKLDRVCEDCYNLYRKPFVATTCRENCYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
QVFDQACKGVYDRNLFKKLDRVCEDCYSLYRKPFVATTCRENCYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
QVFDQACKGVYDRNLFKKLDRVCEDSYNLYRKPFVATTCRENCYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
QVFDQACKGVYDRNLFKKLDRVCEDCYNLYRKPFVATTCRENSYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
Fig. 3 – Sequenze aminoacidiche dei neurormoni ricombinanti saggiati in vivo. Nella prima riga è
indicata la sequenza dell’ormone selvatico cHH di Nephrops norvegicus; di seguito le sostituzioni dell’acido aspartico (posizione 12), asparagina (28), della terza (26) e della quinta
cisteina (43).
Amino acid sequences of recombinant neuro-hormones assayed in vivo. In the first line the sequence
of wild cHH of Nephrops norvegicus is shown, below are indicated the substitution of aspartic acid
(position 12), asparagine (position 28), and of third (26) and fifth (43) cysteine.
nencHH
ento di glicemia
1,2
L’effetto fisiologico, visualizzato
come andamento temporale della glicemia emolinasp12
fatica in P. elegans, dopo iniezione dell’ormone ricombinante selvatico e delle 4cys3
forme
mutanti rispetto alla soluzione
salina
di
controllo
è
mostrato
in
Fig.
4.
L’aumento
di
asn28
1,0
glicemia massimo si riscontra dopo 2 h dall’iniezione della proteina di fusione selvatica
cys5
NencHH, mentre i 4 ormoni mutati presentano un’attività iperglicemizzante significatiPBS
vamente minore rispetto al NencHH
selvatico (p < 0.01) ma maggiore (a 1 h e 2 h) della
0,8
salina di controllo. In particolare, l’rcHHasp12 mostra l’effetto iperglicemico maggiore e (a 1 h, 2 h e 4 h) significativamente differente da quello della salina di controllo
(p < 0.05).
0,6
0,4
0,2
cys3
cys5
QVFDQACKGVYDRNLFKKLDRVCEDSYNLYRKPFVATTCRENCYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
QVFDQACKGVYDRNLFKKLDRVCEDCYNLYRKPFVATTCRENSYSNRVFRQCLDDLLLIDVIDEYVSSVQMVGK
Gli ormoni cHH e GIH nel ciclo riproduttivo dei crostacei decapodi
371
nencHH
asp12
cys3
asn28
cys5
PBS
1,2
1,0
Incremento di glicemia
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
0
2
4
20
22
24
Tempo (h)
Fig. 4 – Risposta glicemica, nelle 24 h, in Palaemon elegans epeduncolati iniettati con l’ormone
selvatico, i tre ormoni mutati come illustrato in Fig. 3 e la soluzione salina sterile (PBS) di
controllo. I valori sono espressi come media ± deviazione standard, n = 10.
Time course of blood glucose in eyestalk-ablated Palaemon elegans injected with the wild type
hormone, the 3 mutant hormones showed in Fig. 3 and the sterile saline buffer (PBS) as control.
Values are expressed as means ± standard deviation, n = 10.
Conclusioni
Gli esperimenti iniziali di Panouse (1946) dimostrarono che l’ablazione dei peduncolari oculari poteva innescare in Palaemon serratus una crescita dell’ovario nelle
femmine calcolato come indice gonado somatico (rispetto al cubo della lunghezza
dell’animale). Inoltre lo stesso autore aveva già individuato, mediante esperimenti
di espianto-reimpianto, la ghiandola del seno come sito di accumulo e rilascio del
fattore di inibizione della vitellogenesi. Lavori più recenti hanno messo in luce che
l’espianto della ghiandola del seno rimuove l’ormone di inibizione delle gonadi (GIH)
così come l’ormone inibitorio della muta (MIH) e gli ormoni iperglicemizzanti dei
crostacei (cHH) che sembrano avere, almeno nei decapodi, un ruolo nell’innesco della
vitellogenesi (Tensen et al., 1989; de Kleijn et al., 1998; de Kleijn e van Herp, 1998).
Gli strumenti molecolari odierni permettono di produrre grandi quantità di ormoni
ricombinanti ed i corrispettivi anticorpi. Tali sonde potranno essere usate in futuro per
modulare finemente la condizione riproduttiva di stock di riproduttori in impianti di
acquacoltura, come già avviene per i pesci. Il nostro approccio ha permesso di clonare
i geni per i cHH ed il GIH di N. norvegicus, di produrre le relative proteine ricombinanti ed i relativi anticorpi che sono stati saggiati su altre specie di decapodi e su uno
stomatopode (Edomi et al., 2002; Giulianini et al., 2002). Si è, inoltre, proceduto ad
372
P.G. Giuliani, R. Mettulio, S. Lorenzon, E.A. Ferrero, P. Edomi
esperimenti di mutagenesi del cHH, cioè di sostituzioni di residui aminoacidi in posizioni ritenute chiave per la funzionalità dell’ormone, che è stato poi saggiato in vivo
per il suo effetto iperglicemizzante sul gamberetto P. elegans. La proteina di fusione
GST-NencHH è in grado di provocare un innalzamento della glicemia analogamente
all’azione di estratti peduncolari omologhi contenenti la forma endogena dell’ormone.
Invece i mutanti puntiformi dei residui di cisteina non causano alcun effetto iperglicemico. La formazione di ponti disulfuro intracatenari al neuropeptide risulta quindi
fondamentale per il mantenimento della configurazione tridimensionale e della funzionalità del cHH.
Tutti gli altri mutanti hanno evidenziato un effetto iperglicemico ridotto e, comunque, sempre considerevolmente minore rispetto all’aumento della glicemia tipicamente
indotto dal cHH ricombinante selvatico. La continuazione con esperimenti di mutagenesi casuale sul NencHH e sul NenGIH potrebbe consentire di produrre ormoni
ricombinanti che abbiano un’efficienza maggiore o una funzione diversa, propria di
altri neuropeptidi della famiglia cHH/MIH/GIH, rispetto alle forme presenti in natura.
Questi ormoni, in combinazione con il blocco della funzionalità di altri fattori mediante
anticorpi, potrebbero essere utilizzati in prove di manipolazione ormonale di riproduttori.
Summary
The crustacean hyperglycaemic hormone (cHH) and the gonad-inhibiting hormone (GIH) belong to a neuropeptide family synthesized and released in a neurohaemal complex of crustacean eyestalks. In order to study
the complex role of these hormones in physiology, gonad maturation, reproduction, and molting, we adopted
a molecular approach. With a combination of RT-PCR and RACE techniques we cloned the cHH and GIH
cDNAs of the Norway lobster Nephrops norvegicus. The deduced open reading frames code for polypeptides
showing an high percent of identity (94-96%) with the other known cHH and GIH of Homarus americanus.
For each neuropeptide a specific polyclonal antibody was raised against a portion of the mature peptide region
obtained through expression in E. coli fused to GST (glutathione-S-transferase). To validate the specificity to
N. norvegicus cHH and GIH, and the cross-reactivity with other species of the affinity-purified antibody, we
performed standard immunocytochemistry of the eyestalk on sections of the decapod species N. norvegicus,
Munida rugosa, Astacus leptodactylus and of the stomatopod Squilla mantis. These immunocytochemical studies locate GIH in superficial axon terminals of the releasing organ, the sinus gland, whereas the cHH shows
a heavy distribution; the anti-cHH labels precisely the synthesizing X organ. Then recombinant proteins were
used to perform biological assays in the animal model Palaemon elegans. The wild-type form of cHH has an
hyperglycaemic activity comparable to that of eyestalk extracts. Mutant forms of cHH, produced by substitution
of highly conserved amino acids (e.g. cysteins), were not able to induce hyperglycaemia in vivo. Therefore,
the cDNA cloning and the subsequent production of recombinant proteins and the relative antibodies provide
molecular tools to analyze and manipulate the function of neuropeptides in Crustaceans.
Ringraziamenti
Si ringraziano la Dott.ssa Nicoletta Pandolfelli e la Dott.ssa Elisabetta Azzoni per il valido contributo
critico ed il Sig. Claudio Gamboz (Centro Servizi Polivalenti di Ateneo – Università di Trieste) per l’utile
assistenza tecnica.
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Gli studi del presente lavoro sono stati finanziati con fondi MURST 40% “Sistemi lagunari dell’alto Adriatico:
genetica, dinamica di popolazione e vulnerabilità eco-tossicologica” e MIPA IVPT U.O.C186 to E.A.F. and VPT
U.O. C134 to Shoreline S.c.a.r.l.