44° Congresso Nazionale della Società Italiana di

Transcript

44° Congresso Nazionale SIBioC - Riassunti Poster
44° Congresso Nazionale della Società Italiana di
Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica (SIBioC)
Roma, 5-7 novembre 2012
Riassunti Poster
Codice Poster
Argomento
•
P001-P037
Biologia molecolare clinica
•
P043-P091
Tecnologia, strumentazione e valutazione metodi
•
•
•
•
•
•
•
•
P038-P042
P092-P109
P110-P127
P128-P133
P134-P143
P144-P150
P151, P155, P161-P163
P166, P169
Controllo di qualità, standardizzazione, tracciabilità
Patologia cardiovascolare
Varie
Allergia
Patologie renali
Patologie genetiche
Endocrinologia
P152-P154, P156-P160
Patologia oncologica
•
P170-P184
Ematologia
•
P191-P205
Farmacologia e tossicologia
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
P164-P165, P167-P168
P185-P190
P206-P211
P212-P219
P220-P230
P231-P242
P243-P250
P251
P252
P253, P263
P254, P256, P260, P262
P264, P267
Coagulazione
Malattie infettive
Patologie autoimmuni
Gravidanza, neonatologia e pediatria
Diabete e sindrome metabolica
Analisi decentrate
Sport e nutrizione
Patologie osteoarticolari
Patologie epatiche
Gestione del laboratorio, automazione e applicazioni informatiche
P255, P257, P258, P261
Patologie neurologiche
P259
Farmacogenetica
P265, P266
Nota dell’Editore:
i riassunti sono stati riprodotti senza alcuna revisione dal materiale direttamente fornito dagli autori.
biochimica clinica, 2012, vol. 36, n. 6
471
P001
A SPECIFIC IMMUNOPHENOTYPE AND
AN INCREASED ADIPOGENIC POTENTIAL
CHARACTERIZED HUMAN AMNIOTIC
MESENCHYMAL STEM CELLS (HA-MSCS)
ISOLATED FROM OBESE PREGNANT WOMEN AT
DELIVERY
1
1
2
C. Nardelli , L. Iaffaldano , M. Raia , M. Ferrigno, E.
2
3
4
1
Mariotti , F. Quaglia , G. Labruna , V. Capobianco , A.
3
1
1
Capone, G.M. Maruotti , L. Pastore , R. Di Noto , P.
3
1
Martinelli , L. Sacchetti, L. Del Vecchio
1
CEINGE-Biotecnologie Avanzate S.C.a R.L., Naples,
Italy and Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie
Mediche, Università degli Studi di Napoli Federico II,
Italy
2
CEINGE-Biotecnologie Avanzate S.C.a R.L., Naples,
Italy
3
Dipartimento di Scienze Ostetrico-Ginecologiche
Urologiche e Medicina della Riproduzione, Università
degli Studi di Napoli Federico II, Italy
4
Fondazione IRCCS SDN–Istituto di Ricerca Diagnostica
e Nucleare, Naples, Italy
Maternal obesity is associated to an increased fetal risk
of obesity and other metabolic diseases. Human amniotic
mesenchymal stem cells (hA-MSC) have not yet been
characterized in obese women. The aim of this study was
to isolate and compare the immunophenotypes of hAMSCs from obese (Ob-) and normal weight control (Co-)
women to identify alterations that could predispose the
fetus to obesity. We enrolled 16 Ob- and 7 Co-women
at delivery (mean/SEM before pregnancy BMI: 40.3/1.8
2
2
kg/m and 22.4/1 kg/m , respectively). Human A-MSCs
were phenotyped by flow cytometry, several maternal and
newborn clinical and biochemical parameters were also
measured. Induction of adipogenesis revealed a higher
adipogenic potential of Ob-hA-MSCs compared with CohA-MSCs as witnessed by significantly higher PPARγ and
aP2 mRNA levels (P=0.02 and P=0.03, respectively) at
post-induction day 14. We found 1/38 tested membrane
antigens was higher expressed on the Ob-hA-MSC than
on the Co-hA-MSC. Further, we observed that IFNγ
upregulated specific membrane antigen expression in
cultured Co-hA-MSCs so overlapping the Ob-hA-MSCs
immunophenotype and increased the adipogenic potential
of these cells. We also found leptin/adiponectin ratio
higher in sera of Ob- than in Co-pregnant women at
delivery. In conclusion, our observation suggests that in
utero inflammatory conditions in obese pregnancy could
drive increased expression of membrane antigens on the
surface of hA-MSCs thereby enhancing their adipogenic
potential of these cells. Further, we confirm the concept
that serum leptin and adiponectin are obesity risk markers
that could be used also during pregnancy to evaluate the
fetus risk obesity.
Grant: MIUR-PRIN 2008.
472
P002
ABERRANT F8 GENE INTRON 1 INVERSION WITH
CONCOMITANT DUPLICATION AND DELETION
IN A SEVERE HEMOPHILIA A PATIENT FROM
SOUTHERN ITALY
1
1
1
2
V. Sanna , C. Ceglia , M. Tarsitano , B. Lombardo , A.
3
2
2
3
Coppola , L. Pastore , G. Castaldo , G. Di Minno
1
CEINGE Biotecnologie Avanzate, Naples, Italy
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università
degli Studi di Napoli "Federico II", Naples, Italy
3
Centro di Coordinamento Regionale Emocoagulopatie,
Dip. di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli
Studi di Napoli "Federico II", Naples, Italy
2
Background: In severe haemophilia A, the most frequent
mutations are the intron 1 and intron 22 inversions,
responsible for about half of the affected patients. These
genetic alterations result from the intrachromosomal
recombination between intronic regions (int1h and int22h)
and their homologous extragenic copies in telomeric
position (1). Aberrant patterns for F8 gene intron 1
inversion (inv1) have been described in a few cases so far.
Here, we characterized the molecular defect in a severe
haemophiliac and his relatives.
Results: The patient exhibited two bands of int1h-1 region
(1908- and 1323-bp), corresponding to the wild type and
inverted configurations, with no bands of int1h-2 fragment.
The amplification of all F8 gene coding sequences,
promoter, 5’ and 3' regions was present with no other
causative mutations. The multiplex ligation-dependent
probe amplification (MLPA) analysis highlighted a large
duplication comprising exons 2-6 of the F8 gene,
confirmed further by comparative genomic hybridization
(CGH) and quantitative-PCR (qPCR) with a concomitant
extragenic deletion towards the telomer. His mother and
sister showed a pattern compatible with the carrier status.
Conclusions: These results show a complex sequence
rearrangement related to the inv1 previously not
described, due to a large duplication affecting the F8
gene with an additional extragenic deletion in telomeric
position, confirming the high mutational heterogeneity of
haemophilia A.
(1) Castaldo G, D’Argenio V, Nardiello P, et al.
Haemophilia A: molecular insights. Clin Chem Lab Med
2007;45:450-61.
P003
ALTERATIONS OF THE LDL RECEPTOR GENE IN
FAMILIAL COMBINED HYPERLIPIDEMIA
1
1
P004
ANALISI DELLA PREDISPOSIZIONE GENETICA
ALLA CELIACHIA IN PAZIENTI CON INFERTILITA’
IDIOPATICA E IN PAZIENTI FERTILI.
2
A. D'Angelo , M.N. D'Agostino , M.D. Di Taranto , A.
1
3
3
3
Ruotolo , G. Marotta , M. Gentile , P. Rubba , G.
1
Fortunato
1
CEINGE S.C.a r.l. Biotecnologie Avanzate, Napoli,
Italy; and Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche,
Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italy
2
Fondazione IRCCS SDN, Napoli, Italy
3
Dip. di Medicina Clinica e Sperimentale, Università
degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italy
Introduction: The Familial Combined Hyperlipidemia
(FCH) is associated with the increase of total
cholesterol, triglycerides or both. Its molecular causes
have not yet completely clarified although a polygenic
and multifactorial basis is considered. Familial
Hypercholesterolemia (FH) is a disease characterised
by increased plasma concentrations of total and LDL
cholesterol, showing a clinical picture overlapping with
that of FCH, in some instances. FH is primarily caused
by mutations in the LDL-receptor gene (LDLR). We aim
to identify LDLR mutations in patients with a clinical
diagnosis of FCH.
Materials and methods: We enrolled 183 patients from
Southern Italy with a clinical diagnosis of FCH. After
genomic DNA extraction from peripheral blood samples,
the promoter and 18 exons of the LDLR gene were
amplified by PCR and directly sequenced. The ROC
curves were constructed with ApoB, LDL cholesterol
and non-HDL cholesterol values using as discriminate
value the presence or absence of LDLR mutations, with
MedCalc software. The threshold value was determined
by the point farthest from the bisector of the ROC curve.
Results: We screened the promoter and 18 exons of
the LDLR gene. Direct sequencing analysis revealed
mutations in the LDLR gene in 18/183 unrelated FCH
patients (mutation rate 9.83%). We observed 14 different
mutations. Among the 14 different mutations we found
12 mutations missense and 2 splicing alterations.Through
the ROC curve analysis we identified the threshold values
of LDL cholesterol equal to 178 mg/dL (83.3% sensitivity
and 51.8% specificity), of ApoB equal to 151 mg/dL
(61.1% sensitivity and 73.8% specificity ) and of nonHDL cholesterol equal to 265 mg/dL (50% sensitivity and
80.6% specificity) that could be useful to identify FCH
patients that have to be screened for LDLR mutations.
Conclusions: The screening protocol based on the direct
sequencing analysis in the LDLR gene allowed to identify
9.83% of FCH patients with mutation in LDLR gene.The
cut-off value of 178 mg/dL for LDL cholesterol is useful
to select FCH patients with an high probability of bearing
LDLR mutations.
S. Egiziano, C. Laporta, V. Mavaracchio, F. Donà, L.
Tognetto, L. Bartoloni
ULSS12 Veneziana, Dipartimento di Patologia Clinica,
Venezia
Per valutare il ruolo della predisposizione genetica alla
celiachia nell'infertilità idiopatica sono stati analizzati
38 pazienti che si sono rivolti al nostro centro per
gli esami propedeutici alla fecondazione assistita e 38
controlli sani, ovvero persone che hanno concepito
naturalmente e nei quali è stata esclusa la presenza della
malattia celiaca conclamata mediante un questionario
telefonico. La tipizzazione HLA degli alleli DQA1,
DQB1 e DRB1 è stata eseguita utilizzando kit INNOLiPA (Innogenetics) basati sul principio dell’ibridazione
inversa su striscia. La presenza degli eterodimeri DQ2
e DQ8 è associata ad un aumento del rischio di
celiachia circa 50 volte superiore rispetto alla popolazione
generale. E’ noto che la celiachia, sia conclamata che
silente, può indurre problemi riproduttivi sia maschili (ad
es. azoospermia ed astenozoospermia) che femminili
(difficoltà di concepimento e aborti spontanei) (AV Stazi
et al, 2005). In ciascun gruppo metà dei pazienti è di
sesso femminile e metà di sesso maschile. La percentuale
di pazienti infertili risultati predisposti geneticamente alla
malattia celiaca è del 39,5%, di cui il 40% di sesso
femminile e il 60% di sesso maschile. Di questi, nell’80%
è stata riscontrata la presenza dell’eterodimero DQ2, nel
13,3% la presenza della sola catena beta del dimero
DQ2 e nel 6,7% la presenza dell’eterodimero DQ8. Nella
popolazione dei controlli sani il 36,8% risulta essere
predisposto, con il 43% di femmine e il 57% di maschi.
Di questi, nel 57,1% è stata riscontrata la presenza
dell’eterodimero DQ2, nel 14,3% la presenza della sola
catena beta del dimero DQ2 e nel 28,6% la presenza
dell’eterodimero DQ8. Tra i pazienti con infertilità
idiopatica sono presenti 11 coppie predisposte e di queste
7 sono composte da un componente predisposto, mentre
4 da entrambi i componenti predisposti. Nei controlli sani
invece, sono presenti 13 coppie predisposte e di queste
12 sono composte da un componente predisposto e una
soltanto da entrambi i componenti predisposti. Dai risultati
ottenuti sembra non esserci correlazione tra infertilità
idiopatica e la sola predisposizione genetica alla celiachia,
anche se si osserva una significativa differenza tra la
presenza dell’eterodimero DQ2 nella popolazione infertile
rispetto alla sana.
473
P009
CORRELAZIONE TRA CLUSTERINA E PROFILO
LIPIDICO IN UNA POPOLAZIONE SARDA
1
1
1
1
A. Baralla , S. Pasella , E. Sotgiu , S. Pinna , A.
1
1
2
1
1
Marchisio , L. Murgia , M. Deiana , P. Mele , L. Deiana
1
Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica,
Dipartimento Scienze Biomediche, Facoltà di Medicina e
Chirurgia, Università degli Studi di Sassari
2
"Ass. Isola dei Centenari", Sassari
La clusterina (CLU) è una glicoproteina con una
distribuzione pressoché ubiquitaria che risulta implicata
in una serie di processi fisiologici e in diverse condizioni
patologiche come il diabete, malattie neurodegenerative,
malattie cardiovascolari e neoplasie. La clusterina è un
eterodimero di 70-80 kDa formata da due catene α e ß
legate da ponti disolfuro in cui i carboidrati contribuiscono
per il 30% della sua massa molecolare. La clusterina
è presente nel plasma sia in forma libera circolante,
sia legata a una subclasse delle HDL. Le HDL come
noto svolgono un ruolo chiave nel metabolismo del
colesterolo plasmatico e nell’insorgenza di numerose
patologie dismetaboliche. In questo lavoro abbiamo voluto
valutare una possibile relazione tra le concentrazioni
nel plasma della clusterina circolante e il profilo lipidico
di un gruppo di 65 individui di età compresa tra i
20 e i 100 anni reclutati mediante il progetto AKeA
che studia la longevità in Sardegna. Le concentrazioni
di clusterina sono state ottenute utilizzando un kit
commerciale ELISA Adipogen di tipo competitivo mentre
i parametri lipidici sono stati ricavati dalle cartelle cliniche
connesse al campione in esame (colesterolo totale,
colesterolo HDL, colesterolo LDL e trigliceridi). L’analisi
multivariata effettuata sul campione suddiviso per fasce
di età (20-50, 80-89, 90-99 e ≥100) ha individuato delle
variazioni significative tra i gruppi sia per quanto riguarda i
parametri clinici del profilo lipidico sia per quanto riguarda
la clusterina, mentre le analisi di associazione hanno
individuato una correlazione positiva della clusterina
con il colesterolo totale (Pearson r=0.336 p=0.01). Tali
risultati indicano come con l’avanzare dell’età ci siano dei
cambiamenti significativi nel profilo lipidico di un individuo.
Inoltre, la correlazione positiva individuata tra clusterina
e colesterolo totale conferma il coinvolgimento di tale
proteina nel metabolismo del colesterolo anche se ulteriori
studi saranno necessari per chiarirne l’effettivo ruolo.
Strickland DK, Ranganathan S. Diverse role of LDL
receptor-related protein in the clearance of proteases and
in signaling. J Thromb Haemost 2003;1:1663-70.
476
P010
DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS
COULD IMPROVE CLINICAL MANAGEMENT OF
PROSTATE CANCER PATIENTS
F. Vendittelli, G. Albino , S. Palumbo, C. Paolillo, C.
Zuppi, E. Capoluongo
Lab. di Biologia Molecolare Clinica, Ist. di Biochimica e
Biochimica Clinica, Università Cattolica del Sacro Cuore,
Roma
Background: The release of tumor cells through
the bloodstream (CTCs) is a peculiar sign of the
aggressiveness of primary tumor and of inefficiency
of therapy. Some reports show that levels of CTCs
correlated with prognosis in patients with advanced
breast, prostate and colorectal cancers suggesting its
use in the clinical management of patients. Up to
date, extensive efforts have been directed toward the
development of methods for detecting circulating prostate
tumor cells as early indicator of disease progression. The
current investigation describes preliminary molecular data
regarding occurrence of CTCs and their use in clinical
management and pharmacological treatment of prostate
cancer (PCa) patients.
Methods: An immunomagnetic method of CTC
enrichment (AdnaTest Prostate Cancer Select) was used
on 5 ml starting blood sample and followed by a multiplex
PCR (AdnaTest Prostate Cancer Detect) for detection of
prostate- and/or cancer-specific markers such as PSA,
PSMA and EGFR. Sixteen PCa patients, subdivided in
High (I) and Low Risk (II) groups according to D’Amico
classification and five negative patient controls (III group),
were tested.
Results: All patients of II group defined by PCa
with disease properly controlled by therapy, were
diagnosed as negative by AdnaTest. Whereas, within
the group I, AdnaTest effectively identified as positive
patients unresponsive to first- or second-line therapy
and as negative patients, although unresponsive to
hormone therapy, were responsive to first- or secondline chemotherapy. Briefly, blood samples of three PCa
patients belonging to group I, resulted positive for at
least one tumor-associated marker (PSA) and 2 out of
3 showed signal for PSMA mRNA. We underline that a
patient (Group I), negative for AdnaTest during the firstline of chemotherapy, after few months, became positive
for PSA marker.
Conclusion: Multiplex PCR developed by Adnagen,
represents a useful alternative method for the detection
of prostate CTCs. Detection of three markers could
potentially be used as a prognostic indicator of aggressive
prostate cancer. Therefore, the presence of CTCs
reported in prostate cancer patients provides novel
opportunities for monitoring the efficacy/resistance to
targeted therapy.
P011
DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS
ON THE BASIS OF CYTOMORPHOLOGY,
IMMUNOFLUORESCENCE AND IN SITU
HYBRIDIZATION WITH THE AID OF A ROBOTIZED
MICROSCOPE: FROM BENCH TO BED SIDE
1
1
1
P012
EX VIVO EFFECT OF VARESPLADIB ON
SECRETORY PHOSPHOLIPASE ALVEOLAR
ACTIVITY IN INFANTS WITH ARDS
L. Gentile, A. Minucci , D. De Luca, M. Piastra, F.
Vendittelli, B. Giardina, G. Conti, E. Capoluongo
2
S. Gabba , T. Dorji , V. Grazioli , A. Albini
1
Lab. Biologia Molecolare, Centro Diagnostico Italiano,
Milano
2
IRCCS Multimedica, Milano
Introduction: Cancer continues to be a leading cause of
death among the industrialized countries and metastases
are the most important factor causing the adverse
prognosis of carcinoma patients. Cancer cells can detach
and disseminate in the blood stream from the primary
tumor during tumor progression and the detection of
rare circulating tumor cells (CTCs) in patients is useful
to monitor the progression and assess response to
treatment. CTCs have been detected in a majority of
epithelial cancers, including those from breast, prostate,
lung and colon both before the primary tumor is detected
and even when the carcinoma recurs. Currently, the
methods for detecting CTCs include cytometric and
nucleic acid based approaches. In our laboratory we use a
filtration-based technique to isolate CTCs preserving the
cellular shape and morphology and we develop an assay
that combines enumeration and genotyping of CTCs,
based on a combination of antibody detection, FISH and
automated fluorescence microscopy.
Material and methods: The assay comprises cell
enrichment, by filtration through an 8 μm pores membrane
and immunofluorescent staining for the detection of the
epithelial marker EpCAM (AUA1), cytokeratins 7 and
8 (CAM 5.2) and CD45 for the negative selection of
leukocytes. We also use a combination of FISH probes
for the detection of cancer-related genes. The images
acquisition is performed with the Ikoniskope robotic
microscopy, a fully automated image acquisition and
display system specific for rare cell identification.
Results and conclusions: We spiked into the blood
of a healthy donor a known number of cells of the
prostate carcinoma cell line LNCaP and processed the
samples through the filtration and detection protocol.
We were able to collect/detect the CTCs with high
sensitivity and specificity. Maintaining the integrity of the
tumor cells detected, our method allows further analysis
of cell morphology and genotype. The combination of
antibodies and FISH probes, and the possibility of the
morphological evaluation, has the potential to provide
valuable information and it is very promising for screening,
early detection of recurrence/relapse and evaluation of
treatment response.
Negin BP, Cohen SJ. Circulating tumor cells in colorectal
cancer: past, present and future challeges. Curr Treat
Options Oncol 2010;11:1-13.
Lab. di Biologia Molecolare Clinica, Istituto di Biochimica
e Biochimica Clinica, Osp. Gemelli, Roma
Background: Secretory phospholipases A2 constitute
a group of enzymes responsible for surfactant
phospholipids catabolism and release of inflammatory
mediators. A wide body of literature suggests that both
catabolic and proinflammatory action of sPLA2 enzymes
might affect lung function, causing acute respiratory
distress syndrome (ARDS). In fact, sPLA2 is responsible
for a vicious cycle characterized by surfactant loss,
which increases lung tissue inflammation, which leads
to type II pneumocyte apoptosis and to additional
surfactant dysfunction. Varespladib is a potent indolebased sPLA2 inhibitor that was optimized by structurebased drug design to inhibit some pulmonary isotypes
of this enzyme (especially sPLA2-IIA, sPLA2-V and
sPLA2X). The molecule acts as an anti-inflammatory
agent by disrupting the first step of the arachidonic acid
pathway of inflammation.
Methods: sPLA2 total activity was measured in
bronchoalveolar lavage (BAL) using a colorimetric method
(Assay Designs). BAL specimens were subdivided in 4
aliquots each with increasing varespladib concentration
(10#M, 40#M, 100#M) or an equal volume of 0.9% saline
solution (basal).
Results: An overall significant difference (p<0.0001)
was found among sPLA2 activity in basal conditions
[37.7 (31.8-48.5) IU/mL] and after addition of increasing
varespladib concentrations: 10 μM [34.1 (24.9-42.5) IU/
mL], 40 μM (28.4 (25.5-32.3) IU/mL] and 100 μM [7.7
(5.4-12.5) IU/mL].
Discussion: Varespladib is able to inhibit the enzymes
of the human secretory phospholipase groups IIa, V
and X activities. In fact, it inhibits ex vivo sPLA2
in BAL at 10, 40 and 100 μM, showing an inverse
correlation between enzyme activity and varespladib
concentrations. Conclusions: Varespladib significantly
inhibit sPLA2 providing efficacious enzyme and tissuespecific anti-inflammatory action at lung level, blocking
surfactant catabolism, increased lung compliance, and
reduce both inflammation of the tissues and the migration
of fibroblasts.
477
P013
FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA:
IDENTIFICATION OF A NEW MUTATION IN THE
PCSK9 GENE
1
1
P014
GENOTYPE-DEPENDENCY OF BUTYRATE
EFFICACY IN CONGENITAL CHLORIDE DIARRHEA:
A COMPARISON BETWEEN IN VIVO AND EX-VIVO
STUDY
2
A. Ruotolo , M.N. D'Agostino , M.D. Di Taranto , A.
1
3
3
3
D'Angelo , G. Marotta , M. Gentile , P. Rubba , G.
1
Fortunato
A. Elce , S. Giordano , M. Scorza , F. Amato , G.
2
3
1
Terrin , R. Berni Canani , R. Tomaiuolo
1
1
1
1
1
1
CEINGE S.C.a r.l. Biotecnologie Avanzate, Napoli,
Italy and Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche,
Università degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italy
2
Fondazione IRCCS SDN, Napoli, Italy
3
Dip. di Medicina Clinica e Sperimentale, Università
degli Studi di Napoli Federico II, Napoli, Italy
CEINGE-Biotecnologie Avanzate e Dip Biochimica e
Biotecnologie Mediche, Università di Napoli Federico II
2
Dip Ginecologia, Ostetricia e Medicina Perinatale,
Università di Roma La Sapienza
3
Dip di Pediatria e European Laboratory for the
Investigation of Food Induced Diseases, University of
Naples Federico II
Introduction: Familial hypercholesterolemia (FH),
characterized by high levels of total and LDLcholesterol and premature coronary heart disease (CHD),
is associated with mutations in three genes: LDL
receptor (LDLR), apolipoprotein B (APOB) and proprotein
convertase subtilisin/kexin9 (PCSK9). The most frequent
mutations were identified in the gene LDLR, whereas
mutations in the APOB and PCSK9 genes are rare and
therefore these genes are not included in the most used
screening procedures. Our aim is to identify mutations in
the PCSK9 gene in order to establish their frequency and
utility in genetic screening.
Materials and methods: We recruited 197 unrelated
patients from Southern Italy with a clinical diagnosis of
FH. Through PCR amplification and direct sequencing
we search for mutations in the exons and the
exon-intron regions of the LDLR and PCSK9 genes.
Conservation of substituted aminoacid across the
different species was assessed by BLAST alignment.
To predict whether a substitution affected protein
function we using 4 different algorithms, SIFT (http://
sift.jcvi.org), PMut (http://mmb.pcb.ub.es/), Mutation
Taster (http://www.mutationtaster.org) and Poly-Phen2
(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2).
Results: Among 197 patients with a clinical diagnosis
of FH, mutations in the LDLR gene result absent in 60
patients, in which we found only one variation in PCSK9
gene that represent 0.5% of total patients and 1.7% of
patients without mutations in LDLR gene. This is a new
genetic variant (c.1394C>T) that causes the aminoacid
substitution p.Ser465Leu. This variant was absent in
188 chromosomes from healthy subjects. The serine
at the position 465 was conserved in the 20 analyzed
species. In silico analysis revealed that the substitution is
“Not tolerated”, “Pathological”, “Probably damaging” and
“Disease causing” according to the algorithm SIFT, PMut,
Poly-Phen and Mutation Taster respectively. The patient
shows increased levels of total cholesterol (447mg/dL)
and of LDL- cholesterol (328mg/dL) even under therapy.
Conclusions: The new PCSK9 variant that we identified
contributes to FH phenotype. Our results suggest that the
screening of mutations in PCSK9 gene should be taken
into consideration for FH disease, although the frequency
of mutated patients is low.
Congenital chloride diarrhea (CLD) is an autosomal
recessive disorder characterized by life-long, severe
diarrhea with intestinal Cl- malabsorption resulting from
a reduced activity of the down regulated in adenoma
exchanger (DRA). Disease is determined by mutations
in the solute carrier family 26, member 3 (SLC26A3)
gene. Currently available therapies are not able to limit
the severity of diarrhea in these patients. Conflicting
results have been reported on the therapeutic efficacy
of oral butyrate, a short chain fatty acid acting as
histone deacetylase inhibitor. We investigated the effect
of butyrate (100 mg/kg/day) in seven CLD children with
different SLC26A3 genotypes. Molecular analysis was
performed in the laboratory of CEINGE-Biotecnologie
Avanzate. Nasal epithelial cells were obtained by brushing
of inferior turbinates in order to study the effect of the
different kind of mutations on DRA functionality and
to assess the effect of butyrate on the expression of
the two main Cl- transporters: DRA and Putative Anion
Transporter-1 (PAT-1). Cells were treated with 5 mM of
sodium butyrate for 24 hours. RNA was extracted and
retro-transcribed in cDNA for downstream applications.
Expression levels of either SLC26A3 and SLC26A6 from
treated and untreated cells were measured by semiquantitative real-time PCR on LightCycler 480 Real-Time
PCR System with Taqman chemistry. Levels of SLC26A3
and SLC26A6 expression before and after treatment were
compared in order to establish the changes determined
by butyrate exposure. Butyrate was able to significantly
improve the SLC26A3 (DRA) and SLC26A6 (PAT1) gene
expression in nasal epithelial cells in 5 out of 7 patients.
A variable clinical response to butyrate was observed
regarding the stool pattern and fecal ion losses. The best
clinical response was observed in subjects with SLC26A3
missense mutations that permit to the protein to reach cell
membrane, and in which butyrate induces the SLC26A3
overexpression. This study revealed that butyrate may
contribute to CLD therapy in a subset of patients and the
study of butyrate effect in nasal cells from CLD patients
may be helpful to predict the clinical response.
Grants from Regione Campania (DGRC 1901/09) are
gratefully acknowledged.
478
P015
HIGH RESOLUTION MELTING ANALYSIS (HRMA)
FOR RAPID GENOTYPING OF ANGIOTENSINCONVERTING ENZYME (ACE) INSERTION/
DELETION (I/D) POLYMORPHISM
P016
IDENTIFICATION OF A NOVEL VARIANT T4G IN THE
PROMOTER 4G/5G REGION OF THE PAI-1 GENE
G. Canu, A. Minucci, S. Palumbo, L. Gentile, C.
Zuppi, B. Giardina, E. Capoluongo
Dip Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università di
Napoli Federico II e CEINGE-Biotecnologie Avanzate
scarl
Laboratory of Clinical Molecular Diagnostics, Institute
of Biochemistry and Clinical Biochemistry, Catholic
University of Rome, Italy
Background: In the renin-angiotensin system, ACE is
a peptidyldipeptide hydrolase that plays a role in the
conversion of angiotensin I into the active octapeptide
angiotensin II as well as inactivates the vasodilator
bradykinin. In human, the levels of plasma and cellular
ACE are strongly determined genetically. Several studies
have shown that approximately 50% of the variability
of plasma ACE between individuals is the results of an
insertion/deletion (I/D) polymorphism in intron 16 of the
ACE gene. The I and D alleles differ for the presence
or absence of a 287 bp Alu sequence DNA fragment.
The ACE I/D polymorphism is generally analyzed by
conventional PCR technique. However, it usually involved
multiple steps and is time-consuming.
Methods: We report here the set-up of a single-tube
HRMA method for the detection of ACE gene I/D
polymorphism. This method takes advantage of the
presence of the 287 bp DNA fragment for the melting
curve analysis of PCR amplicons associated to three
genotypes (I/I, I/D, D/D). Primers’ design (three primers:
two external to 287 bp Alu sequence and one specific
for the insertion) considered the different efficiency of
amplification of the allele I than allele D.
Results: HRMA was found to be particularly suitable
for the identification of ACE gene I/D polymorphism: in
fact, 50 samples previously genotyped by conventional
PCR and sequencing were 100% concordant with the
HRMA results, showing high reproducibility, sensitivity
and specificity. Three genotypes were distinguished
by normalized/temperature shifted melting curves, and
fluorescence difference plots. In addition, each genotype
was associated with a single peak, and despite of Alu
sequence, no non-specific amplicons were found.
Discussion: The development of rapid genotyping
technique to assess the ACE I/D polymorphism presented
in this study can be important in clinical or research studies
and may become the method of choice for epidemiologic
studies concerning ACE gene I/D polymorphism.
Conclusion: This study confirms the great potential of
the HRMA as rapid, closed-tube mutation scanning and
it constitutes the first application of this technique to
highlight the presence of a DNA fragment insertion
characterizing three genotypes.
Sayed-Tabatabaei FA, Oostra BA, Isaacs A, et al. ACE
polymorphisms. Circ Res 2006;98:1123-33.
F. Amato, R. Liguori, R. Di Fiore, S. Quaranta
The plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is an
important regulator of the fibrinolytic pathway. The 4G/5G
polymorphism in the PAI-1 promoter is associated with
altered PAI-1 transcription. The presence of 4G instead
of 5G in the promoter region of the gene is associated
with a higher plasma levels of PAI-1 protein. Eriksson et
al. (1995) found that the prevalence of the 4G allele was
significantly higher in patients with myocardial infarction
before the age of 45. We have identified a new 4G/5G
allele, in which a T is present instead of a G, changing
the region formed by 5G in T plus 4G. This new variant
was identified in two women, one young woman with an
event of myocardial infarction, the other one in pregnancy.
Although both alleles (5G and 4G) bind a transcriptional
activator, the 5G allele also binds a repressor protein
to an overlapping binding site. In the absence of bound
repressor, the 4G allele is associated with an increased
basal level of PAI1 transcription. Using TFsearch to try
to establish the effect of this new variant on the pattern
of transcription factors, we found that the variant T4G
profoundly change the type and amount of probable
transcription factors respect to both the variant 4G and
5G. To test experimentally this new variant, we cloned
a promoter region of PAI-1 gene of 1.6 kb in a reporter
system. The first data obtained, although preliminary,
show an increased transcriptional activity of the construct
carrying the variant T4G respect to both the 4G and 5G. It
would be interesting to confirm these data also checking
the action of cytokines such as IL1, IL6 or TNF-A, known
to have a greater effect on the variant 4G compared to the
5G.
479
P021
L’ANALISI MOLECOLARE DI 21 PAZIENTI ITALIANI
CON SINDROME DI BARDET-BIEDL INDICA BBS1,
BBS2 E BBS10 QUALI PRINCIPALI GENI CAUSATIVI
1
1
1
M. D'Antonio , G. Sauchelli , A.A. Crispo , I.C.M.
1
2
2
1
Tandurella , F. Testa , F. Simonelli , G. Esposito , F.
1
Salvatore
1
CEINGE Biotecnologie Avanzate s.c.a r.l., Napoli e Dip.
di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università di
Napoli Federico II
2
Dip.di Oftalmologia, Seconda Università di Napoli
(SUN)
La sindrome di Bardet-Biedl (BBS) è una
ciliopatia con coinvolgimento multisistemico caratterizzata
dall'associazione tra retinite pigmentosa (>90% dei
casi), obesità, polidattilia, alterazioni renali, ipogonadismo
e deficit cognitivo. L'espressione clinica è variabile,
anche se molti pazienti manifestano quasi tutti i tratti
dall’infanzia e tendono ad aggravarsi con l’età. La
prevalenza Europea è stimata tra 1/125.000 e 1/175.000.
L'ampio spettro clinico osservato nella BBS si associa
ad una significativa eterogeneità genetica essendo state
identificate mutazioni in 14 geni diversi (BBS1-14). La
malattia è trasmessa prevalentemente come carattere
autosomico recessivo; in alcuni casi è stata osservata
una trasmissione triallelica (BBS1, BBS2, BBS6). Per
la messa a punto di una efficace strategia diagnosticomolecolare, abbiamo inizialmente analizzato il DNA
genomico di 21 pazienti italiani affetti da BBS, utilizzando
il chip della Asper Biotech (Estonia) che ricerca 333
mutazioni note in 12 geni BBS, nel gene ALMS1, e nel
gene GNAS1. L’analisi ha evidenziato 11 alleli mutati (3
in BBS10, 6 in BBS1, 2 in BBS6) in 6 pazienti, 5 dei
quali sono risultati omozigoti. Sono stati quindi analizzati
mediante sequenziamento diretto gli esoni e le relative
giunzioni di splicing dei geni BBS10, BBS1, BBS2, BBS6,
le cui mutazioni rendono conto, secondo dati di letteratura,
rispettivamente del 20%, 23%, 8% e 6% circa dei casi
di BBS. Abbiamo così identificato otto nuove varianti di
sequenza (62%), tre in BBS10, una in BBS1, e 4 in
BBS2. Abbiamo identificato in totale 2 mutazioni in 10/21
pazienti (48%), 1 sola mutazione in 2/21 (10%) e nessuna
mutazione in 9 pazienti (43%) per un totale di 14 variazioni
geniche differenti. Inoltre, il 19% dei pazienti presenta
mutazione di BBS10, il 24% di BBS1, il 10% di BBS2; 1
paziente, composito eterozigote per due nuove mutazioni
frameshift in BBS2 è anche eterozigote per una mutazione
missenso in BBS1. Tutti i soggetti omozigoti dichiarano
consanguineità dei genitori. Lo screening molecolare sarà
presto esteso ai rimanenti geni; per i pazienti eterozigoti
per una sola variante, sarà valutata la dose genica
mediante array CGH.
Acknowledgments:
Regione
Campania,
DGRC
1901/2009; IRCCS - Fondazione SDN.
482
P022
MANAGEMENT OF REAL MICROBIOLOGICAL
EMERGENCIES: REAL TIME PCR PLATFORM
AS INTEGRATION TOOL AMONG CLINICAL
BIOCHEMISTRY, MICROBIOLOGY AND CLINICAL
MOLECULAR BIOLOGY
L. Bianchi, Z. Napoli, M. Niccolai, R. Giannecchini, F.
Santoni, R. Lari
U.O. Lab. di Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche,
Az. Osp. di Pistoia
Introduction: Meningitis and malaria are medical
emergencies that require a multidisciplinary approach and
Real Time PCR (RT-PCR) platform increases diagnostic
effectiveness, reducing the turn around time (TAT),
increasing the sensitivity and, for malaria, standardizing
parasitemia.
Purpose: The aim of this study was to analyze the
impact of RT-PCR in terms of diagnostic efficacy in the
management of microbiological "emergencies".
Methods: 95 cerebrospinal fluids (CSFs), positive to
physical-chemical analysis, and 14 cases of suspected
malaria were analyzed with RT-PCR. The nucleic acids
were extracted using the extractor EZ1-Advanced and
Virus DNA kit (Qiagen). Qualitative/quantitative RTPCR for bacteria (EuSepScreen lattanti/adulti, Eurospital)
and viruses (HSV and enterovirus, BioMieraux) were
used for the detection of most important pathogens
causing meningoencephalitis. Quantitative RT-PCR Artus
(Qiagen) and Liferiver (DID) kits were used for detecting
and typing Plasmodium species.
Results: 9 CSFs analyzed were positive for bacteria
(4 to S. pneumoniae: 2 with negative bacterioscopic
analysis and 3 with negative culture) and 11 for viruses
(including 1 to HHV-7). All positive bacterial cases showed
a procalcitonin (PCT) increase. There were no cases
with negative molecular test and positive culture test.
The malaria RT-PCR has confirmed all positive cases
(n = 6) of thin blood smears (TBS), including the only
case with gametocytes alone. RT-PCR parasitemia was
comparable to BST one.
Conclusion: About CSF: 1) evaluation of biochemical test
results such as PCT and blood count allow to decide
which RT-PCR panel is more appropriated; 2) a fully
automated platform for RT-PCR methods can provide
a more effective response in terms of treatments. In
fact, RT-PCR methods are faster (TAT <2-3h), more
sensitive(<99%) and VPN is 100%. In addition, RTPCR allow many viral pathogens detection, reducing
the cases in which therapy remains on empirical basis.
Limits? The reduced number of pathogens, especially
bacteria, that can be detected. For malaria diagnosis
RT-PCR improves identification of Plasmodium species
and allows standardization of parasitemia calculation,
making it suitable for its insertion in urgency/routines, with
important clinical relapses for the patients.
P023
MANNOSE-BINDING LECTIN2 GENE FUNCTIONAL
POLYMORPHISMS ANALYSIS IN ITALIAN PATIENTS
WITH AGE-RELATED MACULAR DEGENERATION: A
PRELIMINARY STUDY
1
1
2
P024
METODOLOGIE PER L'IDENTIFICAZIONE DI
POLIMORFISMI NEL GENE hHCN4
M. Carboni, V. Bulla , F. Pudda, E. Canu , S. Pasella, P.
Mele, A. Marchisio, F. Balzano, A. Mannu, L. Deiana
2
E. Mello , P. Concolino , B. Falsini , A.M. Minnella , F.
1
1
1
1
Annunziata , C. Zuppi , B. Giardina , E. Capoluongo
1
University of Rome
2
Institute of Ophtalmology, Catholic University of Rome
Background: Age-related macular degeneration (AMD) is
the leading cause of blindness in the elderly population
living in developed countries; in late stage it includes
two forms: “dry” and the most severe “wet”. AMD
is a multifactorial disorder where some variants in
genes encoding complement pathway proteins have been
associated with AMD. Mannose Binding Lectin (MBL) is
an important component of the innate immune system.
MBL’s recognition of microorganism or endogenous
apoptotic cells facilitates their clearance through opsonophagocitic pathways. Expression levels of functional
MBL are strongly genetically determined. In this study
we investigated MBL2 polymorphisms as potentially
associated with AMD. Moreover MBL2 could help to
discriminate between two forms of AMD: wet and dry.
Methods: 85 nonsmokers Caucasian patients (39 DryAMD and 46 Wet-AMD) were genotyped for three
polymorphisms in the promoter of MBL2 gene (-550H/
L, -221X/Y, +4P/Q variants) and for three major mutant
alleles in exon 1 (p.R52C, p.G54D, p.G57E). In addition
55 healthy control subjects were genotyped.
Results: MBL-2 SNP frequencies were not significantly
different between patients and controls (p>0.01). By
haplotype analysis, the largest differences were found in
Wet-AMD group vs Dry and controls (p<0.05). LYPA and
HYPD haplotypes frequencies were lower in Wet-AMD,
whereas HYPA frequency was higher.
Discussion: MBL2 could be involved in AMD
pathogenesis: in fact, LYPA and HYPD haplotypes, who
correlate with a medium promoter activity and produce a
non-functional protein respectively, seem to be protective
towards progression from Dry to Wet-AMD. Besides
HYPA, that synthesizes a wild-type protein with high
activity of promoter, is more distributed in Wet-AMD than
in control or Dry individuals. We can hypothesize that
higher active MBL circulating protein, as a consequence
of the presence of MBL2 genotype, could result in a
higher complement activation and MBL-dependent cell
mediated citotoxicity at macular level, that could lead to
AMD onset. Therefore lower active MBL circulating protein
could be protective in AMD progression. Study on large
population will clarify the role of MBL2 polymorphisms in
AMD development and progression.
Dinu V, Miller PL, Zhao H. Evidence for association
between multiple complement pathway genes and AMD.
Genet Epidemiol 2007;31:224-37.
É stato dimostrato che il battito del cuore è provocato
da un solo gene detto hHCN4 o gene “pacemaker”, che
sarebbe il grado di azionare del meccanismo della pompacuore controllandone la frequenza cardiaca. hHCN4
gestisce in maniera diretta una proteina che agisce
da canale ionico, detto canale “funny” o canale del
pacemaker, tale gene è molto espresso nei mammiferi
nel nodo seno-atriale. Nei roditori una riduzione del
gene hHCN4 determina bradicardia e la sua eliminazione
porta a rallentamento del ritmo fino alla morte. Il DNA
genomico di soggetti bradicardici di origine sarda che
hanno superato i cento anni di età, appartenenti al
progetto AKeA, è stato estratto da sangue intero e il gene
hHCN4 amplificato tramite PCR. Gli amplificati dei diversi
esoni sono stati quindi analizzati mediante l’utilizzo del
DHPLC, tecnica che permette di identificare polimorfismi
in una sequenza. Il DNA usato come standard, appartiene
ad un unico individuo non bradicardico, è stato amplificato
tramite PCR, sequenziato e confrontato con il gene wild
type per determinare eventuali variazioni nella sequenza
genomica. Lo studio è in fase preliminare. I risultati
ottenuti sono in numero limitato per un’analisi statistica.
Lo studio preliminare condotto su soggetti ultralongevi
bradicardici ha evidenziato al momento la presenza
di polimorfismi sinonimi che non influiscono sulla
funzionalità del canale “funny”. Tali risultati rappresentano
i primi dati di uno studio più ampio.
Milanesi R, Baruscotti M, Gnecchi-Ruscone T, et al.
Familial sinus bradycardia associated with a mutation
in the cardiac pacemaker channel. N Engl J Med
2006;354:151-7.
483
P025
MiRNAs EVALUATION IN HUMAN PERIPHERAL
BLOOD CELLS OF CELIAC PATIENTS
1
2
1
M. Capuano , M. Galatola , M.V. Esposito , L. Del
1
1
3
1
Vecchio , L. Sacchetti , L. Greco , N. Tinto
1
Dep. of Biochemistry and Medical Biotechnology,
University of Naples “Federico II”, and CEINGE
Advanced Biotechnology, s. c. a r. l., Naples
2
Dep. of Biochemistry and Medical Biotechnology,
University of Naples “Federico II”, and Dep. of
Paediatrics and European Laboratory for the
Investigation of Food-Induced Diseases (ELFID),
University of Naples “Federico II”, Naples
3
Dep. of Paediatrics and European Laboratory for
the Investigation of Food-Induced Diseases (ELFID),
University of Naples “Federico II”, Naples
Celiac disease (CD) is an immune mediated enteropathy
caused by permanent sensitivity to gluten in genetically
susceptible individuals. HLA DQ2/DQ8 haplotypes confer
the highest estimated heritability (~35%) reported so far;
however, the presence of HLA-risk alleles is a necessary
but not sufficient condition for the development of CD.
In the last four years, several Genome Wide Association
studies identified about 40 genomic regions harboring
64 candidate genes, but unfortunately they account for
only 4% of the genetic variance. A recent study of
our group focused on the involvement of microRNAs
(miRNAs) in the intestinal epithelium of the human CD
small intestine. MiRNAs are small non-coding RNAs
that modulate gene expression, causing an inhibition
of translation or some degree of degradation of the
target mRNA. They play a relevant role in a variety of
physiological and pathological conditions. In a previous
study we found that, among 365 human miRNAs tested,
the expression of about 20% of the miRNAs differed
between CD and control children, particularly miR-449a
showed the higher expression levels in CD patients. In
this study, we evaluated the expression of miR-449a in
peripheral blood cells of CD patients aimed to identify a
new easy and non-invasive diagnostic tool of the disease.
For this purpose, we recruited 40 children, 20 active CD,
10 Gluten Free Diet (GFD) CD and 10 controls. From all
participants 2 blood samples with EDTA were collected.
Peripheral lymphocytes were sorted using Fluorescenceactivated cell sorting (FACS) and peripheral monocytes
were isolated by Macs cell isolation kit (Miltenyi Biotec).
Total RNA was extracted from both lymphocytes and
monocytes. The expression level of the miR-449a, in
each cell population, was evaluated by quantitative RTPCR using RNU48 as endogenous control. Preliminary
data show that the miR-449a expression was similar
in lymphocytes but lower in monocytes from CD than
from controls. Further studies are in progress to test
the correlation among expression level of miR-449a in
intestinal mucosa and in peripheral monocytes of the
same CD patients in order to investigate if the miR-449a
evaluation in monocytes could be useful in CD diagnosis.
484
P026
MOLECULAR ANALYSIS OF PATIENTS WITH
ELEVATED LONG-CHAIN 3-OH-ACILCARNITINES
ALLOWS DIFFERENTIAL DIAGNOSIS BETWEEN
LCHAD AND MTP DEFICIENCY
1
1
1
R. Romanelli , C. Cozzolino , E. Scolamiero , G.
1
3
1
1
Parenti , G. Andria , M. Ruoppolo , G. Frisso , F.
2
Salvatore
1
degli Studi di Napoli “Federico II”
2
CEINGE-Biotecnologie Avanzate scarl, Napoli
3
Dip. di Clinica Pediatrica, Università degli Studi di
Napoli “Federico II”
The mitochondrial trifunctional protein (MTP) is a
multienzyme complex of the fatty acid beta-oxidation
cycle. It is composed of 4 #-subunits (encoded by HADHA)
harboring long-chain 2,3 enoyl-CoA hydratase (LCEH)
and long-chain L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase
(LCHAD) activity, and 4 β-subunits (encoded by
HADHB) harboring long-chain 3-ketoacyl-CoA thiolase
(LCKT) activity. MTP deficiency is an autosomal
recessive disorder distinguished in two diseases: isolated
LCHAD deficiency (LCHADD), characterized by reduced
LCHAD activity, and general MTP deficiency (MTPD),
characterized by reduced activity of all three MTP
enzymes. Here, we report two patients, for which
plasma acylcarnitine profile analysis by tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS) showed an increase of
long-chain 3-hydroxy species: 3-OH-palmitoylcarnitine
(C16OH) and 3-OH-oleylcarnitine, (C18:1OH). These
findings suggested either long-chain 3-hydroxyacyl-coA
dehydrogenase deficiency (LCHADD) or complete MTP
deficiency. By molecular analysis of the HADHA and
HADHB genes, the patient 1 revealed homozygosity for
the common #-subunit mutation c. G1528C (p.E510Q),
that is located directly within the catalytic region of the
LCHAD domain and is present in homozygous form
in about 70% of affected individuals. This result is
consistent with LCHADD diagnosis. Patient 2 was found
to be a compound heterozygote for 2 novel mutations
in HADHB gene: c.A284G (p. T62A), absent in 600
normal chromosomes, and c. 358+1 G>A, resulting in
the skipping of exon 5 with an in-frame 44-bp deletion,
suggesting MTP deficiency. In conclusion, we emphasize
the importance of genetic analysis for a correct differential
diagnosis of diseases that show overlapping biochemical
findings, such as LCHADD and MTPD. This is very
important for the accurate genetic counseling.
P027
MULTIPLEX REAL TIME PCR ALLELIC
DISCRIMINATION OF G1691A (LEIDEN MUTATION)
AND G20210A (FACTOR II) MUTATIONS ON
Q3 SIMPLE PLATFORM FROM BUCCAL SWAB
WITHOUT EXTRACTION
1
1
P028
MULTIPLEX REAL TIME PCR EVALUATION OF
GENETIC CELIAC DISEASE PREDISPOSITION
(HLA-DQ2 AND HLA-DQ8) IN 102 CASES AND
RELATIVE CORRELATION WITH HLA-DRB1
HAPLOTYPE INVESTIGATED BY REVERSE DOTBLOT HYBRIDIZATION
1
M. Valisi , A. Colombo , D. Stangalini , A.
2
2
3
Donnangelo , A. Marzorati , S. Coffa , M.
3
3
2
Bianchessi , S. Conoci , D. Russo
1
1
2
M. Valisi , A. Colombo , A. Donnangelo , A.
2
1
1
2
Marzorati , D. Stangalini , A. Stangalini , C. Roccio , D.
2
Russo
1
Fleming Research Service Lab, Milano
Clonit, Milano
3
ST Microelectronics, Agrate
2
Hereditary thrombophilia is a genetically determined
tendency to develop thromboembolic disease at a young
age with recurrent character. Environmental risk factors
(smoking, alcohol, stress, diet, etc.) and genetic mutations
such as the Leiden mutation localized on the factor V gene
and the mutation G20210A Prothrombin gene located on
or factor II, interact resulting in the expression of this
disease. This study was performed by multiplex TaqMan
real-time PCR that allows the simultaneous amplification
and characterization of the Factor V (G1691A) and Factor
II (G20210A) specific SNPs on Q3 system; an innovative
platform developed by ST Microelctronics in collaboration
with Clonit. It is presented as a ready to use “samplein, result out” tool where the reagents (Clonit) are preloaded. This small and single assay system uses a silicon
microchip that allows the simultaneous amplification of
the heterozygous positive controls, negative controls,
and the sample for both mutations: one sample for
one chip. The reaction starts directly from buccal swab
and it doesn’t need any kind of DNA extraction. Buccal
swab from 30 random patients have been analyzed by
the new ST platform and compared with whole blood
extracted DNA at Fleming Research Service Lab using
QIACube instrument and amplified by AB7500 using
commercial reagents (Clonit). The final results performer
simultaneously on both systems (Q3 without extraction
and conventional instrumentation by reference reagents
with standard extraction) performed simultaneously have
demonstrated the perfect correlation. The implementation
of this new real time platform allows reducing the time
analysis and the cost of the assay. Morover, it’s able
to perform appropiately the tests also in not specialized
labs with small number of samples or in POC, since the
microchip concept allows single sample analysis without
both any reagents waste and the external extraction that
currently requires specialized staff.
1
Service Lab Fleming Research, Milano
Clonit, Milano
2
Celiac disease is a systemic immune disorder
characterized by mild to severe gastrointestinal symptoms
(such as diarrhea, weight loss, abdominal pain, abdominal
distention, etc). This disease is a multifactorial disorder
resulting from the interaction of specific pairs of allelic
variants in two HLA genes, HLA-DQA1 and HLA-DQB1,
associated with celiac disease susceptibility, and other
environmental factors. Because of 30% of the general
population has one of the celiac disease-associated HLA
alleles and only 3% of individuals with one or both
of these alleles develop celiac disease, presence of
celiac disease-associated HLA alleles is not diagnostic
of celiac disease; however, their absence excludes a
diagnosis of celiac disease. The loci within the DRDQ region are especially valuable for their tight linkage
and high linkage disequilibrium. The HLA-DRB1 gene is
very important to identify the presence of homozygous
or heterozygous alpha or beta chain in DQ-heterodimer
and the susceptibility to celiac disease. This study
was performed by multiplex TaqMan real-time PCR
(Clonit srl) that allows the simultaneous amplification
and characterization of the specific allele variants of
DQA1 (DQA1*02 , DQA1*03 and DQA1*05) and DQB1
(DQB1*02 and DQB1*0302 ) in 102 Italian patients;
all these celiac disease associated HLA alleles are
necessary to allow the determination of the presence
of DQ2-heterodimer or DQ8-heterodimer. We have also
characterized the HLA-DRB1 haplotype of every patients,
both the carriers of DQ2-/DQ8-heterodimer or not, with
a reverse dot-blot hybridization (Innogenetics srl) to
allow differentiation of homozygotes from heterozygotes
carriers of risk alleles and cis-position on the DR3DQ2 haplotype from trans-position DR5-DQ7/DR7-DQ2
in heterozygotes carriers. The evaluation of 102 random
samples shows that 40% of the tested patients (N=39)
presents genetic predisposition to celiac disease. 33%
(N=13) of these predisposed samples present only the
DQ2 ß chain, 41% (N=16) has got the allelic variants
of HLA-DQ2, 17% (N=7) expresses the allelic variants
of HLA-DQ8 and 9% (N=3) is characterized by the two
HLA genes allelic variants of HLA-DQ2 and HLA-DQ8.
The final results obtained from both analysis (real time
and reverse dot blot) performed simultaneously have
demonstrated the correlation between the HLA-DQ2/DQ8
expression and HLA-DRB1 haplotype.
485
P029
MUTATION ANALYSIS OF SARCOMERIC GENES
IN HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY FAMILIES
FROM SOUTHERN ITALY
1
1
3
1
S. Zanotta , P. Coppola , G. Limongelli , G. Frisso , F.
2
Salvatore
1
degli Studi di Napoli "Federico II", Napoli
2
CEINGE-Biotecnologie Avanzate scarl, Napoli
3
Dip. di Cardiologia, Seconda Università di Napoli, A.O.
Monaldi, Napoli
Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most
common genetic cardiovascular disorder characterized
by thickening of the left ventricular wall and potentially
fatal arrhythmias. It is the most frequent cause of sudden
cardiac-related death in young people and a major cause
of cardiac failure and death in the elderly. However,HCM
frequently goes undiagnosed until the appearance of
overt signs and symptoms. Genetic screening of HCM
patients allows to obtain information useful for an early
diagnosis and so limit the severe consequences of silent
HCM[1]. Mutations in 8 or more genes encoding proteins
of the cardiac sarcomere are responsible for HCM,
such as MYH7, MYBPC3 and TNNT2. We analyzed,
by PCR and direct sequencing, 93 independent HCM
patients from Southern Italy for MYH7, MYBPC3, TNNT2,
TNNI3, TPM1, MYL2, MYL3 and ACTC1 genes. We
also analyzed 119 subjects from 31 HCM families to
evaluate the mutation segregation in the family. Mutations
were identified in 47 of 93 patients (50%). The most
frequent genes altered in the genotyped patients were
MYH7 and MYBPC3, which were mutated in 43% and
42% of genetic positive cases, respectively. Genes
TNNT2, TPM1 and TNNI3 were altered in 11% and
2% of cases,respectively. We found 11 novel mutations:
6 in MYBPC3, 4 in MYH7 and 1 novel mutation in
TNNT2. 5 patients at HCM end-stage phase had double
mutations: 2 had double mutations in MYBPC3 gene,
and 1 patient had 2 mutations in MYH7 gene;the other
were compound heterozygous, harboring 1 mutation in
MYH7 and 1 in MYBPC3 genes and 1 mutation in MYH7
and 1 in TPM1 genes. 70(59%) family subjects, of whom
26 were asymptomatic, carried a mutation. Our data
agree with HCM molecular epidemiology present in the
literature, reporting genes most frequently associated
with HCM are MYH7, MYBPC3 and TNNT2. In our
cohort complex genotypes, characterized by double
mutations, were present in HCM end-stage patients,
suggesting that genetic screening may play a role in
the identification of HCM patients at risk of disease
progression. Molecular screening of first-degree resulted
very important for characterize family members at risk for
developing disease and excluding unaffected relatives,
which is information not achievable otherwise.
Maron BJ, Maron MS, Semsarian C. Genetics of
hypertrophic cardiomyopathy after 20 years: clinical
perspectives. J Am Coll Cardiol 2012;60:705-15.
486
P030
POLIMORFISMO DEL GENE ACE: GENE DELLA
LONGEVITA’ O FATTORE DI RISCHIO NELLA
PATOLOGIA IPERTENSIVA
B. Lo Sasso, A. Caruso, L. Agnello, F. Bazza, G.
Pecoraro, V. Randazzo, M. Ciaccio
Dip. di Biopatologia e Biotecnologie Mediche e Forensi,
Sez. di Biochimica Clinica e Medicina Molecolare,
Università degli Studi di Palermo.
Negli ultimi decenni l’allungamento della vita media
ha stimolato un particolare interesse nello studio
dei processi dell’invecchiamento e nella ricerca di
possibili geni coinvolti nella longevità. In particolare i
centenari dimostrano di avere una prevalenza minore
di malattie cardiovascolari e dei fattori di rischio ad
essa correlati. L’enzima di conversione dell’angiotensina
(ACE), presente in tutte le cellule endoteliali, gioca
un ruolo essenziale nel mantenimento dell’omeostasi
del flusso vascolare, regolando sia la produzione
del vasocostrittore angiotensina II sia inattivando la
bradichinina. In particolare alcuni studi hanno riportato
una possibile correlazione tra il polimorfismo Inserzione/
Delezione (I/D) localizzato all’interno dell’introne 16 del
gene ACE e la patologia ipertensiva nonché un suo
possibile ruolo nella longevità. Lo studio è stato condotto
su 200 soggetti di età >90 anni provenienti dalla Regione
Sardegna, 123 pazienti ipertesi (24-76 anni) e 112
soggetti normotesi (30-65 anni). Il polimorfismo (I/D) è
stato tipizzato mediante PCR; gli amplificati di 490bp
(allele I) e di 190bp (allele D) sono stati visualizzati su gel
di agarosio al 2%. I nostri risultati mostrano una frequenza
del genotipo D/D maggiore nei soggetti ipertesi rispetto ai
soggetti normotesi (49% vs 36%, P = 0.027) e maggiore
nel gruppo dei centenari sia rispetto ai soggetti ipertesi
che normotesi ( 52% vs 49%, P = 0.016; 52% vs 36% , P <
0.01 ). Sebbene il ruolo del gene ACE nel processo della
longevità e nella patogenesi delle malattie cardiovascolari
rimanga controverso, il nostro studio suggerisce una
possibile associazione tra longevità e varianti alleliche di
geni coinvolti nella patogenesi dell’ipertensione.
P031
PROTHROMBOTIC GENE VARIANTS IN AMI YOUNG
WOMEN
1
1
2
P032
SCREENING DI MUTAZIONI BETA-TALASSEMICHE
MEDIANTE ANALISI DI TIPO HIGH RESOLUTION
MELTING (HRMA)
2
S. Giordano , R. Tomaiuolo , C. Bellia , A. Caruso , R.
1
1
3
3
Di Fiore , S. Quaranta , D. Noto , A.B. Cefalù , P. Di
4
5
3
2
Micco , F. Zarrilli , M. Averna , M. Ciaccio
C. Di Mauro, S. Puzone, M.R. Storino, R. Sessa, P.
Izzo, M. Grosso
1
Dip. di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Universita’
degli Studi di Napoli Federico II e Ceinge-Biotecnologie
Avanzate, Napoli
CEINGE-Biotecnologie Avanzate e Dip Biochimica e
Biotecnologie Mediche, Università di Napoli Federico II
2
Sez di Biochimica Clinica e Medicina Molecolare,
Dip Biopatologia e Biotecnologie Mediche e Forensi,
Università di Palermo
3
Centro per le Dislipidemie Genetiche-Dip di Medicina
Interna e Specialistica, Università di Palermo
4
Pronto Soccorso, Unità di Medicina Interna, Osp
Fatebenefratelli di Napoli
5
Dip. Bioscienze e Territorio, Università del Molise,
Isernia
Given its high incidence, morbidity and mortality, acute
myocardial infarction (AMI) is a relevant clinical and social
problem particularly in young women. 10% of AMI occurs
in subjects aged <45 years, (juvenile AMI) independently
of the presence of typical risk factors, suggesting that
genetic predisposition plays a relevant role. Some variants
in genes encoding inhibitors of hemostasis have a
procoagulant effect, predisposing to venous thrombosis,
but their role in arterial diseases is still controversial. The
most common prothrombotic variants are: factor V (FV)
Leiden, which causes resistance to protein C; prothrombin
(FII) G20210A, that causes a higher plasma level of
FII; the C677T of methylene-tetrahydrofolate reductase
(MTHFR) enzyme which impairs the homocysteine levels;
and the -455G>A of beta-fibrinogen which causes
increased levels of fibrinogen. The aim of the study
was to evaluate the potential link between such gene
variants and AMI in young women. The four prothrombotic
gene variants were analyzed using a commercial kit
based on real-time PCR and light-cycler analyzer in 955
young AMI patients (362 females, 593 males) and in
698 AMI patients (245 females, 453 males). We studied
909 unrelated subjects (458 females, 451 males) from
the same geographic area as control group. In young
AMI females, the allelic frequency of either FV Leiden
and of FII G20210A was significantly higher versus the
control group (O.R.: 3.67 for FV Leiden and O.R.: 3.84
for FII G20210A; p<0.001). AMI male patients showed
the allelic frequency of the MTHFR C677T variant and
the homozygous variant genotype significantly higher as
compared to the control population (O.R. 3.05). The
data confirm that young AMI in females is a peculiar
phenotype with specific risk factors as the increased
plasma procoagulant activity of FV and FII. Instead, the
homozygous state for the 677T MTHFR variant may
cause increased levels of homocysteine and/or an altered
folate status and thus an increased risk for later AMI,
particularly in males. These observations may contribute
to a better stratification of the genetic AMI risk in different
age and gender subjects and may help to improve
prevention strategies for acute coronary diseases in
specific risk-group subjects.
Le beta talassemie sono condizioni generalmente
associate a mutazioni puntiformi a carico del gene
beta globinico. Nel nostro laboratorio abbiamo messo
a punto una procedura basata sulla tecnica dell’High
Resolution Melting Analysis (HRMA) per l’identificazione
di tali mutazioni in 40 portatori di tratto beta-talassemico.
La metodica dell’HRMA permette di identificare la
presenza di mutazioni puntiformi, piccole delezioni o
duplicazioni. La procedura consiste in una reazione
di amplificazione e nella successiva determinazione
del profilo di denaturazione in un determinato range
di temperatura (60-95 °C) che avviene nello stesso
tubo di reazione in un termociclatore (LightCycler®
480, Roche Applied Science). Questa caratteristica
riduce notevolmente il rischio di contaminazione e
di manipolazione del campione. L’intera procedura si
presta, inoltre, ad essere automatizzata e può quindi
essere eseguita da un unico operatore, riducendo quindi
notevolemente i costi del personale preposto a tali
indagini. Dall’analisi dei profili di denaturazione è possibile
identificare direttamente alterazioni di sequenza nei
prodotti di amplificazione grazie al cambiamento della
curva di denaturazione rispetto a quella di un controllo
normale. Nel nostro studio abbiamo messo a punto le
condizioni di reazione per cinque regioni del gene betaglobinico in cui cadono più frequentemente mutazioni beta
talassemiche (promotore prossimale, sequenze esoniche
ed introniche, regione 3’UTR). In tutti i portatori di
tratto beta-talassemico da noi analizzati è stato possibile
identificare alterazioni delle curve di denaturazione
rispetto ai controlli normali. La presenza di una
determinata mutazione puntiforme è stata poi confermata
mediante sequenziamento diretto dell’amplicone. Inoltre,
questo metodo è risultato altamente riproducibile ed
accurato in quanto ciascun tipo di mutazione ha mostrato
uno specifico profilo di melting, anche nel caso di
mutazioni che cadono in posizioni molto ravvicinate, come
le mutazioni IVS1:1 e IVS1:6. Il metodo dell’HMR risulta
quindi molto economico, affidabile, rapido ed utilizzabile
anche nel corso di diagnosi prenatali.
Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution
melting applications for clinical laboratory medicine. Exp
Mol Phatol 2008;85:50-8.
487
P035
VARIAZIONE DEI LIVELLI PLASMATICI DI TTR
NELLA POPOLAZIONE SARDA
S. Pasella, A. Baralla, E. Canu, S. Pinna, A. Mannu , V.
Ventura , E. Sotgiu, L. Deiana
P036
VITAMIN E SUPPLEMENTATION IN TYPE 2
DIABETIC MELLITUS AND FIBRINOGEN -854 G/
A POLYMORPHISM EFFECTS ON FIBRINOGEN
DECREASE
1
La transtiretina (TTR) è una proteina coinvolta nel
trasporto degli ormoni tiroidei e del retinolo A,
entrambi ormoni essenziali per la normale crescita e
sviluppo di tutti gli organi dell’organismo umano. Dalla
letteratura è noto che sono molteplici i fattori che
possono causare variazioni dei livelli plasmatici della
TTR. Da studi preliminari sulla longevità in Sardegna
(Progetto di ricerca AKeA) è emersa l’esistenza di
alcune importanti variazioni nell’espressione di diverse
proteine plasmatiche; in particolare, è stata osservata
una riduzione statisticamente significativa (pvalue<0.05)
dell’espressione proteica di TTR in soggetti con età
superiore ai 90 anni. Nel presente lavoro si è voluto vedere
come variano i livelli plasmatici di TTR utilizzando un
metodo quantitativo e se esiste una corrispondenza con
i risultati dell’analisi semiquantitativa ottenuti mediante
elettroforesi bidimensionale e analisi di immagine. E’
stato esaminato un campione rappresentativo della
popolazione sarda composto di 71 individui, di cui
23 centenari (100-104y), 17 novantenni (90-99y), 15
ottantenni (80-89y) e 16 con età inferiore ai 50 anni.
La concentrazione plasmatica della TTR è stata valutata
mediante il kit Assay Max Human Prealbumin ELISA
(Assaypro). I risultati del presente lavoro mostrano
una diminuzione significativa (p <0.05) dei valori di
concentrazione plasmatica di TTR con l’avanzamento
dell’età, in particolare nel gruppo dei novantenni e
dei centenari. Il gruppo degli ottantenni mostra invece
valori confrontabili a quello con un età inferiore ai
50 anni. Inoltre, suddividendo ulteriormente ogni fascia
d’età per sesso è emerso che le concentrazioni di
TTR nel plasma sono più basse nelle donne rispetto
agli uomini. Questi risultati confermano i nostri dati
preliminari. In genere bassi livelli plasmatici di transtiretina
sono associati a condizioni di malnutrizione e alla
risposta infiammatoria di fase acuta. Il fatto che sia
stata osservata la massima significatività statistica nelle
diminuzioni della concentrazione di TTR in soggetti
centenari e ultracentenari suggerisce la possibilità di un
coinvolgimento della proteina nella longevità.
Johnson M, Merlini G, Sheldon J, et al. Clinical indications
for plasma protein assays: transthyretin (prealbumin)
in inflammation and malnutrition. Clin Chem Lab Med
2007;45:419–26.
2
3
2
F. Busco , R. Testa , R. Festa , M. Boemi , A.
1
2
2
1
Marziali , A.R. Bonfigli , M. Cucchi , R. Galeazzi
1
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche e Molecolari,
INRCA, Ancona
2
Centro Ricerche Metaboliche sul Diabete e gli Alimenti,
INRCA, Ancona
3
Dip. Scienze Cliniche e Molecolari, Università
Politecnica delle Marche
Aim: Patients with type 2 diabetes mellitus have
an increased risk of accelerated atherogenesis and
thrombosis. This illness is associated with increased
generation of free oxygen radicals (oxidative stress) and
pro inflammatory basal status. Diet supplementation with
Vitamin E or Vitamin E alone is able to decrease oxidative
stress and basal inflammation. Fibrinogen is a crucial
acute phase protein involved in the process of thrombus
formation, whose plasma levels rise in inflammatory
conditions. Fibrinogen levels are also influenced by
genetical factors. Two nonrelated polymorphisms in the
promoter region of ß fibrinogen gene, -455 G/A and
-854 G/A substitution, are known to have a substancial
impact on the basal rate of transcription of the gene
and, subsequently, on fibrinogen plasma concentration.
The aim of this study was to determine the effect of
vitamin E treatment on fibrinogen plasmatic levels in
diabetic patients and whether these two polymorphisms
may influence Vitamin E effect.
Methods: Thirty-seven type 2 diabetic patients (24
males and 13 females, mean age±SD, 61.9±6.5 years,
mean BMI±SD 28.1±3.4, mean duration of diabetes±SD
5.8±5.6 years) were treated with vitamin E 500 UI/
die. We determined fibrinogen, -455 G/A and -854 G/A
polymorphisms and other biological variables at baseline,
during (5th and 10th week) and after (30th week) vitamin
E supplementation.
Results: Fibrinogen drastically decreased after vitamin E
supplementation (baseline 365.8±91.1, after 30 weeks
316,1±68.4, p<0.001). Multivariate analyses showed no
significant effect of -455 G/A, while significant effect
was detected for -854 G/A polymorphism (p=0.043).
In particular, contrast test showed a significant effect
between baseline and the 30th week (p=0.015).This effect
is linked to GA allele whose carriers showed a relevant
decrease in fibrinogen levels.
Conclusions: These data confirm that vitamin E is able
to decrease fibrinogen levels in type 2 diabetes, and
show that -854 G/A polymorphism influences fibrinogen
decrease. It opens further fields of study, where the
evaluation of GA and GG allele could offer different
personalized therapeutic targets.
Testa R, Bonfigli AR, Sirolla C, et al. Effect of 4G/5G PAI-1
polymorphism on the response of PAI-1 activity to vitamin
E supplementation in Type 2 diabetic patients. Diabetes
Nutr Metab 2004;17:217-21.
489
P039
TORCHECK: UNO STRUMENTO PER LA
VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITÀ DEI TEST
PER LA DETERMINAZIONE DEGLI ANTICORPI ANTITORCH
2
1
1
1
G. Fuzzi , S. Giovannini , A. Renieri , M. Pierini , R.
1
1
3
3
Ndreu , A. Pilo , C. Prontera , D. Battaglia , S.
1
1
Masotti , G. Zucchelli
1
QualiMedLab & Istituto di Fisiologia Clinica CNR, Pisa
Laboratorio Analisi Istituto Fanfani, Firenze
3
Fondazione Toscana "Gabriele Monasterio", Pisa
2
I saggi anticorpali, nonostante alcuni interventi di
standardizzazione e lo sviluppo di metodi automatizzati,
continuano a essere affetti da variabilità molto elevate;
questo è particolarmente evidente nelle determinazioni
del complesso ToRCH. Per migliorare la comprensione
delle problematiche legate alla misura di anticorpi e
per fornire ai laboratori uno strumento di controllo,
QualiMedLab/CNR propone da tre anni il programma
“ToRCHeck” per la Valutazione Esterna di Qualità
(VEQ) delle determinazioni quantitative e qualitative
degli anticorpi IgG e IgM di Toxoplasma, Rubella,
Citomegalovirus, Herpes simplex; la stessa VEQ
consente di monitorare anche le determinazioni degli
anticorpi IgG anti-Helicobacter pylori. Al ciclo di controllo
2012 partecipano circa 65 laboratori italiani. Per gli
anticorpi anti-Rubella e anti-Toxoplasma la VEQ fornisce
la possibilità di comparare i numerosi sistemi analitici
che utilizzano metodi quantitativi per esprimere il titolo
IgG dei sieri in UI/mL. Per questi anticorpi, i risultati
del ciclo 2011 indicano che la variabilità totale (CV trametodi e tra-laboratori) è elevata (valore medio 33.8%
per Toxoplasma IgG e 29.6% per Rubella IgG). Questa
variabilità include sia la precisione dei metodi (che risulta
compresa sia per Toxoplasma che per Rubella tra 15
e 25 CV%) sia le differenze sistematiche tra-metodi. La
valutazione qualitativa dei risultati (basata sulle risposte
dei partecipanti ai quali viene richiesto di classificare il
campione come “positivo”, “negativo” o “dubbio”) mostra
che in alcuni casi, in particolare nei campioni di controllo
a concentrazione di anticorpi borderline, le classificazioni
non sono univoche, talvolta anche nell’ambito dell’utilizzo
dello stesso metodo. Queste misclassificazioni non sono
da sottovalutare se si pensa che alcuni di questi test
hanno particolare rilevanza nel monitoraggio sierologico
delle donne in gravidanza e che il loro stile di vita potrebbe
essere radicalmente modificato a seconda del risultato
ottenuto. Il soggetto sieropositivo per Toxoplasmosi IgG e/
o per Rubella IgG è infatti ritenuto teoricamente “protetto”,
mentre i soggetti non protetti devono sottoporsi a controlli
periodici durante la gravidanza.
P040
UN NUOVO APPROCCIO ALLA VALUTAZIONE
DELLA COMMUTABILITÀ DI SIERI DI CONTROLLO
PER L’ANALISI ENZIMATICA: L’ESEMPIO DELLA
GAMMA-GLUTAMIL TRANSFERASI (GGT)
A. Carobene, E. Guerra, F. Ceriotti
Diagnostica e Ricerca San Raffaele, Istituto Scientifico
Ospedale San Raffaele, Milano
Dimostrare la commutabilità dei sieri di controllo utilizzati
nei programmi di VEQ è uno dei problemi maggiori per
la complessità del protocollo. Scopo di questo lavoro
è validare un approccio alternativo alla verifica della
commutabilità: confrontare gli effetti prodotti sui materiali
di controllo con quelli sui pool di sieri umani freschi di
analoga attività, modificando le condizioni di misura.
Materiali e metodi: Partendo dal metodo di riferimento
IFCC per la GGT abbiamo variato di volta in volta
una condizione analitica: pH (da 7.5 a 8.5 a 25
°C); concentrazione e tipo di tampone (da glicilglicina
(Gly-Gly)150 mmol/L a Tris + Gly-Gly 80 mmol/L),
concentrazione del substrato (da 4 a 6 mmol/L). Le
condizioni simulavano quelle presenti nei reattivi delle
ditte Roche (Cobas 501), IL (ILab 650) e Siemens (Advia
2400). Nuovo approccio: 2 controlli e 2 pool analizzati in
triplo per ciascuna condizione di reazione indicata. Modo
tradizionale: 10 pool distribuiti su tutto il range analitico
analizzati in doppio e controlli in triplo sia con metodo di
riferimento sia con i reattivi delle 3 ditte.
Risultati: La prova di commutabilità tradizionale indicava
i 2 controlli commutabili per i metodi IL e Siemens,
e non commutabile quello ad attività maggiore per
il metodo Roche (scarto normalizzato = 6.6). Tutte
le condizioni studiate mostravano comportamenti dei
controlli lievemente diversi da quelli dei pool: l’incremento
di 0.2 unità di pH rispetto all’ottimale comportava una
riduzione di attività del 3% nei pool contro un aumento
dell’1% nei controlli; la concentrazione di substrato di 4
mmol/L un decremento del 5.8% nei pool contro 8.8–9.5%
nei controlli, il tampone Tris- Gly-Gly 80 + 80 mmol/L un
decremento di 6.5% nei pool contro 4.5–5.5% nei controlli.
Discussione: L’approccio proposto ha messo in evidenza
un comportamento non commutabile per entrambi i
materiali (effetto delle variabili diverso rispetto ai pool
di sieri umani). L’apparente contraddizione con la
prova tradizionale, che sembra invece confermarne la
commutabilità, deriva da un duplice fattore: alcune
condizioni hanno un effetto opposto e quindi si annullano
(ad es. pH e concentrazione di substrato) e i metodi di
routine da noi considerati lavorano in condizioni molto
simili a quelle del metodo di riferimento.
491
P041
VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA DI INDICATORI
BASATI SUL CQA PER IL CONTROLLO DELLA FASE
ANALITICA
P042
VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITÀ
DELL'OSTEOCALCINA: DATI PRELIMINARI
1
R. Guerranti, M. Trinchera, A. Silvietti, C. Scapellato
UOC Patologia Clinica – Azienda Ospedaliera
Universitaria Senese, Policlinico Santa Maria alle Scotte,
Siena – Italy
Obiettivo: La definizione dei traguardi analitici rappresenta
uno step fondamentale durante la pianificazione del
controllo di qualità e l’Errore Totale accettabile (ETa)
rappresenta una modalità per definire le specifiche di
qualità di una misura. Conoscendo inoltre l’Errore Totale
sperimentale (ETs) è possibile verificare il raggiungimento
del livello di qualità progettato (ISO 15189). A tale scopo
vi sono vari indicatori sui quali manca però una vera e
propria standardizzazione. L’obiettivo di questo studio è
la valutazione della concordanza dei risultati ottenuti con
indicatori diversi da utilizzare per il controllo della fase
analitica.
Metodologia: Sono stati analizzati i dati del Controllo di
Qualità Allargato (CQA) Liquid Assayed Multiqual (BioRad) escludendo gli analiti con un numero di laboratori
partecipanti al CQA <10. Gli indicatori utilizzati sono il TEB
% (ETs*100/ETa) ed il Sigma per i quali abbiamo scelto
rispettivamente i valori <100 e >2 come valori soglia per
stabilire il raggiungimento dell’ obiettivo. Per ogni analita
abbiamo valutato la media per il TEB e per il Sigma su
6 serie di dati raccolti nel 2011 (2 livelli di controllo su 3
strumenti Cobas 6000, Roche).
Risultati: I risultati ottenuti con i due indicatori derivati dal
CQA sono stati anche confrontati con i dati delle VEQ
2011 della Regione Toscana. Questo studio evidenzia
una concordanza del 93% fra i risultati degli indicatori TEB
e Sigma (VPP 0,913 – VPN 1). Se poi confrontiamo il TEB
ottenuto con l’ETs del CQA con il TEB ottenuto con l’ETs
delle VEQ (entrambi rispetto rispetto ai traguardi fissati dal
Laboratorio) otteniamo una concordanza del 92% (VPP
0,905 – VPN 1).
Conclusioni: I valori del TEB ricavati dal CQA o
dalla VEQ rappresentano entrambi dei validi indicatori
per il monitoraggio del rispetto dei traguardi analitici.
Analizzando altri indicatori ricavati dalla VEQ (%
esercizi accettati rispetto agli esercizi inviati, zone) si
ottengono percentuali di concordanza meno significative
probabilmente per il fatto che le modalità con cui tali
indicatori sono ricavati o il loro stesso significato (le zone
VEQ valutano il miglioramento conseguibile) sono diversi
fra CQA e la VEQ.
Ottomano C, Ceriotti F, Galeazzi M, et al. Linee guida per
la gestione dei programmi di Controllo di Qualità Interno.
Biochim Clin 2008;32:102-21.
492
1
1
1
S. Giovannini , A. Pilo , A. Renieri , M. Pierini , C.
2
2
2
2
Vassalle , S. Bianchi , A. Vannucci , D. Battaglia , G.
1
Zucchelli
1
QualiMedLab & Istituto di Fisiologia Clinica CNR, Pisa
Fondazione Toscana "Gabriele Monasterio", Pisa
2
L'osteocalcina è una proteina di piccole dimensioni
con funzioni endocrine sintetizzata principalmente dagli
osteoblasti. Viene utilizzata per la valutazione del
metabolismo osseo, ovvero in caso di osteoporosi, ma
anche di iperparatiroidismo primario/secondario e morbo
di Paget, che ne provocano aumenti anche elevati. Per
valutare i metodi utilizzati e la qualità analitica nella
misura dell'osteocalcina, a partire dal 2012 QualiMedLab/
CNR ha organizzato il programma sperimentale di
Valutazione Esterna di Qualità (VEQ) Immunocheck
Osteocalcina. Partecipano al programma 40 laboratori
italiani e francesi. Ogni laboratorio riceve 12 campioni
di plasma da misurare e trasmettere a QualiMedLab/
CNR tramite accesso riservato al sito web eqas.ifc.cnr.it
o via fax. Al termine dell'esercizio, vengono preparati e
diffusi riepiloghi esplicativi delle prestazioni del laboratorio
che riportano il risultato ottenuto, la sua deviazione dalla
media di consenso e dalla media del metodo, le statistiche
di tutti i risultati e dei risultati raggruppati per metodo
e la valutazione (valore Z e punteggio) del risultato.
Ad oggi sono disponibili i risultati preliminari relativi ai
dati inviati dai laboratori nei quattro esercizi di controllo
conclusi. I metodi più usati nella VEQ sono: Diasorin
Liaison (LSN), Roche Elecsys (ROCX), Siemens Immulite
(IMM2), Brahms Kryptor (KRY). Dato che gli 8 campioni
di plasma derivano da 3 pool OS1, OS2 e OS3 (inviati
come campioni incogniti rispettivamente 3, 2 e 3 volte
ciascuno), nel calcolo delle medie e dei CV% i risultati
sono stati accorpati. Nel pool OS1 i metodi LSN, ROCX
e KRY misurano da 28 a 32 ng/mL; nel pool OS2 gli
stessi metodi misurano da 75 a 110 ng/mL; nel pool
OS3 misurano da 146 a 191 ng/mL. L’accordo tra metodi
risulta soddisfacente. Fa eccezione il metodo IMM2 che
ottiene risultati molto più bassi (circa 50%) rispetto a
LSN, ROCX e KRY (rispettivamente 11, 31 e 74 ng/
mL sui tre pool OS1, OS2, OS3). Queste differenze
sono verosimilmente dovute ai diversi anticorpi utilizzati
nella misura di questa proteina. Per quanto riguarda
la precisione dei metodi (variabilità entro-metodo, tralaboratori) questa è da considerarsi buona (6-9 CV%),
considerando anche che la molecola dell’osteocalcina è
molto instabile.
P047
BN2 E VISTA : DUE SISTEMI NEFELOMETRICI A
CONFRONTO NELLA MISURA DI 17 COMPONENTI
DEL SIERO E 4 DELLE URINE
P048
CATENE LEGGERE LIBERE SIERICHE: ASPETTI
ANALITICI E CONFRONTO FRA METODI
1
L. Loiodice, R. Lovero, E. Mascolo, M. Tampoia, L.
Varraso, S. Calvi, A. Colacicco, R. Scarcella, I.
Specchia, F. Di Serio
U.O.Patologia Clinica I, Azienda Universitario
Ospedaliera Policlinico di Bari
Introduzione: Nel nostro laboratorio l’immissione di un
nuovo analizzatore (VISTA Siemens) ha significato l’
apporto di una nuova tecnologia rispetto al sistema in uso
(BN2 Siemens). Scopo del nostro lavoro è stato verificare
il grado di correlazione dei due sistemi prima di iniziare la
nuova attività lavorativa.
Materiali e metodi: Abbiamo dosato 17 analiti sierici (IgG,
IgA, IgM, IgE, C3, C4, A1AG, APT, Ceruloplasmina, RF,
ASL, IgG1, 2, 3, 4, B2MS, HCY e 4 urinari (AlbU, B2M
U, kappa U, lambda U) sui campioni pervenuti in routine
per venti giorni. Per ogni analita sono stati calcolati il
coefficiente di correlazione ( r ) di Pearson, lo slope ( S ) e
l’intercetta ( I ) secondo la regressione lineare di Passing
Bablock ed il p value secondo il test t di Student per
dati appaiati. I risultati stati valutati anche con il metodo
di Bland Altmann utilizzando il programma di statistica
Medcal. I calibratori e controlli sono stati forniti dalla ditta
Siemens per i rispettivi analizzatori.
Risultati: L’r di Pearson è risultato compreso tra 0.85
e 0.99; lo slope varia tra 0,62 e 1,17 (i valori della
pendenza comprendono il valore uno e non sono elevati) e
l’intercetta ( I ) varia da –8 a +2 (i valori dell’I comprendono
lo zero); il p value (>0,05) non ha rilevato differenze
statisticamente significative per tutti gli analiti; secondo
Bland ed Altmann il bias, con Intervallo di Confidenza
al 95% da –13,21 a 27,42, conferma che le differenze
(media + o - 1,96) non sono statisticamente significative
e che, pertanto, i metodi possono essere usati in modo
interscambiabile.
Discussione e conclusioni: la comparazione tra
i metodi valutata statisticamente e clinicamente,
con il monitoraggio dei pazienti (check in), ha
permesso l’interscambiabilità delle strumentazioni sino
alla sostituzione del BN2 con il Vista, riducendo ogni
possibilità di errore e migliorando le performance
analitiche.
1
1
V. Barchiesi , D. Cerasuolo , M. Cuomo , E.
1
1
1
3
Leonardi , S. Liotti , R. Scarano , M. Di Donato , M.
3
2
1
Fumi , T. Lupo , E. Cavalcanti
1
S. C. Medicina di Laboratorio, I.N.T. - IRCCS,
Fondazione G. Pascale, Napoli
2
DAsMeLab, Università Federico II, Napoli
3
Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica,
Università Federico II, Napoli
Per la diagnosi ed il monitoraggio dei pazienti con
Componenti Monoclonali è entrata nella pratica clinica la
misura delle Catene Leggere Libere sieriche (FLC) con
metodi immunochimici. Per tale dosaggio, fino al 2011,
era disponibile un kit commerciale che utilizza anticorpi
policlonali, applicabile su diversi nefelometri e turbidimetri
(Freelite™, The Binding Site); oggi è disponibile anche un
metodo che utilizza anticorpi monoclonali (N Latex FLC,
Siemens) applicabile sui nefelometri della stessa ditta.
Scopo del lavoro è stato quello di valutare le performances
analitiche dei due kit del commercio, confrontandoli tra
loro secondo il protocollo CLSI. L’imprecisione tra le serie
del kit Freelite™, applicato su Cobas C6000, Roche,
ha mostrato su sieri di controllo, a due diversi livelli,
dei CV inferiori a 4.5% per le catene κ ed a 5.5% per
le catene λ. Per il kit N Latex FLC, applicato su BNP
ProSpec, i CV erano inferiori al 5% per entrambe le catene
leggere. L’imprecisione nella serie, valutata su pool di
sieri a diverse concentrazioni, sia sul BNP ProSpec che
sul Cobas C6000, ha mostrato CV sempre inferiori al
2% per entrambe le catene leggere. Sono stati valutati
gli intervalli di riferimento, per il kit N Latex FLC, su 60
campioni da donatori afferenti alla Medicina Trasfusionale
dell’INT, che sono sovrapponibili a quelli indicati dalla
ditta produttrice. Per il confronto fra metodi sono stati
analizzati 108 campioni da paziente, con gammopatie
monoclonali, afferenti all’INT. Il t-test ha rivelato differenze
statisticamente significative tra i due metodi per le catene
κ (p=0.01) e rapporto κ/λ (p=0.02) e non significative per
le catene λ(p=0.69). L’analisi della regressione lineare ha
mostrato valori di r=0.89 per catene κ, r=0.60 per λ e
r=0.78 per il rapporto. Il metodo di Cohen ha evidenziato
un accordo tra i due metodi dell’89% per le catene κ, del
65% per le λ e dell’84% per il rapporto κ/λ. Il confronto fra
metodi ha confermato che i due test non possono essere
considerati equivalenti e che risultati migliori si ottengono
quando il confronto viene effettuato utilizzando i due kit
sulla stessa strumentazione. Si è inoltre evidenziata la
mancata identificazione, con il kit N Latex FLC, di un caso
di mieloma micromolecolare lambda.
495
P049
CELIAC DISEASE DIAGNOSIS AND MONITORING:
COMPARISON BETWEEN CHEMILUMINESCENCE
AND ELISA ANTI-TRANSGLUTAMINASE AND ANTIDEAMIDATED GLIADIN PEPTIDES MEASUREMENTS
1
1
2
2
A. Aita , D. Basso , E. Rossi , M. Pelloso , G.
3
2
1
2
Guariso , C. Zambon , F. Navaglia , E. Greco , D.
2
2
1
2
Bozzato , A. Padoan , P. Fogar , M. Plebani
P050
CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE: VALUTAZIONE
DI UN NUOVO TEST DIAGNOSTICO IN
IMMUNOENZIMATICA COMPLETAMENTE
AUTOMATIZZATO
F. Dastoli, M.M. Pietracupa, G. Solito, I. Ronchi, M. De
Cristofaro
U.O.C. Microbiologia e Virologia, Osp. S. Pertini, Roma ASL RMB
1
Department of Laboratory Medicine, University-Hospital
of Padova, Italy
2
Department of Medicine - DIMED, University of Padova,
Italy
3
Department of Women’s and Children’s Health,
University of Padova, Italy
Objectives: Celiac disease (CD) diagnosis is based on
anti-tissue transglutaminase (tTG) and anti-deamidated
gliadin peptides (AGA) determination. The majority of
commercially available assays for tTG and AGA are
ELISAs with sensitivity and specificity above 95%,
never reaching however 100%. The aim of this study
was to compare the analytical performances and the
clinical utility for CD diagnosis and monitoring of tTG
and AGA of the IgA and IgG classes measured by
new chemiluminescent (QUANTA Flash®, Inova) and
established ELISA (QUANTA Lite®, Inova) methods. The
one run measurements of IgA and IgG tTG and AGA
(h-tTG/DGP screen) by QUANTA Flash® and QUANTA
Lite® were also evaluated.
Methods: We studied 321 children (155 CD; 166 controls).
tTG IgA and IgG, DGP IgA and IgG, h-tTG/DGP screen
were measured by QUANTA Flash® and QUANTA Lite®.
Results: Intra- and inter-assay coefficients of variations
of QUANTA Flash® were: 1.6% and 3.0% for tTG IgA,
3.7% and 4.0% for tTG IgG, 8.6% and 6.8% for DGP
IgA, 8.6% and 3.2% for DGP IgG, 5.1% and 2.4% for htTG/DGP screen. The most sensitive (96.1%) and specific
(97.0%) test for CD diagnosis was QUANTA Flash® tTG
IgA (cut-off:16 U), while the less sensitive (82.1%) and
specific (78.6%) was QUANTA Lite® tTG IgG (cut-off:4
U). We performed binary logistic regression analyses
considering CD diagnosis as dependent, and including
as predictors QUANTA Flash® or QUANTA Lite® tTG
IgA and IgG, DGP IgA and IgG, and h-tTG/DGP screen.
QUANTA Flash® allowed to obtain a better correct
overall classification of patients (96.60%) with respect
to QUANTA Lite® (95.14%). Among QUANTA Flash®
predictors, tTG IgA only was selected as significantly
correlated with CD (r=0.263, p<0.0001, Exp(B)=1.0506,
95% CI=1,0286-1,0731). 18 CD children on GFD had a
complete follow-up with measurements at 4, 12 and 24
months. QUANTA Flash® tTG IgA was the most reliable
index (Repeated measures analysis of variance, between
subject effect F=5.03, p<0.05) in monitoring GFD.
Conclusion: QUANTA Flash® tTG IgA measurement is
an extremely sensitive and specific index not only for CD
diagnosis, but also for the monitoring of CD patient on
GFD.
496
Introduzione: Chlamydophila pneumoniae è uno dei
maggiori agenti responsabili di infezioni respiratorie.
Reinfezioni ad andamento cronico sembrano essere
correlate anche con numerose patologie come
aterosclerosi, morbo di Alzheimer, tumori polmonari;
l’utilizzo di una sierodiagnosi è attualmente un sistema
semplice, veloce e affidabile anche nella identificazione
dello stato dell’infezione e nell’eventuale follow up del
paziente.
Materiali e metodi: Un totale di 58 sieri di soggetti con
sintomatologia clinica di infezione respiratoria è stato
analizzato per la ricerca di anticorpi IgA, IgG, IgM anti- C.
pneumoniae per mezzo di un test ELISA in automazione
(Chorus-Chlamydophila pneumoniae, Diesse). Come test
di riferimento è stato utilizzato il kit già in uso presso
il laboratorio (Cp Savyon Diagnostics Ltd); i risultati
discordanti in IgM sono stati confermati mediante test
di immunofluorescenza (Chlamydia MIF IgM, Focus
Diagnostics).
Risultati: La concordanza totale tra i due test in analisi
è stata del 91.4% (CI95%=81.3-96.2) nel caso delle IgA
(28 sieri positivi e 30 negativi) , 87.9% (CI95%=77-94)
nel caso delle IgG (29 sieri positivi e 29 negativi) e del
93.1% (CI95%=83.5-97.3) per le IgM (7 sieri positivi e 51
negativi); la verifica dei campioni IgM discordanti dopo
l’analisi con test in immunofluorescenza aumentava la
concordanza totale al 94.8% (CI95%=85.9-98.1).
Conclusioni: Lo studio effettuato conferma una buona
correlazione dei test Chorus Diesse rispetto ai
test utilizzati come riferimento interno, associata a
caratteristiche di semplificazione nell’ esecuzione del test,
con interventi dell’operatore e tempi di esecuzione e
risposta ridotti al minimo.
Campbell LA, Kuo CC, Wang SP, et al. Serological
response to chlamydia pneumoniae infection. J Clin
Microbiol 1990;28:1261-4.
P051
COMPARISON OF TWO DIFFERENT PLATFORMS
OF MOLECULAR DIAGNOSTICS
A. Pancrazzi, T. Fanelli, C. Paoli, A. Spolverini, A.M.
Vannucchi
Dip. di Area Critica Med. Chir., Unità di Ematologia,
Università di Firenze
The high-resolution melt (HRM) is a technique that
has many applications such as detection of mutations,
genotyping of single nucleotide polymorphism, searchig
for loss of heterozygosity, analysis of DNA methylation,
characterization of the haplotypes. The widespread use of
many types of analysis tools, based on different physical
and chemical principles, contributes to the instrumental
variability of diagnostic tests. We have compared 2
different instruments, one is Rotorgene 6000 (Corbett)
and other is Step One Plus (Applied Biosystems, AB).
The Corbett ‘s instrument works with the technology
of ventilated rotor while AB works with the Peltier
system. We evaluated the ability of each instrument to
genotype by melting temperature (Tm) and to scan for
heterozygosity by curve shape. A 107bp fragment of the
MPL was amplified by PCR and 3 different amplicons
of genotypes MPL515WT, MPL515WL and MPL515WK
were analyzed. These MPL mutations, that result in
the substitution of tryptophan 515 with leucine (W515L)
or lysine (W515K), have been identified in 5-10% of
patients with primary myelofibrosis and 3% with essential
thrombocythemia (Vannucchi et al, Blood, 2008). The
sample used for the qualitative analysis is genomic DNA
from 10 donors and from 2 patients positive for mutations
MPL515. The gDNA was subjected to total amplification
(WGAkit, Qiagen). Were prepared dilution curves with
DNA from healthy donors and patients (analyzed in
Sanger system). The curve points for the analysis of the
mutation MPL515WL were the following: 1%, 10%, 50%,
100% and for MPL515WK: 1%, 10%, 50%. The use of
different platforms and reagents required an optimization.
Reagents of the instruments manufacturers have best
performance in their respective machine. By setting a
standard reading range (70-95°C), the delta of average
melting temperatures between the MPL515WL PCR curve
analyzed in AB and the one analyzed in Corbett is
4.90, for MPL515WK PCR curve the delta is 4.05. This
difference on raw data value is extremly significant (p
<0.0001). This work shows that the diffusion of various
technologies require a careful analysis of optimization
and a particular attention to the type of data released for
clinical diagnostics.
P052
CONFRONTO TRA DUE METODICHE PER IL
DOSAGGIO DELL’ ANTIGENE PROSTATICO
SPECIFICO TOTALE
G. Barbina, U. Qualizza, A. Colatutto, B. Marcon, E.
Tonutti, S. Mazzolini, P. Sala
Dip. di Diagnostica di Laboratorio, Azienda OspedalieroUniversitaria “S. Maria della Misericordia”, Udine
Scopo: L’antigene prostatico specifico (PSA totale) è
una molecola appartenente al gruppo delle callicreine
(idrolasi), sintetizzato dalla ghiandola prostatica che,
dosato nel sangue si è dimostrato un utile marcatore,
sensibile e specifico, nel monitoraggio post operatorio di
pazienti con cancro prostatico oltre che nel monitoraggio
dell’ipertrofia prostatica benigna. Scopo del presente
lavoro è il confronto tra due metodiche interamente
automatizzate tra le più in uso.
Materiali e metodi: Sono stati raccolti e sottoposti ad
analisi settanta campioni di siero. Tali campioni sono stati
dosati in duplicato con la metodica PSA ADVIA Centaur
(Siemens Healthcare Diagnostics) e con quella PSA
Third Generation Immulite 2000 (Siemens Healthcare
Diagnostics).
Risultati: Una prima analisi dei dati mostra un intervallo
di concentrazione che va da 0.01 a 9.50 μg/L per la
metodica ADVIA Centaur e da 0.01 a 12.5 μg/L per la
metodica IMMULITE 2000. La correlazione risulta ottima
(R= 0.9908) con lieve sovrastima della metodica ADVIA
Centaur (y = 1.1244x – 0.0488). La precisione analitica
totale evidenzia un CV di 6.41% per ADVIA Centaur e si
attesta su 8.2% per IMMULITE.
Discussione e conclusioni: La comparazione delle due
metodiche nell’intervallo considerato risulta molto buona
sia in termini statistici che clinici. I bassi CV riscontrati
indicano che i prodotti offrono ampia garanzia di efficacia
analitica. La nostra esperienza ci suggerisce che una
scelta tra le due metodiche, considerata l’elevata qualità
dei risultati che ambedue hanno dimostrato, andrebbe
fatta principalmente sulla base del modello organizzativo
che ciascun laboratorio intende adottare.
Watt KW, Lee PJ, M'Timkulu T, et al. Human prostatespecific antigen: structural and functional similarity
with serine proteases. Proc Nat Acad Sci USA
1986;83:3166-70.
497
P054
DETERMINAZIONE DEI SOLFATI ED OSSALATI
URINARI: ULTERIORI ACCORGIMENTI
METODOLOGICI
P053
CONFRONTO TRA IL DOSAGGIO DELLA
TROPONINA T CON METODICA DI 4^
GENERAZIONE E CON METODICA AD ALTA
SENSIBILITÀ
1
2
1
1
B. Rampoldi , R. Rigolini , P. Giubbilini , E. Perfetti , S.
1
2
1
Mazza , S. Palatresi , E. Costa
G. Cangiano , A. Latte , E. Di Maina , G. Buccino , C.
1
1
1
Taranto , A. Garofalo , M.M. D'Ambrosio , M.
1
1
D'Amora , A. Sarappa
1
Servizio di Medicina di Laboratorio, IRCCS Policlinico
San Donato, San Donato Milanese
2
Unità Operativa di Cardiologia Clinica - UTIC, IRCCS
Policlinico San Donato, San Donato Milanese
1
Introduzione: L’infarto del miocardio acuto costituisce
la principale causa di morte. Negli ultimi decenni la
possibilità di dosare le troponine cardiache specifiche
(cTn) ha cambiato l’approccio alla diagnosi di sindrome
coronarica acuta. In particolare le nuove tecnologie
hanno consentito di sviluppare saggi immunologici ad
alta sensibilità in grado di rilevare nel siero e nel plasma
concentrazioni molto basse di troponina T (cTnT).
Scopo: Lo scopo di questo studio è quello confrontare i
dosaggi di cTnT effettuati con il test di 4^ generazione e
con il saggio ad alta sensibilità.
Materiali e metodi: Sono stati arruolati 274 soggetti sani
e 77 pazienti ricoverati nel reparto di cardiologia con
sindrome coronarica acuta. A questi è stato effettuato il
dosaggio della cTnT sia mediante il test troponina T di 4^
generazione sia mediante il test troponina T hs (Roche
Diagnostics Cobas e 601).
Risultati: L’analisi dei dosaggi effettuati sui campioni
di soggetti sani con le due metodiche ha mostrato
differenze statisticamente significative (media±errore
standard) (12,47 ng/L ± 1,556 per TnT vs 6,029 ng/
L ± 0,4173 per TnT hs; p<0,0001) mentre l’analisi dei
dosaggi effettuati sui campioni di soggetti malati non ha
mostrato differenze statisticamente significative (837,2
ng/L ± 152,5 per TnT vs 822,2 ng/L ± 154,5 per TnT hs;
p=0,2474). L’analisi della regressione lineare tra i risultati
ottenuti con le due metodiche nei soggetti sani (intervallo
10-380 ng/L) mostra una slope di 0,1170 ± 0,01463 e
Il dosaggio dell’ossaluria si effettua per lo studio
nefrolitiasico ma anche su “opportuna” soluzione acquosa
per la valutazione quali/quantitativa di un calcolo urinario.
La relativa automazione di tale parametro assieme al
“complicato” dosaggio fotometrico del solfato nelle urine
indirizza il laboratorista a trovare nuovi accorgimenti
metodologici e strumentali al fine di ottenere prestazioni
affidabili, facilmente realizzabili ed a costo contenuto. Le
metodiche a termine utilizzate su VIVA Vitalab Siemens
hanno i seguenti parametri strumentali: solfati precipitati
con bario cloruro (lettura a 436 nm, multipunto a 6
calibratori – 0-20-50-100-200 e 400 mg/dL, R1:urina =
220:5 μL), ed ossalati (lettura a 578 nm, a 2 calibratori
– 0 e 0,5 mmol/L), R1:urina:R3 = 200:9:50 μL). La
determinazione dell’ossalato nei calcoli urinari utilizza una
soluz. acquosa ottenuta con circa 0,20 mg di calcolo
frantumato / 5 gocce di acido solforico conc. / 5-10 mL
con acqua e breve centrifugazione. I metodi risultano
lineari fino a 400 mg/dL per i solfati e 3,00 mmol/L
per gli ossalati. Si evidenziano profili di imprecisione
inferiori al 5% negli intervalli 0,01 – 3,00 mmol/L per
gli ossalati e 2 - 400 mg/dL per i solfati. Le prove
di recupero mostrano per gli ossalati valori percentuali
compresi tra l’81,8 ed il 102,7% (recupero medio del
96,1%) e per i solfati valori tra il 95,4 ed il 106,02%
(recupero medio del 98,2%). Le imprecisione nella e tra
le serie mostrano dei CV<4%. Buone sono le correlazioni
ottenute tra i valori dosati con le metodiche adattate
su VIVA Vitalab rispetto a quelli ottenuti con il metodo
manuale per gli ossalati e con l’analizzatore AU600
Beckman per i solfati. Il kit in “manuale” Acido Ossalico
della ditta LTA da noi adattato sullo strumento VIVA
Vitalab consente di determinare agevolmente non solo
l’ossalato nelle urine ma anche quello contenuto nei
calcoli urinari. Con le variazioni metodologiche da noi
apportate in automazione è possibile triplicare il numero
delle determinazioni per confezione di acido ossalico. Il
dosaggio dei solfati da noi creato ed automatizzato non
necessita di bianco campione e si effettua subito dopo la
calibrazione evitando così la degradazione del reagente
preparato.
Cangiano G, Russo M, Forte F, et al. Diagnostica
di laboratorio della calcolosi urinaria. Biologi Italiani
2008;8:40-7.
1
1
1
1
2
un’intercetta di 4,570 ng/L ± 0.4181; r =0,1904. L’analisi
della regressione lineare tra i risultati ottenuti con le due
metodiche nei soggetti malati (intervallo 10-6850 ng/L)
mostra una slope di 1,010 ± 0,009680 e un’intercetta di
2
-23,29 ng/L ± 15,21; r =0,9932.
Conclusioni: I nostri dati dimostrano l’esistenza di una
scarsa correlazione del test troponina T hs con il saggio
di 4^ generazione nel range di valori della popolazione
sana ed un’elevata correlazione nel range di valori della
popolazione malata, a conferma della maggiore sensibilità
del test troponina T hs.
Thygesen, K, Alpert J, White HD on behalf of the Joint
ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of
Myocardial Infarction. Eur Heart J 2007;28:2525-38.
498
U.O. Lab. Patologia Clinica, Osp. dei Pellegrini, ASL
NA 1 Centro
2
Lab. Patologia Clinica ed Ematologia, Azienda
Ospedaliera apss Trento
P055
DETERMINAZIONE DELL'OMOCISTEINA:
DUE METODI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI A
CONFRONTO
L. Zardo, S. Chiappin, R. Turrini, L. De Valentin, D.
Bergamin, G. Piaserico
P056
DETERMINAZIONE DELLA PROTEINA C REATTIVA:
CONFRONTO FRA DUE METODI
A. Romero, L. Battistelli, M. Mercadanti, A. Caleffi, G.
Lippi
Lab. Analisi, Ospedale di Castelfranco Veneto (TV)
U.O. Diagnostica Ematochimica, Az. OspedalieroUniversitaria, Parma
L'omocisteina (Hcy) è un aminoacido solforato che
si forma dalla demetilazione intracellulare della
metionina, aminoacido essenziale che viene introdotto
con l'alimentazione. Recenti studi hanno evidenziato
che concentrazioni plasmatiche elevate di Hcy sono
correlate ad un aumento del rischio di malattia
cardiovascolare, sono un fattore di rischio per patologia
neurodegenerative, sono presenti nelle donne in
gravidanza affette da preeclampsia, distacco prematuro di
placenta e aborti spontanei e ricorrenti. Scopo di questo
lavoro è confrontare due diversi metodi immunologici
competitivi per la determinazione dell'Hcy totale che
comprende sia le forme libere sia legate alle proteine:
HemosIL Homocysteine applicato su ACL TOP 700 e
Immulite 2000 Homocysteine. Sono stati analizzati 40
pazienti per ciascuno dei quali è stato raccolto un
campione di plasma con Na fluoruro per la determinazione
su Immulite e uno di plasma citrato per la determinazione
su ACL TOP. E' noto che i valori di Hcy ottenuti con
plasma citrato sono approssimativamente più bassi del
14,6% rispetto a quelli degli stessi campioni anticoagulati
con EDTA o eparina a causa della diluizione con
l'anticoagulante. Avendo assimilato la nostra provetta
contenente Na floruro a quelle con EDTA o Eparina, i dati
ottenuti su ACL TOP sono stati aumentati del 14,6% prima
del confronto con quelli ottenuti su Immulite 2000. L'analisi
dei dati mediante regressione lineare ha dimostrato una
buona correlazione fra i due metodi (r= 0,9103) come pure
il diagramma di Bland-Altman, dove solo 4 campioni su
36 risultano avere una differenza fra i due metodi che
non rientra nell'intervallo di confidenza al 95%. Anche la
valutazione della classificazione dei risultati in normali o
patologici sulla base dei rispettivi intervalli di riferimento
ha riportato una buona sovrapposizione fra i due metodi
analizzati: solo due pazienti sono stati inquadrati, da
un punto di vista clinico, in modo significativamente
diverso dai due metodi. I due metodi si possono definire
confrontabili. Le differenze significative riscontrate fra i
due sistemi (5% dei pazienti studiati) sono probabilmente
da attribuire a qualche interferente presente nel campione
che agisce diversamente nei due metodi di analisi.
Introduzione: La proteina C reattiva (PCR), sintetizzata dal
fegato, sotto lo stimolo delle citochine proinfiammatorie, è
il reattante della fase acuta più utilizzato nella diagnosi e
nel monitoraggio delle flogosi acute e croniche. Lo scopo
del nostro studio è quello di valutare la performance di una
metodica applicabile su piattaforma di chimica clinica, in
confronto con la metodica nefelometrica in uso, al fine di
verificarne il possibile utilizzo in regime di urgenza.
Materiali e metodi: I campioni di siero di 54 pazienti sono
stati processati utilizzando la metodica nefelometrica di
riferimento con strumento BN Prospec e reattivo PCR hs
(Siemens), e con il metodo a intervallo esteso (RCRP)
basato su una tecnica immunoturbidimetrica con particelle
(PETIA), applicato su Dimension X Pand (Siemens). Il
metodo nefelometrico con PCR hs ha una sensibilità
analitica di 0.0015 mg/L, diluisce automaticamente il
campione in caso di eccesso di antigene. L’intervallo di
misura analitica del metodo RCRP comprende valori da
0.5 a 250 mg/L; i campioni con valori di PCR superiori a
250 mg/L devono essere diluiti manualmente.
Risultati: L'equazione del modello per le statistiche di
regressione (risultati del metodo RCRP) = pendenza
x (risultati del sistema BN) + intercetta ha evidenziato
una pendenza di 1.047, un'intercetta di 0.81 mg/L, e un
coefficiente di correlazione di 0.9983.
Discussione: Il dosaggio della PCR è ampiamente
utilizzato nella valutazione degli stati infiammatori. La
facilità di esecuzione del test e la applicabilità su
piattaforme di chimica clinica automatizzate ne hanno
consentito l’utilizzo anche in regime di urgenza. Dai
risultati del nostro lavoro si evince che le performances
dei due metodi sono sovrapponibili. Riteniamo che la
minore sensibilità analitica del metodo RCRP per i valori
estremi dell’intervallo analitico, sia compensata dalla più
rapida velocità di esecuzione, considerando la previsione
di utilizzo in regime di urgenza. La possibilità di applicare
il metodo RCRP su analizzatore di chimica clinica,
attualmente dedicato alla farmaco-tossicologia, consente
di implementarne l’utilizzo e di sostituire il nefelometro
dedicato all’urgenza, con un risparmio di risorse tecniche
ed economiche.
499
P057
DETERMINAZIONE DELLA TRANSFERRINA
CARBOIDRATO CARENTE (CDT): PRESTAZIONI DEI
METODI SEPARATIVI A CONFRONTO
P058
DISTRIBUZIONE DEI VALORI DI TROPONINA T HS
CARDIACA (CTNT HS) IN UNA POPOLAZIONE DI
SOGGETTI SANI
A. Fortunato, C. Marchetti, G. Soffiati
B. Rampoldi , R. Rigolini , P. Giubbilini , E. Perfetti , S.
1
2
1
Mazza , A. Ricevuti , E. Costa
Laboratorio di Chimica Clinica ed Ematologia - Ospedale
"San Bortolo" Vicenza
Introduzione: La transferrina, una glicoproteina (ß1globulina) coinvolta nel trasporto del ferro, le isoforme
(disialo, monosialo e asialotransferrina) denominate nel
loro complesso transferrina carboidrato carente (CDT)
rappresentano complessivamente, nel siero di pazienti
con un consumo regolare di alcol, meno del 2% della
transferrina totale. C’è un generale consenso sulla
correlazione tra consumo di alcol al di sopra di 60-80 g/
die per 10-15 giorni ed un aumento della CDT al di sopra
del valore normale.
Materiali e metodi: Sono state confrontate le
determinazioni di CDT eseguite su 88 campioni di siero di
pazienti afferenti al nostro Laboratorio per la verifica del
consumo cronico di alcol con un metodo HPLC (BioRad
% CDT su strumento Agilent 1200) e due metodi in EC di
cui uno Capillarys (SEBIA) dotato di più capillari, in grado
di processare fino ad 8 campioni contemporaneamente,
adatto per processare un numero elevato di campioni
ed uno P/ACE MDQ (Beckman-Coulter) con un singolo
capillare ed adatto per essere utilizzato da personale
specificamente addestrato. In questo studio non sono stati
utilizzati metodi immunometrici in quanto non dimostrano
una specificità analitica comparabile con quella dei metodi
separativi.
Risultati: In 78 campioni (89%) i risultati sono al di sotto
del valore soglia per tutti i metodi. Gli altri 10 (11%)
risultano tutti positivi con HPLC, con P/ACE 6 di questi
risultano positivi e 4 vengono classificati come dubbi , con
Capillarys i campioni positivi concordanti sono 6. Due dei
quattro campioni risultati negativi con Capillarys e positivi
con HPLC mostrano in CE % di CDT molto vicine al valore
soglia.
Discussione: In questo studio, anche se su un numero
limitato di campioni, i metodi presi in considerazione
hanno dimostrato una adeguata specificità (le
discrepanze sono legate a campioni con valori molto
vicini alla soglia), anche se con diversa sensibilità
nell’identificazione di isoforme particolari (varianti
genetiche) e con differenti caratteristiche di praticabilità e
produttività.
500
1
1
1
1
1
Servizio di Medicina di Laboratorio, IRCCS Policlinico
San Donato, San Donato Milanese
2
Unità Operativa di Ortopedia II, IRCCS Policlinico San
Donato, San Donato Milanese
Introduzione: La troponina T viene attualmente
considerata il più sensibile e specifico marcatore
biochimico di necrosi del miocardio. La Società Europea di
Cardiologia, l’American College of Cardiology (ESC/ACC)
e l’American Heart Association (AHA) offrono una nuova
definizione universale di infarto miocardico basata sul
riscontro di danno miocardico in relazione ad un aumento
delle concentrazioni ematiche di troponina T oltre il limite
del 99° percentile della popolazione di riferimento in un
contesto clinico di ischemia miocardica acuta.
Scopo: Lo scopo di questo studio è quello di valutare la
distribuzione dei valori di cTnT hs misurata mediante il
test troponina T hs (Roche Diagnostics Cobas e601) in
una popolazione di soggetti sani e caratterizzare la sua
relazione al genere ed all’età.
Materiali e metodi: È stata presa in considerazione una
popolazione di 274 soggetti candidati ad intervento di
chirurgia ortopedica (132 maschi e 142 femmine) con
un’età media (SD) di 56,07 (17,77) anni [intervallo: 15-91];
femmine 60,41 (16,78) anni, maschi 51,41 (17,68). La
presenza di patologie cardiache acute è stata esclusa
mediante l’anamnesi ed un’accurata valutazione clinica.
Risultati: Non si osservano differenze statisticamente
significative tra i valori di cTnT hs (media ± SEM) in uomini
e donne (uomini: 6,508 ng/L ± 0,6508, n=132; donne:
5,838 ng/L ± 0,5835 n=142; p=0,4431). I soggetti sono
stati suddivisi in 8 gruppi di età crescente ed è stata
effettuata un’analisi della varianza dalla quale emerge
che esiste una differenza statisticamente significativa tra
i diversi gruppi. In particolare si osserva un aumento
del valore medio di cTnT nel gruppo: età > 81. Media
± errore standard degli 8 gruppi: 10-20: 3,222 ng/L
±0,2222; 21-30: 4,063 ng/L±0,6799; 31-40: 3,792 ng/
L±0,5212; 41-50: 4,078 ng/L±0,5040; 51-60: 5,905 ng/
L±1,447; 61-70: 6,310 ng/L±0,8903; 71-80: 8,491 ng/L
±1,136; >81: 13,46 ng/L±2,611; p<0,0001.
Conclusioni. I nostri dati indicano che il valore di cut-off,
basato sul 99° percentile della distribuzione della cTnT
hs in una popolazione di soggetti sani, può cambiare
significativamente in base all’età della popolazione di
riferimento.
P059
ELETTROFORESI CAPILLARE: VALUTAZIONE DI UN
NUOVO STRUMENTO
1
1
2
3
P060
ELETTROFORESI IN TECNICA CAPILLARE E GEL
D’AGAROSIO PER LA IDENTIFICAZIONE DELLE
COMPONENTI MONOCLONALI DI PICCOLA ENTITÀ:
NOSTRA ESPERIENZA
A. Vernocchi , E. Longhi , M. Mussap , U. Basile
1
Servizio di Medicina di Lab., IRCCS Multimedica,
Milano
2
Lab. Centrale IRCCS San Martino e Ist. Naz. ricerca sul
cancro, Genova
3
Dip. di Medicina di Lab., Policlinico Gemelli, Roma
E’ stato valutato presso il nostro Laboratorio il
nuovo strumento V8-Elettroforesi Capillare (HelenaUK) commercializzato in Italia da Medical Systems,
per la separazione delle proteine sieriche, secondo
un dettagliato protocollo. Di seguito sono riportati in
sintesi i punti più significativi. Imprecisione: lo studio
dell’imprecisione nella serie e tra le serie è stata
effettuata su 3 diversi campioni per albumina, alfa1,
alfa2, beta1, beta2 e gamma globuline. Le prove “nella
serie” e “fra le serie” sono state eseguite secondo le
indicazioni di specifici e riconosciuti documenti. Essendo
la ricerca delle Componenti Monoclonali (CM) lo scopo
diagnostico principale della elettroforesi sierica, è stata
valutata anche l’imprecisione nella serie di una CM
(CV=1.5%). Sensibilità: la sensibilità è stata valutata su
un campione con una CM di 15 g/L. Per effettuare
le diluizioni della CM sono stati usati due campioni di
siero, uno con ipogammaglobulinemia ed un secondo
con normogammaglobulinemia. La sensibilità ottenuta è
stata di 0.4 g/L (sensibilità desiderabile non oltre 0.7 g/
L). Confronto con Capillarys (Sebia), strumento utilizzato
per la routine presso il nostro Laboratorio, con lo scopo
di valutare la correlazione delle concentrazioni di 61
differenti campioni con CM selezionati in tre differenti
2
Laboratori: R =0.9875. Complessivamente sono stati
eseguiti e confrontati tra i due sistemi dal 12 ottobre 2011
a tutt’oggi circa 2500 campioni. Interferenze analitiche:
E’ stata valutata l’interferenza da emoglobina (campione
con forte emolisi), da chilomicroni e da mezzi di contrasto
(MdC). E’ stata testata l’intererenza dei seguenti MdC:
MdC per coronarografia, MdC per TAC e gadolinio per
RMN. Lo studio è stato effettuato sia “in vivo” sia “in vitro”.
E’ stato inoltre valutato il carry over utilizzando un siero
con elevata CM ed un siero con ipogammaglobulinemia,
non evidenziando eventuale carry over causato dalla
CM. La produttività dello strumento è di 40 campioni/
ora reali, quindi più ridotta rispetto a quella di Capillarys
(Sebia), essendo il capillare dello strumento V8 di
una lunghezza maggiore (23 cm), ma la capacità di
risoluzione soprattutto nelle zone beta1 e beta2 è risultata
decisamente migliore, proprio per la differente lunghezza
del capillare.
1
1
1
M. Mosavat , A. Saccà , A. Andreozzi , G.
1
2
2
1
D’auria, , M.C. Stanziola , A. Castagliuolo , R. Iovine
1
ASL NA2 Nord, Laboratorio di Patologia Clinica,
Ospedale San Giuliano, Giuliano in Campania
2
ASL NA2 Nord, Laboratorio di Patologia Clinica,
Ospedale Rizzoli, Ischia
Obiettivo dello studio è stato, quello, di comparare
la elettroforesi sieroproteica, relativa ai campioni della
routine di una settimana, del metodo capillare versus
quella eseguita in agarosio per identificare e tipizzare
CM di valore ponderale medio e piccolo. Due operatori
esperti hanno ispezionato visivamente, in cieco, le due
serie di analisi di 416 reperti ciascuna. Per dirimere dubbi
o confermare le positività/negatività abbiamo utilizzato
il metodo Immunofissativo (IFE Interlab). Come tempi
operativi i due metodi hanno dimostrato una produttività
comparabile. Per i tempi di refertazione, la ispezione
visiva dei 416 grafici-capillare ha richiesto un tempo
superiore di 27’ rispetto al tempo impiegato per la
ispezione visiva delle ETF in agarosio. La concordanza
tra operatori nella individuazione dei campioni allarmati o
positivi è stata superiore per la tecnica in agarosio; 92%
contro 86%. I campioni falsi positivi sono stati in numero
superiore per l’agarosio (specificità diagnostica capillare
99.7% contro 98.5% agarosio). La sensibilità diagnostica
del metodo in agarosio è stata del 93,8 % (15 positivi,
per una prevalenza del 3.60%) contro il 65,2% del metodo
capillare (7 positivi, per una prevalenza dello 1.68%).
Riteniamo, infine, che tali differenze siano da imputare alla
maggiore sensibilità del metodo in agarosio, ma anche
ad una necessaria implementazione ed affinamento della
ispezione visiva dei grafici della capillare.
501
P061
ELETTROFORESI SU GEL D'AGAROSIO AD ALTA
RISOLUZIONE A COSTI CONTENUTI
1
1
1
1
P. Sacchi , A. Recchioni , S. Lodolini , M. Bassano , S.
1
2
Cicconi , M. Acetoso
1
U.O. Medicina di Laboratorio, Osp. B.Eustachio, San
Severino Marche, MC
2
U.O. Lab. Analisi, A.O. San Salvatore, Pesaro
Scopo del lavoro: proporre una metodica modificata, al
fine di ottenere una maggior risoluzione per la ricerca di
componenti monoclonali sieriche ed aumentare il valore
semeiotico dell'elettroforesi.
Materiali e metodi: Strumento Interlab G26, kit per
elettroforesi delle proteine del siero ß1 ß2 Interlab,
coloranti Acid blue ed Acid Violet.
Risultati: La metodica standard Interlab prevede una
migrazione di 8 min. a 400V ed una colorazione con
Acid blue per 4 min.; si ottiene un pattern elettroforetico
di 22 mm con separazione delle sieroproteine in sei
zone o bande distinte, ciascuna contenente una o più
proteine differenti. Sono stati analizzati 155 campioni,
provenienti da pazienti lungodegenti, oncologici ed in
larga maggioranza ultrasessantacinquenni. Ispezionando
visivamente i gel, difficilmente si percepivano quadri
di oligoclonalità, frequenti per la tipologia dei pazienti
studiati. Lo strumento Interlab G26 esegue in completa
automazione ogni fase del processo analitico (cadenza
analitica 117 test/h) e permette di applicare modifiche alla
metodica; le migliori condizioni operative, a nostro avviso,
prevedono una migrazione di 13 min. a 400V ed una
colorazione con Acid Violet per 10 min. In tal modo, si
ottiene un pattern elettroforetico di 35 mm. Analizzando
nuovamente i campioni, sono risultate apprezzabili la
banda della pre-albumina, l'eterozigosi dell'α1antitripsina,
tra le zone ß1 e ß2 una tenue banda relativa alla frazione
C4 del complemento, in zona anodica gamma una tenue
banda relativa a FDP; in caso di manifesto quadro
infiammatorio, in zona catodica gamma si è evidenziata
una banda omogenea relativa alla PCR. La zona gamma
è risultata ampiamente distesa ed in alcuni casi con
evidenti quadri di oligoclonalità in relazione all'età ed alle
patologie dei pazienti studiati. Le bande relative a C4,
FDP, PCR, α1antitripsina sono state tipizzate mediante
immunofissazione.
Conclusioni: l'applicazione della metodica modificata
non inficia in maniera significativa la produttività dello
strumento ed utilizzando il kit della metodica standard non
genera aumento dei costi.
502
P062
ETANOLO: CONFRONTO FRA CONCENTRAZIONE
PLASMATICA CON METODO ENZIMATICO E
CONCENTRAZIONE EMATICA IN HS-GC-FID
L. Gasbarri, S. Corezzi, S. Fabbroni, E. Luttini, F.
Mencaroni, D. Tavanti
U.O. Tossicologia, Lab. Anal. Osp. S.Donato, ASL8
Arezzo
Nel nostro Laboratorio l’etanolo viene dosato H24
nel plasma con metodo di screening enzimatico. I
campioni con valore legale positivi allo screening vengono
successivamente sottoposti a conferma HS-GC con
detector FID. In questo caso si utilizza sangue intero dalla
seconda provetta di prelievo. Per l’etanolo, il Codice della
Strada prevede infatti limiti di concentrazione nel sangue
intero.
Materiali e metodi: Il metodo di screening utilizza il
reattivo EtOH Flex Reagent Cartridge Siemens su
strumento Dimension RXL. L’etanolo è ossidato ad
aldeide acetica in presenza di ADH con riduzione del
NAD a NADH ed aumento di assorbanza a 340 nm. Il
range analitico è 0.03-3.0 g/L. Il metodo HS-GC prevede
la diluizione 1:6 del sangue intero con soluzione acquosa
contenente iso-propanolo come S.I. e (NH4)2SO4 1M
come agente di salting-out. L’analisi è effettuata su GC
Perkin Elmer Clarus 580 dotato di iniettore in spazio di
testa TurboMatrix 40 e detector FID (200 °C) gestito
dal programma TotalChrom Navigator. Il campione viene
termostatato per 15’ a 70 °C sotto agitazione ed analizzato
in isoterma a 40 °C su colonna Perkin Elmer Elite-BAC1
(30 m, 0.32 mm ID, 1.8 μm df) con flusso di He 2.0 mL/
min. I tr sono 2.58 min per l’etanolo e 3.91 min per lo S.I..
Il range di calibrazione è fino a 6.0 g/L.
Risultati: Delle 2 metodiche si è valutata precisione
fra le serie ed accuratezza. 50 campioni sono stati
analizzati con le 2 metodiche ed i valori di concentrazione
sono stati correlati utilizzando la regressione lineare
con metodo dei minimi quadrati (pendenza=0.872,
intercetta=-0.058, R=0.9914) e metodo di Passing e
Bablok (pendenza=0.855, intercetta=-0.040). I valori nel
sangue intero risultano circa il 15% in meno rispetto a
quelli nel plasma in accordo con il diverso contenuto di
acqua nelle due matrici. Emerge pertanto la necessità che
l’utenza sanitaria e l’Autorità Giudiziaria siano informati
della sovrastima del valore preliminare ottenuto nello
screening rispetto a quello definitivo ottenuto con la
conferma cromatografica.
Barnhill MT Jr, Herbert D, Wells DJ Jr. Comparison
of hospital laboratory serum alcohol levels obtained
by an enzymatic method with blood levels forensically
determined by gas-chromatography. J An Tox
2007;31:23-30.
P063
EVALUATION OF DIRUI ANALYZERS FOR URINE
CHEMISTRY AND URINE SEDIMENT ANALYSIS
1
1
2
2
D. Pesce , G. Cirillo , C. Gasparinetti , S. Michienzi
P064
EVALUATION OF SYSMEX XE-5000 FOR FLOW
CYTOMETRIC ANALYSIS OF PERITONEAL FLUID
G. Lippi, C. Cattabiani, D. Gennari, F. Pavesi, M.
Bardi, P. Bonelli, S. Pipitone
1
Lab. di Analisi Cliniche e Microbiologiche, Osp. Santa
Scolastica, Cassino
2
Servizi Diagnostici S.r.l., Roma
The aim of this study was to evaluate the urine analyzers
DIRUI H-800/FUS-100 for chemical and sediment
analysis, respect to systems of other brands, in terms
of reliability and analytical quality. Linearity, precision
and carryover were determined for both instruments. A
total of 550 urine samples was analyzed and the results
was compared in term of agreement/disagreement and
additional tests (clinical chemistry assay and manual
microscopic count) were carried out to validate the result.
For glucose, bilirubin, urobilinogen, blood, ketone and
nitrite results the percentage of agreement was greater
than 90%, less for leukocyte esterase and protein results
(79,1% and 74,4%, respectively). Analysis of discordant
results showed for H-800 a good correlation with clinical
chemistry analisys for bilirubin and low correspondence
for glucose and proteins. No supplementary tests
were available for urobilinogen and ketones. Results
in disagreement for blood, nitrite and leukocyte were
confirmed by manual microscope review: it showed for
H-800 a 37% of agreement for blood results, 80% for nitrite
and 57% for leukocytes. Urine samples with abnormal
or high abnormal microalbumin/creatinine ratio (M:C) by
H-800 were tested with an immunoturbidimetric assay
that confirmed the 100% of samples with normal M:C
and 43% with abnormal and high abnormal M:C. RBCs,
WBCs, squamous and not squamous epithelial cells,
pathological casts, hyaline casts and yeasts showed
results with high percentage of agreement on the systems.
Only crystals and bacteria data showed results with
substantial disagreement. Review of the manual count
on disagreement samples showed that the FUS-100 was
correct on 71% of samples for RBCs, 79% for WBCs,
85% for SECs, 88% for NSECs, 22% for pathological
casts, 78% for hyaline casts, 79% for yeast, 88% for
crystals and 47% for bacteria. Precision and linearity
were good for both DIRUI instruments and no carryover
effect was observed. Based on the results of this study
DIRUI H-800 for urine chemistry combined with FUS-100
for urine sediment may led to a clinically acceptable
urinalysis system. Both instruments have good precision
and linearity, are free of sample carryover and they
performed well both technically and operationally during
the evaluation period.
Unità Operativa Diagnostica Ematochimica, Azienda
Ospedaliero-Universitaria di Parma, Parma.
Background: Ascites, a term that defines the accumulation
of fluid within the peritoneal cavity, is a frequent side
effects of several localized and systemic disorders.
Although the gold standard for laboratory assessment
of ascites is based on manual microscopic analysis and
entails total cell and cytocentrifuged differential counts,
automated flow cytometry may be effective to overcome
most of the drawbacks of manual enumeration and
identification. Therefore, the aim of this study was to
evaluate the performances of the novel Sysmex XE-5000
(Dasit SpA) for flow cytometric analysis of peritoneal fluid.
Materials and methods: The comparison studies were
performed by analysis of 118 consecutive peritoneal
fluid samples collected from inpatients in EDTA. The
white blood cell (WBC), total nucleated cell (TNC),
polymorphonuclear cell (PMN), monocyte (MONO) and
Other cell counts were compared with manual microscopy
on Nageotte chamber after staining with Turk's and MayGrunwald-Giemsa reagents, or with results obtained on
the same samples on a Sysmex XE-2100.
Results: The comparison between XE-5000 and
microscopic analysis yielded the following results (with
mean bias and 95%CI): TNC r=0.97 (40; -110 to 180 /μL;
p=0.61), WBC r=0.97 (10; -140 to 150 /μL; p=0.92), PMN
r=0.95 (40; -120 to 200 /μL; p=0.62), MONO r=0.96 (10;
-40 to 50 /μL; p=0.72), and Other r=0.63 (30; 20 to
40 /μL; p<0.01), with all correlations being p<0.001. The
corresponding figures for comparison of XE-5000 with
XE-2100 were TNC r=0.98, WBC r=0.98, PMN r=0.96,
MONO r=0.98, and Other r=0.71 (all p<0.001). Even more
interestingly, at the diagnostic threshold of 500 /μL for
peritonitis, the agreement between XE-5000 and manual
microscopy was perfect (kappa statistics 1.00; p<0.001),
and thereby displaying both sensitivity and specificity of
100%.
Conclusions: The results of this study reveal extraordinary
performance of the Sysmex XE-5000 for flow cytometric
analysis of peritoneal fluids when compared with manual
microscopy, that is the current gold standard.
503
P069
IS THE C3-EPIMER OF D3 RESPONSIBLE OF THE
BIAS OBSERVED BETWEEN IMMUNOASSAY AND
LC-MS/MS VITAMIN D DETERMINATION?
P070
LA DETERMINAZIONE DELLA RENINA
CON METODO CHEMIOLUMINESCENTE
AUTOMATIZZATO
G. Canu, J. Gervasoni, A. Cocci, C. Zuppi, C.
Carrozza, S. Persichilli
A. Fortunato, C. Marchetti, G. Secco, G. Soffiati
Laboratorio Analisi I, Policlinico Universitario
“A.Gemelli”, Roma
Background: Total 25-hydroxy vitamin D concentration
(25-OHD2+25-OHD3) is considered a reliable measure
of vitamin D status. Results from current methods
show a great inter-assays variability despite the
introduction of certified reference material have enhanced
agreement between different methods. Nevertheless,
some unexplained factors continue to confound 25OHD measurement. Several studies indicated that the
presence of 25-OHD epimer (epi-25-OHD) could be
a potential confounder. The presence of this epimer
was initially considered relevant only in children but
recently epi-25-OHD was observed in adults. The current
methods for 25-OHD determination are immunoassays
and high-performance liquid chromatography tandem
mass spectrometry (HPLC-MS/MS). According to results
of our previous paper and to literature data, a positive
bias between LC-MS/MS vs immunoassays methods was
found. Aim of study was to investigate if epi-25-OHD
could be responsible of the bias between LC-MS/MS
and immunoassay measurement. For this purpose, we
analyzed vitamin D using two commercial LC-MS/MS kits
of which only one able to selectively separate epi-25OHD from 25-OHD, and results were compared to an
immunoassay method (ECLIA) that declare not crossreactivity with epi-25-OHD.
Methods: 25-OHD levels in 50 serum samples from adult
healthy subjects was measured using Liaison, automated
chemiluminescence method and two different commercial
kits (Chromsystem and PerkinElmer) on an HPLC-MS/
MS. PerkinElmer kit with a longer chromatographic run
permits to separate epi-25-OHD from 25-OHD.
Results: A general good correlation was shown
among the three methods studied: DiaSorin vs
PerkinElmer, R2=0.91; DiaSorin vs Chromsystems,
R2=0.90; Chromsystems vs PerkinElmer, R2=0.87.
Vitamin D mean concentrations obtained by the
immunoassay method were lower than those measured
by LC-MS/MS using both kits. The percentage difference
between both LC-MS/MS and immunoassay methods
ranged from from 1.0 to 25%. The presence of epi-25OHD was detected in 46 of 50 samples. The ratio (%)
epi-25-OHD/25-OHD ranged from 0 to 3.0%.
Conclusion: Low epi-25-OHD levels measured with
PerkinElmer kit, even if observed in 92% of patients could
not justify the bias between LC-MS/MS and immunoassay
results.
Carter GD. Accuracy of 25-hydroxyvitamin D assays:
confronting the issues. Curr Drug Targets 2011;12:19-28.
506
Introduzione: la renina ha una funzione di primo piano
nella regolazione della pressione arteriosa ed è coinvolto
nei processi fisiologici che inducono l'ipertensione
arteriosa. La determinazione dei livelli plasmatici di renina
possono essere valutati per indagare l'origine di particolari
forme ipertensive. In questo studio sono state valutate le
prestazioni di un metodo di recente commercializzazione
per la determinazione della renina attiva.
Materiali e metodi: sono stati confrontati i risultati
ottenuti in 136 campioni di plasma EDTA con il sistema
automatizzato iSYS (IDS) rispetto a quelli ottenuti con
i metodi Liaison (DiaSorin) e IRMA (CISbio) secondo
le indicazioni del documento CLSI EP-9A2; negli stessi
campioni è stata misurata l’attività reninica plasmatica
con il metodo RIA PRA (DiaSorin). Sono state valutate
anche le prestazioni analitiche del nuovo metodo secondo
i documenti CLSI EP17-A per la sensibilità e EP05-A2 per
la precisione.
Risultati: la regressione di Passing-Bablok del sistema
iSYS verso il metodo Liaison mostra una pendenza di
1,11 (IC95% = 1,07–1,13) ed una intercetta di 0,53
(IC95% = -0,24–1,22), verso il metodo CISBio mostra
una pendenza di 1,11 (IC95% = 1,04–1,20) ed una
intercetta di -2,34 (IC95% = -3,87–0,37), verso il metodo
PRA (μU/mL vs ng/mL/h) mostra una pendenza di
41,9 (IC95% = 37,8–47,5) ed una intercetta di -7,4
(IC95% = -11,5 – -3,7). Il coefficiente di correlazione
di Pearson è risultato di 0,993 (IC95%=0,991-0,995 e
P <0.0001), 0,981 (IC95%=0,974-0,988 e P <0.0001) e
0,923 (IC95%=0,894-0,945 e P <0.0001) rispettivamente
per iSYS verso Liaison, CISbio e PRA. Nella valutazione
della ripetibilità sono stati riscontrati valori di CV compresi
tra 2,5 e 5,4 per le determinazioni nella serie e tra 1,5
e 6,1 tra le serie per concentrazioni da 17,1 a 437 μU/
mL. La sensibilità analitica (LoB) è risultata di 0,9 μU/mL,
mentre quella funzionale (LoQ) di 4,6 μU/mL. Nella prova
di diluizione la correlazione tra valori osservati ed attesi
ha mostrato una pendenza di 1,00 (IC95% = 0,985–1,023)
ed una intercetta di -0,46 (IC95% = -11,5– -0,25) con un
coefficiente di Pearson di 0,9996 (IC95%=0,9989-0,9999
e P <0.0001).
Conclusioni: IDS-iSYS ha mostrato risultati sovrapponibili
ai metodi di confronto e buone prestazioni analitiche.
P071
LA GFR DELLA CISTATINA C: ALCUNE
CONSIDERAZIONI
P072
MORFOLOGIA URINARIA IN AUTOMAZIONE SU
SYSMEX UF-1000i: UN PITFALL “AL FEMMINILE”
L. Bassi, M. Mariani, L. Pizzi, A. Sarzi Amade', S.
Sudati, S. Testa
M. Fumi, M. Melorio, Y. Pancione, A. Pesaturo, V.
Piscopo, S. Sale, V. Rocco
Laboratorio Analisi chimico cliniche e microbiologia,
Azienda Istituti Ospitalieri, Cremona
UOC Patologia Clinica, A.O.R.N. "G. Rummo" di
Benevento
La cistatina C (Cys-C), proposta come marker di danno
renale,è dipendente quasi interamente dalla GFR. La
necessità di individuare un marcatore di danno renale
più sensibile della creatinina e la possibilità di dosare la
Cys-C su piattaforme di chimica clinica in turbidimetria
rende interessante valutare un’equazione per il calcolo
della GFR specifica.
Scopo: Scopo è valutare una equazione per il calcolo della
eGFR-Cys-C e definire un possibile valore di cut off.
Materiali e metodi: Sono state dosate creatinina, con
metodo enzimatico, e Cys-C,con reattivo Gentian, su
strumentazione AU2700 (Beckman), su donatori uomini
(159) e donne (150) e su 60 pazienti ricoverati in
nefrologia e dialisi. Il calcolo della GFR della creatinina è
stato eseguito secondo la formula MDRD a 4 parametri,
mentre la GFR della Cys-C è stata calcolata con la formula
elaborata e validata da Flodin (Scan J Clin Lab Invest
2007;67:560-7) per il reattivo Gentian (correlazione alla
iohexol clearance). L’analisi statistica, eseguita con il
software MedCalc, ha previsto la definizione dell’intervallo
di riferimento con eliminazione degli outliers (test di
Tukey), la valutazione della distribuzione normale dei dati
(D’Agostino–Pearson) e il calcolo dell’intervallo al 95%
lato sinistro della distribuzione.
Risultati: I risultati della GFR creatinina dei donatori
sono espressione di assenza di problemi renale secondo
le indicazioni della linea guida NKDEP (valore minimo
I pitfalls sono trappole in grado di alterare i dati numerici
citometrici e che bisogna conoscere bene al fine di
evitarle.
Scopo del lavoro: Il riconoscimento dei pitfalls è
essenziale per il miglioramento dell’accuratezza e, tutto
il personale di laboratorio, che esegue e referta i test in
urgenza, deve essere in grado di riconoscerli.
Metodologia: Il citofluorimetro Dasit SYSMEX UF-1000i,
tramite dimensionamento FSC, complessità cellulare
SSC e fluorescenza alta FLH e bassa FLL, è in
grado di fornire citogrammi e di distinguere le varie
popolazioni cellulari urinarie, con notevole vantaggio
nella individuazione delle microematurie. In alcuni
pazienti, l’analizzatore forniva un dato numerico da
presenza di globuli rossi non confermato né dal
controllo biochimico (assenza di emoglobina), né da
quello microscopico. In essi, tuttavia il citogramma di
ricerca FSC/SSC evidenziava la comparsa di una “falce”
costituita da elementi che, per complessità e dimensioni,
venivano identificati dallo strumento come globuli rossi,
determinandone così una sovrastima. Tale flag era simile
a quello che gli analizzatori ematologici producono con
di campioni di sangue midollare per presenza in essi di
goccioline di grasso.
Risultati: Il pitfall interessava circa l’1.6% dei campioni,
era assente nei soggetti di sesso maschile, mentre
in quelli di sesso femminile interessava solo donne
di età inferiore a 65 anni. Inoltre si aveva una sua
riduzione quando venivano raccolti 3 campioni per
la conta di Addis. Queste valutazioni, unitamente al
controllo microscopico, evidenziante formazioni che, per
rifrangenza ed eterogeneità delle dimensioni, non erano
classificabili come emazie, orientavano per inquinamento
da detergenti. L’ipotesi veniva suffragata dalla scomparsa
del flag nei soggetti interessati, al controllo eseguito dopo
lavaggio dei genitali solo con acqua corrente.
Conclusioni: La citofluorimetria per l’esame morfologico
delle urine, è una tecnologia sensibile ed accurata
che evidenzia in misura maggiore le criticità della fase
preanalitica e che presuppone delle buone capacità da
parte dell’operatore nell’interpretazione dei citogrammi al
fine di migliorare l’accuratezza del risultato fornito.
uomini 131.97 mL/min/1.73m
2
/ donne 131.48 mL/
2
min/1.73m ) e il valore minimo della GFR-Cys-C è risultato
2
71.54 mL/min/1.73m per gli uomini (CI 66.3/76.8) e 84.51
2
mL/min/1.73m (CI 78.9/90.0) per le donne. I pazienti
provenienti da nefrologia e dialisi presentano per GFR
2
creatinina valori da 3.0 a 27.0 mL/min/1.73m e da 4.0 a
2
28 mL/min/1.73m per GFR Cistatina. Le due popolazioni
risultano nettamente separate.
Conclusioni: La GFR della cistatina può essere utilizzata
per individuare pazienti con danno renale, ma utilizzando
la formula validata per il metodo in uso. Gli studi in corso
sulla standardizzazione del metodo potranno portare a
definire un unico tipo di calcolo per GFR Cys-C e renderla
un sensibile marcatore di danno renale e risolvere i
problemi legati alla non uniformità dei risultati.
507
P073
NUOVO METODO GC-FID PER L’ANALISI RAPIDA
DEL COLESTEROLO E DEL 7-DHC DA SPOT
DI SANGUE INTERO SU CARTA BIBULA PRETRATTATA CON STABILIZZANTE
1
1
1
2
S. Clericuzio , M. Gelzo , R. Barone , G. Corso , A.
1
Dello Russo
1
Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche,
2
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale,
Università degli Studi di Foggia
Obiettivi: 1) Implementare un metodo GC-FID per l’analisi
del colesterolo (CHOL) e del 7-deidrocolesterolo (7-DHC)
da spot di sangue intero (DBS) per la diagnosi della
sindrome di Smith-Lemli-Opitz (SLOS). 2) Stabilizzare gli
steroli nei DBS mediante l’utilizzo di un antiossidante
aggiunto alla carta bibula.
Metodi: I DBS sono stati preparati mediante deposizione
del sangue intero su carta pre-trattata con idrossitoluene
butilato (BHT). L’efficacia dell’antiossidante sulla stabilità
degli steroli nel DBS è stata valutata su 5 campioni reali
preparati con carta trattata e non trattata con BHT. Gli
steroli sono stati determinati entro 24 h dalla preparazione
dei DBS e la stabilità a 4 °C è stata monitorata per
56 giorni. Gli steroli sono stati estratti da un dischetto
di 6 mm, ed analizzati mediante GC-FID in meno di 9
min. Per la validazione del metodo abbiamo valutato:
selettività, linearità, imprecisione, accuratezza, efficacia
di estrazione e carry-over. L’imprecisione e l’accuratezza
del metodo è stata valutata su tre campioni di controllo,
a differenti livelli di concentrazione (neg-QC, pos-QC-L e
pos-QC-H), preparati con emazie negative mescolate a
un pool di plasma negativo e due livelli di un pool positivo.
Risultati: Nei DBS senza BHT, dopo 56 giorni, la
concentrazione di 7-DHC ed il rapporto 7-DHC/CHOL
erano ridotti del 72.7% e 80.9%. Nei DBS con
BHT le variazioni osservate non erano statisticamente
significative. Il metodo è risultato lineare per il CHOL da
1.72 a 110.0 mg/dL (r = 0.9993), e per il 7-DHC da 0.63
a 40.5 mg/dL (r = 0.9988). L’imprecisione e l’accuratezza
nel giorno erano rispettivamente inferiori a 9.5% e 9.7%
per il CHOL, e inferiori a 4.4% e -4.3% per il 7-DHC.
L’imprecisione e l’accuratezza tra i giorni erano inferiori a
7.1% e 7.3% per il CHOL, e inferiori a 14.8% e -13.1% per
il 7-DHC. I rapporti 7-DHC/CHOL nei DBS e nei plasmi di
8 pazienti variavano da 0.035 e 1.448 e da 0.012 e 0.926,
rispettivamente, ed erano significativamente differenti dai
valori ottenuti nei 30 soggetti non affetti (p<0.05).
Conclusioni: L’analisi del CHOL e 7-DHC da DBS
mediante GC-FID mostra buoni parametri analitici e
può essere utile per lo screening della SLOS. La
carta pre-trattata con BHT previene significativamente la
degradazione del 7-DHC nei DBS conservati a 4 °C per
almeno 56 giorni.
508
P074
PERFORMANCE OF ACMIA METHOD FOR THE
QUANTIFICATION OF BLOOD TACROLIMUS
1
2
1
M. Tempestilli , E. Di Stasio , M.R. Basile , F.
1
1
Elisei , L.P. Pucillo
1
Clinical Biochemistry and Pharmacology Laboratory,
National Institute for Infectious Diseases “L.Spallanzani”
IRCCS, Rome, Italy
2
Institute of Biochemistry and Clinical Biochemistry,
Catholic University of Sacred Heart, Rome, Italy
Background: Therapeutic drug monitoring (TDM) of
Tacrolimus (TACRO) is particular important in patients
who undergo solid organ transplantation. In fact TACRO
has a narrow therapeutic range, and the failure to
comply with is associated with under-immunosuppression
or various toxicities and potential drug interactions.
Affinity Column Mediated Immunoassay (ACMIA) a fully
automated method for TDM of TACRO, not requiring
the precipitation step, may represent an efficient and
simple alternative to other methods that request sample
preparation. The aim of this work was to compare the
analytical performances of ACMIA to LC-MS/MS as the
reference method.
Methods: Performance characteristics of ACMIA were
evaluated using samples spiked with tacrolimus and
quality control materials. Two hundred and four whole
blood samples from patients who received liver (n=65) or
kidney (n=24) transplant were assayed by ACMIA and LCMS/MS. Standard statistical analysis was performed for
methods comparison.
Results: On artificially spiked samples, the average
difference between results obtained by ACMIA and
LC-MS/MS was 0.28±0.58 ng/mL (2.98±7.23%). Cross
checking of calibrators and controls by both methods were
in accordance with the nominal concentrations of TAC.
The Limit of Quantification (LOQ) of ACMIA was found to
be 2.8 ng/mL. The overall comparison of results obtained
on 204 routine samples with the two methods generated
the following results: Pearson coefficient was 0.886,
p<0.0001; Spearman’s correlation was 0.906, p<0.0001.
ACMIA in respect to LC-MS/MS values, gave a slope of
1.199 ± 0.044 and an intercept of 0.638 ± 0.298 by Deming
regression and a mean positive bias of 1.83 ± 1.63 ng/mL
by Bland-Altman analysis.
Conclusions: ACMIA is a good assay for therapeutic drug
monitoring of TAC, with good analytical performances
when performed on samples with TACRO concentrations
within the therapeutic range. Results obtained by ACMIA,
must be interpreted cautiously in samples with lower TAC
concentrations (<5 ng/mL).
Griffey MA, Hock KG, Kilgore DC, et al. Performance of
a no-pretreatment tacrolimus assay on the Dade Behring
Dimension RxL clinical chemistry analyzer. Clin Chim Acta
2007;384:48-51.
P075
PRESTAZIONI ANALITICHE DEL SISTEMA IDS-iSYS
PER LA DETERMINAZIONE DEL PTH INTATTO
Introduzione: Numerosi studi hanno dimostrato la
mancanza di confrontabilità dei risultati ottenuti con i
differenti metodi disponibili per la determinazione del
PTH e la difficoltà nel raggiungere una loro adeguata
standardizzazione. In questo studio sono state valutate le
prestazioni del metodo IDS-iSYS Intact PTH, riguardo alla
sensibilità analitica, la ripetibilità, gli intervalli di riferimento
ed il confronto con altri sistemi automatizzati.
Materiali e metodi: Il profilo di precisione e la sensibilità
sono stati valutati con 11 pool di sieri. Per il confronto
dei metodi sono stati analizzati i campioni di 218
pazienti sottoposti a dialisi (52 in dialisi peritoneale e
156 in emodialisi) e 169 soggetti, presunti sani, con i
sistemi iSYS (IDS), ADVIA Centaur (Siemens) e Liaison
(DiaSorin). Il calcolo degli intervalli di riferimento per i
soggetti sani è stato effettuato secondo il documento CLSI
C28-A3.
Risultati: Nella valutazione della sensibilità analitica del
metodo IDS-iSYS il valore di LoQ ottenuto è stato
< 5 pg/mL. I valori di CV del profilo di imprecisione
sono risultati compresi tra 0,7 e 8,3% nell’intervallo da
20,3 a 2120 pg/mL. Le equazioni di regressione trovate
sono: Centaur=1,37iSYS+5,9 (r=0,995 e P<0,0001),
Liaison=1,15iSYS+9,4 (r=0,934 e P<0,0001). Gli intervalli
di riferimento, relativi al 95% centrale della distribuzione
dei risultati ottenuti, sono risultati 10,9-71,0 11,5-50,3
e 18,0-82,0 pg/mL rispettivamente per Centaur, iSYS e
Liaison.
Conclusioni: Le caratteristiche analitiche del metodo IDSiSYS Intact PTH si sono dimostrate confrontabili con
quelle degli altri sistemi automatizzati. Sebbene si sia
dimostrata una buona correlazione tra i risultati ottenuti
tra i sistemi valutati per la misura del PTH intatto, questo
studio ha confermato le differenze, proporzionali ai livelli
di concentrazione, tra i vari metodi.
P076
PSA LIBERO E TOTALE DUE METODI A
CONFRONTO: MODULAR E170 (ROCHE
DIAGNOSTICS) E ADVIA CENTAUR XP (SIEMENS
HEALTHCARE DIAGNOSTICS)
R. Fucci , I. Paganini , F. Morandini , C. Gattini , B.
Salvadori , F. Veroni , F. Martone , R. Girolami , A.
Ognibene
Dipartimento di Diagnostica di Laboratorio, Laboratorio
Generale, Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi,
Firenze
Introduzione: La misura dell’antigene prostatico specifico
(PSAt) e della sua frazione libera (PSAl) è ampiamente
utilizzata nella pratica clinica come marcatore del cancro
alla prostata (PCa). L’obiettivo di questo studio è di
valutare i metodi di misura di questi parametri eseguiti
sull’Advia Centaur XP (Siemens Healthcare Diagnostics).
Materiali e metodi: La valutazione del profilo di
imprecisione dei metodi è stata eseguitacome descritto
nelle linee guida NCCLS (protocollo EP-5, Evaluation
of Precision Performance of Quantitative Measurement
Methods); a questo scopo sono stati utilizzati sieri di
controllo a due diversi livelli di concentrazione (Biorad).
Per il confronto tra metodi il PSA totale e libero è stato
misurato in 62 campioni precedentemente analizzati con
lo strumento Modular E170 (Roche Diagnostic). Il rapporto
tra il PSA Libero e Totale è stato calcolato per ogni
paziente. I risultati ottenuti con i due strumenti, compreso
il rapporto calcolato PSAt/PSAl sono stati sottoposti ad
analisi Bland-Altman e Passing-Bablok.
Risultati: La valutazione dell’imprecisione intra-assay del
metodo ha mostrato un CV% di 2.7 e 2.8 per il PSA totale
e libero rispettivamente per il livelli 1, e un CV% di 2.3 e
1.1 per il PSA totale e libero rispettivamente per il livello 2.
L’imprecisione inter-assay del metodo ha mostrato un CV
% di 3.4 e 5.9 per il PSA totale e libero rispettivamente per
il livelli 1, e un CV% di 3.8 e 2.4 per il PSA totale e libero
rispettivamente per il livello 2. I metodi hanno rilevato una
buona correlazione (PSA tot. y = 0.8973x - 0.4325, PSA
libero y = 1.1514x + 0.017) ma una sovrastima sistematica
del PSA libero e una sottostima meno rilevante del PSA
totale.
Conclusioni: I risultati ottenuti hanno dimostrato un’ottima
performance analitica per i metodi oggetto dello studio,
anche se, al momento dell’adozione, dovranno essere
opportunamente adeguati gli intervalli di riferimento.
509
P079
UN NUOVO SENSIBILE METODO PER LA RICERCA
DELLA PROTEINA DI BENCE JONES SU URINE NON
CONCENTRATE
P080
URINE PROTEIN PROFILING BY MALDI-TOF/MS:
NORMALIZATION AND REPRODUCIBILITY
1
A. Vernocchi, E. Longhi, R. Forotti, G. Lucatello
Servizio di Medicina di Lab., IRCCS Multimedica, Milano
La ricerca della proteina di Bence Jones (BJ) nelle
urine riveste un ruolo diagnostico di grande importanza.
Abbiamo valutato presso il nostro Laboratorio l’utilizzo
di due anticorpi prodotti dalla ditta BIOCI (Torino),
rispettivamente anti catene leggere libere (CLL) k e
lambda miscelati in un unico reagente pronto all’uso.
Lo scopo dello studio è stato quello di valutare la
sensibilità dei due nuovi anticorpi (BIOCI) applicati
a tre differenti sistemi in agarosio con metodo IFE
(immunofissazione) disponibili in commercio: Hydrasys Sebia, SAS- Helena e Easy Interlab G26 – Interlab. E’
stata utilizzata per i tre sistemi una particolare mascherina
con una superficie idrofoba ed una idrofila allo scopo di
ottimizzare la reazione antigene-anticorpo che avviene
nel gel di agarosio. Sono stati preparati due materiali
a titolo noto di CLL k e lambda (separati e purificati
per immunoaffinità) mediante lettura spettrofotometrica
a 280 nm, allo scopo di ottenere con opportuni calcoli
una concentrazione di 100 mg/L per entrambe le CLL;
per verificare tale concentrazione sono stati eseguiti i
dosaggi immunonefelometrico e con test colorimetrico al
Pirogallolo. Le due soluzioni di CLL k e lambda sono state
opportunamente diluite allo scopo di valutare la sensibilità
(e la specificità) dei due nuovi anticorpi sui tre sistemi di
agarosio utilizzati nello studio. Sono stati selezionati nel
nostro Laboratorio 100 campioni di urine con proteina di
BJ, e sono stati confrontati i risultati tra il metodo utilizzato
nel nostro Laboratorio (Hydragel 4 IF- SEBIA) ed il nuovo
metodo in valutazione. I tre sistemi in agarosio hanno
dimostrato una elevata sensibilità, ovvero inferiore a 10
mg/L come indicato dalle linee guida, e precisamente
di 6.25 mg/L sia per le CLL k, sia per le CLL lambda.
In conclusione, alla luce della elevata sensibilità, della
facile praticabilità, dell’uso di urine non concentrate con
conseguente riduzione dei costi sia dal punto di vista dei
reagenti che dei sistemi per la concentrazione delle urine,
riteniamo di poter affermare che l’utilizzo di questi due
nuovi anticorpi possa rappresentare un efficace sistema
per la ricerca della proteina di Bence Jones nelle urine,
facilmente praticabile in tutti i Servizi di Medicina di
Laboratorio.
2
1
2
M. La Malfa , A. Padoan , D. Basso , C. Zambon , S.
2
2
1
2
Moz , D. Bozzato , P. Fogar , E. Greco , F.
1
3
2
Navaglia , G. Pavanello , M. Plebani
1
Department of Laboratory Medicine, University-Hospital
of Padova, Padova
2
Department of Medicine – DIMED, University of
Padova, Padova
3
SIPRES, Gruppo Pavanello, Padova
Objectives: MALDI-TOF/MS analysis is accurate for
peptides/proteins identification, but only few studies have
addressed its analytical variability for the urine matrix. We
evaluated intra- (CVw) and inter-assay (CVb) variability
of MALDI-TOF/MS urinary profiling comparing the results
obtained using three different normalization strategies:
internal standard (SI), relative intensity (RI) and total ion
current (TIC).
Methods: Fresh urine from 10 healthy subjects were
pooled, aliquoted and immediately frozen at -80 °C. To
estimate CVb, every day and for 14 days one aliquot
was thawed, dialyzed at 4 °C (1kDa) before MALDI-TOF/
MS analysis (Bruker Daltonics). For CVw one aliquot was
thawed, dialyzed and then spitted in 20 new aliquots,
which were independently analysed. Before dialysis, each
urine aliquot was added with a 1589.9 m/z peptide at
12.58 pmol/uL (internal standard). Flex Analysis was
used for baseline subtraction and peaks detection. Peak
intensities were divided by the intensity of the internal
standard (SI), the intensity of the most abundant peak (RI)
or by TIC, obtained by averaging all spectra’s TIC.
Results: In a mass range of 1050 to 4000 m/z, we
identified from the analysis of all 14 spectra for the CVb
a total of 134 peaks, and a total of 81 peaks from the
20 spectra for CVw. With the SI, RI, TIC normalization,
the mean CVb% [95%CI] were: 228.9[214.1-243.6],
158.3[137.0-179.5], 156.6[135.3-177.8], while CVw%
[95%CI] were: 199.9[171.9-227.8], 151.0[116.7-185.2],
149.4[115.1-183.7], respectively. These high CVs were
due, at least in part, to the presence of an overall
high number of low abundant features, alternatively
undetectable or fairly detectable. To overcome this
bias we evaluated, for each normalization method,
whether a detection cut-off limit might improve CVs
by checking a 0.2% to 5% range values. The best
combination between CVs and the number of detectable
features were 4%, 2.5% and 0.5 % for the SI,
RI and TIC respectively. SI, RI, TIC mean CVb%
were: 192.7[177.8-207.6], 40.1[34.2-46], 39.0[33.6-45.2],
while the mean CVw% were: 120.6[108.7-132.6],
40.1[33.9-46.3], 36.9[31.1-42.8], respectively.
Conclusion: For the MALDI-TOF/MS analysis of urine, TIC
normalization should be preferred with respect to RI and
SI.
511
P081
UTILIZZO LINEE GUIDA CLSI EP-6A (CLINICAL
AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE)
PER LA VALIDAZIONE DELLA LINEARITA’
DI UN ANALIZZATORE IN CONTINUO DELLA
FUNZIONALITA’ RENALE
1
1
1
1
Servizio Universitario di Medicina di Laboratorio,
Ospedale di Desio, Desio (MB)
2
DIMS, Medicina e Chirurgia, Università Milano Bicocca
3
Orvim s.r.l., Paderno Dugnano (MI)
4
Kardia s.r.l., Milano
Scopo: Lo strumento King (Kidney Instant MonitoringKardia-Orvim) in valutazione presso l’U.O. di Patologia
Clinica dell’Ospedale di Desio è il primo analizzatore
in continuo della concentrazione urinaria di ioni H+,
Na+, K+, Cl-, NH4+ e della diuresi. La validazione
strumentale secondo le linee guida CLSI comprende 5
fasi: 1-preliminare, 2-linearità, 3-precisione, 4-LoB (Limit
of Blank) / LoD (Limit of Detection) / LoQ (Limit of
Quantitation), 5-interferenti. Scopo di questo lavoro è la
validazione della fase di linearità. Per linearità si intende
la capacità dello strumento di fornire risultati che sono
direttamente proporzionali alla concentrazione di analita
presente nel campione in esame. In particolare tale fase
permette di verificare il range di linearità stabilito dal
produttore dello strumento in valutazione.
Materiali e metodi: Tutti i campioni provengono da
urine-24 ore di pazienti afferenti al Centro Prelievi
dell’Ospedale di Desio. Per la fase di linearità si applicano
le linee guida CLSI EP6-A1: per ogni analita (H+, Na+, K
+, Cl-, NH4+) si preparano 11 campioni a concentrazione
scalare e si analizzano in triplicato. Tutte le determinazioni
sono eseguite in parallelo su due strumenti King 01 e
King 02 e ogni analita con il metodo di riferimento: Na
+/K+ = fotometria a fiamma (I.L.), Cl- = potenziometria
diretta (Modular, Modulo ISE, Roche), NH4+ = colorimetria
(Cobas Integra, Roche), pH = pH-metria ( Deltaohm).
Risultati: I range strumentale di linearità dichiarati dal
produttore (mmol/L) sono i seguenti: Cl- = 10-400, K+ =
1-150, Na+ = 1-250, pH = 3,5-8,5, NH4+ = 1-100.
Conclusioni: Il nostro lavoro ha permesso di confermare
su entrambi gli strumenti valutati i range di linearità
dichiarati dal produttore. Sarà quindi possibile procedere
alla fase di valutazione di possibili interferenti presenti
in urine di pazienti ricoverati presso unità di terapie
intensive.
CLSI. Evaluation of the linearity of quantitative
measurement procedures. CLSI document EP6-A. CLSI,
Wayne, PA, 2003.
S. Buoro, S. Apassiti, R. Gustinetti, C. Salieri, P.
Filisetti, M. Alessio, C. Galliani, P. Gherardi, E.
Lochis, G. Azzara, A. Crippa
3
S. Signorelli , L. Invernizzi , R. Falbo , I. Negrelli , R.
3
4
2
Orsenigo , G. Longoni , P. Brambilla
512
P082
VALIDAZIONE DI SYSMEX UF1000I PER ESAME
CITOMETRICO AUTOMATIZZATO DEL LIQUOR
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Az. Osp. Ospedali Riuniti,
Bergamo
Obiettivo: Nella moderna organizzazione di Laboratorio
l’automazione dell’esame citometrico del Liquor (CSF) è
un obiettivo cogente. Questo studio si propone di validare
l’impiego di UF1000i in funzione delle specifiche e dei cutoff patologici indicati dalle Linee Guida (LG) CLSI H56-A.
Materiali e metodi: 76 campioni nativi di CSF raccolti
in provette sterili con cellularità da 0 a 367 WBC/μL
sono stati analizzati su UF1000i. Il conteggio WBC è
confrontato con metodo di riferimento MO: conteggio
in camera di Nageotte e classificazione morfologica su
citocentrifugato. 33 dei 76 campioni esaminati (43,4%)
avevano conteggio a MO>5 WBC/μL. La concordanza tra
metodi è valutata con correlazione Pearson (coefficiente
r), regressione Passing-Bablok, Bias Bland-Altman;
l’accuratezza diagnostica con analisi curve ROC. Su
campioni omogenei, costituiti da pool di surnatanti di CSF
a cui sono stati aggiunti leucociti ottenuti da buffy-coat di
sangue intero, è stato valutato: il profilo di imprecisione
con 10 ripetizioni su 3 campioni con valore medio di WBC
da 3,5 a 28,8/μL; il carry over (CO) secondo LG ICSH 1994
su campioni in tre serie distinte con WBC da 93 a 132/μL.
Risultati: Si evidenzia ottima correlazione per il
conteggio WBC (r=0.99; y=0.93x+0.07) con bias di
3.5 (IC 95% da -7.0 a 0.0). L’analisi delle curve
ROC, a cut-off di UF1000i = 4 WBC/μL mostra
le seguenti performance diagnostiche rispetto a MO:
sensibilità=100% (0 Falsi Negativi), specificità=83,7% (7
Falsi Positivi), concordanza diagnostica: 90,9%, Valore
Predittivo Negativo=100%, Valore Predittivo Positivo=
82,9%. Il CO è assente (valore massimo=0,22%
nelle tre serie di campioni). Il profilo di imprecisione
evidenzia CV<20% anche nel campione con WBC=3,5/μL
(CV=16,5%).
Conclusioni: I risultati evidenziano ottima concordanza
dei conteggi di UF1000i rispetto al metodo di riferimento
in MO, ottime prestazioni di imprecisione e CO assente.
Le performance diagnostiche a cut-off di 4 WBC/μL sono
caratterizzate da concordanza diagnostica del 90.9%
e VPN del 100%. I citogrammi di UF1000i forniscono
inoltre un valido supporto all’analisi morfologica. I dati
confermano il suo possibile impiego nei percorsi di
automazione dell’analisi citometrica di CSF rispetto ai
contenuti di LG CLSI H56-A.
P083
VALUTAZIONE DEGLI INTERVALLI DI RIFERIMENTO
E DELLE PRESTAZIONI ANALITICHE DEL TEST
CISTATINA C TRAMITE L’USO DI DUE REAGENTI DI
PRODUZIONE DI DUE DITTE DIFFERENTI
L. Bassi, M. Mariani, L. Pizzi, A. Sarzi Amade' , S.
Sudati, S. Testa
Laboratorio analisi chimico cliniche e microbiologia,
Azienda Istituti Ospitalieri, Cremona
La Cistatina C (Cys-C), proteina basica non glicosilata
prodotta da quasi tutte le cellule nucleate, è filtrata dal
glomerulo e quasi interamente catabolizzata dal tubulo.
La Cys-C è stata recentemente proposta come marcatore
di funzionalità renale più sensibile della creatinina serica
principalmente nei pazienti con lieve riduzione della GFR
e a rischio cardiovascolare.
Scopo: Lo scopo del lavoro è valutare i range di
riferimento della Cys-C (Gentian), rispetto quelli della CysC (Sentinel).
Materiali e metodi: Sono state valutate:
•stabilità del reattivo e prestazioni del metodo;
•livelli decisionali per fasce di età e sesso.
Sono stati utilizzati plasmi di donatori, per definire gli
intervalli di riferimento, per sesso e fasce di età (circa 30
pazienti per gruppo con età inferiore a 20 anni, tra 20/30,
tra 30/40, tra 40/50 e oltre 50) e per il confronto tra metodi,
plasmi di pazienti con danno renale. In ogni gruppo
di pazienti è stata dosata anche la creatinina. I calcoli
statistici sono stati eseguiti utilizzando il programma
statistico MedCalc.
Risultati:
•Il reattivo in valutazione ha mostrato una calibrazione
per lotto stabile nel periodo della prova (45 giorni). I
controlli strumentali hanno evidenziato un CV% di 5.69
per il livello1 (atteso 0.90 mg/L/ottenuto 0.88 mg/L), un
CV% di 5.29 per il livello2 (atteso 2.89 mg/L/ottenuto 2.75
mg/L);
•I calibratori Gentian sono pronti all’uso, mentre quelli
Sentinel richiedono diluizioni a raddoppio manuali con
possibilità di non precisa diluizione e problemi in
calibrazione;
•L’intervallo di riferimento, calcolato sui donatori, con
eliminazione degli outliers (test di Tukey), è risultato pari
a 0.52/1.03 mg/L in linea con i dati forniti dalla ditta
(0.53/1.01 mg/L);
•Non si sono evidenziati variazioni degli intervalli di
riferimento per sesso e fasce di età con il metodo in
valutazione;
•Il coefficiente di correlazione calcolato su 62 pazienti
afferenti al laboratorio dai reparti di nefrologia e dialisi
ha un valore pari a 0.9806 e l’equazione della retta di
regressione Y=0.462+0.7061X.
Conclusioni: Il metodo in valutazione ha dimostrato buona
stabilità e precisione con valori di concentrazione senza
differenze significative per età e sesso. L’introduzione in
routine può prevedere un unico intervallo di riferimento.
P084
VALUTAZIONE DELLA PERFORMANCE ANALITICA
DELL'ANALIZZATORE AUTOMATICO COBAS C311
A. Primiano, A. Schiattarella, K. Pocino, C. Zuppi, M.
Antenucci
Lab. di Analisi I, Policlinico Universitario A.Gemelli,
Roma
Introduzione e scopo: Nell’ambito della riorganizzazione
e del consolidamento del Laboratorio di Analisi I,
la determinazione quantitativa degli analiti urinari
che precedentemente veniva eseguita sull’analizzatore
AU2700 (Beckman Coulter) è stata implementata
sull’analizzatore automatico Cobas C311 (Roche
Diagnostics). Pertanto abbiamo valutato la performance
analitica di tale analizzatore confrontando i risultati con
quelli ottenuti dal sistema precedentemente utilizzato.
Materiali e metodi: Sono stati analizzati 100 campioni
di urine delle 24 ore provenienti dai reparti interni
ed esterni del nostro Policlinico e sono stati dosati i
seguenti parametri: glucosio, Na, K, Cl, Ca, Crea, P, urea,
acido urico, Mg, amilasi e proteine totali. La precisione,
l’accuratezza, e la correlazione con i metodi in uso sono
stati valutati in accordo con i protocolli NCCLS/ CLSI.
Per entrambi gli analizzatori sono stati utilizzati reagenti,
calibratori e controlli delle rispettive case produttrici.
La differenza sostanziale tra i due analizzatori consiste
nell’utilizzo di diversi calibratori: AU2700 (Beckman
Coulter) utilizza un calibratore specifico, su matrice
umana, per i campioni di urine, mentre il Cobas
C311 (Roche Diagnostics) fa riferimento alle calibrazioni
effettuate su matrice proteica, tranne che per il dosaggio
delle proteine urinarie.
Risultati e conclusioni: Il confronto tra i metodi, effettuato
attraverso l’analisi della regressione lineare di Pearson e il
Bland-Altman plot, ha evidenziato una buona correlazione
tra i due strumenti (AU2700 e Cobas C311): tutti gli
analiti dosati, infatti, presentano un ottimo coefficiente
2
di correlazione (r >0,990) e un bias non significativo.
La precisione intra-serie e inter-serie mostra coefficienti
di variazione (CV) compresi rispettivamente tra 0.54% 2.97% e 1.2% - 5.0%. La valutazione della performance
analitica e il confronto tra i campioni dimostra che i
due sistemi forniscono risultati sovrapponibili, e quindi
possono essere indifferentemente utilizzati in base alle
specifiche esigenze.
513
P085
VALUTAZIONE DELLE PRESTAZIONI ANALITICHE
DEL SISTEMA ANALITICO ALERE NS-PLUS
PER LA DETERMINAZIONE IMMUNOCHIMICA
QUANTITATIVA DELLA TRANSFERRINA FECALE
1
1
2
1
L. Bressan , N. Corcione , D. Dama , P. Luraschi
P086
VALUTAZIONE DI SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ DI
TRE REAGENTI APTT PER LA DIAGNOSI PRECOCE
DI LUPUS ANTICOAGULANTE
L. Loiodice, P. Ranieri, L. De Marinis, F. Catacchio, A.
Lamanna, S. Petruzzellis, A. Sollecito, L. Varraso, F. Di
Serio
1
Lab. Medico, Dip. di Prevenzione Medico, ASL Varese
Corso di Laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico,
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi
dell'Insubria, Varese-Como
2
La transferrina (Tf) è una ß1-globulina con PM da 75 a
80 kDa e compare nelle feci in seguito a sanguinamento
del tratto gastro-intestinale. Rispetto all’emoglobina (Hb),
Tf è più stabile alle alte temperature e maggiormente
resistente all’attacco batterico; la determinazione della Tf
nelle feci è stata proposta, in aggiunta alla ricerca della
Hb, in quanto permetterebbe di rivelare sanguinamenti
che potrebbero sfuggire con la sola ricerca della Hb
(stadi precoci del cancro del colon-retto, polipi del
colon). La misurazione della Tf fecale è stata effettuata
con strumento NS-Plus prodotto da Otsuka Electronics,
utilizzando reagenti, materiali di controllo e dispositivi
monouso prodotti da Alfresa Pharma Corporation e
commercializzati da Alere. Per la raccolta del campione
viene utilizzato un dispositivo monouso che permette
il prelievo di una quantità standardizzata di feci e la
diluizione in un volume predeterminato di tampone. La
misurazione della concentrazione della Tf avviene con
metodo immunochimico abbinato alla spettrofotometria
con oro colloidale. Si sono valutate le caratteristiche di
imprecisione (nella serie e tra le serie) a differenti livelli
di concentrazione, linearità, sensibilità analitica (mediante
calcolo del LOD in accordo con il documento CLSI EP17A), ed esattezza analitica. L’imprecisione entro la serie
(CV%) è risultata compresa tra 0,9 % e 23,6 % per
concentrazione di Tf di 209 e 6 ng/mL, rispettivamente.
Il profilo di imprecisione ha mostrato la classica
conformazione a U, con deterioramento dell’imprecisione
agli estremi dell’intervallo analitico. L’imprecisione tra le
serie (CV%) è risultata 7,4% e 6,4% per concentrazioni di
46 e 154 ng/mL, rispettivamente. Il metodo ha mostrato
linearità e buon accordo trovato/atteso (regressione
trovato/atteso: pendenza 1,02; intercetta 1,1 ng/mL;
r 0,999) nell’intervallo di concentrazione 5-500 ng/
mL. Il valore del LOD è risultato pari a 1,52 ng/
mL. In conclusione il sistema analitico ha mostrato
soddisfacenti caratteristiche di accuratezza analitica,
adeguate all’utilizzo clinico previsto.
514
U.O. Patologia Clinica I Azienda Ospedaliera
Universitaria Policlinico Consorziale di Bari
Scopo: Valutare la sensibilità e la specificità di valori di
APTT ottenuti con tre reagenti a diversa composizione
fosfolipidica e di attivatori, per una diagnostica precoce di
Lupus anticoagulante (LA).
Materiali e metodi: Sono stati selezionati 50 campioni di
plasma raccolti da soggetti sani e 26 campioni di pazienti,
afferenti al Centro Emostasi e Trombosi, per i quali i test
di 2° livello avevano confermato la diagnosi di LA. In
tutti i campioni, l’APTT è stato misurato sull’analizzatore
CA 7000 Siemens utilizzando tre differenti reagenti:
Actin FS (Siemens), Pathromtin SL (Siemens), APTT SP
(Instrumentation Laboratory). Nell’indagine statistica, per
la valutazione dei risultati, sono stati utilizzati il test di
Student per dati non appaiati, l’analisi di Bland ed Altmann
e la formula di Bayes.
Risultati: Nei soggetti sani, il confronto tra metodi
mostra che i valori di APTT (Actin FS: media =
27.4, DS=2.4; Pathromtin SL: media=34, DS=4.0; APTT
SP: media=29.2, DS=4.9) non sono significativamente
differenti solo per misurazioni eseguite con Actin FS e
con APTT SP (p = 0,13). I risultati ottenuti da pazienti
LA positivi (Actin FS: media = 31,5, DS = 7,6; Pathromtin
SL: media = 61,4, DS = 26; APTT SP: media = 77,2
DS = 35,2) evidenziano una differenza statisticamente
non significativa solo tra Pathromtin SL vs APTT SP (p =
0,075). L’analisi di B.A. evidenzia i seguenti bias: Actin FS
e Pathromtin SL -29 ( IC 95% da -38 a -21 ); Pathromtin SL
e APTT SP -15.7(IC 95% da -26 a 5.5); Actin FS e APTT
SP -45 (IC 95% da -59 a 32). Sensibilità e specificità: Actin
FS = 0.52 e 1 rispettivamente; Pathromtin SL e APTT SP
= 1.
Conclusioni: l’Actin FS non mostra la stessa predittività
degli altri reagenti, nella precoce identificazione di pazienti
con LA, pertanto, nella scelta del metodo da utilizzare,
deve essere considerata la prevalenza della popolazione
afferente al laboratorio.
P087
VALUTAZIONE IN UN LABORATORIO
CENTRALIZZATO DI UN SISTEMA EVOLUTO
INNOVATIVO DI EMOGASANALISI
P088
VALUTAZIONE PRELIMINARE CIRCA L’IMPATTO
DELLE MANUTENZIONI SUI RISULTATI ANALITICI
DELLA TROPONINA RICHIESTA IN URGENZA
B.C. Creanza, M. Guida, G. Dirienzo
S. Gelsumini , R. Serdi , E. Stenner , E. Gianoli , G.
1
2
Paladini , G. Paladini
ASL BARI - Struttura Complessa di Patologia Clinica Ospedale Civile Umberto I - Altamura, Bari
Le performance analitiche dei risultati ottenuti mediante
l’utilizzo di un sistema evoluto di emogasanalisi
possono essere qualitativamente allineate ai sistemi
di riferimento di laboratorio. Sono state effettuate due
differenti valutazioni: 1. Valutazione delle prestazioni
dell’ABL 825 FLEX dotato del proprio dispositivo
per la gestione in completa automazione della fase
preanalitica in termini di correlazione dell’emoglobina
con la valutazione dell’indice di correlazione R2 rispetto
allo strumento di riferimento ABX Pentra DX 120.
2. Ripetibilità intraserie del glucosio e di elettroliti
(cloro, sodio e potassio), rispetto allo strumento di
riferimento AU480. Le strumentazioni protagoniste di
questa valutazione sono: Modello emogasanalizzatore
ABL 825 FLEX (Radiometer Medical); Dispositivi di
prelievo utilizzati: siringhe pre-eparinate SafePICO di
Radiometer Medical ApS in abbinamento al sistema di
miscelazione automatica e standardizzata del campione
integrato nell’emogasanalizzatore; Modello analizzatore
Laboratorio: ABX Pentra DX 120 (Horiba); Modello
analizzatore Laboratorio: AU 480 (Beckman Coulter).
Correlazione ctHb: le analisi sono state condotte
eseguendo in successione 43 campioni di pazienti
provenienti da reparti ed eseguiti “random” sui due
strumenti. I dati ottenuti sono stati valutati attraverso il
metodo della regressione lineare e calcolo del coefficiente
R2. Ripetibilità intraserie glucosio e elettroliti (K+, Na+,
Cl-): la valutazione è stata condotta attraverso analisi
ripetute di un pool di sieri replicati per 21 volte di cui
2 campioni hanno presentato problemi di aspirazione,
pertanto non inclusi nella valutazione. Il sistema ABL825
FLEX fornisce una buona correlazione con lo strumento
di riferimento nella valutazione dell’emoglobina, grazie
alla combinazione dei dispositivi di prelievo safePICO e
grazie al modulo FLEXQ [campionatore automatizzato, in
grado di eseguire i campioni dopo averli miscelati grazie
alla presenza di una mixing ball presente all’interno della
SafePICO]. Il dispositivo utilizza un disco in fibra rivestito
con 60 U.I. di eparina liofila che non interferisce sui risultati
finali dell’esame.
Bonini P, Plebani M, Ceriotti F, et al. Errors in laboratory
medicine. Clin Chem 2002;48:691-8.
1
1
1
1
1
Dip. di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera
“Ospedali riuniti”- Trieste
2
Dip. di Onco-Ematologia, Azienda Ospedaliera
“Ospedali riuniti”- Trieste
Nel Laboratorio Urgenze dell’Azienda Ospedaliera
“Ospedali Riuniti” di Trieste (sede di Cattinara), le richieste
di troponina vengono processate sull’analizzatore
Access2 (Beckman Coulter), con metodo AccuTnI.
Scopo: Valutare l’impatto delle manutenzioni sui risultati
analitici della troponina urgente.
Metodologia: Sono stati arruolati i campioni urgenti di
plasma (raccolti in provette con litio-eparina e centrifugati
a 4.000 rpm per 5 min) con le seguenti concentrazioni di
troponina: 19,6 μg/L; 106,06 μg/L; 124,55 μg/L; 257,70 μg/
L; 292,37 μg/L; 349,05 μg/L; <0,01 μg/L. I campioni sono
stati processati in serie, secondo lo schema seguente: a)
2 replicati di materiale di controllo basso (Seronorm); b) 3
replicati di un pool ricavato da campioni con TnI <0,01 μg/
L; c) campione critico; d) 3 replicati di un pool ricavato da
campioni con TnI <0,01 μg/L; e) 2 replicati di materiale di
controllo basso (Seronorm). Campioni con TnI >102,000
μg/L, corrispondente al limite di linearità del metodo, sono
stati diluiti 1:5 con diluente dedicato.
Risultati: Dopo il processamento di ogni campione critico
(c), i risultati relativi ai tre replicati del pool (d) sono stati
i seguenti:
- non sono stati rilevati risultati falsamente positivi rispetto
al cutoff in uso (0,06 μg/L);
- solo in un caso il risultato è stato 0,01 μg/L
(corrispondente al limite di sensibilità analitica del
metodo);
- gli altri risultati sono stati < 0,01 μg/L.
Discussione e conclusioni: Data l’elevata frequenza
quotidiana delle richieste urgenti di troponina, le azioni di
manutenzione sullo strumento Access2 sono state riviste.
Nel nostro Laboratorio, quindi: la manutenzione
settimanale (Special Clean) viene eseguita con cadenza
giornaliera; c’è attenzione a mantenere costante la
temperatura ambiente, evitandone gli sbalzi repentini.
Quindi, l’attenzione alle manutenzioni è, verosimilmente,
responsabile della bontà dei risultati analitici, confortati
anche dall’assenza di reclami e/o richieste di chiarimenti
da parte dei clinici circa tali esiti, sempre agendo nell’ottica
della salvaguardia dell’outcome del paziente.
Dimeski G, Jones B, Brown N. Carryover can be a cause
of false-positive results with the Beckman AccuTnI assay.
Clin Chem Lab Med 2012;50:1135-6.
515
P089
VALUTAZIONE PRELIMINARE DELL'ANALIZZATORE
CHEM 400 ISE - GESAN
D. Cerasuolo, L. Russo, E. De Iuliis, F. Di Paola, E.
Cavalcanti
S. C. Medicina di Laboratorio, I.N.T. - IRCCS,
Fondazione G. Pascale, Napoli
Si riportano i risultati di uno studio preliminare
sulle caratteristiche dell’analizzatore CHEM 400 ISE,
commercializzato dalla GESAN Production (TP), la cui
cadenza analitica è di 400 esami/ora (580esami con ISE
incluso). Lo strumento può analizzare simultaneamente
un massimo di 70 campioni con caricamento in continuo
ed identificazione positiva di reagenti e campioni mediante
bar code. Le caratteristiche di riproducibilità sono state
studiate valutando l’imprecisione nella serie e tra le serie
per alcuni analiti (albumina, proteine totali, colesterolo,
colesterolo HDL, trigliceridi, sodio, potassio e calcio
totale), rappresentativi delle varie possibilità operative
dello strumento; la prima analizzando tre pool di sieri
da pazienti a diverse concentrazioni (20 repliche) e
la seconda utilizzando i valori (n=20) relativi a due
sieri di Controllo Normale e Patologico. Reagenti,
calibratori e controlli erano forniti dalla ditta GESAN.
Entrambe le imprecisioni si sono rilevate trascurabili
(pool basso: CV% 4,0 ÷ 5,6; pool normale: CV%
0,58 ÷ 3,29; pool alto: CV% 0,80 ÷ 1,80; Controllo
Normale CV% 2,5 ÷ 5,0; Controllo Patologico CV% 2,4
÷ 5,5). Gli stessi metodi sono stati, inoltre, confrontati
con quelli implementati sull’analizzatore Cobas C6000
(Roche Diagnostics) utilizzato nel nostro laboratorio.
Questa correlazione è stata eseguita su 100 sieri da
paziente a diversi livelli di concentrazione per tutti gli
analiti esaminati. I valori ottenuti sono stati valutati
mediante analisi della regressione lineare ed il calcolo
del coefficiente di correlazione r. I risultati sono del tutto
soddisfacenti (r= 0,89 ÷ 0,99), tranne per sodio e potassio
per i quali probabilmente si verificano fenomeni di carryover da reagente. Analizzati singolarmente, infatti, la
correlazione migliora significativamente. E’ stata valutata
altresì la metodica per il dosaggio del calcio ionizzato,
implementata su entrambe le strumentazioni, (reattivo
fornito dalla ditta GESAN), che ha mostrato buone
caratteristiche di imprecisione (CV% 5,0) nonchè di
correlazione tra i due analizzatori (r=0,89) e tra questi ed
il dosaggio in emogas-analisi (r=0,9).
516
P090
VALUTAZIONE PRELIMINARE DELLE PRESTAZIONI
ANALITICHE DI MAGLUMI 2000 PLUS PER LA
MISURA DI FERRITINA, MIOGLOBINA E CK-MB
G. Grandi , F. Veroni , G. Avveduto , F. Fissi , M.
Monti , A. Neri , F. Daniele , D. De Ninno , D. Tinalli
Laboratorio Generale, Dipartimento Diagnostica di
Laboratorio, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi,
Firenze
Scopo dello studio è stata una valutazione preliminare
delle prestazione analitiche del nuovo strumento Maglumi
2000 Plus, prodotto da SNIBE e distribuito in Italia da
Medical System. Lo strumento, che sfrutta un sistema
immunoenzimatico sandwich con anticorpi monoclonali
e rivelazione in chemiluminescenza, può misurare un
ampio repertorio di analiti in grado di soddisfare le
diagnostiche biochimiche maggiormente diffuse, tra i quali
per una prima valutazione delle prestazioni di Maglumi
2000 Plus, sono state prese in esame la ferritina, la
mioglobina e il CK-MB. La misura di questi tre analiti è
stata eseguita su 60 campioni, reclutati dalla routine del
nostro laboratorio e i risultati confrontati con quelli ottenuti
su Advia Centaur (Siemens). Le rette di regressione,
rispettivamente di ferritina, mioglobina e CK-MB, sono
2
risultate y = 0,825x–5,411 (R = 0,965; range 13 – 542
2
ng/mL), y = 0,916x – 10,4 (R = 0,979; range 18 – 1114
2
ng/mL), y = 1,347 x + 3,358 (R = 0,979; range 0.3 –
188 ng/mL ). Utilizzando gli intervalli di riferimento in uso
per i risultati ottenuti su Advia Centaur e quelli indicati
dalla ditta per Maglumi 2000 Plus, la concordanza tra i
due metodi è risultata dell’86% per la ferritina, del 96%
per la mioglobina e del 98% per il CK-MB. Lo studio di
imprecisione effettuato secondo il protocollo NCCLS EP5A2 e su tre livelli di concentrazione, ha evidenziato un CV
intra-assay inferiore al 10% e un CV inter-assay inferiore
al 15% per tutti e tre gli analiti. In conclusione, i risultati
preliminari delle prestazioni analitiche dello strumento
Maglumi 2000 Plus per i tre analiti testati sono stati
soddisfacenti e compatibili con l’uso clinico. Questo dato,
se confermato anche sugli altri test proposti dalla ditta,
insieme alla elevata produttività strumentale (180 test/
ora), al confezionamento dei reattivi (liquidi con calibratori
inclusi), alla facilità d’uso del software e l’ampia capacità
di reattivi on-board, lo rendono uno strumento molto
versatile e potenzialmente interessante per l’ampiezza del
menu.
P091
VANTAGGIO DELLA VALUTAZIONE PRELIMINARE
CON LINEE GUIDA CLSI EP10-A3 (CLINICAL
AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE)
DI UN ANALIZZATORE IN CONTINUO DELLA
FUNZIONALITÀ RENALE PER IL MIGLIORAMENTO
DELLA PRECISIONE
1
1
1
3
L. Invernizzi , S. Signorelli , R. Falbo , I. Negrelli , R.
3
4
2
Orsenigo , G. Longoni , P. Brambilla
P092
ANALYTICAL PERFORMANCE OF NOVEL
IMMUNOENZYMOMETRIC ASSAY FOR cTnI
COMPARED WITH OTHER cTnI AND cTnT
IMMUNOASSAYS
2
1
1
3
M. Franzini , C. Prontera , S. Masotti , G. Zucchelli , S.
1
1
1
2
Storti , D. Chiappino , D. Della Latta , C. Passino , M.
1
1
Emdin , A. Clerico
1
1
Serv. Univ. di Med. di Laboratorio Osp. di Desio, Desio
(MB)
2
DIMS, Medicina e Chirurgia, Univ. Milano Bicocca
3
Orvim s.r.l., Paderno Dugnano (MI)
4
Kardia s.r.l., Milano
Scopo: Lo strumento Kidney Instant Monitoring (Ki.n.g)
(Orvim Kardia) è il primo analizzatore automatico
in continuo di urina che determina la diuresi e la
concentrazione di H+, Na+, K+, Cl- e NH4+. Scopo
del lavoro è effettuare, per ogni analita analizzato,
una valutazione preliminare dell’imprecisione per mettere
in evidenza eventuali problematiche strumentali e
correggerle prima di procedere con la fase di valutazione
della precisione.
Materiali e metodi: I campioni provengono dalla raccolta di
urine-24 ore di pazienti del Centro Prelievi dell’Ospedale
di Desio. Fase preliminare: per ogni analita si applicano
linee guida CLSI EP10-A3: 2 serie di analisi per 5 giorni
consecutivi su pools di materiale con 3 concentrazioni
diverse di analita: Low (L), Mid (M) e High (H). Fase di
Precisione: per ogni analita si applicano linee guida CLSI
EP5-A2: 2 campioni a concentrazioni diverse di analita
analizzati in 2 serie separate per 20 giorni in triplicato.
Le analisi sono condotte in parallelo su 2 strumenti e
confrontate con il metodo di riferimento. pH: pH-metria
(Delta Ohm); Na+/K+: fotometria a fiamma (I.L.); Cl-:
potenziometria indiretta (Modular, Modulo ISE, Roche);
NH4+: colorimetria (Cobas Integra, Roche).
Risultati: I due strumenti sono sovrapponibili. La fase
preliminare ha permesso di apportare interventi per
migliorarne la performance: modifica rette calibrazione e
fattori correzione; modifica elettrodi; modifica diametri del
sistema di aspirazione e fluidica; modifica elettrovalvola e
sistema campionatore. Si è quindi dimostrato un notevole
miglioramento della precisione. Il CV% del metodo, infatti,
per tutti gli analiti è risultato ≤ al limite di accettabilità per
il CV% (15%).
Conclusioni: I risultati dimostrano l’importanza della
fase preliminare nella validazione strumentale. L’elevata
precisione dello strumento lo rende adatto all’uso come
point of care testing (POCT) in unità di terapia intensiva
per la valutazione ed il monitoraggio in continuo della
funzionalità renale.
CLSI. Preliminary evaluation of quantitative clinical
laboratory measurement procedures. CLSI document
EP10-A3. CLSI, Wayne, PA, 2006.
Fondazione Toscana G. Monasterio, Pisa
Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa
3
QualiMedLab & Istituto di Fisiologia Clinica - CNR, Pisa
2
Background: We evaluated the analytical performance
and the clinical results of a novel immunoenzymometric
assay for the cTnI using the automated AIA platform.
Methods: The third generation AIA-Pack method for
plasma cTnI assay was performed in our laboratory
according to the recommendations made by the
manufacturer, using the AIA-2000 platform (TOSOH
Corporation). For comparison, plasma concentrations of
cTnI were also measured using the Access AccuTnI
method with the UniCell DxI 800 platform (BeckmanCoulter Diagnostics).
Results: The limits of blank (LoB) and detection (LoD) for
the third generation AIA-Pack method were determined
according to the CLSI EP17-A protocol in heparinized
plasma samples. The calculated LoB and LoD values
were 3.5 ng/L and 8.7 ng/L, respectively. Moreover, the
limits of quantitation (LoQ) at 20% CV and 10% CV
were 30 and 100 ng/L of cTnI, respectively. A close
linear relationship (R=0.999, plasma= 3.10 + 0.95 serum)
was found between cTnI concentrations measured in
105 serum and heparinized plasma samples of healthy
subjects and patients with cardiac diseases. TOSOH
method showed a close correlation (R=0.991) ma also
a mean negative bias (i.e., underestimation) of -30.2 %
compared to Beckman-Coulter. The distribution of cTnI
values, measured by the TOSOH method, was evaluated
th
in 452 healthy individuals. The calculated 99 percentile
of the cTnI values was 33 ng/L (median 9.0 ng/L, range
0-44 ng/L).
Conclusion: Our data suggest that the analytical
performance of the third-generation AIA-Pack assay
should be considered to be as clinically acceptable for the
evaluation of patients with cardiac diseases.
Clerico A, Giannoni A, Prontera T, et al. High-sensitivity
troponin: a new toll for pathophysiological investigation
and clinical practice. Adv Clin Chem 2009;49:1-30.
517
P093
COST-BENEFIT ANALYSIS OF COPEPTIN
COMBINED WITH TROPONIN I FOR EXCLUSION OF
ACUTE MYOCARDIAL INFARCTION
P094
CTNT FOURTH GENERATION VS CTNT-ULTRA
ASSAY: IMPACT ON EMERGENCY DEPARTMENT
S. Valenti, G. Andalò
1
2
2
2
D. Cosseddu , G. Alberto , L. Arnaldi , C. Runzo , S.
1
4
4
Musolino , G.M. Bruno , S. Di Matteo , G.L.
3
2
1
Colombo , A. Soragna , M. Migliardi
1
S.C. Analysis laboratory – A.O. Ordine Mauriziano di
Torino - Turin (Italy)
2
DEA – A.O. Ordine Mauriziano di Torino - Turin (Italy)
3
University of Pavia, Dpt. of Pharmaceutical Sciences,
Faculty of Pharmacy - Pavia (Italy)
4
S.A.V.E. Studi Analisi Valutazioni Economiche Srl –
Milan (Italy)
Objective: We developed a cost-benefit analysis in the use
of copeptin for rapid rule out of acute myocardial infarction
(AMI) in the Department of Emergency-Urgency (DEA).
Methods: We defined a theoretical decision tree model
based on differential costs for patients with chest pain and
non-significant ECG that arrived in DEA. Patients were
divided into two branches: those that had only troponin
I measured vs patients with measurements for both
troponin and copeptin. Patient cost for the two biomarkers,
a flat fee for the equipment of analysis of copeptina was
enhanced. Finally we hypothesized two evaluations for
the use of health care resources and medical staff: in the
first scenario, costs for each item were valorized (medical
staff, monitoring room, exam fees), in the second a rate of
"astanteria" consisting of direct costs and diagnostic tests
was used. The model was then adapted to the clinical
experience of DEA Mauriziano Hospital of Turin in 2011.
Results: Cost-benefit analysis showed that the number of
patients in the copeptin group that would have required
a 3rd troponin sample would have been 47 vs 161,
freeing up medical resources and monitoring room. The
use of copeptin saved, approximately 5 h and 41 min.
Enhancement of the freed time, could have theoretically
resulted in savings of about €75 per patient, with a costbenefit ratio equal to 4.25. Using costs for the rate of
"astanteria", the savings per treated patient goes up
to about €125, with a cost benefit ratio of 7.13. Costbenefit analysis has therefore determined that every euro
invested in copeptin determines a health benefit in the
range of EUR 4.25 to 7.13 for the Hospital.
Conclusion: The fast exclusion of AMI in patients with
chest pain is strategic because we need to reduce health
care costs without compromising patient safety. Our
results highlight the role of copeptin as a cost-benefit tool
to rule out AMI, so as to significantly reduce the length of
stay in the DEA and thereby generate savings of health
care resources and better organization of working time for
medical and nursing staff.
Drummond MF, O'Brien BJ, Stoddart GL, et al. Methods
for the economic evaluation of health care programmes.
Third edition. New York: Oxford University Press, 2006.
518
Laboratorio a Risposta Rapida Azienda USL di Ravenna
In Ravenna hospital, we have used cardiac troponin
since 1996. In 2002 Emergency Department, organized in
three hospitals with 140-150000 health services per year,
introduced a protocol for Chest Pain. The Short–Stay
Observation for Chest Pain was gradually shortened in
conjunction with the increase of assays sensitivity used in
laboratory for cardiac markers analysis. In all laboratories
of Area Vasta Romagna we use only cTnT-ultra assay
from Roche and this reduced Short-Stay Observation from
9 hours to 3-6 hours in February 2011. At first the report
showed a “double cut-off”: one was 99° percentile value,
the other was the previous assay cut-off (cTnT fourth
generation), respectively for the rule-out and the rule-in
of patients. Patients with values between first and second
cut-off received a second sample according with literature.
In September 2012 the report has been modified and
shows only 99° percentile value. The main outcome of
cTnT-ultra assay usage is the decrease of Short-Stay
Observation for chest Pain to 3-6 hours and the removal
of myoglobin assay, sensitive but not specific marker.
There wasn’t an increase of troponin assay request but a
initial decrease of 8.6% from Emergency Department. We
regularly check the assay results through the Information
Data Base and we can confirm that patients with positive
value are increased by about 25%. “New positive” patients
follow-up is still underway.
P095
EFFETTI DELLA SUPPLEMENTAZIONE DI
VITAMINA D SUI LIVELLI DI PTH E FGF-23
NELL'INSUFFICIENZA CARDIACA: RISULTATI
PRELIMINARI A 3 MESI DAL TRATTAMENTO
1
1
2
3
P096
EPIDEMIOLOGICAL ASSOCIATION OF INCREASED
HEMOGLOBIN VALUES WITH UNFAVORABLE
LIPID PROFILE IN A LARGE POPULATION OF
UNSELECTED OUTPATIENTS
1
2
2
S. Scarlini , F. Turrini , T. Trenti , E. Baraldi , M.C. De
3
3
Santis , L. Roli
G. Lippi , M. Montagnana , E. Danese , G.L.
2
2
Salvagno , G.C. Guidi
1
1
Medicina Interna Cardiovascolare, Nuovo Ospedale
Civile S. Agostino - Estense, Modena
2
Dipartimento di Patologia Clinica, Nuovo Ospedale
Civile S. Agostino - Estense, Modena
3
Laboratorio di Patologia Clinica Endocrinologia, Nuovo
Ospedale Civile S. Agostino - Estense, Modena
Razionale: Tra gli effetti della supplementazione di
Vit.D nell’insufficienza cardiaca (IC) vi è la riduzione
dell'iperparatiroidismo secondario in cui l'eccesso di PTH
causa ipertofia dei cardiomiociti e fibrosi interstiziale. Studi
clinici suggeriscono che l'aumento precoce di FGF23
causerebbe declino dei valori di Vit.D e iperparatiroidismo
secondario, venendo meno la fisiologica inibizione di
feedback sul PTH della Vit.D.
Scopo: Per investigare gli effetti a breve termine della
supplementazione di Vit.D in soggetti con IC (classe
NYHA II-III, età>60 anni, ipovitaminosi D, stabilità clinica
da un mese, GFR>30 mL/min) su PTH e FGF23, abbiamo
confrontato 16 soggetti in trattamento con Vit.D (300000U
carico + 50000U/mese) e 14 soggetti in trattamento con
placebo in uno studio randomizzato, controllato, in doppio
cieco, da marzo a luglio. Vit.D e PTH sono stati dosati
con metodo Beckman Coulter e DiaSorin rispettivamente,
FGF23 con un metodo per ricerca (Kainos Laboratories
Inc.).
Risultati: Il gruppo in trattamento ha presentato aumento
significativo di Vit.D rispetto ai valori basali (p=0,000) e
al gruppo placebo (p=0,000); quest'ultimo ha presentato
un aumento significativo dei valori rispetto ai basali
per l’esposizione solare, ma significativamente inferiore
rispetto al gruppo trattato. L'iperparatiroidismo secondario
è stato corretto solo nei pazienti trattati (p=0,028); FGF23
è significativamente aumentato nei due gruppi rispetto
ai valori basali (p=0,023 placebo; p=0,032 trattamento),
ma la differenza tra i gruppi non era statisticamente
significativa.
Conclusioni: La supplementazione di Vit.D ha determinato
una riduzione significativa di PTH (effetto non rilevabile
per variazioni legate all'esposizione solare) e un aumento
di FGF23, confermando l'effetto di stimolazione della
sintesi di FGF23 da parte della Vit.D, sebbene sia noto
che FGF23 ne inbisca la sintesi a livello renale. Non
è chiarito il valore clinico di delle alterazioni di FGF23,
ma lo studio conferma definitivamente la presenza di un
feedback positivo. Nell'IC le alterazioni del metabolismo
fosfo-calcico, la carenza di Vit.D, l'iperparatiroidismo
secondario e le conseguenti variazioni di FGF23 sono da
considerarsi dunque un nuovo paradigma di alterazione
neuro-ormonale.
Unità Operativa Diagnostica Ematochimica, Azienda
Ospedaliero-Universitaria di Parma, Parma.
2
Sezione di Chimica Clinica, Dipartimento di Scienze
della Vita e della Riproduzione, Azienda OspedalieroUniversitaria di Verona, Verona.
Background: It is acknowledged that high values of
hemoglobin are a risk factor for thrombosis due to
hyperviscosity syndrome, which impairs oxygen delivery
to peripheral tissues and worsens vascular occlusion.
Little is known, however, if increased hemoglobin values
may produce alternative proatherogenic effects through
different pathways, such as modulating the concentration
of blood lipids.
Methods: We performed a search on our LIS for results
of hematological and lipid tests on unselected outpatients
aged >18 y, referred for routine testing over 6 months.
No exclusion criteria were applied for extracting data of
low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high density
lipoprotein cholesterol (HDL-C), total to HDL-C ratio (COL/
HDL) and atherogenic index of plasma (AIP).
Results: Cumulative results were retrieved for 4,874
outpatients (2,150 men). Significantly higher hemoglobin
values were found in males than in females (146±14
vs 134±12 g/L; p<0.01). After stratification of study
population into quartiles of hemoglobin for both genders,
males in the forth quartiles tended to have a much
higher COL/HDL ratio (4.0±1.2 vs 3.4±1.0; p<0.01),
AIP (-0.05±0.28 vs –0.09±0.28; p<0.01), triglycerides
(1.33±0.69 vs 1.21±0.65 mmol/L; p<0.01), LDL-C
(3.2±0.9 vs 2.5±0.9 mmol/L; p<0.01), but similar HDL-C
(1.4±0.4 vs 1.4±0.4 mmol/L; p=0.36). A similar situation
wad found in women in the top versus those in the
bottom quartile of hemoglobin, with higher values found
for COL/HDL (3.5±1.1 vs ±1.1; p=0.04), AIP (-0.16±0.28
vs –0.19±0.30; p=0.04), triglycerides (1.2±0.6 vs 1.1±0.6
mmol/L; p<0.01), LDL-C (3.3±0.9 vs 2.8±1.0 mmol/L;
p<0.01), counterbalanced by lower HDL-C (1.6±0.5 vs
1.7±0.5 mmol/L; p<0.01). The Odds Ratio (OR) for
undesirable values were 2.51 (95% CI, 1.9-3.2) for COL/
HDL, 1.3 (95% CI 1.01 to 1.7) for AIP, 1.36 (95% CI
0.99-1.9) for triglycerides, 3.5 (95%CI, 2.6-4. 7) for LDLC and 1.1 (95 CI 0.8-1.5) for HDL-C in women. In men,
ORs were 1.51 (95% CI 1.2-1.9) for COL/HDL, 1.3 (95%
CI 1.0-1.7) for AIP, 1.5 (95% CI, 1.1-2.1) for triglycerides,
2.4 (95% CI 1.9-3.1) for LDL-C and 0.9 (95 CI 0.6-1.5) for
HDL-C.
Conclusions: This large epidemiological study on
unselected outpatients suggests that high hemoglobin
values may be associated with atherosclerotic risk in both
genders.
519
P099
INSUFFICIENZA RENALE ACUTA IN PAZIENTI
SOTTOPOSTI AD INTERVENTI CARDIOCHIRURIGICI:
QUALE PREDITTIVITÀ DI NGAL?
1
1
2
2
C. Cosma , M. Zaninotto , A. Bortolami , R. Bianco , D.
1
1
Faggian , M. Plebani
1
U.O.C.Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera di
Padova- Università degli Studi di Padova
2
Div. di Cardiochirurgia, Azienda Ospedaliera di PadovaUniversità degli Studi di Padova
Introduzione: La misura della creatinina, riconosciuta gold
standard per la diagnosi di insufficienza renale acuta
(IRA), possiede numerose e note limitazioni; c’è quindi
l’esigenza di disporre di nuovi biomarcatori che evidenzino
precocemente l’insorgenza di IRA.
Scopo: Valutare l’efficacia del test uNGAL in relazione
allo sviluppo di IRA e le ricadute sull’ approccio clinico
in una popolazione consecutiva di pazienti sottoposti ad
interventi di cardiochirurgia (CHCARD).
Materiali e Metodi: Da gennaio ad agosto 2012, 492
pazienti (347 maschi e 145 femmine, età, range 49-83
anni), sottoposti ad interventi di CHCARD, sono stati
monitorati (pre/post intervento e ad intervalli di 12/24 ore
per 7 giorni) con la determinazione uNGAL (ArchitectAbbott Diagnostics) e di creatinemia (Cobas C 702,
Roche). I risultati sono espressi come medie ± DS.
Risultati: I valori di uNGAL e creatinemia nella
popolazione maschile sono risultati 105,75±307,9 mg/L
(intervallo riferimento [0-120] mg/L) e 115±59,42 μmol/
L (intervallo riferimento [62-115] μmol/L) e in quella
femminile 130,59±728.78 mg/L e 86,11±42,82 μmol/L
(intervallo riferimento [53-97] μmol/L). Solo il 6,7% della
popolazione studiata ha sviluppato IRA post-intervento
segnalata da significativi incrementi di uNGAL (da 10
a 50 volte il limite superiore di normalità) che hanno
preceduto quelli di creatinina di circa 24 ore. In tali
pazienti una significativa diminuzione di uNGAL in 24h (da
valori >a 400 mg/L a valori < 120 mg/mL) accompagnata
da valori di creatinina costantemente elevati nei giorni
successivi (> 250 μmol/L) era predittiva di recupero della
funzionalità renale. In alcuni pazienti (n=7), che hanno
sviluppato una sindrome da bassa gittata cardiaca (BGC)
post-operatoria, si sono riscontrati singoli e sporadici
incrementi di uNGAL (>500 mg/L) in concomitanza agli
eventi di BGC, con valori di creatinina che sono risultati
costantemente nel range di normalità.
Conclusioni: I risultati ottenuti, evidenziano nella
popolazione di pazienti CHCARD studiata, due
informazioni peculiari e di rilevanza clinica fornite
dalla determinazione di uNGAL: mancato recupero
della funzionalità renale in pazienti con concentrazioni
costantemente elevate; incremento in condizioni di BGC
che potrebbe mascherare l’insorgenza di IRA.
P100
L'IMPATTO DELLA TROPONINA AD ALTA
SENSIBILTÀ NELLA GESTIONE DEL PAZIENTE CON
SOSPETTA SINDROME CORONARICA ACUTA
R. Paravidino, V. Marrè, F. Deiana, S. Massaro, P.
Iandolo , R. Tronci, P. Botto, C. Ottaviano, G. Devoto
Laboratorio Analisi Centrale, ASL4 - Chiavarese Ospedale Lavagna
Scopo: Revisionare il protocollo diagnostico delle
Sindromi Coronariche Acute (SCA) dopo 12 mesi
dall’introduzione in routine della Troponina Hs con
tre obbiettivi: valutare le performance diagnostiche del
test, rivedere il protocollo diagnostico, in particolare la
possibilità di eliminare il terzo controllo alle 12 ore,
riduzione del numero di ore trascorse dai pazienti nel
Dipartimento di Emergenza (DEA).
Materiali e metodi: Sono stati arruolati 3312 Pazienti
afferenti al DEA. Sono state diagnosticate 336 SCA.
Nei restanti 2976 pazienti sono risultati negativi gli
accertamenti diagnostici per cardiopatia ischemica acuta.
Le concentrazioni di Troponina Hs sono state determinate
con il sistema Modular Analytics E170, con valore di
cut-off pari a 0.014 ng/mL (99° Percentile). Come Gold
Standard sono state utilizzate le diagnosi di dimissione
dai reparti di degenza. Sono stati calcolati la sensibilità,
la specificità, il valore predittivo positivo (VPP), il valore
predittivo negativo (VPN).
Risultati: 32 falsi negativi al primo prelievo: 8 SCA
(5 pazienti con TnT positiva al secondo prelievo, 3
pazienti con TnT sempre negativa nei controlli al ricovero),
24 IMA (15 pazienti 1 solo prelievo pre ricovero, tutti
positivi al secondo controllo in reparto; 9 pazienti con
TnT positivi al secondo prelievo). 861 i falsi positivi.
Le perfomance del test sono risultate: sensibilità 91%,
specificità 72%, VPP 30%, VPN 98%. Il livello decisionale
di 0.017 ng/mL, ottenuto tramite l’analisi ROC, discrimina
tra la popolazione afferente al DEA per altre cause e
soggetti con SCA e IMA con un VPP 29.5% e VPN
97.8%. Delta percentuale, utile nell’interpretazione delle
variazioni delle concentrazioni della troponina nei prelievi
seriati, è risultato essere non inferiore al 100%; tutti i
pazienti IMA + SCA avevano delta superiori a tale livello.
Delta temporale: tutti i pazienti IMA + SCA positivi al
secondo prelievo eseguito entro 6 ore dal prelievo basale.
Discussione e conclusioni: Si propone la modifica
del protocollo diagnostico delle SCA che prevede
l’esecuzione di un prelievo basale e di un secondo
prelievo entro 6 ore, con un risparmio di circa 1500 ore
annue di permanenza dei pazienti presso il DEA con
indubbi vantaggi nella gestione del reparto.
521
P101
MR-ProADM AND LIPOPROTEIN(a) IN
HYPERTENSIVE PATIENTS
2
2
2
1
P. Cardelli , G. Ferranti , G. Salerno , M.T. Corsetti , R.
1
2
1
1
Di Costanzo , A. Costante , R. Amodeo , V. Soldati , E.
1
2
1
2
Scaramucci , A. Tammeo , V. Polidori , L. De Biase
1
Central Laboratory, S. Andrea Hospital of Rome
II Faculty of Medicine and Psychology ‘’Sapienza’’,
Rome
2
Aim: The present study was performed to evaluate the
serum levels of midregional proadrenomedullin (MRproADM), lipoprotein(a) (Lp(a)), apolipoprotein A (apoA1) and apolipoprotein B (apo - B1) in patients with
hypertension.
Methods: The study included 16 patients with esseltial
hypertension and 15 control subjects. 87% of patients
were smokers or ex-smokers while 25% of patients were
diabetics. Blood samples were withdrawn at time 0 (before
starting therapy) centrifuged and all the serum samples
were stored at -80 °C until use. Lp(a) was measured
by nephelometric immunoassay (Siemens BNII), MRproADM was measured by a Time-Resolved Amplified
Cryptate Emission (TRACE, kit Brahms Kryptor) and apoA1 and apo-B were measured by kits Vitros Fusion 5.1
(Johnson & Johnson). The results were analyzed using
the Kruskal-Wallis, Mann-Whitney, multiple regression
and Pearson correlation (p values ≤ 0.05 were considered
statistically significant).
Results: In patients with hypertension MR-proADM and
Lp(a) serum levels were significantly (p<0.0001) higher
compared to the control group, while no modification of
apo-A1 or apo-B1 serum concentration were observed
between the groups. In multiple regression analysis with
Mr-ProADM as the dependent variable, Lp(a) was a
significant contributor to the regression (coefficient=0.019,
t=9.82 and p<0.0001). Mr-ProADM levels increased in
accord to quartiles of Lp(a) (p=0.02). The correlation
between MR-proADM and Lp(a) in hypertension patients
was r=0.95, p<0.0001.
Conclusion: The present study suggest that Mr-ProADM
and Lp(a) could be utilized for the assessment of the risk
of vascular or cardivascular complications in patients with
hypertention.
Al-Omari MA, Khaleghi M, Mosley TH Jr, et al. Midregional pro-adrenomedullin is associated with pulse
pressure, left ventricular mass, and albuminuria in
African Americans with hypertension. Am J Hypertens
2009;22:860-6.
522
P102
N- TERMINAL FRAGMENT OF BRAIN NATRIURETIC
PEPTIDE PREDICTS VASCULAR HEALTH
AND SUBCLINICAL ATHEROSCLEROSIS IN
HYPERTENSIVE: RESULTS FROM MEHLP STUDY
1
2
2
M. Franzini , L.E. Pastormerlo , C. Prontera , E.
2
2
2
2
Giannelli , M. Maltinti , P. Di Cecco , S. Masotti , A.M.
2
2
2
2
Mazzone , S. Maffei , C.L. Susini , D. Chiappino , A.
2
Clerico
1
Scuola Superiore Sant'Anna, Pisa
Fondazione Toscana G. Monasterio, Pisa
2
Background: Brain natriuretic peptide (BNP) expression
in arterial vessels increase with the evolution of
atherosclerosis, thus plasma assay of BNP N-terminal
fragment (NT-proBNP) might reflect the vascular
pathophysiology. The MEHLP is a population study aimed
to evaluate the amount of cardiovascular subclinical
pathology in an asymptomatic general population selected
from the community of Montignoso (Ms), Italy.
Methods: The population (1474 people, m±SD: 61±14
years, males 48%, left ventricular ejection fraction 58±5%,
2
cardiac mass index 118±42mg/m ) was screened with
biohumoral evaluation comprehensive of the N-terminal
fragment of brain natriuretic peptide (NT-proBNP),
coronary calcium score (CCS) assessed by thoracic
computed tomography, intima media thickness (IMT) of
common carotid artery and ascending aorta dilatation
(AAD; 850subjects) assessed by echography.
Results:
Diabetes,
hypertension
and
hypercholesterolemia were present in 11%, 41% and 38%
of subjects, respectively; 13% were actual smokers, 31%
past smokers. Median NT-proBNP was 59 ng/L (IQ range
33-101). CCS, IMT and AAD were, respectively, 156±521
U.A., 0.8±0.3 mm and 32±4 mm, with 11%, 25% and 4%
of people showing CCS, IMT and AAD respectively higher
than 400 U.A., 75° percentile, and 40 mm. CCS >400 U.A.,
IMT >75° percentile and AAD >40 mm were all predicted
at ROC analysis by plasma NT-proBNP levels (AUCs
0.589, 0.591, 0.564, respectively, p<0.05 for all). NTproBNP was higher in patients with a) CCS>400 U.A. (64,
42-128 vs. 57, 32-98 ng/L, p<0.01), b) IMT>75° percentile
(72, 38-139 vs. 58, 32-95, p<0.01), c) AAD >40 mm (65,
36-171 vs. 59, 33-99, p=0.05), despite no differences in
left ventricular ejection fraction, nor in cardiac mass; this
findings were confirmed in the subset of hypertensives,
while not in subject with diabetes, hypercholesterolemia,
or with past/present smoking habit.
Conclusions: NT-proBNP level, within the upper normal
range, predicts subclinical coronary atherosclerosis and
vascular health, namely in asymptomatic hypertensive
subjects, with no relation with heart structural and
functional involvement, possibly reflecting a vascular
source of production and secretion.
Emdin M, Fontana M, Poletti R, et al. Natriuretic peptide
testing in primary care patients. Clin Chem Lab Med
2008;46:1533-42.
P105
THE COMBINED USE OF NEUTROPHIL
GELATINASE-ASSOCIATED LIPOCALIN AND
BRAIN NATRIURETIC PEPTIDE IMPROVES
RISK STRATIFICATION IN PEDIATRIC CARDIAC
SURGERY
P106
TROPONINA CARDIACA I AD ALTA SENSIBILITA'
E ORARIO DI PRELIEVO IN CORSO DI INFARTO
ACUTO DEL MIOCARDIO
1
1
2
3
G. Bonetti , E. Agazzi , A. Affatato , L. Caimi
1
1
2
S. Storti , M. Cantinotti , V. Lorenzoni , M. Del
1
1
1
1
Fiandra , D. Chicchi , M.S. Parri , A. Romanelli , F.
1
3
Della Pina , A. Clerico
1
Fondazione Toscana G. Monasterio, Massa, Italy
CNR Institute of Clinical Physiology, Pisa, Italy
3
Scuola Superiore Sant’Anna, Pisa, Italy
1
U.O. Lab. Analisi Chimico Cliniche, Spedali Civili di
Brescia
2
U.O. Cardiologia, UTIC, Spedali Civili di Brescia
3
Dip. Scienze Biomediche e Biotecnologie, Università
degli Studi di Brescia
2
Background: Acute kidney injury (AKI) is a common
and severe complication in children undergoing cardiac
surgery for congenital heart disease (CHD). Diagnosis of
AKI in this clinical setting is at the present inadequate,
based on serial serum creatinine measurements, with
some limitations leading to a delay in diagnosis and
a failure in identifying sub-clinical damage. Clinical
relevance of brain natriuretic peptide (BNP) in pediatric
cardiac surgery has been acknowledged in the last years,
although extensive studies are still lacking. We test
the hypothesis whether the combined use of a cardiospecific biomarker (BNP) and a early marker of renal
failure (urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin
- uNGAL), may improve both risk stratification and
diagnostic accuracy of AKI in pediatric cardiac surgery.
Methods: We prospectively enrolled 135 children [median
age 7 (interquartile range 1–49) months] undergoing
cardiac surgery for CHD. Biomarkers were evaluated
pre and post operatively at different times after
cardiopulmonary-bypass (CPB): uNGAL at 2, 6 and 12
hours (h); BNP at 12 and 36 h; serum creatinine at 2, 6,
12, and 36 h. Development of AKI has been defined as
1.5 serum creatinine increase.
Results: AKI occurred in 39% of patients (65% neonates
and 32% older children, p=0.004). Peak of uNGAL values
occurred more frequently at 2-h. uNGAL values at 2-h
[median 28.2 (interquartile range 7.0–124.6) ng/L] had
a good diagnostic accuracy for early diagnosis of AKI
with an AUC (area under the curve) ROC (receiver
operating characteristic) curve of 0.85 (SE 0.034). In a
multivariable logistic regression analysis development of
AKI was significantly associated with uNGAL values at
2 h after CPB [OR=1.88 (1.30–2.72, p=0.001)], together
with CBP time and Aristotle score (index of complexity of
the surgical procedure), while pre-operative BNP values
were not. uNGAL and pre-operative BNP values (together
with Aristotele score) were significantly associated with
adverse outcome (longer intubation time and mortality).
Conclusions: Pre-operative BNP and uNGAL values after
CPB (together with Aristotle score) were independently
associated with a more severe course and worse outcome
in children undergoing cardiac surgery for congenital heart
disease.
524
Per la diagnosi di necrosi miocardica il gold standard
biochimico è rappresentato dalla troponina cardiaca
(cTn), tradizionalmente impiegata in protocollo con
prelievi seriati: all’ammissione in ospedale(H), dopo
4-6 e 12h. Nella 3a Definizione Universale dell’Infarto
miocardico (IMA) (3IM) 2012 viene indicato, con i nuovi
metodi di determinazione di cTn ad alta sensibilità, un
protocollo con 2 prelievi: basale e dopo 3-6h, ed eventuali
prelievi più tardivi in caso di ulteriori episodi ischemici;
si indica inoltre che nell'IMA il rilascio del marcatore
dovrebbe avere un tipico rilascio con incremento e/
o riduzione con almeno 1 valore superiore al livello
decisionale (LD) per necrosi miocardica.
Scopo: Valutare la cinetica di rilascio della cTnI in rapporto
all’orario di insorgenza dei sintomi in un gruppo di pazienti
(pz) con IMA impiegando un metodo ad alta sensibilità.
Materiali e metodi: In 79 pz con diagnosi di IMA (16F,
63M, età media 68a, range: 36-88a) la cTnI è determinata
con metodo LOCI su sistema Dimension Vista (LD:0.045
μg/L, CV≤10% a 99°perc.) su campioni di plasma LiHep, all’ammissione, dopo 6 e 12h. cTnI è definita
positiva (+) se ≥LD mentre la cinetica di rilascio "tipica"
quando la differenza (D) tra la concentrazione di cTnI
di campioni successivi è superiore alla D critica derivata
dalla variabilità biologica, con aumento ≥46% o riduzione
≥32%.
Risultati: Nel gruppo (Gr) di 53 pz con insorgenza sintomi
≤6h (GrA), cTnI+ a T0: n=38 (72%), cTnI+ a T6: n=15
(28%), di cui 9 con insorgenza ≤2h, 4 a 2-3h e 2 a 4h. Nel
GrA la cinetica è stata "tipica" in 46 pz (86.8%). Nel GrB
di 26 pz con insorgenza dei sintomi >6h, cTnI+ a T0: n=24
(92%), cTnI+ a T6: n=2 (8%), con insorgenza dei sintomi
a 48 e 72h. Nel GrB la cinetica si è mostrata "tipica" in 11
pz (42.3%).
Discussione e conclusioni: Nei pz studiati si evidenzia
come nel 78.5% dei casi la cTnI sia già + all’ammissione
mentre nel 21.5% lo sia a 6h. Il presente studio conferma
quanto indicato nel documento 3IM in cui si consiglia
l’impiego di un prelievo basale ed un successivo dopo
3-6h, anche se, in base ai dati riscontrati, utili potrebbero
essere 3 prelievi consecutivi: all’ammissione,dopo 3 e 6h,
in quanto il solo prelievo dopo 3h potrebbe non essere
sufficiente in caso di ammissione precoce del pz in H.
P107
TROPONINA DI ULTIMA GENERAZIONE: QUALI
RICADUTE SULLA GESTIONE DEL PAZIENTE CON
DOLORE TORACICO IN PRONTO SOCCORSO?
P108
TROPONINE CARDIACHE A CONFRONTO IN UNA
POPOLAZIONE DI SOGGETTI ANZIANI
1
1
1
1
2
M.M. Mion , G. Bragato , M. Zaninotto , G. Vettore , F.
2
3
3
1
Tosato , L. Babuin , S. Iliceto , M. Plebani
1
1
2
M.M. Mion , G. Bragato , M. Zaninotto , A. Rossi , V.
2
1
Giantin , M. Plebani
1
1
U.O.C. Medicina di Laboratorio, Az. Osp. – Univ. di
Padova, Padova
2
Dip. di Pronto Soccorso, Az. Osp. – Univ. di Padova,
Padova
3
Dip. di Scienze Cardiologiche, Toraciche e Vascolari,
Az. Osp. – Univ. di Padova, Padova
Scopo di questo studio è stato verificare l’impatto
dell’introduzione di un nuovo metodo di misura della
troponina cardiaca I (TnI) di ultima generazione, in
sostituzione al precedente (rispettivamente: DimensionVista=TnI-V; Dimension-RxL=TnI-R; μg/L; Siemens),
sulla gestione del paziente (pz) in Pronto Soccorso
(PS) e sul corrispondente tasso di ricovero ospedaliero.
Da settembre 2010 (introduzione di TnI-V in routine)
a gennaio 2011, è stata richiesta la determinazione di
TnI-V per 3886 pz in PS. Da uno studio precedente,
risulta che il range di concentrazioni TnI-V=0.046-0.400
corrisponde al range TnI-R=0.00-0.15 (cutoff per danno
miocardico: TnI-V=0.045, TnI-R=0.15). In 839 pz (gruppo
A, 21.6%) (M=440, F=399, range di età=22-102 anni),
TnI-V è risultata nel range 0.046-0.400 in PS e/o durante
il ricovero in reparto mentre in 609 pz (gruppo B,
15.7%), TnI-V era compresa nel range 0.046-0.400 già
in PS. Diagnosi principale alla dimissione (gruppo A):
infarto miocardico acuto (IMA) (69, 8.2%), patologie
(P) cardiache non-IMA (314, 37.4%), dolore toracico di
origine non cardiaca (42, 5.0%), P pneumologiche (159,
18.9%), P gastroenteriche (52, 6.2%), P neurologiche
(48, 5.7%), P nefrologiche (30, 3.6%), infezioni-sepsi (30,
3.6%), P oncologiche (25, 3.0%), P metaboliche (20,
2.4%), sincope (15, 1.8%), P ortopediche (11, 1.3%),
P psichiatriche (4, 0.5%), P ginecologiche (1, 0.1%),
altra diagnosi (19, 2.3%). Per i pz del gruppo B, sono
state riviste le schede di accesso al PS da un pool di
medici esperti, all’oscuro del dato della TnI-V: per 581
pz (95.4%) è stata riconfermata la necessità del ricovero
ospedaliero; per 28 pz (4.6%) il ricovero è stato indotto
dal solo incremento della TnI-V (>0.045). L’introduzione
in routine di un metodo per la TnI di ultima generazione,
ha consentito di identificare una maggiore percentuale di
pz con valori positivi di TnI (>cutoff) in PS mentre la % di
ricovero ospedaliero determinato esclusivamente dal dato
biochimico non è aumentata significativamente (4.6%). In
particolare, 69 pz del gruppo A (8,2%) sono stati dimessi
con una diagnosi di IMA (TnI-V>cutoff, TnI-R<cutoff)
anziché di Angina Instabile in base ai valori di TnI-V,
confermando la maggiore sensibilità nell’individuazione di
danno miocardico del nuovo metodo.
Padova, Padova
2
Clinica Geriatrica, Az. Osp. – Univ. di Padova, Padova
Lo studio ha valutato le prestazioni cliniche di 2
metodi di ultima generazione per la misura delle
troponine cardiache (Tn) e di 1 metodo di generazione
precedente (rispettivamente: Dimension-Vista=TnI-V,
Siemens; Modular E170=hsTnT, Roche; DimensionRxL=TnI-R, Siemens; μg/L), in una popolazione di soggetti
anziani. Da marzo ad ottobre 2011 sono stati arruolati
384 pazienti (pz) presso la Clinica Geriatrica. GRUPPO 1
(GR1): 30 pz afferenti agli ambulatori (6M+24F; età=69-92
aa); GRUPPO 2 (GR2): 354 pz ricoverati presso la
Clinica Geriatrica (114M+240F; età 64-105 aa). Cutoff
per danno miocardico: TnI-V=0.045, hsTnT=0.014, TnIR=0.15. Nei pz del GR1 è stato effettuato 1 solo prelievo,
mentre nei pz del GR2 sono stati effettuati ≥ 2 prelievi
seriali. I pz del GR2 sono stati classificati in base a:
A) TnI-V (NEG: ≤0.045 in tutti i prelievi; POS: >0.045 in
almeno 1 prelievo); B) diagnosi di dimissione principale
(DDP). Studio di comparazione: range di concentrazione
di TnI-V, hsTnT, TnI-R misurati in 235 campioni dei
pz del GR2, rispettivamente: 0.046-0.437, 0.010-0.550,
0.00-0.88. GR1: TnI-V è risultata <0.045 nel 100% dei
pz. GR2: 242 pz (68%) sono risultati NEG mentre 112 pz
(32%) POS. DDP nei pz del GR2, n (%; POS): Sindrome
Coronarica Acuta SCA 9 (2.5%; 9); Scompenso Cardiaco
46 (13%; 15); Patologia (P) Pneumologica PP 64 (18%;
17); P-Gastroenterica 55 (15.5%; 15); P-Neurologica 60
(17%; 18); P-Nefrologica 35 (10%; 18); P-Metabolica
6 (2%; 3); Anemizzazione 19 (5%; 3); Altro 60 (17%;
14). Nel GR2, 28 pz (7.9%) sono deceduti durante il
ricovero: 12 (43%) POS, 16 (57%) NEG. Nello studio
di comparazione, 32 (14%) e 232 (99%) campioni sono
risultati >cutoff utilizzando rispettivamente TnI-R e hsTnT.
In particolare, nei pz con SCA, TnI-R e hsTnT sono
risultate >cutoff rispettivamente nel 29% e nel 100% dei
campioni analizzati. TnI-V è risultata <cutoff nel 100%
dei pz del GR1, confermandone l’attesa specificità. GR2:
DDP più frequente=PP (18%). L’aumentata % di TnI-V
e hsTnT >cutoff nei pz con SCA (100%), ne evidenzia
la maggiore sensibilità vs TnI-R nella diagnosi precoce
di danno miocardico. I decessi, risultati più frequenti nei
pz con valori di TnI-V>cutoff (11% vs 7%), confermano
l’attesa utilità prognostica della nuova metodica di analisi.
525
P109
“TRIAGE CARDIO PANEL”: PRESTAZIONI
ANALITICHE E CLINICHE DI UN NUOVO PANNELLO
DI BIOMARCATORI SU STRUMENTAZIONE POINT
OF CARE
P110
24S-HYDROXYCHOLESTEROL IN PLASMA: A
MARKER OF CHOLESTEROL TURNOVER IN
NEURODEGENERATIVE DISEASES
V. Leoni , C. Caccia
1
1
1
1
M.M. Mion , G. Bragato , A. Karydi , M. Zaninotto , L.M.
2
1
Biasucci , M. Plebani
1
Padova, Padova
2
Istituto di Cardiologia, Università Cattolica del Sacro
Cuore, Roma
L’esigenza di disporre dell’informazione di laboratorio in
tempo utile per la gestione del paziente critico, rende
necessario il ricorso alle analisi decentrate (Point of
care Testing, POCT) presso presidi sanitari distanti dal
Laboratorio di Analisi. E’ stato valutato il nuovo pannello
biochimico "Triage Cardio 2 Panel": 2 immunodosaggi
in fluorescenza per la determinazione della troponina
cardiaca I (TnI-T) e del peptide natriuretico di tipo B
(BNP), su analizzatore Triage MeterPro (Alere San Diego
Inc.). Le prestazioni sono state confrontate con quelle dei
metodi per la determinazione del frammento N-terminale
del pro-ormone del BNP (NT-proBNP, Dimension ExL),
della troponina cardiaca I (TnI-E, Dimension ExL; TnIA, ADVIA Centaur) (Siemens Health Care Diagnostics),
della troponina cardiaca T (generazione precedente
e ultima: TnT e hs-TnT) (Roche Diagnostics). Studio
dell’imprecisione: 44 determinazioni di TnI-T e BNP
in un pool di plasma (EDTA) con 2 diversi lotti di
reattivo per 22 giorni. Studio clinico: la concentrazione dei
biomarcatori è stata determinata nel campione (plasma
EDTA) di 68 pazienti non consecutivi (45M+23F; età:
mediana, range: 70, 46-94 anni) all’ammissione in pronto
soccorso (PS) per dolore toracico. Livello decisionale
per danno miocardico: TnI-T=0.02 μg/L, TnI-E=0.045 μg/
L, TnI-A= 0.040 μg/L, TnT=0.03 μg/L, hs-TnT=14 ng/L;
livello decisionale per scompenso cardiaco: BNP=100
ng/L; NT-proBNP=450 e 900 ng/L (≤50 anni e >50
anni, rispettivamente). Studio dell’imprecisione: media
(CV%) TnI-T=0.02 μg/L (20.00%); BNP=114 ng/L (9.33%).
Diagnosi principale alla dimissione: sindrome coronarica
acuta 48 (SCA: infarto miocardico acuto 39; angina
instabile 9); patologia cardiaca non-SCA 16; altra diagnosi
4. Pazienti con concentrazioni di biomarcatore > livello
decisionale, n (%): TnI-T 47 (69%), TnI-E 48 (71%), TnI-A
50 (74%), TnT 42 (62%), hs-TnT 55 (81%); BNP 30 (44%);
NT-proBNP 35 (51%). Le caratteristiche di imprecisione
sono apparse soddisfacenti. Le prestazioni cliniche sono
risultate accurate e in linea con quelle dei metodi in uso
di routine nel laboratorio centralizzato, anche quando di
ultima generazione e ad elevata sensibilità, suggerendo
un impiego affidabile del POCT valutato nella diagnostica
di laboratorio decentrata.
526
Laboratorio di Patologia Clinica e Genetica Medica,
Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta,
Milano
Brain cholesterol is mainly involved in cell membrane
structure and in signal transduction, neurotransmitter
release, synaptogenesis and membrane trafficking.
Impairment of brain cholesterol metabolism was
described in neurodegenerative diseases, such as
Alzheimer, Huntington Diseases and Multiple Sclerosis.
Since the blood-brain barrier efficiently prevents
cholesterol uptake from the circulation into the brain,
de novo synthesis is responsible for almost all
cholesterol present there. Cholesterol is converted
into 24S-hydroxycholesterol (24OHC) by cholesterol
24-hydroxylase (CYP46A1) expressed in neural cells.
Plasma levels of 24OHC depend upon the balance
between cerebral production and hepatic elimination
and are related to the number of metabolically active
neurons in the brain. Factors affecting brain cholesterol
turnover and liver elimination of oxysterols were
found to significantly affect its plasma levels, together
with the metabolism of plasma lipoproteins, genetic
background, nutrition and lifestyle habits. Either increased
or decreased plasma 24OHC was described in patients
with neurodegenerative diseases. A group of evidence
suggest relating reduced levels to the loss of metabolically
active cells and the degree of brain atrophy. Other
processes, however, such as inflammation, dysfunction
of BBB, increased cholesterol turnover might counteract
this tendency resulting into increased levels or in not
significant changes. The study of plasma 24OHC is likely
to offer an insight about brain cholesterol turnover with a
limited diagnostic power.
Leoni V, Caccia C. Oxysterols as biomarkers
in neurodegenerative diseases. Chem Phys Lipids
2011;164:515-24.
P111
ACCURATEZZA DELLA DIAGNOSI DI SEPSI NEI
PAZIENTI AFFERENTI AL PRONTO SOCCORSO:
RIVALUTAZIONE DEGLI INTERVALLI DI
RIFERIMENTO DELLA PROCALCITONINA
1
2
1
1
G. Grandi , G. Giannazzo , A. Caldini , M. Brogi , T.
1
1
2
1
Biagioli , A. Terreni , B. Casanova , V. Ercoli , A.
1
1
Moscarella , G. Messeri
1
Firenze
2
Pronto Soccorso Medico Chirurgico e Osservazione
Breve, DEA, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi,
Firenze
La diagnosi di sepsi nei pazienti afferenti al PS deve
essere effettuata con elevata accuratezza e tempestività.
Scopo del lavoro è stato quello di rivalutare, il cutoff della Procalcitonina (PCT; eseguita h24 con test
Vidas Brahms PCT, Biomerieux) attualmente fissato a
0.5 ng/mL, mediante analisi retrospettiva nei pazienti
afferenti al PS con diagnosi di ingresso di sospetta sepsi/
infezione grave dal 1° gennaio 2011 al 31 maggio 2011.
Per ogni paziente sono stati esaminati i dati relativi
a PCT, emocromo, e eventuale emocoltura, diagnosi
di entrata e di uscita dal PS e eventuale ricovero.
Sono stati arruolati 1628 pazienti, di cui 828 (51%) di
sesso femminile e 800 di sesso maschile (49%), di età
media pari a 69 anni (range: 8-110 anni). Dividendo la
popolazione in tre gruppi (PCT, ng/mL <0,05; 0,05-0,49;
≥ 0,5) si nota che, all’aumentare della PCT, aumenta la
percentuale di ricoveri (44,07%;73,84%;85,31%) e quella
di diagnosi in uscita di sepsi (1,44%; 12,74%; 31,52%).
Inoltre, sia il numero di leucociti che la percentuale
di granulociti neutrofili, sono risultati significativamente
aumentati nel II e nel III gruppo (t-test, p<0.00001). Il
numero di emocolture positive risulta più alto nel II e
III gruppo (7;54;57), mentre la percentuale diminuisce
(78%; 73%; 43%), dato probabilmente attribuibile a
terapie antibiotiche pregresse all’accesso al PS. Per
la rivalutazione del cut-off è stata utilizzata la ROC
curve dividendo i pazienti in base alla diagnosi di
sepsi in uscita dal PS. Al cut-off attuale, 0.5 ng/mL,
la sensibilità è risultata 61%, la specificità 80% e
l’accuratezza 77%, mentre utilizzando un cut-off di 0.25
ng/mL è stata ottenuta una sensibilità del 77%, una
specificità del 72% e un’accuratezza del 72% (AUC=
0.814; p<0.0001). Utilizzando il cut-off di 0.25 ng/mL si
ottiene un significativo aumento di sensibilità (14%) a
discapito di solo il 5% di accuratezza. Dal momento che
per i pazienti in ingresso al PS è molto importante una
elevata sensibilità diagnostica e sulla base dei risultati
ottenuti, il cut-off è stata abbassato a 0,25 ng/ml, soglia
peraltro utilizzata anche nello studio RCT PROHOSP.
Schuetz P, Christ-Crain M, Thomann R, et al.
The ProHOSP Randomized Controlled Trial. JAMA
2009;302:1059-66.
P112
C’È UN TEMPO PER L’URGENZA?
C. Perani , G. Tiraboschi, B. Saladino, A. Panna, L.
Auriemma
Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Bolognini
di Seriate
Obiettivo è stato quello di analizzare la tempistica di
gestione degli esami richiesti in urgenza-emergenza.
Sono state valutate le richieste urgenti pervenute al
Laboratorio di Seriate-Azienda Ospedaliera Bolognini nel primo trimestre 2012, analizzando sia il TAT di
Laboratorio (tempo tra la ricezione del materiale biologico
e la comunicazione del risultato, prefissato in massimo
60 min) che il TAT clinico (tempo tra la formulazione
della richiesta e la disponibilità del dato, auspicato in
max. 80 min) di ogni Unità Operativa (U.O.) richiedente
dell’Ospedale di Seriate. Il Laboratorio di urgenza, aperto
24/24 ore con guardia attiva tecnica, è integrato nel
Laboratorio centrale; il trasporto del materiale biologico
è gestito dalle Unità richiedenti e la distanza si percorre
mediamente in 5 min; l’U.O. accetta e riceve le risposte
per via informatica. Di ogni richiesta è stato rilevato l’orario
di accettazione degli esami, di check-in in laboratorio e di
rilascio delle risposte. Da 21 U.O. sono pervenute 14.061
richieste in urgenza (30% dalle ore 7 alle 8.30, 35% dalle
ore 8.30 alle 14, 35% dalle ore 14 alle 7). Risulta che il
98.4% rientra nei 60 min del TAT di laboratorio (media
30 min), 1.4% tra i 60 e i 70 min per ricontrollo di dati
patologici e/o per non conformità preanalitiche, 0.1% tra
70-90 min per ritardata coagulazione delle provette di
siero per proteina C reattiva e proteine totali e 0.1% per
blocchi strumentali. Il tempo tra la prescrizione degli esami
e l’arrivo in Laboratorio del materiale biologico va da un
minimo di 1 min alle 5 ore, con un tempo medio per tutte le
U.O. di 31 min; il TAT clinico si mantiene per il 76% negli
80 min, per il 4% tra 80-90 min e per il 20% oltre i 90 min.
Sheppard C, Franks N, Nolte F, et al. Improving quality
of patient care in an emergency department: a laboratory
perspective. Am J Clin Pathol 2008;130:573-7.
527
P117
INFEZIONI DA MICETI DEL GENERE CANDIDA IN
PAZIENTI OSPEDALIZZATI NEL BIENNIO 2009-2011
V. Cortese, L. De Cristofano, A. Pesce, P. Rotondo, A.
Monteforte, C. Maisto, M.R. Righetti, R. Miceli, M.T.
Polistina
Lab. Patologia Clinica P.O. San Giovanni Bosco
Introduzione: La Candida è un micete saprofita, che
si può presentare o come un abituale commensale
dell’uomo o come patogeno. Essendo un microbo
“endogeno” le infezioni da Candida vengono definite
opportunistiche, poiché tendono a comparire quando si
verifica alterazione dell’immunocompetenza dell’ospite,
infatti la candidosi,dopo la pneumocistosi, è la più
frequente malattia opportunistica in pazienti affetti da
AIDS.
Materiali e metodi: Nel sospetto della presenza di lieviti
le colonie, bianche perlacee, cresciute dopo 24–48 h
a 37°C su Agar Sabouraud, sono state identificate con
il sistema Vitek 2 della Bio-Merieux. L’antimicogramma,
invece, è stato effettuato con tre tecniche, che davano per
ogni antimicotico testato le corrispondenti MIC: sistema
di sensibilità Sensitrite YeastOne, E-test su agar MuellerHinton e card Vitek2. Il test di sensibilità Sensitrite è un
test di microdiluizione colorimetrica. Ogni piastra contiene
96 pozzetti con concentrazioni scalari di antimicotico e un
indicatore colorimetrico. Dopo 24-48 ore d’incubazione il
viraggio dell’indicatore dal blu al rosso indica la crescita
micotica all’interno del pozzetto. Conoscendo il Break
Point di ogni singolo antimicotico, il rapporto tra MIC e
B.P. indica l’efficacia del farmaco. L’E-Test è un test
di diffusione su agar. Si allestisce mettendo su Agar
Mueller Hinton una striscia di carta bibula rettangolare,
contenente concentrazioni scalari dell'antimicotico di cui
si vuole saggiare l'attività.
Risultati: Nel biennio 09/11nel nostro ospedale sono
stati isolati 82 ceppi di miceti appartenenti al genere
Candida. Dai risultati ottenuti, concordemente con altri
autori, si evidenzia che la maggior parte delle candidosi
si riscontrano nei reparti di terapia intensiva dove sono
presenti pazienti immunocompromessi,inoltre si osserva,
che nella maggior parte dei casi C.albicans, C.sake,
C.dubliniensis e C.norvegensis risultano sensibili agli
antimicotici testati, mentre i restanti ceppi hanno acquisito
delle resistenze.
Conclusioni: I miceti del genere Candida, un tempo
sottovalutati per il loro saprofitismo naturale, diventano
oggi sempre più causa di complicanze nella degenza
ospedaliera, principalmente per due motivi:bassa
immunocompetenza dei ricoverati ed elevata tossicità dei
farmaci antimicotici.
530
P118
INTRODUZIONE DEL TSH FRA GLI ESAMI
RICHIEDIBILI DAL PRONTO SOCCORSO:
VALUTAZIONE DELLA APPROPRIATEZZA DELLA
RICHIESTA
1
1
2
1
A. Giacomini , H. Afshar , D. Foresti , M. Miolo , C.
1
2
1
3
Bacelle , M. Chiesa , P. Carraro , M. Plebani
1
Dip. Medicina di Laboratorio, Lab. Analisi Osp.
Sant’Antonio, Padova
2
Pronto Soccorso, Osp. Sant’Antonio, Padova
3
Dip. Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Università di Padova
Introduzione e scopo: Abbiamo valutato, in collaborazione
con il Pronto Soccorso (PS) dell’Ospedale S.Antonio,
l’utilizzo del TSH, test introdotto fra gli esami richiedibili
dal Pronto Soccorso (PS) degli ospedali afferenti al
Dipartimento Interaziendale Medicina di Laboratorio di
Padova.
Materiali e metodi: Nel periodo marzo-agosto 2012 sono
pervenute dal PS 240 richieste di TSH, riferite nel 25%
dei casi a patologie tiroidee anamnestiche. Il TSH è
stato determinato con metodo LOCI su strumentazione
Dimension EXL (Siemens Healthcare Diagnostics). I
livelli decisionali adottati sono stati: TSH>4mU/L per
ipotiroidismo, TSH<0.2 mU/L per ipertiroidismo. Per
ciascuna richiesta, in base al verbale di PS, sono state
valutate: congruità secondo le linee guida adottate dal
Dipartimento, efficacia organizzativa e clinica valutate in
base ad indicatori di qualità previamente concordati.
Risultati: Le richieste di TSH hanno riguardato l’1.7% degli
accessi al PS. Il motivo principale di richiesta è stato
fibrillazione/flutter atriale (73 casi), seguito da patologia
tiroidea nota (56 casi). Il TSH è risultato >4 mU/L in 22
casi (9.2% del campione) e <0.2 mU/L in 5 casi (2.0%). La
richiesta del TSH è risultata congrua nel 75.8% dei casi.
Il test ha favorito la dimissione sicura del paziente in 134
casi (55.8%), ha contribuito a determinare il ricovero in 15
casi (6.3%), non ha modificato l’atteggiamento del clinico
in 91 casi (37.9 %). Il test ha contribuito ad individuare
un percorso diagnostico idoneo in 161 casi (67.1%), un
percorso terapeutico idoneo in 136 casi (56.7%) e ha
determinato il percorso diagnostico e terapeutico in 9 casi
(3.8%): 8 aggiustamenti di terapia ed una nuova diagnosi.
Discussione e conclusioni: Il TSH si è dimostrato efficace
nell’escludere una patologia tiroidea in soggetti afferenti
al P.S. per turbe del ritmo e nel rilevare la necessità di
aggiustamenti di terapia in presenza di patologia tiroidea;
tuttavia il livello di appropriatezza della richiesta di tale
test può essere migliorato, incrementandone l’efficacia,
ed inoltre una valutazione costi/benefici è necessaria per
confermare questa implementazione.
Carraro P. Esami di laboratorio raccomandati in alcune
tipiche situazioni di Pronto Soccorso. Biochim Clin
2011;35:207-28.
P119
L’ESAME AUTOMATIZZATO DELLE URINE:
APPROCCIO BOTTOM-UP NELLA DIAGNOSI DI
RABDOMIOLISI
P120
PSEUDOPARAPROTEINEMIA RELATED TO
CONTRAST AGENT ADMINISTRATION AFTER
ANGIOCARDIOGRAPHY: DETECTION IN THE βFRACTION BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
G. Stel, F. De Biasi, P. Sala
1
Dip.di Medicina di Lab., Az. Osp-Universitaria S. Maria
d. Misericordia, Udine
Introduzione: La rabdomiolisi, patologia a eziologia
eterogenea, comporta danno ai muscoli scheletrici con
rilascio in circolo di mioglobina, molecola a basso p.m.
(17.7 kD), che filtra a livello glomerulare comparendo nelle
urine; essa rappresenta un rilevante fattore di tossicità
tubulare.
Materiali e metodi: Le urine dei tre casi di
seguito riportati sono state analizzate come campioni
di routine con sistema integrato Instrumentation
Laboratory (iChem Velocity - iQ200 Sprint). I dosaggi
della mioglobina plasmatica sono stati eseguiti in
immunochemiluminescenza (Stat Myoglobin, Abbott; val.
rif.: M <155, F <106 ng/mL) dopo l’osservazione della
discordanza tra emoglobinuria ed ematuria.
Risultati: Caso 1: F, 43 anni, utente esterna. Si
rileva incongruenza tra emoglobinuria (Hb >1,00
mg/dL) e assenza di emazie. Il sospetto di
rabdomiolisi è confermato dal dosaggio della mioglobina
plasmatica (3941 ng/mL). La paziente aveva subito
tiroidectomia totale per Ca Papillifero 20 giorni prima
e presentava franco ipotiroidismo e un quadro clinico
ed elettromiografico di polimiosite. Possibili cause del
danno muscolare: ipotiroidismo o anestesia con Propofol.
Caso 2: M, 22 anni, ricoverato in Medicina d’Urgenza.
Si rileva incongruenza tra emoglobinuria (Hb >1,00 mg/
dL) e assenza di emazie. I parametri ematochimici alterati
(CPK 178407 U/L; mioglobina 9461 ng/mL) ci indirizzano
ulteriormente verso l’ipotesi di rabdomiolisi. Storia clinica:
il paziente si era sottoposto a eccessivo sforzo fisico per
ripresa di attività agonistica senza adeguato allenamento.
Caso 3: M, 49 anni, utente esterno, esegue esami
ematochimici di base. La discordanza tra emoglobinuria
ed ematuria ci permette d’individuare la presenza di
mioglobina (2600 ng/mL). Il paziente presenta mialgie
diffuse e persistenti. In ricovero è formulata diagnosi di
dermatomiosite.
Conclusioni: L’integrazione dei dati chimico-fisici e della
parte corpuscolata in automazione, riducendo il numero
di campioni da rivedere, permette al laboratorista di
valutare attentamente e interpretare in maniera critica i
casi clinicamente più rilevanti, contribuendo a ottimizzare
la gestione del paziente, talvolta suggerendo ai clinici
elementi essenziali per una rapida diagnosi, con un
percorso “bottom-up”.
Bagley WH, Yang H, Shah KH. Rhabdomyolysis. Intern
Emerg Med 2007;2:210-8.
2
1
L. Troccoli , G. Salerno , M.T. Corsetti , R. Di
1
2
2
2
Costanzo , F. De Iuliis , M.R. Favaroni , M. Falco , R.
2
2
1
1
D'Urso , A. Proietti , F. Tabacco , L. Portaro , P.
2
Cardelli
1
Central Laboratory, S. Andrea Hospital of Rome
II Faculty of Medicine and Psychology ‘’Sapienza’’,
Rome
2
Aim: Capillary electrophoresis has become a routine
method for the detection of serum proteins. The aim of this
study, was to analyze the potential interference on serum
protein electrophoresis due to a contrast medium which
has ultraviolet absorbance as well as serum proteins.
Methods: 56 year old man with hypertriglyceridemia,
hypertension and kidney failure, was admitted at coronary
care unit (CCU) of S’Andrea Hospital of Rome, with
acute coronary syndrome. Coronary angiography was
performed in emergency using iomeprol as a contrast
medium. A first blood sample was withdraw after the
intervention and a second one was performed after 24
hours. Each was immediately sent to the laboratory for
evaluation of troponin I, creatinine and serum protein
electrophoresis.
Results: Creatinine and troponin I (Tn-I) serum levels
were respectively 2,2 mg/dL and 20.5 ng/mL. The serum
protein electrophoresis based on ultraviolet absorbance at
200 nm (Capillarys, Sebia), showed an unusual peak in
the anodic ß-fraction. After 24 h a second blood sample
was withdrawn and analyzed. The Tn-I and creatinine
serum levels were decreased (12.5 ng/mL and 1.9 mg/
dL respectively) while the unusual peak was unchanged.
The subsequent immunofixation (Sebia Hydrasys) failed
to show any monoclonal protein.
Discussion and conclusions: The present case report
described how a contrast medium (iohexol) can result as
a “monoclonal like peak” in the ß-fraction as confirmed by
immunofixation. This artifact was due to the absorbance
at 200 nm of both resolved proteins and contrast medium.
After 24 h the artifact was still present, because iomeprol
has a renal clearance, for this reason in patients with
kidney failure who have received iomeprol as contrast
medium, during the preceding 2–6 days the serum protein
analysis using the capillary electrophoresis should be
avoided.
Bossuyt X. Interferences in clinical capillary zone
electrophoresis of serum proteins. Electrophoresis
2004;25:1485-7.
531
P121
QUANTIFICAZIONE DEI LIVELLI INTRACELLULARI
DI ATP, ADP E AMP MEDIANTE ELETTROFORESI
CAPILLARE UV DETECTION AD INIEZIONE INVERSA
P122
SINDROME DELLA SACCA DELLE URINE VIOLA: UN
CASO
1
1
2
2
1
B. Scanu , F. Berlinguer , G. Leoni , M.A. Pinna , D.
1
1
1
1
Cambedda , S. Ena , M. Sanna , E. Pisanu , C.
1
1
1
Carru , L. Deiana , A. Zinellu
1
2
M.T. Muratore , R. Carrozza , G. Valeri , B.M.
2
Mongiardo
1
Lab. Analisi Osp. Belcolle, Viterbo
U.O.C. Medicina d'Urgenza, Osp. Belcolle, Viterbo
2
1
Dipartimento di Scienze Biomediche; Università di
Sassari
2
Dipartimento di Medicina Veterinaria; Università di
Sassari
L’ATP intracellulare è la più importante fonte di energia
della cellula ed il mantenimento dell’omeostasi dei livelli
di ATP ADP e AMP è un elemento cruciale per il
mantenimento delle corrette attività intracellulari. Vari
studi hanno dimostrato l’importanza dei livelli di ATP negli
spermatozoi la cui presenza a livelli ottimali garantisce
una corretta funzionalità spermatica. É stata dunque
sviluppata una nuova metodica in elettroforesi capillare
allo scopo di monitorare i livelli di ATP intracellulare.
L’analisi dei nucleotidi veniva eseguita in elettroforesi
capillare UV detection mediante una procedura di riverseinjection, in cui il campione viene caricato all’outlet per
ridurre il percorso elettroforetico ed i tempi analitici. La
separazione di ATP, ADP ed AMP in elettroforesi capillare
può essere eseguita mediante l’impiego di un tampone
sodio acetato 60 mmol/L a pH 3.8 su un capillare da 30
cm di lunghezza totale e 75 μm di diametro. In queste
condizioni elettroforetiche ed utilizzando un sistema di
iniezione normale i tempi analitici sono di circa di 30
min e possono essere ridotti a 10 min aggiungendo al
tampone della corsa metilcellulosa ad una concentrazione
finale dello 0.01%. I tempi analitici sono stati ulteriormente
ridotti utilizzando il sistema di iniezione inversa che
garantiva una separazione degli analiti in meno di 3
min. Le condizioni così adottate garantiscono un’ ottima
riproducibilità sia intrasaggio (CV=4%) che intersaggio
(CV=8%) ed un buon recupero analitico (99.0%). La
metodica è stata applicata allo scopo di valutare la
criotolleranza degli spermatozoi nei grifoni. Sono state
eseguite delle analisi dei livelli di ATP prima e dopo
la crioconservazione del seme di 4 soggetti differenti.
Come atteso i livelli di ATP si riducevano a seguito della
procedura di congelamento (1.19 ± 0.16 nmol ATP/10*6
spermatozoi nel seme fresco rispetto a 0.22 ± 0.27 nmol
ATP/10*6 spermatozoi del seme scongelato, p< 0.001).
In conclusione la metodica permette la quantificazione
intracellulare di ATP fornendo un utile strumento agli studi
di crioconservazione in quanto la valutazione di questo
analita permette di valutare la vitalità degli spermatozoi a
seguito delle procedure di congelamento.
532
Le urine normalmente gialle possono assumere diverse
colorazioni: arancio, rosso, verde, blu, marrone, nero,
in relazione ad eventi fisiopatologici e/o a contaminanti.
Recentemente è giunta alla nostra attenzione un’urina
di colore viola di un paziente di anni 78 ricoverato in
Medicina, per scompenso cardiaco. Al ricovero indici
di flogosi aumentati, creatinina al limite superiore,
transaminasi, bilirubina e fosfatasi alcalina normali,
emoglobina 12.4 g/dL, globuli bianchi 4130/mmc,
piastrine 96000/mmc. In seconda giornata applicazione di
catetere vescicale, in diciassettesima giornata comparsa
di urine viola nella sacca di raccolta. Esame chimico
fisico: densità 1014, pH 8.5, albumina 30-70 mg/dL,
emoglobina assente, esterasi leucocitaria 500, nitriti
assenti; sedimento: cristalli di triplo fosfato, >40 leucociti
pcm, batteri, corpuscoli nero-violacei. Viene consigliata
dal laboratorio l’esecuzione dell’urinocoltura e del profilo
proteico urinario. Al paziente viene sostituito il catetere,
somministrata idratazione con 1000 cc di fisiologica ed
effettuati lavaggi vescicali. In diciottesima giornata le urine
tornano chiare, il sedimento evidenzia tappeto di leucociti,
>2 cilindri ialini pcm, cristalli di triplo fosfato, emazie
isomorfe e fosfati amorfi ed assenza dei corpuscoli
violacei del giorno precedente. Il profilo proteico urinario
evidenzia una lieve proteinuria glomerulare non selettiva.
L’urinocoltura evidenzia un’infezione urinaria con carica
batterica costituita da Proteus Mirabilis >100000 ufc/mL
risolta con chinolonici per os. E’ stata diagnosticata una
PUBS (purple urine bag syndrome), patologia attribuibile
a infezione del tratto urinario soprattutto in pazienti
cateterizzati con costipazione intestinale. Questa rara
sindrome riscontrata già nel 1812 al re Giorgio III e
descritta in letteratura nel 1978 è dovuta alla presenza
nelle urine di batteri (Klebsiella spp, P.mirabilis, E.coli,
Providencia stuarti, Enterococcus spp) producenti indossil
solfatasi. Il triptofano alimentare, deaminato dalla flora
intestinale ad indolo, è poi trasformato in indossile solfato
infine ossidato a indaco e indirubina responsabili del
colore viola. La sindrome malgrado le apparenze è
normalmente benigna.
Hadano Y, Shimizu T, Takada S, et al. An update on
purple urine bag syndrome. Int J Gen Med 2012;5:707-10.
P123
STUDIO DI PREVALENZA DELLE DOPPIE O
TRIPLE COMPONENTI MONOCLONALI E DELLE
COMPONENTI BICLONALI E TRICLONALI NEI
LABORATORI DEL SERVIZIO DI PATOLOGIA
CLINICA DELL’A.O.O.R. PAPARDO-PIEMONTE DI
MESSINA
G. Falliti, G. Sauta, M.L. Natoli, L. Baldini, A. Barrile , P.
Irrera, P. Noto, F. Tavilla, M.L. Giunta
Servizio di Patologia Clinica, A.O.O.R. PapardoPiemonte, Messina
Introduzione: Oltre a malattie immunoproliferative
caratterizzate dalla produzione di Ig monoclonali e di
gammopatie monoclonali benigne esistono situazioni
contraddistinte dalla dimostrazione elettroforetica di due
o tre CM, la cui presenza non implica necessariamente
una diagnosi di processo evolutivo maligno. Esiste sia
una doppia o tripla CM di significato indeterminato
(65% dei casi), sia la doppia o tripla CM mielomatosa
(16%) che quella associata a linfomi, macroglobulinemia
di Waldenström, LLC e malattie linfoproliferative non
classificate (19%). I pazienti con doppia o tripla CM di
significato incerto rimangono solitamente clinicamente
stabili, tranne nei rari casi in cui si ha un’evoluzione verso
un mieloma multiplo. Esiste inoltre la componente bi-e
triclonale,dovuta alla proliferazione di due o tre cloni di
cellule immunocompetenti, producenti Ig o catene leggere
libere dello stesso tipo.
Materiali e metodi: L’elettroforesi proteica capillare si
esegue tramite lo strumento “Capillarys” della ditta SEBIA,
utilizzato altresì per effettuare l’immunosottrazione.
L’immunofissazione su gel d’agarosio si esegue
utilizzando lo strumento “Hydrasis” della ditta SEBIA.
Risultati: Dall’analisi delle IFEs del quinquennio
2008-2012 si è notata un’ampia variabilità di doppie
CM, con una percentuale del 2,45% sul totale di curve
presentanti CM e casi di tripli CM (0,38%). E’stato
messo in evidenza anche un caso di tripla CM di un
paziente ricoverato nel reparto di dialisi. Questa presenza
pur rappresentando un campanello d’allarme è stata
diagnosticata come condizione transitoria riferibile ad
eventi clinici non prettamente ematologici. Si nota una
discreta percentuale (1,99%) di componenti biclonali e rari
casi di componenti triclonali. Infine nelle IFEu sono state
evidenziate alcune doppie CM (0,67%) ed un caso di tripla
CM.
Conclusioni: La bassa frequenza di curve con
doppie o triple CM e componenti bi- e triclonale
favorisce l’applicazione di protocolli di monitoraggio
della progressività delle condizioni dei pochi pazienti
presentanti tali particolari anomalie. In futuro le doppie e
triple CM e le componenti biclonali e triclonali saranno
studiate in maniera più approfondita per l’applicazione di
protocolli di studio sulla “malattia minima residua”.
P124
STUDIO DI PREVALENZA DELLE COMPONENTI
MONOCLONALI NEI LABORATORI DEL SERVIZIO
DI PATOLOGIA CLINICA DELL’A.O.O.R. PAPARDOPIEMONTE DI MESSINA
G. Falliti, G. Sauta, M.L. Natoli, G. Siracusa, A.
Cavaleri, A. Barbera, R. Gervasi, M. Carilli, M.L. Giunta
Servizio di Patologia Clinica, A.O.O.R. PapardoPiemonte, Messina
Introduzione. Le CM nel tracciato elettroforetico inducono
ad adottare algoritmi diagnostici per la quantificazione
delle componenti stesse, fornire indizi sulla loro natura
consentendo adeguate diagnosi e trattamenti terapeutici.
Quando la CM è <3 g/dL e non è accompagnata da
nessuna alterazione nell’organismo si parla di MGUS.
Le CM sono tipizzate con l’immunofissazione (IFE) o
l’immunosottrazione (ISE). E’ possibile definirne la natura
benigna o maligna solo con il criterio di progressività.
Materiali e Metodi: L’elettroforesi proteica capillare
ed Immunosottrazione si eseguono con lo strumento
“Capillarys” della ditta SEBIA. L’immunofissazione su gel
d’agarosio si esegue impiegando lo strumento “Hydrasis”
della ditta SEBIA.
Risultati: Sono stati analizzati i dati riguardanti le
curve patologiche della foresi dal 2009 al 2012. Prese
in considerazione la provenienza dei pazienti ovvero
se ricoverati nei due Presidi Ospedalieri dell’A.O.O.R.
Papardo-Piemonte, se utenti esterni, il loro sesso e la
loro età, abbiamo evidenziato, scartando le ripetizioni,
24228 tracciati elettroforetici, di cui 1298 patologici e 656
presentanti CM. Nel P.O. “Papardo” si è osservata una
media del 7% di curve patologiche ed una media del 3,3%
presentanti CM. Nel P.O. “Piemonte” si è evidenziata una
media di curve patologiche del 2,16%, ed una media
dell’1,56% presentanti CM. Età media di individui con la
CM è di 68,51 anni con prevalenza di 1,17 negli uomini
(54%) rispetto alle donne (46%). Nelle IFEs si è notata una
prevalenza delle CM di tipo IgGκ. Nelle IFEu si è osservata
la prevalenza di CM di tipo IgGλ.
Conclusioni: La differenza di percentuali di CM tra i due
Presidi Ospedalieri è giustificata dalla presenza di pazienti
del reparto di Ematologia nel P.O. “Papardo” con una
percentuale del 68% rispetto alla totalità dei casi osservati
di CM. Tale percentuale ci consente di attuare protocolli
operativi e flow-chart dedicati.
Di Pietro R, Portera M, Antoci F, et al. Screening di CM in
un campione rappresentativo della popolazione siciliana
nel distretto nebroideo. Biochim Clin 2005;29:245.
Dolci A, Vernocchi A. Aspetti metodologici nella ricerca e
caratterizzazione delle componenti monoclonali nel siero.
Biochim Clin 2012;36:84-7.
533
P125
ULERA CORNEALE DA PSEUDOMONAS E
ACANTHAMOEBA IN PAZIENTE PORTATORE DI
LENTI A CONTATTO
P126
VALUTAZIONE DEL CITOFLUORIMETRO SYSMEX
UF-1000i NELLA DETERMINAZIONE DEL NUMERO
DI SPERMATOZOI NEL LIQUIDO SEMINALE
V. Cortese, G. Carlini, M. Cioffi, C. Maisto, M.R.
Righetti, L. De Cristofano, R. Miceli, A. Monteforte, A.
Pesce, P. Rotondo, M.T. Polistina
G. Previtali, S. Bussaconi, C. Fermi, P. Rossetti, A.
Turini
Lab. Patologia Clinica P.O. San Giovanni Bosco
Introduzione: Il genere Pseudomonas è formato da bacilli
Gram negativi. La specie aeruginosa è la più diffusa,le
infezioni da essi provocate possono interessare molti
distretti anatomici. Un’infezione dell'occhio sostenuta da
Pseudomonas aeruginosa spesso risulta secondaria a
contaminazione delle lenti a contatto. Oltre ai bacilli
del genere Pseudomonas, l'occhio può essere attaccato
anche da un protozoo patogeno veicolato dalla polvere
l'Acanthamoeba.
Caso clinico: Paziente portatrice di lenti a contatto
morbide, si è presentata all'attenzione degli oculisti,
riferendo dolore intenso all'occhio sinistro, fotofobia,
riduzione del visus e presenza di secrezione abbondante.
Il materiale purulento è stato raccolto con un tampone
ed inviato in Microbiologia, per l’esecuzione dell'esame
colturale.
Materiali/metodi: Giunto in laboratorio sono state
allestite semine su terreni selettivi. Dopo 24 ore a
37 °C su agar cetrimmide si sono sviluppate delle
colonie successivamente identificate per Pseudomonas
aeruginosa dal sistema Vitek 2 della Bio-Merieux.
L'antibiogramma è stato eseguito con il metodo Kirby
Bauer utilizzando solo dischetti corrispondenti ad
antibiotici disponibili sotto forma di colliri e/o pomate
oftalmiche.
Risultati: La paziente è stata trattata dagli oculisti,
con instillazioni di Levofloxacina collirio e Colistina
preparazione iniettabile per instillazione topica. La terapia
è proseguita poi con la sola Levofloxacina collirio fino a
cinque giorni dopo la completa riepitelizzazione. In seguito
si è verificata una riacutizzazione del processo flogistico
che ha reso necessario un ulteriore approfondimento
diagnostico dal quale è emerso la scomparsa dello
Pseudomonas, ma allo scraping si è avuta la presenza di
cisti di Acantoameba. A guarigione avvenuta, la paziente
è stata sottoposta a trapianto di cornea.
Conclusioni: Un’infezione mista della cornea da
Pseudomonas ed Acantoameba costituisce, in
oftalmologia, un evento di estrema gravità. In caso
di infezioni sostenute da tali patogeni è fondamentale
approntare subito un idoneo protocollo diagnostico e
terapeutico. Questo dimostra che è indispensabile, con
pazienti “gravi”, la stretta collaborazione tra microbiologo
ed oculista, vista anche la diffusione sempre maggiore
che le lenti a contatto stanno avendo.
534
U.O. di Patologia Clinica, Osp. di Fidenza, AUSL di
Parma
La determinazione del numero di spermatozoi è
fondamentale nel valutare la fertilità maschile. Da alcuni
anni è stato introdotto in commercio il citofluorimetro
Sysmex UF-1000i, come evoluzione del Sysmex
UF-100,che è un analizzatore automatico dedicato
all'esame del sedimento urinario. Scopo di questo
studio è stato quello di valutare l'analizzatore Sysmex
UF-1000i nella determinazione del numero di spermatozoi
confrontando i dati in citofluorimetria con quelli ottenuti
con la microscopia ottica in camera di Thoma. Nel
rispetto della dichiarazione di Helsinki sono stati utilizzati
in maniera anonima 150 campioni di liquido seminale
raccolti secondo le indicazioni del manuale WHO. Dopo
fluidificazione i campioni, diluiti con soluzione spermicida,
sono stati analizzati effettuando contemporaneamente
il conteggio degli spermatozoi sia con microscopio
ottico (diluizione: 1/20) che con analizzatore UF-1000i
(diluizione: 1/100). Le due metodiche sono state messe
a confronto mediante regressione di Passing-Bablok
e diagramma delle differenze di Bland Altman. La
regressione di Passing-Bablok mostrava una retta pari
a y = 0,933x + 1,27. L'intervallo di confidenza al 95%
(CI) per l'intercetta era compreso tra 0,43 e 2,58; il
CI per il coefficiente angolare era compreso fra 0,88
e 0,98. Nel diagramma di Bland Altman risultava una
differenza percentuale media di + 0,2% con un CI
compreso fra - 3,52% e + 3,92%. I limiti inferiore e
superiore delle differenze in percentuale osservate erano
rispettivamente : - 38,1% e +38,6%. L'analisi statistica
evidenziava una buona correlazione fra i due metodi
con un test di Cusum che indicava una non significativa
deviazione dalla linearità (p>0,10),anche l'analisi delle
differenze percentuali mostrava differenze statisticamente
non significative fra i due metodi. La necessità di
standardizzazione e le difficoltà di conteggio nelle
camere citometriche incoraggiano l'utilizzo del sistema
diagnostico Sysmex UF-1000i nella determinazione degli
spermatozoi nel liquido seminale.
World Health Organization. Laboratory manual for the
axamination of human semen and sperm-cervical mucus
interaction. Cambrige: University Press, 2009.
P127
VALUTAZIONE DEL RISCHIO CHIMICO AL QUALE
E’ ESPOSTO IL PERSONALE DEL LABORATORIO
MEDICO DELL’ASL DI VARESE
P128
ALLERGIA ALIMENTARE AL GRANO: UTILITA' DEL
TRI A 14
1
L. Bressan, N. Corcione
Lab. Medico, Dip. di Prevenzione Medico, ASL Varese
Il laboratorio è un ambito lavorativo che presenta rischi
per la salute e la sicurezza del personale e spesso tale
rischio non è percepito, con la conseguente possibilità
di danni per gli operatori. Con lo studio ci proponiamo
di valutare il rischio chimico (RC) al quale è esposto
il personale dell’U.O. Laboratorio Medico dell’ASL di
Varese. Esso prevede una valutazione preliminare e in
seguito approfondita del RC. La valutazione preliminare
è stata eseguita con la metodologia Hierarchisation des
risques potentiels che porta alla determinazione della
classe di priorità: A, B o C. Per le sostanze chimiche della
classe A, valore numerico (v.n.) tra 1 e 8 o B v.n. tra 9
e 18, è necessario eseguire l’analisi dettagliata del RC
poiché è probabile che queste sostanze presentino un
rischio non irrilevante per la sicurezza dei lavoratori; per
quelle relative alla classe C, con v.n. tra 19 e 25, il rischio
è irrilevante. Bisogna precisare che l’algoritmo adottato
presenta delle criticità che potrebbero sovrastimare la
sostanza chimica collocandola in una classe di priorità
più alta. Per ovviare a tale inconveniente, sono stati
considerati i prodotti chimici con v.n. da 1 a 15. La
valutazione approfondita del RC è stata condotta usando
il Movarisch che consente di assegnare un v.n. al rischio
in modo da classificare la sostanza nel seguente modo:
rischio irrilevante per la salute con R: 0,1≤R<15 e 15≤R<21
(intervallo di incertezza) o rischio superiore al rischio
irrilevante per la salute (21≤R≤40, 40<R≤ 80 e R>80). Sono
state valutate 81 sostanze. Dall’analisi preliminare è stata
accertata la presenza di 17 sostanze appartenenti alle
classi A e B; successivamente, esse sono state sottoposte
a valutazione approfondita del RC dal quale è emerso
che 2 sostanze presentano un valore di R nell’intervallo
di incertezza (supplemento di crescita legionella BCYE
e NAOH), 7 sostanze hanno un rischio irrilevante per la
salute e 8 sostanze presentano un rischio superiore al
RC irrilevante per la salute (Supplemento selettivo Bolton
Broth e Preston Campylobacter, NIN, ZYM B, metanolo,
acetamide, reattivo di Nessler, ipoclorito di sodio). I dati
ottenuti ci sembrano confortanti e indicano che RC nel
laboratorio medico è basso per la sicurezza e irrilevante
per la salute dell’operatore.
2
1
1
B. Cinti , L. Antonicelli , V. Viola , G. Ciarrocchi , M.
1
Tocchini
1
Lab. Analisi, Azienda Ospedaliero-Universitaria
Ospedali Riuniti, Ancona
2
Allergologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria
L'introduzione nel nuovo pannello del microarray
ImmunoCAP ISAC (ThermoFisher) della LTP (Lipid
Transfer Protein) del grano, rTri a14, ha facilitato la
gestione di un caso di allergia alimentare complesso.
Una paziente, di 35 anni, con già diagnosticata
allergia respiratoria (acari, graminacee, cipresso, gatto)
e sospetta allergia alimentare (orticaria/angioedema e
anafilassi da esercizio fisico dopo assunzione di frutta,
mais, grano) è giunta alla nostra osservazione per
reazione anafilattica dopo ingestione di una piadina.
Le IgE specifiche testate presso un altro centro
(ImmunoCAP-ThermoFisher), evidenziavano, oltre agli
inalanti, positività per grano, mais, grano saraceno,
pomodoro, prezzemolo, assenzio, semi di girasole, e
per le LTP alimentari testabili con questo sistema:
rPru p3, rAra h9, rCor a8. I prick tests da noi
effettuati confermavano le positività verso pesca,
arachide, nocciola, pomodoro, farina e mais. La dieta
di esclusione, autogestita dalla paziente e sempre più
allargata, determinava un vistoso dimagrimento e grave
compromissione della vita sociale. E' stato quindi testato
il siero su ImmunoCAPISAC (ThermoFisher). Il risultato
ha confermato l'allergia verso gli inalanti e ha evidenziato
la positività verso tutte le Lipid Transfer Protein (LTP)
presenti nel microarray: rAra h9, rCor a8, nJug r3,
rPru p3, nArt v3, rPla a3 ed in particolare rTri a14 =
LTP del grano, inserita nel nuovo pannello ISAC da
112 allergeni. Non sono state rilevate IgE specifiche
verso le altre componenti molecolari del grano. La
rTri a14, a differenza delle altre LTP, risulta essere
termolabile; il test di esposizione orale ad alimenti con
patata cotta, riso cotto, pasta cotta ha dato in effetti
esito negativo. E' seguita una normalizzazione della dieta
con la graduale reintroduzione di alimenti quali patata,
pasta cotta, verdure cotte, mela e pesca sbucciate. La
sensibilizzazione a rTri a14, nota anche come causa dell'
“asma del fornaio”, è associata a problemi respiratori, più
che a problemi alimentari. La cottura dei cibi contenenti
grano e derivati, ne permette l'assunzione. Sono da
evitare in ogni caso alimenti contenenti farina poco cotta
come pizza e piadina.
535
P129
ESAMI DI SCREENING PER I NEO ASSUNTI:
UTILITA' DELLA CRD NELLA SENSIBILIZZAZIONE
AL LATTICE DI GOMMA
P130
ESTRATTI E FRAZIONI MOLECOLARI IN SINERGIA
NELLA DIAGNOSTICA ALLERGOLOGICA
MOLECOLARE: UN CASO CLINICO INTERESSANTE
V. Viola, B. Cinti , G. Ciarrocchi , M. D'Anzeo, T.
Santini, L. Marinelli, M. Tocchini
B. Cinti , L. Antonicelli , V. Viola , G. Ciarrocchi , M.
1
Tocchini
Laboratorio Analisi, Azienda Ospedaliero-Universitaria
1
2
1
1
1
Lab. Analisi, A.O.U. Ospedali Riuniti, Ancona
Allergologia, AOU Ospedali Riuniti, Ancona
2
La prevalenza di sensibilizzazione al lattice di gomma
risulta essere nella popolazione generale del 3,3-18,6%
(secondo la popolazione studiata e il test diagnostico
utilizzato) e del 3-17% negli operatori sanitari altamente
esposti. Nella gestione delle criticità del rischio lavorativo
l’Azienda Ospedali Riuniti di Ancona prevede per
gli operatori sanitari obbligati ai DPI (dispositivi di
protezione individuale), l'inserimento del dosaggio delle
IgE specifiche (sIgE) per il lattice di gomma (k82) nel
pannello degli esami ematochimici da testare al momento
dell'assunzione. Solo in caso di positività (sIgE per k82
>0,10 KUa/L), si procede con la ricerca delle sIgE verso
le singole molecole allergeniche in modo da fornire un
preciso profilo di sensibilizzazione. Il dosaggio delle sIgE
verso il lattice è stato eseguito su un analizzatore UniCap
250 - metodo FEIA (ThermoFisher). Sono stati eseguiti
dosaggi su 478 campioni di operatori sanitari (ausiliari,
infermieri, tecnici di laboratorio, medici, biologi,..) inviati
dal DSTB (Ufficio Medico Competente) nel periodo
compreso dal 01/01/10 al 30/06/12. Dei 478 campioni
testati, 13 (pari al 2,7%) sono risultati positivi al k82 (0,67
KUa/L– 14,9 KUa/L); nei positivi, la ricerca di sIgE verso
le singole molecole allergeniche ha evidenziato in 11
campioni (84,6%) la sola positività verso la profilina rHev
b8; un operatore sanitario, chirurgo, ha riportato sIgE per
Hev b 5 pari a 4,77 KUa/L, mentre le sIgE di un secondo
operatore, infermiere, sono risultate positive per Hev b
6.01=0,80 KUa/L e Hev b 6.02 = 0,72 KUa/L. In questo
studio quindi la prevalenza vera di sensibilizzazione al
lattice di gomma negli aspiranti operatori sanitari scende
al 0,4%. La CRD nella diagnostica allergologica in vitro
è fondamentale per smascherare le cross-reattività: in
particolare nella sensibilizzazione al lattice di gomma
la CRD permette di distinguere una sensibilizzazione
alla profilina, panallergene comune all'ambiente vegetale,
di scarso significato allergologico, da una più grave
verso componenti molecolari, quali Hev b5 e Hev b6,
che rivestono una rilevanza clinicamente significativa
soprattutto negli operatori sanitari esposti al lattice.
536
La diagnostica allergologica in vitro si avvale oggi del
dosaggio delle IgE specifiche verso gli estratti allergenici
e verso le singole componenti molecolari ricombinanti o
altamente purificate. Nell'aprile 2012 è giunta alla nostra
osservazione una paziente, di 10 anni, per sindrome
orale allergica (SOA) e angioedema al volto, a seguito
di ingestione di carne di pollo. Sintesi anamnestica: nel
2003, all'età di un anno, l'ingestione di pesce (sogliola)
aveva causato orticaria generalizzata e tosse insistente.
Era stato quindi escluso totalmente il pesce dalla dieta e
nonostante ciò si erano manifestati successivamemente
episodi di eruzioni cutanee al semplice contatto con
oggetti contaminati da residui di pesce. Nel 2010
erano insorti disturbi faringei dopo ingestione di noce
e venivano segnalati transitori episodi di dispnea da
sensibilizzazione verso inalanti (acari e cipresso). Nel
2012 si è manifestata una sindrome orale allergica
e angioedema al volto dopo ingestione di carne di
pollo; in quell'occasione è stato prelevato il siero e
testato con il sistema in microarray ImmunoCAP®ISAC
(ThermoFisher). Il risultato ha confermato la presenza
di IgE specifiche (sIgE) verso noce (nJug r1), cipresso
(nCup a1) e acari (rDer f2 e nDer p1) e verso il pesce
(rGad c1 - parvalbumina). Risultavano completamente
assenti le sIgE verso le altre albumine sieriche e la
livetina, l'albumina sierica del pollo (nGal d 5). L'ipotesi
formulata è stata allora che la carne di pollo, fino a quel
momento consumata senza problemi, fosse stata causa di
reazione in quanto contaminata durante la manipolazione
con del pesce o che l'animale fosse stato alimentato con
mangimi contenenti farine di pesce. Al fine di confermare
quest'ipotesi, abbiamo dosato le sIgE verso l'estratto di
pollo (f83) su ImmunoCAP 250 (ThermoFisher). Il risultato
è stato sIgE = 0,29 KU/L. E' stato effettuato lo skin
prick test con estratti di pollo, di due ditte differenti
(Alk Abellò e Lofarma) che ha confermato la positività
rilevata in vitro. Il percorso diagnostico seguito per
questa paziente, dimostra che la diagnostica sierologica
tradizionale basata sugli estratti può essere di supporto e
a completamento della più sottile e innovativa diagnostica
molecolare su microarray.
P133
VALUTAZIONE DELLA PERFORMANCE DI UN
NUOVO TEST QUANTITATIVO PER IL DOSAGGIO
DELLE IgE SPECIFICHE SU SIERO UMANO CON
METODICA IN IMMUNOBLOT
A. Caccamo, G. Genovese, P. Sarica, D. Mazzacuva, M.
Francone, R.E. Saladino, G. Romeo
Lab. di Tipizzazione Tissutale, Az. Osp. BMM di Reggio
Calabria
Scopo: valutare la performance analitica di un nuovo
sistema diagnostico immunoblot per la quantificazione di
IgE specifiche su siero umano, espresse in UI/ml e classe
allergenica con accuratezza decimale.
Materiali e metodi: “Allergyscreen”, Mediwiss GmbH, usa
tecnologia immunoblot con allergeni o mix fissati su
membrane di nitrocellulosa. Ogni banda si riferisce ad
un singolo allergene o mix. La membrana contiene 20
bande e il controllo pos. Un lettore automatico legge le
strip, il software di analisi elabora i dati ed archivia i
referti. I risultati sono espressi in IU e classe allergenica. Il
sistema è stato valutato partecipando al programma VEQ
gestito da DigitalPT per VEQ membro Internazionale di
EQA, presso AOU di BO S.Orsola-Malpighi: programmi
ALLY443 (inalanti), FOOD443 (alimenti). I programmi
annuali prevedono 4 invii trimestrali. Sono stati raffrontati
i risultati ottenuti da “Allergyscreen” con quelli ottenuti da
~ 65 laboratori con tecnologia ImmunoCAP considerata
riferimento per la diffusione internazionale.
Risultati: in ALLY433 sono stati testati: D1, D2, M6, E1,
E2, E5, T3, T4, T9, W19, W21, I1, I3 alcuni con 2/3
invii. I risultati delle due metodiche sono sovrapponibili
come da schede riassuntive. Le positività sono state tutte
riconosciute: per 14 allergeni veniva data stessa classe,
per 10 di questi il valore in KU/L rientrava nella dDS,
per 11 allergeni veniva assegnata una classe allergenica
diversa (per 8 una/due classi sup., per 2 una classe inf.).
In FOOD443 sono stati testati: F1, F2, F4, F13, F17, F25,
F26, F49, F84, F95, alcuni in più invii. I risultati delle due
metodiche sono sovrapponibili. Le positività sono state
così riconosciute: 15 all. stessa classe, per 6 di questi il
valore KU/L rientrava nella dDS; per 5 veniva assegnata
una classe allergenica diversa (3 una o più classi sup., 2
una classe inf.). Agli all. F2, F26, F95, in due invii, è stata
assegnata con entrambe le metodiche classe 0. In un solo
episodio, in approfondimento, l’allergeneF17, analizzato
in due invii, ha avuto nel I° invio classe 0 contro classe 1,
2 o 3; nel II° ha avuto classe 3 come 31 laboratori su 57.
Conclusioni: La metodica Allergyscreen ha confermato la
correttezza di tutte le risposte e l’assoluta sovrapponibilità
dei risultati con ImmunoCAP.
538
P134
DETERMINATION OF URINARY EXCRETION OF
CYSTINE BY HPLC-FL ON HEALTHY POPULATION
1
1
1
F. Corrente , J. Gervasoni , A. Cocci , B.
2
1
1
Zappacosta , C. Zuppi , S. Persichilli
1
Laboratorio Analisi I, Policlinico Universitario A.
Gemelli, Roma
2
U.O.C. Laboratorio Analisi, Fondazione di Ricerca e
Cura Giovanni Paolo II, Campobasso
Introduction: Cystinuria is an inheritable autosomal
recessive disorder of amino acids transport affecting
the epithelial cells of the renal tubules and
gastrointestinal tract. It is characterized by abnormal
urinary concentrations of cystine and other dibasic amino
acids, resulting in formation of crystals increasing risk
of kidney stones. Initially in our laboratory cystinuria
was measured by a semiquantitative method based
on the reaction of cyanide nitroprusside (Brand’s test).
However, diagnosis and therapeutic control of cystinuria
required an accurate determination of the urinary cystine
concentration. Therefore, a quantitative measure by an
HPLC method was preferred to Brand’s test. In this work
we report cystinuria evaluation on a healthy population
proposing cutoff values by HPLC-FL method.
Methods: Eighty 24-h urine samples were collected
from healthy subjects (37 male and 43 female;
20-80 age range). Our method involves the use of
tri-n-butylphosphine to reduce disulfides in urine to
their reduced forms. After protein precipitation with
trichloroacetic acid, the reduced sulfhydryl groups
were derivatized using the thiol-specific fluorogenic
reagent 4-(aminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole
(ABD-F) in borate buffer (pH 8). The reaction products
were separated by HPLC, detected and quantified
by fluorescence detection (λex: 385 nm; λem: 515
nm). Integration and elaboration of the chromatographic
peaks were carried out by using ChromQuest 5.0
software (Thermo Fisher Scientific). Urinary creatinine
was quantified using an enzymatic method (Cobas C311,
Roche Diagnostics).
Results: We determined the reference values of cystine
in urine of healthy subjects. Total cystine was 84,5±42,5
μmol/g creatinine (mean±DS) and it ranged from 14,8 to
166,0 μmol/g creatinine (2,5th - 97,5th percentiles).
Conclusions: These values well agree with reference
ranges of cystinuria obtained by other Authors using both
HPLC and LC-MS/MS analysis. The cystine levels in our
group showed a Gaussian distribution with a typical bellshaped curve. No differences were observed between
males and females.
Kusmierek K, Chwatko G, Glowacki R, et al.
Determination of endogenous thiols and thiol drugs in
urine by HPLC with ultraviolet detection. J Chromatogr B
Analyt Technol Biomed Life Sci 2009;877:3300-8.
P135
ESTIMATED GLOMERULAR FILTRATION RATE
MAY HELP DETECT CHRONIC KIDNEY DISEASE IN
ELDERLY PEOPLE WITH SERUM CREATININE STILL
IN THE NORMAL RANGE
1
2
3
1
F. Busco , R. Festa , R. Testa , A. Marziali , A.R.
3
1
1
Bonfigli , M. Boemi , R. Galeazzi
1
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche e Molecolari,
INRCA, Ancona
2
Dipartimento di Scienze Cliniche e Molecolari,
Università Politecnica delle Marche
3
INRCA, Ancona
Aim: Chronic kidney disease (CKD) is a condition of
great impact on both the quality and quantity of life, as
well as healthcare costs. It is an age-related disease,
with important and common conditions as risk factors:
cardiovascular disease, diabetes, hypertension, obesity.
So, prevention and early diagnosis are crucial. A simple
and cheap lab test correlating closely with the glomerular
filtration rate (GFR) would be the ideal approach. Serum
creatinine alone is not a reliable marker of CKD, especially
in the elderly population, because of the creatinine-blind
range. In fact, serum creatinine decreases with age
despite the decline in GFR, resulting in an increased
number of patients with CKD but a normal creatinine
value. The aim of this study was to test the effectiveness
of estimated GFR (eGFR) to identify the presence of CKD
in elderly patients with serum creatinine in the blind range,
i.e. still normal.
Methods: Seventy patients from INRCA hospital in
Ancona, both outpatients and hospitalized (excluding
nephrology and dialysis clinics), aged 75-95 years, with
serum creatinine 0.6 to 1.2 mg/dL, were randomly
selected. GFR was measured by means of the creatinine
clearance test and was estimated using the CKD-EPI
formula. Diagnostic cut-off was set at 60 mL/min (CKD
stage ≥ 3). Creatinine clearance was used as reference
test. The concordance between the two methods was
investigated.
Results: The prevalence of CKD in this population was
63±11% (95% CI). The eGFRCKD-EPI showed the following
performances: sensitivity = 65%±14%; specificity = 73%
±17%; PPV = 80%±13%; NPV = 56%±17%.
Conclusions: The prevalence of CKD is high in the elderly
population with normal serum creatinine. eGFRCKD-EPI at
the cut-off of 60 mL/min is able to identify two-thirds of
these cases, with a rate of false positivity of 20%. It looks
like a pretty good result for a free-of-charge information,
obtained from a serum creatinine value otherwise almost
useless.
Earley A, Miskulin D, Lamb EJ, et al. Estimating equations
for glomerular filtration rate in the era of creatinine
standardization: a systematic review. Ann Intern Med
2012;156:785-95.
P136
MONITORING OF PLASMA AND ERYTHROCYTES
PHOSPHOLIPID FATTY ACID IN THE GENERAL
POPULATION AND IN ITALIAN HEMODIALYSIS
PATIENTS
1
1
2
A. De Stefano , P. Bertucci , A. Noce , S.
1
1
1
1
Ballerini , M.T. Caliò , P. Casalino , S. Bernardini , M.
1
Dessi
1
Dip. Medicina di Laboratorio Università Tor Vergata
Roma
2
Servizio Nefrologia e Ipertensione Università Tor
Vergata Roma
Epidemiological studies have shown that cardiovascular’s
mortality observed in uremic patients aged between 25-35
years, is equal to that observed in the general population
over 85 years. This phenomenon can be explained only by
considering factors associated with chronic renal failure
(proteinuria, malnutrition, inflammatory state, oxidative
stress, etc.). It is shown that ω-3 polyunsaturated fatty
acids (PUFA) reduce the risk of cardiovascular disease
(CVD) in the general population. The goal of our work was
to evaluate the plasma total and red blood cell membrane
PUFA composition in a group of Caucasians patients in
chronic tri-weekly hemodialysis, and in a group of healthy
subjects (control group). In addition, the relationship
between fatty acids ω-3 and ω-6 (ARA/EPA/DHA and ARA)
and the possible differences in PUFAs concentrations
were evaluated. We enrolled 99 HD and 160 control
subjects, none treated with drugs or antioxidant dietary
supplements for at least 90 days. The blood samples
were analysed using a gas-chromatographic system
coupled to a spectrometric mass detector. The daily
intake of total calories, animal protein and vegetable,
animal and plant lipids, carbohydrates, of the fibers and
of retinol, is significantly lower in patients undergoing
dialysis than those belonging to the control group (p
<0.001). Plasma levels of triglycerides (p <0.0001), total
cholesterol (p <0.05) and LDL cholesterol (p<0.05), are
significantly higher in dialysis patients, while the level of
HDL cholesterol (p <0.05) was significantly lower. Among
the plasma PUFA, C20: 3 (DHA) (p < 0.001), 20: 4 (ARA)
(p < 0.001), C18: 2 (p < 0.001), C18: 3 (p < 0.001) and
C20: 5 (EPA) (p = 0.0081) were significantly reduced in
HD patients. Among the erythrocyte PUFA, C18:2, the
DHA, the ARA, C18:3 and the erythrocyte PUFAs ratios
were significantly reduced in uremic patients (p < 0.0001).
A dieto-therapy treatment to increase PUFAs levels of ω-3
(EPA and DHA) and to optimize the ω-6/ω-3 ratio, could
exercise a CV protective action as fatty acid composition
reflects that of the myocardium and is influenced by diet.
We have found that many classes of PUFAs are lacking
in HD patients, due to the removal of nutrients through the
dialysis and to persistent malnutrition.
539
P139
URINARY EXOSOME PROTEIN COMPOSITION
IN HEREDITARY TUBULOPATHIES: TOWARD
BIOMARKERS DISCOVERY
1
1
1
F. Raimondo , L. Morosi , S. Corbetta , A.
2
3
1
1
Bettinelli , P.L. Pozzi , P. Brambilla , F. Magni , M.
1
Pitto
1
Dept. of Health Sciences, Univ. Milano-Bicocca, Monza
2
Dept. of Pediatrics, San Leopoldo Mandic Hospital,
Merate-Lecco
3
Dept. of Laboratory Medicine, San Leopoldo Mandic
Hospital, Merate-Lecco
Among the different forms of hereditary renal
tubulopathies (HRT) associated with hypokalemia,
metabolic alkalosis and normotension, two main types
of disorders have been identified: Gitelman disease,
which appears to be a homogeneous post-Henle's loop
disorder, and Bartter syndrome, a heterogeneous Henle
loop disorder. A specific gene has been found responsible
for Gitelman disease, encoding the thiazide-sensitive
Na-Cl cotransporter (NCCT) of the distal convoluted
tubule, while many different genes have been shown
to be responsible for Bartter syndrome. Many of these
disorders can be diagnosed by a combination of specific
disturbances in plasma and urine parameters. However,
this field may also benefit from the developments
in urinary proteomics. More specifically, most of the
transporters along the nephron are excreted in urine
in so-called urinary exosomes. Therefore, the aim of
this work is the isolation of urinary exosomes and the
study of their composition in order to provide urinary
biomarkers for HRT. 2nd morning urines were collected
from 21 Gitelman patients (age 14,8 ± 9,4), from
17 Bartter ones (age 13,2 ± 9,1) and from 38 ageand sex-matched controls. After urinary vesicle isolation
by ultracentrifugation, and exosome characterization by
immunoblotting with known markers (TSG101, AQP1),
proteins were analyzed by EF and WB with antibodies
against the disease-related transporters. The biochemical
characterization of urinary vesicles shows the purity
of our samples by the assessment of the exosomal
markers TSG101 and AQP1 in exosomes of both patients
and controls. The IB analysis of NCCT revealed the
absence of the protein in urinary exosomes of all Gitelman
patients, as expected, but also in some controls’ one,
suggesting its possible diagnostic role in excluding, (but
not in confirming), the Gitelman syndrome in children
with presumptive symptoms. These results suggest that
exosome isolation may provide an efficient first step in
HRT biomarker discovery in urine.
Grants from FIRB: Rete Nazionale per lo studio del
proteoma umano (n. RBRN07BMCT).
P140
URINARY NGAL AS A VALUABLE MARKER OF
KIDNEY GRAFT PERFUSION: A PRELIMINARY
PEDIATRIC EXPERIENCE
1
1
1
C. Cosma , M. Zaninotto , M.C. Varagnolo , A.
2
3
3
1
Amigoni , E. Vidal , L. Murer , M. Plebani
1
Dep. of Laboratory Medicine, University-Hospital,
Padova
2
Dep. of Paediatrics, Paediatric Intensive Care Unit,
University of Padua, Padova
3
Dep. of Oncological and Surgical Sciences, Section of
Paediatric Urology, Urology Unit, University Hospital of
Padua, Padova
Background: The assessment of adequate renal perfusion
is essential in the first hrs after kidney transplantation
(KTx) and it is usually based on the evaluation of clinical
parameters. The common clinical and laboratory markers
(diuresis, serum creatinin and/or cystatin C) have low
diagnostic accuracy. The purpose of our study was to
investigate the role of urinary Neutrophil GelatinaseAssociated Lipocalin (uNGAL) in the monitoring of kidney
graft perfusion in the first 72 hrs post-KTx.
Materials and methods: Consecutive children undergoing
living related (LR) or deceased donor (DD) KTx, were
prospectively enrolled between April 2010 and July
2011. uNGAL levels were quantified every 12 h by
chemiluminescent microparticle immunoassay (CMIA,
Abbott Architect). Urine samples were collected from a
ureteral stent draining directly the transplanted kidney.
uNGAL levels were correlated with the real-time values
of renal regional oxygen saturations (rSO2) using nearinfrared spectroscopy (NIRS). Twenty-three children were
included, 6 underwent LR-KTx and 17 DD-KTx. Median
age at KTx was 9.2 yrs (range 1.6-17.8) and median
weight was 20 kg (range 6.5-65).
Results: Basal uNGAL values (ng/mL) were higher in
DD-KTx (mean 765.82+931.73) compared with LR-KTx
(301.88+363.49; p<0.05). A significant decreasing trend
in uNGAL values was observed in both LR- and DD-KTx
(121.36+124.99 vs 32.23+23.51 ng/mL respectively), 72
h post-transplantation. In all LR-KTx, uNGAL values were
within the proposed normal range (<150 ng/mL) within 12
h after KTx. 71% and 28% of DD-KTx recipients, showed
uNGAL levels above-normal at 12 and 72 h post-KTx
(729.63+721.18 and 121.36+124.99, respectively). The
trend of uNGAL levels showed a significant correlation
with renal rSO2 both in DD-KTx (r=-0.96) and LR-KTx
(r=-0.89).
Conclusions: uNGAL is a reliable marker of renal
ischemia. As its decreasing trend was significantly
associated with an improvement in renal rSO2, uNGAL
levels monitoring could became an useful non-invasive
tool for the evaluation of kidney graft perfusion during
the first hrs after transplantation, a tricky phase when
an ischemic insult could benefit from prompt medical or
surgical treatment.
541
P141
URINARY SEDIMENT: AN ESSENTIAL ANALYSIS TO
IDENTIFY THE OFTEN MISSED CYSTINURIA
1
1
1
P142
VALORI SIERICI DI γ-GLUTAMILTRANSFERASI
(GGT) IN SOGGETTI CON ALTERATA FUNZIONE
RENALE
1
D. Scribano , C. Rossi , S. Persichilli , J. Gervasoni , B.
2
1
Zappacosta , C. Zuppi
G. Lobreglio, F. Sicuro, G. Capuano
1
U.O.C. Patologia Clinica, P.O. "Vito Fazzi", ASL LE,
Lecce
U.O.C. Analisi 1 Policlinico Universitario “A. Gemelli”Roma
2
*U.O.C. Laboratorio Analisi Fondazione di Ricerca e
Cura "Giovanni Paolo II"- Campobasso
Introduction: Cystinuria is an autosomal recessive
disorder characterized by impairment of the proximal
renal tubules which are unable to reabsorb cystine and
dibasic amino acids, leading to the formation of recurrent
kidney stones. Two types of cystinuria are known : A
e B. Type A heterozygotes are generally asymptomatic
while type B heterozygotes usually have a three-fold
increased incidence of kidney stones compared to general
population.
Case report: A 46-year-old man was admitted to this
hospital because of cardiac arrhythmia and syncope.
The patient’s medical history included these episodes
that occurred unpredictably and were unrelated to eating
or physical activity and occasional episodes of renal
colics controlled by himself with hyperhydration. All routine
investigations ruled out cardiac pathologies, but the
urinalysis (pH = 6.5) showed the presence of several
cystine crystals. The determination of cystinuria showed
a value above 300 μmol/mmol of creatinine, while the
values of homocysteine (HCY), folic acid and vitamin B12
were within the normal range. The urinalysis was reapeted
after a month and showed absence of cystine crystals
and massive presence of amorphous urates (pH = 6.5)
but the value of cystinuria was confirmed and HCY, folic
acid and vitamin B12 were again within the normal range,
so the clinic diagnosis of cystinuria was supposed. We
made recommendation to the patient to carry out genetic
investigation supporting the clinical diagnosis.
Materials and methods: The urinary sediment (the
second urine of the morning) was examined by Sedimax
(Menarini), the urinary cysteine and homocysteine were
determined by an HPLC-FL method, folic acid and vitamin
B12 were determined by CMIA method (Architect PLUS
Abbott).
Conclusion: The analysis of the urinary sediment is a
valuable tool for the diagnosis and monitoring of the
diseases of the kidneys and the urinary tract, even if is
mandatory to use the correct methodology and it is just a
great help to identify the cystinuria often missed.
542
Scopo: La γ-glutamiltransferasi è stato a lungo considerato
un test di funzionalità epatica ed un marcatore di
eccessivo uso di etanolo. Recenti studi epidemiologici
hanno esteso lo spettro di condizioni cliniche associate
ad un aumento della GGT, mentre non sono ancora del
tutto i meccanismi fisiopatologici di queste associazioni.
Lo scopo di questo studio è di valutare i livelli sierici di
GGT in una popolazione ambulatoriale con alterazioni
biochimiche di funzionalità o danno renale (organo molto
ricco di strutture vasali).
Materiali e metodi: Sono stati valutati 1800 soggetti
afferenti all'ambulatorio di Patologia Clinica del nostro
P.O. di età compresa tra 18 e 75 anni (960 maschi,
840 femmine) per i quali erano disponibili i valori
di GGT, creatinina, eGFR, albuminuria, ALT, AST ed
esame emocromocitometrico. La GGT e le transaminasi
sono stati misurati con metodi enzimatici-colorimetrici e
l'albuminuria con metodo turbidimetrico su analizzatori
Roche/Modular P, l'esame emocromocitometrico è stato
eseguito su analizzatori ematologici Sysmex, la eGFR
(estimated glomerular filtration rate) è stata calcolata con
l'equazione MDRD.
Risultati: In 243 soggetti è stato riscontrato una alterata
funzionalità e o segni biochimici di danno renale con
2
valori di eGFR < 60 mL/min/1,73 m superficie corporea
e/o albuminuria < 30 mg/g creatininuria, in assenza di
segni biochimici di danno epatico (valori di transaminasi
nel range di riferimento) e di aumento di MCV all'esame
emocromocitometrico. I valori di GGT sierici di questi
soggetti erano statisticamente più elevati rispetto a quelli
dei soggetti senza alterazioni della funzionalità renale: 87
± 54 U/L vs 34 ± 29 U/L; p < 0,001.
Discussione: Questo studio ha evidenziato valori più
elevati di GGT in soggetti con alterazioni della funzione
e/o segni biochimici di danno renale; i meccanismi
fisiopatologici più verosimili dell'associazione di GGT
con varie condizioni patologiche sono costituiti dalla
deplezione del glutatione da parte di sostanze ossidanti
che causa un incremento compensatorio di GGT e/o dalla
produzione di radicali liberi dalle reazioni catalizzate da
GGT. Pertanto, alti valori di GGT possono rappresentare
non solo un marker di condizioni cliniche e/o precliniche,
ma anche un fattore di rischio che contribuisce alla loro
insorgenza ed evoluzione.
P144
ANALISI MUTAZIONALE DEI GENI APOA1 E LPL
NELLA SINDROME DA BASSE HDL
P143
VALUTAZIONE DEL SISTEMA “ANALISI AD
IMMAGINE” (SEDIMAX) PER LO SCREENING
MICROBIOLOGICO
1
1
1
1
2
G. Covili Faggioli , M. Bove , P. Parisi , S. Ambretti , E.
2
1
1
Mirone , E. Di Somma , M.A. Laudadio , T.P.
1
1
1
1
1
Papillo , P. Selva , R. Venturi , E. Beltrandi , R. Motta
1
U.O. Lab. Centralizzato, Policlinico S. Orsola, Bologna
U.O. di Microbiologia, Policlinico S. Orsola, Bologna
2
Scopo: Verificare la sensibilità dello strumento Sedimax
Menarini Diagnostics nello screening delle infezioni delle
vie urinarie, eseguito con la tecnologia "ANALISI AD
IMMAGINE”, utilizzando il conteggio dei batteri.
Materiali e metodi: Sono stati valutati 1689 campioni di
soggetti adulti (1154 F; 535 M), selezionati presso la U.O.
Microbiologia-Landini, per i quali era stato richiesto anche
l’esame completo urine, eseguito su provetta dedicata
presso l’U.O. Laboratorio Centralizzato-Motta. Su questi
campioni è stato effettuato l’esame microbiologico con
semina in piastra, mediante Seminatore Automatico
“Chromagar orientation chima”. In seguito, nei campioni
positivi, è stata effettuata l’identificazione biochimica
del microrganismo, mediante strumentazione “Vitek
2 Biomerieux”, con successivo antibiogramma. Nei
campioni positivi, è stata valutata, nell’esame completo
urine, sia la presenza di batteri che dei leucociti, per
escludere un eventuale inquinamento del campione
stesso. I soggetti sono stati suddivisi in 4 categorie:
positivi e negativi all’esame completo urine (cut off
>80 num/uL), positivi e negativi all’esame colturale (cut
off >10^5/mL), in maniera da poter applicare un Test
non parametrico binomiale e verificare la significatività
statistica tra le categorie.
Risultati: Numerosità osservata con esame completo
urine: 255 positivi (15%), 1434 negativi (85%). Numerosità
osservata con esame colturale: 365 positivi (22%), 1324
negativi (78%). Il test statistico non parametrico applicato
alle suddette categorie è risultato significativo (P <0.001).
Conclusioni: Le ottime performance strumentali
evidenziate dimostrano che l’utilizzo del sistema “ANALISI
AD IMMAGINE” (Sedimax) sarebbe applicabile con
grande vantaggio nello screening microbiologico delle
urine, permettendo una significativa riduzione del turn
around time per i campioni negativi. Si eviterebbe inoltre
la prescrizione di terapie chemioantibiotiche empiriche
e, si otterrebbe un sostanziale risparmio sui costi
dell’urinocoltura.
Zaman Z, Fogazzi GB, Garigali G, et al. Urine
sediment analysis: Analytical and diagnostic performance
of sediMAX-a new automated microscopy imagebased urine sediment analyser. Clin Chim Acta
2010;411:147-54.
2
1
2
G. Truglio , A. Montali , M. Lucarelli , E. Salvia , F.
3
2
1
Martino , M. Arca , R. Strom
1
Dip. di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia, Sapienza
Università di Roma
2
Dip. di Clinica e Terapia Medica, Sapienza Università di
Roma
3
Dip. di Pediatria, Sapienza Università di Roma
Le dislipidemie aterogene sono alterazioni del
metabolismo lipidico associate ad elevato rischio
cardiovascolare. La sindrome da basse HDL rientra
in questo quadro di manifestazioni, con numerosi
geni potenzialmente coinvolti. Ciò rende particolarmente
complessa l’analisi mutazionale. In una casistica
pediatrica di 84 bambini con valori di colesterolo
HDL < 40 mg/dL, abbiamo preliminarmente effettuato
l’analisi mutazionale di 2 geni candidati, quello per
l’apoproteina A-I (APOA1) e quello per la lipoproteinlipasi
(LPL). L’analisi mutazionale è stata condotta per
sequenziamento mediante una piattaforma strumentale
automatizzata in formato 96-well comprendente il sistema
robotico Microlab Starlet (Hamilton), l’analizzatore
genetico ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystem) e il
software SeqScape (Applied Biosystem) per l’analisi dei
dati. Come popolazione di controllo è stata utilizzata
quella del database EU SNP. Nel gene APOA1 sono
state identificate le seguenti variazioni di sequenza: 1 nel
promotore (-75G>A), 21 introniche (9 delle quali nuove)
e 1 esonica (A188S). L’unica funzionalmente descritta
è la -75G>A (ad elevata frequenza nella popolazione
analizzata: 0.161, p<0.05 rispetto ai controlli) che sembra
influenzare il tasso di trascrizione del gene ed è associata
a bassi valori di HDL. Nel gene LPL sono state identificate
le seguenti variazioni di sequenza: 1 al 5’UTR (-281T>G),
9 esoniche (N291S, L365V, D9N, S45N (nuova), R89Q
(nuova), V108V, E118E, T106T, S447X) e 15 introniche.
Le variazioni N291S, L365V, -281T>G e D9N (ad elevata
frequenza complessiva nella popolazione analizzata:
0.233, le prime 2 p<0.01 rispetto ai controlli), sono state
associate a fenotipi iperlipidemici con bassi livelli di
HDL. La S447X (a bassa frequenza nella popolazione
analizzata: 0.071, rispetto ai controlli 0.120, p=0.058),
risulta associata ad un’aumentata attività della LPL, con
bassi valori di trigliceridi nel siero e diminuito rischio
cardiovascolare. Un approccio sperimentale di ricerca
mutazionale ad alta produttività risulta indispensabile
per la caratterizzazione genetica di questa sindrome.
La selezione di numerose variazioni di sequenza non
precedentemente caratterizzate funzionalmente, pone
il problema della corretta individuazione di un loro
significato clinico.
543
P145
DELEZIONE DEL BRACCIO LUNGO DEL
CROMOSOMA Y IN UN SOGGETTO CON RITARDO
MENTALE
1
1
P146
DETERMINAZIONE DEGLI STEROLI PLASMATICI ED
ERITROCITARI DI PAZIENTI AFFETTI DA DIFETTI
DELLA BIOSINTESI E DEL METABOLISMO DEL
COLESTEROLO
1
S. Egiziano , V. Mavaracchio , F. Donà , L.
1
1
2
2
Tognetto , A. Brugnoli , E. Stathaki , S. Gimelli , F.
2
3
1
Sloan Béna , F. Garonna , L. Bartoloni
R. Barone , M. Gelzo , S. Clericuzio , G. Corso , A.
1
Dello Russo
1
1
ULSS12 Veneziana, Dipartimento di Patologia Clinica,
Venezia
2
Service de Genetique Medicale, HUG, Geneve
3
ULSS12 Veneziana, Dipartimento di Salute Mentale,
Venezia
È stato analizzato il caso di un signore di 40 anni
valutato per ritardo mentale di grado medio con episodi
di esibizionismo sessuale. L’analisi citogenetica classica
ha evidenziato una delezione a carico del braccio lungo
del cromosoma Y [46,XY, del(Yq)]. Tale alterazione è
stata confermata mediante l’utilizzo di due kit diversi per
l’analisi delle microdelezioni del cromosoma Y, entrambe
basate su tecnica di PCR multiplex ed elettroforesi su
gel di agarosio (Y Chromosome AZF Analysis System,
Promega e AZF- MX, AB Analitica). La delezione inizia
tra SY117 (presente) e SY121 (assente) e si estende fino
ai telomeri, la cui assenza è stata confermata mediante
ibridazione in situ fluorescente (FISH). La delezione
comporta l’assenza di gran parte della regione AZFb
e la totale mancanza della regione AZFc e dei geni
a valle. Mediante ibridazione genomica comparativa su
microarray (Agilent 44K) è stata esclusa la presenza di
ulteriori grandi delezioni o inserzioni. È noto che nel tratto
deleto sono situati geni implicati nella spermatogenesi.
Dai risultati ottenuti possiamo quindi ipotizzare una
probabile sterilità del paziente. Lo spermiogramma è in
corso mentre i dosaggi ormonali sono: FSH 40 UI/L (Val.
rif.: 1-20 UI/L); LH 8 UI/L (Val. rif.: 1-10 UI/L); 17-betaEstradiolo (E2) < 20 ng/L (Val. rif.: < 50 ng/L); Prolattina
15 mcg/L (Val. rif.: 3-15 mcg/L) e Testosterone 2,7 mcg/
L (Val. rif.: 1,7-8 mcg/L). Sono invece rarissimi i casi
riportati in letteratura di ritardo mentale o disturbi psichici
in pazienti con delezione del braccio lungo del cromosoma
Y e il gene direttamente responsabile non è stato ancora
identificato.
Tyson C, Dawson AJ, Bal S, et al. Molecular cytogenetic
investigation of two patients with Y chromosome
rearrangements and intellectual disability. Am J Med
Genet A 2009;149A:490-5.
544
1
1
1
2
2
Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale,
Università degli Studi di Foggia
Introduzione: In questo lavoro riportiamo la nostra
esperienza sulla diagnosi dei difetti congeniti della
biosintesi e del metabolismo del colesterolo (CHOL). Tali
difetti causano complessi quadri clinici caratterizzati da
malformazioni multiple, ritardo mentale e di crescita e nei
casi più gravi, morte intrauterina. La sindrome di SmithLemli-Opitz (SLOS) rappresenta il prototipo di tali difetti
ed è causata dal deficit dell’enzima 7-deidrocolesterolo
reduttasi con accumulo nel sangue e nei tessuti del 7deidrocolesterolo e dell’isomero 8-deidrocolesterolo.
Metodi: Mediante la gascromatografia accoppiata alla
spettrometria di massa è stato determinato il profilo
completo degli steroli nel plasma e nelle membrane
eritrocitarie (EM) di pazienti con sospetto clinico di difetto
della biosintesi del CHOL, utilizzando un metodo già
standardizzato.
Risultati: I valori di riferimento degli steroli plasmatici,
ottenuti in 364 soggetti non affetti, sono in accordo con
quelli riportati in letteratura. Tra i pazienti investigati dal
2005 ad oggi, riportiamo i dati di 20 pazienti affetti da
SLOS, di cui 7 rappresentavano nuovi casi e 13 erano
pazienti in follow-up. Inoltre, nello stesso periodo abbiamo
identificato un nuovo caso di condrodisplasia punctata Xlinked ed uno di xantomatosi cerebrotendinea. L’incidenza
dei casi SLOS è risultata pari a 1 su 53 pazienti
sospetti (1.89%). Inoltre abbiamo valutato l’influenza del
tempo di conservazione sul rapporto deidrocolesteroli/
colesterolo (DHC/CHOL) nei campioni di plasma e di EM
di pazienti SLOS conservati a -20 °C per 22 e 20 mesi,
rispettivamente. I risultati hanno mostrato una significativa
correlazione lineare negativa tra il tempo di conservazione
ed il rapporto DHC/CHOL sia nel plasma che nelle EM. La
riduzione del rapporto DHC/CHOL nei campioni di EM era
almeno due volte maggiore rispetto al plasma.
Conclusioni: I risultati di questo studio possono essere
utili per la diagnosi e l’interpretazione dei dati ottenuti in
pazienti con quadro clinico suggestivo di un difetto della
biosintesi e del metabolismo del CHOL.
Corso G, Gelzo M, Barone R, et al. Sterol profiles
in plasma and erythrocyte membranes in patients with
Smith-Lemli-Opitz syndrome: a six-year experience. Clin
Chem Lab Med 2011;49:2039–46.
P147
DETERMINAZIONE DELL'ASSETTO EMOGLOBINICO
AL PRIMO LIVELLO DIAGNOSTICO: RILEVANZA
DELLO STUDIO FAMILIARE
1
1
2
3
M. Mercadanti , A. Caleffi , S. Moretti , S. Bigoni , A.
3
1
Ravani , G. Lippi
1
U.O. Diagnostica Ematochimica, Az. OspedalieroUniversitaria, Parma
2
U.O. Neonatologia e terapia intensiva neonatale,
Az.Ospedaliero-Universitaria, Parma
3
U.O. di Genetica Medica, Az. Ospedaliera Universitaria,
Ferrara
Il fenomeno migratorio che da anni interessa il nostro
paese ha modificato il tradizionale scenario delle
emoglobinopatie della popolazione autoctona, con casi
complessi, talvolta di difficile identificazione da parte
del laboratorio di primo livello. Riportiamo il caso di un
neonato, pretermine, nato alla 23° settimana, di origine
nigeriana, per il quale era richiesto l’assetto emoglobinico,
essendo i genitori portatori rispettivamente di HbS e HbC.
Lo screening in HPLC (Variant II, Bio-Rad) evidenziava
un picco anomalo del 9.6%, ad eluizione veloce ed un
picco pari all’1.7% eluente in posizione C. L’elettroforesi
alcalina confermava la presenza di una banda in zona
C ed una in zona J, l’elettroforesi acida rilevava una
banda in zona C ed una in zona prossima ad F.
Nel sospetto di emoglobinopatia Hb Bart’s e HbC si
consigliava rivalutazione dopo il secondo mese di età
corretta. Il controllo ad un anno evidenziava un quadro
compatibile con eterozigosi HbC (Hb A= 65.5%, Hb
F=5.6%, A2=3.2%, Hb C=25.7%). La bassa percentuale
della Hb C, in presenza di microcitosi ed ipocromia
(MCV=58 fl; MCH=19.8 pg), con sideremia nei limiti,
induceva il sospetto di un concomitante difetto dei geni
alfa, per cui, nel referto interpretativo, si consigliava
approfondimento al secondo livello diagnostico. Con
la collaborazione della pediatra sono stati recuperati i
referti delle analisi molecolari eseguite in occasione delle
precedenti gravidanze della coppia, presso la UO di
Genetica, AOU di Ferrara, da cui emergeva: per la madre
eterozigosi per HbS e per la delezione alfa talassemica
del tipo–alfa 3.7 e per il padre omozigosi per HbC e per la
delezione alfa talassemica del tipo –alfa 3.7. Alla luce di
questi dati si concordava con la pediatra di non proseguire
con gli accertamenti ritenendo verosimile per il neonato
un difetto talassemico di uno o due geni alfa, responsabile
della microcitosi. Dati i genotipi parentali era esclusa la
delezione di tre geni, come supportato dall’assenza di
Hb H. E’ importante disporre di cromatografi che rilevino
percentuali anche minime di componenti anomale. La
consulenza genetica, la collaborazione con la pediatra
e l’integrazione delle informazioni hanno permesso di
evitare un inutile ricorso a costose indagini molecolari.
P148
EFFICACY OF THE ALPHA-1-ANTITRYPSIN
DEFICIENT VARIANTS DETECTION BY SEMIAUTOMATED SEBIA ISOELECTROFOCUSING
PHENOTYPING AND THE NEED FOR A
RE-EVALUATION OF REFERENCE AND
INTERPRETATIVE RANGES FOR ALPHA-1ANTITRYPSIN QUANTITATION
1
1
1
1
M. Scarpellini , D. Ricotta , L. Piccioni , M. Borghesi , I.
1
2
3
4
Bianchi , L. Corda , N. Gatta , D. Medicina , L.
1
1
Caimi , I. Zanella
1
Laboratorio Analisi Chimico-Cliniche, A.O. Spedali
Civili, Brescia-Sezione di Biochimica e Biochimica
Clinica, Facoltà di Medicina, Università di Brescia
2
Medicina Generale 1, A.O. Spedali Civili, Brescia
3
Associazione Nazionale ALFA1-AT, Sarezzo, Brescia
4
Prima Anatomia Patologica, A.O. Spedali Civili, Brescia
Alpha-1-antitrypsin (A1AT) is a serum protein that diffuses
in the lungs and inhibits neutrophil elastase preventing
alveolar elastine degradation. A1AT locus is extremely
polymorphic: in addition to the native M allele, more
than 100 variants have been identified. Several deficiency
alleles have been described. Z and S alleles account for
the majority of pathological mutations. A1AT deficiency is
a genetic codominant condition that increases the risk of
developing lung and liver diseases and rarely panniculitis
and vasculitis. Early identification of at risk subjects
is crucial since disease progression can be slowed
by therapy and minimizing exposure to environmental
agents. However the disorder is largely under-recognized
due to the fact that many AAT deficient individuals do
not have clinical manifestations until the age of 40-50.
Although the deficiency can result in a disease state in
homozygous ZZ, compound heterozygous SZ or nullmutations harbouring subjects several data suggest that
people with even only one Z allele may be at risk in the
case of other liver or lung insults. Laboratory evaluation
of A1AT deficiency involves serum measurement by
nephelometry and characterization by phenotyping or
genotyping. The normal range of serum levels is reported
between 200/220 and 80/120 mg/dL. However the cutoff value below which it might be useful to evaluate the
phenotype/genotype is still a matter of debate. The main
purposes of the present study were:
1-to evaluate a semi-automated protocol (Sebia IEF) as a
diagnostic tool to identify deficient phenotypes;
2-to establish phenotype interpretation efficacy comparing
the results with genotype whenever possible;
3-to ascertain the phenotype in different patients: patients
with serum levels of A1AT below the cut-off value of
80-120 mg/dL, subjects identified as heterozygous by
serum electrophoresis evaluation and subjects with low
alpha 1 globulin fraction at serum protein electrophoresis.
Our results confirm the efficacy of Sebia phenotyping
protocol in identifying the main deficient S and Z alleles.
We also confirm the necessity to use higher serum level
cut-off for selecting subjects for phenotyping/genotyping
to minimize the risk of missing subjects susceptible to
A1AT deficiency related manifestations.
545
P149
INTRA- AND EXTRACELLULAR FOLATE LEVELS
IN A PATIENT AFFECTED BY HEREDITARY
FOLATE MALABSORPTION (HFM) AFTER
DIFFERENT FOLINIC ACID POSOLOGY: A
BIOCHEMICAL EVIDENCE FOR CLINICAL THERAPY
IMPROVEMENT
1
1
2
2
G. Canu , R. Penitente , I. Russo , A. Ruggiero , P.
2
1
1
1
Maurizi , C. Zuppi , A. Minucci , B. Giardina , E.
1
Capoluongo
1
University of Rome, Italy
2
Institute of Pediatrics, Catholic University of Rome, Italy
Background: Folate is an essential nutrient involved
in a range of one-carbon metabolic reactions. Serum
concentrations are commonly measured to assess the
folate status, while erythrocyte (RBC) concentrations
considered the best way for the measure of usual or longterm status. Folate supplementation increases serum
and RBC folate concentrations. However, the duration of
supplementation required for RBC folate concentrations
to reach a new steady state is uncertain. HFM is
characterized by folate deficiency with impaired intestinal
folate absorption and impaired folate transport into the
central nervous system. Herein, we report the folate
status [serum, RBC and cerebrospinal fluid (CSF)] in a
one year old female suffering from HFM after different
folate treatment protocols in order to evaluate the optimal
therapy.
Methods: Patient underwent to folinic acid administrations
[oral, intravenous (IV) and intramuscular doses (IM)].
After 5 mg IV or IM administrations, 5 serial blood
samples and 2 CSF samples were collected. 24 days
after, patient underwent to IM administration (5mg). After
one week, one more blood sample was collected. For
two weeks, patient underwent to three IM administrations
(5mg/dose). At the end of each week a blood sample was
collected. Samples were analyzed on Architect® Abbott
using Architect® Folate kit. For the RBC folate assay, an
manual pre-treatment step was required.
Results: After oral folinic acid administration, serum
folate levels remained under cut-off. Folate IV-treatment
restored the normal folate levels in serum and RBCs
for 22 days, and determined also an increasing of the
CSF folate levels. Contrastingly, 6 days after the single
IM administration, serum and RBC folate concentrations
decreased, while after 3 IM administrations/week normal
levels were restored.
Discussion: For steady-state folate concentrations, IV
administration is optimal but invasive. For this reason, an
IM treatment (3 folinic acid administration/week) may be
used as alternative since it maintained stable the folate
concentrations in serum and RBCs. These results may
indicate that different routes of folate absorption may exist
at gastrointestinal and peripheral levels.
546
P150
POSSIBILITA’ DIAGNOSTICHE DEL LABORATORIO
DI 1° LIVELLO PER I DIFETTI STRUTTURALI
DELL’EMOGLOBINA
1
1
2
2
G. Barberio , L. Caberlotto , D. Leone , A. Citana , G.
2
Ivaldi
1
U.O.Medicina di Laboratorio, Ospedale Cà Foncello,
Treviso
2
Laboratorio di Genetica Umana, Ospedali Galliera,
Genova
Al centro del percorso diagnostico di laboratorio che
porta ad individuare o ad escludere la presenza di
un difetto dell’emoglobina (Hb) troviamo la valutazione
quali-quantitativa delle frazioni dell’emoglobina (Hb)e le
recenti Raccomandazioni per il laboratorio di 1°livello
della Società Italiana per lo studio delle Talassemie ed
Emoglobinopatie (SITE) hanno ribadito tale concetto.
Materiali e metodi: Il nostro recente confronto tra
metodi separativi diversi, al fine anche di avvalorare
i concetti espressi dalle Raccomandazioni SITE, si è
basato sull’analisi di 210 campioni anonimizzati e per i
quali era stato ottenuto il consenso all’approfondimento
diagnostico. Questi campioni sono stati esaminati in
HPLC mediante tre diversi sistemi (8160-Menarini,
Variant II-BioRad, G8-Tosoh) e in CE (Capillarys 2
Analyzer – Sebia).
Risultati: Abbiamo ottenuto buoni risultati nella
quantificazione dell’HbA2 e dell’HbF da tutte le
strumentazioni utilizzate. Nella separazione delle varianti
Hb, sia per le più comuni e frequentemente riscontrate
sia per quelle più rare, i quattro sistemi hanno rivelato
comportamenti differenti in alcuni casi. L’aspetto rilevante,
e ben messo in evidenza dalle Raccomandazioni SITE,
è rappresentato però dal fatto che non può essere
un unico metodo separativo a consentire una diagnosi
definitiva dei difetti strutturali dell’Hb. Associando un
metodo cromatografico con uno elettroforetico e altri
eventuali test biochimici specifici si sono così potute
concludere, per i campioni esaminati, tutte le diagnosi
relative alle quattro varianti più frequenti (Hb S, C, E e Hb
Lepore), senza dover ricorrere all’analisi molecolare.
Conclusioni: Si ritiene pertanto che qualora un laboratorio
sia in grado di affrontare, in presenza di varianti Hb, alcuni
esami di conferma in un ambito non molecolare (livello
intermedio) possa proficuamente utilizzare i metodi HPLC
abbinati all’elettroforesi capillare per una conclusione
definitiva nel 93% dei casi che normalmente si possono
presentare al laboratorio di 1° livello. Avere la possibilità
di poter giungere ad una conclusione diagnostica non
presuntiva, senza dover ricorrere sempre all’analisi
molecolare può costituire un modo per contenere
significativamente la spesa sanitaria.
P151
ANALISI RETROSPETTIVA DEI VALORI DI IGF1 IN
PAZIENTI PEDIATRICI E ADULTI
1
2
2
2
S. Suppressa , M. Brugia , F. Balducci , V. Scocco , M.
2
Tocchini
1
Patologia clinica Università di Bologna
2
Laboratorio Biochimica Clinica e Microbiologia Azienda
Ospedali Riuniti Ancona
Premesse: Il dosaggio di IGF1 è largamente utilizzato
nella diagnosi dei disordini della secrezione dell’ormone
della crescita (GH) e nel follow-up dei pazienti in
terapia. L’introduzione del metodo automatizzato in
chemiluminescenza (standard WHO 87/518) ha apportato
delle modifiche rispetto ai metodi radioimmunometrici
precedentemente utilizzati in termini di appropriatezza
diagnostica e range di riferimento. Scopo del lavoro
è stato quello di valutare, nella nostra popolazione,
la distribuzione dei valori di IGF1 per fasce di età e
per genere e confrontarle con quelle suggerite dalla
letteratura scientifica.
Materiali e metodi: Tra l’1/01/2008 e 1/06/2012 sono stati
esaminati 9778 campioni di siero afferenti al laboratorio
dai reparti interni e dagli Ospedali di tutta la regione
Marche. Il dosaggio dell’IGF1 è stato effettuato mediante
metodo chemiluminescente (Immulite 2000 Siemens
sensibilità 20ng/mL). La popolazione è stata suddivisa in
2 gruppi: il primo tra 0-20 anni è stato studiato in dettaglio,
mentre il secondo (21-100 anni) è stato suddiviso per
fasce d’età di 5 anni. L’analisi statistica è stata effettuata
mediante SPSS.
Risultati: Nei pazienti al di sotto dell’anno di età la mediana
del dosaggio dell’IGF-1 è stata pari a 45 ng/mL. Tale
valore aumenta gradatamente fino all’età di 15 anni (397
ng/mL) per poi decrescere fino a 20 (253 ng/mL). Tali
mediane, soprattutto nella fascia di età tra 6-11 anni,
mostrano un andamento diverso tra maschi e femmine.
Tra 21-100 anni si nota poi un progressivo decremento
dei valori di IGF-1 fino a 98 ng/mL.
Conclusioni: Dall’elaborazione dei dati, si evidenzia che
l’IGF-1 presenta una distribuzione ben distinta per fasce
d’età e sesso e presenta una buona correlazione con
i range suggeriti dalla letteratura scientifica, sebbene si
pone la necessità di rivedere gli intervalli di normalità per
migliore l’efficacia del test nella pratica clinica soprattutto
nei primi 20 anni.
Chaler EA, Meazza C, Guercio G, et al. Serum IGF-I
and IGFBP-3 reference values from a chemiluminescent
assay in normal children and adolescents of hispanic
and italian origin: presence of sexual dimorphism in IGF-I
values. J Pediatr Endocrinol Metab 2009;22:1127-35.
P152
CLINICAL UTILITY OF ANTI-MÜLLERIAN
HORMONE ON THE EVALUATION OF FERTILITY
PRESERVATION IN YOUNG FEMALE PATIENTS
AFTER TREATMENT FOR HEMATOLOGICAL
MALIGNANCY
1
2
2
G.L. Salvagno , R. Di Paola , S. Zaffagnini , M.
1
2
3
2
Gelati , A. Perandini , C. Tecchio , C. Costantini , R.
2
2
1
Montemezzi , M. Franchi , G.C. Guidi
1
Sez. di Biochimica Clinica , Dip. di Scienza della Vita e
della Riproduzione, Univ. di Verona
2
Sez. di Ostetricia e Ginecologia, Dip. di Scienza della
Vita e della Riproduzione, Univ. di Verona
3
Sez. di Ematologia, Dip. di Medicina, Univ. di Verona
Background: The new advances in the treatment of
cancer have greatly increased the life expectancy
of premenopausal women with haematological
malignancies.The susceptibility of the ovarian reserve
to chemotherapy is highly variable from one patient to
another. Anti-Mullerian hormone (AMH), has been shown
to be one of the most sensitive markers of ovarian reserve
and fertility preservation.
Aim: To better characterize the evolution of fertility
preservation, based antral follicle counts (AFC), serum
anti-Müllerian hormone (AMH) assay, follicle stimulating
hormone (FSH), and inhibin B were assayed in female
patients treated for lymphoma and leukemia.
Materials and methods: 63 consecutive women diagnosed
with a hematological disease (48 with Hodgkin's
lymphoma; 9 Non Hodgkin's lymphoma; 6 acute myeloid
leukemia) were eligible for enrolment. All patients [median
age 31 yr (range 17-40 yr)] were in complete remission
with a median follow-up time of 9.0 yr after therapy.
64 normal controls were also evaluated [median age 31
yr (range 20-42 yr)]. Participants had a baseline blood
drawing during the early follicular phase of the menstrual
cycle for AMH, FSH, and inhibin B measurements. Antral
follicle counts (AFC) were performed by transvaginal
ultrasonography on menstrual cycle day 2. Serum levels
of AMH and inhibin B were determined using AMH Gen
II Elisa assay and Inhibin B Gen II ELISA (Beckman
Coulter) respectively, both assessed on a Triturus® EIA
Analyzer (Grifols). FSH was performed by using an
automated chemiluminescence assay system (Immulite
2000®, Siemens).
Results: A significant variation of AFC [9.8 vs 16.0,
p<0.005)], AMH [2.02 ng/mL vs 2.97 ng/mL, p<0.05], FSH
[16.9 mU/mL vs 8.1 mU/mL, p<0.05] and inhibin B [33.7
ng/L vs 69.4 ng/L, p<0.005] were observed by KruskalWallis one-way analysis of variance between patients and
controls. The ROC curve analysis comparing AMH and
FSH values of patients (at the same AFC cut-off point of
8) revealed that AMH had a better area under the curve
(AUC)(0.904; p=0.005) than FSH (0.678; p=0.005).
Conclusions: Ovarian reserve is reduced in female
patients affected by lymphoma. AMH is the most reliable
serum marker of fertility preservation outcomes, together
with AFC as a biophysical marker, in girls receiving
treatment for cancer.
547
P154
DEFINIZIONE DEL LIMITE DI RILEVAZIONE (LOD)
DEL [-2]PROPSA IN VISTA DI UN SUO POSSIBILE
UTILIZZO COME INDICATORE PRECOCE DI
RECIDIVA DEL TUMORE PROSTATICO
P153
CORRELATION OF SERUM CYSTATIN C WITH
GLOMERULAR FILTRATION RATE IN PATIENTS
RECEIVING PLATINUM-BASED CHEMOTHERAPY
V. Barchiesi, S. Cecere, D. Cerasuolo, M. Di Maio, F. Di
Paola, S. Pignata, E. Cavalcanti
Istituto Nazionale Tumori - IRCCS, Fondazione G.
Pascale, Napoli
We measured serum concentrations of cystatin C
and creatinine and calculated Glomerular Filtration
Rate (GFR, Cockcroft-Gault equation) in a series of
cancer patients (pts), before and during platinum-based
chemotherapy. Serum creatinine, cystatin C, and GFR
were determined simultaneously in all pts, before the first
cycle and before subsequent administrations. Pearson
correlation coefficients (r) were calculated. To assess
the diagnostic accuracy of serum cystatin C in predicting
2
2
GFR<80 mL/min/1.73m and GFR<60 mL/min/1.73m ,
ROC (receiver operating characteristics) plots were
performed (pROC package for R), calculating the area
under the curve (AUC) and 95% confidence interval (CI).
Overall, 31 patients were studied (7 males and 24
females), 18 receiving carboplatin-based and 13 cisplatinbased chemotherapy. Overall, 155 measurements were
performed (range 1 – 12 per patient, 37 in males,
118 in females). Median baseline cystatin value was
1.39 mg/l (range 0.75–1.94). Median baseline GFR
2
was 87.8 mL/min/1.73m . Out of 31 pts, 14 had a
baseline GFR<80: all 14 pts had a baseline cystatin
> upper normal limit, whilst serum creatinine value
was within normal range in 13 (93%). Of pts starting
treatment with baseline normal GFR, 2 pts subsequently
developed GFR<80, both with high baseline cystatine
and normal creatinine value. In the overall series, linear
regression showed a significant relationship (p<0.001)
between GFR and concomitant value of serum cystatin
C (r=0.56). The relationship was statistically significant
in both males and females, but r coefficient was higher
in females (0.62 vs 0.43 in males). In the overall
series, for GFR<80, the AUC of ROC curve for cystatin
was 79.5% (95%CI 72.6%–86.5%). The best threshold
was 1.285 mg/L (sensitivity 83.3%, specificity 60.2%,
negative predictive value 84.8%, positive predictive value
57.5%). AUC was 81.2% (95%CI 73.6% – 88.8%) and
74.5% (95%CI 57.1%–91.9%) in females and males,
respectively. For GFR<60, the AUC for cystatin was
88.0% (95%CI 81.0%–94.9%). The best threshold was
1.62 mg/L (sensitivity 81.8%, specificity 81.7%, negative
predictive value 96.4%, positive predictive value 42.9%).
The AUC for cystatin was 88.6% (95%CI 80.8%–96.5%)
and 88.5% (95%CI 73.9%–100%) in females and males,
respectively.
548
1
1
1
2
F. Ceriotti , M. Pontillo , L. Fasoli , M. Lazzeri , G.
2
2
2
3
Lughezzani , G. Lista , A. Larcher , G. Fuzzi , G.
2
Guazzoni
1
Diagnostica e Ricerca San Raffaele, Istituto Scientifico
Ospedale San Raffaele, Milano
2
Dipartimento di Urologia, Ospedale San Raffaele Turro,
Università Vita-Salute San Raffaele, Milano
3
Istituto Ricerche Cliniche “M. Fanfani”, Firenze
Introduzione: Il [-2]proPSA è una molecola che si genera
nella prostata durante la sintesi del PSA e passa in circolo
in quantità più elevata in presenza di tumore prostatico.
Data la sua maggiore specificità per la diagnosi precoce
di tumore rispetto al PSA totale si potrebbe ipotizzare una
sua utilità anche nell’individuazione precoce di recidive
dopo la prostatectomia totale. Scopo del lavoro è la
valutazione della possibilità tecnica di questo utilizzo
verificando il limite di rilevazione (LoD) della molecola.
Materiali e metodi: Sono stati utilizzati campioni residui da
prelievi di 10 pazienti con recidiva biochimica e patologica
di Ca prostatico, dopo prostatectomia radicale. I campioni
sono stati diluiti con pool di sieri di soggetti di sesso
femminile con PSA totale non misurabile e portati ad
una concentrazione di PSA totale pari a circa 0.2 ng/
mL (valore che definisce una ripresa di malattia dopo
prostatectomia radicale). I campioni diluiti sono stati
aliquotati, congelati a -80 °C ed il [-2]proPSA è stato
misurato in duplicato in 5 diverse giornate. Seguendo il
documento CLSI EP 17-A il LoD è stato poi calcolato
secondo la formula seguente: LoD = limite del bianco
(LoB) + Cß x DS cumulativa (dove Cß è il 95° percentile
della distribuzione Gaussiana standard corretto = 1.645/
(1-1(4 x f) [f = gradi di libertà = 90]).
Risultati: I valori di [-2]proPSA nei campioni diluiti dei 10
soggetti sono risultati compresi tra 0.73 e 3.67 pg/mL con
una DS cumulativa pari a 0.1979 pg/mL. Come limite del
bianco si è utilizzato il valore fornito dalla ditta (0.5 pg/mL).
In queste condizioni il LoD è risultato 0.8 pg/mL.
Discussione: Il valore di LoD ottenuto è tale da prospettare
la possibilità di utilizzo della misura del [-2]proPSA come
marcatore precoce di recidiva dopo prostatectomia totale
per Ca prostatico. Sarà ora necessario verificare se
questa applicazione potrà dare vantaggi clinici rispetto alla
misura del PSA totale.
P155
DETERMINAZIONE DEL TESTOSTERONE SIERICO:
CONFRONTO TRA METODO IMMUNOMETRICO E
HPLC-MS/MS
1
1
1
2
C. Artusi , M. Marinova , L. Brugnolo , G. Antonelli , M.
1
1
Zaninotto , M. Plebani
1
UOC Medicina di Laboratorio, Azienda OspedalieraUniversità degli Studi, Padova
2
Dip. di Medicina, Università degli Studi di Padova
Introduzione: La sindrome dell’ovaio policistico (PCOS)
è uno dei più comuni disordini ormonali nelle donne,
essendo presente nel 5-10% delle donne in età
fertile e rappresenta una delle più comuni cause di
infertilità. Attualmente la diagnosi di PCOS richiede
anche la determinazione dei livelli sierici totali di
testosterone (Te). La letteratura scientifica evidenzia
come i numerosi metodi analitici utilizzati siano altamente
imprecisi ed innacurati con conseguente mancanza di
standardizzazione.
Obiettivi:
Confrontare
il
sistema
diagnostico
immunometrico in uso nella nostra routine con un metodo
HPLC-MS/MS per la determinazione del testosterone
sierico nelle donne.
Materiali e metodi: Sono stati raccolti 123 campioni di
siero di pazienti donne afferenti al Servizio Medicina
di Laboratorio con richiesta di testosterone sierico.
Tutti i campioni sono stati analizzati con un metodo
in immunochemiluminescenza (ECLIA) sullo strumento
Modular E170 (Roche Diagnostics) e con un metodo
HPLC-MS/MS a triplo quadrupolo (Agilent Technologies).
I risultati sono stati elaborati statisticamente con Analyseit® Software (Ltd, Leeds, UK).
Risultati: I due metodi, messi a confronto attraverso
la regressione lineare e l’analisi di Bland-Altman,
2
presentano una buona correlazione (R =0.80, y=0.9224x
+0.2758) e un bias statisticamente non significativo
nel range di concentrazioni 0.08-6.70 nmol/L. Anche
nella valutazione del limite di quantificazione (ECLIA
LOQ=0.120 nmol/L vs HPC-MS/MS LOQ=0.165 nmol/L)
e dell’imprecisione analitica (ECLIA CV=5.3% vs HPCMS/MS CV=5.9%) i due metodi presentano entrambi
prestazioni adeguate alla diagnostica di PCOS.
Conclusioni: Il metodo immunometrico attualmente in uso
nella nostra routine ha mostrato una buona correlazione
con il metodo di riferimento, universalmente riconosciuto,
HPLC-MS/MS (sviluppato e validato). I dati ottenuti
confermano quindi che il metodo ECLIA applicato
su Modular E-170 è analiticamente affidabile per la
determinazione del testosterone sierico nelle donne come
segnalato dal programma di standardizzazione degli
ormoni del Center of Disease Control and Prevention.
P156
DIFFERENTI ISOTIPI DI GAMMOPATIE
MONOCLONALI IN UNA SERIE DI 1187 CASI
A. Frezzotti, M. Galeazzi, C. Paladini, R. Mazzoni, G.
Pennesi, M. Tocchini
Lab. Analisi, Ospedali Riuniti, Ancona
Introduzione: In laboratorio è frequente il riscontro
di una gammopatia monoclonale la cui prevalenza
è più frequente nelle persone anziane. Descriviamo
le caratteristiche delle componenti monoclonali (CM)
osservate in un periodo di tre anni.
Materiali e metodi: Negli anni 2009-2011 sono stati
studiati i campioni di 1187 pazienti (678 maschi e 509
femmine) che presentavano per la prima volta anomalie
del tracciato elettroforetico (Capillarys-Sebia) identificate
come CM alla immunofissazione su gel di agarosio
(Hydrasys-Sebia). E’ stata calcolata la frequenza delle
gammopatie monoclonali e biclonali e dei diversi isotipi
di CM. E’ stata valutata la differenza tra gruppi per età e
sesso.
Risultati: In 1133 pazienti (95,45%) era presente una CM;
i maschi erano 640 (56,49%) con età di 67±12,7 e le
femmine 493 (43,51%) con una età di 68±12,9; il 50% dei
pazienti sia maschi che femmine avevano più 70 anni. La
CM in 747 casi (62,90%) era di tipo IgG, in 203 (17,10%)
IgM, in 203 (12,22%) IgA, in 3 (0,25%) IgD; in 32 casi
(2,70%) erano presenti solo catene leggere e in 3 (0,25%)
solo catene pesanti. In 54 pazienti (4,55%), 38 (70,4%)
maschi con età 69,7±14,4 e 16 (29,6%) femmine con età
66,3±14,8 era presente una doppia CM; il 50% aveva più
73 anni. Le CM erano in 13 casi (1,09%) IgG-IgG, in 17
(1,43%) IgG- IgM, in 10 (0,84%) IgG IgA, in 7 (0,59%) IgAIgM e in 7 (0,59%) IgM-IgM. Nelle gammopatie con una
CM le catene leggere erano di tipo κ in 685 casi (60,60%)
e di tipo λ in 445 casi (39,40%). Nelle gammopatie con
doppia CM erano presenti catene leggere dello stesso tipo
κ o λ in 22 casi (40,74%) e catene leggere di tipo sia κ che
λ in 32 casi (59,26%). Nei maschi la frequenza di doppia
CM rispetto ad una CM era significativamente più elevata
(p=0,04) senza differenza per l’età. Per i diversi isotipi di
CM non si osservava nessuna differenza significativa né
per età né per sesso.
Conclusioni: La ripartizione dei diversi isotipi e la
frequenza di doppia CM risultano simili ai dati riportati in
letteratura. Lo studio delle frequenze ha evidenziato che
la presenza di doppia CM è più elevata nei maschi.
Decaux O, Rodon P, Ruelland A, et al. Epidemiology
of monoclonal gammopathy in a general hospital and a
university internal medicine department. Rev Med Interne
2007;28:670-6.
549
P157
ESPERIENZA DI UTILIZZO DI HE4 E CA125 NELLA
DIAGNOSTICA DEL CARCINOMA OVARICO
EPITELIALE
1
1
1
1
L. Bani , F. Cappellini , R. Falbo , M. Bertona , P.
2
Brambilla
1
Servizio Universitario di Medicina di Laboratorio, A. O.
di Desio e Vimercate, Desio (MB)
2
DIMS, Università degli Studi di Milano - Bicocca, Monza
(MB)
Introduzione: HE4 è una glicoproteina espressa in elevate
concentrazioni nel siero di pazienti affetti da carcinoma
ovarico epiteliale (EOC); grazie a queste caratteristiche
HE4 è stato proposto come marker complementare a
CA125.
Scopo: Verificare le performance diagnostiche di HE4
nella diagnosi del carcinoma ovarico rispetto a CA125 e
valutare l’algoritmo ROMA.
Materiali e metodi: Nel periodo compreso tra Agosto 2011
e Marzo 2012 sono stati raccolti 132 campioni di siero su
cui è stata determinata la concentrazione di HE4 tramite
dosaggio immunoenzimatico su BEP 2000 (Siemens).
99 delle 132 donne presentavano anche contemporaneo
dosaggio di CA125 eseguito su Modular (Roche). Ai fini
dello studio sono state incluse sole le 99 pazienti con
entrambi i dosaggi le quali sono state classificate in 4
categorie: nessuna patologia o patologie non tumorali,
tumori benigni, tumori maligni e carcinoma ovarico.
Risultati: 42 sono state le pazienti con nessuna patologia
o patologie non tumorali, 42 i casi di tumori benigni 9 di
tumori maligni e 6 di carcinoma ovarico. HE4 risulta al di
sopra del cutoff di 70 pM in tutti i casi di carcinoma ovarico
e non risulta alterato in nessuna condizione benigna ad
eccezione di un caso gravato da IRC. Di converso CA125
non identifica un caso di carcinoma ovarico e presenta
valori al di sopra del cutoff (35 UI/L) in 4 casi di condizioni
benigne. Sui 42 casi con nessuna patologia entrambi i
marcatori presentano valori al di sopra dei rispettivi cutoff
in 3 casi. L’utilizzo dell’algoritmo ROMA ha permesso di
identificare correttamente tutti i pazienti con carcinoma
come casi ad elevato rischio e tutti i pazienti con patologie
benigne come soggetti a basso rischio.
Conclusioni: Sebben con ristretta casistica, la valutazione
dei risultati ottenuti evidenzia che HE4 è un marcatore più
sensibile di CA125, che l’associazione tra HE4 e CA125
risulta essere la soluzione ottimale per la discriminazione
tra carcinomi ovarici e neoplasie benigne. Un caso
di carcinoma viene perso con la sola valutazione di
CA125 ma viene comunque identificato con l’utilizzo
dell’algoritmo ROMA.
550
P158
ESPERIENZA PLURIENNALE SULL'UTILIZZO
DELLA PROTEINA S100B NEL MONITORAGGIO DEL
MELANOMA MALIGNO
1
1
1
1
C. Cocco , B. Caruso , L. Lippa , N. Melloni , E.
2
2
1
Vigato , M. Governa , M.S. Graziani
1
Lab. Analisi dO, Az. Osp. Univ. Integrata di Verona
Chirurgia Plastica dO, Az. Osp. Univ. Integrata di
Verona
2
Introduzione: La proteina S100B è utilizzata nel
monitoraggio post-chirurgico del melanoma maligno
poichè numerosi studi hanno evidenziato la correlazione
fra elevate concentrazioni sieriche della proteina e la
progressione della malattia. Scopo del presente lavoro è
quello di verificare se la misura di S100B possa essere
un parametro utilizzabile nelle decisioni terapeutiche
(trattamento intensivo vs standard) di questi pazienti.
Materiali e Metodi: Dal 2003 al 2011 la concentrazione
sierica della proteina S100B è stata misurata in n=
3097 campioni di siero ottenuti da n=588 pazienti affetti
da melanoma maligno istologicamente confermato e
a diverso stadio clinico. La misura di S100B è stata
effettuata con l’analizzatore Liaison XL (DiaSorin) in
chemiluminescenza. Tutti i risultati ottenuti sono stati
integrati con i parametri clinici e la diagnostica per
immagini (Ecografia, TAC, RMN).
Risultati: L’analisi della performance diagnostica della
proteina S100B nel predire la progressione della malattia
impiegando un cut-off di 250 ng/L ha mostrato una
sensibilità=79% (IC 95%: 68.9-86.5), una specificità=
97.4% (IC 95%: 95.3-98.6). Il valore predittivo positivo
e negativo sono risultati rispettivamente 86.4 (IC
95%:76.8-92.4) e 95.7 (IC 95%: 93.2-97.3) mentre
l’efficienza è stata di 94.2% (IC 95%: 91.7-96). L’analisi
con la curva ROC di diversi cut-off (100, 120, 150, 170,
200, 220, 250) ha confermato il valore 250 ng/L come
migliore compromesso fra sensibilità e specificità.
Conclusioni: La nostra esperienza risulta a favore dell’uso
della proteina S100B nella gestione dei pazienti con
melanoma cutaneo maligno anche alla luce della recente
disponibilità di una terapia adiuvante che si è dimostrata
efficace in stadi avanzati della malattia (stadio III e oltre).
Kruijiff S, Hoekstra HJ. The current status of S-100B as a
biomarker in melanoma. Eur J Surg Oncol 2012;38:281-5.
P159
GAMMOPATIE MONOCLONALI IN UNA SERIE DI
9237 DONATORI DI SANGUE
1
1
1
1
A. Frezzotti , M. Galeazzi , C. Paladini , P. Caprini , R.
1
1
2
2
Mazzoni , M. Tocchini , G. Riganello , M. Piani
1
Lab. Analisi, Osp. Riuniti, Ancona
Dip. Reg. di Medicina Trasfusionale
2
Introduzione: Il riscontro occasionale di una componente
monoclonale (CM) in soggetti adulti sani è relativamente
frequente: circa 1,7% in soggetti di 50-59 anni e 5% in
soggetti con più di 70 anni. Il riscontro di una CM nel siero
è importante poiché essa può non essere accompagnata
da segni clinici o dati di laboratorio alterati o essere
la prima manifestazione di una concomitante malattia
linfoproliferaitva. Dal 2003 il Consiglio d’Europa e dal 2005
la Legge Italiana prevede per i donatori di sangue tra gli
esami di controllo standard anche la elettroforesi proteica.
Materiali e metodi: Negli anni 2007-2011, è stata eseguita
la elettroforesi proteica serica con metodo capillare
(Capillarys-Sebia) su 9237 donatori, 6193 maschi (67%)
e 3044 femmine (33%) di 18-65 anni di età. La
immunofissazione è stata eseguita su gel di agarosio
(Hydrasys-Sebia). I donatori sono stati suddivisi in 4
gruppi: maschi e femmine di 18-50 e 50-65 anni. E’ stata
calcolata la frequenza delle CM nei diversi gruppi e la
frequenza dei diversi isotipi.
Risultati: I maschi avevano 37,9 (±11,3) anni e le
femmine 34,8 (±11,2). I tracciati elettroforetici mostravano
anomalie in 174 casi; la immunofissazione su 168 casi
evidenziava una CM in 52 (0,56%): 50 su 6193 maschi
(0,81%) e 2 su 3044 femmine (0,07%)(p<0,0001). Nei
maschi di 18 - 50 anni (5139) si osservavano 21 CM
(0,41%) e in quelli di 50 - 65 anni (1054) si osservavano
29 CM (2,75%) mentre solo nelle femmine di 50 – 65
anni (359) si osservavano 2 CM (0,56%). Le CM erano di
tipo IgG in 36 casi (69,23%), IgM in 9 (17,31%), IgA in 6
(11,54%) e IgD in 1 (1,92%). La catena leggera era di tipo
κ in 34 casi (65,38%), e λ in 18 (34,62%).
Conclusione: La presenza di una CM nella nostra
popolazione di donatori ha una frequenza simile ai dati
riportati in letteratura. La presenza di una CM nelle
femmine è significativamente più bassa rispetto ai maschi.
Quando si osserva una CM il donatore viene avviato a
consulenza ematologia e per misura precauzionale viene
escluso dalla donazione.
Maisnar V, Tichy M, Rehacek V, et al. Monoclonal
gammopathies in a series of 1743 plasma donors. Acta
Medica 2006;49:119-21.
P160
HIGH DETECTION RATE OF GENOMIC
IMBALANCES IN CD138-POSITIVE ENRICHED
PLASMA CELLS FROM MULTIPLE MYELOMA
PATIENTS
E. Danese, S. Munari, M. Montagnana, E. Meneghelli, F.
Aprili, G.C. Guidi
Dip. di Scienze della Vita e della Riproduzione, Sezione
di Biochimica Clinica, AOUI Verona
Background: Multiple Myeloma (MM) is a heterogeneous
disease, which is characterized by the occurrence of
specific genomic abnormalities that are both of diagnostic
and prognostic relevance. The detection of these
abnormalities through molecular-genetic techniques is
hampered by the overall low percentage of proliferating
plasma cells (PCs) present in whole bone marrow
(BM) aspirates. To overcome the risk of false-negative
results, the International Myeloma Working Group has
recently suggested to perform interphase FISH (i-FISH)
on enriched PCs samples.
Aims: (a) to develop and optimize a protocol of magnetic
cell sorting (MACS) for the selection of CD138-positive
PCs from whole BM aspirates; (b) to compare the
diagnostic efficacy of i-FISH in enriched PCs with that in
whole BM samples.
Methods: 140 samples from patients with MM (n=120)
and benign monoclonal gammopathy of undetermined
significance (MGUS, n=20) were divided into two groups
representing two different phases for analysis: (1) 120
cases referred to our diagnostic centre before June
2012 were evaluated by i-FISH performed on unsorted
BM cells from routine chromosomal preparations; (2) 20
cases collected after June 2012 were assessed by iFISH performed on CD138+ sorted BM cells. Magnetic
cell separation of PCs was performed using the Whole
Blood CD138 MicroBeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
according to the manufacturer’s protocol. The MACS
enrichment was verified by flow cytometric analysis.
The i-FISH panel included probes for the identification
of t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16;q32) and 13q14/17p13
aberrations. 300 nuclei were scored for each sample. The
detection threshold for gains, losses and translocations
was set at 10% for all probes.
Results: The percentage of plasma cells after magnetic
cell separation varied between 30% and 78%. One or
more genomic abnormalities were detected in enriched
PCs in 10/20 (50%) cases, whereas in whole BM samples
these abnormalities were detected in only 23/120 (19%)
of the cases (P<0.001).
Conclusion: MACS-enrichment technique results in a
significantly increased detection rate of clinically relevant
genomic abnormalities in intherphase cells.
Ross FM, Avet-Loiseau H, Ameye G, et al. Report from
the European Myeloma Network on interphase FISH in
multiple myeloma and related disorders. Haematologica
2012;97:1272-7.
551
P161
INHIBIN B: A USEFUL MARKER OF TESTICULAR
FUNCTION IN CONGENITAL HYPOGONADOTROPIC
HYPOGONADISM
1
1
1
A. Gubbiotti , L. Scarnecchia , L. Rosengart , S.
2
Scommegna
1
U.O.C. Biochimica Clinica Azienda Ospedaliera San
Camillo Forlanini Roma
2
U.O.C. Pediatria ed Ematologia Pediatrica Azienda
Ospedaliera San Camillo Forlanini Roma
Background: Inhibin B (InB) is a dimeric glycoproteic
hormone produced by testicular Sertoli cells since fetal
life. Its main function is providing feed-back regulation
on pituitary FSH secretion. Plasmatic InB is detectable
in males since birth up to adulthood in a characteristic
pattern, so it is widely considered as a marker of future
spermatogenesis even in pediatric age.
Objectives: to describe the usefulness of plasmatic
InB assay in diagnosis and follow-up of congenital
hypogonadotropic hypogonadism (CHH) since infancy.
Methods: InB B Gen II ELISA, enzymatically amplified
three-step “sandwich “ assay (manufactured by Beckman
Coulter Inc. and distributed by Pantec) was used for
the quantitative measurement of plasmatic InB in human
serum.
Results: an infant male with multiple pituitary hormone
deficiency due to severe anterior pituitary hypoplasia was
demonstrated to have CHH, by typical clinical picture
(micropenis and small testicular volume), and very low
levels of Testosterone, LH, FSH, and InB, during the
expected hormonal surge of minipuberty (2nd – 6th month
of life). Treatment with recombinant FSH was able to
increase testicular volume for age, and restore plasmatic
InB levels within the normal range for age. Medium-term
follow up (4 years) demonstrated persistence of normalfor-age both testicular volume, evaluated clinically and by
testicular sonography, and InB plasmatic levels.
Conclusion: this case report demonstrates that InB is a
valuable marker of testicular function for diagnosis and
follow-up of CHH even in infancy.
Crofton PM, Evans AEM, Groome NP, et al. Inhibin B
in boys from birth to adulthood: relationship with age,
pubertal stage, FSH and testosterone. Clin Endocrinol
2002;56:215–21.
552
P162
LA DETERMINAZIONE DELL’ALDOSTERONE
CON METODO CHEMIOLUMINESCENTE
AUTOMATIZZATO NEL PLASMA E NELLE URINE
Introduzione: L’aldosterone svolge un importante ruolo
nella regolazione del bilancio elettrolitico e del rapporto
di volume e pressione del sangue. La determinazione
della sua concentrazione risulta molto utile nel
percorso diagnostico dell’ipertensione per la possibilità di
evidenziare fenomeni di iper o ipo secrezione.
Materiali e metodi: La concentrazione di aldosterone
è stata misurata in 88 campioni di urina delle 24 ore
e 95 campioni di plasma EDTA di pazienti afferenti
al nostro laboratorio. La popolazione analizzata era
costituita complessivamente da 93 donne e 90 uomini.
Oltre al metodo correntemente utilizzato, ALDOCTK
DiaSorin RIA, le determinazioni sono state eseguite con
il sistema completamente automatizzato IDS-iSYS. Le
concentrazioni di aldosterone erano comprese tra 1,3
e 40,5 ng/dL e tra 12,6 e 94,1 ng/dL rispettivamente
per i campioni di urina e di plasma. La riproducibilità
del metodo IDS-iSYS nelle urine è stata valutata
secondo il documento CLSI EP5-A2 per concentrazioni di
Aldosterone comprese tra 14,1 e 97,7 ng/dL.
Risultati: La regressione di Passing-Bablok del sistema
iSYS verso il metodo RIA mostra una pendenza di 1,20
(IC95% = 1,11-1,28) ed una intercetta di 2,1 (IC95% =
1,08-3,19) per le urine ed una pendenza di 0,84 (IC95% =
0,76-0,92) ed una intercetta di 3,78 (IC95% = -6,28-13,57)
per i campioni di plasma. Il coefficiente di correlazione
di Pearson è risultato di 0,951 (P <0.0001) e 0,953 (P
<0.0001) rispettivamente per i campioni di urina e plasma.
La distribuzione dei valori nel diagramma di Bland-Altman
Media% (+ 1.96 DS) è risultata di -39,7 (da -99,8 a 20,3)
per le urine e di 5,8 (da -77,9 a 89,5) per i campioni di
plasma. Nella valutazione della ripetibilità nei campioni di
urina sono stati riscontrati valori di CV compresi tra 5,5 e
12,7 per le determinazioni nella serie e tra 2,8 e 8,4 tra
le serie.
Conclusioni: La correlazione positiva dei risultati
riscontrata tra il metodo IDS-iSYS ed il metodo
RIA DiaSorin, considerato come riferimento, associata
alla buona riproducibilità dei risultati, ai limitati
interventi manuali dell’operatore e tempi brevi necessari
per l’ottenimento dei risultati conferiscono al nuovo
metodo un ruolo importante nel percorso diagnostico
dell’ipertensione.
P163
LOW LUTEINIZING HORMONE (LH) LEVELS IN
MEN WITH LONG TERM EFFECTS AFTER USE OF
FINASTERIDE AGAINST ANDROGENIC ALOPECIA
1
1
2
P164
PANCREATIC CANCER (PaCa)-DERIVED SOLUBLE
MEDIATORS INDUCE DENDRITIC CELLS (DC) TO
ACQUIRE AN IMMUNESUPPRESSIVE PHENOTYPE
BY DOWNREGULATING CTLA4
2
S. Cauci , G. Stel , S. Mazzolini , G. Barbina , F. La
1
3
3
3
Marra , G. Mazzon , G. Chiriacò , C. Trombetta
1
Dip. Scienze Mediche e Biologiche, Università di Udine,
Udine
2
Laboratorio Analisi d'Elezione, Azienda Ospedaliero
Universitaria, Santa Maria della Misericordia, Udine
3
Dip. Clinico di Scienze Mediche, Chirurgiche e della
Salute, Clinica Urologica, Università di Trieste, Trieste
Background: Finasteride is widely used for benign
prostatic hyperplasia (at 5 mg/die) and alopecia (at 1 mg/
die). Finasteride is an inhibitor of the enzyme 5-alphareductase, that impairs the conversion of testosterone
(T) to dihydrotestosterone (DHT). So far only 2
studies addressed the impact of finasteride on side
effects, particularly depression, among patients treated
for alopecia. Only preliminary information is available
on hormonal profile of patients with adverse sideeffects. However, the results of the alopecia studies
require confirmation and a deeper evaluation of reasons
producing long-term persistence of sexual dysfunctions.
We aimed to characterize 9 patients with long-term postfinasteride syndrome in comparison to 30 healthy controls.
Methods: Nine patients (36 ± 5 years old) with persistent
(over 6 months) adverse effects including erectile
dysfunction, loss of libido and depression, and 30 healthy
matched controls were enrolled. Luteinizing hormone
(LH), follicle stimulating hormone (FSH), estradiol (E2),
total testosterone, free testosterone, and available
testoterone levels were evaluated in morning serum of all
subjects.
Results: LH was nearly 2-fold lower in cases (P =
0.01), whereas FSH was not statistically different between
groups. Testosterone concentrations (including total, free
and available forms) were lower in cases than in controls,
P < 0.01. Interestingly, the ratio of T/E was lower in cases
than in healthy controls, P < 0.01.
Conclusions: The percentage of subjects having postfinasteride syndrome is still to be determined and reasons
of such persistent effects are unknown. Our study was
the first to determine a peculiar hormonal profile in
these patients suggesting an impairment of the endocrine
interplay of hypothalamus, pituitary and the testis, which
specifically dampens LH, one of the gonadotrophins
released from the pituitary gland, that helps to produce
testosterone.
La Marra F, Di Loreto C, Mazzon G, et al. Preliminary
evidence of a peculiar hormonal profile in men
with adverse effects after use of finasteride against
androgenetic alopecia. Am J Pathol 2012;181:S8.
1
1
1
2
E. Gnatta , P. Fogar , A. Aita , C. Frasson , S.
3
3
1
1
Teolato , M. Facco , D. Bozzato , S. Moz , G.
1
2
1
1
Semenzato , G. Basso , D. Basso , M. Plebani
1
Department of Medicine - DIMED, University of Padova,
Padova
2
Department of Women’s and Children’s Health,
University of Padova, Padova
3
Laboratorio Oncoematologia pediatrica, University of
Padova, Padova
Objective: An altered function of lymphocytes, DC and
immature myeloid cells appears to be an hallmark
of tumor-mediated immune suppression and the two
inhibitory co-stimulatory receptors PDL-1 and CTLA4
might have a role in this context. The aim of the
present in vitro study was to assess whether PaCa
cells cross-talk with normal mononuclear circulating cells
(PBMC) causing them to acquire an immunesuppressive
phenotype and to evaluate whether PDL1 and CTLA4 are
involved.
Methods: PBMC from blood donors were cultured for 4
days in Control (CTL) and in the PaCa cancer cell line
Capan1 conditioned media (CM). Lymphocytes subsets
(CD4+, CD8+, CD4+CD25+) and CD33+ immature
myeloid cells subsets (CD14+/-; HLA-DR+/-) expressing
or not PDL1 and/or CTLA4 were analysed by flow
cytometry. To assess immunesuppressive function,
myeloid cells were FACS sorted and co-coltured with
allogenic total T lymphocytes in 1:20 and 1:40 ratio.
Total T lymphocytes proliferation was determined by 3HThymidine uptake.
Results: Capan1 CM caused an expansion of
CD4+CD25+ (p=0.01) and a reduction of CD33+CD14HLA-DR+ (p=0.03) cells. In this latter cellular subset,
CM caused also an increase of PDL1 (p=0.046) and
a decrease of CTLA4 (p=0.05) positive cells. FACS
sorted CTL and CM CD33+CD14-HLA-DR+ cells did
not significantly affect the proliferation of allogenic
total T lymphocytes at 1:20 (p=0,54) or at 1:40 ratio
(p=0,81). The CD33+CD14-HLA-DR+ PDL-1+ cells did
not significantly modify allogenic T cells proliferation with
respect to PDL- cells (p=0,11), while those cells which
were CTLA4 negative caused a significant inhibition of
T cell proliferation in comparison of CTLA4 positive cells
(p=0,008).
Conclusions: PaCa-derived soluble factors induce
the expansion of the inhibitory lymphocytes subset
CD4+CD25+ and a reduction of the immature
CD33+CD14-DR+ dendritic cells. The tumor associated
reduced expression of the inhibitory molecule CTLA4 in
this cell population was demonstrated to characterize an
immunosuppressive phenotype and this study suggests to
take care in the use of anti-CTLA4 therapies.
553
P165
RICERCA DEL SANGUE OCCULTO FECALE
E STABILITA’DELL’EMOGLOBINA FECALE:
CONFRONTO TRA DUE TAMPONI DI
CONSERVAZIONE
P166
SIMULTANEOUS CORTISOL AND CORTISONE
MEASUREMENT IN URINE BY LC-MS/MS IN A
ROUTINE LABORATORY
1
E. Gnatta, M.G. Epifani, M. Zaninotto, M. Plebani
2
2
2
G. Antonelli , C. Artusi , M. Marinova , L. Brugnolo , M.
2
2
1
Dip di Medicina, Università degli Studi di Padova
Dip interaziendale Azienda Ospedaliera-Università degli
Studi, Padova Servizio Medicina di Laboratorio
2
Obiettivo: La determinazione del Sangue Occulto Fecale
(SOF) è di fondamentale importanza per una diagnosi
precoce del cancro colon-rettale. Scopo dello studio
è valutare la stabilità dell’emoglobina Fecale (HbF)
a diverse temperature (T) in campioni SOF positivi
con due diversi dispositivi di raccolta del campione
(Sentinel CH): FOB Gold Tube Screen e FOB Gold
Tube NG con tampone di conservazione H (BH) e N
(BN) rispettivamente. Inoltre sono state analizzate le
prestazioni analitiche di BH, progettato per lo screening
con l’obiettivo di ridurre la degradazione di HbF a
temperatura (T) ambiente.
Metodi: LOQ, imprecisione totale (2 livelli di controllo; 2
campioni; range: 66.3-447.6 ng/mL), linearità ed effetto
prozona sono stati valutati mediante uso di Hb umana
di sintesi in BH. Le prove di stabilità per FOB Gold
Tube Screen sono state condotte su 3 campioni fecali
(HbF=96.5, 227.8 e 649.5 ng/mL): da ciascuno si è
ricavato un pool (50 mL da 30 campionamenti). I 3 pools
sono stati aliquotati e conservati 15gg a T 4, 23, 30 e 37
°C . Stesso procedimento è stato seguito per FOB Gold
NG con altri 3 campioni (HbF=131.9, 277.2 e 632.3 ng/
mL). Un’aliquota di ogni campione per ogni temperatura
è stata testata, in triplicato, ai giorni 0, 1, 4, 5, 8, 11, 14
e 15 sullo strumento Cobas 6000 (Roche Diagnostics)
ed è stata valutata la percentuale (%) di degradazione
dell’HbF.
Risultati: Prestazioni analitiche: LOQ=18,9 ng/mL;
imprecisione totale=6.5-9.41%; assenza di effetto
prozona fino a 20.000 ng/mL; ottima linearità (slope=0.99
intercept=1.26, range: 74.8-800.8 ng/mL) anche in
campioni con varianti emoglobiniche (HbS, HbC e
HbA1c). Degradazione media % HbF dopo 5gg T 4 °C:
BN=5.3, BH=-3.2; T 23 °C: BN=-12.8, BH=-9.66; T 30
°C: BN=-49.9, BH=-28.5; T 37 °C: BN=-66.0, BH=-54.6.
Degradazione media % HbF dopo 8gg T 4 °C: BN=-4.8,
BH=-4.6; T 23 °C: BN=-16.3, BH=-10.31; T 30 °C:
BN=-56.1, BH=-38.3; T 37 °C: BN=-80.0, BH=-72,3.
Conclusioni: Il tampone BH, a differenza di BN, sembra
garantire all’HbF una maggiore stabilità. Entrambi i
dispositivi non permettono una conservazione dell’HbF
ad alte T (>23 °C). La degradazione % osservata non
risulta essere concentrazione-dipendente per BH mentre
BN conserva meglio i campioni a bassa concentrazione.
554
Introduction: Cortisol (F) is a steroid hormone produced by
adrenal gland under the influence of adrenocorticotrophic
hormone. It’s metabolized via the action of the enzyme 11
ß-hydroxydehydrogenase type 2 (11 ß-HSD2), expressed
in the kidney, colon and salivary tissue, which converts
F to the inactive form cortisone (E). Urine free E and the
ratio of urine F to E are considered indices of 11 ß-HSD2
in the kidney and the simultaneous analysis of F and
E is potentially useful in patients with adrenal disorders,
but also in athletes in relation to physical exercise and
training status. Historically, immunoassay were widely
used for F analysis, but successively chromatographic
methods have been preferred because less susceptible
to interference from E and other steroid metabolites. Few
LC-MS/MS methods for F and E analysis have been
reported, but these methods are time- and labor-intensive.
Aim: Development and validation of a LC-MS/MS method
to measure simultaneously F and E in urine with simple
sample preparation.
Methods: After the urine acidification, the samples were
processed to the LC-MS/MS system that includes an online SPE. Chromatographic separation of F and E was
achieved by use a Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6 mm x
50 mm, 1.8 μm). F, E, d4F and d7E were detected in
the multiple-reaction monitoring mode. Both quantitative
and qualitative mass to charge transitions were used
to monitor F (363±121, 363±327) and E (361±163,
361±145), with single transitions for the internal standards
(d4F 367±121, d7E 369±169). Tests for linearity, LOD,
LOQ, imprecision and recovery were carried out.
Results: Calibration curves were linear throughout the
studied ranges (F: 5-680 nmol/L, E: 11-1385 nmol/L) with
correlation coefficient >0.998 for both analytes. LOD and
LOQ were 4 and 5 nmol/L for F and 5 and 6 nmol/L for E.
The intra-day and inter-day imprecisions were <10% for F
and E. Recoveries ranged from 91 to 112%.
Conclusions: The proposed method demonstrated
satisfactory linearity, analytical sensitivity, imprecision
and accuracy for F and E. The pre-analytical variability has
to be investigated as well as the reference ranges. Taking
into account the obtained data, we should conclude that
the method can be proposed for the application in a
routine clinical laboratory.
P167
TRE CASI DI GAMMAPATIE MONOCLONALI DI TIPO
IgD
P168
UNA RARISSIMA CONDIZIONE: DESCRIZIONE DEL
SECONDO CASO DI MGUS IgE
M. Galeazzi, A. Frezzotti, C. Paladini, P. Caprini , G.
Pennesi , M. Tocchini
G. Avveduto , F. Balboni , T. Biagioli , A. Caldini , M.
1
1
2
1
Brogi , A. Terreni , B. Morrocchi , F. Cassani , A.
1
1
1
Gironi , L. Reggiani , G. Messeri
Lab. Analisi, Osp. Riuniti, Ancona
Introduzione: Le componenti monoclonali (CM) di tipo IgD
sono rare e nel 60% sono di tipo IgDλ e quasi sempre
associate a mieloma multiplo (MM); rarissimi sono i casi di
gammapatia monoclonale di incerto significato (MGUS).
Materiali e metodi. L’elettroforesi serica è stata
eseguita con la tecnica capillare, (Capillarys-Sebia);
l’immunofissazione è stata eseguita su gel di
agarosio (Hydrasys-Sebia). Sono state determinate le
immunoglobuline e le catene leggere libere κ e λ (Freelite
TM –Binding Site su BNA II-Dade Bhering).
Risultati: Caso 1. Maschio di 63 anni: nel febbraio 2009
veniva identificata una CM IgDλ; il rapporto κ/λ era 0,05
(IR 0,26-1,65). Le IgG risultavano leggermente diminuite,
5,52 g/L; normali erano Hb: 14,1 g/dL e creatinina: 1,1
mg/dL. L’esame urine evidenziava la perdita di 5g/24h di
proteine e la presenza di catene leggere libere di tipo λ.
La diagnosi clinica era di MM. Il paziente è attualmente
in terapia. Caso 2. Maschio di 60 anni: nel settembre
2009 veniva identificata una CM IgDλ; il rapporto κ/λ era
0,08. Le IgG risultavano leggermente diminuite, 5,47 g/
L; normali erano Hb: 13,6 g/dL e creatinina: 1,0 mg/dL.
Assente era la proteinuria di Bence Jones. La biopsia
midollare evidenziava plasmacellule atipiche pari all’8%.
La diagnosi clinica era di MGUS. A tre anni di distanza i
dati di laboratorio sono pressoché invariati ed il paziente
è asintomatico. Caso 3. Femmina di 62 anni: nel febbraio
2010 venivano identificata una CM IgDκ e la presenza di
catene libere di tipo κ; alterati erano i valori di Hb: 9,4 g/dL
e creatinina: 2,6 mg/dL. La diagnosi clinica era di MM e la
paziente moriva dopo 4 mesi per insufficienza renale.
Conclusione: Le CM vanno accuratamente tipizzate e
la identificazione di una IgD è importante poiché è
caratterizzata da rapida evoluzione e quindi richiede un
attento monitoraggio. Inoltre è importante che in caso di
insufficienza renale di dubbia eziologia si proceda ad uno
studio approfondito dell’assetto proteico poiché è elevato
il rischio di misisinterpretare le nefropatie secondarie a
discrasie plasmacellualri.
Kuliszkiewicz-Jnus M, Zimmy A, Sokolska V, et al.
Immunoglobulin D myeloma-problems with diagnosing
and staging (our experience and literature review). Leuk
Lynphoma 2005;46:1029-37.
1
2
1
1
1
Firenze
2
Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, IFCA, Firenze
Il Mieloma Multiplo (MM) IgE è il più raro e rappresenta
circa lo 0.01% di tutti i MM. Il primo caso è stato descritto
nel 1967 e ad oggi sono 46 i casi riportati in letteratura. Il
MM IgE è più aggressivo e con una prognosi più infausta:
la sopravvivenza media dalla diagnosi è infatti 16 mesi,
contro 30 degli altri tipi di MM. Scopo di questo lavoro
è descrivere un caso clinico di MGUS IgE, condizione
ancora più rara del MM IgE, di cui in letteratura è riportato
solo un altro caso, descritto nel 1980. A luglio 2012,
il signor PP di 69 anni viene ricoverato presso l’AOU
Careggi per un intervento neurochirurgico (glioblastoma
parasagittale destro), ed in seguito ricoverato in
Riabilitazione Neurologica (IFCA, Firenze). Agli esami di
ingresso l’elettroforesi sieroproteica mostra una spiccata
ipogammaglobulinemia, ed una lieve alterazione in zona
beta 2. L’esame emocromocitometrico, e gli altri parametri
ematochimici risultano nella norma. Viene eseguita
l’immunofissazione (IFE) che evidenzia una componente
monoclonale IgE Lambda, corrispondente all’alterazione
del tracciato in zona beta 2. La misura delle catene
leggere libere sieriche risulta nella norma. Il signor PP
riferisce che già nel 1994 era stato sottoposto ad esami di
approfondimento in seguito al riscontro di un incremento
di IgE sieriche. Consultando i dati archiviati presso
Laboratorio Generale AOUC, è stato ritrovato il tracciato
elettroforetico e l’IFE eseguiti nel 1994 che risultano
sovrapponibili a quelli attuali, così come l’IFE urinaria
risultava negativa. Negli anni successivi fino al 1999 il
sig PP si sottopone a controlli con cadenza annuale:
l’entità della componente monoclonale rimane costante e
la proteinuria di Bence Jones resta negativa. In seguito
il signor PP riporta di aver volontariamente interrotto i
controlli periodici. Dal 1994 a oggi il paziente non ha mai
avuto sintomatologia clinica che possa essere associata
al MM. Pertanto si può concludere di essere in presenza
di un caso di MGUS IgE Lambda, rimasto stabile per 18
anni, a conferma del fatto che le discrasie plasmacellulari
IgE, malgrado la maggior aggressività del MM IgE, non
sono sempre associate ad un fenotipo maligno.
Ludwig H, Vormittag W. "Benign" monoclonal IgE
gammopathy. Br Med J 1980;281:539-40.
555
P169
UTILIZZO DELLA TIREOGLOBULINA
ULTRASENSIBILE NEL FOLLOW-UP DI PAZIENTI
CON CARCINOMA TIROIDEO
1
1
1
P170
EXTRAMEDULLARY HAEMATOPOIESIS IN
ADULT POLYTRANFUSED PATIENTS WITH
THALASSAEMIA: THE HIGH PREVALENCE OF THE
GENETIC COMPOUNDS IVS 1-6/CODON 39
1
M. Brugia , S. Suppressa , A. Serpilli , V. Scocco , M.
1
2
2
2
Tocchini , A. Taccaliti , F. Silvetti , G. Palmonella , M.
2
Boscaro
1
1
2
P. Ricchi , M. Ammirabile , T. Di Matola , A.
1
1
1
1
Spasiano , S. Costantini , P. Cinque , L. Pagano , L.
1
Prossomariti
1
Laboratorio Biochimica Clinica e Microbiologia Azienda
2
Clinica Endocrinologica Azienda Ospedali Riuniti
Ancona
Premesse: Il carcinoma papillare e follicolare della tiroide
o carcinomi tiroidei differenziati (CTD) sono le neoplasie
endocrine più frequenti e la prevalenza di recidive
è piuttosto elevata. Nel follow-up dopo trattamento
chirurgico e ablativo la Tireoglobulina (Tg) nel siero
dovrebbe essere indosabile. Secondo le recenti linee
guida la presenza di livelli di Tg >1 ng/mL in terapia o
livelli >2 ng/mL dopo stimolo con rhTSH, deve essere
considerata come ripresa di malattia. Scopo del lavoro
è stato quello di verificare l’utilità del dosaggio della
Tg ultrasensibile (Tg us), che insieme ai dati ecografici,
potrebbe ridurre il ricorso alla stimolazione con rhTSH e
altri test aggiuntivi.
Materiali e metodi: Tra 1/11/2011 e 01/03/2012 sono stati
esaminati 65 campioni di siero di 19 pazienti maschi e
46 femmine sottoposti a tiroidectomia totale per CTD e
seguiti presso la Clinica Endocrinologica dell’Ospedale di
Ancona. Su tutti i pazienti è stato effettuato il dosaggio
della Tg basale e di quella dopo stimolo (ECLIA Modular
E170). La Tg basale è stata dosata anche con metodo
ultrasensibile (Access Beckman Coulter). Su tutti i pazienti
inoltre è stata effettuata la ricerca di anticorpi anti-Tg
(CMIA Architect Abbott).
Risultati: Tutti i pazienti sono risultati negativi per la ricerca
degli anticorpi anti-Tg. La correlazione tra Tg us e quella
dopo stimolo è risultata statisticamente significativa. I
pazienti, in base all’ecografia del collo, ai referti istologici
e ai valori di Tg us, sono stati suddivisi in 5 gruppi. Gruppo
A Tg ≤0.03 ng/mL (9 pazienti) nessuno ha presentato
recidiva di malattia. Gruppo E Tg #1 ng/mL (8 pazienti)
tutti hanno presentato recidiva. Nei restanti gruppi B, C,
D Tg 0,04-0,99 ng/mL (48 pazienti) 7 hanno presentato
recidiva.
Conclusioni: Dall’elaborazione dei dati, si evidenzia che la
Tg us è in grado di individuare recidiva di malattia anche
nei pazienti con valori di Tg <1 ng/mL. Il dosaggio della
Tg us nel follow-up del CTD può essere utile in quanto
evita la stimolazione esogena con rhTSH contenendo i
costi sanitari (circa 1000 € a paziente) e riduce il disagio
per il paziente.
Medical guidelines for clinical practice for the diagnosis
and management of thyroid nodules. Endocr Pract
2006;12:63-102.
556
1
UOSD Centro delle Microcitemie AORN Cardarelli,
Napoli
2
Patologia Clinica Ospedale dei Colli, AORN Monaldi,
Napoli
Introduction: The mechanisms responsible for the
sporadic occurrence of Extramedullary Hematopoiesis
(EMH) in polytransfused thalassaemic patients have not
yet been clarified. In this study we tried to clarify the
influence of genotype and of other factors on the presence
of EMH.
Material and methods: We performed a retrospective
database review of our polytransfused thalassaemic
patients between January 2006 and December 2011.
Demographics, transfusion, genetic, radiologic and
biochemical data were collected and statistically
analysed.
Results: EMH was found in 18 patients. Patients with
EMH were older, had higher number of erythroblasts and
higher level of the soluble form of transferrin receptor
(sTfR) with respect to patients without EMH; on the other
hand, patients with EMH had a lower iron intake and a
higher pre-transfusion Hb level as compared with those
without EMH. 9 out of 18 patients with EMH had the
genetic compounds IVS 1-6/codon 39. A high frequency
of thrombotic events was also recorded among patients
with this genetic compounds.
Conclusion: Overall, among the cohort of our transfused
patients, these data identify the presence of a category
of patients mostly with the genetic compounds IVS
1-6/codon 39 which have increased sTfR level and
excessive expansion of erythroid marrow, despite the
optimal transfusion regimen, probably responsible for the
tendency to develop EMH.
P171
BIOLOGICAL VARIABILITY OF LYMPHOCYTE
SUBSETS OF HUMAN ADULTS’ BLOOD
F. Tosato, G. Pantano, M.C. Sanzari, D. Bernardi, A.
Padoan, P. Fogar, M. Plebani
P172
DETECTION OF SERUM IGA MONOCLONAL
COMPONENTS IN PATIENTS EVALUATED FOR AL
AMYLOIDOSIS, USING HEAVY CHAIN/LIGHT CHAIN
IMMUNOASSAY (HEVYLITE)
1
Dip. Medicina di Laboratorio, Az. Osp. Padova
Introduction: Lymphocyte subpopulations are altered in
many immune diseases. To evaluate the effect of
medical treatment or to follow the course of disease, the
distribution and changes of the lymphocyte populations
are followed for longer periods, both in the clinical setting
and for research. In order to properly estimate longitudinal
changes it is important to take into consideration the
biological variation.
Objective: We considered biological variability in order
to provide an insight into the performance of lymphocyte
populations allowing to define quality specifications of
their determination, and to define the utility of traditional
population-based values.
Methods: Four-colour-flow cytometry was used to
investigate biological variation of lymphocyte populations
in peripheral blood of 20 adult healthy subjects
(eleven women, nine men aged 25–58 years) recruited
from our laboratory staff and followed for 3 months.
Absolute counts and proportions were determined for
T-cells (CD3+), T-helper cells (CD3+CD4+), cytolytic
T-cells (CD3+CD8+), B-cells (CD3-CD19+), NK-cells
(CD3-CD16+/56+), non-MHC restricted cytolitic T-cells
(CD3+CD56+) and activated T-cells (CD3+HLA-DR+).
Results: CVintra, CVbetween and Individuality Index are:
0.04, 0.10 and 0.13 for CD3; 0.08, 0.17 and 0.20 for CD4;
0.05, 0.26 and 0.03 for CD8; 0.11, 0.29 and 0.14 for CD19;
0.25, 0.49 and 0.28 for CD56; 0.23, 0.45 and 0.21 for
CD16; 0.38, 0.62 and 0.43 for CD56+CD3+; 0.23, 0.56
and 0.14 for CD3DR. Quality specifications: CV desirable,
CV minimum and CV optimum are: 0.020, 0.030 and 0.010
for CD3; 0.040, 0.060 and 0.020 for CD4; 0.025, 0.038 and
0.013 for CD8; 0.055, 0.083 and 0.028 for CD19; 0.125,
0.188 and 0.063 for CD56; 0.015, 0.173 and 0.058 for
CD16; 0.190, 0.285 and 0.095 for CD56+CD3+; 0.115,
0.173 and 0.058 for CD3DR.
Conclusions: Data on the components of biological
variation can be applied to set quality specifications for
allowable precision, bias and total error. Data on withinsubject biological variation and analytical precision can
be used to determine the change that has to occur
to an individual’s serial results before the change is
significant (reference change values). Comparing withinand between-subject biological variation allows us to
define the uselessness of normal ranges.
1
2
1
F. Lavatelli , G. Palladini , G. Sarais , V. Valentini , T.
2
1
1
3
1
Bosoni , A. Foli , M. Nuvolone , S. Harding , G. Merlini
1
Amyloidosis Research and Treatment Center, Dept.
of Molecular Medicine, Fond. IRCCS Policlinico San
Matteo and University of Pavia, Italy
2
Clinical Chemistry Dept., Fond. IRCCS Policlinico San
Matteo, Pavia, Italy
3
The Binding Site, Birmingham, UK
Background: AL amyloidosis patients often have small
monoclonal components (MC), difficult to quantify by
densitometry. IgA are most problematic, due to anodic
TM
migration and masking under ß-zone proteins. Hevylite
IgA assay (The Binding Site) separately quantifies
IgAκ and IgAλ and infers clonality from IgAκ/IgAλ-ratio.
This study aimed at assessing Hevylite performance in
identifying serum IgA MC in a series of patients referred for
suspected systemic AL amyloidosis, in whom agarose gel
electrophoresis/immunofixation (IFE) had detected IgAκ or
IgAλ MC, or IgA bands without identifiable associated light
chains (LC), or increased IgA background without clear
MC.
Methods: Serum MC were assessed by IFE and free light
TM
chain (FLC) quantification (Freelite ) in 35 consecutive
patients. Hevylite reference ranges are: IgAκ 0.48-2.82 g/
L; IgAλ 0.36-1.98 g/L; IgAκ/IgAλ-ratio 0.8-2.04.
Results: At IFE, 28/35 patients had complete IgA
components (8 IgAκ; 20 IgAλ), 17 of which (6 IgAκ; 11
IgAλ) could be quantified by densitometry. 2 patients had
IgA bands without identifiable LC; 5 had increased IgA
background. Using Hevylite, IgAκ/IgAλ-ratio was elevated
in all cases with IgAκ MC at IFE; 6 of them also had high
IgAκ concentration (range: 2.94-30.1 g/L). IgAκ/IgAλ-ratio
was low in 18/20 cases with IgAλ MC (13 had increased
IgAλ; range: 2.01-22.4 g/L), normal in the remaining two.
In both patients with IgA bands without detectable LC,
IgAκ/IgAλ-ratio was normal; 2/5 patients with increased
IgA background had high IgAκ/IgAλ-ratio, with normal κ/λ
FLC ratio. AL amyloidosis was eventually diagnosed in 20
patients; in all, IFE showed complete IgA MC (quantifiable
by densitometry in 12). In 18/20, IgAκ/IgAλ-ratio was
abnormal; in the remaining two, who had IgAλ at IFE,
monoclonal λ FLC were detected by κ/λ ratio. No patients
with IFE polyclonal background had AL.
Conclusions: Hevylite showed good diagnostic sensitivity
(90%) in IgA AL amyloidosis, which can be improved with
combination of FLC measurement. Calculation of IgAκ/
IgAλ ratio and quantification of IgAκ and IgAλ allowed
quantitative estimation of the MC in the majority of AL
amyloidosis patients with IgA components, comparing
favorably with SPEP.
557
P173
EARLY DETECTION OF CD4+CD26-CD38+ SUBSET
IN HODGKIN’S LYMPH NODES
1
1
1
V. Gasparetto , B. Callegari , L. Candiotto , A.
2
1
1
Padoan , N. Toffano , R. Di Gaetano , M.C.
2
1
Sanzari , G. Tagariello
P174
EFFICACIA DI UN SISTEMA MULTIREGOLE
NEL RICONOSCIMENTO DI PATOLOGIE
ONCOEMATOLOGICHE MEDIANTE ESAME
EMOCROMOCITOMETRICO
1
1
1
1
C. Parma , F. Cappellini , G. Limonta , M. Bertona , P.
2
Brambilla
1
U.O. Trasfusionale ed Immunologia, C.Reg. per le
Malattie del Sangue, Osp San Giacomo, Castelfranco
Veneto, ULSS 8 Veneto
2
Dip. di Medicina di Laboratorio, Az Osp. Universitaria,
Padova
1
Introduction: Hodgkin lymphoma (HL) is characterized
by a minority of neoplastic cells-Hodgkin and ReedSternberg cells (HRS)-that express the membrane CD30
and grow in typical microenvironment composed of
reactive elements. The HRS with disturbed cytokine
production appear to regulate their surrounding and for
example attract activated but anergic CD4 T. Studies
have shown that the presence of CD30 and the resulting
cytokine network to inhibit also the expression of the
activation marker CD26 on CD4,contribute to the impaired
immune response observed in HL. We explored with a
simple cytometric test whether the absence of CD26 was
able to differentiate HL from reactive Lymph Node (RLN)
and to use it in HL patient’s follow up.
Methods: Cells suspension from LN (102 HL and 43 RLN)
were analyzed by flow cytometry (FC) using antibodies
such as CD45, and CD3, CD4 for T cells, CD19 for B
cells and marker of activation CD38 than CD26.Data were
analyzed with box plot diagrams and ROC curve.
Results: Compared with RLN, HL showed some
statistically significant differences: reduced CD19+,
increased CD3+ and expanded subset CD4+CD26CD38+. The area under ROC curve was 0,8639.
Comparison between RLN and histotype-differenciated
HL confirm these results, in particular the mixed-cellularity
and scleronodular histotypes. Clinical data show, with the
increase of the stage of HL, an increase of CD3+ cells
while a reduction of CD19+ cells is observed. Peripheral
blood (PB) from HL at diagnosis, compared with a control
group of blood donors, show an increased CD4+CD26CD38+ subset (results not statistically significant due to
the small sample size) that were also back to normal
values in patients reaching complete remission.
Conclusions: These results demonstrate that increased
CD4+CD26-CD38+ in lymph node of HL seems to be a
useful tool to differentiate them from RLN. Data from PB at
diagnosis and following therapy suggest to use this subset
as a possible marker for monitoring HD.
Introduzione: L’esame emocromocitometrico è un valido
supporto nello screening oncoematologico. Sono state
prese in considerazione le neoplasie mieloproliferative
(NM) e la Leucemia Linfatica Cronica (LLC). Le
NM sono malattie clonali della cellula staminale
mieloide compredenti Leucemia Mieloide Cronica (LMC),
Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essenziale (TE)
e Mielofibrosi Idiopatica (MI). La prevalenza delle
NM nella popolazione è di 0.02%. La LLC è una
patologia caratterizzata dalla proliferazione clonale di
linfociti B piccoli e maturi, con una prevalenza dello
0,04% nella popolazione generale. Nel laboratorio
analisi dell’ospedale di Desio sono attualmente in uso
specifiche regole di validazione che contribuiscono al
riconoscimento delle patologie oncoematologiche.
Scopo: Valutazione dell’efficacia delle regole di
validazione nel riconoscimento delle patologie
oncoematologiche
Materiali e metodi: Mediante il sistema di validazione
Sysmex SIS sono state impostate regole atte al
riconoscimento delle NM ed LLC. Le regole WBC 20, 25,
28, che prendono in considerazione alterazioni della linea
mieloide correlate a dati anagrafici del paziente, sono
specifiche per il riconoscimento delle NM. La regola WBC
13, che blocca i campioni di pazienti con più di 12 anni,
558
Servizio Universitario di Medicina di Laboratorio
Azienda ospedaliera di Desio e Vimercate, Desio (MB)
2
DIMS, Dipartimento di Medicina Sperimentale,
Università degli studi di Milano – Bicocca, Monza (MB)
3
aventi un valore di linfociti superiore a 5000 /mm , è
specifica per la LLC.
Risultati: Le regole impostate per le NM hanno sensibilità
(Sn.) del 41% e specificità (Sp.) del 98%. La prevalenza
della malattia è di 0,02%, la probabilità post test in caso di
test positivo (PPT+) sale allo 0,6%, la probabilità post test
in caso di test negativo (PPT-) scende allo 0.0007%. Per
la LLC la regola mostra una Sn. dell’82% ed una Sp. del
99%. La prevalenza della LLC è di 0,04%, la PPT+ sale
al 2,6%, mentre la PPT- scende allo 0.0006%.
Conclusioni: Le regole di validazione introdotte per
identificare le patologie oncoematologiche si sono
rivelate utili in quanto le PPT per entrambe le
patologie oncoematologiche considerate si discostano
sensibilmente dalle rispettive “probabilità pre test”.
P175
EVALUATION OF THE DIAGNOSTIC PERFORMANCE
OF THE SYSMEX XE-2100 AND OF THE ADVIA
120 AUTOMATED HEMATOLOGY ANALYZERS IN
TERMS OF MORPHOLOGIC FLAGS
P176
EVALUATION OF THE RETICULOCYTE COUNTING
BY THE MINDRAY BC 6800 AUTOMATED
HEMATOLOGY ANALYSER: COMPARISON
WITH ABX PENTRA 120, COULTER LH750 AND
MICROSCOPY
S. Colarossi, N. Mangialetto, G. Palumbo, S. Capalbo
1
U.O.C. Ematologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria
Ospedali Riuniti, Foggia
Introduction: Automated hematology analyzers produce
morphologic flags when processing samples with
abnormal cells.
Methods: The aim of this study was to evaluate the
diagnostic performance of two hematology analyzers,
ADVIA 120 (Bayer) and Sysmex XE-2100 (Dasit), in
terms of morphologic flags, in comparison with manual
microscopy review (NCCLS H20-A). The morphologic
flags of each analyzer were divided into four categories:
Blasts, Immature Granulocytes and/or Left Shift, Atypical
Lymphocytes and Nucleated RBCs. The suspect
message Abn Lympho/L_Blasts? is only created by the
XE-2100. One hundred blood samples analyzed in our
routine haematology laboratory were included in this
study.
Results: To compare the results from XE-2100,
ADVIA-120 and the reference procedure, truth tables
were constructed. The predictive value of instrument
flagging for the presence of abnormal WBCs and of
nucleated RBCs after clinical review was expressed by the
following parameters: sensitivity, specificity, efficiency.
Nine of 100 blood films showed ≥1% blasts on microscopic
examination; the rates of false negative (FN) results
were 2% for the ADVIA 120 whereas the sensitivity of
blast flag was 100% on the XE-2100. Nine samples
contained ≥1% immature granulocyte; only one sample
was missed by ADVIA 120 flagging. Three blood smears
showed ≥1% atypical lymphocytes; the rate of FN results
was 1% for both analyzers. Seven samples contained
NRBCs and were flagged by both instruments. The
specificity of ADVIA 120 were 90%, 83%, 77%, 91%, in
terms of blasts, IG and/or LS, Atypical Lympho, NRBCs,
respectively. The false positive (FP) rates produced by the
automated analyzer XE-2100 were 4%, 7%, 16%, 4%, in
terms of blasts, IG and/or LS, Atypical Lympho, NRBCs,
respectively. The Abn Lympho/L_Blasts flag occurred
in 22 of 100 samples; 18 samples contained abnormal
lymphocytes or lymphoid blasts; two positive samples
were missed by XE-2100 flagging.
Conclusions: The XE-2100 represents improvement in
terms of specificity and sensitivity for the detection of
abnormal WBCs and of NRBCs.
Buttarello
M.
GdSE-SIMeL.
Risultati
della
sperimentazione
multistrumentale
in
ematologia
automatizzata: lo stato dell’arte. Riv Med Lab-JLM
2004;5:136-41.
1
1
R. Grillone , M. Buonanno , A. Chiefalo , M.
1
1
1
1
Conticelli , A. Contina , A.M. Riccio , C. Saglioccolo , A.
1
1
2
Scognamiglio , F. Tagliaferri , E. Grimaldi , F.
2
1
Scopacasa , B. Dente
1
U.O.C. di Medicina di Laboratorio, Ospedale San Paolo
ASL NA1 centro, Napoli
2
Università degli Studi di Napoli Federico II
The Mindray BC 6800 analyzer (Mindray Bio-Medical
Electronics Co) is a new developed automated
hematology analyser with high throughput rate. It provides
33 reportable and 14 research parameters of leukocyte,
red and platelet series, a differential leukocyte count
(DLC), reticulocytes and erythroblast (NRBC). The
technologies used for the DLC include fluorescence, laser
light scatter (forward and side scatter) and analyzing
a 3 dimensional scattergram (“SF Cube” technology).
For reticulocyte analysis the analyser uses a cyanine
dye to stain the reticulocye’s RNA, and fluorescence
intensity, scatter light intensity at two angles and cell size
are registered. The aim of this study was to evaluate
the reticulocyte counting from the Mindray BC6800 in
comparison with those obtained from the ABX Pentra
DX120 (Horiba ABX), Beckman Coulter LH750 and
microscopic count used as reference. The obtained
results demonstrated no carryover. Precision was good
with low coefficients of variation (CV= 2.61%). Although
the analysis of results evaluated with Wilcoxon test
revealed significant differences between BC6800 and the
other methods (p<0.05), the Spearman rank correlation
coefficients revealed that BC6800 gave reticulocyte count
results that correlate well with those obtained by manual
method (rs = 0.963); a slightly lower correlation was
observed between BC6800 and ABX Pentra as well
as between BC6800 and LH750 (rs = 0.863 and rs =
0.903 respectively). BC 6800 results compared very well
with those obtained by manual method and these data
were confirmed by Bland-Altman analysis: no significant
bias (mean of difference: -0.06) was observed between
BC6800 and manual method. Slight difference between
BC6800 and both ABX Pentra 120 and Coulter LH750
(mean of difference: -0.15 and -0.147 respectively) was
found and a slight bias was revealed by Bland-Altman
analysis. In conclusion we have found that for reticulocyte
counting, the Mindray BC6800 provides accurate and
reliable results.
Piva E, Brugnara C, Chiandetti L, et al. Automated
reticulocyte counting: state of the art and clinical
applications in the evaluation of erythropoiesis. Clin Chem
Lab Med 2010;48:1369–80.
559
P177
IMPATTO DELL’IMPLEMENTAZIONE DELLE
REGOLE DI VALIDAZIONE DELL’ESAME
EMOCROMOCITOMETRICO MEDIANTE IL SISTEMA
SYSMEX SIS NEL LABORATORIO ANALISI
DELL’OSPEDALE DI DESIO
1
1
1
1
Servizio Universitario di Medicina di Laboratorio,
Azienda ospedaliera di Desio e Vimercate, Desio (MB)
2
DIMS, Dipartimento di Medicina Sperimentale,
Università degli studi di Milano – Bicocca, Monza (MB)
Introduzione: L’esame emocromocitometrico è, per
semplicità di esecuzione e capacità di fornire informazioni,
uno degli esami più richiesti in laboratorio analisi.
Il processo di validazione dei dati utilizza algoritmi
complessi, composti da regole fondate su dati
analitici, allarmi strumentali ed informazioni sui pazienti.
L’applicazione degli algoritmi permette la validazione
automatica dei campioni che non hanno violato le regole
e l’identificazione di quelli che, bloccati dalla violazione
di almeno una regola, necessitano di revisione. Presso
il laboratorio analisi dell’ospedale di Desio è in uso un
set di regole impostate mediante il sistema di validazione
Sysmex SIS.
Scopo: Valutazione dell’impatto delle regole di validazione
in uso sull’attività di laboratorio.
Materiali e metodi: Le analisi sono state eseguite sul
contaglobuli Sysmex XE 2100. Nel periodo compreso tra
Marzo ed Agosto 2012 sono stati raccolti i dati relativi
agli esami emocromocitometrici sottoposti alle regole di
validazione impostate a Gennaio 2012.
Risultati: Dei 69964 campioni (media giornaliera = 578
campioni), l’8,4% ha richiesto una revisione: il 4,5% da
parte del personale medico, il 3,9% da parte di quello
tecnico. Dei campioni rivisitati dal personale tecnico il 34%
è stato ripetuto per allarmi relativi alla conta differenziale
dei globuli bianchi, il 39% per allarmi relativi ai parametri
emometrici e il 54% per allarmi riguardanti le piastrine.
Dei campioni revisionati dal personale medico il 76% ha
richiesto la valutazione della formula leucocitaria, l’9% la
revisione per sospetta presenza di schistociti e il 20%
per la ricerca di aggregati piastrinici, con una media
giornaliera di 26 vetrini.
Conclusioni: Il sistema di regole di auto validazione,
introdotto da Gennaio 2012 con il nuovo software, ha
permesso una riduzione del numero degli emocromi da
rivisitare pur mantenendo la stessa efficienza di screening
del passato e l’integrazione del lavoro del personale
tecnico e medico nel rispetto delle professionalità
specifiche.
G. Introcaso, A. Cavallero, M. Raggi, T. D'errico, A.
Ratto, D. Riggio, M. Rossi
1
C. Parma , F. Cappellini , G. Limonta , S. Signorini , P.
2
Brambilla
560
P178
PERFORMANCE DELL'EMOCITOMETRO SYSMEX
XE 2100 NELLA RILEVAZIONE DEGLI AGGREGATI
PIASTRINICI
U.O. di Medicina di Laboratorio, Centro Cardiologico
''Monzino'', Milano
Introduzione: I conteggi piastrinici effettuati con gli attuali
sistemi analitici possono essere inaccurati e gli aggregati
piastrinici causare conteggi sottostimati. La validazione
tramite regole automatizzate di rilevazione aggregati è
adottata nella routine di laboratorio. Scopo del presente
studio è verificare le performance analitiche per la
rilevazione degli aggregati piastrinici tramite software
Dasit management system (DMS).
Materiali e metodi: Sono stati estratti dal DMS i risultati
di 414 campioni positivi per la regola di ricerca degli
aggregati piastrinici (PLT 03) analizzati su Sysmex XE
2100 in un periodo di due anni. Tale regola valuta la
presenza di cluster caratteristici per gli aggregati almeno
in uno dei seguenti canali: canale DIFF, canale IMI, canale
NRBC con conteggio piastrinico inferiore a 130(x10exp9/
L). Tutti i campioni sono stati analizzati secondo gli
emogrammi completi compreso lo scattergram del canale
WBC/BASO. Sono stati inoltre eseguiti gli strisci ematici
per la ricerca degli aggregati piastrinici su vetrino.
Abbiamo valutato la sensibilità della regola (PLT 03) =
Vp/(Vp+Fp) in riferimento a due gruppi di pazienti: (a)
cure intensive/postoperatorie (N= 261) e (b) degenza/
ambulatoriali (N= 153).
Risultati: La regola (PLT 03) ha dimostrato una sensibilità
del 9.8% per il gruppo (a) e dell’86.6% per il gruppo
(b). Tale differenza è dovuta alle caratteristiche dei
campioni del gruppo (a): alti e patologici conteggi WBC
con frammenti cellulari che causano un elevato numero
di falsi positivi Fp=138, rilevati nel canale DIFF. La
comparazione dei dati dei canali Diff e IMI ha mostrato
che lo scattergram del canale IMI è il più efficace
nella rilevazione degli aggregati PLT, come confermato
allo striscio ematico periferico, con sensibilità analitica
uguale al 100% (N=111). Abbiamo trovato inoltre come
interferenti filamenti di fibrina e frammenti tissutali(N= 98).
Conclusioni: La regola (PLT 03) del DMS è utile per
lo screening dei campioni ematologici. Richiede tuttavia
implementazione tramite modifica della regola su canale
IMI e gating automatizzato sui cluster specifici per gli
aggregati piastrinici.
Wu W, Guo Y, Zhang L, et al. Clinical utility of automated
platelet clump count in the screening for ethylene diamine
tetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia.
Chin Med J 2011;124:3353-7.
P179
PERFORMANCE EVALUATION OF DM BODY FLUID
SOFTWARE MODULE USING THE AUTOMATED
DIGITAL CELL MORPHOLOGY ANALYZER
CELLAVISION DM96
P180
PRIMA VALUTAZIONE DEL NUOVO STRUMENTO DI
ELETTROFORESI CAPILLARE CAPILLARYS II FLEX
PIERCING (SEBIA) PER LO SCREENING DELLE
EMOGLOBINOPATIE SU SANGUE DI CORDONE
OMBELICALE
B. Peruzzi, R. Caporale, A.M.G. Gelli, A. Fanelli
1
Laboratorio Generale, AOU-Careggi, Firenze
Background: Differential count and morphological
analysis of nucleated cells in body fluids (BF) (eg,
cerebrospinal (CSF), ascitic (AF), pleural (PlF), pericardic
(PeF), synovial (SF) is very useful to the clinician. We
evaluate the use of the Sysmex XE-5000 hematology
analyzer in combination with the CellaVision DM96,
an automated digital cell morphology system with BF
application, for cell differential count in BF.
Methods: A total of 40 body fluids samples (10 CSF,
12 AF, 16 PlF, 1 SF, 1 PeF) were analysed with the
XE-5000 to obtain cell count and WBC differentiation
into Mononuclear (MN) and Polymorphonuclear (PMN)
cells. A cytospin preparation (Cytofuge2, Iris Int.) were
performed using 250-300 ul of a cells suspension
(20 cells /ul) to obtain a cell pellet of approx. 5000
cells; slides were left to air-dry and stained with the
Wright-Giemsa method. Slides were analyzed using the
DM96. PMN% and MN% reported by the XE-5000
were compared with PMN% (Neutr.+Eos.) and MN%
(Lymph.+Mono/Macroph.) obtained at the DM96 after
cells re-classification. Statistical analysis was performed
by Pearson correlation and by Bland-Altman plot. % of
Other cells classified with the DM96 (eg. Mesothelial,
Tumor cells) were compared by Spearman correlation
with % HF (High Fluorescence cells) reported by the
XE-5000.
Results: The comparison between XE-5000 and DM96
show very good correlation for PMN% (r=0,97; p<0,0001)
and MN% (r=0,96; p<0,0001). The Bland-Altman plot
(mean bias; 95% IC) shows no significant differences
for MN% (-1,37; -4,34 to 1,60; p=0,36). A slight positive
bias of the XE-5000 (3,71; 0,87 to 6,54; p=0,032)
was observed for low PMN counts. HF-BF% shows a
significant correlation with Other cells (r=0,50; p=0,0011).
Conclusions: From our experience the use of the XE-5000
in combination with the DM96 can significantly improve
automation and standardization in the diagnostic workup of body fluids analysis. Furthermore, DM96 represents
a valuable tool to increase diagnostic accuracy, overall
quality in morphological analysis, documentation of
analysis results (digital archiving) and of the identification
of the responsibility of slide interpretation.
1
1
2
G. Avveduto , M. Brogi , A. Caldini , S. Urbani , A.
1
1
1
1
Terreni , T. Biagioli , G. Grandi , A. Moscarella , V.
1
1
2
1
Ercoli , L. Reggiani , M. Santosuosso , G. Messeri
1
Firenze
2
Banca del Cordone Ombelicale, Dipartimento
Biomedicina, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi,
Firenze
Il sangue cordonale (CB), ricco di cellule staminali
ematopoietiche, viene impiegato da oltre 20 anni a
scopo di trapianto allogenico in malattie ematologiche,
immunologiche e metaboliche. Secondo gli Standard
Internazionali NetCord FACT (IV ed, 2010), l’idoneità al
trapianto di una sacca di CB, è garantita da uno studio
dell’assetto emoglobinico che escluda la presenza delle
più comuni Hb varianti (S, C, D e E) e di talassemia major.
Lo screening, da anni impiegato in paesi con consolidata
realtà multietnica, è diventato di crescente rilevanza
clinica in Italia. Sono state valutate le performances
dello strumento Capillarys 2 Flex Piercing, (SEBIA)
confrontando i risultati ottenuti (metodo Screening Cord
Blood) con quelli ottenuti in HPLC (Dual Kit, Variant
II, Biorad), in termini di imprecisione, correlazione e
sensibilità di rivelazione di HbS. L’imprecisione è stata
valutata ripetendo per 6 giorni 5 aliquote di CB conservate
a -80°C (protocollo NCCLS EP5-A2), ottenendo un CVtot
(HbA) di 1.56% in HPLC e 1.30% in CE. La presenza
di talassemia viene valutata dalla % di HbA, in quanto
la sintesi di HbA2 non è ancora sufficiente per la sua
quantificazione. Sono stati quindi analizzati in parallelo
50 campioni di CB: l’analisi statistica dei risultati ottenuti
per HbA (regressione di Deming) evidenzia un coefficiente
2
angolare di 1.17 ed un’intercetta di 1.29 con un r =
0.976. L’analisi di Bland-Altman mostra una differenza
media di +4.42%, tale differenza sistematica è dovuta alla
mancanza di calibrazione di HbA, rendendo necessario
stabilire intervalli di riferimento metodo specifici. La
rivelazione di varianti emoglobiniche in eterozigosi su CB
richiede una buona capacità separativa e una notevole
sensibilità dato che la sintesi delle catene beta è ancora
scarsa (Hb F 80% circa). Un campione di sangue di
adulto con HbS in omozigosi (privo di HbA) è stato diluito
serialmente con CB: la sensibilità di rilevazione di HbS
è risultata dello 0,2% in HPLC e dello 0.8% in CE. Le
prove effettuate su HbS hanno dimostrato un’eccellente
sensibilità della CE nella rivelazione della più comune tra
le varianti emoglobiniche. Sebbene questi dati debbano
essere confermati su un numero più ampio di campioni e
per le altre emoglobine varianti comuni, il nuovo strumento
SEBIA sembra essere adeguato per lo screening su CB.
561
P181
SMUDGE CELLS IDENTIFICATION IN CLL PATIENTS
USING AUTOMATED MICROSCOPY CELLAVISION
DM96
P182
STUDIO PRELIMINARE DI CORRELABILITA’ TRA
DUE METODICHE PER LA DETERMINAZIONE DELLE
FRAZIONI DI HbA2 E HbF
B. Peruzzi, A. Fanelli, R. Caporale, A.M.G. Gelli
A. Amato, D. Zei, D. Ponzini, P. Di Biagio, E. Melis, O.
Sarra, D. Gianni
Background: Blood films from CLL patients show
characteristic smudge cells (or basket cells or
Gumprecht's shadows) were initially considered as
artefact of slide preparation; their formation were
later demonstrated to be related to the content of
cytoscheletal proteins present in CLL cells. Recent
literature demonstrate smudge cells index (SCI) as an
independent predictor of overall CLL patients survival.
Introduction of virtual microscopy have been demonstrate
to offers advantages to blood smear examination: we
evaluate the performance of the CellaVision DM96, an
automated digital cell morphology analyzer, to enable
smudge cells identification in previously untreated CLL
patients.
Methods: 33 samples from patients suspected to have
CLL (multicolour flow cytometry with a panel of antibodies
including CD19, CD20, CD22, CD5, CD23, CD38, CD79b,
FMC-7, CD200, sKappa/sLambda light chain and CD45
was used to confirmer the diagnosis) and 67 normal donor
samples were obtained from the routine workload. WBC
analysis of all samples was assessed with the Sysmex
XE-2100 cell counter. All blood smears were prepared
using the automated slide maker and stainer Sysmex
SP-1000 and finally analyzed using DM96 system set to
analyse 200 WBC.
Results: We calculated SCI on blood smear of all the
samples using the ratio between smudge cells/smudge
cells + intact lymphocytes. The SCI in CLL patients is not
correlated to sex and age and there was no correlation
of SCI with absolute lymphocyte count (r= 0,29; p-value=
0,1076) or with lymphocyte percentage (r=0,05; p-value=
0,7789). The median SCI was significantly elevated in CLL
patients (median of 33,3%; range: 9,3-69,1 %) compared
to normal donor (median of 11,8% range: 3,8-29,4%) with
a p-value <0,0001. Moreover SCI was significantly lower
in CD38+ patients (median of 17,3%; range: 10,3-33,3%)
when compared with CD38- patients (median of 48,8%;
range from 9,3% to 69,1%) with a p-value=0,0056.
Conclusions: Our investigation indicates that DM96
Digital Morphology Analyzer allows to obtain a good
agreement between our results and the study published
by Nowakowski et al (JCO 2009;27;11 1844-1849) in the
estimation of SCI giving the possibility to improve quality
assurance, transferability of results, and traceability of the
method.
562
A.N.M.I. Onlus - Centro Studi Microcitemie Roma, Italia
Il Centro Studi Microcitemie di Roma si occupa da
oltre 40 anni di prevenzione e diagnostica di talassemie
ed emoglobinopatie. La determinazione delle frazioni
di HbA2 e HbF, parametri molto significativi ai fini
diagnostici, viene effettuata quotidianamente su pazienti
inviati al nostro centro utilizzando prevalentemente una
strumentazione in HPLC. In questo studio preliminare,
effettuato su un ristretto gruppo di pazienti, abbiamo
voluto confrontare i risultati ottenuti per i valori di HbA2
e HbF con quelli ottenuti utilizzando uno strumento
di nuova commercializzazione la cui metodica si basa
sull’elettroforesi capillare al fine di valutarne l’accuratezza.
Questa stessa metodica è stata inoltre utilizzata per
valutare la capacità e la precisione nel riconoscere
e quantificare frazioni emoglobiniche anomale quando
presenti. Un pool di 100 campioni di sangue
intero prelevati random da pazienti dell’ambulatorio,
preliminarmente analizzati come di routine in HPLC
con strumentazione Variant II (Bio Rad Laboratories),
sono stati successivamente esaminati in elettroforesi
capillare utilizzando MINICAP Flex Piercing (Sebia). I
risultati ottenuti sono stati messi a confronto utilizzando
il coefficiente di correlazione di Pearson. Non avendo
riscontrato la presenza di varianti emoglobiniche nel pool
di pazienti considerato, in un momento successivo sono
stati accuratamente selezionati alcuni campioni in cui
l’HPLC aveva già rilevato tali emoglobine. L’analisi dei
risultati ottenuti con le due metodiche ha evidenziato
un coefficiente di correlazione di 0,987 per l’HbA2
e 0,980 per l’HbF. Questi valori sono indice di una
correlazione molto forte. I cromatogrammi ottenuti dalle
due metodiche da campioni con varianti emoglobiniche
hanno evidenziato entrambe le diverse frazioni presenti
mostrando una buona corrispondenza sia a livello
qualitativo che quantitativo. In questo studio preliminare si
può quindi ritrovare una sostanziale sovrapponibilità tra i
risultati acquisiti con le due diverse strumentazioni.
P183
VALUTAZIONE NRBC IN SOGGETTI TALASSEMICI
CON I SISTEMI SYSMEX XE-2100 E ADVIA-2120I
1
1
1
S. Buoro , M. Vavassori , P. Gherardi , R.
1
1
1
1
Gustinetti , C. Saleri , E. Lochis , P. Dominoni , A.
2
2
2
1
Falanga , M. Marchetti , A. Trinchera , A. Crippa
P184
WHITE BLOOD CELL ANALYSIS (WBC
DIFFERENTIAL COUNT) IN BODY FLUIDS:
COMPARISON BETWEEN THE SYSMEX XE5000 AND
MANUAL FLOW CYTOMETRY
B. Peruzzi, A.M.G. Gelli, A. Fanelli , R. Caporale
1
Lab. Analisi Chimico Cliniche, Az. Osp. Ospedali Riuniti
Bergamo
2
Servizio di Immunoematologia e Medicina
Trasfusionale, Az. Osp. Ospedali Riuniti Bergamo
Scopo: Nel sangue periferico (SP) di pazienti talassemici
(TAL) è nota la presenza di eritroblasti (NRBC) e questa
sembra essere correlata ad un’eritropoiesi inefficace.
Nella moderna organizzazione di Laboratorio il conteggio
NRBC in microscopia ottica (MO) su striscio di SP
è di scarsa praticabilità per i tempi richiesti e le
risorse dedicate. Gli analizzatori ematologici di ultima
generazione sono dotati di diversi metodi di conta degli
NRBC caratterizzati da rapidità e precisione. Obiettivo di
questo studio è la comparazione del conteggio NRBC
fornito da Sysmex XE-2100 e ADVIA-2120i verso MO in
tre categorie di pazienti: ß-TAL, Trait-TAL e Controlli.
Metodi: 49 campioni di SP raccolto in EDTA (29 ß-TAL, 7
Trait-TAL, 13 Controlli) sono stati analizzati con XE-2100
e ADVIA2120i. Il conteggio NRBC è stato confrontato
con il metodo di riferimento (conteggio manuale in
MO effettuato da due operatori secondo LG H20-A2).
La concordanza tra la media dei conteggi manuali e
l’automazione è stata valutata con regressione lineare
(coefficiente r) e Bias di Bland-Altman, l’accuratezza
diagnostica con analisi curve ROC.
Risultati: Il confronto rispetto al conteggio NRBC in MO
2
ha fornito i seguenti risultati: per XE-2100 R =0.994,
Bias –2.61(IC95% da –4.88 a –0.34), Concordanza
98%, Sensibilità (SE) e Valore Predittivo Negativo (VPN)
100%, Specificità (SP) 96.2%, Valore Predittivo Positivo
VPP 95.8% a un cut-off NRBC≥0,9%. Per ADVIA 2120i
2
R ==0.949, Bias –5.80 (IC95% da –9.83 a –2.33),
Concordanza 73.5%, SE 43.5%, VPN 66.7%, SP e VPP
entrambi del 100% a un cut-off NRBC≥2%.
Conclusioni: I risultati ottenuti su questa popolazione
critica di soggetti indicano performance diagnostiche
superiori di XE-2100 con il canale di conteggio degli
NRBC attivato rispetto ad ADVIA-2120i. L’impiego di
ADVIA 2120i su queste popolazioni selezionate implica
la necessaria costruzione di algoritimi diagnostici che
prevedano opportuni reflex test, sfruttando i possibili
parametri di ricerca forniti dallo strumento, al fine di
migliorarne le perfomance analitiche e diagnostiche.
Danise P, Maconi M, Barrella F, et. al. Evaluation
of nucleated red blood cells in the peripheral blood
of hematological diseases. Clin Chem Lab Med
2011;50:357-60.
Background: Accurate and rapid analysis of body fluids
(BFs) are important for the diagnosis and treatment of
several disease. Manual microscopy is the “gold standard”
for quantification and differentiation of WBC in BF but this
method is time-consuming and has a high imprecision.
Aim of this study was to evaluate the Sysmex XE5000
hematology analyzer in WBC differential on BFs obtained
from routine workload.
Methods: WBC differential and count cells of a total of 43
BFs (5 cerebrospinal, 23 ascitic, 15 pleural fluids) were
performed on the XE5000 using the dedicated BF mode.
Flow cytometry (CFM) analysis of all samples was assess
in a FACS Canto II using moAb CD45 FITC; the analysis
was performed using a gate strategy of a combination of
side scatter (SSC) vs CD45 expression to differentiated
granulocytes (PMN) from monocytes/macrophages and
lymphocytes (MN). Debris were excluded by eliminating
all the events that were smaller than lymphocytes. We
compared:
1. % MN and % PMN XE5000 vs % MN and % PMN CFM
(SSC vs CD45);
2. %WBC XE5000 vs %WBC CFM (CD45+);
3. %HF_TC XE5000 vs % NO WBC CFM (CD45-).
Statistical analysis was performed by Pearson correlation
and by Bland-Altman plot.
Results: The comparison between XE5000 and CFM
show very good correlation for:
1. PMN% (r=0,90; p<0,0001); mean bias -2,30 (95% IC
from -5,02 to 0,41; p-value=0,0944);
2. MN% (r=0,91; p<0,0001); mean bias 1,77 (95% IC from
-0,81 to 4,35; p-value=0,1741);
3. WBC% XE vs %WBC CFM (CD45+cells): r=0,89; p
value <0,0001; mean bias -1,25 (95% IC from -2,73 to
0,23; p-value=0,0961);
4. %HF_TC XE vs % NO WBC CFM (CD45- cells): r=0,89;
p-value<0,0001; mean bias 1,25 (95% IC from -0,23 to
2,73; p-value=0,0961).
All those analysis shown no significant differences.
Conclusions: Our works demonstrate that the BF mode
of the Sysmex XE5000 is a suitable tool for a rapid
and reliable screening of WBC differential counts in BF
analysis, providing also a good discrimination between
WBC and non WBC cells.
563
P187
ELIA IMMUNOCAP AVIDITY DETERMINATION OF
IGG ANTI BETA2-GLYCOPROTEIN I ANTIBODIES IN
PATIENTS WITH AND WITHOUT ANTIPHOSHOLIPID
SYNDROME
1
1
2
3
B. Montaruli , C. Marchese , S. Stella , A. Kuzenko , A.
2
3
2
1
Vaccarino , M.T. Bertero , M. Bazzan , M. Migliardi
1
Laboratory Analysis, AO Ordine Mauriziano - Turin
CMID-University of Turin, Torino Nord Emergenza San
Giovanni Bosco Hospital
3
Immunology Department AO Ordine Mauriziano - Turin
P188
EVALUATION OF A NEW QUANTITATIVE HIGHLY
SENSITIVE LATEX D-DIMER (Dd) ASSAY IN
PATIENTS WITH CLINICALLY SUSPECTED DEEP
VEIN THROMBOSIS (DVT)
C. Legnani, M. Cini, M. Sartori, B. Cosmi, G. Palareti
Dept. Angiology and Blood Coagulation “Marino
Golinelli”, University Hospital S. Orsola-Malpighi,
Bologna, Italy
2
Background: Anti-B2-glycoprotein I antibodies (aB2-GPI),
one of the subgroups of antiphospholipid antibodies
(aPL), present a huge heterogeneity due to epictopic
specificity, involvement in pathogenesis and avidity. The
objective of our study was to evaluate avidity of IgG
aB2-GPI in patients with and without Antiphospholipid
Syndrome (APS) by using EliA ImmunoCAP chaotropic
determination.
Materials and methods: 28 patients with primary and/
or secondary APS (17 out of 28) and with autoimmune
or infection diseases (11 out of 28) were studied by
evaluating LA, anticardiolipin (aCL) EliA immunoassay,
aB2-GPI EliA (ImmunnoCAP) and ELISA (Varelisa)
immunoassays and IgG aB2-GPI chaotropic ELISA
(Varelisa) and EliA (ImmunoCAP) assays.
Results: Good agreement was found between ELISA
and EliA chaotropic avidity assays (k = 0.88). 7 and 21
patients had respectively high and low EliA chaotropic
avidity. All the patients with high avidity had APS while
no subjects with high avidity were found in autoimmune/
infectious patients group (p <0.05). The most common
clinical APS feature among patients with high avidity
aB2-GPI was vascular thrombosis (6 vascular thrombosis
and 1 pregnancy morbidity, p = 0.31), in all cases
due to venous thrombosis (6 venous thrombosis and 1
pregnancy morbidity, p = 0.36).
Conclusions: EliA chaothropic is as suitable as ELISA
assay for the determination of aB2-GPI avidity but fully
automated and easier for basic/routine laboratories. In our
preliminary study high aB2-GPI avidity was associated
with clinical features of the syndrome (mainly venous
thrombosis) while in patients with autoimmune/infection
diseases low avidity prevailed. Determination of aB2-GPI
avidity should be considered for clinical differentiation of
patients with aB2-GPI.
Cucnik S, Kveder T, Artenjak A, et al. Avidity of anti-ß2glycoprotein I antibodies in patients with antiphospholipid
syndrome. Lupus 2012;21:764-5.
Dd testing is widely used in conjunction with clinical
pretest probability (PTP) for venous thromboembolism
(VTE) exclusion. In patients presenting negative Dd and
low/intermediate PTP, VTE can be excluded without
performing imaging tests. However, each Dd assay should
be validated in prospective outcome studies before clinical
use. We report on the evaluation of a new, automated,
latex turbidimetric immunoassay for Dd measurement, the
Sclavo Auto D-Dimero (Sclavo Diagnostics Int.), provided
by Dasit. Consecutive patients referred to our outpatient
clinic for suspected leg DVT were included. The exclusion
criteria were: previous DVT event, symptoms lasting
> 15 days, anticoagulant treatments already underway
at presentation, pregnancy. Patients were classified as
DVT positive/negative according to the results of the
following diagnostic work-up: PTP, Dd and compression
ultrasound (CUS) to assess proximal DVT, to be repeated
after 5-7 days in patients with negative initial CUS and
high PTP or altered Dd. Negative patients received a
phone call after 3 months. The PTP (high/moderate/low)
was evaluated using the Wells score. Dd levels were
measured by the STA Liatest (Diagnostica Stago). Plasma
aliquots were frozen for further analysis. The new Dd
assay was evaluated on two analyzers (Sysmex CA-7000
and Sysmex CS-2100, provided by Dasit). Only patients
with low/intermediate PTP were included. Plasma of 300
patients was tested. The DVT prevalence was 11.3%.
The cut-off level providing the highest sensitivity was 200
ng/mL. Since no false negative patients were detected,
the sensitivity and negative predictive (NPV) values were
100% [sensitivity = CA-7000: 100% (95%CI: 90-100),
CS-2100: 100% (95%CI: 90-100); NPV = CA-7000: 100%
(95%CI: 98-100), CS-2100: 100% (95%CI: 98-100)].
Specificity was 65% (95%CI: 59-71) and 69% (95%CI:
63-75) for CA-7000 and CS-2100, respectively. The
reproducibility of the assay was good being the total CVs
< 10% for Dd level around the cut-off value. In conclusion,
the Sclavo Auto D-Dimero assay proved to be accurate
when used for DVT diagnostic work-up in outpatients.
Based on 100% sensitivity and NPV and lower limit of the
95% CI higher than 90% and 95%, respectively, it can be
used as a stand-alone test in patients with low/moderate
PTP.
565
P189
LMWH ANTI XA ACTIVITY IN SELECTED
POPULATIONS
P190
VALUTAZIONE DI UN NUOVO APPARECCHIO
AUTOMATICO PER LA COAGULAZIONE, COAG30
S. Testa, O. Paoletti, A. Zimmermann , L. Bassi, E.
Cancellieri, A. Cogrossi, S. Zambelli
R. Canonico, D. Ercolini, A. D'Antonio, C. Alone, E.
Paone, L. Atripaldi
Haemostasis and thrombosis center- clinical pathology
division - Azienda Istituti Ospitalieri - 26100 Cremona
Laboratorio di Analisi Ospedale D. Cotugno, Napoli
Background: Anti-Xa activity (aXa) can be used as
biological marker of LMWH, but aXa routine monitoring is
not recommended. Anyhow, anti-Xa monitoring could be
indicated in selected conditions.
Aim: Describe the incidence of aXa levels out of range,
both in prophylaxis and in therapeutic regimen, in special
populations (pregnancy, renal disease, over/under weight
and in elderly/critical patients), treated with enoxaparin for
at least two weeks.
Material and methods: We retrospectively analyzed data
collected during 2011. 373 aXa activity were performed on
patients treated with enoxaparin at standard or adjusted
dose. 252 determinations were on patients treated with
therapeutic and 121 with prophylactic regimen. Blood
samples were collected after 4 hours from the last LMWH
injection, in patient treated at least from 2 days. AXa was
measured by Stago Rotachrom chromogenic assay on
STA-R .
Results: Out of range aXa levels were 38% and 34% of the
total therapeutic and prophylaxys regimen, respectively.
We found a reduction in out of range in population treated
with adjusted doses in comparison with standard regimen.
Conclusion: Out of range aXa levels are frequently
observed both in prophylaxis and in therapeutic regimen in
special patient populations. AXa could guide LMWH dose
adjustment to improve the maintenance of prophylaxis/
therapeutic levels, avoiding dangerous out of range.
566
Lo scopo del lavoro è quello di valutare nel nostro
Laboratorio le performances dell’apparecchio automatico
Coag30 per coagulazione della Medical Systems prodotto
dalla TND Elettronica su progetto e collaborazione
esperta della ICD&Partners. La valutazione della qualità
analitica di questo strumento ha previsto la correlazione
con il nostro apparecchio ACL Advanced ed utilizzo di due
tromboplastine Recombiplastin lotto EO315307 ISI 0,91
della IL e Thromboplastin Li Lotto 10929288 ISI 1.12 della
Helena utilizzate sugli apparecchi ACL n 05121348 della
IL e Coag30 n 10019 della Medical Systems mantenendo
medesime caratteristiche di lavoro valutando ripetibilità
DV CV tempo di decadimento della Tromboplastina.
Su entrambi gli apparecchi è stato fatto MNPT da
plasmi freschi normali, le calibrazioni sono state fatte sia
dal MNPT che da plasmi riferimento esprimendo tempi
concentrazioni e INR in base all’ISI delle tromboplastine
sopra indicate. La curva di calibrazione eseguita sulla
macchina ACL Advanced IL ottenuta con con la
Tromboplastina Helena rispetto a quella ottenuta con
Ricombiplastin IL risulta meno dolce, troppo ripida e non
permette anche su valori percentuali alti differenze di
tempi significative tra varie concentrazioni determinando
un errore sulla ripetibilità e sul calcolo dell'INR. La
calibrazione con il SARP Plasma di riferimento Helena
eseguita con Thomboplastin Helena ha dato risultati
analoghi a quelli ottenuti con MNPT dei plasmi freschi.
Con i plasmi freschi è stato preparato un pool
congelato analizzato per 20 giorni 10 volte al giorno
sia sull'apparecchio Coag che su IL. Quando è stata
utilizzata il Ricombiplastin entrambe le macchine si sono
comportate in modo identico mostrando un CV 2% a
differenti livelli di attività e concentrazioni utilizzando
la Tromboplastina Helena i CV sono risultati maggiori
del 5% evidenziando gli stessi problemi di ripetibilità e
conservazione dovute all’alta torbidità e mancanza di
stabilità pur avendo applicato una forzata e continua
agitazione del reagente. I risultati di correlazione tra i due
apparecchi sono validi mostrando valori di R tra 0,978 e
0,989.
P191
A CASE OF KETONE BODIES POSITIVE
INTERFERENCE IN THE TRINDER METHOD FOR
SALICYLATE MEASUREMENT
P192
A SIMPLE TOXICOLOGICAL ANALYSIS OF
ANABOLIC STEROID PREPARATIONS FROM THE
BLACK MARKET
C. Lo Cascio, M. Bertolani, B. Caruso, M.S. Graziani
M. Pellegrini, M.C. Rotolo, R. Di Giovannandrea, R.
Pacifici, S. Pichini
Lab. Analisi dO, Az. Ospedaliera Universitaria Integrata
Verona
Introduction: In the diagnostic pathway of paediatric acute
metabolic acidosis, salicylate intoxication is sometimes
considered. We report here a case of a young child with
marked ketosis, due to a genetic metabolic disorder, with
a false positive result in salicylate determination.
Methods: An 11 month old child, presented to paediatric
emergency unit with important ketoacidosis. Salicylate
was determined with SAL reagent (Siemens) applied on
Dimension Vista (Siemens) according to the manufacturer
instructions. The method is based on the Trinder method
and uses the reaction between salicylate and Fe-nitrate
to form a coloured complex. Samples from blood donors
were spiked with sodium salt of 2-ketobutirric acid
(Aldrich).
Results: Serum samples from the patient gave persistent
positive results, showing values slowly decreasing as
the clinical situation improved (60 mg/L, 54 mg/L, 34
mg/L, <17 mg/L). Since parents firmly denied salycilate
ingestion, samples were tested with an immunoenzymatic
method and resulted negative. Salicylate measurements
on blood donor samples spiked with 2-ketobutirric acid,
showed results positively correlated with the amount of the
added substance.
Discussion: Ketone bodies interference with Trinder
method has been already reported, but it is not specifically
mentioned in the manufacturer reagent sheet. It is
important to be aware of this positive interference because
it can cause a delay in the diagnosis or treatment of a
ketoacidosis or rise doubts on the capacity of parents to
create a safe environment for their children.
Tilbrook LK, Slater J, Agarwal A, et al. An unusual cause of
interference in a salicylate assay caused by mitochondrial
acetoacetyl-CoA thiolase deficiency. Ann Clin Biochem
2008;45:524–6.
Department of Therapeutic Research and Medicine
Evaluation, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy
Anabolic steroids are synthetic substances related to the
male sex hormones They have a number of physiological
effects, most notably an anabolic effect that promotes
the growth of skeletal muscle and androgenic effects that
foster the development of male sexual characteristics.
Abuse of anabolic steroids is motivated in most cases
by a desire to build muscles, reduce body fat, and
improve sports performance. Abuse is estimated to be
very high among competitive bodybuildersand spread
among elite and recreational athletes. After opening the
borders to Eastern Europe an explosionof the black
market for anabolic steroids occurred. During the last
10 years, numerous products that supposedly support
athletic performance and muscle growth were obtained
from different websites, but also confiscated in house
searches. Several of those were identified as counterfeit
substances
Objectives: A simple and rapid gas chromatography
(GC) method with mass spectrometry (MS) detectionwas
developed for the identification and quantification of
anabolic steroids in pharmaceutical preparations from the
black market.
Material and Methods: After a liquid-liquid extraction
of pharmaceutical products at acidic, neutral andbasic
pH with chloroform-isopropanol (9:1, v/v), the different
steroids were separated by fused silica capillary column
and detected by electron impact (EI)-MS in positive
ionization mode.
Results and conclusion: The assay was validated in the
range from 10 mg to 250 mg/g powder preparations and
0.02 mg to 200 mg/mL liquid preparations with good
2
determination coefficients (r _ 0.99) for the calibration
curves. At three concentrations spanning the linear
dynamic ranges of the calibration curves, mean recoveries
were always higher than 90% and intra-assay and
inter-assay precision and accuracy were always better
than 15%. This method was successfully applied to the
analysis of 15 pharmaceutical preparations sold by illegal
sources. In only two cases the content was the one
reported on the labels. In the other cases, no substances
at all, or steroids different from those reported on the
labels or different amounts from those declared were
found.
567
P193
APPROCCIO ALLO SVILUPPO SPERIMENTALE
DI UN METODO ANALITICO PER LA RICERCA
DELL’ETILGLUCURONIDE (ETG) NELLA MATRICE
CHERATINICA
P194
CONFIRMATION OF CARBOHYDRATE-DEFICIENT
TRANSFERRIN GENETIC VARIANTS BY CAPILLARY
ZONE ELECTROPHORESIS IN A CLINICAL
PATHOLOGY LABORATORY
A. Peruzzini, F. Svaizer, M. Gottardi
C. Canali , T. Trenti , G. Manieri , V. Galli , R. Bedin
Lab. LIESP APSS Trento
1
Questo lavoro di applicazione del metodo per il
dosaggio dell’EtG su una matrice cheratinica ha previsto
la verifica della qualità di alcuni parametri quali la
precisione, l’accuratezza, la sensibilità e la specificità
per il suo utilizzo nello screening dei campioni. I
risultati ottenuti relativamente ai parametri elencati sono
stati soddisfacenti; solo la sensibilità non si è rivelata
sufficientemente idonea al valore di cut-off suggerito di
30 pg/mg. Tale valore dovrà necessariamente essere
aumentato al di sopra di 50 pg/mg, limite comunque da
accertare. Nonostante siano state eseguite diverse prove
per riuscire a discriminare i negativi dai positivi con un
cut-off fissato a 30 pg/mg, ne saranno necessarie ulteriori
di approfondimento per la validazione del metodo allo
scopo di migliorare la sensibilità analitica aumentando la
quantità del campione, oppure aumentando il cut-off allo
scopo di diminuire i falsi positivi, senza però vanificare il
tentativo di miglioramento delle altre prestazioni analitiche
descritte. Con questo studio, infatti, si è riusciti a
discriminare bene solo i campioni negativi da quelli la
cui concentrazione di metabolita era superiore a 50 pg/
mg. Si è rivelato come punto critico in questo studio la
disponibilità di un numero di campioni esiguo sul quale
poter evidenziare con certezza la concentrazione dei
campioni a livello prossimi al cut-off. Infatti, nonostante in
Italia ci sia un abuso diffuso di alcol, è stato difficile trovare
persone che abusano di alcol disponibili alla raccolta
del campione. Sono state introdotte alcune modifiche
sostanziali al metodo per quanto riguarda la preparazione
del campione nella fase di lavaggio ed estrattiva. E’
stato verificato che, in virtù dell’alta polarità dell’EtG,
anche l’H2O risulta un solvente idoneo per il lavaggio
alla pari del diclorometano e metanolo. Si è deciso di
utilizzare per l’estrazione del campione il solvente VMAT come per le droghe di abuso uniformando,quindi,la
pratica di estrazione. E’ importante rilevare che a fronte di
quantità notevole di EtG superiore a 280 pg/mg occorre
intervenire con un’opportuna diluizione del campione per
evitare l’effetto negativo dell’eccesso di Ag (effetto Hook).
L’applicazione del metodo alla matrice cheratinica resta
pertanto condizionato da ulteriori idonei approfondimenti.
568
1
1
1
2
2
Lab. Tossicologia Clinica e Diagnostica Avanzata,
Nuovo Ospedale Civile S. Agostino Estense, Modena
2
Dip. di Neuroscienze-Lab. Neuroimmunologia, Nuovo
Ospedale Civile S. Agostino Estense, Modena
Background: The detection of CDT, a marker for
chronic alcohol abuse, is performed by chromatographic,
electrophoretic and immunoassays methods, in this
assay the presence of VG (genetic variant) may bring
to misleading interpretations with false positives or
negatives. IEF is recognized as the gold standard method
to characterize and to classify the VG, however it is
extremely laborious not suitable for routine use.
Aim: Our aim is to confirm the presence and characterize
VG in doubtful samples by capillary electrophoresis
assay only, as routine technique, without IEF (isoelectric
focusing) method.
Methods: In our study we considered 85 patients: 49
patients whose electrophoretic profile was suggestive
for VG presence and 36 patients whose profile was
normal. Between the 36 normal patients we had 16
CDT positives ad 20 CDT negatives. These 85 samples
were confirmed with IEF/Immunoblot using a specific
antibody anti-transferrin (Dako). Further we investigated
39 samples classifyed as “ Non detectable CTD due
to analytical interference” during the year 2011. All our
samples (85+39) were tested by capillary electrophoresis
(CZE) P/ACE MDQ Beckman Coulter using CEofix CTD
Kit (Analis, Belgium), after neuraminidase (Clostridium
perfringens, Sigma) digestion 24 h, 37°C, to eliminate the
sialic acid residues from the protein chain.
Results: The CZE analysis has confirmed the presence of
VG in the group of 49 patients and has excluded in the
group of 36. In the group of 39 patients were definitively
detected 28 VG (71,8%): 6 CD and 22 BC. However 11
samples remained unexplained and non detectable as no
sure interpretation was possible.
Conclusions: Our study focuses on the fact that the
only electrophoresis is not enough to evaluate the VG
presence a crucial point due the legal implications of
the CDT test. As it is necessary a confirmatory method
to give clear and defendable results, the digestion with
neuraminidase before coupled by CZE method could be
suitable for routine purpose to set up in a clinical pathology
laboratory.
Wuyts B, Delanghe J, Kasvosve I, et al. Determination
of carbohydrate-deficient transferrin using capillary zone
electrophoresis. Clin Chem 2001;47:247-55.
P197
INDAGINI DI LABORATORIO PER L’ASSOLVIMENTO
DEGLI OBBLIGHI DI LEGGE DERIVANTI
DALL’APPLICAZIONE DEL CODICE DELLA STRADA
Art.186/187
P. Bucchioni, F. Evangelisti , M. Vignali , G.
Petricciani , I.M. Sbarbaro
Lab. Analisi Osp. S.Bartolomeo Sarzana Sez.
Tossicologia
Il Codice della Strada riporta i protocolli operativi per gli
accertamenti delle sostanze d’abuso: art 186 e 187 del DL
30.4.1992 n. 285, rispettivamente per alcool e droga. Per
soddisfare queste esigenze operative, nel 2010, abbiamo
studiato, condiviso e reso operativo con la Prefettura di La
Spezia un “ Protocollo tossicologico-codice stradale”,con
la finalità di disciplinare e razionalizzare il servizio in
oggetto, in piena osservanza della normativa vigente.
Ciò ci ha permesso di seguire tutte le procedure
previste: dall’attivazione della “catena di custodia” fino
alla conferma dei risultati con indagini di “secondo livello”
in spettrometria di massa, allo scopo di produrre un
referto finale proprio conforme e sostenibile in sede
amministrativa e/o giudiziaria. Ed è proprio questo il punto
più critico e al contempo più qualificante: superare il
valore indiziario degli esami di screening (I livello) su
urine, per raggiungere il valore probatorio delle conferme
(II livello) su sangue. A tal fine, andremo a valutare
uno studio retrospettivo che va a dimostrare come il
percorso virtuoso che inizia con gli aspetti formali del
“consenso informato” e della “catena di custodia” e giunge
al raggiungimento della certezza di guida sotto effetto di
sostanze stupefacenti e/o di alcool, abbia portato a partire
dall’applicazione dell’accordo con la Prefettura (luglio
2010), un decremento significativo dei risultati positivi a
fronte di un incremento dei controlli effettuati. Nelle tabelle
che verranno esposte nel poster sono riportati i risultati
analitici di tale studio. Dall’osservazione dei nostri dati
emerge la necessità di rendere omogenei e corretti i
percorsi operativi che la Legge ci impone. In altri termini
gli operatori chiamati ad espletare tali indagini, sono tenuti
ad implementare un iter procedurale che sia aderente alla
normativa vigente con due scopi entrambi irrinunciabili:
fornire all’autorità giudicante le prove di condotta di guida
illecita ed, al contempo, garantire la non punibilità per i
conducenti che non hanno commesso il fatto
570
P198
MAGIC TRUFFLES OR PHILOSOPHER’S STONES: A
LEGAL WAY TO SELL PSILOCYBIN?
1
1
1
1
E. Marchei , M. Pellegrini , M.C. Rotolo , S. Pichini , R.
1
2
Pacifici , F. Saggio
1
Department of Therapeutic Research and Medicines
Evaluation, Istituto Superiore di Sanità, Rome, Italy
2
Comando Carabinieri per la Tutela della Salute, Rome,
Italy
Introduction: “Magic mushrooms” is the most common
name given to hallucinogenic fungi containing the
psychoactive alkaloids psilocybin and psilocin. In recent
years, “magic truffles” have become a new form of supply
of psychoactive Psilocybe alkaloids, since Psilocybe
sclerotia are not specifically included in the laws banning
the sale, the purchase and the use of such substances
and mushrooms containing them.
Methods: A liquid chromatography –tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS) method was developed for
the rapid determination of psilocybin and psilocin in
Psilocybe sclerotia. Following a simple step extraction
with methanol, the alkaloids were separated on a
reversed-phase column using a gradient of 0.1% formic
acid – acetonitrile s a mobile phase at a flow rate of 0.2 mL/
min. Separated analytes were detected by electrospray
ionization tandem mass spectrometry in the positive ion
mode using multiple reaction monitoring.
Results: The developed method was linear over
the calibration range for all two substances under
2
investigation, with a r 0.99. The detection and
quantification limits were 0.3mg and 1mg per 100mg
truffles, for both psilocin and psilocybin and the intraand inter-day coefficients of variation were always better
than 15%. Using this method, the presence of only
psilocybin was demonstrated in examined Psilocybe
sclerotia. The content of psilocybin was found to vary over
a concentration range of 59.3 to 167.8 mg per 100 mg
truffles corresponding to 0.06-0.16% alkaloid per fresh
sclerotia.
Conclusion: The results of our analyses can be an
incentive for the policy makers to include Psilocybe
sclerotia in the list of controlled plants or herbal products
that contain psychotropic alkaloids in the corresponding
laws banning the sale, the purchase and the use of illegal
drugs in European and non European Countries.
P199
METABOLIC ALTERATIONS INDUCED BY
METHACRILIC MONOMERS IN HUMAN PULPAR
FIBROBLASTS
P200
METODI IMMUNOMETRICI E HPLC-MS/MS A
CONFRONTO NELLO SCREENING TOSSICOLOGICO
1
1
2
3
3
C. Callà , A. Lupi , M.L. Gozzo , L. Cicillini , B.
1
1
Giardina , G. Nocca
1
1
2
M. Marinova , C. Artusi , L. Brugnolo , G. Antonelli , M.
1
1
1
1
Laboratorio Analisi I, Policlinico A. Gemelli, Roma
2
Ist. Chimica Riconoscimento Molecolare CNR, Roma
3
Laboratorio Analisi, Osp. G. Vannini, Roma
Aim: Composite resins were introduced in the 1960s
for the restoring of anterior teeth in substitution
of the amalgam that presented both aesthetical
and biocompatibility problems. However, since the
polymerization of methacrylates is never complete, the
need to appraise the biocompatibility of composite resins
became evident. The incomplete conversion causes in
fact the release of monomers that may implement adverse
effects in the organism, i.e. allergic reaction, systemic
toxicity, cytotoxicity. Given that very little information
has been so far delivered on the effects of methacrylic
monomers on cell metabolism, the aim of this work was
the evaluation of the biochemical interactions between
methacrylates and human fibroblasts.
Methods: The effects of triethylenglycol-dimethacrylate
(TEGDMA), 2-hydroxyhethyl methacrylate (HEMA), and
1,4-butanediol dimethacrylate (BDDMA) on 1) cellular
energetic metabolism (oxygen consumption rate, glucose
consumption, G6PDH, lactate production) 2) cellular
redox status (GSH concentration, the activity of the
enzymes regulating glutathione metabolism and REDOX
status of cells) were analysed according to Nocca et al.
Data are expressed as the mean ± statistical error of
the mean (SEM). The means were compared by analysis
of variance (ANOVA) followed, when appropriate, by a
multiple comparison of means by Student-Newman-Keuls
test: p < 0.05 was considered significant.
Results: The results showed that TEGDMA, HEMA and
BDDMA induce a statically significant decrease of oxygen
consumption, an enhancement of glucose consumption,
lactate production and also GSH depletion.
Conclusions: The alterations in energy metabolism,
REDOX status and glutathione balance – produced in the
cellular metabolism by HEMA, TEGDMA and BDDMA –
can be considered among the mechanisms inducing the
clinical and sub-clinical adverse effects that have been
occasionally reported during the use of dental resins. In
our opinion, such investigations can therefore be helpful
to test the behavior of materials especially designed to be
applied inside the human body.
Nocca G, De Palma F, Minucci A, et al. Alterations of
energy metabolism and glutathione levels of HL-60 cells
induced by methacrylates present in composite resins. J
Dent 2007;35:187-94.
2
Introduzione: Il laboratorio di Farmacotossicologia
assume un ruolo importante nel Servizio Medicina di
Laboratorio nella problematica delle sostanze d’abuso
poiché deve essere in grado di produrre dati sostenibili
sia scientificamente sia legalmente e garantire l’affidabilità
di tutte le fasi del processo. Per tale motivo, la scelta
delle metodologie più idonee rappresenta un impegno
importante che il laboratorio deve garantire.
Obiettivi: Valutare le prestazioni analitiche delle
metodiche DRI (homogeneous enzyme immunoassay) e
KIMS (Kinetic Interaction of Microparticles in a Solution),
applicate su due diversi analizzatori automatici presenti
in commercio, evidenziando le problematiche relative
alla diversità di riconoscimento delle classi di sostanza
come conseguenza dei diversi principi analitici e degli
anticorpi presenti nei reagenti. Al fine di realizzare
una valutazione più completa possibile è stata eseguita
l’analisi di conferma mediante LC-MS/MS.
Materiali e metodi: Sono stati analizzati 211 campioni
di urine di pazienti afferenti al Servizio Medicina di
Laboratorio con richiesta di screening tossicologico con
pannelli differenziati. I campioni sono stati processati
contemporaneamente con Cobas 6000 versione c501 e
ILab Taurus. L’analisi di conferma è stata eseguita su
i campioni con risultati discrepanti utilizzando il sistema
HPLC-MS/MS Agilent 6430.
Risultati: Anfetamine: KIMS 12 FP (12/166=7%); DRI 1
FN (1/166=0.6%) con un valore di poco inferiore al cutoff (1000 μg/L). Oppiacei: KIMS 9 FP (9/185=5%) e 3
FN (3/185=1,6%); DRI 1 FP (1/185=0.5%). Metadone:
KIMS 14 FP (14/169=8.2%); DRI 1 FN (1/169=0.6%).
Cannabinoidi: KIMS 5 FP (5/179=2.8%) e 1 FN
(1/179=0.6%) con un valore ai limiti del cut-off (50 μg/
L); DRI 5 FN (5/179=2.8%) dei quali 3 campioni (1.7%)
con un valore ai limiti del cut-off. Cocaina: DRI 1 FN
(1/176=0.6%).
Conclusioni: Dai dati ottenuti si evidenza una percentuale
di discordanza tra metodi pari al 24% attribuibile
principalmente al diverso principio di misura che privilegia
la sensibilità (KIMS) o la specificità (DRI). Di conseguenza
ogni laboratorio sulla base della popolazione di afferenza
e della possibilità di eseguire il test di approfondimento
dovrà scegliere la tecnologia di screening più adatta alla
specifica realtà clinica.
571
P201
MONITORAGGIO BIOLOGICO DELL’ESPOSIZIONE A
GAS ANESTETICI: ESPERIENZA ASL-BR
T. Voi, P. Robert, R. Incalza, M. Scoditti
Lab. di Patologia Clinica distrettuale e Tossicologia "A.
Di Summa", Brindisi
Si definiscono anestetici quei farmaci che determinano
una abolizione dello stato di coscienza ed una inibizione
temporanea della sensibilità dolorifica limitatamente al
periodo della loro somministrazione. Gli anestetici per
inalazione sono distinti in due gruppi: gassosi e volatili. In
riferimento alle linee guida sulla prevenzione e sicurezza
nelle sale operatorie, il nostro laboratorio ha monitorato
l’esposizione di lavoratori della ASL-BR al fine di valutare
il rischio sanitario da esposizione a gas anestetici.
Un’esposizione cronica a tali gas infatti produce effetti
tossici a livello di diversi apparati (riproduttivo, epatico,
emolinfopoietico). L’esposizione può essere dovuta a
perdite di gas dalle apparecchiature per anestesia,
comportamenti scorretti degli anestesisti, insufficiente
manutenzione degli impianti e dei sistemi di aspirazione
e convogliamento all’esterno dei gas, inadeguatezza dei
sistemi di ricambio dell’aria. Il metabolismo di questi
gas, ne consente il dosaggio urinario, infatti nel secondo
trimestre 2012 sono stati analizzato campioni urinari
provenienti da 18 lavoratori operanti nelle sale operatorie
della asl br. I campioni sono stati prelevati all'inizio e
alla fine del turno lavorativo e sono stati esaminati in
Gas cromatografia con detector MS tramite l’impiego di
una colonna cromatografia del tipo Poraplot Q. I risultati
ottenuti hanno dimostrato che l’esposizione rientra nei
limiti degli Indici Biologici di Esposizione per 16 campioni,
mentre in due casi la concentrazione riscontrata risulta
superiore. A conclusione del nostro studio, possiamo
confermare l’importanza del monitoraggio biologico come
sistema efficace di controllo nell'ambito della sorveglianza
sanitaria.
Mushlin PS, Mark JB, Elliott WR, et al.
Inadvertent development of subatmospheric airway
pressure during cardiopulmonary bypass. Anesthesiology
1989;71:459-62.
Ozanne
GM,
Young
WG,
Mazzei
WJ,
et
al.
Multipatient
anesthetic
mass
spectrometry.
Anesthesiology 1981;55:62-70.
Able M, Eisenkraft JB. Erroneous mass spectrometer
readings caused by desflurane and sevoflurane. J Clin
Monit 1995;11:152-8.
572
P202
MONITORAGGIO DELL’ABUSO ALCOLICO E
INTERAZIONE TRA FARMACI E TRASFERRINA
CARBOIDRATO CARENTE: PRESENTAZIONE DI UN
CASO CLINICO
1
2
1
1
M. Vidali , V. Bianchi , M. Bagnati , N. Atzeni , G.
1
Bellomo
1
Azienda Ospedaliero-Universitaria Maggiore della
Carità e Università del Piemonte Orientale, Dip. di
Scienze della Salute, Novara
2
Azienda Ospedaliera S.S. Antonio e Biagio e C. Arrigo,
Alessandria
Introduzione: Sebbene siano stati condotti numerosi
studi per identificare potenziali fattori associati a
false positività all’esame della Transferrina Carboidrato
Carente (%CDT), il problema dei falsi negativi è stato
valutato solo marginalmente. In questo lavoro riportiamo
il possibile effetto della terapia farmacologica sui livelli di
CDT in un paziente forte bevitore con storia clinica nota
(lug 2007-apr 2012).
Materiali e Metodi: XY maschio 70 anni. La
concentrazione di CDT (%disialotransferrina, cut-off
2,0%) è stata misurata con “%CDT kit by HPLC” (BioRad) su HPLC 1200 Agilent. La concentrazione urinaria
di etilglucuronide (EtG) è stata valutata su ADVIA 2400
(Siemens Healthcare) con kit DRI-EtG EIA (MicrogenicsThermo Fischer) (cut-off 0,5 mg/L).
Risultati: Il paziente a fine 2007 presentava AST
137 U/L, ALT 120 U/L, GGT 434 U/L, MCV
101 fl e CDT 3,3%; a dic 2007 dopo intervento
per duplice by-pass aorto-coronarico iniziava terapia
con amlodipina, perindopril, atorvastatina, isosorbide
mononitrato, carvedilolo, ticlopidina e pantoprazolo. Nei
mesi successivi l’abuso progressivamente riprendeva;
tuttavia, a dispetto di ciò che riferiva la famiglia, a lug
2009 presentava una CDT di 0,8%. A set 2009 il paziente
veniva ricoverato per frattura di bacino a seguito di caduta
(il tasso alcolemico dopo 16 h dal ricovero era 0,8 g/L).
Su pressione della famiglia si sottoponeva a gen 2011
(senza preavviso) al test della CDT risultato negativo
(1,1%), presentando tuttavia GGT 555 U/L, MCV 101 fl
e livelli di EtG urinario, valutati 3 volte/settimana per 2
settimane, notevolmente aumentati (>50 mg/L). Da feb
2011, in carico al SerT, iniziava terapia con Disulfiram,
ma continuava a bere, come testimoniato dalla famiglia e
da ulteriore indagine con EtG urinario. A mag 2011, dopo
ricovero d’urgenza (tasso alcolemico di 1,2 g/L), veniva
trasferito presso struttura privata dove attualmente vive.
Conclusioni: Questo caso evidenzia in modo significativo
le criticità dell’uso di un marcatore a bassa sensibilità
come la CDT nel monitoraggio di un paziente con
storia di abuso alcolico cronico accertato. Inoltre, i dati
suggeriscono una possibile interferenza di alcuni farmaci
nel processo di formazione delle varie glicoforme di
transferrina.
P207
EBV: PROFILO SIEROLOGICO CON PRESENZA
CONTEMPORANEA DI ANTI-EBNA IgG, ANTI-VCA
IgG e ANTI-VCA IgM
P208
EPIDEMIOLOGIA DELL’INFEZIONE DA
TOXOPLASMA IN DONNE IN ETÀ FERTILE: DATI
DEGLI ULTIMI 8 ANNI
M. Della Strada, P. Billi, S. Pelliconi, S. Semprini
L. Tomasicchio, A. Viniero, R. Genco, A.M.
Rutigliano, V. Masellis, R. Luce, R. Scarcella, F. Di Serio
U. O. Microbiologia-Centro Servizi Laboratorio Unico
Area Vasta Romagna-Azienda USL Cesena
Introduzione: I test sierologici per la diagnosi di
infezione da Epstein-Barr Virus (EBV) comprendono
tradizionalmente la ricerca di anti-EBNA IgG, anti-VCA
IgG e anti-VCA IgM. La presenza contemporanea dei tre
anticorpi può rappresentare un problema interpretativo.
Materiali e metodi: In un anno (2011) di attività routinaria,
si sono effettuati nel Laboratorio di Area Vasta Romagna
9294 test sierologici per EBV su analizzatore automatico
in chemiluminescenza Liaison® (DiaSorin) impiegando
reattivi Liaison® VCA IgG, Liaison® EBNA IgG e Liaison®
EBV IgM.
Risultati: La contemporanea presenza dei tre anticorpi
è stata riscontrata su 261 campioni (corrispondenti a
220 pazienti) pari al 2,8% delle determinazioni. Dei 220
pazienti, 197 (89,5 %) sono stati testati per CMV (IgG e
IgM); di questi 67 (34%) sono risultati CMV IgM positivi.
Per altri 17 pazienti, nel corso degli accertamenti richiesti,
sono emerse altre possibili cause di reattività crociata
(Toxoplasma, Bartonella, Herpesvirus 1-2, Enterovirus,
Adenovirus, Micoplasma), mentre per quattro pazienti è
stato documentata la persistenza di IgM dopo infezione
primaria (dati storici del Laboratorio).
Conclusioni: Rimane un'elevata percentuale (60%) di casi
in cui con i test richiesti di routine non è stato possibile
una interpretazione del risultato (differenziazione tra:
aspecificità, persistenza di IgM, o riattivazione). Per tali
casi, su indicazione clinica, si ipotizza l'introduzione di blot
per confermare la specificità delle IgM e l'esecuzione del
test di avidità per distinguere tra persistenza di IgM dopo
infezione primaria o riattivazione.
U.O. Patologia Clinica I, Azienda Ospedaliero
Universitaria Policlinico, Bari
Introduzione: Quanto più precocemente nel periodo
gestazionale viene contratta l’infezione da Toxoplasma
gondii, tanto più gravi sono i danni fetali che essa
procura. Grazie all’osservazione attenta dello stato
di immunizzazione delle donne in età fertile e al
miglioramento delle norme alimentari, negli ultimi anni
si è avuta in Italia una riduzione di tali problematiche.
Scopo del nostro studio è valutare tale evidenza fra
le donne in età fertile sottoposte al test di screening,
mediante dosaggio degli anticorpi anti-Toxoplasma IgG
e IgM, afferenti alla nostra Unità Operativa nel periodo
2004-2012.
Metodi: La ricerca di anticorpi anti-Toxoplasma (IgG e
IgM) è stata effettuata in 8939 donne di età compresa tra
i 13 e i 45 anni, suddivise in 3 classi di età, con metodo
in chemiluminescenza (principio sandwich) a due step, su
strumentazione Liaison (Dia Sorin). Con lo stesso metodo
è stato effettuato il test di avidità delle IgG per individuare
eventuali infezioni in atto.
Risultati: La prevalenza di IgG anti-Toxoplasma nelle
8939 donne testate è stata del 14%, diminuendo dal
20% nel 2004 all’11% nel 2012. Considerando l’età, essa
è stata del 10% per la classe di età 13-24 anni ed è
aumentata progressivamente fino al 18% nella classe
35-45 anni. Si è osservata altresì una riduzione delle
infezioni in atto dal 2% nel 2004 allo 0,7% nel 2012.
Conclusioni: Una sieroprevalenza per Toxoplasma gondii
del 14% costituisce un dato in linea con il generale trend di
riduzione della sieropositività riscontrato in Italia e in altri
Paesi (USA, U.K., Norvegia). Verosimilmente ciò è legato
alla migliore sorveglianza alimentare rispetto ad altri Paesi
come il Brasile dove la percentuale di immunizzazione si
aggira intorno al 60%. L’aumento della prevalenza con
l’età concorda con tali risultati.
Masini L, Casarella L, Grillo RL, et al. Studio
epidemiologico sulla prevalenza di anticorpi antiToxoplasma gondii in una popolazione ostetrica. It J
Ginaecol Obstet 2008;20:159-66.
Dubey JP. Toxoplasmosis: a waterborne zoonosis. Vet
Parasitol 2004;126:57-72.
575
P209
IL DOSAGGIO DEI MARKERS D'INFIAMMAZIONE E
DEL NT-proBNP NEL FOLLOW-UP TERAPEUTICO
CON PMX NELLA STRATIFICAZIONE DEL RISCHIO
DEL PAZIENTE CON SEPSI SEVERA
1
1
2
1
A.M. Rosa , M. Sarno , A. Lepore , V. Plutino , R.
1
Antonetti
1
Dip. di Patologia clinica, II Lab. Analisi Azienda OspUniv. Foggia
2
Centro Antiveleni
Introduzione: La diagnosi clinica di sepsi severa
comporta, oltre ai segni clinici che caratterizzano la
S.I.R.S. anche la presenza di disfunzione d'organo
almeno in un sistema come quello cardiocircolatorio.
Scopo del lavoro: Monitorare l'outcome del dosaggio
dei markers di infiammazione quali PCR, procalcitonina
(PCT), citochine e NT-proBNP nel follow-up terapeutico
del paziente con sepsi severa.
Materiali e metodi: Sono stati studiati 23 pazienti ricoverati
nel reparto di Rianimazione con diagnosi di sepsi grave
da Gram negativi (Endotossinemia > 0.6). Il dosaggio
in chemiluminescenza di NT-proBNP è stato eseguito
utilizzando il sistema Vitros 3600 della Ortho Clinical
Diagnostics; i livelli delle citochine sono stati dosati
all'inizio dello studio in chemiluminescenza con Immulite
(Medical Systems); in seguito gli stessi pazienti sono
stati analizzati con il sistema Evidence (tecnologia
Biochip Array Randox) distribuito dalla Medical Systems
e quelli della procalcitonina con tecnologia ELFA (Vidas
Biomerieux).
Risultati: Nei pazienti in trattamento con emoperfusione
con cartuccia di PMX (Polimixina B) abbiamo osservato
una correlazione positiva tra i valori dell'NT-proBNP con
le citochine IL6, IL8 e MCP-1 (73%) e con la PCT
(62.5%). Al tempo T0 i valori di NT-proBNP erano
significativamente alti ed una costante riduzione si è avuta
al T72 dopo terapia. I due sistemi Immulite e Evidence
hanno presentato una buona correlazione tra i valori
positivi e negativi dei campioni analizzati, anche se con
diversi range di riferimento.
Conclusioni: Nei pazienti con sepsi grave aumentano
i livelli delle citochine, del NT-proBNP e della PCT
e il trattamento con PMX determina una riduzione
significativa delle loro concentrazioni sieriche. E' emerso
un possibile utilizzo del NT-proBNP come marcatore di
danno miocardico reversibile in caso di sepsi, non solo per
i noti effetti cardiovascolari, ma anche immunomodulanti.
576
P210
INNOVAZIONE TECNOLOGICA, SPENDING REVIEW
E APPROPRIATEZZA DELLA RICHIESTA
Z. Napoli, M. Donati, S. Turrisi, R. Lari, L. Bianchi
U.O. Lab. di Analisi Chimico Cliniche e Microbiologiche,
Ospedale del Ceppo, Pistoia
Introduzione: Le nuove tecnologie quali microarray
proteici, RT-PCR multiplex, automazione e informatica
stanno trasformando progressivamente il modo di gestire
la diagnostica microbiolgica. L’impiego di metodiche multistep amplia lo spettro diagnostico riducendo il turn around
time (TAT) e permettendo un percorso diagnostico più
efficace.
Obiettivo: Scopo di questo studio è analizzare come
inappropriatezza e inadeguatezza del campione possono
ridurre il rapporto costo/benefico apportato dalle nuove
metodologie incrementando la spesa sanitaria.
Metodi: Con metodiche RT-PCR sono stati analizzati 189
campioni di LCR per la ricerca di batteri (EuSepscreen
lattanti/adulti) e virus (BioMerieux) e 933 tamponi cervicali
(TC) per ricerca di C.trachomatis (CT), N.gonorrhoeae
(NG), ureaplasmi (UU e UP) e micoplasmi (MH e MG). Il
cut-off di cellularità scelto è 1000cell/PCR (differenza di
positività: p<0.001).
Risultati: Per LCR il TAT complessivo è 2-3h. Si osserva
il 12% di richieste inadeguate per il pannello batterico con
esame chimico-fisico negativo e solo il 4% per le richieste
virologiche: costo complessivo €3280 (12% della spesa
complessiva). Per TC si osserva il 18% di inadeguati per
cellularità scarsa, il 25% di casi con richiesta di 1 patogeno
e il 12% su 2 o più matrici: costo complessivo di €32400
(45% della spesa complessiva).
Conclusioni: I dati di questa analisi mostrano che
diversi sono i fattori che possono far incrementare la
spesa, valutata in questo studio solo per i reattivi, fino
al 45%. La scelta della tecnologia (multiplex di più
patogeni) può incidere del 24% sulla spesa con possibile
diminuzione della qualità analitica, l’inadeguatezza per
il 15% e l’inappropriatezza della richiesta, sottostimata
in misura maggiore per le richieste ambulatoriali rispetto
a quelle degli interni, per il 9%. Ne consegue che
al microbiologo spetta il difficile onere di intervenire
nell’integrazione migliore tra metodiche ormai consolidate
e tecnologie emergenti (microarray e RT-PCR) e lo sforzo,
oggi più che mai necessario vista la diminuzione delle
risorse disponibili, per accrescere in prospettiva l’impatto
clinico del referto molecolare, attraverso una maggiore
appropriatezza e razionalizzazione delle richieste (che
può produrre risultati negativi sul paziente) e una sempre
maggiore efficacia della risposta.
P211
INTRODUZIONE DEL TEST CMV AVIDITÀ A
PIOMBINO: PRIME VALUTAZIONI
P212
ACETYLCHOLINE RECEPTOR BINDING
AUTOANTIBODIES IN PEMPHIGUS
P. Brunori, L. Faggiani, L. Ceccarelli, L. Villani, P.
Masi, C. Quintavalle, U. Paoletti, C. Centini, S. Del
Chierico, A. Tognini, L. Biondi, V. Pappalardo
G. Lobreglio, R. Torsello
Analisi Chimico Cliniche (Aziendale) - Sezione
Piombino, USL6 Livorno
Generalità: L’infezione da Citomegalovirus (CMV) è
frequente e spesso asintomatica, ma nel corso della
gravidanza una infezione primaria può causare gravi
danni al feto. La sola determinazione delle IgM antiCMV come screening nella gravidanza non permette
di distinguere fra infezione primaria e riattivazione
secondaria (meno pericolosa rilevata in circa il 20%
dei casi). Nei campioni positivi per IgG e IgM,
l‘avidità delle IgG è uno strumento per differenziare le
infezioni primarie (bassa avidità) da quelle recidivanti o
persistenti (alta avidità). L‘avidità, infatti, aumenta già
nel primo mese dopo la sieroconversione per CMV e
raggiunge un “plateau“ verso i 4-6 mesi successivi alla
sieroconversione.
Materiali e metodi: A giugno 2012 il test Architect (Abbott)
CMVavidity è stato introdotto nel nostro laboratorio,
in aggiunta protocollo precedente, che prevede la
conferma della positività IgM con metodo alternativo
(Vidas, Biomerieux). Il presente lavoro riassume la nostra
esperienza allo scopo di affinare un protocollo diagnostico
aziendale.
Risultati: Su 1044 determinazioni di CMV IgG ed IgM,
nel periodo considerato sono stati selezionati i 55
pazienti risultati positivi per IgM o comunque testati per
CMVavidity. Il 53% dei casi ha fornito un risultato di avidità
alta, il 41% bassa, ed il 6% in zona grigia (GZ). In 42
casi sono state determinate le IgM anche con il metodo
alternativo che non ha sempre confermato la positività (il
29% dei casi è risultato negativo). Su 24 pazienti IgM+
sono stati eseguiti sia il test CMVavidity sia il dosaggio
alternativo. Fra questi 7 hanno dato valori discordanti
(Architect+ Vidas-), tutti con alta avidità, mentre 4 pazienti
Architect+ sono risultati GZ con Vidas, 3 di questi sono
risultati a bassa avidità. Con il metodo IgM Architect la
percentuale di pazienti che risulta positiva è maggiore che
con Vidas.
Conclusioni: L’assunzione di un protocollo automatizzato
permette di gestire agevolmente il maggior numero di
casi risultati IgM+, anche negli stadi di sieroconversione
durante l’ infezione primaria, che spesso risultano GZ con
il metodo alternativo.
U.O.C. Patologia Clinica, P.O. "Vito Fazzi", ASL LE,
Lecce
Background: The binding of autoantibodies to cell-surface
antigens on keratinocytes results in blistering of the skin
and oral cavity in a variety of dermatologic conditions.
In pemphigus some autoantibodies with acantholytic
activity bind to keratinocytes desmosomal cadherins,
desmoglein (Dsg) 1 and Dsg 3. However pemphigus
autoimmunity is not limited to antidesmoglein antibodies;
non-desmoglein antibodies induce pemphigus-like lesion
in neonatal mice and cholinergic receptors expressed
by keratinocytes accumulate within regions of the cell
membrane associated with the desmosomes. Therefore
we sought to determine whether autoantibodies against
the acetylcholine receptor (ARAb) are present in sera of
patients with phemphigus.
Methods: We studied 34 patients with pemphigus
vulgaris ( 12 men and 22 women ), 11 patients with
bullous pemphigoid; 8 patient with SLE, 13 patient with
chronic urticaria, 7 patients with Duhring's dermatitis
herpetiformis, and 21 normal subjects. The presence
of circulating intercellular-substance antibodies was
determined by indirect immunofluorescence on monkey
esophagus; anti-desmoglein 1 and 3 antibodies were
determined by an ELISA method; quantitative ARAb by a
radioreceptor assay, which measure antibody binding to
125I-α-bungarotoxin-labeled acetylcholine receptor.
Results and conclusions. ARAb were detected in 23
patients with pemphigus (67.6%) at variable titers, but
not in sera of patients with other conditions or normal
subjects: p<0.001. In 18 of the 23 patients with ARAb
we detected also anti intercellular-substance antibodies
directed against Dsg 1 or Dsg 3, but in 7 patients (17%)
we found only the autoantibodies directed against the
acethylcholine receptor. These results suggest that ARAb
could lead to reversible detachment and acantholysis of
keratinocytes in some patients with pemphigus. Further
work will be needed to determine the target epitope of
the ARAb on the keratinocytes and how these antibodies
contribute to the pathogenesis of pemphigus.
577
P213
ANTICORPI ANTI-GLICOPROTEINA 2 (GP2): UN
NUOVO MARCATORE ASSOCIATO A FENOTIPI
DELLA MALATTIA DI CHRON
1
1
1
1
L. Marinelli , G. Ciarrocchi , B. Cinti , V. Viola , M.
1
2
2
2
d'Anzeo , E. Bendia , G. Falcioni , A. Benedetti , S.
3
3
3
Gatti , V. Romagnoli , C. Catassi
P214
DETERMINAZIONE DEI LIVELLI CIRCOLANTI DI
FARMACO E DELLA PRESENZA DI ANTICORPI
ANTI-FARMACO IN PAZIENTI CON PATOLOGIE
INFIAMMATORIE CRONICHE AUTOIMMUNI IN
TERAPIA CON INFLIXIMAB
1
1
1
1
C. Guiotto , L. Germano , M. Vizzini , E. Miotto , M.
2
3
2
1
Daperno , R. Pellerito , R. Rocca , M. Migliardi
1
SO Laboratorio Analisi, Sierologia, Ospedali Riuniti
Policlinico – Ancona
2
SO Clinica di Gastroenterologia, Università Politecnica
delle Marche - Ancona
3
SO Clinica di Pediatria, Università Politecnica delle
Marche - Ancona
Introduzione: Studi recenti hanno dimostrato che una
glicoproteina di membrana (GP2) presente nei granuli
di zimogeno costituisce il target di autoanticorpi antipancreas, associati alla Malattia di Crohn (MC). Lo studio
intende dimostrare l’associazione di anticorpi anti-GP2
con alcuni fenotipi della malattia.
Materiali e metodi: Un totale di 83 sieri di pazienti adulti
e pediatrici, 51 con diagnosi di MC e 32 con Retto-Colite
Ulcerosa (RCU), sono stati esaminati per la ricerca di
anticorpi anti-GP2 e anticorpi anti-ASCA mediante test
elisa (GA-Generic Assays; Alifax). Un gruppo di controllo
di 25 donatori sani (DS) è stato esaminato in parallelo.
Il test anti-GP2 impiega un antigene di GP2 umana
ricombinante. Il valore di 20 U/mL è stato considerato
quale cut-off per entrambi i test.
Risultati: 15 sieri (29,4%) risultarono positivi per IgG e/
o IgA anti-GP2 nel gruppo di pazienti MC; 4 pazienti
(12,5%) erano positivi nel gruppo RCU. Nessun donatore
sano risultò GP2 positivo. Presenza di anticorpi antiASCA è stata riscontrata in 24 (47%) pazienti MC, ma
in nessun siero RCU e DS, rispettivamente. Dei 15 sieri
GP2 positivi, 9 erano GP2 e ASCA positivi, 6 erano
ASCA negativi. Dei 24 casi ASCA positivi, 15 risultarono
GP2 negativi. Sommando la positività di anti-GP2 e antiASCA, la sensibilità complessiva nel gruppo MC salì al
58,8% (30 casi). Nessuna variazione è stata osservata nei
gruppi RCU e DS. Riguardo all’associazione di anti-GP2
con fenotipi di MC, 11/15 pazienti GP2 positivi avevano
una localizzazione ileo-colica, 10/11 mostravano gradi di
attività endoscopica (SES) da moderata a severa, in 9/15
è stato evidenziato un fenotipo stenosante. Quest’ultimo
aspetto è risultato statisticamente significativo con il
riscontro di anticorpi anti-GP2 (p=0.002).
Conclusioni: Il nuovo test sierologico anti-GP2 appare
in via preliminare un marcatore specifico e selettivo di
MC, significativamente associato con una localizzazione
ileo-colica della malattia. Dettagli clinici e di laboratorio
saranno discussi.
Roggenbuck D, Hausdorf G, Martinez-Gamboa L, et
al. Identification of GP2, the major zymogen granule
membrane glycoprotein, as the autoantigen of pancreatic
antibodies in Chron's disease. Gut 2009;58:1620-8.
578
1
Lab. Analisi, Osp. Ordine Mauriziano, Torino
Gastroenterologia, Osp. Ordine Mauriziano, Torino
3
Reumatologia, Osp. Ordine Mauriziano, Torino
2
Obiettivi: Scopo di questo studio pilota è il confronto di
due metodi per la determinazione dei livelli circolanti di
Infliximab (IFX) e degli anticorpi anti-Infliximab (ATI) e la
valutazione della relazione tra i diversi profili clinici e la
presenza in circolo del farmaco e/o degli anticorpi antifarmaco in soggetti con patologie infiammatorie croniche
autoimmuni, gastroenteriche o reumatiche, in terapia con
Infliximab, farmaco biologico diretto contro il TNFα.
Metodi: Sono stati arruolati 25 pazienti con patologie
gastroenteriche (n=13) e reumatiche(n=12): 23 in terapia
con IFX e 2 con Adalimumab (altro biofarmaco)
precedentemente trattati con IFX. I campioni di siero sono
stati prelevati prima dell’infusione del farmaco. Sono stati
valutati due tipi di metodi: Promonitor IFX Determination of
Drug and Anti-drug Antibodies Concentration (Menarini) e
TNFα Blocker monitoring/Antibodies against TNFα Blocker
(ImmunDiagnostik).
Risultati: I due metodi per la misura del farmaco sono
ben correlati (R di Spearman 0.821, p <0.0001), ma
la concordanza tra i risultati ottenuti è scarsa (y=2.55x
+0.713). Nei due pazienti in terapia con Adalimumab, l’IFX
risulta indosabile con il metodo Promonitor (<0.053 mg/
mL), mentre con il metodo ImmunDiagnostik si ottengono
valori pari a 6.5 e 20.1 μg/mL, probabilmente dovuti a
reazione crociata tra i due farmaci. Con entrambi i metodi
è stata osservata la presenza di ATI in due pazienti,
condizione che correla con la perdita clinica della risposta
al trattamento.
Conclusioni: I risultati ottenuti con i due metodi correlano
con il quadro clinico e presentano una buona correlazione
tra loro. La misura combinata di IFX e ATI si rivela un
utile supporto per monitorare e ottimizzare la terapia
con Infliximab. La valutazione di casistiche più ampie
e omogenee sarà necessaria per confermare i risultati
ottenuti.
Lo studio è stato realizzato grazie al contributo della
Fondazione Scientifica Mauriziana Onlus.
Chaparro M, Guerra I, Munoz-Linares P, et al. Systematic
review: antibodies and anti-TNFα levels in inflammatory
bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 2012;35:971-86.
P216
TIPIZZAZIONE HLA NELLA DIAGNOSI DEL MORBO
CELIACO: ESPERIENZA SU POPOLAZIONE
PEDIATRICA DEL TORINESE
P215
MARCATORI IMMUNOLOGICI DI ARTRITE
REUMATOIDE: DALLE LINEE GUIDA
ALL’APPLICAZIONE PRATICA
1
1
2
1
2
2
2
C. Alpini , S. Valaperta , F. Bobbio-Pallavicini , G.B.
1
1
Vadacca , G. Merlini
T. Manetta , M.F. Rostagno , M. Pozzato , I. Dagna , A.
2
3
Cristiano , C. Barbera
1
1
Servizio Analisi Chimico Cliniche, Fondazione
I.R.C.C.S. Policlinico S.Matteo, Pavia
2
Unità di Reumatologia, Fondazione I.R.C.C.S.
Policlinico S.Matteo, Pavia
Scopo: L’algoritmo proposto da Jaskowski et al. per
la diagnosi dell’artrite reumatoide (AR) si basa sulla
determinazione degli isotipi del fattore reumatoide (RF) e
degli anticorpi anti peptide ciclico citrullinato (CCP). Nel
presente lavoro abbiamo valutato l’impatto di due saggi
ELISA per la determinazione degli isotipi del RF sulla
classificazione di 100 pazienti con diagnosi clinica di AR.
Materiali e metodi: 1) 100 sieri di pazienti con diagnosi
di Early AR (F 69, 46aa±18, M 31, 52aa±11); 2) RF
IgA-IgG-IgM ELISA, Orgentec, strumentazione DSX; 3)
RF IgA-IgM-IgG EliA e CCP 2 IgG EliA, Phadia ab,
strumentazione ImmunoCap250.
Risultati: Stratificando i pazienti in base all’algoritmo
proposto abbiamo ottenuto i seguenti risultati:
Classe 1 “diagnosi quasi certa”: 6% di pz con RF EliA vs
11% con RF ELISA;
Classe 2 “diagnosi molto probabile”: 3% di pz con
entrambi i saggi;
Classe 3 “diagnosi probabile”: 3% di pz con RF EliA vs
6% con RF ELISA;
Classe 4 “diagnosi possibile”: 84 % pz con RF EliA vs 69%
con RF ELISA.
Discussione e conclusioni: Questa esperienza di lavoro
ha dimostrato che il dosaggio di test immunologici di
laboratorio, per altro inclusi nei criteri dell’American
College of Rheumatology per la diagnosi di artrite
reumatoide, e la loro applicazione nell’algoritmo di
Jaskowski, sono un valido supporto per la conferma di
una diagnosi, ma insufficienti come profilo diagnostico
per AR. Questo conferma che nonostante i progressi
del laboratorio, la diagnosi di questa patologia è ancora
essenzialmente clinica, soprattutto in fase precoce di
malattia.
Jaskowski TD, Hill HR, Russo KL, et al. Relationship
between rheumatoid factor isotypes and IgG anticyclic citrullinated peptide antibodies. J Rheumatol
2010;37:1582-8.
Laboratorio Citoimmunodiagnostica, Dipartimento
Scienze della Sanità Pubblica e Pediatriche AO OIRMS.Anna, Torino
2
Dipartimento Diagnostica e Servizi AO OIRM-S.Anna,
Torino
3
Servizio di Gastroenterologia, Dipartimento Scienze
della Sanità Pubblica e Pediatriche AO OIRM-S.Anna,
Torino
La celiachia è conseguenza di una alterata risposta al
glutine in soggetti con determinate varianti geniche degli
alleli HLA, ovvero il DQ2 (osservato nel 90-95% dei
celiaci) ed il DQ8 (presente in circa il 5% dei pazienti).
Esiste una quota di pazienti celiaci (meno del 2%) che
non possiede né il DQ2 né il DQ8, così come circa il
30% della popolazione generale (non celiaca) presenta
i suddetti alleli predisponenti. Nel nostro studio sono
stati esaminati 514 pazienti (età 2-16 anni, periodo
Gennaio 2009-Dicembre 2011) con diagnosi di sospetta
celiachia; ciascuno è stato sottoposto al dosaggio degli
anticorpi anti-endomisio (IFA test, celiac Monkey Distal
Esophagus EMA kit- Diamedix), anti transglutaminasi
(Elia autoimmunity Thermofisher- Celikey IgA-Acy) e ad
una tipizzazione HLA con tecniche di biologia molecolare
(SSO INNO-LIPA). Scopo del lavoro è stato quello
di verificare, laddove si accertasse una diagnosi di
celiachia, con positività degli anticorpi anti-endomisio
ed anti-transglutaminasi, quale fosse il fenotipo HLA
correlato, per documentare se la presenza di un HLA
DQ2 e/o DQ8 rappresenti una condizione predisponente
alll’insorgere della patologia nella nostra popolazione.
Obiettivo secondario è stato accertare quali fossero gli
altri HLA DQ presentati dai pazienti celiaci DQ2 e/o DQ8
negativi ed i DQ dei pazienti “sierologicamente” negativi.
Dei 514 pazienti esaminati, 417 sono risultati negativi e
97 positivi; nei negativi, 178 presentavano un eterodimero
HLA predisponente; nei positivi, 16 possedevano un
eterodimero HLA non predisponente. Il contributo della
genetica potrebbe "modificare" l'approccio diagnostico
per il morbo celiaco, ma non va dimenticato che
il contributo della biopsia intestinale è ancora molto
importante per la definizione stessa della malattia. Fino
a quando i metodi sierologici non saranno ulteriormente
migliorati e la costituzione genetica dei celiaci meglio
definita sembra prudente, per la diagnosi di celiachia,
affidarsi ad un approccio combinato di criteri clinici,
genetici, sierologici ed istologici.
Husby S, Koletzko S, Korponay-Szabó IR, et al. European
Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and
Nutrition guidelines for the diagnosis of coeliac disease. J
Pediatr Gastroenterol Nutr 2012;54:136-60.
579
P217
TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA (TNF)
PROMOTER HAPLOTYPE CONCURS WITH HLADQA1-DQB1 IN DETERMINING CELIAC DISEASE
RISK
P218
VALUTAZIONE DEL DOSAGGIO DI ANTICORPI
ANTI-RECETTORE TSH CON METODO DI TERZA
GENERAZIONE
1
1
1
1
1
E. Rossi , C. Zambon , F. Navaglia , E. Greco , D.
1
1
1
1
1
Bozzato , M. Pelloso , A. Aita , P. Fogar , S. Moz , G.
2
1
1
Guariso , D. Basso , M. Plebani
1
Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Azienda
Ospedaliera Università di Padova, Padova
2
Dipartimento di Pediatria, Azienda Ospedaliera
Università di Padova, Padova
The rare A alleles at -308 and -238 positions of the
TNFa gene have been associated with CD. Although
they may be candidate disease susceptibility factors,
it is likely that they act as part of TNFa haplotypes
resulting from the combination of more SNPs of
the promoter. The scopes of this study were to
ascertain whether five SNPs in the TNFa promoter
(-1031T>C,-857C>T,-376G>A,-308G>A,-238G>A) are
associated singly or as haplotypes with CD and
whether their effect is HLA-DQA1/–DQB1 dependent
or independent. 527 children (250 CD, 277 controls)
were studied. TNFa gene polymorphisms and HLADQA1 and –DQB1 alleles were analysed by RTPCR. The TNFa-1031C (OR=2.540,95%CI:1.157-5.575),
-857T
(OR=0.421,95%CI:0.282-0.627),
-376A
(OR=2.037,95%CI:1.109-3.741)
and
-308A
(OR=4.486,95%CI:3.076-6.541), but not -238 alleles,
were significantly CD-associated, this finding being
confirmed at multivariate logistic regression analysis.
The possible haplotypes derived from the combination
of these four SNPs were estimated using
the Arlequin statistical software. Six haplotypes
were obtained: two (CCGG,TTGG) were more
frequent in controls; three (CCAG,TCGA,CCGA)
were more frequent in CD; one (TCGG) was
equally found in controls and CD. TNFa promoter
genotypes inferred from haplotypes were classified in
six categories: 1)CD-associated/CD-associated; 2)CDassociated/TCGG; 3)CD-associated/control-associated;
4)control-associated/TCGG; 5)TCGG/TTG; 6)controlassociated/control-associated. A strong correlation was
found between the first two categories and CD and
between the last category and controls not only
considering all cases, but also considering only those
bearing HLA-DQA1/–DQB1 risk alleles. Binary logistic
regression analysis performed by including among
predictors TNFa promoter genotypes and HLA-DQ
haplotype, documented a strong association between CD
and homozygous HLA-DQ2 (OR=481;95%CI:112-2068),
heterozygous HLA-DQ2 (OR=73;95%CI:26-208) or
HLA-DQ8 (OR=14;95%CI:5-45), but also an HLAindependent correlation with CD-associated TNFa
promoter homozygous (OR=7;95%CI:1,48-34,31) or
heterozygous (OR=5;95%CI:1,56-16,59) genotypes. In
conclusion the TNFa promoter haplotypes CCAG, TCGA
and CCGA was shown to increase CD risk independently
from HLA-DQ alleles suggesting the pivotal role of TNFa
in the disease pathogenesis.
580
2
1
1
M. Brugia , S. Suppressa , F. Balducci , R. Ferroni , M.
1
Tocchini
1
Lab. Biochimica Clinica e Microbiologia. Azienda
2
Patologia Clinica Università di Bologna
Premesse: Gli anticorpi anti-recettore del TSH (TrAb)
stimolano la ghiandola tiroidea a produrre una maggiore
quantità di ormoni in quanto stimolano il recettore
del TSH. Il loro dosaggio è utile per diagnosticare il
morbo di Graves-Basedow, per monitorare le donne in
gravidanza e il rischio di recidive. Nella prassi clinica,
la rilevazione dei TrAb avviene tramite dosaggi di
seconda generazione che utilizzano TSHr umano o suino
immobilizzato con anticorpi (RIA, ELISA). Un anticorpo
monoclonale stimolante la tiroide umana (M22) ha reso
possibile la messa a punto di un nuovo dosaggio dei TrAb
automatizzato.
Materiali e metodi: Tra luglio e agosto 2012 sono stati
esaminati 76 campioni di siero afferenti al laboratorio dai
reparti interni e dagli Ospedali della regione Marche. Il
dosaggio dei TrAb è stato effettuato sia mediante metodo
RIA (Stratec SR300 Brahms; sensibilità 0,3 IU/L, cutoff 1,5 IU/L TSHr umano) che elettrochemiluminescente
(Modular E170 Roche; sensibilità 0,3 IU/L, cut- off 1,75 IU/
L). L’analisi statistica è stata eseguita con SPSS.
Risultati: Il dosaggio dei TrAb, eseguito con entrambe le
metodiche, è risultato essere al di sotto dei rispettivi cutoff in 60 campioni; in 14 campioni, invece, ha presentato
valori positivi al test. Solo 2 campioni positivi al test RIA
(1.6-2 UI/L) sono risultati invece negativi con metodo
ECLIA (0,30-1,33 UI/L). La curva di regressione lineare ha
mostrato un buona correlazione tra i 2 metodi (R 0,88).
Conclusioni: Nonostante la differenza dei metodi utilizzati
in quanto utilizzano anticorpi e tecniche di rilevazione
diverse, la correlazione è comunque risultata buona. I soli
2 casi con discrepanza avevano concentrazioni di TrAb
molto basse vicine al cut-off RIA. L’utilizzo in routine di
un metodo automatizzato di terza generazione potrebbe
apportare un miglioramento sia in termini di rapidità di
refertazione che riduzione del rischio radioattivo.
Kamijo K, Ishikawa K, Tanaka M. Clinical evaluation of
3rd generation assay for thyrotropin receptor antibodies:
the M22-biotin-based ELISA initiated by Smith. Endocr J
2005;52:525-9.
Sanders J, Jeffreys J, Depraetere H, et al. Characteristics
of a human monoclonal autoantibody to the thyrotropin
receptor: sequence, structure and function. Thyroid
2004;14:560–70.
P221
CORRELATION BETWEEN LIPID PROFILE AND
INTIMA MEDIA THICKNESS AT DELIVERY IN
PREGNANCIES COMPLICATED BY INTRAUTERINE
GROWTH RESTRICTION
1
1
1
2
P222
DETERMINAZIONE DEI LIVELLI DI PRESEPSINA
(SCD14-ST) SU SANGUE CORDONALE DI NEONATI
SANI MEDIANTE PATHFAST™ PRESEPSIN
(MITSUBISHI CHEMICAL)
1
2
1
1
C. Cosma , D. Faggian , M. Zaninotto , S. Visentin , E.
2
3
1
Cosmi , A. Lapolla , M. Plebani
S. Sale , A. Casani , M. Fumi , Y. Pancione , L.
2
1
Orfeo , V. Rocco
1
1
Padova, Italy
2
Dep. of Health of the Woman and Child, University of
Padua, Padova, Italy
3
Dep. of Medical and Surgical Sciences, University of
Background: Low birth weight is known to be associated
with an increased in cardiovascular risk.
Aim: This study has examined the associations between
abdominal aortic fetal intima media thickness (aIMT)
measured in utero during the early third trimester of
pregnancy and neonatal and maternal lipid profile at
delivery in pregnancies complicated by intrauterine growth
restriction.
Materials and methods: 165 patients were enrolled and
divided in control (AGA=97), small for gestational age with
(SGA=57) and intrauterine growth restriction (IUGR=11).
The aIMT was determinated by ultrasonography in the
early third trimester of pregnancy. The lipid profile was
measured in mothers and fetuses at delivery. Data were
expressed in median, considering significant p<0.05.
Results: The groups are similar for pre-pregnancy BMI
and age. IUGR groups presented a lower birthweight than
the other two (1919 gr vs 2567 gr vs 3254 gr, respectively,
p< 0.05). aIMT was significantly higher in IUGR than SGA
and AGA (1,05 mm vs 0.77 mm vs 0.59 mm respectively,
p<0.05). Total cholesterol, HDL, LDL, oxidized LDL, and
triglycerides maternal were significant higher compared to
neonatal. The fetal concentration of leptin is lower than
maternal but this difference is only significantly in IUGR
(p=0.0343). Fetal leptin was positively correlated with
birthweight (p<0.05). The fetal concentration of oxidized
LDL was significantly higher in IUGR than SGA and
AGA (18 mmol/L vs 12.59 mmol/L and 13.51 mmol/L,
respectively, p<0.05). Higher fetal cholesterol and LDL
were significantly associated with lower neonatal weight
(p<0.05). There was a hypertrigliceridemia in SGA and
IUGR groups than AGA (p= 0.05) and among SGA fetuses
we found a significant positive correlation between fetal
aIMT and trygliceride concentration (p<0.05). Finally we
found a negative correlation between oxidized LDL and
aIMT that among IUGR and SGA was not significantly
positive.
Conclusion: Lipidic profile of the mother is correlated
with lipidic profile of the fetus and newborns with
low birthweight had higher chances to present higher
colesterol and LDL. Low birthweight was associated
with dislipidemic state as well as high tryglicerids were
associated with increase aIMT in intrauterine growth
restricted fetuses.
582
U.O.C Patologia Clinica, A.O.R.N. "G. Rummo" di
Benevento
2
TIN, A.O.R.N. "G. Rummo" di Benevento
La sepsi è una delle principali cause di morbidità e
mortalità nelle TIN. La necessità di una diagnosi precoce,
che non può attendere l’esito delle colture, ha reso
necessario lo sviluppo di test sierologici rapidi come
ausilio diagnostico. La presepsina, ovvero la frazione
solubile del CD14 (sCD14), è risultata significativamente
più elevata in adulti con sepsi. Pochi studi hanno
dimostrato il valore diagnostico anche nei neonati.
Scopo del lavoro è stato valutare i livelli plasmatici di
sCD14 su sangue cordonale in neonati a termine sani,
mediante PATHFAST™ Presepsin (Mitsubishi Chemical).
Metodologia: Il PATHFAST™ Presepsin con metodica
immunoenzimatica in chemiluminescenza può effettuare
determinazioni su piccole quantità di sangue intero in
pochi minuti. I campioni sono stati ottenuti in sala parto
attraverso puntura del cordone subito dopo clampaggio.
Dopo separazione, il plasma, refrigerato a T=2-8 °C, è
stato analizzato entro 3 giorni.
Risultati: Il valore medio di sCD14 cordonale è risultato
953 pg/mL (±419) (95% ICmedia: 848-1058 pg/mL)
con un range tra 290 e 1943 (2.5°-97.5°centile). I
valori riscontrati risultano più elevati rispetto a quelli
ottenuti con la medesima metodica in una popolazione
di adulti sani. Per cui, in riferimento ad altri studi circa
la scarsa capacità dei neonati di produrre sCD14, in
condizioni normali, è probabile che la discordanza sia
dovuta all’utilizzo di metodiche differenti. Nonostante la
significatività del valore medio, l’ampio range di valori
di sCD14, ci ha indotto a tentare una correlazione con
altri indici di flogosi/infezione: conta # e % dei monociti,
ratio I/T dei neutrofili, analisi citofluorimetrica dei monociti
(CD14,CD64,CD16,CD45).
Conclusioni: I risultati ottenuti dimostrano che un valore di
sCD14 pari al 95% IC mediana (967 pg/mL) è correlato,
sia alla conta monocitaria fornita dall’emocitometro
(Siemens ADVIA 2120i) (p=0.0004), sia alla conta %
ottenuta mediante analisi citofluorimetrica (p<0.0001),
che al valore I/T dei granulociti neutrofili (p=0.0008). Ad
ogni modo, sono necessari ulteriori studi, sia sui neonati a
termine sani, che su quelli settici, per la validazione clinica
di questo test.
P223
DIAGNOSTIC ACCURACY OF sFlt-1, PlGF, sFlt-1/
PlGF RATIO AND PTX3 IN PREECLAMPSIA
1
2
2
F. Cappellini , P. Algeri , S. Ornaghi , D.
3
1
4
5
Bernasconi , S. Signorini , P. Brambilla , G. Urban , P.
2
Vergani
1
University Dept. of Laboratory Medicine, Hospital of
Desio, Desio, Monza e Brianza, Italy
2
Dept. of Obstetric and Gynaecology, Univ. of MilanBicocca, Monza, Monza e Brianza, Italy
3
Clinical Medicine and Prevention, Center of Biostatistic
for Clinical Epidemiology, Univ. of Milan-Bicocca,
Monza, Monza e Brianza, Italy
4
Dept. of Experimental Medicine, School of Medicine,
Univ. of Milan-Bicocca, Monza, Monza e Brianza, Italy
5
Dept. of Obstetric and Gynaecology, Hospital of Desio,
Desio, Monza e Brianza, Italy
Introduction: Preeclampsia (PE) is a common, pregnancyspecific syndrome defined by elevated blood pressure
combined with proteinuria and edema. The incidence has
been reported in 2±7% of all pregnancies. Abnormal levels
of endothelial dysfunction markers, such as soluble Fmslike tyrosine kinase 1 (sFlt-1), Placental Growth Factor
(PlGF), and of systemic inflammation marker, such as
Pentraxin 3 (PTX3), have been observed in maternal
blood during the disease. Aim of the study was to define
the diagnostic sensitivity (sens) and specificity (spec) of
sFlt-1, PlGF, sFlt-1/PlGF ratio and PTX3 in PE.
Materials
and
methods:
Twenty-two
singleton
preeclamptic patients (cases) and 23 controls,
represented by gestational age homogeneous women
compared to cases, were included in the study; controls
were represented by singleton pregnancies complicated
by preterm delivery, intrauterine growth restriction and
preterm premature rupture of membranes. Maternal
serum samples were collected at delivery in Obstetric and
Gynaecology department of San Gerardo Hospital, Monza
between January 2005 and December 2007. Samples
analysis were performed in May 2012 at laboratory of
Desio Hospital, Desio. sFlt-1 and PlGF were measured on
Cobas 8000 by electrochemiluminescence assay (Roche
Diagnostics), PTX3 was measured on BEP 2000 Advance
(Siemens Healthcare Diagnostics) using an ELISA assay
(Diesse Diagnostica Senese). ROC curves for each
marker was performed.
Results: sFlt-1 had an AUC of 0,927; the optimal cut-off
was 5579 pg/mL with a sens of 95,5% and a spec of
78,3%. PlGF showed a lower value of AUC (0,82), a cutoff equal to 48,9 pg/mL, with sens of 87,0% and spec
of 77,3%. sFlt-1/PlGF ratio showed the best performance
with an AUC value of 0,949. The cut-off was 132,3 with a
sens of 90,9% and a spec of 91,3%. PTX3 had the lowest
AUC value (0,772) with a cut-off of 2,1 ng/mL (sens =
86,4%; spec = 69,6%).
Conclusion: Our results suggested sFlt-1/PlGF ratio as
the most accurate marker for identification of PE at
delivery. Collecting samples of new preeclamptic patients
at different gestational ages could be useful in order to
establish the sFlt-1 and PlGF rising times.
P224
EVALUATION OF ANTI-MÜLLERIAN HORMONE IN
YOUNG GIRLS WITH TURNER'S SYNDROME
1
2
2
1
G.L. Salvagno , R. Gaudino , C. Piona , M. Gelati , P.
2
2
1
Cavarzere , F. Antoniazzi , G.C. Guidi
1
Sezione di Biochimica Clinica, Dipartimento di Scienza
della Vita e della Riproduzione, Università di Verona
2
Sezione di Pediatria, Dipartimento di Scienza della Vita
e della Riproduzione, Università di Verona
Background: Turner syndrome (TS) is a chromosomal
anomaly characterized by the complete or partial deletion
of the second sex chromosome responsible for a
heterogeneous constellation of clinics events of which the
most important are the short stature, ovarian dysgenesis
and infertility. Recently, anti-Mullerian hormone (AMH)
has been suggested as an indirect marker of ovarian
reserve in women with hypogonadism and infertility.
Aim: The aim of our study was to determine AMH serum
concentration, the genotypic characteristics, phenotype
and health status of patients with TS in different stages
of life.
Materials and methods: We evaluated AMH concentration
in 23 patients with Turner’s syndrome follow at the Centre
for Paediatric Endocrinology. AMH concentration was
determined using AMH Gen II Elisa (Beckman Coulter),
assessed on a Triturus® EIA Analyzer (Grifols). The
genotypic characteristics, phenotype and health status of
patients was evaluated during the routine pediatric visit.
Results: First of all, this study showed the extreme
phenotypic heterogeneity and genotypic of this syndrome,
highlighted especially by the variability of response to
treatment with growth hormone. The second important
result was that AMH was not detectable in 91.3% (21/23)
of patients with TS that differs statistically significantly
from AMH’s levels in healthy volunteers. Finally, 33.3% of
our patients were positive for searching of Y-chromosome
material, an important risk factor for the development of
gonadal tumors.
Conclusions: From the analysis of auxological parameters
evaluated in our patients who have reached the final
height , emerges the need to perform new studies in
order to identify clinical, laboratory or genetic factors
able to better predict the response to therapy for short
stature. A systematic search for a hidden Y-chromosome
mosaicism, and AMH levels in TS patients could help us to
evaluate the risk of development of germ cell tumors and
ovarian preservation improving the quality of life of these
patients.
583
P225
INFLAMMATORY MARKERS, INTRAUTERINE
GROWTH RESTRICTION AND AORTA INTIMA MEDIA
THICKNESS AT DELIVERY
1
1
1
2
C. Cosma , D. Faggian , M. Zaninotto , S. Visentin , E.
2
3
1
Cosmi , A. Lapolla , M. Plebani
1
Padova, Italy
2
Dep. of Health of the Woman and Child, University of
3
Dep. of Medical and Surgical Sciences, University of
Background: Intrauterine growth restriction (IUGR) and
neonatal low birth weight are often associated with
increased intima/media thickness of the abdominal aortic
wall (aIMT). Studies performed on the abdominal aortic
wall of a stillbirth presenting with IUGR and aIMT
have suggested an association among IUGR, aIMT, and
inflammation. This studies led us to analyzed a profile
inflammatory (IL6, TNF-alfa and protein C reactive).
Aim: This study has compared maternal and fetal
inflammatory markers at delivery in pregnancies
complicated by intrauterine growth restriction and
examine the association with aIMT.
Materials and methods: 165 patients were enrolled and
divided in control (AGA, n=97), small for gestational age
(SGA, n=57) and intrauterine growth restriction (IUGR,
n=11). We measured aIMT by ultrasonography in the early
third trimester of pregnancy. Inflammatory profile (PRC,
IL-6 and TNF-alfa) was evaluated in mothers and fetuses
at delivery. Exclusion factors were diagnosis of maternal
chorioamnionitis or maternal diseases that may support
an ongoing inflammatory state. Data was analyzed
by Analyse.it and expressed in median considering
significant p<0.05.
Results: There were not differences in maternal age,
parity and pre-pregnancies BMI among the groups. The
97 AGA delivered at a mean gestational age of 38.27
weeks (±2.21) significantly higher than IUGR fetuses
(35.18 weeks ±2.44) (p<0.05) but not than SGA (38.23
weeks±1.61) (p=0.6). aIMT was significantly higher in
IUGR than SGA and AGA (1,05 mm vs 0.77 mm vs 0.59
mm respectively, p<0.05). TNF-alfa and PCR were not
significantly different in cases compared to AGA for both
mothers and fetuses. Moreover, we not found differences
among the groups as regards IL-6 and no significant
correlation was observed between aIMT and fetal or
maternal inflammatory status.
Conclusion: Our data do not confirm previous reports
where higher inflammatory markers were found in fetuses
with intrauterine growth restriction. Considering our
results inflammatory markers could not be linked to signs
of possible vascular damage in SGA and IUGR fetuses as
well as it could be connected to a particular maternal or
fetal metabolic status.
584
P226
LA BIOCHIMICA URINARIA DEL FETO OTTENUTA
CON CISTOCENTESI: UTILITA' CLINICA NELLE
GRAVI UROPATIE FETALI
1
2
2
2
C. Rossi , M. Pellegrino , G. Noia , L. Masini , C.
2
2
2
2
Manzoni , A. Giona , A. Facente , A. Caruso , C.
1
1
Zuppi , C. Callà
1
Dipartimento di Diagnostica e Medicina di laboratorioPoliclinico universitario "A.Gemelli", Roma
2
Dipartimento per la tutela della salute della donna e
della vita nascente-Policlinico universitario "A.Gemelli",
Roma
Introduzione: La gestione delle uropatie ostruttive in fase
prenatale non può prescindere dalla diagnostica invasiva
e non. L’approccio diagnostico invasivo più frequente è
la cistocentesi ecoguidata, con prelievo di urina fetale
nel punto di transfissione. La biochimica urinaria fetale
è determinante nella scelta dell’approccio invasivo più
appropriato.Scopo del lavoro è stato dimostrare che
cistocentesi ripetute (2 casi) possono essere diagnostiche
e terapeutiche, determinando miglioramenti pressori nel
detrusore vescicale fetale, contribuendo al buon esito
perinatale.
Materiali e metodi: Prima paziente: 26a settimana con
diagnosi di massa fetale addominale sin (sospetto rene
displasico multicistico). Seconda paziente: 14a settimana
con diagnosi di megavescica fetale. In entrambe sono
state effettuate 7 cistocentesi ecoguidate. Sui campioni
di urina fetale sono stati dosati: elettroliti, creatinina,
microalbuminuria ed osmolalità (C 311 Roche, BNII
Siemens, Osmometro AI).
Risultati: I parametri di funzionalità renale, nel primo
caso, sono risultati sempre elevati indice di una
funzionalità compromessa. A 4 giorni di vita, il bambino
è stato sottoposto a nefroureterectomia sn, con diagnosi
definitiva di forma segmentale di displasia renale. La
cistouretrografia effettuata a 3 mesi di vita ha evidenziato:
parenchima renale dx sano, con funzionalità renale nella
norma. Nel secondo caso i test biochimici sull’urina
fetale hanno evidenziato una normale funzionalità del
parenchima renale pur in presenza di megavescica
(sindrome di Prune-Belly), confermata postnatalmente.
Alla nascita le condizioni generali sono risultate discrete
con parametri biochimici e ecografia dell’apparato urinario
nella norma.
Conclusioni: L’uso delle tecniche invasive ecoguidate
ha permesso di considerare il feto come "paziente"
e l’approccio invasivo può essere effettuato con un
rapporto rischio-beneficio basso.Le indagini biochimiche
nei distretti indagati hanno permesso di monitorare
l’evoluzione della patologia, conducendo le gravidanze
fino alla 37°e 38° settimana, rispettivamente, con un
intervento appropriato e senza accanimento terapeutico.
I test biochimici sono stati di grande supporto per la
formulazione della diagnosi confermata alla nascita dei
bambini e per detendere la distensione della megavescica
fetale.
P229
PROTEOMICS IDENTIFIES PLACENTAL PROTEINS
ALTERED BY GESTATIONAL DIABETES MELLITUS
1
2
3
3
A. Lapolla , G. Desoye , G.B. Nardelli , G. Bogana , M.
3
1
4
Carrozzini , M. Roverso , P. Traldi
1
Dep. of Medical and Surgical Science, University of
Padova
2
Dep. of Obstetrics and Gynecology, Medical University
of Graz, Austria
3
Dep. of Gynecological Sciences and Human
Reproduction, University of Padova
4
ISTM-CNR, Padova
The role of placenta during the fetal grown is well
known. This tissue is exposed to the regulatory influence
of many different substrates present either in maternal
or in fetal circulation. Its functionality can be affected
by changes of active substances present in both
circulations and it can produce active molecules affecting
mother and fetus independently. A pathological state,
as the onset of gestational diabetes mellitus (GDM)
necessarily reflects on the change of these equilibria.
The present investigation was focused on the possible
changes occurring in the placenta protein profile in
presence of GDM. For this aim either the top-down
or the bottom-up approaches were employed. The
placenta samples from 20 healthy and from 20 GDM
pregnant women were pooled. The two samples so
obtained were analyzed by MALDI/MS and the proteins
detected were tentatively identified on the basis of
their molecular weight. Alternatively the two pools were
analyzed by electrophoresis and the different bands
obtained were digested by trypsin and the digestion
products were analyzed by MALDI. Interestingly, aside
quantitative changes observed in the protein profiles
of healthy and GDM subjects, some glycated proteins
have been detected. An example is represented by the
SRRM1 protein, identified either in the diabetic placenta
homogenate pool or in the control one by means of
SDS-PAGE followed by MALDI/MS analysis of the in-gel
tryptic digested. MALDI spectrum of the SRRM1 digestion
products shows, in the case of diabetes, the presence
of molecular species ascribable to glycation processes.
Species at m/z 1406, for instance, can be explained by the
condensation of three methylglyoxal (MGO) molecules.
MS/MS experiments supports this hypothesis showing
the presence of four arginine residues in the aminoacidic
sequence of this molecular species, which could bind the
MGO.
586
P230
VALUTAZIONE COMPARATIVA DI UN METODO
ENZIMATICO PER LA MISURA DEGLI ACIDI
BILIARI CONIUGATI TOTALI SUL SISTEMA
OLYMPUS AU 2700 RISPETTO AD UNA METODICA
RADIOIMMUNOLOGICA
R. Rosso, L. Motta, G. Vignati
Laboratorio Analisi Chimico Cliniche e Centro Malattie
Endocrine e Metaboliche, Ospedale "G.Fornaroli",
Magenta (MI)
La colestasi intraepatica in gravidanza (ICP) è sospettata
nelle gravide che presentano combinazione di prurito
cutaneo diffuso ed alterazioni dei test di funzionalità
epatica. E’ un fattore di rischio per morte fetale in utero,
frequente dopo la 37 WOP. La somministrazione di
acido ursodesossicolico (UDCA) è il trattamento medico
più efficace per migliorare la sintomatologia e arrivare
al termine naturale della gravidanza. Misurazione e
monitoraggio degli acidi biliari sono utili nel confermare la
diagnosi e nel monitoraggio terapeutico.
Materiali e metodi: Il metodo in uso (acidi biliari coniugati
totali RIA, in fase solida ad esecuzione manuale; ICN
Biomedicals, Pantec) ha come limite la tempestività
della risposta; per migliorarla abbiamo valutato la
determinazione del parametro sulla strumentazione
automatica AU2700 (Beckman Coulter). Il metodo
impiegato (Dyazime Laboratories) si basa sulla reazione
reversibile di conversione degli acidi biliari in 3chetosteroidi e tio-NADH catalizzata dall’enzima 3-αidrossisteroide deidrogenasi. La formazione di tio-NADH
viene determinata misurando la variazione di assorbanza
a 405 nm. Abbiamo testato i campioni (n =145) pervenuti
nel periodo con la metodica RIA e su AU2700; effettuato
una verifica degli intervalli di riferimento; verificata la
potenziale interferenza sui risultati da parte di UDCA,
dichiarata dal produttore, sulle pazienti con ICP in
trattamento con tale farmaco.
Risultati: Variabilità analitica (inter-assay): CV tra 2.84 e
3,13%. Confronto su campioni di routine (n=113: y = 2.70
+ 0.875x; r = 0.956. Parametri popolazione di riferimento
(n=115): mediana=2,80; 2,5°-97,5° percentile=0,69-9,78.
Pazienti in trattamento con UDCA (n=32): nessuna
diversità di classificazione dei risultati rispetto al metodo
RIA (che non risente di tale interferenza).
Conclusioni: Visti i risultati ottenuti si è optato per
l’introduzione del dosaggio su AU2700. Il tempo di
risposta pienamente rispondente alle necessità cliniche
(60 min) evidenzia un sicuro beneficio nella gestione delle
pazienti con ICP.
Favre N, Bourdel N, Sapin V, et al. Importance of bile acids
for intra-hepatic cholestasis of pregnancy. Gynecol Obstet
Fertil 2010;38:293-5.
P231
DETERMINAZIONE DELL’EMOGLOBINA GLICATA
IN CAMPIONI CON VARIANTI EMOGLOBINICHE:
CONFRONTO TRA SEI DIVERSI ANALIZZATORI
P232
DETERMINAZIONE DELL’EMOGLOBINA GLICATA
MEDIANTE ELETTROFORESI CAPILLARE
1
1
1
2
1
L. Brugnolo , C. Artusi , G. Antonelli , M. Marinova , M.
1
1
1
1
2
M. Marinova , S. Altinier , C. Artusi , G. Antonelli , L.
1
1
1
Brugnolo , M. Zaninotto , M. Plebani
1
1
2
Dip. di Medicina, Università degli Studi di Padova
Introduzione: Il principio analitico di riferimento per la
misura dell’emoglobina glicata (HbA1c) è la cromatografia
di affinità al boronato che permette la separazione
della frazione glicosilata dalla non-glicosilata. Per la sua
determinazione routinaria, l’HPLC rappresenta la tecnica
più diffusa in grado di offrire migliori prestazioni analitiche.
Obiettivo: Confrontare sei diversi analizzatori per valutare
le differenze nelle misure di HbA1c in presenza di diverse
varianti emoglobiniche.
Materiali e metodi: Sono stati raccolti campioni di sangue
di pazienti afferenti all’UOC Medicina di Laboratorio
con richiesta di HbA1c che presentavano alcune delle
più comuni varianti emoglobiniche: HbS (n=35), HbD
Punjab (n=15), HbHasharon (n=16), HbC (n=6), HbE
(n=3) e altre non identificate (n=6). Tutti i campioni
sono stati analizzati con Adams HA8160 TP (A Menarini
Diagnostics), HLC-723 G8 (Tosoh Bioscience), Variant
II modalità dual-kit e Turbo (Bio-Rad), Cobas 6000
(Roche Diagnostic) e confrontati con lo strumento Afinion
(Sentinel CH) scelto come metodo di riferimento. I
risultati sono stati elaborati statisticamente con Analyseit® Software.
Risultati: I sei metodi sono stati messi a confronto
attraverso la regressione lineare e l’analisi di BlandAltman. È stato riscontrato un bias statisticamente
significativo (range) nella misura di HbA1c con tutti gli
analizzatori: HbS (-4.6% Tosoh +11.3% BioRad Turbo),
HbHasharon (-7.4% Menarini +6.1% BioRad dual-kit),
HbD Punjab (-5.5% Menarini +7.8% BioRad Turbo).
Per quanto concerne le altre varianti, data la scarsa
numerosità, è stato valutata la mediana dei bias (range)
dei valori ottenuti con tutti gli analizzatori confrontati
con Afinion: HbC (-8.6% Roche +7.0% BioRad dual-kit),
HbE (-71.0% BioRad dual-kit +2.2% BioRad Turbo), per
le varianti non definite (-5.9% Menarini +5.1% BioRad
Turbo).
Conclusioni: I risultati ottenuti per la determinazione
di HbA1c evidenziano differenze statisticamente
significative in presenza di varianti emoglobiniche in
base al sistema diagnostico utilizzato, con conseguente
scarsa confrontabilità tra i differenti sistemi analitici. È
stato invece precedentemente verificato che in campioni
che non privi di varianti emoglobiniche gli analizzatori
presentano una buona correlazione.
2
Introduzione: L’emoglobina glicata (HbA1c) è un
biomarcatore “chiave” per il monitoraggio dell’equilibrio
glicemico a medio-lungo termine nei pazienti diabetici.
Attualmente, per la sua determinazione la HPLC
rappresenta la tecnica di elezione per la maggiore
sensibilità, precisione, accuratezza e specificità.
Recentemente è stato introdotto in commercio Capillarys
2 Flex piercing, un sistema automatico di elettroforesi
capillare per la separazione e la quantificazione di HbA1c.
Obiettivi: Valutare le performance analitiche dello
strumento Capillarys 2 Flex Piercing nella determinazione
di HbA1c e valutare come variazioni quantitative o
qualitative del pattern emoglobinico possano influenzare
la sua quantificazione.
Materiali e metodi: Sono stati raccolti campioni di
sangue intero di pazienti privi di varianti emoglobiniche
(n=79) e con alcune delle più comuni varianti:
HbS, HbC, HbE e HbD (n=17). I campioni sono
stati analizzati contemporaneamente con Capillarys 2
Flex Piercing (Sebia) e con Adams HA8160 TP (A.
Menarini Diagnostics) e i risultati sono stati elaborati
statisticamente con Analyse-it® Software.
Risultati: I risultati ottenuti dalle prove di imprecisione,
sia nella serie sia tra le serie, mostrano un CV<
3.7%. I due metodi, messi a confronto attraverso la
regressione lineare e l’analisi di Bland-Altman, nel gruppo
di pazienti privi di varianti emoglobiniche, presentano
un’ottima correlazione (R2=0.97, p<0.0001) e un bias
di 0.8 mmol/mol, statisticamente ma non clinicamente
significativo. La scarsa numerosità del gruppo di pazienti
con emoglobinopatie non consente di ottenere dati
statistici affidabili. In pazienti con varianti HbS, HbC, HbD
e HbE le concentrazioni di HbA1c ottenute con i due
metodi, appaiono sovrapponibili.
Conclusioni: Le prestazioni analitiche, sia in termini di
imprecisione che correlazione con il metodo di riferimento,
sono risultate molto soddisfacenti. Le più comuni
varianti emoglobiniche studiate non hanno dimostrato
interferenza analitica nel sistema di determinazione.
La facilità d’uso, la robustezza e la produttività oraria
attestano la possibile applicazione nella diagnostica
clinica di laboratorio.
587
P233
EMOGLOBINA GLICATA E APPROPRIATEZZA
DELLE RICHIESTE NEL MONITORAGGIO DEL
PAZIENTE DIABETICO
1
2
R. Marozzi , G. Catanoso
P234
EVALUATION OF ANALYTICAL PERFORMANCE OF
A NEW METHOD FOR HbA1c DETECTION
C. Novembrino, N. Failla, M.G. Ratti, M.G. Meroni, L.
Villanova, R. Maiavacca
1
Lab. Centrale Analisi Chimico Cliniche e Microbiologia,
Fond. IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore
Policlinico, Milano
Nel monitoraggio del paziente diabetico numerose
linee guida sottolineano l'importanza del dosaggio
dell'emoglobina glicata ad intervalli basati sui valori
dell'esame stesso. Una corretta tempistica è in grado di
garantire efficienza ed efficacia sia per il paziente che per
il sistema sanitario. Come suggerito da ADA e NICE si
è considerato come cut-off di buon controllo del diabete
il valore di 53 mmol/mol. Sono stati estratti i dati dal
2002 al 2012 dei dosaggi delle emoglobine glicate eseguiti
presso il Laboratorio di Iseo. Ognuno dei 127907 risultati
ottenuti ed elaborabili in modo anonimo per paziente è
stato classificato secondo il grado di coerenza alle linee
guida, ottenendo una suddivisione in richiesta corretta o
anticipata (sovra-richiesta) o in ritardo (sotto-richiesta). Si
è così ricavato che il 57,8% delle richieste è stata eseguita
in tempi corretti (34,8% diabete non sotto controllo e
23,0% in controllo), il 22,7% in anticipo (media 99,6
giorni), il 19,5% in ritardo (media 370 giorni). Non sono
state osservate differenze significative rispetto al sesso
o all'età (cut-off 40 anni). Risultati diversi sono stati
riscontrati tra medici di base e specialisti. Applicando
una tolleranza di 14 giorni ai tempi d'esecuzione, si
ricava che il 65,0% delle richieste è stata eseguita nei
tempi corretti (38,9% diabete non sotto controllo e 26,1%
in controllo); il 19,6% in anticipo, il 15,4% in ritardo.
Il risultato del 42,2% delle richieste effettuate in tempi
non adeguati (35,0% se corretto per tolleranza) permette
di affermare che esiste un margine di miglioramento
nella gestione del paziente diabetico, in particolare
per garantire un'efficace valutazione del controllo della
patologia. Sarebbe quindi opportuno attivare un progetto
di informazione e sensibilizzazione dei medici affinché le
richieste siano maggiormente coerenti alle linee guida.
American Diabetes Association. Standards of medical
care in diabetes: 2012. Diabetes Care 2012;35(Suppl 1):
S11-63.
Background: Glycated hemoglobin (HbA1c) is a
biomarker for monitoring long-term glycemic status in
diabetic patients. Capillarys 2 Flex Piercing is a capillary
electrophoresis (CE) system produced by Sebia; the
Capillarys HbA1c kit is designed (according to IFCC
recommendations) for separating and quantifying HbA1c
on the above-mentioned analyzer and, due to the
enhanced resolution, is able to detect hemoglobin
variants. Aim of this study was to assess the analytical
performance of this new method for routinely HbA1c
quantification in diabetic patients, including uremic and
carriers of inherited hemoglobin disorders. A method
comparison was therefore performed on 535 blood
samples correlating results with those obtained with
our routine method (HPLC Variant II Biorad); the
presence of interfering substances was evaluated with
special attention to fetal hemoglobin (HbF), carbamylated
Hb (cHb) and frequent Hb variants. The interference
of cHb was assessed by incubating blood samples
with different levels of HbA1c (low, medium, high)
with increasing concentrations of sodium cyanate (0.25
mM-0.5mM-1mM-2mM). The effect of HbF concentration
was investigated by mixing adult blood samples (at 3
different HbA1c concentrations) with neonatal blood in
order to obtain different HbF levels in the final pool.
Results: Our results showed a good correlation
with a coefficient r=0.992; Bland-Altman plot showed
that only 28/535 samples (5.2%) were discordant
with differences outside the range mean ±2SD.
HbA1c quantification was accurate and independent
of the presence of hemoglobinopathies and common
hemoglobin interferences. HbA1c detection on CE system
was not affected by HbF percentages in the evaluated
range (up to 15% of HbF) and by cHb up to 9.2%, resulting
from in vitro carbamylation with 2 mM solution of sodium
cyanate.
Conclusions: On the basis of the present results and given
the short time of the analysis and the high throughput, the
use of Capillarys HbA1c kit on Capillarys 2 Flex Piercing is
suitable for routinely glycemic control in diabetic patients.
Urrechaga E. High-resolution HbA(1c) separation
and hemoglobinopathy detection with capillary
electrophoresis. Am J Clin Pathol 2012;138:448-56.
Lab. Analisi P.O. di Iseo - A.O. Chiari (BS)
2
Lab. Analisi P.O. di Chiari - A.O. Chiari (BS)
588
P237
RELATIONSHIP BETWEEN ß-C-TELOPEPTIDES OF
TYPE I COLLAGEN (ß-CTX) AND FASTING PLASMA
GLUCOSE IN AN UNSELECTED POPULATION OF
OUTPATIENTS
1
2
1
M. Montagnana , G. Lippi , E. Danese , G.
1
1
Brocco , G.C. Guidi
1
Sez. di Biochimica Clinica, Dip. di Scienze della Vita e
della Riproduzione, AOUI di Verona
2
U.O. di Diagnostica Ematochimica, Azienda
Ospedaliero-Universitaria di Parma
Background: Although it is conventionally recognized that
bone metabolism is influenced by ambient glucose levels,
controversial information is available on the relationship
between markers of bone turnover and glucose status.
Methods: We performed a retrospective analysis on the
database of our Laboratory Information System to retrieve
results of fasting plasma glucose (FPG) and serum ß-Ctelopeptides of type I collagen (ß-CTX) tests, which were
performed on consecutive outpatients referred by general
practitioners for routine blood testing over the last 2 years.
Results: Cumulative results for FPG and serum ß-CTX
tests were retrieved for 733 outpatients >20 years old.
The mean ß-CTX value of subjects (n=34) with FPG
≥7.0 mmol/L was significantly lower than that of the
euglycaemic (FPG <5.6 mmol/L, n=533) population (0.334
ng/mL, 95%CI: 0.068-0.651 ng/mL versus 0.417 ng/mL,
95%CI: 0.118-1.853 ng/mL; p=0.03). Moreover, the mean
ß-CTX value of subjects (n=204) with Impaired Fasting
Glucose (FPG levels 5.6 mmol/L to 6.9 mmol/L) was
significantly lower than that of the euglycaemic population
(0.405 ng/mL, 95%CI: 0.114-0.850 versus 0.417 ng/
mL, 95%CI: 0.118-1.853 ng/mL; p=0.01). A negative
significant correlation (Spearman’s test) was observed
between ß-CTX and FPG (r=-0.10, p=0.007).
Conclusions: Results of our retrospective analysis on an
unselected population of outpatients are consistent with
the hypothesis that bone turnover, as reflected by serum
ß-CTX values, might be somehow down regulated in
hyperglycaemic subjects.
590
P238
STUDIO CROSS-OVER RANDOMIZZATO, IN DOPPIO
CIECO, CON PLACEBO PER VALUTARE L’EFFETTO
DELL’ACIDO α-LIPOICO COME INTEGRATORE
ALIMENTARE SULL’OMEOSTASI DEL GLUCOSIO
NEI PAZIENTI CON DIABETE DI TIPO 2
1
1
2
1
R. Testa , M. Boemi , R. Festa , M. Cucchi , A.
3
1
4
4
Ceriello , A.R. Bonfigli , F. Busco , R. Galeazzi , A.
4
Marsiali
1
INRCA, Ancona
2
Dip. Scienze Cliniche e Molecolari, Università
Politecnica delle Marche
3
August Pi Sunyer Institute of Biomedical Investigations,
Spain
4
Laboratorio Analisi, INRCA, Ancona
Scopo: L’acido alfa-lipoico (ALA), composto antiossidante
che ricopre un ruolo chiave nel metabolismo energetico
cellulare, ha molte potenziali applicazioni per vari
aspetti della patologia del diabete contribuendo alla
normalizzazione del livello di glucosio nel sangue.
Obiettivo primario di questo studio è stato quello di
investigare l’effetto della somministrazione di ALA come
integratore alimentare sull’omeostasi del glucosio nei
pazienti con diabete di tipo 2 in terapia combinata con
metformina-sulfaniluree.
Metodologia: Sono stati studiati 34 pazienti (età media
66.7±4.3 anni) con diabete di tipo 2. Lo studio presentava
il seguente schema: studio cross-over, randomizzato,
in doppio cieco. I pazienti sono stati randomizzati in
due gruppi: il primo gruppo (n=17) è stato trattato con
ALA, 1 compressa da 600 mg/die, per 30 giorni, il
secondo gruppo (n=17) è stato trattato con 1 compressa
di placebo/die, per 30 giorni. Al termine del primo periodo
di trattamento è seguito un periodo di 15 giorni di washout e quindi il cross-over e la seconda fase di trattamento,
sempre di 30 giorni, in cui i pazienti appartenenti ai due
bracci sono stati incrociati per le loro rispettive terapie.
Risultati: Nessuna differenza statisticamente significativa
è stata trovata per la variabile KITT (indice K
del test di tolleranza all’insulina) e per l’indice
HOMA-IR dopo trattamento, evidenziando che l’ALA
non ha determinato variazioni significative dell’insulino
resistenza. Al contrario, la concentrazione della glicemia a
digiuno dopo trattamento con ALA era significativamente
più bassa rispetto ai valori dopo trattamento con placebo
(p=0.008). Differenze significative sono state trovate
anche per l’Insulina a digiuno (p=0.011), il C-peptide
(p=0.038), e il GLP-1 (p=0.016).
Conclusioni: La somministrazione orale di ALA in pazienti
diabetici di tipo 2 trattati con metformina e sulfaniluree
comporta dei miglioramenti sull’omeostasi del glucosio
probabilmente mediati da un effetto “incretinico” sulla
produzione del GLP-1.
Ceriello A, Motz E. Is oxidative stress the pathogenic
mechanism underlying insulin resistance, diabetes, and
cardiovascular disease? The common soil hypothesis
revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:816-23.
P239
TERAPIA COMBINATA NEL TRATTAMENTO DEL
DIABETE MELLITO TIPO II: ATTIVITA’ FISICA E
PROGRAMMA DIETETICO CONTROLLATO
1
2
P240
THE INTEGRATED MANAGEMENT OF THE
DIABETIC PATIENT "COLLABORATION BETWEEN
BLOOD DRAWING CENTER AND THE GENERAL
PRACTICE DOCTORS OF THE DISTRICT"
3
G. Mattera , M. Di Meglio , L. Mattera , A.
1
1
Castagliuolo , M.C. Stanziola
A.M. Basile, C. Mastrorocco, S. Lenoci
1
Centro Prelievi Lab. di Patologia Clinica Osp. Miulli,
Acquaviva delle Fonti, Bari
U.O. Patologia Clinica , Osp. A.Rizzoli, Lacco Ameno Ischia (Na)
2
Università di Napoli "Parthenope", Scienze delle attività
motorie preventive ed adattative
3
M.G., Ischia (Na)
Il diabete mellito di tipo II mostra un trend in ascesa in
termini di morbidita’ e mortalita’ anche per la mancanza
di programmi terapeutici ed educazionali standardizzati.
Sebbene i presidi terapeutici medici attuali determinano
generalmente un buon controllo dei livelli glicemici
ematici, la progressione e l’impegno multi organico
restano tuttavia immodificati nella storia naturale di
malattia. L’obesita’ e le abitudini sedentarie favoriscono
una scarsa “compliance” ed una difficile attuazione dei
programmi di training proposti. E’ stato condotto uno
studio pilota in 18 pazienti (50-70 anni), affetti da diabete
mellito tipo II da almeno 10 anni in trattamento regolare
con antidiabetici orali in scarso compenso glicemico,
valutato mediante dosaggi di HbA1c (media 8.63%)
suddivisi in 3 gruppi di sei persone e per un periodo
di 12 settimane. Un primo gruppo è stato sottoposto
esclusivamente ad un programma di attività fisica prima
di modica intensita’ e poi aerobica fino al raggiungimento
dello steady state. Un secondo gruppo di pazienti è stato
sottoposto ad attività fisica e ad un piano alimentare con
dieta ricca in fibre ed apporto calorico di circa 1500 kcal/
die. Un terzo gruppo era di controllo. La determinazione
dei livelli di HbA1c veniva eseguita al T0 e dopo 3 mesi. Il
gruppo di soggetti sottoposto sia ad un regime alimentare
controllato che ad esercizio fisico adeguato mostrava,
dopo 12 settimane, una riduzione dei livelli di HbA1c
statisticamente significativa rispetto ai valori basali di circa
1.1% (p < 0.01) ed una migliore endurance sia in termini
di resistenza fisica che di aderenza al trattamento. Questo
studio pilota ha evidenziato come il trattamento combinato
che prevede un’attivita’ fisica moderata ed un programma
alimentare possa determinare:
- risposte favorevoli in particolare sul controllo della
glicemia;
- migliore performance dei pazienti diabetici sia in termini
di resistenza che di adeguamento al trattamento non
farmacologico;
- identificare i pazienti responder scegliendo programmi di
attività fisica personalizzati.
Introduction: Diabetes takes the sixth place among the
most common chronic diseases in Italy, with an increasing
trend in recent years. Apulia confirms this trend with
an increase from 5.4% in 2003 to 6.5% in 2008. The
blood drawing center in Miulli Hospital participates in
the Regional Project "Development of taking care of
the diabetic patient to reduce the risk of complications"
through an active collaboration between Hospital and
General Practitioners (GPs).
Objectives: Reporting on an "acceptable" range, through
a careful and constant monitoring, the following
parameters: blood pressure, glycated hemoglobin, BMI,
total cholesterol, HDL, LDL, creatinine, micro albuminuria,
GFR.
Methods: In the first three months of 2012, 158 diabetic
patients were subjected to blood tests: (glycosylated
hemoglobin, total cholesterol, HDL, LDL, creatinine,
microalbuminuria). The data contained in a database were
sent to GPs.
Results: 97.9% of patients have type 2 diabetes, the
remaining have type 1, aged 68.7 ± 12.0 years, disease
duration 11.1 ± 7.5 years, BMI 28.6 ± 5.1 kg/m².
Insulin dependent patients are 12%, patients receiving
hypoglycemic 83%, 5% no therapy. Glycosylated Hb <48
mmol/mol -37% (53-98 mmol/mol) - 57% (100-113 mmol/
mol) -6%, total cholesterol >200 mg/dL -36%, HDL >96
mg/dL -1%; LDL (130-159 mg/dL) -27%, (160-189 mg/
dL) -9%; creatinine >1,30 mg/dL -3.9%; microalbuminuria
>30.0 mg/L -23%; GFR <90 mL/min/1.73 m² -0.8%.
Conclusions: The project is in the initial phase. The first
results say diabetic patients assisted by GPs show a fair
compensation glyco-metabolic. Italian data show that the
synergy between the expert assistance of the structures
of diabetes and General Medicine reduces up to 65% of
hospitalization of diabetic patients, recovery up to 25%
and triples the likelihood that the patient is monitored
according to the guidelines.
591
P241
VALUTAZIONE DEL SISTEMA HPLC “HA-8180V”
PER LA DETERMINAZIONE DELL’EMOGLOBINA
GLICATA
P242
VALUTAZIONE DELLE PERFORMANCE DI
GLUCOMETRI IN USO PRESSO L’ASUR MARCHE
AREA VASTA 2, SEDE SENIGALLIA
C. Villa, G. Scarsi
S. Barocci , M. Vidali , L. Petrolati , A. Tarsi , M.
1
1
3
3
3
Mecozzi , G. Carta , G. Tinti , S. Rilli , S. Manfrini
Laboratorio Analisi A.O. "S. Antonio Abate" Gallarate
L’utilità della determinazione dell'emoglobina glicata
(HbA1c) nel mantenimento del controllo glico-metabolico
su pazienti con diabete mellito è ampiamente
documentata in letteratura. In questi ultimi anni, per
migliorare le performances analitiche del test, IFCC ha
prodotto uno standard internazionale sul quale calibrare i
sistemi in uso; inoltre sono state redatte raccomandazioni
riguardanti la determinazione di HbA1c, l’espressione dei
risultati e l’errore analitico totale massimo accettabile.
Scopo del lavoro è la valutazione dello strumento ADAMS
A1C HA-8180V, distribuito da Menarini S.p.a., sia per gli
aspetti analitici che gestionali. Imprecisione nella serie:
sono stati analizzati campioni con HbA1c bassa, normale,
border line ed alta; ogni campione è stato ripetuto 20 volte
i risultati sono: basso: media 25,78 mmol/mol c.v. 0,72%,
normale: media 38,33 mmol/mol c.v. 0,25%, borderline:
media 49.97 mmol/mol c.v. 0,22%, alto: media 106,9
mmol/mol c.v. 0,24%. Imprecisione tra serie: sono stati
analizzati per 15 giorni due controlli (Glyco Hb control)
con valori di HbA1c normale e patologico. I risultati sono:
low: media 41,47 mmol/mol c.v. 1,12%, high: media 96,87
mmol/mol c.v. 0,92%. Confronto: HA-8180V vs Variant II;
è stata determinata l’HbA1c di 329 soggetti (293 diabetici
e 36 non diabetici) sugli strumenti HA-8180V e Variant
II (Bio-Rad). La retta di regressione ha una pendenza
di 0,9965 con intercetta di 0,7539 e un coefficiente di
correlazione r di 0,995. Lo strumento in prova risponde
alle raccomandazioni proposte. L’imprecisione è molto
contenuta in un ampio range di concentrazioni sia nella
serie che tra serie; inoltre l’impiego di calibratori allineati
allo standard IFCC ha ridotto l’inesattezza della misura
come dimostra il confronto effettuato con un altro sistema
analitico. Si apprezzano anche la semplicità operativa e
l’alta cadenza analitica.
592
1
2
1
1
1
ASUR MARCHE AV2, U.O. Patologia Clinica,
Senigallia (AN)
2
Dipartimento di Scienze Mediche, Università Amedeo
Avogadro del Piemonte dell'Est e Unità di Chimica
Clinica dell'Ospedale Maggiore della Carità, Novara
3
ASUR MARCHE AV2, Centro Antidiabetico, Senigallia
(AN)
Obiettivi: Gli strumenti portatili per la determinazione
rapida della glicemia su sangue capillare (glucometri)
sono indispensabili per l’autocontrollo glicemico del
paziente. L'obiettivo del presente studio è la valutazione
delle performance dei glucometri in dotazione presso il
Presidio Ospedaliero di Senigallia.
Metodologia: Sono stati selezionati, come popolazione di
studio, n. 50 pazienti del Centro Antidiabetico del Presidio
Ospedaliero di Senigallia, che sono stati sottoposti
nello stesso tempo a prelievo ematico e puntura con
lancetta per la determinazione diretta della glicemia
con glucometro. Sono stati considerati nello studio
n. 6 glucometri delle aziende Sanofi-Aventis, Bayer,
Roche, Lifescan e due della Menarini, posti a confronto
con il sistema Vitros 5600 (Ortho-Clinical Diagnostics),
utilizzato come metodo di riferimento. Questo strumento
permette anche la determinazione dell’idoneità del
campione (presenza di emolisi o meno). Sui dati ottenuti
dai sei glucometri, rispetto al metodo di riferimento, sono
state eseguite le analisi di regressione non parametrica di
Passing-Bablok e quella di Bland-Altman.
Risultati: L’analisi di Passing-Bablok ha evidenziato un
errore sistematico costante nei reflettometri n. 1 (intercetta
12,8; LL95% 3,38-UL95% 21,31), n. 3 (intercetta 20,16;
LL95% 6,63-UL95% 30,40) e n. 6 (intercetta 13,6; LL95%
4,69-UL95% 22,57), che potrebbe essere dovuto alla
differente matrice utilizzata (sangue intero vs siero),
effetto che invece non è rilevante nei glucometri n. 2, n. 4
e n. 5. L’analisi di Bland-Altman ha evidenziato una buona
performance di tutti i glucometri. Tutti hanno un valore
negativo della media delle differenze, rispetto al saggio
di riferimento, ad indicare che tutti i sistemi sovrastimano.
I glucometri che hanno le migliori performance, secondo
l’analisi di regressione, sono il n. 2 ed il n. 5, sebbene
l’analisi di Bland-Altman abbia evidenziato che il primo,
il secondo, il quinto ed il sesto sono caratterizzati
da errore proporzionale all’aumentare dei valori della
glicemia. La sovrastima massima dei glucometri (media
delle differenze fra metodo di riferimento e glucometro) è
risultata essere quella del 4 (16,37 mg/dL).
P245
CRP ED EMOCROMO IN POCT: VALUTAZIONE
ANALITICA DEL METODO MICROSEMI CRP-HORIBA
L. Varraso, R. Lovero, E. Mascolo, A. Mileti, I.
Specchia, E. Cleopazzo, F. Di Serio
P246
FUNZIONALITA’ OPERATIVA E PERFORMANCE
ANALITICHE DI EMOGAS ANALIZZATORI A
CARTUCCIA E DI SISTEMI ANALITICI TRADIZIONALI
IN UN REPARTO DI TERAPIA INTENSIVA
1
U.O.C. Patologia Clinica I Azienda Ospedaliera
Policlinico Bari
Il dosaggio della CRP e la valutazione dell’emocromo
sono eseguiti di routine anche nei reparti di neonatologia:
la peculiarità dei piccoli pazienti, spesso prematuri, pone
delle criticità legate alla difficoltà della raccolta del
campione ematico.
Scopo: Valutare l’accuratezza del metodo Microsemi CRP
(HORIBA) quale POCT per la determinazione della CRP
e dell’emocromo su campione da capillare.
Materiali e metodi: Tre livelli di controllo (HORIBA) sono
stati utilizzati per la valutazione della precisione. La CRP
e l’emocromo di 50 pazienti neonati, sono stati determinati
sull’analizzatore HORIBA e i dati confrontati con quelli
misurati nei rispettivi campioni di siero (Dimension Vista;
CRP = 3-210 mg/L) e di sangue-EDTA ( ADVIA 2120). I
dati sono stati valutati con la regressione di Passing and
Bablok e l’analisi di Bland and Altman.
Risultati: Valutazione della CRP. Lo studio di precisione
mostrava CVs% compresi tra 0.80 e 3.6. Lo studio di
comparazione con il metodo Vista evidenziava i seguenti
risultati: y = 1.09 (95% CI, da -0.28 a 2.97) + 0.98
(95% CI, da 0.91 a 1.04) x; bias assoluto = -0.91 mg/
L (95% CI = -5.52 a 3.69). Valutazione dei parametri
emocromocitometrici. WBC: CVs% da 0.5 a 2.5; bias
assoluto = -0.54 (95% CI -0.79 a -0,19). RBC: CVs% da
0.5 a 1.0; bias assoluto = -0.27 (95% CI -0.22 a -0.13).
PLT: CVs% da 2.4 a 2.9; bias assoluto = -6.84 (95% CI
-12.92 a 1.54). HB: CVs% da 0.27 a 0.83; bias assoluto =
0.033 (95% CI -0.045 a 0.12).
Conclusione: I dati preliminari mostrano che il metodo
Microsemi CRP fornisce risultati riproducibili. La presenza
di un bias non statisticamente significativo per CRP,
HB e PLT non pone rischi di interpretazione rispetto
ai risultati ottenuti in laboratorio. La semplicità d’uso e
la possibilità di misurare su capillare contestualmente
CRP ed emocromo, suggeriscono che l’analizzatore
Microsemi CRP può essere utilizzato quale POCT in
reparti particolarmente critici quale la neonatologia.
594
1
2
1
S. Salti , S. Rapi , M. Bonizzoli , F. Veroni , A.
2
1
2
Peris , A. Ognibene , P. Dammiano
1
Laboratorio Centrale, Dipartimento di Laboratorio
A.O.U. Careggi Firenze
2
Unità Terapia Intensiva, A.O.U. Careggi Firenze
Introduzione: Le linee guida sul Risk managements
(EP23-A) introducono l’uso di standard interni per il
controllo della strumentazione rendendo i sistemi analitici
a cartuccia un opzione pienamente praticabile. In questo
studio un sistema a cartuccia (GEM 400 IL) è stato
affiancato alla strumentazione attualmente in uso (ABL
800 Radiometer) allo scopo di verificare le performance
diagnostiche e l’impatto dei 2 sistemi nel flusso di lavoro.
Materiali e metodi: Lo studio è stato condotto presso
un reparto di terapia intensive con 10 letti (circa
3000 emogas/mese). I 26 infermieri sono stati invitati
ad eseguire gli emogas su entrambi i sistemi ed a
registrare gli eventi significativi (codificati come: ritardi
>5’, ritardi < 5’, errori di campionamento, errori analitici).
Le registrazioni degli operatori sono state integrate con i
system log strumentali. Le performance dei test principali
(pH, Hb, Hct, PO2, PCO2, K, Na, Cl, Ca2+, Glu, TBil,
Lattato) sono state valutate mediante regressione lineare
ed analisi di Bland Altman.
Risultati: Sono stati analizzati 2784 campioni sull’ABL;
1205 sul GEM e 1157 su entrambi i sistemi. I principali
blocchi operativi sono risultati 214 flag (7.7%) su ABL e
83 problemi di campionamento, (6.9%) sul GEM. Sono
state raccolte 264 segnalazioni; 89 (33.7%) riguardavano
l’ABL (28% ritardi < 5 min, 16% ritardi > 5 min, 4
errori campionamento, 46 flag analitici) e 175 (66.3%)
il GEM (50% ritardi < 5 min, 13% ritardi > 5 min, 35%
errori campionamento e 3 flag analitici). Le performance
analitiche sono state studiate su 1002 campioni. I
coefficienti angolari dei test sono risultati compresi tra
0.92 ed 1.047, l’intercetta tra -3.14 e 5.21 ed i coefficienti
di correlazione di Pearson tra 0.92 e 0.996. Un Errore
totale di -38.8% è stato trovato per la bilirubina totale
mentre per gli altri analiti gli errori totali sono risultati <4%.
Discussione: Lo studio conferma la buona correlazione
esistente tra i 2 sistemi. Si evidenzia la maggiore
disponibilità del sistema aperto e la strategia più
‘garantista’ in fase di refertazione dei sistemi a
cartuccia. Indipendente dal sistema analitico utilizzato
resta l’importanza di una revisione dei risultati analitici
prima del loro utilizzo nella pratica clinica
P247
IL LABORATORIO NELLA DIAGNOSI DI DIABETE
MELLITO: CONFRONTO TRA DUE SISTEMI DI
DOSAGGIO DEL GLUCOSIO EMATICO IN POCT
P248
POINT OF CARE TESTING E SUA INTEGRAZIONE
NEL LIS: VALUTAZIONE DELLE NON CONFORMITÀ
UN ANNO DOPO
M.A. Isgrò, R. Morelli, L. Colacicco, C. Zuppi, D.
Scribano
L. Varraso, R. Lovero, I. Speccia, F. Di Serio
Dip. Medicina di Laboratorio, Cattedra di Biochimica
Clinica e Biologia Molecolare Clinica, U.O.C. Analisi 1,
Pol." A. Gemelli", Università Cattolica del Sacro Cuore,
Roma
Introduzione: L’utilizzo dei glucometri nelle strutture
ospedaliere è una sfida organizzativa per il laboratorio che
deve scegliere la strumentazione analitica, addestrare
il personale infermieristico e soprattutto assicurare la
qualità dei risultati con un costante CQI. Data l’importanza
che ha la determinazione seriata della glicemia nel
monitoraggio della terapia antidiabetica, abbiamo valutato
l’accuratezza di due sistemi di dosaggio in Point-of-Care
Testing (POCT) del glucosio ematico: StatStrip Xpress
(Menarini) e Breeze®2 (Bayer) in uso presso il nostro
policlinico.
Materiali e metodi: Sono stati arruolati 148 pazienti
afferenti presso la nostra struttura ospedaliera per
una valutazione dello stato glico-metabolico. A ciascun
paziente è stata determinata la glicemia da sangue intero
sugli strumenti StatStrip Xpress e Breeze®2 e da plasma
fluorurato con esochinasi (Roche/Hitachi Cobas 8000).
Sono stati calcolati i valori di media, D.S. e CV intraed inter-assay dei controlli ed analizzati statisticamente i
risultati delle determinazioni.
Risultati e conclusioni: I valori di media e CV intraed inter-assay dei controlli hanno confermato il corretto
funzionamento dei glucometri. Entrambi gli strumenti
mostrano una buona correlazione rispetto al sistema
2
di riferimento (R = 0.9459 e 0.9420, rispettivamente).
Tuttavia l’analisi mediante plot di Bland-Altman ha rivelato
una maggiore sovrastima del sistema StatStrip Xpress
rispetto al sistema Breeze®2 (13.73 mg/dL vs. 4.57
mg/dL, rispettivamente); l’entità della sovrastima per il
sistema Breeze®2 tende a ridursi per valori elevati di
glicemia (>150 mg/dL). Entrambi i sistemi si presentano
come strumentazioni affidabili, di facile comprensione ed
utilizzo e sicuri in quanto dotati di espulsione automatica
della striscia reattiva dopo l’utilizzo. Inoltre, il sistema
Breeze®2 è in grado di aspirare il campione di sangue
tramite sistema capillare. Tuttavia soltanto lo StatStrip
Xpress ha a disposizione un sistema di connettività in
rete (StatStrip Connectivity meter), imprescindibile dalla
gestione del POCT nell’ambito del laboratorio, facilitando
le fasi di riorganizzazione che passano attraverso il
processo di consolidamento e decentralizzazione degli
esami.
U. O. Patologia Clinica I Azienda Ospedaliero
Universitaria Policlinico Bari
Scopo: Nei 12 mesi che hanno fatto seguito
all’interfacciamento dei GEM 4000 al LIS e con
il conseguente avviamento di una nuova modalità
operativa, sono state monitorate tutte le attività
focalizzando l’attenzione su eventuali punti di forza e
punti di debolezza. Un passo avanti rispetto allo status
precedente è stato fatto reclutando una U.O di particolare
criticità, quale il Pronto Soccorso.
Materiali e metodi: Le non conformità (NC) che hanno
determinato il blocco della trasmissione dei dati dai
POCT al LIS sono state valutate e confrontate con
lo stesso trimestre dell’anno precedente (Marzo-Maggio
2011). Le NC sono state classificate in tre classi: esame
programmato ma non eseguito in modalità LIS (classe
I); esame programmato con codice di accettazione errato
(classe II); riutilizzo dello stesso barcode (classe III).
Risultati: Il carico di lavoro nel trimestre 2012 (n. 3081
emogas) evidenziava un incremento del 39,4% rispetto al
periodo precedente (n. 2210 emogas); contestualmente
si registrava un decremento delle NC dal 5.5% al 3.5%.
L’analisi delle NC per singole classi, evidenziava una
diversa distribuzione rispetto al 2011. La NC a più alta
frequenza era quella di classe I: 76% vs 52% nel 2011.
La NC di classe II presentava un significativo decremento:
7% vs 32% nel 2011. La NC di classe III confermava il
dato del 2011: 19%.
Conclusioni: L’inclusione della U.O. di Pronto Soccorso,
a causa dell’iniziale inesperienza da parte degli operatori,
ha mascherato il significativo decremento delle NC
registrate negli altri reparti sottoposti già da un anno
a monitoraggio costante. In contrapposizione a questa
(negativa) evidenza, tuttavia, dobbiamo sottolineare
l’impatto positivo che l’introduzione di questa nuova
modalità di lavoro ha avuto sull’operatività del PS, anche
in rapporto alla collaborazione degli operatori del PS con
il laboratorio. I dati suggeriscono che un reclutamento
graduale dei reparti per l’interfacciamento dei GEM 4000
al LIS, attraverso il sistema GEM Web Plus, unitamente
ad un feedback costante e percorsi di formazione da parte
del laboratorio, consente una progressiva riduzione delle
NC e un miglioramento del flusso operativo, adeguato alle
specifiche esigenze dei reparti.
595
P249
QUALITY ASSESSMENT PROGRAM ON POCT
GLUCOSE METERS ACCUCHECK INFORM
II OPERATED BY CENTRAL LABORATORY:
PERFORMANCE OF DEVICES AND METHOD
RELIABILITY
S. Salti, B. Peruzzi, F. Veroni, S. Rapi
Lab. generale, Dipartimento di Laboratorio, A.O.U.
Careggi Firenze
Background: POCT guidelines require to submit devices
at EQA program or at periodic evaluation of performance
using control material different to normal reference. EQA
program available in Italy for POC glucometer don’t
allow monitoring of more than 20 devices moreover
monitoring of a large number of devices results in a
significant increasing of cost. Aims of the present reports
was to verify performance of devices and reliability and
working time of a quality assessment strategy operated by
Laboratory.
Materials and methods: 2 pool of human serum was
obtained by residual materials from inpatients and tested
for viral infections. Glucose concentration with laboratory
method (ADVIA 2400, Siemens) results: L1=70.3+/-0.02
mg/dL and L2=296+/-0.05 mg/dL (mean and s.d by
8 runs). Both samples were analyzed in two different
days (at least one month of delay) on 50 POCT
devices (Accuchech Inform2. Roche); overall results
were used for analytical performance evaluation. Working
time for sample preparations, delivery and running were
separately registered.
Results: Mean values of all instruments results
L1=80.23+/-1.85 and L2=308.3+/-8.3, bias between
Laboratory and POC device (without reference method)
results L1=6.59% and L2=2.03%. No total error over 15%
were observed in the 200 of collected data; 1 data show
a total error >10%; and 7 samples show a total errors >
5%. Working time results of 15 min for single device for
laboratory and 7+/-5 min for devices for nurses.
Discussion: Overall comparison confirm the good
correlation between POCT an laboratory; a bias >5%
may be expected for low values. Inter-devices variability
and samples with significant standard error results very
low. An accurate evaluation of available instruments may
be performed in hospital starting from laboratory residual
materials; the overall procedure results time consuming
and is not so easy to perform in a hospital spread in many
building. Main difficult are related to samples selections
and delivered. A total amount of 24 working hours for
nurses and 18 hours for laboratory operators results in our
experience.
EN ISO 22870:2006. Point of care testing (POCT) –
Requirements for quality and competence.
596
P250
THE GOVERNANCE PROCESSES OF THE
LABORATORY FOR PERFORMING EXAMINATIONS
OF POCT AT UTAP
1
1
1
1
S. Bedendo , M. Fagiano , N. Braga , D. Zaghi , A.
2
3
1
Menardo , A. Pozzato , A. Camerotto
1
SOC Medicina di Laboratorio, ULSS 18 Rovigo
UTAP "Medici piu'" Lendinara, ULSS 18 Rovigo
3
SOC Ostetricia e Ginecologia, ULSS 18 Rovigo
2
Objective: The UTAP (Territorial Unit of Primary Care)
clinics are general practitioners associated with the
purpose of providing assistance to patients, integrated
with the hospital. In the area of ULSS 18, there
are two active UTAP locations. Describe the process
management of POCT tests performed at the UTAP to
ensure tests with TAT and adequate quality standards to
improve clinical decision making.
Methodology: The choice of instrumentation was carried
out considering as priority areas:
- impact in the organizational process POCT: simplicity
and ease of use by operators;
- specifications of instrumentation and reagents:
instrumental analytical quality, storage conditions and
expiry date of reagents.
Our tools and equipment are inventoried as the SOC
Laboratory Medicine; reagents order to the companies is
provided by a Technical Coordinator of the Laboratory and
codified in cost centers. The instruments are connected by
a HL7 standard network management software (Net Care,
Menarini) to the Laboratory for the purpose of a real-time
governance (QC, monitoring results).
Results: We have defined the administrative procedures
for acceptance of patients, the management procedures
throughtout the analytical process and in particular:
traceability of the sample, values of clinical alerting,
management and quality assurance of analytical
instrumentation. Roles - With specific management
procedures have been defined roles and responsibilities
for the various operators involved in the process: UTAP
operator (doctor or nurse), nursing POCT Manager,
Technical Manager of the Laboratory POCT, POCT
Manager computer, UTAP Medical Director, Laboratory
Supervisor. Responsibility - Director of Laboratory
Medicine: responsibility of the acquisition of equipment,
software and materials, the results of tests performed in
the manner provided. General Practitioners: responsibility
of clinical use of the results. UTAP operators: they are not
accountable for results, but the respect of the timely and
correct procedures.
Conclusions: The laboratory governance of processes
POCT UTAP is a necessary foundation to ensure proper
management efficiency and analytical quality.
SiBioC Documents. Recommendations for the
implementation and management of the POCT. Biochim
Clin 2011;35:242-52.
P251
ASSESSING 25-HYDROXYVITAMIN D NUTRITIONAL
STATUS IN THE NORTH-WESTERN ITALY
P252
PROTEOMICS OF ARTICULAR OSTEOARTHRITIC
CHONDROCYTES EXPOSED TO
ELECTROMAGNETIC FIELDS
M. Vidali, G. Bellomo, M. Basile
3
Dept. of Health Sciences, University “Amedeo Avogadro”
of East Piedmont, and Clinical Chemistry Unit, Maggiore
della Carità Hospital, Novara, Italy
Introduction: Many studies have recently reported on
the widespread prevalence of deficiency/insufficiency of
vitamin D across European countries, particularly in
the elderly and adolescents. However, the variation in
vitamin D status both between as well within countries
is very high. Most of the published studies on vitamin
D levels in Italy have been performed in specific ageor disease- subgroups; however, few data are available
on the nutritional status of vitamin D in the adult general
population. We report on vitamin D levels evaluated with
a single analytical method in a large sample of adults from
North-Western Italy. Association with age, sex and season
was also evaluated.
Materials and methods: 13110 cases (24% males, 76%
females; median age 67y, IQR 56-77) were collected in
the North-Eastern of Piedmont (North-Western Italy) and
25-OH-vitamin D levels were measured by Liaison® 25
OH Vitamin D total (DiaSorin) test.
Results: Median total vitamin D level was 19.9 ng/mL,
IQR 11.2-28.8, with up to 3592 (27.4%) and 10185 out
of 13110 (77.7%) respectively below 12 and 30 ng/mL.
Vitamin D levels were significantly higher in women than
men (20.5 vs 18.1 ng/mL; p<0.0005), in summer than in
winter (21.4 vs 18.5 ng/mL; p<0.0005), and in the ≤45y or
46-64y than in the ≥65y subgroup (20.3 and 21.3 vs 18.8
ng/mL). Lowest vitamin D levels were displayed in winter
by men aged ≥65y (14.7 ng/mL, IQR 8.1-23.1) and 46-64y
(16.8 ng/mL, IQR 10.3-24.7). In comparison, women of
the same age subgroups displayed considerably higher
values (women aged ≥65y: median 18.2 ng/mL, IQR
8.7-27.9; women aged 46-64y: median 20.6 ng/mL,
IQR 12.7-28.2). Multivariate analysis confirmed that age
(p<0.0005), sex (p=0.002), season (p<0.0005) and their
interaction (p=0.034) were independently associated to
vitamin D concentrations.
Conclusions: This study suggests that the majority of adult
Italian population living in the North-Western Italy is at risk
to develop serious bone diseases. However, these data
must be interpreted with caution if considering the lack of
standardization of vitamin D assays.
1
1
4
D. Vannoni , C. Corallo , G. Landi , A. Albanese , E.
4
1
3
2
Battisti , S. Giglioni , R. Leoncini , C. Scapellato
1
Dep.Internal Medicine, Endocrine-Metabolic Sciences
and Biochemistry, University of Siena, Italy
2
U.O.C. Clinical Pathology, AOUS, Siena, Italy
3
U.O.S Standardizzazione e sviluppo in Biochimica
Clinica, AOUS, Siena Italy
4
TAMMEF Centre, University of Siena, Italy
Objectives: To compare human primary osteoarthritic
chondrocytes submitted to electromagnetic fields (EMFs),
which positively interfere with patients affected by OA, by
a proteomic approach.
Materials and methods: Osteoarthritic chondrocytes,
isolated from the femoral heads of OA patients, were
cultured in vitro and exposed 30 min/day for two weeks to
extremely low frequency electromagnetic field (ELF) with
fixed frequency (100Hz) and to therapeutic application
of musically modulated electromagnetic field (TAMMEF)
with variable frequencies, intensities and waveforms.
Sham exposed (S.E) cells served as control group. Cell
viability was measured at days 2, 7 and 14. After two
weeks of treatments, a proteomic approach, using 2DElectrophoresis and mass spectrometry, was performed.
Results: Cell viability was different in chondrocytes
exposed to ELF and TAMMEF system compared to
S.E. Proteome analysis showed different expression
levels of proteins derived from nucleus, cytoplasm,
and cell organelles, due to the treatments.
Particularly, were identified proteins functionally related
to energetic metabolism (glyceraldeyde-3-phosphate
dehydrogenase), stress response (Mn-superoxide
dismutase, heat shock proteins), cytoskeletal regulation
(actin), proteinase inhibition (cystatin-B) and inflammation
regulatory functions (S100-A10, S100-A11).
Conclusions: EMFs do not cause damage to cultured
chondrocytes, besides stimulate safely OA chondrocytes
and are responsible of different protein expression in
the three groups. Furthermore, protein analysis of OA
chondrocytes treated with ELF and the new TAMMEF
system could be useful to clarify the pathogenetic
mechanisms of OA and to identify biomarkers of the
disease.
Battisti E, Piazza E, Rigato M, et al. Efficacy and safety
of a musically modulated electromagnetic field (TAMMEF)
in patients affected by knee osteoarthritis. Clin Exp
Rheumatol 2004;22:568-72.
597
P255
Aß OLIGOMERS: A NEW CSF BIOMARKER FOR THE
DIAGNOSIS OF ALZHEIMER'S DISEASE
1
1
P256
CONSOLIDAMENTO DI CMV AVIDITY E
MIGLIORAMENTO DEL TAT DURANTE LA
GRAVIDANZA PRESSO L'AUSL MODENA
2
G.M. Sancesario , M. Nuccetelli , M.T. Cencioni , Z.
3
2
3
1
Esposito , G. Borsellino , G. Sancesario , S. Bernardini
S. Tagliavini, D. Carra, M. Varani, P. Natali, A.M. Cenci
1
Corelab - Dipartimento Patologia Clinica - Nuovo
Ospedale Civile San Agostino Estense - AUSL Modena
Dept. of Experimental Medicine and Surgery, Univ. Tor
Vergata, Rome
2
Lab. of Neuroimmunology, Santa Lucia Foundation,
Rome
3
Dept of Systems Medicine, Univ. Tor Vergata, Rome
Aß oligomers are soluble aggregates of a variable number
of Aß monomers and constitute the precursors of insoluble
large fibrils that deposit in amyloid plaques in the brain
of Alzheimer’s disease (AD). The neurotoxic role of Aβ
oligomers in vitro has stimulated an extensive search
for their presence in the cerebrospinal fluid (CSF) of
AD patients. In fact, whereas the insoluble fibrils deposit
in brain tissue, soluble oligomers can diffuse into the
CSF and, if detected in sensitive assays, they would
constitute a useful biomarker for the amyloid pathogenic
cascade. The aim of this study is to investigate whether
measurement Aß oligomers in the CSF could be effective
in the diagnosis of AD aside from Aß42 monomers, total
tau (T-tau), and phosphorilated tau (P-tau). We analyzed
137 CSF using fluorescence resonance energy transfer
(FRET) applied to flow cytometry. Levels of Aß oligomers
are lower in the CSF of probable AD (n = 46) (P< 0.05)
than in patients with other dementia (OD) (n = 35) or
with other neurological disorders (OND) (n = 56). CSF
of AD showed typical T-tau and P-tau increase (P<0.01)
and Aß42 decrease (P<0.01) compared to OD or OND.
In addition, the ratio Aß oligomers/P-tau was lower in
AD than in OD (P<0.01) and OND (P<0.05) patients,
(sensitivity 75%, specificity 64%), whereas the ratio of Aß
oligomers/T-tau was significantly lower in AD compared to
OND (P<0.01) (sensitivity of 78% and a specificity of 71%)
but not to the OD group. Such values were comparable to
sensitivity and specificity yielded by the other biomarkers
alone or in combination. Our study demonstrates that the
levels of Aß oligomers are lower in the CSF of probable AD
than in control patients. Then, by analogy to monomeric,
we could suggest that the oligomeric Aß in the CSF
are decreased because aggregated Aß is deposited in
plaques in the brain. Under our experimental setting,
FRET analysis of the CSF Aß oligomers is as useful as
the other biomarkers in the diagnosis of AD.
Sancesario GM, Cencioni MT, Esposito Z, et al.
The load of amyloid-ß oligomers is decreased in the
cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients. JAD
2012;31:865-78.
Durante i primi mesi della gravidanza una recente
infezione da CMV può causare danni al feto. Per tale
motivo, in positività sia di IgG sia di IgM, è importante
eseguire la determinazione dell’avidità delle IgG, la
quale, crescendo con il tempo, aiuta a dirimere fra
prima infezione e riacutizzazione. Presso il Corelab dell'
AUSL di Modena alle pazienti positive per entrambe
le classi Ig veniva tradizionalmente consigliata la
determinazione dell’avidità CMV-IgG. La paziente si
ripresentava mediamente con una nuova prescrizione
dopo qualche giorno dalla prima determinazione ed il
campione veniva avviato alla conferma presso un altro
centro. Il TAT medio dalla prima determinazione era di due
settimane e, per ridurlo, abbiamo studiato l’introduzione
di un test sugli analizzatori in dotazione al laboratorio, in
grado di determinare l’avidità in completa automazione
entro la giornata. Il metodo adottato (Abbott CMV avidity
su Architect) presenta un CV totale del controllo basso
(media 28%) pari a 12% ed un CV del controllo alto
(media 82%) pari ad 1.6%. Il metodo su Architect presenta
una concordanza del 78% con il metodo precedente
(DSX-Dynex, TechnoGenetics). La maggior parte dei casi
discordanti (15%) riguarda campioni risultati greyzone
con uno dei due metodi. Nello studio di correlazione
il coefficiente di Pearson r=0.72 (C.I.95%=0.53-0.84)
conferma che i risultati, pur essendo in generale accordo,
non sono direttamente correlabili. Nel mese di settembre
2012 sono stati esaminati mediamente 26 +/- 6 campioni/
die, con una incidenza di positività IgM pari al (6+/-3)% .
Di queste ultime, il 5.9% è risultata a bassa avidità.
La tempestività delle risposte, tutte fornite in giornata,
ha contribuito ad una più consona gestione clinica del
paziente, licenziando velocemente il referto definitivo o
avviando il campione ai necessari approfondimenti.
Munro SC, Hall B, Whybin LR, et al. Diagnosis of
and screening for cytomegalovirus infection in pregnant
women. J Clin Microbiol 2005;43:4713-8.
599
P257
DESCRIZIONE DEL PRIMO CASO DI ATASSIA
CEREBELLARE ASSOCIATO AD ANTICORPI ANTI
HU E GANGLIONEUROMA TORACICO
1
2
1
1
P258
DIAGNOSTIC POWER OF 24SHYDROXYCHOLESTEROL IN CEREBROSPINAL
FLUID
1
2
3
4
E. Corsini , R. Fancellu , G. Del Mese , A. Mancano , S.
2
1
1
1
Salvarani , M. Lazzaroni , I. Gabrieletto , G. Bernardi
V. Leoni , A. Solomon , L. Minthon , K. Blennow , M.
2
4
Kivipelto , I. Bjorkhem
1
1
UO Laboratorio Patologia Clinica e Genetica Medica,
Fondazione IRCCS Istituto Neurologico C.Besta Milano
2
SC Neurologia, Ospedale Villa Scassi – ASL3, Genova
Gli anticorpi anti-Hu sono autoanticorpi contro
antigeni onconeurali associati a sindromi neurologiche
paraneoplastiche. Sono diretti contro il nucleo delle cellule
del SNC e dei gangli dorsali e l’antigene bersaglio è una
proteina che lega l’RNA. L’immunofluorescenza indiretta
è il test di screening e l’immunoblot test di conferma.
Anticorpi anti-HU sono più frequentemente associati
a tumore polmonare a piccole cellule in pazienti con
neuropatie periferiche o degenerazione cerebellare ma
sono stati descritti anche in altri tumori. Una donna di 27
anni manifestava dall’età di 19 una atassia progressiva;
l’esame neurologico confermava la patologia cerebellare.
Dall’età di 23 anni la risonanza magnetica mostrava
un’atrofia cerebellare progressiva. I livelli plasmatici di
analiti associati a patologia cerebellare erano normali,
i test genetici erano negativi. Gli anticorpi anti Nucleo
(ANA) erano positivi (1:320) così come gli anticorpi
anti SSB (1+). Si riscontrava una positività anti nucleo
neuronale in immunofluorescenza (1:640) confermata in
immunoblot per antigeni HU ricombinanti, dimostrando
la contemporanea presenza di ANA e anti cervelletto.
Una Tac evidenziava una lesione espansiva nel
mediastino sinistro. In seguito all’asportazione del tumore,
l’esame istologico diagnosticava un Ganglioneuroma.
Sezioni istologiche di tumore della paziente testate in
immunoistochimica con il siero della stessa, risultavano
debolmente positive. Dopo l’intervento, il titolo anticorpale
scendeva a 1:160 dopo 4 mesi ed a 1:80 dopo 8 e 10 mesi.
La sintomatologia cerebellare peggiorava leggermente
dopo l’intervento per poi stabilizzarsi. Questo è il primo
caso finora descritto di associazione di anticorpi anti
Hu e ganglioneuroma, un tumore benigno del gruppo
dei tumori neuroblastici. Tra questi, il neuroblastoma è
stato associato a opsoclono-mioclono-atassia, assente
nella nostra paziente. La mancanza di caratteristiche
istologiche distintive potrebbe spiegare l’associazione di
questo tumore benigno con anticorpi anti-Hu e un’atassia
cerebellare che si è presentata con lento decorso,
simulando una forma degenerativa progressiva.
McKeon
A,
Pittock
SJ.
Paraneoplastic
encephalomyelopathies: pathology and mechanisms.
Acta Neuropathol 2011;122:381-400.
600
Laboratory of Clinical Pathology and Medical Genetics,
AmadeoLab R17, Foundation IRCCS Institute of
Neurology “Carlo Besta”, Milano, Italy
2
Aging Research Center, Karolinska Institutet,
Huddinge, Sweden
3
Clinical Memory Research Unit, Department of Clinical
Sciences, Lund University, Malmö, Sweden
4
Department of Psychiatry and Neurochemistry, Institute
of Neuroscience and Physiology, The Sahlgrenska
Academy, University of Gothenburg, Mölndal, Sweden
Previously we reported that 67% of patients with
Alzheimer´s disease (AD) and 50% of patients with
mild cognitive impairment (MCI) had increased levels
of the oxysterol 24S-hydroxycholesterol (24OH) in
cerebrospinal fluid (CSF). In the same populations an ADlike biomarkers pattern (increased Tau, P-tau and reduced
#-Amyloid (Ab42)) were found at similar frequency (AD)
or lower frequency (MCI). In the present work we
investigated 5 groups of patients at our memory clinic:
healthy volunteers who did not later develop cognitive
problems (n=26), subjects with subjective cognitive
impairment (n=33), patients with MCI (n=27), patients with
MCI with a later progression into AD at follow up (n=10)
and patients with AD (n=24). We calculated the fraction
of positive or negative tests for each subgroup of patients
with use of previously published cut-off levels for 24OH,
Tau, P-tau and A#42. The fraction of the population with
pathological levels of 24OH was 4% in the controls, 34%
in SCI, 37% in MCI stable, 80% in MCI progressive and
42% in AD. The corresponding figures for Tau, P-tau and
A#42 were lower in the case of SCI and MCI stable but
higher in the case of controls and AD. In case of MCI
progressive the fraction of pathological levels of 24OH and
Ab42 were the highest, 80% and 63% respectively. The
diagnostic power of 24OH in CSF seems to be similar
to or lower than that of the established biomarkers Tau,
P-tau and A#42 in the diagnosis of established AD. The
lower frequency of pathological levels of 24OH in CSF in
patients with established AD may be due to a reduced
number of dying neuronal cells releasing the oxysterol
at a late stage of the disease. The high proportion of
pathological levels of 24OH in SCI and stable MCI is of
interest and suggest that 24OH may be more sensitive
than the classical biomarkers in an early phase of the
neurodegenerative process.
Leoni V, Caccia C. Oxysterols as biomarkers
in neurodegenerative diseases. Chem Phys Lipids
2011;164:515-24.
P261
IL DOSAGGIO DEI MARCATORI TUMORALI SU
LIQUOR CON ARCHITECT PLUS ABBOTT
P262
INFORMATIZZAZIONE DI LABORATORIO DEL
RISCHIO NEFROLITIASICO
M. Lazzaroni, E. Corsini, S. Diciocia, A. Porini, G.
Bernardi
G. Cangiano , A. Latte , E. Di Maina , G. Buccino , C.
1
1
1
Taranto , A. Garofalo , M.M. D'Ambrosio , M.
3
1
D'Amora , A. Sarappa
U.O. Patologia Clinica e Genetica Medica, Istituto
Neurologico "C. Besta", Milano
1
2
1
1
1
Il dosaggio dei marcatori tumorali su liquor è
importante nella diagnosi e nel monitoraggio di tumori
primitivi o metastatici del sistema nervoso centrale. Le
carcinomatosi meningee sono particolarmente frequenti
ed in costante aumento: i referti autoptici documentano
oggi carcinomatosi meningee nel 5-8% dei casi di tumore
esaminati. L’esame citologico è l’esame di elezione,
con limitazioni date dall’estrema fragilità delle cellule
tumorali liquorali e dalla necessità di personale qualificato.
Recentemente sono comparse in letteratura diverse
proposte per la ricerca di marcatori tumorali su liquor.
In caso di carcinomatosi meningee si trovano nel liquor
concentrazioni elevate di CEA e dei marcatori mucinici
Ca19.9 Ca125 Ca15.3; alfa-fetoproteina e beta-HCG
si elevano in presenza di tumori germinali cerebrali.
Abbiamo utilizzato l’analizzatore automatico Architect
Plus Abbott per valutarne un possibile utilizzo clinico
nel dosaggio dei marcatori tumorali su liquor. Per prima
cosa abbiamo verificato l’assenza di segnale di fondo
utilizzando 20 liquor di soggetti sicuramente non affetti
da patologia tumorale: i risultati hanno documentato
assenza di effetto matrice e dosaggi inferiori al limite
della sensibilità dei metodi. Abbiamo testato replicati
di diluizioni seriate per verificare la linearità alle basse
concentrazioni e abbiamo inoltre verificato la ripetibilità
intra e interserie. I risultati ottenuti mostrano un’ottima
sensibilità e permettono di fare il dosaggio nei marcatori
nella pratica clinica come documentato dalla concordanza
dei risultati ottenuti su 10 campioni di pazienti con
diagnosi certa. I risultati vanno obbligatoriamente espressi
come presenza o assenza di sintesi intratecale, con
quantificazione della frazione intratecale, particolarmente
utile nel monitoraggio della terapia cui vengono sottoposti
i pazienti.
Corsini E, Bernardi G, Gaviani P, et al. Intrathecal
synthesis of tumor markers is a highly sensitive test in
the diagnosis of leptomeningeal metastasis from solid
cancers. Clin Chem Lab Med 2009;47:874–9.
Kim A, Ji L, Balmaceda C, et al. The prognostic value of
tumor markers in newly diagnosed patients with primary
central nervous system germ cell tumors. Pediatr Blood
Cancer 2008;51:768–73.
602
U.O. Lab. di Patologia Clinica, Osp. dei Pellegrini, ASL
NA 1 Centro Napoli
2
Lab. Patologia Clinica ed Ematologia, Azienda
Ospedaliera apss Trento
3
Direzione Generale, ASL NA 3 Sud
Lo screening metabolico urinario effettuato su pazienti
a rischio nefrolitiasico necessita di raccolte delle 24 ore
(in acido cloridrico e clorexidina) ma anche di dosaggi
praticati su urine estemporanee. L’informatizzazione
presente nel nostro Laboratorio ed i relativi collegamenti
con le strumentazioni biochimiche in uso risultano
abbastanza problematici per tali specifici campioni così
come l’archiviazione, le ricerche e principalmente la
stampa del referto finale. Per tali motivazioni ma anche
per calcolare ed ottenere un foglio finale indicante
le componenti quali/quantitative di un calcolo renale
(dosati con metodi completamente strumentali) si è
creato un programma in Access di facile gestione. Il
data base è costituito da una serie di tabelle (esami,
paziente, reparti, ecc.) facilmente accessibili grazie alla
costruzione di maschere e da diversi report, scaturiti da
opportune relazioni (query) utili alla stampa finale del
referto. L’utilizzo di piccoli programmi (macro) all’interno
dello stesso data base rendono più semplici le ricerche
e la immissione dei dati urinari (dosati su comuni
analizzatori biochimici), delle supersaturazioni, la ricerca
di pazienti, l’inserimento di esami non routinari, di
grafici bitmap, ecc. L’utilizzo di relazioni tra più tabelle
concorreranno alla estrapolazione dei campi anagrafici
e di quelli laboratoristici, questi ultimi opportunamente
elaborati, utili alla creazione del referto finale. Il grafico
di supersaturazione viene opportunamente ritagliato ed
inserito all’interno della maschera esami sotto forma
di immagine bitmap collegata. Rispetto al sistema
informatico presente nel nostro Laboratorio il programma
in Access da noi proposto evidenzia in un unico foglio
di stampa il rischio nefrolitiasico in modo evidente,
conciso e di facile interpretazione. Notevole appare la
possibilità di referto “diretto”, compresa l’immagine, del
calcolo urinario. L’utilizzo della nostra applicazione ridurrà
notevolmente i tempi di risposta quando sarà in grado
di estrapolare anche il grafico di supersaturazione e di
interfacciarsi con gli analizzatori biochimici.
Cangiano G, Russo M, Forte F, et al. Diagnostica
di laboratorio della calcolosi urinaria. Biologi Italiani
2008;8:40-7.
P263
L’ELF-TEST (SIEMENS): L’IMPORTANZA DELLA
VALIDAZIONE CLINICA IN UN LABORATORIO
OSPEDALIERO “DI PROVINCIA”
1
1
1
1
V. De Rienzo , M. Fumi , Y. Pancione , V. Piscopo , S.
1
2
2
2
1
Sale , S. Alessio , M. Talamo , A.S. Megna , V. Rocco
1
UOC Patologia Clinica, A.O.R.N. “G. Rummo” di
Benevento
2
Malattie Infettive, A.O.R.N. “G. Rummo” di Benevento
La stadiazione della fibrosi epatica è fondamentale per
la prognosi e l’orientamento terapeutico: lo sviluppo
di metodi non invasivi, quali biomarkers sierici ed
elastografia transiente, rappresenta un progresso in
epatologia. I marcatori sierici possono essere raggruppati
in due categorie: ”diretti” per la presenza in circolo
di peptidi coinvolti in fibrinogenesi, fibrinolisi o flogosi
e “indiretti” costituiti da una miscela di alterazioni
biochimiche e parametri clinici riscontrati nelle CLDs.
La capacità predittiva di molteplici combinazioni di
questi marcatori è incrementata dalla loro inclusione
in un algoritmo matematico. Scopo del lavoro è stato
testare l’utilità diagnostica del test ELF (Enhanched Liver
Fibrosis), soprattutto nella individuazione dei casi di fibrosi
limitata.
Metodologia: L’ELF combina 3 marcatori sierici diretti: Ac.
Ialuronico, Propeptide amino-terminale del procollagene
di tipo III e Inibitore Tissutale della Metalloproteinasi I.
Lo studio è stato condotto su 3 gruppi di pazienti: 31
donatori sani, 48 soggetti afferiti al servizio di epatologia
per vaghi disturbi digestivi e/o persistente o intermittente
incremento delle transaminasi e 51 soggetti con grave
epatopatia accertata mediante biopsia.
Risultati: Tra i donatori, 26 soggetti presentavano
ELF-t <7.7 (assenza di fibrosi), nei restanti 5 l’ELFt >7.7 (range 7.91-8.55) orientava per presenza di
moderata fibrosi epatica. In questi, con FIBROTEST
ed HEPASCORE negativi, ulteriori indagini (marcatori
indiretti, BMI) evidenziavano: in 1 aumento della GGT, in 3
aumento dell’ BMI (>25), in 1 assenza di altre alterazioni.
Nel II gruppo di pazienti, 28 presentavano valori di ELF
test <7.7, 15 (HCV positivi) mostravano 7.7<ELF-t<9.8
mentre i restanti 5 presentavano ELF-t >9.8. Infine il
III gruppo, costituito da soggetti con grave epatopatia,
presentava ELF-t >9.8.
Conclusioni: I risultati ottenuti dimostrano l’efficacia
dell’ELF test nella individuazione dei casi di severa fibrosi,
ma, sorprendentemente, la possibilità di identificare casi
di sospetta lieve fibrosi in soggetti teoricamente sani
(donatori) e di stratificare quelli che richiedono conferma
bioptica dell’ELF test.
Pinzani M. The ELF panel: a new crystal ball in
hepatology? Gut 2010;59:1165-7.
P264
L’USO DI ALCUNI ALGORITMI DIAGNOSTICI E LA
PRESA IN CARICO DEL RISULTATO PATOLOGICO
NELLE EPATITI VIRALI
E. Tili, G. Forconi, C. Martini, S. Secondini, P. Pauri
U.O. Patologia Clinica Jesi, Area Vasta 2 - ASUR
Marche
Scopo: L’uso di algoritmi diagnostici è una risorsa per
il miglioramento dell’appropriatezza della richiesta e
per dare maggior valore alle professioni che operano
all'interno dei laboratori.
Materiali e metodi: Nella nostra realtà abbiamo introdotto
nel tempo alcuni algoritmi, anche allo scopo di migliorare
la gestione delle risorse sanitarie. In particolare, per
epatite B, in accordo con specialisti ospedalieri e MMG,
in caso di positività per HBsAg, effettuiamo a cascata
tutti i marker di epatite e HBV DNA. Per gli operatori
sanitari nati dopo il 1991 abbiamo introdotto in prima
battuta la ricerca di anticorpi anti-HBs e, solo se negativi,
la ricerca di HBsAg e anti-HBc. Per HCV, l’espressione dei
risultati come sample/cutoff (S/CO) permette di costruire
algoritmi di conferma, in base alla storia clinica ed all’età,
evitando sprechi per test di conferma. Nel caso di soggetti
con sospetta epatite acuta, per evitare il ricorso a test
multipli contemporanei per epatite A, B o C, suggeriamo
in mancanza di fattori di rischio solo la ricerca di IgM antiHAV, HBsAg, anti-HBc IgG (eventualmente IgM). Per il
follow-up delle epatiti croniche HBV o HCV controlliamo
la cadenza di richiesta dei test molecolari per la scelta
e la valutazione dell’efficacia della terapia (HBV DNA,
HCV RNA e HCV genotipo), lavorando in un’ottica di
presa in carico integrata fra Territorio e Ospedale, in cui il
laboratorio svolge un ruolo centrale.
Risultati: Dal database del laboratorio abbiamo estratto i
dati relativi alle richieste dei marcatori delle epatiti virali
giunte nell’anno 2011 e primo semestre 2012. A fronte
di 6851 HBsAg, i test di approfondimento (anti-HBc IgM,
HbeAg, anti-HBeAg) sono stati effettuati solo in 250 casi;
sono stati effettuati 1910 anti-HBs. Il 4,6% dei pazienti è
positivo per anti HCV e di questi il 30% supera i 65 anni
di età, non sottoposti quindi alla ricerca di HCV RNA in
quanto non eleggibili per terapia antivirale.
Discussione: L’analisi dei dati raccolti dimostrano
l’efficacia degli algoritmi diagnostici, accompagnati
dalla presa in carico del paziente, sulla strada
del miglioramento continuo dell’appropriatezza della
richiesta.
603
P266
STUDIO DELLE BANDE OLIGOCLONALI IgG
LIQUORALI IN UN GRUPPO DI PAZIENTI HIV
POSITIVI
P265
SERUM CONCENTRATION DEFICIENCY OF 25OH VITAMIN D IN PATIENTS WITH MYOTONIC
DYSTROPHY TYPE 1
1
2
2
2
M. Morello , C. Terracciano , E. Rastelli , R. Massa , S.
1
2
Bernardini , R. Zenobi
Lab. Analisi Chimico Cliniche A.O. S. Gerardo di Monza
1
Department of Experimental Medicine and Surgery,
Faculty of Medicine, University of Rome Tor Vergata
2
Department of Neurosciences, Faculty of Medicine,
University of Rome Tor Vergata
Introduction: Myotonic Dystrophy type 1 (DM1) is the
most common form of adult onset muscular dystrophy.
DM1 is a multisystemic disorder involving skeletal muscle,
as well as heart, eye, endocrine and central nervous
systems. Distal muscle weakness and myotonia are the
prevalent muscular symptoms. Vitamin D is a regulatory
molecule involved in calcium homeostasis, endocrine
and immune systems. In addition, vitamin D seems to
influence muscle metabolism through stimulation of IGF1
axis. Vitamin D deficiency is a recognized pathological
condition characterized by muscle weakness, rickets or
osteomalacia.
Objective and methods: To assess whether vitamin D
might contribute to DM1 severity, serum levels of vitamin
D (25-OH vitamin D), parathyroid hormone (PTH) and
IGF1 were measured. Sixty-one subjects were enrolled
in this study: 31 patients with adult-onset DM1 (16 premenopausal women and 15 men, mean age 41.6 years)
and 30 age-matched normal controls.
Results: In DM1 patients vitamin D showed a 55%
reduction compared to controls (p<0.01), with a mean
value of 16.3 ng/mL, indicative of vitamin D deficiency.
PTH levels were normal in both groups, while IGF 1
was slight decrease (p<0.05) in DM1 compared to control
patients. Inflammatory parameters (Interleukin-6, TNF-α
and C-reactive protein) were also assayed and did not
show any differences compared to controls. In DM1
patients, Vitamin D reduction is statistically correlated to
cholesterol levels (total and LDL: r = -0.44 and r =-0.37
respectively p<0.05), while no correlations were found
between Vitamin D and other biochemical parameters.
Discussion: The IGF 1 low levels might explain some
of symptoms of DM1 patients and also the decrease of
vitamin D due to IGF 1 action on the epithelial cells;
further, the lack of correlation between vitamin D and PTH
show that in these patients the vitamin D concentrations
don’t alter the PTH release. Whether 25-OH vitamin D
reduction in DM1 is due to an impairment of UV skin
synthesis or a defective hepatic hydroxylation need to be
investigated.
604
R. Brivio, L. Pirovano, D. Corti, L. Carati, V. Minolfi, N.
Spinoni
Introduzione: Molteplici studi evidenziano che il Virus
dell’Immunodeficienza Umana (HIV) mostra un peculiare
neurotropismo e infetta molto precocemente il Sistema
Nervoso Centrale (SNC). I sintomi possono essere
transitori nel periodo della sieroconversione o interessare
sia il SNC che il Sistema Nervoso Periferico nelle fasi
avanzate della malattia. Uno studio evidenzia che più
dell’80% dei pazienti neurologicamente asintomatici ha
mostrato anomalie nel Liquido Cefalo Rachidiano quali:
leggera pleiocitosi (di cellule mononucleate), aumentata
concentrazione di IgG liquorali, aumento dell’indice di
Link, normale indice di funzionalità della Barriera Emato
Encefalica (BEE) e nel 50% dei casi presenza nel liquor
di Bande Oligoclonali IgG (BO) assenti nel siero.
Scopo: Analizzare retrospettivamente i reperti liquorali
rilevati in pazienti HIV positivi afferenti all’A.O. S. Gerardo
di Monza negli anni 1995-2011.
Metodi: Ricerca BO in isoelettrofocalizzazione con
rivelazione immunologica specifica (Medical System);
dosaggio di Albumina e IgG plasmatiche e liquorali con
metodo immunonefelometrico (APS, Beckman); calcolo
dell’indice di Link e di funzionalità di BEE.
Risultati: Sono stati analizzati i campioni sierici e liquorali
di 54 pazienti (F=8 età media 41 anni e M=46 età
media 42 anni); 33 pazienti (61% F=7 e M=26) sono
risultati positivi per presenza di BO liquorali, in 2 casi
era contemporaneamente presente un’infezione luetica.
L’indice di Link è risultato sopra i limiti di riferimento
(>0.85) in 16 pazienti con BO liquorali presenti, più alto,
ma non significativamente, rispetto ai pazienti con BO
assenti (mediana 0.84 vs 0.61). L’indice di funzionalità di
BEE medio è risultato sovrapponibile nei due gruppi (8.48
vs 8.43).
Conclusioni: L’elevata percentuale di BO nei pazienti HIV
positivi, confermata anche nel nostro studio, suggerisce
l’opportunità di indagare l’eventuale infezione da HIV in
pazienti con sintomi neurologici altrimenti inspiegabili.
Sebbene non sia completamente chiara la patogenesi
delle BO in tali circostanze, pur considerando l’invasività
della rachicentesi e la complessità analitica, la loro ricerca
potrebbe fornire un utile compendio in questi pazienti.
P267
UTILIZZO DI UN SISTEMA ESPERTO NELL’ ANALISI
DEL SEDIMENTO URINARIO
V. Sbolci, D. Borgi, D. De Ninno, R. Palumbo, G.
Salerno, F. Veroni, S. Rapi, A. Ognibene
Dipartimento di Diagnostica di Laboratorio, Laboratorio
Generale, Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi,
Firenze
L’introduzione, nei laboratori clinici, di nuove tecniche
automatizzate per la lettura del sedimento urinario, tra
cui la microscopia a flusso con digitalizzazione ed
analisi delle immagini tramite reti neurali (iQ 200 IL), ha
contribuito a migliorare la standardizzazione dell’analisi
microscopica urinaria. Tale tecnica, seppur affidabile,
richiede ancora una valutazione manuale per verificare
e, se necessario correggere, i risultati mediante analisi
microscopica. L’utilizzo di sistemi esperti (SE) in grado
di combinare parametri chimici e morfologici, può offrire
un aiuto interessante in termini di risparmio di tempo e
di riduzione dei campioni da verificare, senza inficiare
la correttezza del dato. Lo strumento di analisi iQ200
è stato integrato con un SE (i-WARE, IL) che utilizza
inferenze logiche in grado di comparare i parametri chimici
e fisici del campione urinario. Il rispetto o meno delle
condizioni dettate dalle regole impostate, permette di
selezionare più accuratamente i campioni da sottoporre
a verifica di II livello mediante microscopia ottica. Il SE
è stato applicato alla validazione di 16264 campioni
urinari, giunti in laboratorio nel periodo 1 aprile-30 giugno
2012 ed è stato valutato per solo sette delle regole
impostate: Hb≥0.06 e RBC<20/uL, esterasi ≥75 mg/dL e
WBC<20/uL, esterasi ≤25 mg/dL e WBC>20/uL, nitriti≥+1
e WBC<20/uL, nitriti >0 e batteri presenti e EPD>10000/
uL, nitriti≥+1 e batteri assenti e EPD≤ 10000/uL, proteine>
5 mg/dL e Hb≥0.06 mg/dL e RBC> 10/uL e età≤12
anni, esterni e proteine≥30 mg/dL. Il 69.8% dei risultati
non hanno superato il filtro delle regole ed è stato
verificato manualmente sul sistema iQ200 dall’operatore,
il restante 30.2% è passato automaticamente alla
validazione tecnica e clinica permettendo all’operatore
di dedicarsi più tranquillamente ai campioni fermati in
griglia. L’elevata percentuale di campioni bloccati dal
S.E. risente verosimilmente di variabili preanalitiche
(raccolta e conservazione del campione) e, in maniera
minore, strumentali. Sebbene debba essere sottoposto ad
ulteriori indagini ed implementazioni, il sistema i-Ware può
velocizzare il flusso di lavoro quotidiano, permettendo una
refertazione più rapida ed affidabile, con indubbi vantaggi
diagnostici.
605

44° Congresso Nazionale della Società Italiana di

Transcript

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