Respuesta inmune en la enfermedad de Chagas y relación con su

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IX
TALLER
SOBRE
LA
ENFERMEDAD
DE
CHAGAS
Trypanosoma cruzi, del Genotipo a la Clínica
BARCELONA, 4 de MARZO de 2013
PONENCIAS
Epidemiología de la diversidad genética del T.cruzi.
Felipe Guhl. 1 - 8.
Relación entre los genotipos de T.cruzi y la presentación clínica de la enfermedad.
Carolina Cura y Alejandro Schijman. 9-16.
Correlación entre genotipo y resistencia a los antiparasitarios en la Enfermedad de
Chagas. John M.Kelly. 17-23.
Respuesta inmune en la enfermedad de Chagas y relación con su variabilidad clínica.
Walderez Ornelas Dutra. 25-32.
El papel de la inmunología en combatir la infección por Tripanosoma cruzi y la
Enfermedad de Chagas. Rick L Tarleton. 33-39.
COMUNICACIONES ORALES. 41
PÓSTERS. 53
IBECS | ÍME | CUIDEN | RECYT | SIIC Data Bases | MEDLINE / Index Medicus | EMBASE / Excerpta Médica | Directorio Ulrich | Social Science Citation Index
Rev Esp Salud Pública 2013; 1-8.
IX Taller sobre la Enfermedad de Chagas, Barcelona, 4 de Marzo 2013
PONENCIA
EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE TRYPANOSOMA CRUZI
Felipe Guhl
Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Tropical. CIMPAT. Universidad de los Andes.
Bogotá. Colombia.
RESUMEN
La enfermedad de Chagas causada por el parásito Trypanosoma cruzi
es una zoonosis compleja, ampliamente distribuida en el continente americano. La infección puede ser adquirida a través de las heces de insectos
triatominos, transfusión de sangre, trasplante de órganos, vía oral, por
transmisión congénita y por accidentes de laboratorio. El completo entendimiento de la etiología y epidemiología de la enfermedad de Chagas a
través de su distribución geográfica es complejo y permanece bajo intensa investigación hasta la actualidad. Los recientes estudios sobre la variabilidad genética del parásito han dado nuevas luces de los diferentes escenarios de los ciclos de transmisión de la enfermedad y su patogénesis
en humanos. El propósito principal para la caracterización molecular de
T.cruzi y sus múltiples genotipos está dirigido hacia su asociación con la
clínica y la patogenesis de la enfermedad, así como al esclarecimiento de
los diferentes escenarios de transmisión y los aspectos co-evolutivos relacionados con reservorios e insectos vectores.
La caracterización molecular de los diferentes aislamientos a partir
de humanos, insectos y reservorios, ha permitido identificar la amplia
variabilidad genética del parásito, abriendo nuevos caminos hacia la
búsqueda de nuevos blancos terapéuticos y pruebas diagnósticas más
específicas que contribuyan a mitigar la enfermedad de Chagas.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi. Patogénesis. ciclos de transmisión.Enfermedades transmisibles.Enfermedades parasitarias.
Correspondencia
Centro de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Tropical.
CIMPAT.
Universidad de los Andes
Bogotá
Colombia.
[email protected]
ABSTRACT
Molecular Epidemiology of
Trypanosoma cruzi
Chagas disease caused by the parasite Trypanosoma cruzi is a complex zoonosis that is widely distributed throughout the American continent. The infection can be acquired by triatomine faeces, blood transfusion, organ transplantation, oral route, congenital transmission and by
laboratory accidents. A full understanding of the etiology and epidemiology of Chagas disease across its geographical distribution was to prove
elusive and complex, and remains under intense investigation to the present day. Recent studies on the genetic variability of the parasite have
given new light on the different scenarios of the cycles of transmission
of Chagas disease and pathogenesis in humans. The main purpose for the
molecular characterization of T. cruzi and their multiple genotypes is
aimed towards his association with the clinic and the pathogenesis of the
disease as well as to clarify the different scenarios of transmission and
co-evolutionary aspects related with insect vectors and reservoirs.
The molecular characterization of the different isolates from
humans, insects and reservoirs has allowed to identify the wide genetic
variability of the parasite, opening new paths towards the search for new
therapeutic targets and diagnostic tests more specific, that contribute to
mitigate Chagas disease.
Key words: Trypanosoma cruzi. Transmission cycles.Communicable
diseases. Parasitic diseases.
Felipe Ghul
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Chagas, causada por
el parásito Trypanosoma cruzi, es una zoonosis compleja, ampliamente distribuida
en el continente americano. La infección
puede ser adquirida a través de las heces de
insectos triatominos, transfusión de sangre,
trasplante de órganos, vía oral, transmisión
congénita y por accidentes de laboratorio.
La enfermedad de Chagas representa un
problema importante de salud pública, con
estimaciones de al menos de 8 a 10 millones de personas que padecen la infección y
alrededor de 110 millones en riesgo de
adquirirla 1 . La migración de personas
infectadas de países endémicos a otras
regiones, incluyendo Europa y Estados
Unidos, hace que la enfermedad de Chagas
se convierta en un problema de salud de
amplia distribución geográfica, según lo
demuestran recientes informes de casos
importados en Europa, Estados Unidos y
Canadá2,3.
La patogénesis de la enfermedad de Chagas comprende dos etapas en las que la fase
aguda se produce una semana después de la
infección inicial. Aproximadamente el 3040% de los pacientes infectados desarrollan la fase crónica de la enfermedad,
durante la que la cardiomiopatía es la manifestación clínica más frecuente y grave,
seguida por casos de megavísceras en cerca
de un 8% de los pacientes infectados4.
El completo entendimiento de la etiología y epidemiología de la enfermedad de
Chagas a través de su distribución geográfica es complejo y permanece bajo intensa
investigación hasta la actualidad. La dificultad de definir completamente los diferentes escenarios de los ciclos de transmisión de la enfermedad es atribuible a varios
factores. En primer lugar, la enfermedad de
Chagas es una zoonosis no erradicable, con
más de 100 especies de mamíferos silvestres y domésticos actuando como reservo2
rios de T. cruzi. El segundo factor que contribuye a la complejidad de la enfermedad
de Chagas es la enorme variedad de insectos triatominos involucrados en la transmisión del parásito. El tercero es la enorme
variabilidad de las manifestaciones clínicas de la enfermedad y, en algunos casos, la
resistencia del parásito a los medicamentos
disponibles.
Durante los últimos 40 años se ha realizado un importante trabajo para dilucidar
la variabilidad de T. cruzi con respecto a su
distribución geográfica y asu asociación
con diferentes especies de triatominos,
reservorios y los seres humanos. El parásito comprende una población heterogénea
que muestra propagación clonal. Se ha
reportado intercambio genético y de
recombinación en estudios in vitro y en la
naturaleza5-7.
ANTECEDENTES
La diversidad genética fue descubierta
inicialmente mediante un panel de isoenzimas utilizado en poblaciones de T. cruzi
aisladas en diferentes ecotopos8. Este estudio pionero reveló diferencias genéticas
sustanciales entre los parásitos en ciclos de
transmisión silvestre y doméstica simpátricas en Brasil. Las variantes descritas fueron designadas como zymodemas I, II y III
y abrieron la puerta a la investigación sobre
la etiología y los ciclos de transmisión de la
enfermedad de Chagas, permitiendo estudios comparativos y la influencia de las
asociaciones huésped-parásito-vector.
En las dos décadas siguientes, varios
autores procedieron a caracterizar aislamientos del parásito aplicando otros métodos moleculares como RAPD´s, PCRRFLPs, secuenciación de genes y microsatélites, entre otros. Como resultado, se
reportó una importante variabilidad genética en los diferentes aislamientos del parásito y a su vez se generó una gran confusión
en la denominación de los diferentes gruRev Esp Salud Pública 2013
pos propuestos. En el año 1999 se estableció por primera vez un consenso internacional sobre la nomenclatura de T. cruzi9 y
se acordó la inclusión de dos linajes genéticos diferentes, el linaje TcI como un grupo
genético homogéneo y el TcII revelado por
los estudios de isoenzimas y dimorfismos
en el gen mini-exón y el dominio divergente del ADNr del parásito10,11.
LA NUEVA NOMENCLATURA
Recientemente se ha propuesto una nueva nomenclatura para T. cruzi, la cual
incluye seis unidades discretas de tipificación (DTUs) nombradas como T. cruzi I
(TcI), T. cruzi II (TcII), T. cruzi III (TcIII),
T. cruzi IV (TcIV), T. cruzi V (TcV) y T.
cruzi VI (TcVI), basada en marcadores
moleculares diferentes y características
biológicas12.
De igual manera, recientemente se ha
reportado un nuevo genotipo con el nombre TcBat, con una asociación estricta a los
murciélagos en Brasil y Panamá13, el cual
tiene connotaciones evolutivas del parásito
de gran interés.
La figura 1 muestra la distribución geográfica de las 6 DTU’s y su correspondencia con ciclos de transmisión asociados al
ambiente silvestre o domiciliar.
Después de diez años de investigación
enfocados a comprobar si TcI era un grupo
homogéneo, varios marcadores moleculares han demostrado la existencia de una
enorme variabilidad genética dentro de T.
cruzi I15-25 (figura 2).
En el año 2007 se reportó la presencia de
cuatro genotipos en aislamientos colombianos de TcI y su relación con los ciclos de
transmisión de la enfermedad de Chagas16,18. El genotipo Ia asociado con infección humana y vectores domiciliarios con
un patrón específico en la posición 28 y en
la 35-40, el genotipo Ib asociado con infección humana y vectores peridomiciliarios
Figura 1
Distribución geográfica de las 6 DTU’s y su correspondencia con ciclos de transmisión
asociados al ambiente silvestre o domiciliario
IX Taller sobre la Enfermedad de Chagas
3
Felipe Ghul
Figura 2
Distribución geográfica de las DTU’s de
Trypanosoma cruzi en el Continente
Americano. Tomado de Patterson y
Guhl, 201029
con una sustitución de T-C en la posición 44,
el genotipo Ic el cual no es muy robusto debido al bajo número de aislamientos utilizados
relacionado con vectores domiciliarios y que
se caracteriza por una secuencia TATATA en
la posición 35-40 y el genotipo Id relacionado con el ciclo selvático y caracterizado por
una deleción de 9 nucleótidos en las posiciones 15-23 de la región microsatélite del gen
mini-exón. De acuerdo a las características
de cada genotipo y a las inserciones, deleciones y SNPs encontrados para cada uno, se
desarrollaron iniciadores específicos que permitieron diferenciar tres de los cuatro genotipos (Ia, Ib y Id)18. Estos trabajos fueron pioneros en el estudio de la diversidad genética
del grupo TcI e instaron a la comunidad científica a continuar los trabajos utilizando otros
marcadores moleculares para corroborar la
existencia de los genotipos encontrados en
TcI con el gen mini-exón. Trabajos posteriores utilizando el gen citocromo b mostraron la
4
presencia de cuatro genotipos filogenéticamente robustos en Colombia y dos subgrupos
en Chile25. En el año 2009 Llewelyn et al.19
reportaron 135 muestras caracterizadas como
TcI procedentes de diversas regiones geográficas endémicas para enfermedad de Chagas
en Latinoamérica. Las muestras fueron sometidas a análisis de 48 microsatélites marcadores demostrando que el grupo TcI era altamente diverso (figura 3). Recientemente, se
analizaron 105 muestras TcI procedentes de
la mayoría de regiones endémicas de Latinoamérica en las que se corroboraron los genotipos Ia, Ib, Ic y Id previamente reportados y
se reportó el genotipo Ie encontrado en Bolivia, Argentina y Chile, caracterizado por
tener un motivo de 44 pb en la región intergénica del gen mini-exón y para el cual se diseñaron iniciadores específicos para su detección. Así mismo, se encontró que este genotipo está muy relacionado con los ciclos
domésticos de Argentina y Bolivia y los
ciclos selváticos de Chile, donde Mepraia
spinolai y M. gajardoi juegan un papel
importante en este ciclo de transmisión26.
Figura 3
Distribución geográfica de los genotipos
de Trypanosoma cruzi I basados en la región SL-IR. Tomado de Guhl et al. 201125
Rev Esp Salud Pública 2013
VARIABILIDAD GENÉTICA Y
ASOCIACIÓN CON RESERVORIOS
Y VECTORES
La distribución de los genotipos de T.
cruzi y los reservorios tiene una implicación
importante en las divisiones de TcI. En el
sur del continente se ha asociado la infección de Canis familiaris a TcIV, V y VI, pero
en el norte se observan los perros infectados
con los genotipos Ia y Ib. Así mismo, un
número significativo de D. marsupialis en
Colombia se ha encontrado infectado con el
genotipo TcId, mostrando la asociación neta
al ciclo selvático de transmisión. Estudios
similares en primates demuestran la predominancia de TcI por infectar reservorios
arbóreos. Existen varias hipótesis acerca de
la distribución de los diferentes grupos
genéticos de T. cruzi, en las que se muestra
que los reservorios que pertenecen a los
ecotopos arbóreos son infectados preferencialmente con TcI mientras que los terrestres son infectados por TcII-TcVI26. Esta
hipótesis es controvertida teniendo en cuenta los últimos reportes que muestran que
reservorios de ecotopos arbóreos como
Monodelphis brevicaudata, Philander frenata y Didelphis aurita están respectivamente infectados con TcIII, TcIV y TcII 14.
Las asociaciones no parecen ser absolutas. Para el caso de TcI no parece existir un
único grupo asociado a Didelphis, como se
había planteado originalmente. Los resultados indican agrupamientos más ligados a la
distribución geográfica que a una asociación a los diferentes reservorios.
Dos estudios recientes relacionados con
la infección artificial y la respuesta del
huésped a diferentes cepas de T. cruzi muestran que dos especies de marsupiales,
Monodelphis domestica y Didelphis virginiana fueron resistentes a la infección con
TcIV32.
La fuerte asociación entre TcI y las diferentes especies del género Rhodnius se
puede explicar a través de mecanismos similares. Algunos estudios utilizando diferentes
especies de triatominos tales como R. pallescens, Triatoma dimidiata, R. colombiensis y
Panstrongylus geniculatus mostraron afinidad a la infección con TcI en comparación
con TcII33. Esta acción de filtro biológico
parece estar modulada por el efecto de los
simbiontes intestinales en los triatominos,
los cuales juegan un papel muy importante
en la metaciclogénesis del parásito.
PATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD
DE CHAGAS Y LAS DTU
El propósito principal para la caracterización molecular de T. cruzi debe estar dirigido hacia su asociación con la clínica y la
patogénesis de la enfermedad así como al
esclarecimiento de los diferentes escenarios
de transmisión.
El estudio de la epidemiología molecular
de T. cruzi ha permitido establecer el posible
efecto de las diferentes DTUs en el desarrollo clínico de la enfermedad de Chagas.
Varios autores han demostrado la presencia de diferentes poblaciones de T. cruzi en
la sangre y en el tejido cardíaco de pacientes
con enfermedad de Chagas, sugiriendo que
los genotipos de T. cruzi que causan el daño
celular son diferentes a los que se encuentran en sangre. Asimismo, se han encontrado diferencias en las poblaciones de T. cruzi
en individuos que sufren cardiomiopatía
chagásica y en aquellos que no la sufren.
Análisis de microsatélites han demostrado
multiclonalidad en muestras de corazón y
de torrente sanguíneo de pacientes infectados demostrando que probablemente poblaciones específicas de T. cruzi pueden determinar el desarrollo de la enfermedad27.
Varios reportes demuestran el efecto de la
variabilidad genética en la respuesta inmune del hospedador. Se conocía que las formas cardíacas en países del Cono Sur en
Suramérica eran causadas por TcII, TcV y
5
Felipe Ghul
TcVI, pero recientemente se ha demostrado
que TcI juega un papel importante en las
formas severas de cardiopatía chagásica.
Estudios en pacientes argentinos mostraron
en las biopsias cardiacas que aquellos que
tenían miocarditis severa estaban infectados
con TcI mientras que las miocarditis moderadas o ausentes eran causadas por TcII,
TcV y TcVI. En el caso de los genotipos TcI,
los pacientes con cardiopatía chagásica crónica presentaban TcIa con mayor frecuencia
en torrente sanguíneo, mientras que en biopsia cardiaca era frecuente encontrar TcId.
Estos resultados concuerdan con los de
pacientes colombianos en los que el genotipo de TcI más frecuente en pacientes adultos
con cardiopatia chagásica crónica fue TcIa y
con menos frecuencia TcId28, lo cual sugiere un posible histotropismo por parte de los
genotipos de TcI y la importancia para los
países del sur, donde se pensaba que las formas cardiacas eran causadas principalmente
por TcII, TcV y TcVI.
Las implicaciones de estos estudios en el
desarrollo de las formas clínicas de la enfermedad de Chagas son de gran importancia y
sugieren la necesidad de adelantar nuevas
investigaciones ecofilogeográficas mediante
otros marcadores moleculares, con el fin de
implementar estrategias dirigidas a mitigar la
enfermedad de Chagas en el continente.
Existen varios reportes que muestran
algoritmos que permiten caracterizar las
diferentes DTU’s utilizando RAPDs, PCRRFLPs, qPCR, MLST, MLMT y secuenciación de ADN, pero hasta la fecha no existe
un protocolo de consenso para la tipificación de los aislamientos.
Los avances en procedimientos de
secuenciación han permitido obtener tres
genomas completos. El primero fue la cepa
CL Brener (TcVI), la cual mostró un alto
grado de elementos repetitivos a lo largo del
genoma30. De igual forma, los genomas de
Esmeraldo (TcII) y Sylvio X10 (TcI) mostraron una relación entre los elementos
repetitivos y las proteínas mucin-like, aso6
ciadas con la invasión celular del parásito, lo
cual representa datos promisorios para un
mejor entendimiento de la estructura genética
de las diferentes DTU’s31.
BIBLIOGRAFÍA
1. WHO. Special programme for research and training in
tropical diseases (TDR), Report of Scientific Group in
Chagas Disease TDR/SWG/09. World Health Organization: Buenos Aires;2007.
2. Schmunis GA, Yadon ZE. Chagas disease: A Latin
American health problem becoming a world health problem. Acta Trop. 2010; 115:14-21.
3. Roca C, Pinazo MJ, López-Chejade P, Bayó J, Posada
E, López-Solana J, Gállego M, Portús M, Gascón J. Chagas disease among the latin american adult population
attending in a primary care center in Barcelona, Spain.
PLoS Neg Trop Dis. 2011; 5:e1135.
4. Rassi A Jr, Rassi A, Marcondes de Rezende J. American
Trypanosomiasis (Chagas Disease) Infect Dis Clin North
Am. 2012; 26: 275-291.
5. Gaunt MW, Yeo M, Frame IA, Stothard JR, Carrasco
HJ, Taylor MC, et al. Mechanism of genetic exchange in
American trypanosomes. Nature. 2003; 421: 936-939.
6. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA,
Zingales B. DNA markers define two major phylogenetic
lineages of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol.
2006; 83: 141-152.
7. Westenberger SJ, Barnabé C, Campbell DA, Sturm NR.
Two hybridization events define the population structure
of Trypanosoma cruzi. Genetics. 2005; 171: 527-543.
8. Miles MA, Toye PJ, Oswald SC, Godfrey DG. The
identification by isoenzyme patterns of two distinct
strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating independently in a rural area of Brazil. Trans R Soc Trop Med
Hyg. 1977; 71: 217-225.
9. Recommendations from a satellite meeting. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 1999; 94: 429-432.
10. Tibayrenc M, Ayala F. Isoenzyme variability in Trypanosoma cruzi the agent of Chagas disease: genetical, taxonomical and epidemiological significance. Evolution.
1988; 42: 277-292.
11. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA,
1996; 83: 141-152.
12. Zingales B, Andrade SG, Briones MRS, Campbell
DA, Chiari E, et al. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraespecific nomenclature: second revision meeting recommends TcI to TcVI. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 2009; 104: 1051-1054.
13. Marcili A, Lima L, Valente VC, Valente SA, Batista JS, et al.. Comparative phylogeography of Trypanosoma cruzi TCIIc: New hosts, association with
terrestrial ecotopes and spatial clustering. Inf Gen
Evol .2009; 9:1265-1274.
14. Llewellyn MS, Lewis MD, Acosta N, Yeo M,
Carrasco HJ, et al. Trypanosoma cruzi IIc: Phylogenetic and phylogeographic insights from sequence
and microsatellite analysis and potential impact on
emergent Chagas disease. PloS Negl Trop Dis. 2009;
3: e510.
15. Herrera C, Bargues MD, Fajardo A, Montilla M,
Triana O, et al. Identifying four Trypanosoma cruzi I
isolate haplotypes from different geographic regions
in Colombia. Infect Genet Evol. 2007; 7: 535-539.
16. Herrera C, Guhl F, Falla A, Fajardo A, Montilla M,
et al. Genetic variability and phylogenetic relationships within Trypanosoma cruzi I isolated in Colombia
based on miniexon gene sequences. J Parasitol Res.
2009; ID 897364.
17. Herrera CP, Guhl F., Falla A., Bargues MD, Breniere F. Concordancia de haplotipos propuestos de
Trypanosoma cruzi con aislamientos de otras regiones de Latinoamérica. Biomédica. 2009; 29:1.
18. Falla A, Herrera C, Fajardo A, Montilla M, Vallejo GA, et al. Haplotype identification within Trypanosoma cruzi I in Colombian isolates from several reservoirs, vectors and humans. Acta Trop. 2009; 110: 1521.
19. Llewellyn MS, Miles MA, Carrasco HJ, Lewis
MD, Yeo M, et al. Genome-Scale Multilocus Microsatellite Typing of Trypanosoma cruzi Discrete
Typing Unit I revals phylogeographic structure and
specific genotypes linked to human infection. PLoS
Pathog. 2009; 5: e1000410.
20. Mejía-Jaramillo AM, Arboleda-Sánchez S, Rodríguez IB, Cura C, Salazar A, Del Mazo J, et al . Geographical clustering of Trypanosoma cruzi I groups
from Colombia revealed by low-stringency single
specific primer-PCR of the intergenic regions of spliced-leader genes. Parasitol Res. 2009; 104: 399–410.
21. Salazar A, Schijman AG, Triana O. High variability of Colombian Trypanosoma cruzi lineage I
stocks as revealed by low-stringency single primerPCR minicircle signatures. Acta Trop. 2006; 100:
110–118.
22. Spotorno AE, Córdova L, Solari A. Differentiation of Trypanosoma cruzi I subgroups through characterization of cytochrome b gene sequences.
Infect Genet Evol. 2008; 8: 898-900.
23. Triana O, Ortiz S, Dujardin JC, Solari A. Trypanosoma cruzi; Variability of stocks from Colombia
determined by molecular karyotype and minicircle
suthern blot analysis. Exp Parasitol. 2006; 113: 6266.
24. Ramírez JD, Duque MC, Guhl F. Phylogenetic
reconstruction based on Cytochrome b (Cytb) gene
sequences reveals distinct genotypes within
Colombian Trypanosoma cruzi I populations. Acta
Trop. 2011; 119: 61-65
25. Guhl F, Ramírez JD. Trypanosoma cruzi I diversity: Towards the need of genetic subdivision? Acta
Trop. 2011; 119:1-4
26. Yeo M, Acosta N, Llewellyn M, Sánchez H,
Adamson S, et al.. Origins of Chagas disease:
Didelphis species are natural hosts of Trypanosoma
cruzi I and armadillos hosts of Trypanosoma cruzi
II, including hybrids. Int J Parasitol. 2005; 35: 225233.
27. Burgos JM, Diez M, Vigliano C, Bisio M, Risso
M, et al. Molecular identification of Trypanosoma
cruzi Discrete Typing Units in end-stage chronic
Chagas heart disease and reactivation after heart
transplantation. Clin Infect Dis. 2010; 51: 485-495.
28. Ramírez JD, Guhl F, Rendón LM, Rosas F,
Marín-Neto J A, Morillo C A. Chagas Cardiomyopathy Manifestations and Trypanosoma cruzi
Genotypes Circulating in Chronic Chagasic
Patients. PLoS Neg Trop Dis. 2010; 4: e899.
29. Patterson James S, Guhl F. Geographical distribution of Chagas disease. In: American Trypanosomiasis. Tibayrenc M, Editor. Oxford: Elsevier;
2010. p. 84-115
30. Teixeira SM, El-Sayed NM, Araújo PR. The
Genome and Its Implications. Adv Parasitol. 2011;
75: 209-230.
31. Andersson, B. The Trypanosoma cruzi genome;
conserved core genes and extremely variable surface molecule families. Res Microbiol. 2011; 162:
619-625.
32. Roellig DM, Ellis AE, Yabsley MJ. Genetically
different isolates of Trypanosoma cruzi elicit different infection dynamics in raccoons (Procyon lotor)
and Virginia opossums (Didelphis virginiana). Int J
Parasitol. 2009; 39: 1603-1610.
7
Felipe Ghul
33. Urrea A, Guhl F, Herrera C, Falla A, Carranza JC,
Cuba-Cuba C, et al. Sequence analysis of spliced-leader intergenic region (SL-IR) and random amplified
polymorphic DNA (RAPD) of Trypanosoma rangeli
strains isolated from Rhodnius ecuadoriensis, R.
colombiensis, R. pallescens and R. prolixus suggests a
degree of co-evolution between parasites and vectors.
Acta Trop. 2011; 20: 59-66.
8
Rev Esp Salud Pública 2013; 86: 9-16.
PONENCIA
RELACIÓN ENTRE LOS GENOTIPOS DE T. CRUZI Y LA PRESENTACIÓN CLÍNICA DE
LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Carolina Cura y Alejandro Gabriel Schijman
Grupo de Biologia Molecular de la Enfermedad de Chagas, Instituto de Investigaciones en Ingenieria
Genetica y Biologia Molecular - INGEBI-CONICET. Buenos Aires. Argentina
RESUMEN
Trypanosoma cruzi, agente etiológico causante del Mal de Chagas,
es una especie formada por poblaciones multiclonales altamente divergentes. La comprensión de su estructura poblacional es relevante para determinar su asociación con las diversas manifestaciones clínicas y severidad de la enfermedad, las cuales presentan una distribución geográfica
diferencial.
Recientemente se ha reconocido que T. cruzi está conformado por
seis Unidades Discretas de Tipificación (UDTs): TcI a TcVI. Aquí presentamos un panorama que resume el conocimiento disponible sobre la
existencia de asociaciones entre los UDTs y las formas clínicas de la enfermedad de Chagas.
Palabras claves: Trypanosoma cruzi. Tipificación Molecular. Enfermedad de Chagas
Correspondencia
Alejandro G. Schijman.
Vuelta de Obligado 2490
[email protected]
ABSTRACT
Relation between the Genotypes T. cruzi
and the Clinical Presentation of
Chagas's Disease
Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, is a species formed by highly divergent multiclonal populations. Understanding
the population structure is relevant to determine its association with clinical manifestations and severity of the disease, which have a different
geographical spread.
Recently it has been recognized that T. cruzi consists of six Discrete
Typing Units (UDTs) ; from Tc I to Tc VI. We present an overview that
summarizes the available knowledge about the existence of associations
between UDTs and clinical forms of Chagas disease
Keywords: Trypanosoma cruzi. Molecular Typing. Chagas Disease.
Carolina Cura et al.
INTRODUCCIÓN
Se ha descrito que la gran diversidad de
formas clínicas, severidad y naturaleza de la
infección crónica en la enfermedad de Chagas son atribuibles a una serie de interacciones complejas entre la constitución genética
del parásito Trypanosoma cruzi (T. cruzi), el
acervo inmunogenético del hospedador humano, y factores del medio ambiente1,2. Las
poblaciones naturales de T. cruzi están compuestas por clones múltiples, distribuidos en
6 Unidades Discretas de Tipificación (UDTs
TcI a TcVI) de diferente distribución geográfica y circulación en los ciclos de transmisión3,4. Aún se desconoce el rol que esta diversidad genética juega en los escenarios
clínicos de las diferentes regiones endémicas.
Por ser la infección humana un evento
reciente en la historia evolutiva del parásito,
es esperable que diferentes poblaciones parasitarias posean diversas tasas de infectividad
y virulencia, así como también, diferentes
capacidades de desarrollar la enfermedad en
el hombre. La existencia de poblaciones parasitarias heterogéneas y de una enfermedad
con diferentes manifestaciones clínicas permite pensar en una relación entre ambas
características que aún no ha sido definida.
En relación a ello, Macedo y Pena (1998)
propusieron un modelo histotrópico clonal
donde diferentes clones parasitarios presentan distinto tropismo tisular y, en consecuencia, están involucrados en las diversas manifestaciones de la enfermedad5.
Para establecer la existencia de una asociación entre las manifestaciones clínicas de la
enfermedad de Chagas y los genotipos parasitarios se requieren estudios complejos de
realizar por varias razones:
- Pacientes asintomáticos pueden tener
alteraciones cardíacas y/o digestivas sub-clínicas, detectables sólo por estudios de diagnóstico por la imágen.
10
- Los aislamientos de T. cruzi a partir
de sangre periférica no necesariamente
revelan el universo completo de linajes
parasitarios que infectan al paciente, ya
que una o varias cepas podrían estar
secuestradas en los tejidos y circulando
en sangre con baja carga parasitaria6-9.
- Los estudios realizados pueden
quedar sesgados por el proceso de análisis en los casos en que éste implique una
amplificación parasitaria, ya sea por cultivo in vitro, o por pasajes en modelo
experimental.
TÉCNICAS MOLECULARES DE
TIPIFICACIÓN DE UDTs EN
MUESTRAS BIOLÓGICAS
En los últimos tiempos, la optimización de técnicas de biología molecular
de mayor sensibilidad permitió caracterizar poblaciones parasitarias en los sitios de las lesiones chagásicas y en sangre periférica8,10-13. Nuestro equipo
cuenta con un sistema de caracterización
molecular directa de linajes mediante la
optimización y desarrollo de distintas
estrategias de PCR basadas en: a) regiones intergénicas para miniexón (SLPCR), b) genes para ADN ribosomal
24sα, y c) fragmentos diferenciales obtenidos por amplificación al azar14-17 que
habían sido originalmente aplicados a
cepas de cultivo. Las mejoras a los sistemas publicados implicaron la incorporación de nuevas secuencias de cebadores,
rondas de PCR anidadas (PCR-Nested),
inicios de PCR a altas temperaturas
(Hot–Start PCR), Taq polimerasas asociadas a anticuerpo inactivante y sistemas de PCR en tiempo real8,11. Este algoritmo de tipificación, que alcanza un
límite de detección promedio de 25 genomas parasitarios en el tubo de reacción y requiere de al menos tres reacciones de PCR independientes, nos ha
permitido identificar UDTs en forma directa en lesiones de pacientes con enferRev Esp Salud Pública 2013
RELACIÓN ENTRE LOS GENOTIPOS DE T. CRUZI Y LA PRESENTACIÓN CLÍNICA DE LA ENFERMEDAD ...
medad de Chagas inmunosuprimidos
por SIDA10,12,18 o por transplante cardíaco8,19, en sangre periférica de niños con
Chagas congénito o vectorial (Burgos y
col., 2007) y en muestras de pacientes
residentes en distintas regiones de Argentina13 (figura 1).
Otra estrategia basada en tres marcadores secuenciales fue propuesta por
Lewis y colaboradores20 que implica la
combinación de la amplificación de
ADNr 24Sα rDNA 1 4 , 2 1 y RFLPs de
amplicones derivados de loci para proteínas HSP60 y GPI22.
Otra estrategia incorpora PCR-RFLP
del gen mitocondrial CO II , amplificación del espaciador no transcrito de
genes para miniexón y del ADN-r 24Sα7.
Una propuesta reciente para simplificar el análisis de linajes es el desarrollo
de un sistema de PCR en tiempo real
multiplex utilizando sondas TaqMan
(Cura Carolina, tesis de la Universidad
de Buenos Aires, en realización), que
permitirá la identificación de los 6 UDTs
en dos o tres reacciones de PCR secuenciales.
Existen otras estrategias basadas en
secuenciación de loci múltiples13, pero
su baja sensibilidad limita su aplicación
en la detección directa de UDTs en muestras biológicas.
En el caso particular de Tc I se ha reconocido una amplia variabilidad de cepas,
lo que llevó a postular su clasificación en
distintos genotipos en base a marcadores
nucleares y mitocondriales24,25.
A nivel sub-UDT se han propuesto
diferentes estrategias, entre ellas las
basadas en el polimorfismo de loci para
microsatelites 26 y en la tipificación por
secuenciación de loci multiples
(MLST)27,28. Recientemente, la posibilidad de usar FACs para separar organismos unicelulares surge como herramienta para caracterizar la composición clonal de poblaciones parasitarias naturales29.
Figura 1
Estrategias de PCR para la identificación de Unidades Discretas de Tipificación
de Trypanosoma cruzi en muestras directas de sangre periférica y tejido
11
DISTRIBUCIÓN DE LINAJES Y
FORMAS CLÍNICAS DE
LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
La búsqueda de asociaciones entre la
diversidad de T. cruzi y las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Chagas
podría permitir identificar el significado
clínico de las subdivisiones biológicas de
T. cruzi.
Chagas agudo. El control del vector y la
transmisión transfusional han posibilitado
la reducción de las infecciones agudas,
resultando emergentes los casos agudos por
transmisión oral30-32 . La mayoría de los
casos agudos resultantes de brotes orales,
han ocurrido en la región Amazónica, causados por TcI, y en menor grado por TcIII y
TcIV31,33-35. Se han documentado casos de
infección oral por TcI en Venezuela y Guyana Francesa32,36 y TcII en el sur brasilero37.
Chagas congénito. Esta vía es relativamente más frecuente en aquellas regiones
donde el control de la transmisión vectorial
y transfusional están resueltos, incluyendo
centros urbanizados endémicos y no endémicos, debido a las migraciones. En los
casos de infección congénita reportados se
hallaron todos los UDTs excepto TcIV11,3841
. La prevalencia de UDTs específicos en
la infección congénita se encuentra en concordancia con la prevalencia observada en
la población general infectada de la misma
región.
Enfermedad de Chagas crónica. TcI ha
sido implicado en casos clínicos en la Amazonia, región andina central, América Central y México42-46, causando cardiomiopatía, en la mayoría de los casos, y meningoencefalitis, en pacientes inmunodeficientes.
En el cono sur, donde T. infestans es el
vector mayoritario, TcII, TcV y TcVI son
los principales agentes causantes de la
enfermedad de Chagas. TcII predomina en
Brasil; TcV, en Argentina, Bolivia y Para-
Tabla 1
Resumen de las asociaciones entre las UDTs de T. cruzi y diferentes ecótopos, huéspedes,
vectores, patologías
Genotipo
TcI
TcII
TcIII
12
Ecotopo/Nicho
Primario: arbóreo palmeras (Attalea), huecos en árboles.
Secundario: árido, rocoso terrestre en Amazonia
No se conoce completamente,
raro en ciclos silvestres
Terrestre, fosorial
TcIV
Arbóreo, y algunos hospederos
terrestres en Norteamérica
TcV
Raro en ciclos silvestres
TcVI
Raro en ciclos silvestres
Geografía
América del Sur, Central
y del Norte
Cono Sur,
esporádico en el Norte
Enfermedad de Chagas
Norte del Amazonas, brotes orales
Esporádico en el Cono Sur (región del
Gran Chaco)
Cardiomiopatía
Meningoencefalitis asociada a SIDA
Brasil Atlántico y Central. Cardiomiopatía,
megasindromes digestivos
Raro en humanos (también en perros domésticos). Casos agudos en la Amazonia
brasilera. Presentación clínica desconocida
América del Sur
Causa secundaria de enfermedad de Chay
gas en Venezuela, esporádico en el resto
del Norte
de América del Sur
Cono Sur
Cono Sur, Gran Chaco, ex- Cardiomiopatía, megasíndromes digestitremo sur de Brasil
vos.
Transmisión vectorial y congénita
Cono sur. Cardiomiopatía, megasíndroCono Sur, Gran Chaco
mes digestivos
América del Sur
guay; y TcVI, en el Gran Chaco11,41,45,47-53.
Sin embargo, en el Gran Chaco también
hay registros de pacientes cardiópatas
infectados con Tc I8,36. Un escenario complejo fue descrito en pacientes con cardiomiopatía crónica severa, sujetos a trasplante cardíaco, manifestando infecciones mixtas por TcI, TcV, o TcVI en sangre periférica, explante cardíaco, biopsias endomiocárdicas del corazón implantado y chagomas epidérmicos, luego de tratamiento
inmunosupresor8.
Una proporción de pacientes del cono
sur desarrollan megavísceras54-56, de baja
frecuencia en el norte de sudamérica y en
América central, reflejando la filogeografía divergente de las UDTs57.
TcIII no ha sido detectado en infecciones
crónicas en humanos, pero sí en perros
domésticos en Paraguay, Brasil y Argentina 9,34,57-59 TcIV es la segunda causa de
enfermedad de Chagas en Venezuela60.
Un resumen de la distribución de UDTs
asociada a la enfermedad de Chagas se
muestra en la tabla 1.
Los resultados obtenidos de muestras
clínicas mostraron una situación compleja,
a saber: la existencia de diferentes UDTs
hallados en pacientes con similares manifestaciones clínicas, incluso la coexistencia
de cepas de distinto linaje en diferentes
tejidos en un mismo paciente, como así
también, la existencia de pacientes con distinto tipo de manifestación infectados por
una misma UDT.
Asimismo, salvo en el caso de Tc III,
hasta ahora asociado sólo a brotes por contaminación oral en el Amazonas brasilero,
se encontraron pacientes con enfermedad
de Chagas infectados por cualquiera de los
otros 5 UDTs parasitarios4.
Estudios en modelo experimental revelaron que una misma cepa parasitaria pueIX Taller sobre la Enfermedad de Chagas
de presentar distinto tropismo según el
genotipo para MHC de los ratones infectados61.
Estos datos indican la importancia de
la relación hospedero-parásito para la
determinación de la evolución de la
enfermedad de Chagas.
BIBLIOGRAFÍA
1.Campbell DA, Westenberger SJ, Sturm NR. The
determinants of Chagas disease: connecting parasite
and host genetics. Curr. Mol. Med. 2004; 4,
549–562.
2.Macedo AM, Machado CR, Oliveira RP, Pena
SDJ. Trypanosoma cruzi: genetic structure of populations and relevance of genetic variability to the
pathogenesis of Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2004: 99, 1–12.
3.Zingales B, Andrade SG, Briones MRS, Campbell
DA, Chiari E, Fernandes O, et al. A new consensus
for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature:
second revision meeting recommends TcI to TcVI.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2009; 104, 1051–1054.
4.Zingales B, Miles MA, Campbell DA, Tibayrenc
M, Macedo AM, Teixeira MM, et al. The revised
Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature:
Rationale, epidemiological relevance and research
applications. Infect Genet Evol. 2012; 12(2):240-53.
5.Macedo AM, Pena SD. Genetic Variability of
Trypanosoma cruzi:Implications for the Pathogenesis of Chagas Disease. Parasitol Today 1998;
14(3):119-24.
6.Vago AR, Andrade LO, Leite AA, Reis AD, Macedo AM, Adad SJ, et al. Genetic characterization of
Trypanosoma cruzi directly from tissues of patients
with chronic Chagas disease. Am. J. Pathol. 2000;
156, 1805–1809.
7.D’Avila DA, Macedo AM, Valadares HM, Gontijo
ED, de Castro AM, Machado CR et al. Probing
population dynamics of Trypanosoma cruzi during
progression of the chronic phase in chagasic
patients. J. Clin.Microbiol. 2009; 47, 1718–1725.
8.Burgos JM, Diez M, Vigliano C, Bisio M, Risso
M, Duffy T, et al. Molecular identification of Trypanosoma cruzi discrete typing units in end-stage
chronic Chagas heart disease and reactivation after
heart transplantation. Clin.Infect. Dis. 2010; 51,
485–495.
13
9.Câmara ACJ, Varela-Freire AA, Valadares HMS,
Macedo AM, D’Avila DA, Machado CR, et al.
Genetic analyses of Trypanosoma cruzi isolates
from naturally infected triatomines and humans in
northeastern Brazil. Acta Trop. 2010; 115, 205–211.
10.Burgos JM, Begher SB, Freitas JM, Bisio M,
Duffy T, Altcheh J, et al. Molecular diagnosis and
typing of Trypanosoma cruzi populations and lineages in cerebral Chagas disease in a patient with AIDS.
Am. J. Trop. Med. 2005; Hyg. 73, 1016–1018.
11.Burgos JM, Altcheh J, Bisio M, Duffy T, Valadares
HM, Seidenstein ME, et al. Direct molecular profiling of minicircle signatures and lineages of Trypanosoma cruzi bloodstream populations causing congenital Chagas disease. Int. J. Parasitol. 2007; 37,
1319–1327.
12.Burgos JM, Begher S, Silva HM, Bisio M, Duffy
T, Levin MJ, Macedo AM, et al. Molecular identification of Trypanosoma cruzi I tropism for central nervous system in Chagas reactivation due to AIDS. Am.
J. Trop. Med. Hyg. 2008; 78, 294–297.
13.Cura CI, Lucero RH, Bisio M, Oshiro E, Formichelli LB, Burgos JM, et al. Trypanosoma cruzi discrete typing units in Chagas disease patients from
endemic and non-endemic regions of Argentina.
Parasitology 2012; 139, 516-521.
14.Souto RP, Zingales B. Sensitive detection and
strain classification of Trypanosoma cruzi by amplification of a ribosomal RNA sequence. Mol. Biochem.
Parasitol. 1993; 62, 45–52.
15.Fernandes O, Mangia RH, Lisboa CV, Pinho AP,
Morel CM, Zingales B et al. The complexity of the
sylvatic cycle of Trypanosoma cruzi in Rio de Janeiro state (Brazil) revealed by the non-transcribed spacer of the mini-exon gene. Parasitology 1999; 118,
161-166.
16.Brisse S, Dujardin JC, Tibayrenc M. Identification
of six Trypanosoma cruzi phylogenetic lineages by
sequence-characterised amplified region markers.
Mol. Biochem. Parasitol. 2000; 111, 95–105.
17.Brisse S, Verhoef J, Tibayrenc M. Characterisation of large and small subunit rRNA and mini-exon
genes further supports the distinction of six Trypanosoma cruzi lineages. Int. J. Parasitol. 2001; 31,
1218–1226.
18.Bisio M, Cura C, Duffy T, Altcheh J, Giganti SO,
Begher S et al. Trypanosoma cruzi discrete typing
units in Chagas disease patients with HIV co-infection. Revista Biomédica 2009; 20, 166–178.
14
19.Diez M, Favaloro L, Bertolotti A, Burgos J, Vigliano
C, Peradejordi Lastra M et al. Usefulness of Polymerase
chain reaction for early diagnosis of Chagas disease reactivation in Heart Transplantation. Am. J. Transplantation
2007; 7:1633-1640.
20.Lewis MD, Ma J, Yeo M, Carrasco HJ, Llewellyn MS,
Miles MA. Genotyping of Trypanosoma cruzi: systematic
selection of assays allowing rapid and accurate discrimination of all known lineages. Am J Trop Med Hyg. 2009;
81(6):1041-1049.
21.Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA,
1996; 83(2):141-152.
22.Westenberger SJ, Sturm NR, Campbell DA. Trypanosoma cruzi 5S rRNA arrays define five groups and indicate the geographic origins of an ancestor of the heterozygous hybrids. Int J Parasitol. 2006; 36(3):337-346.
23.Cosentino RO, Agüero F. A simple strain typing assay
for Trypanosoma cruzi: discrimination of major evolutionary lineages from a single amplification product. PLoS
Negl Trop Dis. 2012; 6(7):e1777.
24.Guhl F, Ramírez JD. Trypanosoma cruzi I diversity:
towards the need of genetic subdivision?Acta Trop.
2011;119(1):1-4.
25.Ramírez JD, Duque MC, Montilla M, Cucunubá Z,
Guhl F. Natural and emergent Trypanosoma cruzi I
genotypes revealed by mitochondrial (Cytb) and nuclear
(SSU rDNA) genetic markers. Exp Parasitol. 2012;
132(4):487-494.
26.Oliveira RP, Broude NE, Macedo AM, Cantor CR,
Smith CL, Pena SD. Probing the genetic population structure of Trypanosoma cruzi with polymorphic microsatellites. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95(7):3776-3780.
27.Yeo M, Mauricio IL, Messenger LA, Lewis MD, Llewellyn MS, Acosta N, et al. Multilocus sequence typing
(MLST) for lineage assignment and high resolution diversity studies in Trypanosoma cruzi. PLoS Negl Trop Dis.
2011; 5(6):e1049.
28.Messenger LA, Llewellyn MS, Bhattacharyya T, Franzén O, Lewis MD, Ramírez JD et al. Multiple mitochondrial introgression events and heteroplasmy in Trypanosoma cruzi revealed by maxicircle MLST and next generation sequencing. PLoS Negl Trop Dis. 2012 ;6(4):e1584.
29.Valadares HM, Pimenta JR, Segatto M, Veloso VM,
Gomes ML, Chiari E et al. Unequivocal identification of
subpopulations in putative multiclonal Trypanosoma cruzi strains by FACs single cell sorting and genotyping.
PLoS Negl Trop Dis. 2012; 6(7):e1722.
30.Coura JR. Transmission of chagasic infection by
oral route in the natural history of Chagas disease.
Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2006; 39, 113–117.
31.Coura JR. Chagas disease: what is known and
what is needed – a background article. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz 2007; 102, 113–122.
32.Alarcón de Noya B, Díaz-Bello Z, Colmenares
C, Ruiz-Guevara R, Mauriello L, Zavala-Jaspe R et
al. Large urban outbreak of orally acquired acute
Chagas disease at a school in Caracas, Venezuela. J
Infect Dis. 2010; 201(9):1308-1315.
33.Marcili A, Lima L, Cavazzana MJ, Junqueira
ACV, Veludo HH, da Silva FM, et al. A new genotype of Trypanosoma cruzi associated with bats evidenced by phylogenetic analyses using SSU rDNA,
cytochrome b and HistoneH2B genes and genotyping based on ITS1 rDNA. Parasitology 2009; 136,
641–655.
34.Marcili A, Lima L, Valente VC, Valente SA,
Batista JS, Junqueira AC et al. Comparative phylogeography of Trypanosoma cruzi TCIIc: new hosts,
association with terrestrial ecotopes, and spatial
clustering. Infect. Genet. Evol. 2009; 9, 1265–1274.
35.Valente SA, da Costa Valente V, das Neves Pinto
AY, de Jesus Barbosa César M, dos Santos MP,
Miranda CO et al. Analysis of an acute Chagas disease outbreak in the Brazilian Amazon: human cases,
triatomines, reservoir mammals and parasites. Trans
R Soc Trop Med Hyg. 2009; 103(3):291-297.
36.Cura CI, Mejia-Jaramillo AM, Duffy T, Burgos
JM, Rodriguero M, Cardinal MV et al. Trypanosoma cruzi I genotypes in different geographical
regions and transmission cycles based on a microsatellite motif of the intergenic spacer of spliced-leader genes. Int. J. Parasitol. 2010. 40, 1599–1607.
37.Steindel M, Kramer Pacheco L, Scholl D, Soares
M, de Moraes MH, Eger I et al. Characterization of
Trypanosoma cruzi isolated from humans, vectors,
and animal reservoirs following an outbreak of acute human Chagas disease in Santa Catarina State,
Brazil. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008; 60(1):2532.
38.Svoboda M, Virreira M, Torrico F, Truyens C,
Alonso-Vega C, Solano M et al. Detection of the
molecular heterogeneity of Trypanosoma cruzi.
Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 2005; 38, 77–83.
39.Virreira M, Alonso-Vega C, Solano M, Jijena J,
Brutus L, Bustamante Z, et al. Congenital Chagas
disease in Bolivia is not associated with DNA polymorphism of Trypanosoma cruzi. Am. J. Trop. Med.
Hyg. 2006; 75, 871–879.
40.Corrales RM, Mora MC, Negrette OS, Diosque
P, Lacunza D, Virreira M, et al. Congenital Chagas
disease involves Trypanosoma cruzi sub-lineage IId in
the northwestern province of Salta. Argentina. Inf.
Genet. Evol. 2009; 9, 278–282.
41.Del Puerto F, Sanchez Z, Nara E, Meza G, Paredes
B, Ferreira E et al. Trypanosoma cruzi lineages detected
in congenitally infected infants and Triatoma infestans
from the same disease-endemic region under entomologic surveillance in Paraguay. Am. J. Trop. Med. Hyg.
2010; 82, 386–390.
42.Bosseno MF, Barnabé C, Magallon GE, Lozano KF,
Ramsey J, Espinoza B et al. Predominance of Trypanosoma cruzi lineage I in Mexico. J. Clin. Microbiol.
2002; 40, 627–632.
43.Montilla M, Guhl F, Jaramillo C, Nicholls S, Barnabé C, Bosseno MF et al. Isoenzyme clustering of Trypanosomatidae Colombian populations. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 2002; 66, 394–400.
44.Añez N, Crisante G, da Silva FM, Rojas A, Carrasco
H, Umezawa ES et al. Predominance of lineage I
among Trypanosoma cruzi isolates from Venezuelan
patients with different clinical profiles of acute Chagas’
disease. Trop. Med. Int. Health 2004, 9, 1319–1326.
45.Higo H, Miura S, Horio M, Mimori T, Hamano S,
Agatsuma T et al. Genotypic variation among lineages
of Trypanosoma cruzi and its geographic aspects. Parasitol. Int. 2004; 53, 337–344.
46.Sánchez-Guillén Mdel C, Bernabé C, Tibayrenc M,
Zavala-Castro J, Totolhua JL, Méndez-López J et al.
Trypanosoma cruzi strains isolated from human, vector,
and animal reservoir in the same endemic region in
Mexico and typed as T. cruzi I, discrete typing unit 1
exhibit considerable biological diversity. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 2006; 101(6):585-590.
47.Chapman MD, Baggaley RC, Godfreyfausset PF,
Malpas TJ, White G, Canese J et al. Trypanosoma cruzi
from the Paraguayan Chaco – isoenzyme profiles of
strains isolated at Makthlawaiya. J. Protozool. 1984;
31, 482–486.
48.Zingales B, Stolf BS, Souto RP, Fernandes O, Briones MR. Epidemiology, biochemistry and evolution of
Trypanosoma cruzi lineages based on ribosomal RNA
sequences. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 1999; 94,
159–164.
49.Brenière SF, Bosseno MF, Noireau F, Yacsik N, Liegeard P, Aznar C et al. Integrate study of a Bolivian
population infected by Trypanosoma cruzi, the agent of
Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 2002; 97,
289–295.
15
50.Diosque P, Barnabé C, Padilla AM, Marco JD,
Cardozo RM, Cimino RO, et al. Multilocus enzyme
electrophoresis analysis of Trypanosoma cruzi isolates from a geographically restricted endemic area for
Chagas’ disease in Argentina. Int. J. Parasitol. 2003;
33, 997–1003.
51.Coronado X, Zulantay I, Albrecht H, Rozas M,
Apt W, Ortiz S, et al. Variation in Trypanosoma cruzi clonal composition detected in blood patients and
xenodiagnosis triatomines: Implications in the
molecular epidemiology of Chile. Am. J. Trop. Med.
Hyg. 2006; 74, 1008–1012.
52.Cardinal MV, Lauricella MA, Ceballos LA,
Lanati L, Marcet PL, Levin MJ et al. Molecular epidemiology of domestic and sylvatic Trypanosoma
cruzi infection in rural northwestern Argentina. Int.
J. Parasitol. 2008; 38, 1533–1543.
59.Enriquez GF, Cardinal MV, Orozco MM, Lanati
L, Schijman AG, Gürtler RE. Discrete typing units of
Trypanosoma cruzi identified in rural dogs and cats
in the humid Argentinean Chaco. Parasitology 2012;
12:1-6.
60.Miles MA, Cedillos RA, Póvoa MM, de Souza
AA, Prata A, Macedo V. Do radically dissimilar
Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause
Venezuelan and Brazilian forms of Chagas' disease?
Lancet. 1981; 1(8234):1338-1340.
61.Freitas JM, Andrade LO, Pires SF, Lima R, Chiari
E, Santos RR et al. The MHC gene region of murine
hosts influences the differential tissue tropism of infecting Trypanosoma cruzi strains. PLoS One. 2009;
4(4):e5113.
53.Carranza JC, Valadares HMS, D’Avila DA, Baptista RP, Moreno M, Galvão LMC et al. Trypanosoma cruzi maxicircle heterogeneity in Chagas disease
patients from Brazil. Int. J. Parasitol. 2009; 39,
963–973.
54.Luquetti AO, Miles MA, Rassi A, de Rezende
JM, de Souza AA, Povoa MM et al. Trypanosoma
cruzi: zymodemes associated with acute and chronic
Chagas’ disease in central Brazil. Trans. R.
Soc.Trop. Med. Hyg. 1986; 80, 462– 470.
55.Freitas JM, Lages-Silva E, Crema E, Pena SDJ,
Macedo AM. Real time PCR strategy for the identification of major lineages of Trypanosoma cruzi
directly in chronically infected human tissues. Int. J.
Parasitol. 2005; 35, 411–417.
56.Lages-Silva E, Ramirez LE, Pedrosa AL, Crema
E, Cunha Galvão LM, Pena SDJ et al. Variability of
kinetoplast DNA gene signatures of Trypanosoma
cruzi II strains from patients with different clinical
forms of Chagas’ disease in Brazil. J. Clin. Microbiol. 2006; 44, 2167–2171.
57.Miles MA, Llewellyn MS, Lewis MD, Yeo M,
Baleela R, Fitzpatrick S et al. The molecular epidemiology and phylogeography of Trypanosoma cruzi
and parallel research on Leishmania: looking back
and to the future. Parasitology 2009; 136,
1509–1528.
58.Yeo M, Acosta N, Llewellyn M, Sanchez H,
Adamson S, Miles GAJ et al. Origins of Chagas
disease: didelphis species are natural hosts of Trypanosoma cruzi I and armadillos hosts of Trypanosoma
cruzi II, including hybrids. Int. J. Parasitol. 2005; 35,
225–233
16
Rev Esp Salud Pública 2013; 87:17-23 .
PONENCIA
MECHANISMS OF RESISTANCE TO ANTIPARASITIC DRUGS IN TRYPANOSOMA CRUZI.
CORRELATIONS BETWEEN GENOTYPE AND RESISTANCE (*)
John M Kelly (1) and Shane R Wilkinson (2).
(1) Department of Pathogen Molecular Biology. London School of Hygiene and Tropical Medicine. London WC1E 7HT. UK.
(2) School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London. London UK E1 4NS, UK.
(*) This work was funded by the Wellcome Trust (grant numbers 084175 and 092573).
ABSTRACT
The nitroheterocyclic compounds benznidazole and nifurtimox are
the only drugs licensed for treatment of Trypanosoma cruzi infections.
Both are pro-drugs and do not have significant trypanocidal properties
until they have undergone intra-parasitic activation. The enzyme responsible is a nitroreductase (TcNTR), which initiates a reductive cascade that leads to the generation of the toxic metabolites that kill the parasite. Processes that act to down-regulate this enzyme lead to cross-resistance against both front line drugs. These include the loss of one of the
chromosomes containing the TcNTR gene, or point mutations which
inactivate the enzyme. TcNTR heterozygotes are infectious, do not display an obvious deleterious phenotype, and are up to 5-fold more resistant to benznidazole and nifurtimox. Complete loss of TcNTR activity
however, renders T. cruzi largely non-infectious suggesting that there
may be a limit to the level of resistance by this mechanism. In natural
populations of T. cruzi, we found no evidence that the extensive variations in benznidazole-sensitivity were linked to mutations in TcNTR.
This, together with evidence that resistance to benznidazole and nifurtimox is not always linked, indicates that other mechanisms independent
of TcNTR can operate. New advances in technology provide opportunities to explore this further.
Keywords: Trypanosoma cruzi. Resistance. Antiparasitic drugs.
Correspondencia
John M Kelly
Department of Pathogen Molecular Biology,
London School of Hygiene and Tropical Medicine,
Keppel Street, London WC1E 7HT, UK.
[email protected]
RESUMEN
Correlación entre genotipo y resistencia
a los antiparasitarios en la
El benznidazol y el nifurtimox, compuestos nitroheterocíclicos, son los
únicos medicamentos aprobados para el tratamiento de las infecciones por
Trypanosoma cruzi. Ambos son profármacos y no tienen importantes propiedades tripanocidas hasta su activación intraparasitaria. La enzima responsable es una nitro-reductasa (TcNTR ), que inicia una cascada reductora
que conduce a la generación de los metabolitos tóxicos que matan al parásito. Los procesos que actúan para regular a esta enzima conducen a la resistencia cruzada contra ambos fármacos. Estos incluyen la pérdida de uno de
los cromosomas que contienen el gen TcNTR o mutaciones puntuales que
inactivan la enzima. Los parásitos TcNTR heterocigotos son infecciosos, no
muestran un fenotipo nocivo obvio y son hasta 5 veces más resistente a
benznidazol y el nifurtimox. Sin embargo, la pérdida completa de la actividad TcNTR hace que T. cruzi no sea infeccioso, lo que sugiere que puede haber un límite para el nivel de resistencia por este mecanismo. En las poblaciones naturales de T. cruzi no se encontraron pruebas de que las amplias
variaciones en la sensibilidad al benznidazol estén vinculadas a las mutaciones en TcNTR lo que, junto con la evidencia de que la resistencia a benznidazol y nifurtimox no siempre es conjunta, indica que existen otros mecanismos independientes de TcNTR. Los nuevos avances en tecnología
ofrecen la oportunidad de explorar más a fondo esta cuestión.
Palabras clave: Trypansosoma cruzi. Resistencia. Fármacos antiparasitarios.
John M. Kelly et al.
INTRODUCTION
Chagas disease is one of the world’s
major “Neglected Diseases”. It is caused
by infection with the protozoan parasite T.
cruzi, which is spread primarily by bloodsucking triatomine bugs. Other means of
transmission include the congenital route,
contaminated food and drink, organ transplantation and blood transfusion. Over 10
million people in Latin America are infected, with 10-20,000 deaths annually1. As a
result of migration, the disease is also
undergoing globalisation, with for example, more than 300,000 infected individuals in the USA2. In 2010, the WHO
announced that Chagas disease had become a serious public health challenge in
Europe, where 4,000 cases have been confirmed in the last 10 years and the estimated number of infections exceeds 80,0003.
This represents a major hidden disease
burden. The WHO report recommended
that “the capacity of national health
systems to correctly diagnose, manage
and treat the disease should be ensured”.
Chagas disease has three phases; acute,
indeterminate and chronic. The ‘acute’
stage is typically asymptomatic or relatively mild, and normally undiagnosed. In
children the infection can be more severe,
presenting as a generalised febrile illness,
with death from myocarditis or meningoencephalitis in up to 5% of diagnosed
cases. With the development of a cellular
immune response parasitemia is suppressed, although sterile immunity is not
achieved. This ‘indeterminate’ stage is
asymptomatic and can last throughout
life. However, these individuals remain a
source of infection. About 30% of those
infected with T. cruzi proceed to the
‘chronic’ stage, sometimes decades later.
This symptomatic phase is characterised
by clinical manifestations which include
cardiomyopathy, damage to the digestive
tract (mainly megacolon and megaoesophagus) and/or lesions in the peripheral
18
nervous system. Corrective surgery costs
$750 million/annum in Brazil alone 4 .
Chagas disease is a leading cause of premature heart disease in many parts of
Latin America, often resulting in sudden
cardiac failure. Reactivation of latent
Chagas disease in HIV/AIDS patients is
also observed, often with unusual clinical
manifestations, including CNS involvement5.
THE MECHANISMS OF ACTION OF
DRUGS USED TO TREAT T. CRUZI
INFECTIONS
There is unlikely to be a vaccine against
Chagas disease in the foreseeable future.
The main prevention strategy has been to
break the transmission cycle by focusing
on the insect vectors. These approaches
have had significant success6, although
problems have been encountered with
sustainability and re-infestation. For treatment of infected individuals, only two
drugs are available, nifurtimox and benznidazole, nitroheterocyclic compounds
which contain a nitro-group linked, respectively, to a furan and an imidazole
(figure 1) 7 . Both have been in use for
more than 40 years. Although effective
against the acute stage, their efficacy
against chronic disease is still under
investigation 8 . Treatment courses are
long, often stretching over several
months, with frequent side effects, which
can result in failure to complete the therapeutic schedule7. T. cruzi strains refractory to treatment are encountered throughout South America and laboratory-generated resistance is readily achievable9-11.
Given the large cohort of infected individuals, new drugs remain a major research
goal. Two parallel research strategies are
being prioritised. First, the development
of new drugs to cure or alleviate chronic
stage symptoms is being widely pursued,
with increasing input from public-private
partnerships. Second, there have been
concerted attempts to fully catalogue and
MECHANISMS OF RESISTANCE TO ANTIPARASITIC DRUGS IN TRYPANOSOMA CRUZI. CORRELATIONS BETWEEN ...
Figure 1
Structures of the nitroheterocyclic drugs used to treat T. cruzi infections
The highlighted regions in nifurtimox and benznidazole correspond to the 5-nitrofuran and the 2-nitroimidazole
groups respectively
dissect the range of mechanisms by which
resistance can arise so that the use of
current drugs can be optimised.
Nifurtimox and benznidazole are prodrugs that require to be activated within
the parasite to have trypanocidal effects, a
process that is mediated by nitroreductases (NTRs)9. For many years, the specific
enzyme(s) involved were unknown, and
there was no information on the nature of
the toxic metabolites that were involved
in parasite killing. In the case of nifurtimox, initial experiments had hinted that
there could be a role for reactive oxygen
species, which can be produced in parasite lysates following one-electron reduction of nifurtimox by type II NTR activity12,13. Under aerobic conditions, this
leads to the production of superoxide
radicals and the regeneration of nifurtimox, a process that has been termed “futile cycling”. Although several parasite flavin-dependent reductases have been linked with this mechanism13-15, there has
been no direct evidence for a functionally
significant role in drug activity. In addition,
parasites that have been genetically manipulated to enhance their oxidative defence
capacity do not display increased resistance
to nifurtimox16-22.
Other nitrofuran pro-drugs have antimicrobial activity, for example nitrofurantoin,
which can be used to treat urinary tract
infections. Drug-resistance in bacteria is
conferred by mutations to flavin-dependent
oxidoreductases belonging to the type I
NTR family23,24. These enzymes catalyse
the O 2 -insensitive NAD(P)H-dependent
two-electron reduction of the drug nitro
group. This results in the generation of a
hydroxylamine product, which can react
further to produce nitrenium ions, leading to
DNA breakage and damage to other macromolecules25,26 . In T. cruzi, two enzymes
have been identified that display type I
NTR-like activity. However, evidence suggests that one of these, prostaglandin F2α
synthase, does not have a significant role in
drug activation, as it is only capable of promoting nifurtimox reduction under anaerobic conditions 27 . Recently, it has been
demonstrated that the second, which has
been designated TcNTR, is primarily responsible for the activation of nifurtimox,
benznidazole and other nitroheterocyclic
drugs in T. cruzi9. The reduction of nifurtimox by this enzyme generates an unsaturated open-chain nitrile, which is responsible
for the trypanocidal effect28. In the case of
benznidazole, drug metabolism leads to the
formation of glyoxal, a metabolite with
diverse cytotoxic properties29.
19
THE T. CRUZI NITROREDUCTASE
(TcNTR)
TcNTR is a NADH-dependent type-I
nitroreductase which utilises FMN as a cofactor9,10,30. Although this class of enzyme is
typically bacterial, paralogues are found in
Trypanosoma brucei, Leishmania species
and some other protozoan parasites. TcNTR
can metabolise a range of nitroheterocycle
drugs including nitrofurans (such as nifurtimox) and nitroimidazoles (such as benznidazole)9,30. Deletion of one copy of the gene
confers resistance to these drugs. Similar
findings have been made in the African
trypanosome T. brucei9, where a genomewide RNAi screen for genes associated with
nifurtimox and benznidazole resistance by
loss-of-function mechanisms identified
TbNTR as the major candidate31.
Cross-resistance to nitroheterocyclic
drugs is easily achievable in the laboratory,
using either nifurtimox or benznidazole as
the selective agent. When we examined the
genetic profile of cross-resistant parasites
we found that loss of one copy of the chromosome containing the TcNTR gene was a
common feature9,10. Chromosome plasticity
is widely observed in trypanosomatids33 and
in vitro, resistance against heterocyclic
drugs by this mechanism appears to occur
without any obvious phenotypic consequences. Interestingly, sequence analysis of the
remaining TcNTR allele in one group of
benznidazole-resistant parasites, revealed
the presence of three distinct mutant genes
in different resistant clones (figure 2)10 .
These mutations were restricted to a region
of the enzyme associated with flavin-binding24 (figure 2) and had arisen independently within a single population. When
each of the mutant proteins were expressed
as a recombinant protein, they were unable
to activate either benznidazole or nifurtimox, a defect that correlated with loss of
FMN-binding capacity. The drug-resistant
phenotype could be reversed by transfection
with wild-type TcNTR.
20
The biological role of TcNTRs has yet to
be unequivocally defined. However, it has
been inferred from a functional screen in T.
brucei that the corresponding enzyme may
be involved in ubiquinone biosynthesis and
that it mediates the transfer of electrons
from NADH to ubiquinone (UQ9) to generate ubiquinol31. Consistent with this, the
trypanosome enzyme preferentially uses
NADH as an electron donor and quinones as
an electron acceptor, suggesting that in
vivo, it functions as a NADH:ubiquinone
oxidoreductase 30. When one copy of the
gene encoding the T. cruzi enzyme was disrupted by targeted gene deletion, the virulence phenotype of the drug-resistant parasites in vitro was found to be the same as
TcNTR homozygotes9,10. This potential for
nifurtimox/benznidazole cross-resistance
by loss of one copy of TcNTR, coupled with
the absence of haploid insufficiency, may be
an explanation for some of the treatment failures observed with these drugs. Complete
loss of TcNTR activity does however have a
significant detrimental effect 9,10 . Null
mutants display a considerably impaired
ability to infect mammalian cells. Even
when they do, there is a major reduction in
the number of amastigotes produced. This
implies that in vivo, there could be a limit to
the extent of resistance to nitroheterocyclic
drugs achievable by mechanisms involving
TcNTR (approximately 5-fold), since parasites are essentially non-infectious in the
absence of a residual level of enzyme activity.
THE COMPLEX NATURE OF DRUGRESISTANCE IN T. CRUZI
Mechanisms can act in concert to promote drug-resistance in T. cruzi. As described
above, in a single drug-selection experiment
with benznidazole, we were able to identify
two different mechanisms that led to reduced intracellular TcNTR activity and concomitant drug-resistance; chromosome loss
and point mutation10. Three distinct mutations were detected which had arisen indeRev Esp Salud Pública 2013
Figure 2
Mutations identified in TcNTR following selection of benznidazole-resistant T. cruzi
Clones were isolated from a population of benznidazole-resistant parasites and the TcNTR genes sequenced10. Differences in amino acid sequence compared to the parental sensitive strain were restricted to a single region of the protein (highlighted in turquoise). Mutations in the corresponding region of E. coli nfsB associated with nitrofurantoinresistance are indicated with asterisks23. The cartoon model of TcNTR identifies the FMN-binding regions by analogy
with E. coli nfsB24. A box identifies the relevant residues in the TcNTR sequence.
pendently in this single population (figure
2). The ability of T. cruzi to readily develop
resistance by mutational mechanisms could
reflect evolved features associated with
genome maintenance. This parasite contains
many highly variant surface antigen genes
which are present in multiple copies, examples being the trans-sialidase and mucin
super-families34. One possibility is that this
extensive antigenic diversity could have arisen as a result of DNA polymerase and/or
DNA repair mechanisms with reduced proof-reading ability, properties selected in response to strong immune pressure. As a consequence, T. cruzi may have an enhanced
ability to develop drug-resistance by
mechanisms involving point mutation or
chromosome rearrangement. This will be an
important factor to consider when new treatment regimes for Chagas disease are
being designed.
Although, resistance mediated by TcNTR
is a readily acquired trait, other experimental evidence also indicates that additional
mechanisms can impinge on drug efficacy.
This was apparent from a study that we
undertook to investigate possible associations between the sequence of TcNTR and
susceptibility to benznidazole10. We analy-
sed the genes from 28 T. cruzi Colombian
strains derived from a variety of biological
and geographical backgrounds 1 0 . 17
synonymous polymorphisms were detected
in this sample, although these were restricted to just 7 of the strains. None of the polymorphisms were located in regions of
TcNTR implicated in enzyme activity. The
major haplotype grouping, which encompassed the other 21 strains, displayed a wide
range of benznidazole-sensitivities (IC50 435µM ). This naturally occurring variation
in sensitivity was therefore independent of
TcNTR sequence. Other studies have also
shown that resistance to nifurtimox can
occur independently of resistance to benznidazole35. By implication, additional mechanisms which give rise to resistance against
nitroheterocyclic drugs must exist. Identifying these, using the full complement of
post-genome technologies, must be regarded as a priority for Chagas disease researchers.
BIBLIOGRAPHY
1. Moncayo A, Silveira AC. Current epidemiological
trends for Chagas disease in Latin America and future
challenges in epidemiology, surveillance and health
policy. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104:17-30.
21
2. Bern C, Montgomery SP. An estimate of the burden of Chagas disease in the United States. Clin
Infect Dis. 2009; 49:e52-54.
3. Available in: http://www.who.int/neglected_diseases/integrated_media_chagas_statement/en/index.
html
4. Moncayo A. Chagas Disease: Current epidemiological trends after the interruption of vectorial and
transfusional transmission in the southern cone
countries. Mem Inst Owaldo Cruz. 2003; 98:577591.
5. Diazgranados CA, Saavedra-Trujillo CH, Mantilla M, Valderrama SL, Alquichire C, Franco-Paredes C. Chagasic encephalitis in HIV patients: common presentation of an evolving epidemiological
and clinical association. Lancet Infect Dis. 2009;
9:324-30.
6. Schofield CJ, Jannin J, Salvatella R. The future
of Chagas disease control. Trends Parasitol. 2006;
22:583-588.
7. Wilkinson SR, Kelly JM. Trypanocidal drugs:
mechanisms, resistance and new targets. Expert Rev
Mol Med. 2009; 11:e31, pp1-24.
8. Urbina JA. Specific chemotherapy of Chagas
disease: Relevance, current limitations and new
approaches. Acta Trop. 2010; 115:55-68.
9. Wilkinson SR, Taylor MC, Horn D, Kelly JM,
Cheeseman I. A mechanism for cross-resistance to
nifurtimox and benznidazole in trypanosomes. Proc
Natl Acad Sci USA. 2008; 105:5022-5027.
10. Mejia AM, Hall BS, Taylor MC, Gómez-Palacio
A, Wilkinson SR, Triana-Chávez O, et al. Benznidazole-resistance in Trypanosoma cruzi is a readily
acquired trait that can arise independently in a single population J Inf Dis. 2012; 206:220-228.
11. Murta SM, Gazzinelli RT, Brener Z, Romanha
AJ. Molecular characterization of susceptible and
naturally resistant strains of Trypanosoma cruzi to
benznidazole and nifurtimox. Mol Biochem Parasitol. 1998; 93:203-214.
12. Docampo R. Sensitivity of parasites to free radical damage by antiparasitic drugs. Chem Biol Interact. 1990; 73:1-27.
13. Viode C, Bettache N, Cenas N, Krauth-Siegel
RL, Chauvière G, Bakalara N, et al. Enzymatic
reduction studies of nitroheterocycles. Biochem
Pharmacol. 1999; 57:549-557.
22
14. Henderson GB, Ulrich P, Fairlamb AH, Rosenberg I,
Pereira M, Sela M, et al. “Subversive” substrates for the
enzyme trypanothione disulfide reductase: alternative
approach to chemotherapy of Chagas disease. Proc Natl
Acad Sci USA. 1998; 85:5374-5378.
15. Blumenstiel K, Schöneck R, Yardley V, Croft SL,
Krauth-Siegel RL. Nitrofuran drugs ascommon subversive substrates of Trypanosoma cruzi lipoamide dehydrogenase and trypanothione reductase. Biochem Pharm
1999; 58:1791-1799.
16. Common subversive substrates of Trypanosoma cruzi lipoamide dehydrogenase and trypanothione reductase. Biochem Pharm. 1999; 58:1791-1799.
17. Wilkinson SR, Obado SO, Mauricio IL, Kelly JM.
Trypanosoma cruzi expresses a plant-like ascorbatedependent haemoperoxidase localized to the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA. 2002;
99:13453-13458.
18. Wilkinson SR, Temperton NJ, Mondragon A, Kelly
JM. Distinct mitochondrial and cytosolic enzymes
mediate trypanothione-dependent peroxide metabolism
in Trypanosoma cruzi. J Biol Chem. 2000; 275:82208225.
19. Wilkinson SR, Meyer DJ, Taylor MC, Bromley EV,
Miles MA, Kelly JM. The Trypanosoma cruzi enzyme
TcGPXI is a glycosomal peroxidase and can be linked to
trypanothione reduction by glutathione or tryparedoxin.
J Biol Chem. 2002; 277:17062-17071.
20. Wilkinson SR, Taylor MC, Touitha S, Mauricio IL,
Meyer DJ, Kelly JM. TcGPXII, a glutathione-dependent
Trypanosoma cruzi peroxidase with substrate specificity
restricted to fatty acid and phospholipid hydroperoxides,
is localised to the endoplasmic reticulum. Biochem J.
2002; 364:787-794.
21. Wilkinson SR, Horn D, Prathalingam SR, Kelly JM.
RNAi identifies two hydroperoxide metabolising enzymes that are essential to the bloodstream form of the
African trypanosome. J Biol Chem. 2003; 278:3164031646.
22. Wilkinson SR, Prathalingam R, Taylor MC, Ahmed
A, Horn, D. Kelly JM. Functional characterisation of the
iron superoxide dismutase gene repertoire in Trypanosoma brucei. Free Radical Biol Med. 2006; 40:198-209.
23. Kelly JM, Taylor MC, Smith K, Hunter KJ, Fairlamb
AH. Phenotype of recombinant Leishmania donovani
and Trypanosoma cruzi which overexpress trypanothione reductase: sensitivity towards agents that are thought
to induce oxidative stress. Eur J Biochem. 1993; 218:2937.
24. Whiteway J, Koziarz P, Veall J, Sandhu N,
Kumar P, Hoecher B, et al. Oxygen-insensitive
nitroreductases: analysis of the roles of nfsA and
nfsB in development of resistance to 5-nitrofuran
derivatives in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;
180:5529-39.
35. Filardi LS, Brener Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to
drugs used clinically in Chagas disease. Trans R
Soc Trop Med Hyg. 1987; 81:75575-75579.
25. Parkinson GN, Skelly JV, Neidle S. Crystal
structure of FMN-dependent nitroreductase from
Escherichia coli B: A prodrug-activating enzyme.
J Med Chem 2000; 43:3624-31.
26. McCalla DR, Reuvers A, Kaiser C. Breakage
of bacterial DNA by nitrofuran derivatives. Cancer Research. 1971; 31:2184-2188.
27. Streeter AJ, Hoener BA. Evidence for the
involvement of a nitrenium ion in the covalent
binding of nitrofurazone to DNA. Pharm Res.
1988; 5:434-436.
28. Kubata BK, Kabututu Z, Nozaki T, Munday
CJ, Fukuzumi S, Ohkubo K, et al. A key role for
old yellow enzyme in the metabolism of drugs by
Trypanosoma cruzi. J Exp Med. 2002; 196:12411251.
29. Hall BS, Bot C, Wilkinson SR. Nifurtimox
activation by trypanosomal type I nitroreductases
generates cytotoxic nitrile metabolites. J Biol
Chem. 2011; 286:13088-13095.
30. Hall BS, Wilkinson SR. Activation of benznidazole by trypanosomal type I nitroreductases
results in glyoxal formation. Antimicrob Agents
Chemother. 2012; 56:115-123.
31. Hall BS, Meredith EL, Wilkinson SR. Targeting the substrate preference of a type I nitroreductase to develop antitrypanosomal quinonebased prodrugs. Antimicrob Agents Chemother.
2012; 56:5821-5830.
32. Alsford S, Eckert S, Baker N, Glover L, Sanchez-Flores A, Leung KF, et al. High-throughput
decoding of antitrypanosomal drug efficacy and
resistance. Nature. 2012; 482:232-236.
33. Obado SO, Bot C, Nilsson D, Andersson B,
Kelly JM. Repetitive DNA is associated with centromeric domains in Trypanosoma brucei but not
Trypanosoma cruzi. Genome Biology. 2007;
8:R37.
34. Franzén O, Talavera-López C, Ochaya S,
Butler CE, Messenger LA, Lewis MD, et al. Shotgun sequencing analysis of Trypanosoma cruzi I
Sylvio X10/1 and comparison with T. cruzi VI CL
Brener. PLoS Negl Trop Dis. 2011; 5:e984.
23
Rev Esp Salud Pública 2013; 87:25-32.
PONENCIA
THE IMMUNE RESPONSE IN CHAGAS DISEASE AND ITS ROLE IN THE VARIABILITY
OF CLINICAL EXPRESSION
Dutra Walderez O (1,2,), NS Hojo-Souza, (1,2) and Kenneth J Gollob (2,3).
(1) Cell-cell interactions Lab. Department of Morphology. Biological Sciences Institute. Federal University of Minas Gerais. Belo Horizonte. MG. Brazil
(2) Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia – Doenças Tropicais (INCT-DT). Belo Horizonte. MG. Brazil.
(3) Graduate Program in Biomedicine. Santa Casa Hospital. Belo Horizonte. Brazil
The authors do not have a commercial or other association that might pose a conflict of interest. This work
was funded by NIH/NIAID - AI066044-03, INCT-DT, FAPEMIG and CNPq.
ABSTRACT
For the past several years, our laboratory has been interested in
understanding the mechanisms that coordinate the establishment of protective versus pathogenic immune responses in human disease. Upon
infection with a pathogen, a series of events happen inside the host that
will culminate with either the control of the pathogen, often leading to
the cure of the infection, or with the lack of proper control of the pathogen and chronification of the infection. Due to the high adaptation of the
parasite to its hosts, reflective of millions of years of co-evolution, the
outcome of a parasitic infection is often the chronification. At this point,
an intriguing event takes place: despite the control of parasitemia, the
chronification of the infection is associated with the establishment of
different clinical diseases. In endemic populations, the great majority of
subjects develop what can be considered a “mild” clinical form of the
diseases, which also reflects the adaptation of the parasite to its host.
However, a significant percentage of the infected individuals develop
what is considered a “severe” form (or forms) of the disease. This is true
for many parasitic diseases such as leishmaniasis, schistosomiasis, and
Chagas disease, focus of this review. Here we will discuss the mechanisms that drive the establishment of protective versus pathogenic
immune responses, which are directly associated to the establishment of
mild or severe forms of Chagas disease, considering the host-related factors.
Keywords: Trypanosoma cruzi. Chagas disease. Immunopathology. Immunoregulation.
Correspondencia
Walderez O. Dutra, Ph.D.
Department of Morphology
Federal University of Minas Gerais-ICB
Av. Antônio Carlos, 6627
Belo Horizonte
MG, 31920-000, Brazil.
[email protected].
RESUMEN
Respuesta inmune en la enfermedad de
Chagas y relación con su variabilidad
clínica
Durante los últimos años nuestro laboratorio ha estado interesado en la
comprensión de los mecanismos que coordinan el establecimiento de la
respuesta inmune protectora frente a patógenos en las enfermedades humanas. Tras la infección con un patógeno, ocurren una serie de eventos
dentro del huesped que culminarán con el control del patógeno, lo que a
menudo conduce a la curación de la infección o bien a la falta de un
control adecuado y la cronificación de la infección. Debido a la alta
adaptación del parásito a sus anfitriones, lo que refleja millones de años
de co-evolución, el resultado de una infección parasitaria es a menudo
la cronificación. En este punto, tiene lugar un evento intrigante: a pesar
del control de la parasitemia, la cronificación de la infección está asociada con el desarrollo de enfermedad. En las poblaciones endémicas,
la gran mayoría de los sujetos desarrollan lo que se puede considerar
una forma clínica "leve" de la enfermedad, lo que también refleja la
adaptación del parásito a su huesped. Sin embargo, un porcentaje importante de los individuos infectados desarrollan lo que se considera
formas "graves" de la enfermedad. Esto es cierto para muchas enfermedades parasitarias como la leishmaniasis, la esquistosomiasis y la enfermedad de Chagas, la cual centra esta revisión. En este trabajo vamos a
discutir los mecanismos que impulsan el establecimiento de la respuesta inmune protectora frente a patógenos, los cuales están directamente
relacionados con el establecimiento de las formas leves o graves de la
enfermedad de Chagas, teniendo en cuenta los factores relacionados
con el huesped.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi. Enfermedad de Chagas. Immunopatología. Immunoregulación.
Dutra Walderez et al.
INTRODUCTION
Chagas disease, caused by the infection
with the protozoan parasite Trypanosoma
cruzi, was discovered over 100-years ago
by the Brazilian scientist Carlos Chagas1.
In 1909, Chagas identified the parasite,
described its life cycle and the first case of
human infection. Despite its relatively
recent discovery, genetic material from T.
cruzi was detected in mummies from the
Andean region over 9,000 years ago 2 .
Also, compelling evidence has been
found that the famous geneticist, Charles
Darwin, who died in 1882, years before
Chagas’ discovery, had been infected with
T. cruzi.
T. cruzi is transmitted in many different
ways, but the most common form of transmission is still via the contact with contaminated feces of hematophagous triatomine insects, which, during the blood
meal, lay feces containing the infective
form of the parasite, the trypomastigote
form, on the host’s skin. As it enters the
host’s organism, trypomastigotes infect
different cell types, especially monocytes,
macrophages and muscle cells, where
they differentiate into the replicative
amastigote form. After many binary divisions, the amastigote forms differentiate
into trypomastigotes, rupturing the cells
and, gaining the extracellular matrix or
the bloodstream, will invade other cells.
The life cycle is complete when the vector
acquires trypomastigote forms from the
host during the blood meal and, inside of
the insect, these forms differentiate into
another replicative form, the epimastigote
form; after successive divisions, the epimastigote forms differentiate into trypomastigotes, which are expelled with the
feces.
Other forms of transmission have become very important from the epidemiological point of view. In the past years, ingestion of contaminated juices has led to
26
cases of acute Chagas disease in Brazil, a
country in which transmission had been
considered interrupted, due to a successful vector control program3. Moreover,
contamination via blood transfusion and
organ transplantation brought Chagas
disease to areas where it is not considered
endemic, such as Europe and the United
States4. The alarming number of cases
registered in the US led to a change in
policy with regards to Chagas disease and
screening for Chagas disease in blood
banks is now mandatory in most regions of
the country4. The increasing mobility of the
world population, which may expose nonendemic areas to diseases, and the climate
changes, which may influence the adaptation of the transmitting vectors, are factors
that represent a great concern for the
worldwide spreading of Chagas disease.
While treatment for Chagas disease
exists, it is most successful if administered
in the acute phase of the disease 5 ; also,
because of its side effects, some people may
not be eligible for treatment. Thus, preventive measures of transmission, as well as new
and more efficient treatments are critical
needs in Chagas disease. If the infection is
identified early on, therapeutics is usually
employed and the chance of successful control of the parasite is of around 90%5. However, if the disease is not treated or if the treatment is not efficient, the infected individuals will enter the chronic phase of the
infection, which may last for their entire life.
In the chronic phase, most patients (about
70%) remain in an asymptomatic clinical
form, named indeterminate, which is the
correlate of the “mild” clinical form mentioned early on. However, 30% of the patients
develop severe forms, resulting from alterations in the digestive system (digestive
form) or in the heart (cardiac form). The
later is the most severe form, accounting for
10,000 deaths every year6. Why most
patients remain totally asymptomatic, while
a significant number develop a deadly disease is an important (an unanswered) question.
THE IMMUNE RESPONSE IN CHAGAS DISEASE AND ITS ROLE IN THE VARIABILITY OF CLINICAL EXPRESSION
The distinct clinical evolution of Chagas disease has been associated with
aspects related to the parasite, as well as
to the host. Factors such as parasite strain
and tissue tropism, parasite load and time
of infection play important roles7. However, it is recognized that the host’s immune response is critical in determining disease evolution.
INDETERMINATE FORM OF CHAGAS DISEASE: EQUILIBRIUM BETWEEN HOST AND PARASITE.
Early studies demonstrated that peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
from indeterminate patients proliferate
upon stimulation with T. cruzi-derived
antigens8 and display a high frequency of
activated CD4+ and CD8+ T cells9. In different studies, we have consistently found
a correlation between IL-10 expression by
T cells and monocytes and the indeterminate form of Chagas disease10-12. Analysis
of clinical parameters that measure cardiac function has shown a direct correlation of better cardiac function and IL-10
expression12. Thus, given the immunoregulatory function of IL-10 and its consistent predominance over inflammatory
cytokines in indeterminate patients, it is
possible that IL-10 displays an important
role in maintaining this protective phenotype, as the indeterminate form seems
to represent a state of immunological
equilibrium between the host and the
parasite, with no development of pathology. Table 1 presents a list of papers that
directly demonstrated the association of
IL-10 and the indeterminate form of Chagas disease.
CARDIAC DISEASE: A LACK OF
PROPER IMMUNOLOGICAL
MODULATION?
Chronic chagasic cardiomyopathy is a
result of an intense inflammatory infiltrate in the myocardium, mostly associated
with T. cruzi antigens13, particularly composed of activated, TNF-alpha and
granzyme-expressing CD8+ T cells14.
Several studies have shown that PBMC
from cardiac patients, like those from
indeterminate patients, proliferate in vitro
upon exposure to parasite or host-derived
antigens8. CD4+ and CD8+ circulating T
cells from both cardiac and indeterminate
patients are highly activated9,10. However,
significant functional differences distinguish these activated cell populations in
the two clinical forms. While we observed
a modulatory profile in activated T cells
from indeterminate patients, we observed
expression of the inflammatory cytokine
TNF-alpha in those of cardiac
patients10,15. A correlation between serum
levels of TNF-alpha and another inflammatory cytokine, IFN-gamma, and the
occurrence of severe chagasic cardiomiopathy has also been established 16-18 .
Moreover, we found that in vitro exposure to T. cruzi trypomastigotes induces preferential expression of TNF-alpha over
IL-10 by monocytes of cardiac patients11.
The in vitro findings of high expression of
the inflammatory cytokines and low
expression of IL-10 are consistent with
the inflammation observed in situ in cardiac patients. Given all this data, it is reasonable to hypothesize that cardiac disease represents a lack of control of the
immune response, leading to the establishment of inflammation and tissue damage. Other authors suggest that the immune
response observed in cardiac patients
represent an “immunological exhaustion”19. Considering this hypothesis, it is
possible that the IL-10 producing cells,
previously activated during the indeterminate phase, could be more susceptible to
s uch mec han is m. The mec hanis ms
through which this ability to control the
inflammation is lost as diseases progresses from indeterminate to cardiac form is
a critical point to be addressed.
27
Table 1
High IL-10 is associated with the indeterminate form of Chagas disease
Finding
Reference
Predominance of Th1 response in cardiac patients
Gomes et al., 200318
Correlation between CD28- T cells and IL-10 levels in indeterminate, but not cardiac, patients Menezes et al., 200410
Increased expression of IL-10 by monocytes from indeterminate, but not cardiac, patients Souza et al., 200411
Increased frequency of IL-10+CD4+CD25high cells in indeterminate but not cardiac patients
de Araújo et al., 201121
Increased IL-10 in sera from indeterminate patients as compared to cardiac
D’Avila et al., 200923
Ex vivo IL-10 regulatory profile of cells from indeterminate patients
Higher expression of IL-10 by CD4-CD8- T cells from indeterminate but not cardiac patients
GENETIC SUSCEPTIBILITY TO
CARDIAC CHAGAS DISEASE
The variability in the clinical manifestations of Chagas disease, mirrored by the
variability observed in the immune response of patients belonging to different
clinical forms, suggests that host genetic
factors may play a role in controlling the
immune response and, thus, may be useful as disease susceptibility markers. In
the past years, a number of studies have
shown that polymorphisms in genes that
code for cytokines, chemokines and other
molecules that influence the immune response are associated with different clinical forms of Chagas disease15. Relevant
for the hypothesis we discussed above is a
study on IL10 gene polymorphism and its
association with cardiac Chagas disease.
Studying a cohort of Brazilian Chagas
patients, we have shown that the functional IL10 gene polymorphism -1082 A/G
that leads to the low expression of IL-10 is
associated with the development of Chagas heart disease20. Thus, it is possible
that genetic factors govern the immune
response in Chagas patients, influencing
the outcome of infection. Interestingly,
polymorphisms in the TNF gene, did not
show any association with the different
clinical forms of Chagas disease in Brazi28
Vitelli-Avelar et al., 200822
Villani et al., 201012
lians, while it was associated with disease
severity in other populations (see table 2
for references). The contradiction of these
findings may be related to the distinct
genetic background of the populations
studied. Table 2 summarizes the gene
polymorphisms in cytokine genes and
other immunologically relevant molecules in Chagas disease.
CONCLUSION
The data presented here supports the
hypothesis that host’s immune response is
strongly associated with the differential
clinical evolution of Chagas disease.
However, given the complex nature of the
host parasite interactions and the immune
response itself, the exact mechanisms
through which the immune response is
established and influences disease evolution are not completely understood. Further studies of patients with well-defined
clinical forms, especially the ones designed as longitudinal studies, may help clarify some of the questions that still remain
open. Also, studies combining host and
parasite factors will be crucial for the
understanding of the disease, as it reflects
the consequences of this complex interaction.
Table 2
Polymorphisms in genes coding for molecules related to the immune response and their
association with chronic Chagas cardiac disease (CCC)
Gene polymorphism
Finding
References
Variable according to the population studied
Deghaide et al., 1998 24
Faé et al., 200025
Fernandes-Mestre et al., 199826
Colorado et al., 200027
Layrisse et al., 200028
Nieto et al., 200029
Cruz-Robles et al., 200430
Garcia-Borrás et al., 200931
TNFA
Beraún et al., 199832
Drigo et al., 200733
Pissetti et al., 201134
Rodrígues-Péres et al.,
200535Criado et al., 201236
TNFB
Beraún et al., 199832
Ramasawmy et al., 200737
MHC genes
Toll-like receptors
MAL/TIRAP
CCL2/MCP-1
BAT-1
CCR5
IKBL/NFKBIL1
MIF
TGF-β1
IFN-
IL1A
IL1B
IL1RN
IL6
IL10
IL12
Association with protection to CCC
Zafra et al., 200838
Association with development of CCC
No association with disease
No association with CCC
Association with development of CCC in Brazilians but not in Colombians
Calzada et al., 200142
Fernandes-Mestre et al., 200443
Torres et al., 200945
Calzada et al., 200946
Torres et al., 2010a47
Flórez et al., 200648
Cruz-Robles et al., 200949
Torres et al., 201050
Costa et al., 201020
Zafra et al., 200752
29
BIBLIOGRAPHY
1.Chagas C. Nova tripanozomiaze humana. Estudos sobre
a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi
n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida
do homem. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1909; 1:159-218.
2.Aufderheide AC, Salo W, Madden M, Streitz J, Buikstra
J, Guhl F, et al. A 9,000-year record of Chagas' disease.
Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101(7):2034-2039.
3.Dias JC. Southern Cone Initiative for the elimination of
domestic populations of Triatoma infestans and the interruption of transfusion Chagas disease: historical aspects,
present situation, and perspectives. Mem Inst Oswaldo
Cruz. 2007;102 Supl 1:11-18.
4.Bern C, Kjos S, Yabsley MJ, Montgomery SP. Trypanosoma cruzi and Chagas' Disease in the United States. Clin
Microbiol Rev. 2011; 24(4):655-681.
5.Sosa-Estani S, Segura EL. Etiological treatment in
patients infected by Trypanosoma cruzi: experiences in
Argentina. Curr Opin Infect Dis. 2006; 19(6):583-587.
6.World Health Organization. Tropical Disease Research.
Programme for research and training tropical disease
(TDR. Fact sheet 2012; 340 [cited aug. 2012]. Avalaible:www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/index.
html.
7.Dutra WO, Gollob KJ. Current concepts in immunoregulation and pathology of human Chagas disease. Curr
Opin Infect Dis. 2008; 21(3):287-292.
8.Dutra WO, Colley DG, Pinto-Dias JC, Gazzinelli G,
Brener Z, Pereira ME, et al. Self and nonself stimulatory
molecules induce preferential expansion of CD5+ B cells
or activated T cells chagasic patients, respectively. Scand
J Immunol. 2000; 51(1): 91-97.
9.Dutra WO, Martins-Filho OA, Cançado JR, Pinto-Dias
JC, Brener Z, Freeman Júnior GL, et al. Activated T and B
lymphocytes in peripheral blood of patients with Chagas’
disease. Int Immunol. 1994; 6(4):499-506.
10.Menezes CA, Rocha MO, Souza PE, Chaves AC,
Gollob KJ, Dutra WO. Phenotypic and functional characteristics of CD28+ and CD28- cells from chagasic
patients: distinct repertoire and cytokine expression. Clin
Exp Immunol. 2004; 137(1):129-138.
11.Souza PE, Rocha MO, Rocha-Vieira E, Menezes CA,
Chaves AC, Gollob KJ, et al. Monocytes from patients
with indeterminate and cardiac forms of Chagas' disease
display distinct phenotypic and functional characteristics
associated with morbidity. Infect Immun. 2004;
72(9):5283-5291.
30
12.Villani FN, Rocha MO, Nunes MC, Antonelli LR,
Magalhães LM, dos Santos JS, et al. Trypanosoma cruziinduced activation of functionally distinct αβ and γδ
CD4_ CD8_ T cells in individuals with polar forms of
Chagas’ disease. Infect Immun. 2010; 78(10):44214430.
13.Fuenmayor C, Higuchi ML, Carrasco H, Parada H,
Gutierrez P, Aiello V, et al. Acute Chagas' disease: immunohistochemical characteristics of T cell infiltrate and its
relationship with T. cruzi parasitic antigens. Acta Cardiol. 2005; 60(1):33-37.
14.Reis DD, Jones EM, Tostes S Jr, Lopes ER, Gazzinelli G, Colley DG, et al. Characterization of inflammatory
infiltrates in chronic chagasic myocardial lesions: presence of tumor necrosis factor-alpha+ cells and dominance of granzyme A+, CD8+ lymphocytes. Am J Trop
Med Hyg. 1993; 48(5):637-644.
15.Dutra WO, Menezes CA, Villani FN, da Costa GC, da
Silveira AB, Reis D, et al. Cellular and genetic mechanisms involved in the generation of protective and pathogenic immune responses in human Chagas disease. Mem
Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104 Supl 1:208-218.
16.Ferreira RC, Ianni BM, Abel LC, Buck P, Mady C,
Kalil J, et al. Increased plasma levels of tumor necrosis
factor-alpha in asymptomatic/"indeterminate" and Chagas disease cardiomyopathy patients. Mem Inst Oswaldo
Cruz. 2003; 98(3):407-411.
17.Talvani A, Rocha MO, Barcelos LS, Gomes YM,
Ribeiro AL, Teixeira MM. Elevated concentrations of
CCL2 and tumor necrosis factor-alpha in chagasic cardiomyopathy. Clin Infect Dis. 2004; 38(7):943-950.
18.Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, MartinsFilho OA, Gazzinelli G, Correa-Oliveira R. Evidence
that development of severe cardiomyopathy in human
Chagas' disease is due to a Th1-specific immune response. Infect Immun. 2003; 71(3):1185-1193.
19.Albareda MC, Laucella SA, Alvarez MG, Armenti
AH, Bertochi G, Tarleton RL, et al. Trypanosoma cruzi
modulates the profile of memory CD8+ T cells in chronic
Chagas' disease patients. Int Immunol. 2006; 18(3):465471.
20.Costa GC, da Costa Rocha MO, Moreira PR, Menezes CA, Silva MR, Gollob KJ, et al. Functional IL-10
gene polymorphism is associated with Chagas disease
cardiomyopathy. J Infect Dis. 2009; 199(3):451-454.
21.de Araújo FF, Vitelli-Avelar DM, Teixeira-Carvalho
A, Antas PR, Assis Silva Gomes J, Sathler-Avelar R, et
al. Regulatory T cells phenotype in different clinical
forms of Chagas' disease. PLoS Negl Trop Dis. 2011;
5(5):e992.
22.Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, TeixeiraCarvalho A, Pinto Dias JC, Gontijo ED, Faria AM, et
al. Strategy to assess the overall cytokine profile of
circulating leukocytes and its association with distinct clinical forms of human Chagas disease. Scand
J Immunol. 2008; 68(5):516-525.
23.D'Avila DA, Guedes PM, Castro AM, Gontijo ED,
Chiari E, Galvão LM. Immunological imbalance between IFN-gamma and IL-10 levels in the sera of
patients with the cardiac form of Chagas disease.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 2009; 104(1):100-105.
24.Deghaide NH, Dantas RO, Donadi EA. HLA class
I and II profiles of patients presenting with Chagas’
disease. Dig Dis Sci. 1998; 43(2):246- 252.
25.Faé KC, Drigo SA, Cunha-Neto E, Ianni B, Mady
C, Kalil J, et al. HLA and beta-myosin heavy chain do
not influence susceptibility to Chagas’ disease cardiomyopathy. Microbes Infect. 2000; 2(7):745−751.
26.Fernandez-Mestre MT, Layrisse Z, Montagnani S,
Acquarella H, Catalioti F, Matos M, et al. Influence
of the HLA class II polymorphism in chronic Chagas’
disease. Parasite Immunol. 1998; 20(4):197-203.
27.Colorado IA, Acquatella H, Catalioti F, Fernandez
MT, Layrisse Z. HLA class II DRB1, DQB1, DPB1
polymorphism and cardiomyopathy due to Trypanosoma cruzi chronic infection. Hum Immunol. 2000;
61(3):320–325.
28.Layrisse Z, Fernandez MT, Montagnani S, Matos
M, Balbas O, Herrera F, et al. HLA-C(*)03 is a risk
factor for cardiomyopathy in Chagas disease. Hum
Immunol. 2000; 61(9):925–929.
29.Nieto A, Beraún Y, Collado MD, Caballero A,
Alonso A, González A. et al. HLA haplotypes are
associated with differential susceptibility to Trypanosoma cruzi infection. Tissue Antigens. 2000;
55(3):195-198.
30.Cruz-Robles D, Reyes PA, Monteón-Padilla VM,
Ortiz-Muñiz AR, Vargas-Alarcón G. MHC class I and
class II genes in Mexican patients with Chagas disease. Hum Immunol. 2004; 65(1):60–65.
31.García-Borrás S, Racca L, Cotorruelo C, Biondi
C, Beloscar J, Racca A. Distribution of HLA-DRB1
alleles in Argentinean patients with Chagas’ disease
cardiomyopathy. Immunol Invest. 2009; 38(34):268-275.
32.Beraún Y, Nieto A, Collado MD, González A,
Martín J. Poly¬morphisms at tumor necrosis factor
(TNF) loci are not associated with Chagas’ disease.
Tissue Antigens. 1998; 52(1):81-83.
33.Drigo SA, Cunha-Neto E, Ianni B, Mady C, Faé
KC, Buck P, et al. Lack of association of tumor
necrosis factor-alpha polymorphisms with Chagas
disease in Brazilian patients. Immunol Lett. 2007;
108(1):109–111.
34.Pissetti CW, Correia D, de Oliveira RF, Llaguno
MM, Balarin MA, Silva-Grecco RL, et al. Genetic
and functional role of TNF-alpha in the development Trypanosoma cruzi infection. PLoS Negl
Trop Dis. 2011; 5(3):e976.
35.Rodríguez-Pérez JM, Cruz-Robles D, Hernández-Pacheco G, Pérez-Hernández N, Murguía LE,
Granados J, et al. Tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphism in Mexican patients with Chagas’ disease. Immunol Lett. 2005; 98(1):97–102.
36.Criado L, Flórez O, Martín J, González CI.
Genetic polymorphisms in TNFA/TNFR2 genes
and Chagas disease in a Colombian endemic population. Cytokine. 2012; 57(3):398-401.
37.Ramasawmy R, Faé KC, Cunha-Neto E, Müller
NG, Cavalcanti VL, Ferreira RC, et al. Polymorphisms in the gene for lymphotoxin-α predispose to
chronic Chagas cardiomyopathy. J Infect Dis. 2007;
196(12):1836–1843.
38.Zafra G, Flórez O, Morillo CA, Echeverría LE,
Martín J, González CI. Polymorphisms of toll-like
receptor 2 and 4 genes in Chagas disease. Mem Inst
Oswaldo Cruz. 2008; 103(1):27-30.
39.Ramasawmy R, Cunha-Neto E, Faé KC, Borba
SC, Teixeira PC, Ferreira SC, et al. Heterozygosity
for the S180L variant of MAL/TIRAP, a gene
expressing an adaptor protein in the Toll-like receptor pathway, is associated with lower risk of developing chronic Chagas cardiomyopathy. J Infect Dis.
2009; 199(12):1838-1845.
40.Ramasawmy R, Cunha-Neto E, Faé KC, Martello FG, Müller NG, Cavalcanti VL, et al. The
monocyte chemoattractant protein–1 gene polymorphism is associated with cardiomyopathy in
human Chagas disease. Clin Infect Dis. 2006;
43(3):305–311.
41.Ramasawmy R, Cunha-Neto E, Faé KC, Müller
NG, Cavalcanti VL, Drigo SA, et al. BAT1, a putative anti-inflammatory gene, is associated with
chronic Cha¬gas cardiomyopathy. J Infect Dis.
2006; 193(10):1394-1399.
42.Calzada JE, Nieto A, Beraún Y, Martín J. Chemokine recep¬tor CCR5 polymorphisms and Chagas’ disease cardiomyopathy. Tissue Antigens.
2001; 58(3):154-158.
31
43.Fernández-Mestre MT, Montagnani S, Layrisse Z.
Is the CCR5-59029-G/C genotype a protective factor
for cardiomyopathy in Chagas disease?. Hum Immunol. 2004; 65(7):725-728.
44.Ramasawmy R, Faé KC, Cunha-Neto E, Borba SC,
Ianni B, Mady C, et al. Variants in the promoter region
of IKBL/NFKBIL1 gene may mark susceptibility to
the development of chronic Chagas’ cardiomyopathy
among Trypanosoma cruzi-infected individuals. Mol
Immunol. 2008; 45(1):283–288.
45.Torres OA, Calzada JE, Beraún Y, Morillo CA,
González CI, González A, et al. Association of the
macrophage migration inhibitory factor -173G/C polymorphism with Chagas disease. Hum Immunol. 2009;
70(7):543–546.
46.Calzada JE, Beraún Y, González CI, Martín J.
Transforming growth factor beta 1 (TGFbeta1) gene
polymorphisms and Chagas disease susceptibility in
Peruvian and Colombian patients. Cytokine. 2009;
45(3):149–153.
González A, González CI, et. al . Role of the IFNG
+874T/A polymorphism in Chagas disease in a Colombian population. Infect Genet Evol. 2010; 10(5):682685.
48.Flórez O, Zafra G, Morillo C, Martín J, González
CI. Interleukin-1 gene cluster polymorphism in Chagas
disease in a Colombian case-control study. Hum
Immunol. 2006; 67(9):741–748.
49.Cruz-Robles D, Chávez-González JP, CavazosQuero MM, Pérez-Méndez O, Reyes PA, Vargas-Alarcón G. Association between IL-1B and IL-1RN gene
polymorphisms and Chagas’ disease development susceptibility. Immunol Invest. 2009; 38(3-4):231-239.
González A, González CI, et al. Lack of association
between IL-6 -174G/C gene polymorphism and Chagas disease. Tissue antigens. 2012; 76(2):131-134.
51.Flórez O, Martín J, González CI. Interleukin 4,
interleukin 4 receptor- and interleukin 10 gene polymorphisms in Chagas disease. Parasite Immunol. 2011;
33(9):506-511.
52.Zafra G, Morillo C, Martín J, González A, González
CI. Polymorphism in the 3’UTR of the IL12B gene is
associated with Chagas’ disease cardiomyopathy.
Microbes Infect. 2007; 9(9):1049-1052.
32
PONENCIA
THE ROLE OF IMMUNOLOGY IN COMBATING TRYPANOSOMA CRUZI
INFECTION AND CHAGAS DISEASE
Rick L Tarleton.
Center for Tropical and Emerging Global Diseases. Department of Cellular Biology. University of Georgia.
ABSTRACT
Chagas disease is a solvable problem and if it is to be solved, applying what we already know about immunity to T. cruzi will be crucial.
But currently too many people get infected, few of those who are infected get diagnosed, especially before irrevocable damage is done, and an
insufficient number of those diagnosed get effective treatment. To alter
this state of affairs, setting appropriate priorities and demanding more of
the research that is ongoing and of the funders of that research is an absolute necessity. We are fortunate to be in a period of significant interest in
Chagas disease by the pharmaceutical industry. This interest is unlikely
to last for long, so it is especially critical now to translate what we know
and can learn into more effective interventions.
Keywords: Chagas disease. Immunity. Biological markers. Vaccine.
res.
Correspondencia
Center for Tropical and Emerging Global Diseases
The Coverdell Center
500 D.W. Brooks Drive
University of Georgia
Athens, GA 30602
[email protected]
RESUMEN
El papel de la inmunología en combatir
la infección por Tripanosoma cruzi y la
La enfermedad de Chagas es un problema resoluble y la aplicación
de los conocimientos actuales de la inmunidad contra T.cruzi será crucial. Pero en la actualidad muchas personas se infectan, sólo algunas se
diagnostican antes que el daño cardíaco se haga irreversible y pocas de
las diagnosticadas reciben un tratamiento efectivo. Para cambiar este
estado de cosas es necesario el establecimiento de prioridades adecuadas y más exigentes en la investigación, así como convencer a los financiadores de que esta es una necesidad absoluta. Tenemos la suerte
de que actualmente la industria farmacéutica tiene interés en la enfermedad de Chagas, aunque es poco probable que dure mucho tiempo,
por lo que es especialmente importante aplicar ya lo que sabemos hacia
intervenciones más eficaces.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Inmunidad.Biomarcadores- Vacuna.
Rick L Tarleton
IMMUNE CONTROL OF T. CRUZI
INFECTION
The immune effector mechanisms that
are crucial to controlling, containing or,
under the best of circumstances, eliminating
an infectious agent are largely predictable
from the lifestyle of the pathogen. This is no
less true for Trypanosoma cruzi which
spends the vast majority of its time in mammals replicating in the cytoplasm of a range
of host cell types. The hundreds of parasites
produced over the approximately 4 day
intracellular phase eventually overwhelm
and destroy the host cell. The released
trypomastigotes may infect other host cells,
or, if parasite release is coincident with the
taking of a blood meal by triatomine insects,
be transmitted to these vectors and thus
capable of spreading to other mammalian
hosts.
As expected from this lifestyle, immune
control of T. cruzi infection in mammals is
most heavily dependent on cytolytic T cells
capable of recognizing and destroying parasite-infected host cells and antibodies that
recognize extracellular parasite stages1-3.
Th1 cells that provide the appropriate helper
function for B and CD8+ T cells as well as
cytokines that enhance macrophage killer
functions are also crucial to control of the
infection. While a number of other effector
mechanisms have been noted to influence T.
cruzi infection, including NK cells, gamma/delta T cells, Th2, Th17, etc., the relative impact of these appears to be rather
modest.
An often ignored aspect of the T. cruzi:
host interface is that immune control of the
infection is in general incredibly efficient.
With the exception of very high dose infections or infection in immunocompromised
hosts, T. cruzi infection is nearly always
controlled acutely and even occasionally
eliminated. Parasite burden in chronically
infected hosts is maintained at low levels,
often below the level of detection by even
34
the most sensitive methods. Some of the
most convincing evidence supporting this
fact is the proficiency with which parasites
within a chronically infected host are restricted from spreading to “new” tissues (e.g.
implanted muscle tissues4), and the inefficiency by which the infection is transmitted
to vectors. In one remarkable study utilizing
serial xenodiagnostic testing of infected
subjects over several years, the majority of
subjects had detectable parasites in less than
25% of tests and one patient had as few as 2
positive bugs among the 1440 bugs that
fed5.
There is anecdotal evidence of spontaneous infection cures in humans and unambiguous proof of cure in mice (figure 1). The
only way that these extremely low parasite
loads can be maintained for decades and
that spontaneous cures can occur is if immune control is in fact highly effective. If this
is so, then why is the infection not always
cured? Why is cure a rare event? An obvious
answer is that like all infections, there is a
range of efficiencies of control of T. cruzi in
host populations. HLA and other polymorphisms provide a genetic basis for this
variability in control and past and current
exposures and conditions (nutritional, hormonal, etc) further assure that there will be
a spectrum of responses to any infection
within a population. So it is reasonable to
believe that individuals on the high efficiency end of the spectrum could cure T.
cruzi infection while those on the other
extreme will be relatively high parasitemic
“transmitters” and/or the most likely to
develop severe disease. And in between these two poles is the majority of individuals
who remain persistently infected but with
mild or unapparent disease.
An alternative view of T. cruzi infection
has been presented asserting that there are
potent immunoregulatory mechanisms that
prevent immune clearance of T. cruzi infection. However there is comparatively little
concrete support for this view. As already
THE ROLE OF IMMUNOLOGY IN COMBATING TRYPANOSOMA CRUZI INFECTION AND CHAGAS DISEASE
Figure 1
T cell phenotype and failure of immunosuppression to reveal parasitic infection documents spontaneous parasitological cure in selected chronically infected mice
Peripheral blood collected from 2 sets of mice at 845 and 677 days post infection with the CL strain of T. cruzi have
T. cruzi-specific CD8+ T cells, as detected by staining with the MHC-peptide tetramer H2Kd loaded with the transsialidase peptide TSKb20 (first column)26. In 2 of these mice (rows 2 and 6), a high proportion of the TSKb20+ cells
express CD127 and CD62L, markers of central memory T cells and indicative of parasitologic cure8. Cure is confirmed by the failure to detect parasites in the blood or tissues in these 2 mice using direct microscopic examination of
blood, hemaculture and PCR following immunosuppression with cyclophosphamide8.
noted, the infection is well controlled by
strong anti-T. cruzi immune responses that
are readily measured in nearly all hosts. And
if these responses are abrogated, as in the
case of HIV infection6,7 or chemical immunosuppression 8 , overwhelming parasite
burden results. Furthermore, immunoregulatory mechanisms known to play important
roles in other infections, including IL-10,
TGF-beta, Treg cells, PD-1, etc., show
modest, at best, expression during or impact
on T. cruzi infection immunity9, 10.
While the persistence of T. cruzi infection
does not appear to be dependent on overt
immunosuppression, infection persistence
itself may result in the gradual deterioration
of immune responses over time as
lymphocytes become exhausted and the
resources of the immune system are depleted. Although more apparent in infections
characterized by high antigen burden11,12,
there is also good evidence of immune deterioration in patients with decades-long T.
cruzi infections13-15. Such induced inefficiency is associated with increased incidence of clinical disease16, however the cause
and effect relationship between these two is
not established (i.e. does the decline in
immune control of the infection contribute
35
Rick L Tarleton
to clinical disease or is exhaustion and disease both a consequence of persistent and
perhaps relatively high parasite load?).
T. cruzi appears to be very adept at persistence and it is clearly the chronic nature of
the infection that drives disease development. However this ability to persist is not
perfect; T. cruzi seems to frequently teeter
on edge of elimination in hosts, occasionally falling off that edge. Thus neither
chronic infection nor disease is an inevitable outcome of infection.
APPLYING IMMUNOLOGICAL
KNOWLEDGE
Given that immune responses to T. cruzi
are normally potent and effective, the protective immune mechanisms are known (as
are many of the parasite targets of these responses), and at least on occasion, these responses result in cure, it is reasonable to ask
how one could use this knowledge in the treatment or prevention of Chagas disease.
Prophylactic vaccination is the holy grail of
any infectious disease but has been achieved only selectively and very inconsistently
with parasitic infections. Vaccine research
got a slow start in Chagas disease, in large
part due to the fear that vaccination might
intensify the anti-self immune responses
that were thought to be responsible for
pathology in the infection17. However with
increasing appreciation for the fact that
Chagas disease is the result of parasite persistence rather than anti-self (autoimmune)
responses, significant interest in vaccine
discovery for T. cruzi infection has emerged. These efforts are continuing and are
significantly enhanced by the ability to use
species that are natural hosts of T. cruzi
(principally rodents) in vaccine trials. As a
result, there are a significant number of protocols and vaccine target antigens that provide a degree of protection from death after
a normally lethal challenge infection, again
demonstrating that T. cruzi is susceptible to
immune control. However none of these
36
vaccines have provided sterile protection e.g. complete clearance of the infection.
Sterile protection is a high bar for any
vaccine, but it is an appropriate one for T.
cruzi infection. As noted above, T. cruzi is
normally very well controlled with low
parasite burden in most cases. However despite this apparently successful outcome, clinical disease frequently develops. So an
effective vaccine is going to have to do better than just limit the parasite burden as already happens in unvaccinated hosts; it is
likely going to have to clear the infection
completely if disease is to be avoided. Lifethreatening acute infection is very rare in T.
cruzi and thus should not be the target of
prevention for vaccine development for T.
cruzi. Rather, preventing persistent infection by achieving sterile cure has to be the
goal.
So can a vaccine be developed that will
sterilely protect humans from T. cruzi infection? A vaccine of such efficiency has not
been achieved even in highly controlled animal studies employing a variety of formats
that induce potent immune responses. Additionally, multiple rounds of infection followed by drug-induced cure, provides vigorous boosting of protective immune responses but fails to protect mice from reinfection
(Bustamante and Tarleton, unpublished).
This ability of T. cruzi to establish infections in hosts even in the face of apparently
“protective” and certainly very potent antiparasite immune responses, presents an
enormous challenge for vaccine development. It may be that parasites like T. cruzi,
that invade host cells relatively silently18,19
and establish infection without alerting host
danger receptors20 will elude even the best
efforts of vaccinologists.
It is possible that a prophylactic vaccine
(by reducing parasite load lower through
more efficient immune responses) could
prevent the development of Chagas disease
despite not completely clearing the infecRev Esp Salud Pública 2013
tion. However, there is no evidence that further reducing parasite levels below their
already low points would reduce pathology.
Furthermore, testing such a vaccine would
require decades of monitoring of infected
subjects, presenting both a logistical and
ethical nightmare.
Therapeutic vaccines have also been
explored as possible treatments for Chagas
disease, with the goal of pushing this controlled infection over the edge toward eradication21. Therapeutic vaccines in general
have a tough duty to perform and they have
not found great success with any infection.
Essentially, they must substantially enhance
a response that has been developed over
time – decades in the case of many subjects
of Chagas disease – and that has effectively
controlled the infection but not eliminated
it. While this may be possible, it is not likely
to be easy in the case of Chagas disease.
And it does not seem likely that a therapeutic vaccine that may or may not do the job
will gain wide acceptance when there are
available drugs that can eliminate the infection.
ALTERNATIVE APPLICATIONS OF
IMMUNOLOGY FOR CHAGAS DISEASE
If the prospects for conventional vaccines
are really as dismal as presented here, are
there alternative ways that immunological
knowledge of T. cruzi infection can be
applied to more effectively deal with Chagas disease? An obvious application is
through the development of better diagnostics. The current practice of using 2 or 3
“conventional” diagnostic tests that predominantly depend on crude antigen preparations is inefficient and insensitive22. Antigen discovery efforts have unveiled better
diagnostic targets and revealed that antibody responses in T. cruzi-infected subjects
are highly variable not only in terms of the
target antigens but also in potency23-25. The
inability of PCR, hemaculture or xenodiagnosis to consistently detect T. cruzi in all
infected subjects makes it very likely that
serology will remain the primary way of
screening for T. cruzi infection. So modernization of T. cruzi diagnostics, and in particular developing a multiplex platform that
allows for detection of responses to many
individual antigens, is long overdue.
While it may end up being impossible to
develop a prophylactic vaccine that can prevent T. cruzi infection in humans, we already have vaccines that can reduce parasite
load in animals. Applying such vaccines in
the field, particularly in companion animals
in endemic areas – the chief source of infection for reduviid bugs in many infested houses - could reduce transmission of infections
to humans. Such vaccines would not need to
prevent infection in animals, but simply
reduce parasite levels to a point that transmission is much less efficient. An easy to
distribute vaccine of this type could be used
in concert with other transmission-reducing
techniques to prevent new infections.
Lastly, it is also often ignored that there
are already effective drug treatments for
Chagas disease. Unfortunately these drugs,
nifurtimox and benznidazole, are not as
widely used as they should be because they
have side effects in a significant (although a
minority) of subjects, and are perceived to
be ineffective in treating established (chronic) T. cruzi infection. Contrary to this perception, both drugs have well-documented
benefit in chronically infected subjects. The
problem is that it is difficult to know when
they work and when they fail because of the
lack of a test of cure in these patients. Just as
the low parasite burden makes direct detection of T. cruzi an undependable diagnostic
of infection in chronically infected subjects,
it is likewise unsuitable also as a test of cure.
The absence of a dependable test of cure is
not only an impediment to the wider use of
these acknowledged suboptimal drugs that
are now available but also makes evaluation
of new drugs nearly impossible. This is another place where immunological assays may
37
Rick L Tarleton
provide an answer. Drug cure in rodents
results in unambiguous alterations in T cell
phenotypes 8 and treatment (and presumed
cure) in humans is also accompanied by alterations in both T cell and B cell responses24.
Using this knowledge as the basis for developing a test of cure should be the highest priority – without such we will have to continue to
settle for inadequate and underutilized therapies.
ACKNOWLEDGEMENTS
Past and present members of the Tarleton
Lab are acknowledged for the data that they
have generated (particularly to Ashley Hartley
for the data in Figure 1) and for the discussions
that have formed the basis of this review.
Research in the Tarleton lab is funded primarily but the U.S. National Institutes of Health.
BIBLIOGRAPHY
1. Kumar S, Tarleton RL. The relative contribution of antibody production and CD8+ T cell function to immune
control of Trypanosoma cruzi. ParasitImmun. 1998;20:
207-216.
2. Tarleton R L, Grusby M J, Postan M , Glimcher L H.
Trypanosoma cruzi infection in MHC-deficient mice: further evidence for the role of both class I- and class II-restricted T cells in immune resistance and disease. Int
Immunol. 1996;8: 13-22.
3. Tarleton R L, Koller B H, Latour A , Postan M. Susceptibility of beta 2-microglobulin-deficient mice to Trypanosoma cruzi infection. Nature. 1992;356: 338-340.
4. Tarleton R L, Zhang L, Downs M O. "Autoimmune
rejection" of neonatal heart transplants in experimental
Chagas' disease is a parasite-specific response to infected
host tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 1997;94: 39323937.
5. Cerisola JA, Rohwedder R, Segura EL, Del Prado CE,
de Martini GJW. El Xenodiagnóstico. Normalización.
Utilidad. Buenos Aires: Ed. Buenos Aires. 1974: 1-127.
6. Vaidian A K, Weiss L M,Tanowitz H B. Chagas' disease
and AIDS. Kinetoplastid Biol Dis. 2004;3: 2.
7. Gutierrez F R, Mariano F S, Oliveira C J, Pavanelli W
R, Guedes P M, Silva G K, et al. Regulation of Trypanosoma cruzi-induced myocarditis by programmed death
cell receptor 1. Infect Immun. 2011;79: 1873-1881.
38
8. Bustamante J M, Bixby L M, Tarleton R L. Druginduced cure drives conversion to a stable and protective CD8+ T central memory response in chronic
Chagas disease. Nat Med. 2008;14: 542-550.
9. Kotner J, Tarleton R. Endogenous CD4(+)
CD25(+) regulatory T cells have a limited role in the
control of Trypanosoma cruzi infection in mice.
Infect Immun. 2007;75: 861-869.
10. Martin D L, Postan M, Lucas P, Gress R, Tarleton R L. TGF-beta regulates pathology but not tissue
CD8+ T cell dysfunction during experimental
Trypanosoma cruzi infection. Eur J Immunol.
2007;37: 2764-2771.
11. Mueller S N, Ahmed R. High antigen levels are
the cause of T cell exhaustion during chronic viral
infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:
8623-8628.
12. Shin H, Wherry E J. CD8 T cell dysfunction
during chronic viral infection. Curr Opin Immunol.
2007;19: 408-415.
13. Arguello R J, Albareda M C, Alvarez M G, Bertocchi G, Armenti A H, Vigliano C, et al. Inhibitory
receptors are expressed by Trypanosoma cruzi-specific effector T cells and in hearts of subjects with
chronic Chagas disease. PLoS One. 2012;7: e35966.
14. Albareda M C, Laucella S A, Alvarez M G,
Armenti A H, Bertochi G, Tarleton R L, et al. Trypanosoma cruzi modulates the profile of memory
CD8+ T cells in chronic Chagas' disease patients. Int
Immunol. 2006;18: 465-471.
15. Albareda M C, Olivera C, Laucella S, Alvarez M
G, Fernandez E R, Lococo B, et al. Chronic human
infection with T. cruzi drives CD4+ T cells to immune senescence. J Immunol. 2009;183: 1675-1684.
16. Laucella S A, Postan, M., Martin, D., B.H. Fralish, M.C. Albareda, M.G. Alvarez, et al. Frequency
of Interferon-gamma-producing T cells specific for
Trypanosoma cruzi inversely correlates with disease
severity in chronic human Chagas disease. J Infect
Dis. 2004;189: 909-918.
17. Tarleton R L. Chagas Disease: a role for autoimmunity? Trends Parasitol. 2003;10: 447-451.
18. Chessler A D, Ferreira L R, Chang T H, Fitzgerald K A, Burleigh B A. A novel IFN regulatory factor 3-dependent pathway activated by trypanosomes
triggers IFN-beta in macrophages and fibroblasts. J
Immunol. 2008;181: 7917-7924.
19. Vaena de Avalos S, Blader I J, Fisher M, Boothroyd J C, Burleigh B A. Immediate/early response
to Trypanosoma cruzi infection involves minimal
modulation of host cell transcription. J Biol Chem.
2002;277: 639-644.
20. Padilla A M, Simpson L J, Tarleton R L. Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma
cruzi infection. J Immunol. 2009;183: 1245-1252.
21. Lee B Y, Bacon K M, Wateska A R, Bottazzi M
E, Dumonteil E, Hotez P J. Modeling the economic
value of a Chagas' disease therapeutic vaccine.
Hum Vaccin Immunother. 2012;8: 1293-1301.
22. Afonso AM E M, Tarleton RL. A Systematic
Review of High Quality Diagnostic Tests for Chagas Disease. PLoS Negl Trop Dis. 2012;6: e1881.
23. Olivera G C, Albareda M C, Alvarez M G, De
Rissio A M, Fichera L E, Cooley G, et al. Trypanosoma cruzi-specific immune responses in subjects
from endemic areas of Chagas disease of Argentina.
Microbes Infect. 2010;12: 359-363.
24. Laucella S A, Perez Mazliah D, Bertocchi G,
Alvarez M G, Cooley G, Viotti R, et al. Changes in
Trypanosoma cruzi-specific immune responses
following treatment: surrogate markers of treatment efficacy. Clin Infect Dis. 2009;49: 1675-1684.
25. Cooley G, Etheridge R D, Boehlke C, Bundy B,
Weatherly D B, Minning T, et al. High throughput
selection of effective serodiagnostics for Trypanosoma cruzi infection. PLoS Negl Trop Dis. 2008;2:
e316.
26. Martin D L, Weatherly D B, Laucella S A, Cabinian M A, Crim M T, Sullivan S, et al. CD8+ T-Cell
responses to Trypanosoma cruzi are highly focused
on strain-variant trans-sialidase epitopes. PLoS
Pathog. 2006;2: e77.
39
Rev Esp Salud Pública 2013; 87: 41.
COMUNICACIÓN ORAL
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE TRYPANOSOMA CRUZI EN AISLADOS DE
PACIENTES CON CHAGAS CRÓNICO Y CONGÉNITO
Molecular Characterization of Trypanosoma cruzi Isolates from Patients
with Chronic and Congenital Chagas Disease
Ana Lineth García, Rudy Parrado, Mary Cruz Torrico, Anabelle de la Barra, Sandro Villarroel y
Faustino Torrico.
IIBISMED. Facultad de Medicina. Universidad Mayor de San Simón.Bolivia.
RESUMEN
Fundamentos: Trypanosoma cruzi, agente causal de la Enfermedad
de Chagas, se clasifica en seis unidades discretas de tipificación o UDT
(TcI,TcII,TcIII,TcIV,TcV y TcVI) [1]. Este complejo de parásitos, presenta importantes diferencias biológicas entre linajes, que aparentemente
están relacionadas con la diversidad clínica de la enfermedad y la susceptibilidad a las drogas. En los últimos años el desarrollo de nuevas técnicas
para la caracterización del los aislamientos de T. cruzi, están aportando
información sobre la genética y la biología de este complejo de parásitos
que en el futuro podrán ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares
involucrados en la patogénesis de la enfermedad.El objetivo del estudio
fue implementar técnicas de caracterización molecular para determinar la
prevalencia de las UDT de T. cruzi que se encuentran circulando en pacientes con Chagas crónico y Chagas congénito provenientes del Departamento de Cochabamba, Bolivia.
Métodos: La caracterización molecular de T.cruzi se llevó a cabo en
58 aislados de pacientes adultos con Chagas crónico y 20 aislados de niños infectados por vía congénita, utilizando un algoritmo que incluía la
PCR multiplex dirigida al gen del mini exón, la PCR D724S rADN y las
PCR-RFLP1f8 y gp72 [2].
Resultados: De los 58 pacientes con Chagas crónico analizados, 53
(91%) portaban el DTU TcV, 3 (5 %) el DTU TcI y solo 2 (4 %) presentaban infecciones mixtas de más de un DTU (Tc III y TcV). Todos los pacientes congénitos (20/20; 100%) presentaron el DTU TcV.
Conclusiones: El algoritmo de identificación implementado en este
trabajo demostró ser reproducible y altamente eficiente para identificar
los linajes de T. cruzi y confirma estudios previos que señalan que la gran
mayoría de las infecciones tanto crónicas como congénitas en Bolivia se
deben al DTU TcV.
Correspondencia
[email protected]
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Unidades discretas de tipificación. Técnicas moleculares.Tripanosoma cruzi.
Keywords: Chagas disease. Discrete Typing Units. Molecular
techniques.Tripanosoma cruzi.
BIBLIOGRAFÍA:
1. Zingales B, Andrade SG, Briones MRS, Campbell DA, Chiari E,
Fernandes O, Guhl F, Lages‐Silva E, Macedo AM, Machado CR, Miles
MA, Romanha AJ, Sturm NR, Tibayrenc M, Schijman AG. . A new
consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second
revision meeting recommends TcI to TcVI. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz.2009; 104:1051‐1054.
2. Fernandes O, Santos SS, Cupolillo E, Mendonça B, Derre R, Junqueira AC, Santos LC, Sturm NR, Naiff RD, Barret TV, Campbell DA,
Coura JR. A mini-exon multiplex polymerase chain reaction to distinguish the major groups of Trypanosoma cruzi and T. rangeli in the Brazilian Amazon. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2001. 95:97-99.
COMUNICACIÓN ORAL
ACCELERATING THE DEVELOPMENT OF A THERAPEUTIC VACCINE FOR HUMAN
CHAGAS DISEASE: RATIONALE AND PROSPECTS
Acelerando el desarrollo de una vacuna terapéutica para la enfermedad de Chagas:
Fundamentos y perspectivas
Eric Dumonteil (1), Maria Elena Bottazzi (2), Bin Zhan (2), Michael J Heffernan (2), Kathryn Jones
(2), Jesus G Valenzuela (3), Shaden Kamhawi (3) , Jaime Ortega (4) , Samuel Ponce de Leon Rosales (5), Bruce Y Lee (6), Kristina M Bacon (6), Bernhard Fleischer (7), BT Slingsby (8), Miguel
Betancourt Cravioto (9), Roberto Tapia-Conyer (9) y Peter J Hotez (2).
(1) Laboratorio de Parasitología Centro De Investigaciones Regional. “Dr. Hideo Noguchi” Autonomous
University of Yucatan (UADY). Merida. Mexico
(2) Sabin Vaccine Institute and Texas Children’s Hospital Center for Vaccine Development. Section of
Pediatric Tropical Medicine. Departments of Pediatrics and Molecular Virology & Microbiology and
National School of Tropical Medicine. Baylor College of Medicine. Houston. Texas. USA
(3) Vector Molecular Biology Section, Laboratory of Malaria and Vector Research. National Institute of
Allergy and Infectious Diseases. National Institutes of Health. Rockville. Maryland. USA
(4) Departamento de Biotecnología y Bioingeniería, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN). Mexico City. Mexico
(5) Laboratorios de Biológicos y Reactivos de México (BIRMEX), Mexico City, Mexico
(6) Public Health Computational and Operations Research, University of Pittsburgh. Pittsburgh PA. USA.
(7) Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Hamburg. Germany
(8) Eisai Co, Ltd, Tokyo. Japan
(9) Instituto Carlos Slim de la Salud (ICSS). Mexico City. Mexico.
Fundamentos: Chagas disease is a leading cause of heart disease affecting approximately 10 million people in Latin America and elsewhere
worldwide. The two major drugs available for the treatment of Chagas
disease have limited efficacy in Trypanosoma cruzi-infected adults with
and determinate status; require prolonged treatment courses; and are poorly tolerated and expensive. As an alternative, an injectable therapeutic
Chagas disease vaccine is under development to prevent or delay Chagasic cardiomyopathy in patients with indeterminate or determinate status
(1). A major hurdle in the critical path for the development and testing of
novel vaccines is overcoming the product development gap for taking a
bench discovery to the point where it shows a clear path to the clinic (2).
The solution is to accelerate the development using the model applied by
Product Development Partnerships (PDPs), which transfers knowledgebased capacity to developing countries.
Métodos: The bivalent vaccine will be comprised of two recombinant Trypanosoma antigens, Tc24 and TSA-1, which will be formulated
on alum and used together with the TLR4 agonist E6020. Specifically,
the genes from these two antigens are cloned and expressed into expression systems (yeast or bacteria) suitable for process development, scale
up and manufacturing. A fermentation and purification process is developed up to 10 L scales to show consistency and reproducibility. The recombinant proteins expressed by these methods will be characterized for
its purity, solubility and stability using analytical methods such as SDSPAGE gels and chromatography. Furthermore, the recombinant proteins
will be formulated on alum and evaluated by assessing the immunogenicity, cardiac studies and efficacy in animal models.
Resultados: Results will be presented showing a successful cloning
strategy and initial expression data of the Tc24 molecule using the yeast
and bacterial expression systems. Fermentation and purification optimization experiments show high yields and suitability for manufacturing
Correspondencia
[email protected]
scales. Immunogenicity studies of experimentally infected mice, naturally infected primates, and mice vaccinated with either Tc24 or TSA1
emulsified in Montanide ISA 720 have initiated and immunological data
will be shown. Finally, a landscape of Cardiac studies show that there is a
difference in ejection fraction between T. cruzi infected mice and age
matched naïve mice using echocardiography up to day 63. Data will be
shown for the entire course of infection
Conclusions: A perspective and initial results of a sustainable model
to accelerate translation of discoveries into new vaccines and applied by
the product development partnership (PDP) called Sabin Vaccine Institute and Texas Children’s Hospital Center for Vaccine Development will be
presented.
Keywords: Chagas disease. Vaccine.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Vacuna.
BIBLIOGRAFÍA
1. Dumonteil E, Bottazzi ME, Zhan B, Heffernan MJ, Jones K, Valenzuela J, Kamhawi S, Ortega J, Ponce de Leon Rosales S, Lee BY,
Bacon KM, Fleischer B, Slingsby BT, Betancourt Cravioto M, TapiaConyer R, Hotez PJ. Accelerating the development of a therapeutic
vaccine for human Chagas disease: Rationale and prospects. Expert
Review of Vaccines. 2012;11(9):1043-55.
2. Bottazzi ME, Brown AS. Model for product development of vaccines against neglected tropical diseases: a vaccine against human hookworm. Expert review of vaccines. 2008;7(10):1481-92.
COMUNICACIÓN ORAL
TRANSMISIÓN CONGÉNITA DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN MELLIZOS NACIDOS
EN ÁREA NO ENDÉMICA: IMPLICACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE INNATA
Y TRATAMIENTO EN EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD
Congenital Transmission of Chagas Disease in Twins Born in a Non-Endemic Area:
Involvement of the Innate Immune Response and Treatment in the Sickness Control
Ana Fernández-Villegas (1), M Carmen Thomas (1), Bartolomé Carrilero (2), Cinta Tellez (3), Laura Murcia (2), Concepción Marañón(1) , Sara Moralo (3) , Manuel Segovia (2), Manuel Carlos
López (1).
(1) Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra. Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IPBLN-CSIC).
(2) Unidad Regional de Medicina Tropical. Hospital Virgen de la Arrixaca.
(3) Unidad pediátrica de Cuidados Intensivos. Hospital Virgen de la Arrixaca.
Fundamentos: La enfermedad de Chagas en zonas no endémicas se
transmite vía congénita (Muñoz et al. 2007; Flores-Chavez et al. 2008;
Carrilero et al. 2009). En estos casos, la detección de la enfermedad no resulta fácil debido a que la mayoría de las madres infectadas y sus bebés
son asintomáticos. En el presente trabajo se estudia, pre y post-tratamiento con benznidazol, la historia clínica y el comportamiento inmunológico
(respuesta innata y adaptativa-humoral) de mellizos nacidos en España
infectados vía congénita.
Métodos: Se realizan pruebas serológicas y moleculares para el diagnóstico de Chagas, medida del nivel de citoquinas en células de sangre
periférica, hemocultivo y determinación del DTU de la cepa infectiva.
Asimismo se comparan los resultados obtenidos en los distintos estudios
realizados pre- y post-tratamiento con benznidazol.
Resultados: Caso clínico: Mujer de 26 años de origen boliviano residente en España da a luz mediante parto natural a mellizos a las 33 semanas de gestación. El bebé I presenta serios trastornos cardiacos y digestivos a los 45 días del nacimiento, detectándose infección por
citomegalovirus que remitió tras tratamiento. A los 5 meses de hospitalización al bebé I se le realizan pruebas diagnósticas de la enfermedad de
Chagas (PCR), al igual que a la madre (IFI y ELISA) y bebé II (PCR), resultando en los tres casos positivas, confirmándose la transmisión de T.
cruzi por vía congénita (Murcia et al. 2012). Tanto la madre como los mellizos fueron tratados con benznidazol (5 mg o 10 mg, respectivamente,
por kg de peso y día) durante 60 días. Tipaje de la cepa infectante: Análisis por PCR usando sondas del miniexon, 24S y 18S (Brisse et al. 2000)
indican que la cepa de T. cruzi aislada en ambos mellizos es de tipo TcV.
Respuesta innata y biomarcadores: El perfil de secreción de citoquinas de
células de sangre periférica estimuladas con ligandos específicos de
TLR2, TLR4 y TLR9 evidencia un estatus inmuno-comprometido para el
bebé I y competente para el bebé II. El estudio serológico realizado pre y
post-tratamiento para la detección de anticuerpos frente al biomarcador
multiantígeno (KMP11, HSP70, PFR2 y Tgp63) (Fernández-Villegas et
al. 2011) evidencia fallo terapéutico en el bebé II motivado por la suspensión de la administración del fármaco por parte de la madre (aproximadamente a los 15 días del inicio). El referido fallo terapéutico fue confirmado mediante detección del DNA del parásito por sucesivas PCRs
realizadas en células concentradas por microhematocrito.
Conclusions: Ambos bebés están infectados con parásitos pertenecientes al linaje DTU-V. La susceptibilidad a la infección por T. cruzi no
está relacionada con la competencia del sistema inmunológico (respuesta
innata) de los bebés. Sin embargo, sí se observa una marcada diferencia
en la patología de la enfermedad en cada mellizo, la cual estaría relacionada con la competencia del sistema inmune innato de estos. El sistema
biomarcador multiantígeno (KMP11, HSP70, PFR2 y Tgp63) muestra ser
eficaz para analizar la eficacia del tratamiento en neonatos infectados.
Correspondencia
Manuel Carlos López
[email protected].
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Benznidazol. Marcadores biológicos.
Key words: Chagas disease. Benzonidazole [Supplementary
Concept]. Biological Markers.
BIBLIOGRAFÍA
1. Muñoz J, Portús M, Corachan M, Fumadó V, Gascon J. Congenital
Trypanosoma cruzi infection in a non-endemic area. Trans R Soc Trop
Med Hyg. 2007; 101(11): 1161-2.
2. Flores-Chávez M, Faez Y, Olalla JM, Cruz I, Gárate T, Rodríguez M,
et al. Fatal congenital Chagas’ disease in a non endemic area: a case
Report. Cases J. 2008; 7;1 (1): 302.
3. Carrilero B, Munoz-Davila MJ, Thomas MC, López MC, Segovia
M. Congenital Chagas disease in a newborn of a Bolivian mother.
Enferm Infecc Microbiol Clin. 2009; 27 (8): 486-487.
4. Murcia L, Carrilero B, Munoz-Davila MJ, Thomas MC, López MC,
Segovia M. Risk factors and primary prevention of congenital chagas
disease in a non endemic country. Clin Infect Dis. 2013; 56(4):496502.
5. Brisse S, Dujardin JC, Tibayrenc M. Identification of six Trypanosoma cruzi lineages by sequence-characterised amplified region markers. Mol Biochem Parasitol. 2000; 111 (1): 95-105.
6. Fernández-Villegas A, Pinazo MJ, Marañón C, Thomas MC, Posada
E, Carrilero B, et al. Short-term follow-up chagasic patientes alter benzonidazole treatment using multiple serological markers. BMC Infect
Dis. 2011;11:206. Disponible en: http://dx.doi.org/10.1186/14712334-11-206.
COMUNICACIÓN ORAL
EARLY MOLECULAR DIAGNOSIS OF ACUTE CHAGAS DISEASE AFTER
TRANSPLANTATION WITH ORGANS FROM T. CRUZI INFECTED DONORS
Diagnóstico molecular precoz de la enfermedad de Chagas aguda tras el transplante de órganos
procedentes de donantes infectados
Carolina Inés Cura (1), Roberta Lattes (2), Claudia Nagel (3), María José Gimenez (4), Marino Blanes (5), Eva Calabuig (5), Agustín Iranzo (4), Laura Alicia Barcan (6), Margarita Anders (7) y Alejandro Gabriel Schijman (1).
(1) Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas, INGEBI-CONICET, Bs. As., Argentina.
(2) Instituto de Nefrología, Bs. As., Argentina.
(3) Unidad de Trasplante Cardíaco, Hospital Universitario Fundación Favaloro, Bs. As., Argentina.
(4) Servicio de Microbiología, Hospital Universitario y Politécnico LA FE, Valencia, Spain.
(5) Servicio de Medicina Interna, Hospital Politécnico LA FE, Valencia, Spain.
(6) Sección Infectología, Servicio de Clínica Médica, Hospital Italiano, Bs. As., Argentina.
(7) Servicio de Transplante Hepático. Hospital Alemán. Bs. As. Argentina.
Background: Chagas disease, caused by T. cruzi, is transmitted
mainly by triatomine insect vectors, blood transfusion or by infected women to offspring. Amastigotes have been isolated from various organs,
thus organ transplantation (Tx) appears as a novel route of transmission.
The results of molecular diagnosis and of characterization of T. cruzi acute infection in naïve Tx recipients transplanted with organs from infected
deceased donors (IDD) are reported.
Mhetods: Case 1: IDD and 3 recipients (1 lung, 1 liver, 1 kidney).
Case 2: IDD and 1 liver recipient. Case 3: IDD and 2 recipients (1 liver
and 1 kidney-pancreas). Case 4: IDD and 2 kidney recipients. Although
other organ recipients from cases 1-4 may possibly exist, no samples were remitted for molecular diagnosis. Peripheral blood or cerebrospinal
fluid (CSF) samples from recipients were collected for detection of T.
cruzi by means of kinetoplastid (kDNA)-PCR. Positive samples were
subjected to a PCR algorithm for identification of T. cruzi Discrete
Typing Units (DTUs) and to Real-time PCR to quantify parasitic loads in
blood samples. Minicircle signatures of T. cruzi infecting populations were also analyzed using RFLP-PCR.
Results: Case 1: blood samples from recipients 1A and 1B were
kDNA-PCR positive after 72 and 98 days post-Tx, respectively, and both
were infected by DTU TcV. The comparison between their minicircle signatures revealed nearly identical RFLP-PCR profiles, confirming a common source of infection. Case 2: the recipient exhibited positive kDNAPCR 36 days post-Tx and was also infected by TcV. Case 3: blood
samples from recipient 3A were kDNA-PCR positive 43 days post-Tx
and TcV was identified. Case 4: One of the recipients showed kDNAPCR positive results 93 days after Tx and central nervous system involvement. T. cruzi infecting populations were characterized as TcV in blood. It
is worth noting that there were three other kidney recipients from cases 1,
3 and 4 that did not show a positive serologic finding or kDNA-PCR result at least after 429, 580 or 298 days post-Tx, respectively.
Correspondencia
[email protected]
Conclusions: Molecular tools allowed for early diagnosis of acute T.
cruzi infection. The routes of transmission could be inferred by fingerprinting of the detected T. cruzi populations, directly in peripheral blood
and CSF samples from transplant recipients. Furthermore, this report reveals the relevance of systematic monitoring of recipients by PCR strategies in order to provide prompt diagnosis and timely anti-trypanosomal
treatment.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi. Transplante.
Key words: Trypanosoma cruzi.Transplantation.
BIBLIOGRAFÍA
1. Storino R, Barragán H. Epidemiología. In: Storino R and Milei J,
editors. Doyma. Enfermedad de Chagas, 1st edn; Buenos Aires; 1994.
p. 51–74.
2. Burgos JM, Altcheh J, Bisio M, Duffy T, Valadares HMS, Seidenstein ME et al. Direct molecular characterization of bloodstream parasite populations causing Congenital Chagas disease. Int J Parasitol.
2007; 37: 1319-1327.
3. Duffy T, Bisio, M, Altcheh J, Burgos JM, Diez M, Levin MJ et al.
Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic
loads in Chagas Disease patients. PLoS Negl Trop Dis. 2009; 3(4):
e419.
Carolina Inés Cura et al.
Table 1
Follow-up of acute infected patients after organ Tx.
Figure 1
Minicircle signatures from infected recipients. A. RFLP- kDNA PCR from blood samples of cases 1A and 1B. B. RFLP- kDNA PCR from peripheral blood (PB) and cerebrospinal fluid (CSF) of case 4A
48
COMUNICACIÓN ORAL
ECONOMIC EVALUATION OF CHAGAS DISEASE SCREENING OF ASYMPTOMATIC
LATIN AMERICAN INDIVIDUALS LIVING IN NON ENDEMIC AREAS (*)
Evaluación económica del cribado de enfermedad de Chagas entre individuos de origen
latinoamericano que viven en áreas no endémicas
Elisa Sicuri (1), Ana Requena (1), Sheila Bussion (2), Edelweiss Alsadoro (1), Elizabeth Posada (1),
Joaquim Gascon (1) y Jose Muñoz (1).
(1) Barcelona Centre for International Health Research (CRESIB, Hospital Clínic-Universitat de Barcelona). Barcelona. España.
(2) Universitat de Barcelona. Barcelona.España.
(*) This work has been supported by the EC within the 7th Framework Program under grant agreement nº
FP7–GA-261495 (COHEMI).
Background: Chagas disease is endemic in several areas of Latin
America and migration is the channel through which the disease is imported in non-endemic countries1. In order to avoid the severe consequences
of the chronic phase of the disease it is fundamental to identify a strategy
through which precociously diagnose the infection in migrants from Latin
America2. This study presents the economic evaluation of Chagas disease
screening of asymptomatic individuals from Latin America in non endemic areas.
Methods: We reviewed all articles published in the literature that
evaluated Chagas disease prevalence of Latin American migrants from
different countries of origin in non endemic countries. The search strategy
was based on the data-base source MEDLINE, and was limited in the search string to articles published from 1997 to 2012 and to English, Spanish, French, and Portuguese languages. We selected articles based on
primary care health centres, maternities, blood banks and community based. We did not include papers based on hospital-based prevalence. The
cost-effectiveness of Chagas disease screening (option test) was tested
through a decision models, which includes two Markov models for the representation of disease progression, against the alternative hypothesis of
no screening (option no test) (figure 1). Costs were estimated from the
price list of a tertiary level hospital of Barcelona, Spain. Transition probabilities among states in the Markov model were taken from various published studies3-6. Quality adjusted life years (QALYs) were calculated
based on previously published utility weights7.
Results: Based on an average estimated prevalence of Chagas disease infection among immigrants from Latin America in Europe of 4.59%
and on a response to treatment rate of 20% of precociously treated patients in the indeterminate phase of the disease, cost per QALY averted
were € 326.98 for the option test and € 348.73 for the option no test. Cost
per QALY averted dropped to € 248.65 for the option test if a response to
treatment rate of 50% was considered (table 1). If the estimated average
prevalence of Chagas among Bolivian immigrants in Europe is considered (20.85%) cost per QALY averted resulted € 310.19 and € 348.08 with
a response to treatment rate of 20%; € 232.18 and € 348.08 response to
treatment rate of 50% (table 2). Univariate threshold analysis assessed
that even with a drop in Chagas’ prevalence to 2.95% or 0.3%, option test
would still be preferred to notest with a response to treatment rate of 20%
or 50%, respectively.
Conclusions: The current study proved Chagas screening of all asymptomatic Latin American migrants is the more cost-effective than the
non-screening option.
Correspondencia
[email protected]
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Cribado.
Key words: Chagas disease. Screening.
BIBLIOGRAPHY
1. Schmunis GA. Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries: the role of international migration. Mem Inst Oswaldo Cruz.
2007;102 Suppl 1:75-85.
2. Sicuri E, Munoz J, Pinazo MJ, Posada E, Sanchez J, Alonso PL, Gascon
J. Economic evaluation of Chagas disease screening of pregnant Latin
American women and of their infants in a non endemic area. Acta Trop.
2011; 118:110-117.
3. Viotti R, Vigliano C, Lococo B, Bertocchi G, Petti M, Alvarez MG, Postan M, Armenti A. Long-term cardiac outcomes of treating chronic Chagas
disease with benznidazole versus no treatment: a nonrandomized trial.
Ann Intern Med. 2006; 144:724-734.
4. Gascon J, Albajar P, Canas E, Flores M, Gomez i Prat J, Herrera RN,
Lafuente CA, Luciardi HL, Moncayo A, Molina L, Munoz J, Puente S,
Sanz G, Trevino B, Sergio-Salles X. [Diagnosis, management and treatment of chronic Chagas' heart disease in areas where Trypanosoma cruzi
infection is not endemic]. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2008; 26:99-106.
5. Pinazo MJ, Canas E, Elizalde JI, Garcia M, Gascon J, Gimeno F, Gomez
J, Guhl F, Ortiz V, Posada Ede J, Puente S, Rezende J, Salas J, Saravia J,
Torrico F, Torrus D, Trevino B. Diagnosis, management and treatment of
chronic Chagas' gastrointestinal disease in areas where Trypanosoma cruzi infection is not endemic. Gastroenterol Hepatol.2009; 33:191-200.
6. Muñoz J, Gomez i Prat J, Gallego M, Gimeno F, Trevino B, Lopez-Chejade P, Ribera O, Molina L, Sanz S, Pinazo MJ, Riera C, Posada EJ, Sanz
G, Portus M, Gascon J. Clinical profile of Trypanosoma cruzi infection in
a non-endemic setting: immigration and Chagas disease in Barcelona
(Spain). Acta Trop. 2009, 111:51-55
7. Wilson LS, Strosberg AM, Barrio K. Cost-effectiveness of Chagas disease interventions in latin america and the Caribbean: Markov models. Am
J Trop Med Hyg. 2005, 73:901-910.
Elisa Sicuri et al.
Figure 1
Schematic of the estimated decision model
Table 1
Cost-effectiveness ratios with a Chagas prevalence of 4.59%
Prevalence 4,59%
Scenario A: 20% Response to Treatment
Test
No test
Costs
29.029.679,00
30.054.145,00
QALYs
Costs/QALYs
86.182,74
348,73
88.780,41
326,98
Scenario B: 50% Response to Treatment
Costs
22.505.595,00
30.054.145,00
QALYs
Costs/QALYs
86.182,74
348,73
90.511,22
248,65
Table 2
Cost-effectiveness ratios with a Chagas prevalence of 20.85%
Prevalence 20,85%*
Scenario A: 20% Response to Treatment
Test
No test
50
Costs
125.095.839,00
136.267.626,00
QALYs
Costs/QALYs
391.483,67
348,08
403.283,57
310,19
Scenario B: 50% Response to Treatment
Costs
95.460.294,00
136.267.625,00
QALYs
Costs/QALYs
391.483,67
348,08
411.145,72
232,18
COMUNICACIÓN ORAL
ACTUALIZACIÓN DEL PROGRAMA DE DETECCIÓN PRECOZ DE LA ENFERMEDAD DE
CHAGAS EN LOS RECIÉN NACIDOS DE ORIGEN LATINOAMERICANO EN CATALUÑA
Update of the Screening Program of Chagas Disease in Newborns
of Latin American Origin in Catalonia
Luca Basile, Pilar Ciruela y grupo de trabajo de la enfermedad de Chagas en Cataluña.
Fundamentos: Debido a la alta presencia en Cataluña de inmigrantes
procedentes de países endémicos de la enfermedad de Chagas, en el año
2010 se ha implementado el programa de cribado sistemático para la prevención de la transmisión congénita de T. cruzi en Cataluña1.
Métodos: La población diana son las mujeres embarazadas latinoamericanas que asisten a las consultas prenatales del sistema sanitario público. El diagnóstico de la infección en las mujeres se realiza con la positividad de dos pruebas serológicas y en neonatos con una prueba
parasitológica al nacer o dos pruebas serológicas a partir de los 9 meses
de edad2. El sistema de vigilancia epidemiológica del programa se basa en
el Sistema de Notificación Microbiologica de Cataluña (SNMC) y los casos notificados se recojen en el Registro voluntario de casos de enfermedad de Chagas en Cataluña3.
Resultados: En 2010 se han diagnosticado 134 mujeres embarazadas
infectadas con T. cruzi. El 92,5% son de origen boliviano, el 96% presenta la forma indeterminada de la enfermedad y el 86% residen en la región
sanitaria de Barcelona. Se tiene confirmación de nacimiento del 89% de
los casos (119) pero 24 casos (20%) se perdieron antes de completar el seguimiento a los 9 meses. De los 95 que completaron el seguimiento, 86
fueron negativos, 8 positivos y uno discordante (figura 1). De los 8 neonatos infectados, 3 presentaron sintomatología al nacer. Todos fueron tratados con Benznidazole y la curación fue del 100%. El control a los otros
hijos de las madres infectadas ha sido muy deficitario aunque se detectaron 2 casos positivos de 136 en riesgo. La tasa de transmisión congénita
ha sido del 8,6% en general y del 9,4% en bolivianas. La tasa estimada de
cobertura del programa ha sido del 77,7% del total de nacimientos de madres latinoamericanas en Cataluña. Según datos preliminares, en 2011 se
han diagnosticado 148 mujeres embarazadas infectadas (+10% respecto
el año 2010). El 90% son de origen boliviano, el 93% presenta la forma
indeterminada de la enfermedad y el 94% residen en la región sanitaria de
Barcelona.
Conclusions: La tasa de trasmisión congénita es ligeramente superior a las publicadas en países no endemicos (rango 0-7,6%)4. La tasa de
cobertura estimada nos indica que hay zonas donde la implementación del
programa es aún deficitaria, por lo que sería conveniente ampliar la red de
centros colaboradores. Es necesario reforzar la red de vigilancia pediátrica con el objetivo de realizar el seguimiento a todos los niños nacidos de
madres infectadas y también al de sus hermanos.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi. Chagas congénito. Vigilancia epidemiologica. Enfermedad de Chagas.
Key words: Trypanosoma cruzi. Congenital Chagas. Chagas Disease.
Surveillance.
Correspondencia
Pilar Ciruela Navas
Agència de Salut Pública de Catalunya
Edifici Dr. Josep Salvany
C/Roc Boronat 81-95
08005 Barcelona
Correo electrónico: [email protected]
BIBLIOGRAFÍA
1.Generalitat de Catalunya. Protocol de cribratge i diagnòstic de la malaltia de
Chagas en dones embarassades llatinoamericanes i en els seus nadons. Departament de Salut, Generalitat de Catalunya; 2010. Disponible en:
http://www20.gencat.cat/docs/canalsalut/Home%20Canal%20Salut/Professionals/Temes_de_salut/Chagas/documents/Arxius/chagas_espanyol.pdf
2. Basile L, Oliveira I, Ciruela P, Plasencia A, Working group for developing
the catalonian screening programme for congenital transmission of Chagas
disease. The current screening programme for congenital transmission of Chagas disease in Catalonia. Euro Surveill. 2011; 16(38):pii=19972. Disponible
en: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=19972
3. Basile L, Ciruela P, grup de treball de la malaltia de Chagas a Catalunya.
Protocol de cribratge de la malaltia de Chagas en dones embarassades llatinoamericanes i els seus nadons. Resultats preliminars. Butlletí Epidemiològic de
Catalunya. 2011; 32(8):99-105. Disponible en:
http://www20.gencat.cat/docs/canalsalut/Home%20Canal%20Salut/Professionals/Recursos/Butlletins_de_salut/PROMOCIO_I_PROTECCIO_DE_LA
_SALUT/BEC_Butlleti_epidemiologic_de_Catalunya/2011/Arxius/bec0820
11.pdf
4.Oliveira I, Torrico F, Muñoz J, Gascón J. Congenital transmission of
Chagas disease: a clinical approach. Expert Rev Anti Infect Ther. 2010;
8(8):945-56.
AGRADECIMIENTOS
Al resto de miembros del Grupo de Trabajo de la enfermedad de Chagas
en Cataluña, que está formado por microbiólogos, comadronas, obstetras,
ginecólogos, pediatras, médicos de família, infectólogos y epidemiólogos que
trabajan en los centros colaboradores del protocolo de cribado de la enfermedad de Chagas en embarazadas latinoamericanas y sus hijos en Cataluña
(http://www20.gencat.cat/docs/canalsalut/Home%20Canal%20Salut/Professionals/Temes_de_salut/Chagas/documents/Arxius/llistatcentres.pdf)
Luca Basile et al.
Figura 1
Diagrama de seguimiento de los casos, desde el diagnóstico de la madre hasta el control
serológico a los 9 meses de los neonatos. Cataluña 2010
52
PÓSTER
CRIBADO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN MUJERES LATINOAMERICANAS EN
ÁREA DE SALUD DE ALICANTE-HOSPITAL GENERAL:
EVALUACIÓN DE APLICACIÓN DE LAS RECOMENDACIONES DE LA DIRECCIÓN
GENERAL DE SALUD PÚBLICA DE LA COMUNIDAD VALENCIANA
Evaluation of the Screening Program of Chagas Disease in Pregnant Latin American Women in
the Area of Alicante-Hospital General
Hector Pinargote (1), José M Ramos (1,2), Mariano Andreu (3), Jaume Sastre (4), Diego Torrús (5),
Juan C Martínez-Escoriza (6) y Joaquín Portilla (1,2 ).
(1) Servicio de Medicina Interna, Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. España.
(2) Departamento de Medicina Clínica. Universidad Miguel Hernández. Campus de San Juan. Alicante.
España.
(3) Servicio de Microbiología. Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. España.
(4) Unidad de Documentación Clínica y Admisión. Hospital General Universitario de Alicante. Alicante.
España.
(5) Servicio de Ginecología y Obstetricia. Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. España.
(6) Unidad de Enfermedades Infecciosas. Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. España.
Fundamentos: La enfermedad de Chagas (EC) es endémica en Norte ( Mejico) Centro y Sudamérica y constituye un problema de salud pública en la mayoría de estos países. Alrededor de un millón y medio de
las personas que viven en España son originarias de éstas áreas geográficas. Como la EC puede trasmitirse a la descendencia por vía transplacentaria, la Dirección General de Salud Pública de la Comunidad Valenciana
recomienda desde octubre de año 2007, en su protocolo de actuación en la
mujer gestante, el cribado sistemático de la EC en las gestantes latinoamericanas1. El objetivo del estudio fue determinar el grado de aplicación
de la recomendación del cribado de la EC en las mujeres gestantes latinoamericanas atendidas en el Hospital General Universitario de Alicante
(HGUA).
Métodos: Se diseñó un estudio retrospectivo cruzando la base de datos de todos los partos de pacientes latinoamericanas atendidas en el Servicio de Obstetricia del HGUA entre enero del 2008 hasta agosto del 2012
(como fuente de información se utilizaron los episodios del registro del
conjunto mínimo básico de datos), con la base de datos de las serología de
tripanosomiasis de la Sección de Microbiología, entre enero de 2008 a
agosto 2012. La determinación de anticuerpos frente Trypanosoma cruzi
se realizó mediante una prueba inmunocromatográfíca (SD Chagas Ab
Rapid, SD Standard Diagnostics, Ing; Corea). A las pacientes con esta
prueba positiva se les midieron los anticuerpos anti-T. cruzi por ELISA e
IFI en el laboratorio de referencia.
Correspondencia
José M. Ramos
Servicio de Medicina Interna
Hospital General Universitario de Alicante
Avda. Pintor Baeza, 12
03010 Alicante. España.
[email protected]
Resultados: Durante el periodo del estudio fueron atendidas 1.197
mujeres latinoamericanas y se excluyeron 65 mujeres de paises caribeños.
La edad media de las 1132 pacientes fue de 29,7 años (desviación estándar: 6,2). Se realizó la serología frente T. cruzi a 465 mujeres, lo que representó el 29,3% intervalo de confianza (IC95%: 38,2-44) de cumplimiento de las recomendaciones. Durante los primeros 8 meses se hizo el
cribado en el 41,1%, aumentando el mismo en los cuatros años sucesivos
(tabla 1). En las mujeres bolivianas se efectuó el cribado frente T. cruzi
en el 58,8, significativamente más que el resto de nacionalidades (odds
ratio (OR: 2,2; IC95%: 1,43-3,34), en cambio en las mujeres argentinas se
realizó en el 27,5 (OR:0,5; IC95%:0,35-0,71). Ocho pacientes fueron positivas frente T. cruzi (prevalencia: 2,8%; IC 95%: (1,6 - 4,9%): 5 de Bolivia (17,5%), 2 de Paraguay (5,4%) y 1 de Argentina (2,8%) (tabla 2).
Teniendo en cuenta la prevalencia de las mujeres a las que se les practicó
la serología, se dejaron de diagnosticar a 19 latinoamericanas (7 bolivianas, 3 paraguayas, 4 argentinas y 5 de otras nacionalidades (tabla 2).
Conclusiones: Se debería mejorar la estrategia y el control de cribado de EC en las gestantes latinoamericanas en el departamento de salud
del HGUA.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Cribado. Embarazo.
Key words: Chagas disease. Screening. Pregnancy
BIBLIOGRAFÍA
1. Conselleria de Sanitat de la Comunidad valenciana. Circular
3/2007/8/1 de la Consellería de Sanitat. Regulación del control de las
infecciones congénitas y perinatales en la Comunidat Valenciana.
[Control regulation of congenital and perinatal infections in Valencia
Community]. [Consultado: 28/12/2012]. Disponible en:
http://www.sp.san.gva.es/DgspPortal/docs/CIRCULAR_3_2007.pdf
Hector Pinargote et al.
Tabla 1
Cribado de la enfermedad de Chagas en los periodos de estudio
Ene 2008 / Ago. 2008
Mujeres
ingresadas en
Obstetricia
Mujeres a las que
se les realizó
la serología
Porcentaje de
mujeres cribadas
OR (IC 95%)
p
258
56
118
21,7
<0,001
216
104
47,5
2,27 (1,53-3,37)
-
115
45,7
1
48,1
2,50 (1,67-3,76)
<0,001
207
Sep. 2008 / Ago. 2009
Sep. 2009/ Ago. 2010
242
Sep. 2010/Ago. 2011
Sep. 2011 / Ago. 2012
209
72
2,44 (1,64-3,63)
34,4
Resultados
positivos
de la
serología
%
resultados
positivos
5
4,2
<0,001
1,42 (0,93-2,15)
0,02
1
1,8
1
0,9
5
4,8
1
1,4
Tabla 2
País de procedencia de las mujeres el estudio, cribado de la enfermedad de Chagas (EC) por país de
procedencia, prevalencia por país y mujeres que teóricamente no se han diagnosticado
Mujeres ingresadas en Sº de
Obstetricia
Nº
%*
Mujeres a las
que se les
realizó la
serología
Argentina
167
14,8
46
Paraguay
Venezuela
Brasil
Uruguay
Perú
Otros¦
Total
97
82
51
39
39
38
43
1132
8,6
7,2
4,5
3,4
3,4
3,3
3,8
100
27,5
0,5 (0,35-0,71)
42,4
149
Bolivia
1,46 (1,12-1,90)
112
27,6
23,3
47,8
% **
312
264
Resultados
positivos
Nº
Ecuador
Colombia
Odds ratio de
cumplimiento de la
recomendaciones
(IC del 95%)***
57
37
14
12
10
15
13
465
58,8
1,08 (0,81-1,42)
Prevalencia
de
EC
IC 95%
0
0.0
0 – 3,1
1
2,8
0,1 - 13
0
0.0
0 - 4,1
0,5 (0,35-0,71)
10
17,5
9,2 - 30,4
27,5
0,53 (0,28-0,99)
0
0.0
0- 26,8
25,6
39,5
30,2
41,1
0,48 (0,23-1)
0,93 (0,48-1,81)
-
45,1
30,8
1,2 (0,76-1,88)
0,63 (0,32-1,25)
2
0
0
0
0
13
5,4
0
0
0
0
2,8
0,9 - 19,5
0 - 30,1
0 - 34,5
0 - 25,4
0 - 28,3
1,6 - 4,9
Mujeres que teóricamente no se han
diagnosticado
****
N
rango
0
0-6
0
4
7
3
0
0
0
0
5
19
0-5
0-16
4 - 12
0-9
0-8
0 - 10
0 - 10
0-6
0-9
11 - 33
* Porcentaje de las mujeres ingresadas; ** Porcentaje del país de origen (porcentaje de cumplimiento de recomendación por país)
***Como referencia otras nacionalidades****mujeres téricas sin diagnosticar de enfermedad de Chagas = numero de mujeres a las que
no se les hizo la serología x prevalencia de resultados positivo . IC: intervalo de confianza.  Otros países (total/realizado/%): Chile
(14/5/(35,7%); Honduras (11/5/ 45,5%), Méjico (6/2/33,3%), Costa Rica (4/0/0%), El Salvador (3/1/33,3%), Guatemala (2/0/0%), Surinam (2/0/0%), Nicaragua (1/0/0).
54
PÓSTER
CRIBADO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN INMIGRANTES DE PARAGUAY
RESIDENTES DE BAIX VINALOPÓ, ALICANTE (*)
Screening of Chagas Disease among Immigrants from Paraguay Living in Baix Vinalopó.Alicante
José Manuel Ramos (1,2,3), Yamileth Ponce (2,4), Ingrid Gallegos (2,4), María Flores-Chávez (5)
y Félix Gutiérrez (2,3).
(1)Servicio de Medicina Interna. Hospital General Universitario de Alicante. Alicante. España.
(2)Unidad de Enfermedades Infecciones, Hospital General Universitario de Elche. Alicante. España.
(3)Departamento de Medicina Clínica. Universidad Miguel Hernández. Elche. Alicante. España.
(4)Unidad de Medicina Familiar, Hospital General Universitario de Elche. Alicante. España.
(5)Servicio de Parasitología. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III. Madrid.
España.
(*) Este estudio ha recibido el apoyo de la Fundación para la Investigación del Hospital Universitario de
Elche (FIBELX 08/08).
Fundamentos: La enfermedad de Chagas (EC) tiene una distribución principal en Centro y Sudamérica. Con motivo de la inmigración de
personas de dichos países se han comunicados numerosos casos de EC
importada en Europa y Estados Unidos (1). La mayoría de los casos de
EC diagnosticados en España corresponde a personas nacidas en Bolivia
(2,3). En el año 2011 vivían en España y en la comarca del Baix Vinalopó
(Alicante) 1.743.100 y 12.359 personas de Latinoamérica, respectivamente y de ellas 86.514 (4.96%) y 1.187 (9.60%) eran de Paraguay (4). El
objetivo del trabajo fue estudiar la prevalencia de EC en población de Paraguay residente en la comarca del Baix Vinalopo y estudiar los factores
de riesgo asociados con la EC.
Métodos: Desde noviembre del 2009 a agosto 2011 se realizaron
charlas informativas en la Asociación de Paraguayos de Elche y en reuniones dominicales sociales y deportivas para explicarles la EC. En la
elección de los individuos se siguió un muestreo de conveniencia y “bola
de nieve”. A continuación y tras dar su consentimiento se recogieron varias gotas de sangre en papel de filtro tipo Whatman Protein Saver™903® Card (Whatman/ GE Healthcare,E.E.U.U.) para la realización
de las pruebas convencionales (ELISA-CNM e IFI-CNM) en el Servicio
de Parasitología del Centro Nacional de Microbiología (CNM), Instituto
de Salud Carlos III. A las muestras capilares con una densidad óptica en el
ELISA-CNM superior a 0,40 y/o una IFI-CNM de 1/20 se les realizó una
ELISA-CNM y una IFI-CNM de sangre venosa. Se consideró EC cuando
en sangre venosa tuviera un valor ELISA-CNM >0,80 y de IFI-CNM >
1/40.
Resultados: De las 1.187 paraguayos empadronados en la comarca
del Baix Vinalopó se realizó la prueba a 162 (13.6%; intervalo de confianza [IC]95%:11,8-15,7%). La edad media era de 30,1 años (±12,8), y
el 56,8% eran mujeres. Las características demográficas y sociales se re
Correspondencia
José M Ramos
Servicio de Medicina Interna
03010 Alicante. Españ
[email protected]
cogen en la tabla 1. La serología en papel de filtro de EC confirmada por
sangre venosa fue positiva en 8 paraguayos (prevalencia: 4,9%; IC95%:
2,5-9,4%). Tres de las ocho (37,5%) casos diagnosticados referían conocer que tenían la EC por un diagnostico realizado en Paraguay durante el
embarazo. La asociación de las variables con la serología se recoge en la
tabla 2. Los pacientes con EC eran mayores que los que no tenían EC
(p=0,06). El diagnóstico de EC durante el cribado se relacionaba con sintomatología referida por el paciente de palpitaciones (p=0,02) y/o dolor
torácico (p=0,005) y con haber nacido en los departamentos de Paraguarí,
Itapúa y Presidentes Hayes (tabla 2).
Conclusiones: La prevalencia de la EC en población paraguaya residente en nuestro área no es nada despreciable y debería realizarse una estrategia de búsqueda activa de casos entre los paraguayos residentes en
España.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Cribado. Paraguay.
Key words: Chagas disease. Screening. Paraguay
BIBLIOGRAFÍA
1. Jackson Y, Angheben A, Carrilero Fernandez B, Jansa i Lopez del
Vallado JM, Jannin JG, Albajar-Viñas P. Management of Chagas disease in Europe. Experiences and challenges in Spain, Switzerland and
Italy. Bull Soc Pathol Exot. 2009;102:326-9.
2. Muñoz J, Gómez i Prat J, Gállego M, Gimeno F, Treviño B, LópezChejade P, et al. Clinical profile of Trypanosoma cruzi infection in a
non-endemic setting: immigration and Chagas disease in Barcelona
(Spain). Acta Trop. 2009;111:51-5
3. Pérez-Ayala A, Pérez-Molina JA, Norman F, Navarro M, MongeMaillo B, Díaz-Menéndez M, et al. Chagas disease in Latin American
migrants: a Spanish challenge. Clin Microbiol Infect. 2011;17:110813.
4. Instituto Nacional de Estadística. Padrón. Población por municipios.
Explotación del padrón municipal a 1 enero del 2011. [consultado
29/12/2012]. Disponible en: http://www.ine.es.
José Manuel Ramos et al.
Tabla 1
Características epidemiológicas y sociodemográficas de los 162 sujetos paraguayos estudiados
Variables epidemiológicas y demográficas
Sexo
n
Hombres
Mujeres
Edad, media (±DE), años
Edad, mediana (rango), años
Población pediátrica < 15 años
Departamento de nacimiento en Paraguay
Itapúa
Otros*
Tiempo de España, media (DE), años
13
8
51
41
22
31,5
25,3
13,6
9
39
4,8 (2,1)
Tiempo en España, mediana (rango), años
Aspectos relacionados con la enfermedad de Chagas
66,7
108
30,2 (13,1)
30 (5-78)
Central
Cordillera
Asunción
%
54
33,3
8
24,1
4 (0-14)
Haber vivido en casa de adobe
Conocimiento de la enfermedad de Chagas
Diagnosticado de enfermedad de Chagas en Paraguay
Palpitaciones
Disfagia
35,8
3
1,9
100
Tener familiares o amigos con enfermedad de Chagas
Transfusión
Referir síntomas relacionados de la enfermedad de Chagas
Estreñimiento
Dolor torácico
58
62,1
14
2
40
8,6
1,2
24,7
17
10,5
38
3
23,5
DE: desviación estándar. * Nacidos en España (n=2), Ñeembucú (n=5), San Pedro (n=5), Concepción (n=3),
Caazapá (n=3), Alto Paraná (n=3), Caaguazú (n=3), Paraguarí (n=7), Pdte. Hayes (n=1), Amambay (n=1).
1,9
Tabla 2
Factores relacionados con la infección por Enfermedad de Chagas
Sexo, femenino
Edad media (±DE) años
Conocimiento de la enfermedad de Chagas
Haber vivido en casa de adobe
Transfusiones previas
Tener familiares o amigos con enfermedad de Chagas
Palpitaciones
Dolor torácico
Estreñimiento
Disfagia
Departamentos de nacimiento en Paraguay
Central, Cordillera, Asunción, nacidos en España, Ñeembucú, San Pedro, Concepción, Caazapá, Alto Paraná, Caaguazú
Itapúa, Paraguarí o Pdte. Hayes
DE: desviación estándar
56
Serología positiva (n=8) Serología negativa(n=154)
Nº (%)
Nº (%)
2 (25%)
36,4 (10,3)
6 (75%)
5 (62,5%)
0
1 (12,5%)
5 (62,5%)
4 (50%)
3 (37,5%)
2 (1,3%)
5 (62,5%)
3 (37,5%)
52 (33,8%)
31,6 (12,8)
94 (61,4%)
53 (34,6%)
2 (1,3)
13 (8,5%)
33 (21,4%)
13 (8,4%)
37 (24,0%)
1 (12,5%)
140 (90,9%)
p
0,6
0,06
0,4
0,1
0,9
0,7
0,018
0,005
0,4
0,1
0,04
14 (9,1%)
PÓSTER
SEROPREVALENCIA DE INFECCIÓN POR TRYPANOSOMA CRUZI EN INMIGRANTES
PROCEDENTES DE LATINOAMÉRICA EN EL MUNICIPIO DE ALICANTE (*)
Seroprevalence of Trypanosoma cruzi Infection in Immigrants
from Latin America in Alicante Municipality
Fabiola Pérez-Chacón (1), Diego Torrús Tendero (1,2), Fernando J Bornay Llinares (3), Cristina Parada
(4), Miriam Navarro Beltra (5), José Manuel Ramos Rincón (1) y Joaquín Portilla Sogorb (1).
(1) Consulta de Enfermedades Importadas y Parasitología Clínica. Unidad de Enfermedades Infecciosas.
Servicio de Medicina Interna. Hospital General Universitario de Alicante.
(2) Departamento de Biotecnología, Universidad de Alicante.
(3) Área de Parasitología. Universidad Miguel Hernández.
(4) Asociación de Afectados de la Enfermedad de Chagas, Voluntarios y Amigos, Valencia (ASAPECHAVAE).
(5) Fundación Mundo Sano España.
(*) Estudio financiado por la Fundación Bienvenida Navarro Luciano Tripodi. Convocatoria premios y
becas 2010-2012
Fundamentos: En la Comunidad Valenciana se realiza actualmente
cribado de la enfermedad de Chagas importada en mujeres gestantes1 y en
donantes de sangre y órganos procedentes de áreas endémicas2, pero no
existe normativa vigente que contemple el cribado de esta enfermedad en
población general de origen latinoamericano. Objetivos: 1. Estimar la seroprevalencia de infección por T. cruzi en la población latinoamericana
residente en Alicante. 2. Estudiar las variables epidemiológicas asociadas
con la presencia de infección por T. cruzi.
Métodos: Estudio observacional de tipo transversal (encuesta de prevalencia). Captación de sujetos mediante: 1. convocatorias con la colaboración de Médicos del Mundo, ASAPECHAVAE, Fundación Mundo Sano y de asociaciones de latinoamericanos residentes en Alicante; 2.
búsqueda activa de casos en actividades sociales y lúdicas de la comunidad latinoamericana (partidos de fútbol). A todos los participantes se les
pasa una encuesta epidemiológica y de conocimientos sobre la enfermedad de Chagas, se les informa sobre la importancia de la detección precoz
de esta enfermedad y finalmente se les ofrece realizarse prueba rápida de
inmunocromatografía para la detección de anticuerpos anti-T. cruzi (Chagas Ab Rapid®, Standard Diagnostics, In.). Los casos positivos fueron
confirmados posteriormente mediante IFI y ELISA. Periodo de estudio:
noviembre 2011-mayo 2012.
Resultados: En total se realizó la encuesta epidemiológica y de conocimientos sobre la enfermedad a 347 personas: 57% mujeres; mediana
de edad 37 (±12,4) años; principales países de procedencia: Bolivia
(49%), Ecuador (21,3%), Colombia (17,3%), Paraguay (3,7%) y Argentina (3,3%). Se realizaron la prueba rápida de Chagas 300 personas (86,5%
del total), de las cuales 22 fueron positivas (prevalencia infección por T.
cruzi 7,33%, IC 95%: 4,2-10,4). La prevalencia en el subgrupo de bolivianos fue del 12,93% (IC 95% 7,5-18,35). De las 22 personas diagnosticadas de infección por T. cruzi, 17 (77,3%) eran mujeres. De acuerdo al
análisis bivariante (tabla 1), las variables en las que se observó asociación
estadística con la infección por T. cruzi fueron: haber visto el vector dentro del domicilio (OR 5,51; IC95%: 1,97-15,39), vivir en casa de adobe
(OR 3,93; IC 95%: 1,62-9, 51), antecedente de transfusión sanguínea (OR
3,11; IC 95%: 1,05-9,17), procedencia boliviana (OR 7,42; IC 95%: 2,1525,65) y ser mujer (OR 2,74; IC 95%: 0,98-7,63). En el análisis multiva-
Correspondencia
Diego Torrús Tendero
Unidad de Enfermedades Infecciosas
03010 Alicante, España
[email protected]
riante (tabla 2) mantuvieron una asociación independiente las variables:
«natural de Bolivia» (OR: 7,9; IC 95%:2,1-29,5 p=0,002) y «residencia
en casa de adobe» (OR: 2,4; IC 95%: 0,97-6,23; p = 0,056).
Conclusiones: 1. La prevalencia de infección por T. cruzi fue relativamente alta (7,3%) en comparación con otras series publicadas en nuestro país3-5; 2. Como en otros estudios, la mayor prevalencia se da entre los
bolivianos (12,93%). 3. La asociación de la infección por T. cruzi con el
antecedente de residencia en vivienda precaria es significativa. 4. Es importante impulsar programas de salud o estrategias que incluyan búsqueda activa de pacientes con enfermedad de Chagas para prevenir posibles
complicaciones de la infección crónica.Palabras clave: Enfermedad de
Chagas. Cribado. Embarazo.
Palabras clave: Seroprevalencia. Chagas. inmigrantes.
Key words: Seroprevalence, Chagas disease, immigrants.
BIBLIOGRAFÍA
1.Conselleria de Sanitat de la Comunidad Valenciana. Circular 3/2007/8/1 de
la Consellería de Sanitat. Regulación del control de las infecciones congénitas
y perinatales en la Comunidat Valenciana. [Consultado: 28/12/2012]. Disponible en: http://www.sp.san.gva.es/DgspPortal/docs/CIRCULAR_3_2007.pdf
2. Boletín Oficial del Estado. Real Decreto 1088/2005, de 16 de septiembre, por el que se establecen los requisitos técnicos y condiciones
mínimas de la hemodonación y de los centros y servicios de transfusión. Ministerio de Sanidad y Consumo: Boletín Oficial del Estado,
núm 225: 20/09/2005.
3.Piron M, Vergés M, Muñoz J, Casamitjana N, Sanz S, Maymó RM,
Hernández JM, Puig L, Portús M, Gascón J, Sauleda S. Seroprevalence of Trypanosoma cruzi infection in at-risk blood donors in Catalonia
(Spain). Transfusion. 2008; 48:1862-8.
4.Soriano Arandes A, Muñoz Gutierrez J, Vergés Navarro M, Castells
Doménech C, Portús Vinyeta M, Gascón Brustenga J. Prevalence of
Chagas disease in the Latin American immigrant population in a primary health centre in Barcelona (Spain). Acta Trop. 2009; 112:228-30.
5.Ramos JM, Ponce Y, Gallegos I, Flores-Chávez M, Cañavate C,
Gutiérrez F. Trypanosoma cruzi infection in Elche (Spain): comparison
of the seroprevalence in immigrants from Paraguay and Bolivia.
Pathog Glob Health. 2012;106:102–6.
Fabiola Pérez-Chacón et al
Tabla 1
Variables asociadas con la infección por T. cruzi (análisis bivariante)
Mujer
Sexo
Hombre
Edad en años
Casa adobe
0,046
36,9 (12,5)
0,038
2,74 (0,98-7,63)
19 (12,9%)
128 (87,1%)
<0,001
7,42 (2,15-25,65)
Si
17(13,8%)
106 (86,2%)
<0,001
5,51 (1,97-15,39)
Si
12 (15,6%)
65 (84,4%)
0,001
3,93 (1,62-951)
Si
11 (11,6%)
84 (88,4%)
0,055
2,31 (0,96-5,53)
Si
5 (17,2%)
24 (82,8)
0,048
3,11 (1,05-9,17)
No
No
Transfusión
124 (96,1%)
154 (90,1%)
OR (IC95%)
Bolivia
No
Zona rural
5 (3,9%)
17 (9,9%)
p
42,6 (9,7)
Otro país
Vector Intradomicilio
ICT Negativo
n= 278
Media (DT)
Mediana (AI)
Nacionalidad
ICT Positivo
n= 22
No
39,5 (14)
3 (2,0%)
5 (2,8%)
37 (15)
150 (98,0%)
172 (97,2%)
10 (4,5)
213 (95,5%)
11 (5,4%)
194 (94,6%)
17 (6,3%)
254 (93,7%)
0,009
Tabla 2
Variables asociadas con la infección por T. cruzi (análisis multivariante)
Edad (en años)
País
Resto de países
Bolivia
Significación
0,009
0,002
Residencia en casa de adobe
No
Sí
58
0,056
OR
1,058
1,000
7,989
1
2,47
IC 95,0% para OR
1,014-1,104
2,159-29,566
0,978-6,237
PÓSTER
EVALUACIÓN DEL ENSAYO BIO-FLASH® CHAGAS EN EL ANALIZADOR
AUTOMÁTICO BIO-FLASH® DE BIOKIT
Evaluation of BIO-FLASH® Chagas assay on biokit’s BIO-FLASH® analyser
Nancy López, Bibiana Canela, Marta López, Laura Heredia y Laurèa Taberner.
Biokit. Lliça d’Amunt. Barcelona.
Fundamentos: El ensayo BIO-FLASH® Chagas, que utiliza un antígeno recombinante, es un inmunoensayo quimioluminiscente en dos
etapas, para la medida cualitativa en suero y plasma humano de anticuerpos humanos IgG e IgM contra el parásito Trypanosoma cruzi, causante
de la enfermedad de Chagas. El objetivo de este estudio fue evaluar las
prestaciones analíticas de este nuevo ensayo en el analizador BIOFLASH®, de biokit, en comparación con otros ensayos comerciales.
Métodos: La especificidad se evaluó ensayando sueros y plasmas
procedentes de donantes de banco de sangre, incluyéndose también donantes procedentes de zonas endémicas de la enfermedad de Chagas, y
también muestras procedentes de pacientes hospitalizados. La sensibilidad se evaluó ensayando muestras con positividad verificada con dos métodos de referencia. Se calculó la especificidad y sensibilidad relativa respecto al valor consenso de los métodos de referencia (kits ELISA:
bioelisa, Certest, y kit quimioluminescente: Architect).
Correspondencia
[email protected]
Resultados: El resultado de especificidad relativa fue 99,68% (n:
2795, IC 95%: 99,4-99,9) mientras que para la sensibilidad relativa se
obtuvo 99,08% (n: 543, IC 95%: 97,9-99,7). La estabilidad del reactivo a
bordo del analizador BIO-FLASH® fue superior a 3 meses. La imprecisión intraensayo varió entre 1,6 % y 4,0 %, mientras que la imprecisión
total lo hizo entre 2,3 % y 4,1 %. El ensayo demostró estar libre de interferencias para Hemoglobina (hasta 5 g/L), Bilirrubina conjugada (hasta
0.18 g/L), Bilirrubina libre (0,18 g/L), Triglicéridos (13 g/L) o Factor
Reumatoide (800 UI/mL). Así mismo, se han evaluado posibles reacciones cruzadas con muestras positivas para diferentes patologías (HBV,
HCV, Malaria, Leishmania, Sífilis, ANA, HIV, HTLV).
Conclusiones: El ensayo BIO-FLASH® Chagas ha mostrado una
buena concordancia con los métodos de referencia y también una buena
imprecisión. También ha mostrado estar libre de los interferentes endógenos más habituales, así como una excelente robustez y elevada estabilidad
a bordo.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Test serológicos.
Key words: Chagas disease. Serologic tests.
PÓSTER
ADDRESSING THE CHALLENGE OF CHAGAS DISEASE IN A NON ENDEMIC COUNTRY:
THE COLLABORATION BETWEEN MÉDECINS SANS FRONTIÈRES (MSF), THE NGO
OIKOS AND THE CENTER OF TROPICAL DISEASES OF SACRO CUORE HOSPITAL
(NEGRAR) IN BERGAMO PROVINCE, ITALY
Afrontar el desafío de la enfermedad de Chagas en un país no endémico: la colaboración entre
Médicos Sin Fronteras (MSF), la ONG Oikos y el Centro de Enfermedades Tropicales del Hospital
Sacro Cuore (Negrar) en provincia de Bérgamo, Italia
Ernestina Carla Repetto (1), Ada Maristella Egidi (1), Andrea Angheben (2,3), Mariella Anselmi
(3,4), Ahmad Al Rousan (1), Gabriel Ledezma (1), Rosita Ruiz (1), Carlota Torrico (1), Mariachiara Buoninsegna (5), Fabio Andreoni (5), Barbara Maccagno (1), Gianfranco De Maio (1), Silvia
Garelli (1).
(1) Médecins Sans Frontières
(2) Center of Tropical Medicine of Sacro Cuore Don Calabria Hospital, Negrar (Verona).
(3) COHEMI Project.
(4) Centro de Epidemiología Comunitaria y Medicina Tropical (CECOMET) Esmeraldas. Ecuador.
(5) OIKOS Onlus. Bergamo.
Background: Migration has expanded Chagas disease`s (CD) geographical limits beyond Latin America (LA)1. Italy is estimated to be one
of the most affected country in Europe but a specific program for this disease has not been implemented so far at national level2.Objectives: MSF
intervention was aimed at strengthening an ongoing program of CD screening among the Latin American community (LAC) living in Bergamo
province, started in 2009 by the NGO OIKOS in collaboration with the
Centre for Tropical Diseases (CTD) Sacro Cuore Hospital (Negrar): the
program consisted in universal voluntary counseling and testing for
Trypanosoma cruzi and in defining the seroprevalence of the disease.
Méthods: Monthly serological screening (two different Elisa tests)
was offered to all migrants from LA living in Bergamo province, without
any restrictions (age, sex or residence permit status). Health promotion on
CD was carried out regularly by health promoters selected from the LAC,
focusing on young people (<30 years), in order to increase awareness and
encourage testing. Second line diagnostics and benznidazole were provided by CTD.
Results: From June to December 2012 above 2000 people were approached during health promotion activities, 784 people were screened
(529 females, 67.5%) and 139 people were found positive (138 Bolivians
and 1 child born in Italy from Bolivian mother): the overall seroprevalence in the LAC was 17,7% while the overall seroprevalence among Bolivians was 19,8%. Among positive cases 102 (73,4%) were females.
Country of origin distribution was: Bolivia 89%, Ecuador 4,8%, Peru`
2%, Brazil 1,4%, born in Italy 1,1%, Argentina 0,8%, Italians (travelers)
0,4%, Chile 0,3%, El Salvador 0,1%. In the Bolivian community males
and females showed both different mean age distribution (33,7 years, SD
+/- 12,7 versus 36,8 years, SD +/-12,6) (Chart 1) and seroprevalence
(15,7% versus 22,6%), respectively, but between positive Bolivian males
and females no significant difference was found in term of mean age
(43,3 years, SD +/- 9,8 versus 44,2 years, SD +/- 10,8 ).
Correspondencia
Ernestina Carla Repetto, [email protected],
Conclusions: With this observed seroprevalence, a large number of
people affected by CD is expected among Bolivians living in Bergamo
area (above 3500 among 18000 total estimated Bolivians). In Italy the delay of public initiatives to tackle this disease and the unavailability of treatment in the public health system is of particular concern, and needs to
be quickly addressed by Italian health authorities. We need more data to
confirm these results and to explain the difference of prevalence seen between men and women, to better explore the CD burden in Italy and to expand the access to test and treatment for this population in need.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas.Inmigrantes. Latinoamérica. Italia.
Key words: Chagas disease. Inmigrants. Latin America. Italy.
BIBLIOGRAPHY
1. Basile L, Jansà JM, Carlier Y, Salamanca DD, Angheben A, Bartoloni A, Seixas J, Van Gool T, Cañavate C, Flores-Chávez M, Jackson
Y, Chiodini PL, Albajar-Viñas P, Working Group on Chagas Disease.
Chagas disease in European countries: the challenge of a surveillance
system. Euro Surveill. 2011;16(37):19968.
2. Angheben A, Anselmi M, Gobbi F, Marocco S, Monteiro G, Buonfrate D, Tais S, Talamo M, Zavarise G, Strohmeyer M, Bartalesi F,
Mantella A, Di Tommaso M, Aiello KH, Veneruso G, Graziani G, Ferrari MM, Spreafico I, Bonifacio E, Gaiera G, Lanzafame M, Mascarello M, Cancrini G, Albajar-Viñas P, Bisoffi Z, Bartoloni A. Chagas
disease in Italy: breaking an epidemiological silence. Euro Surveill.
2011;16(37):19969.
Ernestina Carla Repetto et al.
Figure 1
Age distribution among screened Bolivians according to sex
62
Rev Esp Salud Pública 2013;63-64.
PÓSTER
ESTUDIO PILOTO SOBRE LA PREVALENCIA EN PORTUGAL DE LA ENFERMEDAD DE
CHAGAS EN MUJERES LATINOAMERICANAS EMBARAZADAS
Pilot Study on the Prevalence of Chagas Disease in Latin American Pregnant Women in Portugal
Ana Rita Ferrão, Marcelo Silva, Jorge Atouguia y Jorge Seixas.
Instituto de Higiene e Medicina Tropical. Universidade Nova de Lisboa.
Fundamentos: La enfermedad de Chagas es causada por el protozoario Trypanosoma cruzi, el cual se transmite a los seres humanos mediante diferentes mecanismos: a través del insecto vector triatomino, vía madre-hijo, transfusión de sangre, transplante o por vía oral1,2,3. El elevado
número de migrantes latinoamericanos en Europa hace que esta enfermedad sea un problema de salud pública en esta región1,4. No se conoce el
número de personas infectadas en Portugal y se calcula que más del 90%
de los casos no se han diagnosticado5. El tamizaje serológico para la enfermedad de Chagas en embarazadas en zonas no endémicas es económicamente rentable6,7. El objetivo de este estudio fue recoger datos epidemiológicos de embarazadas latinoamericanas, evaluar la prevalencia de la
infección por T. cruzi y comparar dos ensayos ELISA en esta población.
Métodos: Fueron reclutadas mujeres embarazadas latinoamericanas
en tres servicios hospitalarios de obstetricia en Lisboa, de las cuales fue
recogida información epidemiológica detallada. Fue evaluada la prevalencia de la infección por T. cruzi a través de un tamizaje serológico. Se
compararon los resultados entre dos ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) en esta población, uno de la empresa REM (Brasil) y otro de Ortho
Clinical Diagnostics (EEUU).
Resultados: Se consideraron 83 mujeres embarazadas en riesgo para
la enfermedad de Chagas. La cuasi totalidad de ellas era nacida en Brasil,
principalmente en el estado de Minas Gerais, donde se encuentra el mayor número de muertes relacionadas con la enfermedad de Chagas en este país. Solo 19,2% de las participantes había residido en zonas rurales.
La mayoría de las embarazadas estaba desempleada en Portugal, lo que
conduce a que más del 50% no desease tener más hijos en este país. En las
61 participantes con pruebas serológicas completas se obtuvieran resultados negativos para T. Cruzi con los dos kits ELISA. Las relaciones absorbancia/valor umbral obtenidas con los dos kits en cada muestra de sangre
fueran comparadas con el teste estadístico Wilcoxon, del cual se obtuve
un valor Sig.= 0,007 (intervalo de confianza de 95%), lo que indica que
tienen diferencias significativas. No hubo muestras en la cuales las relaciones absorbancia/valor umbral eran iguales: en 39 casos las relaciones
fueran más grandes con la OrthoClinicalDiagnostics, con una media de
0,099, y en 22 casos ocurrió lo contrario, siendo la media de las relaciones
obtenidas con el REM de 0,051.
Correspondencia
Ana Rita Ferrão
Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Universidade Nova de Lisboa
Rua da Junqueira, 100
1349-008 Lisboa, Portugal
Conclusiones: No hubo mujeres embarazadas infectadas por T. cruzi
en la muestra estudiada. La mayoría de las mujeres eran brasileñas y vivían con bajos ingresos. Fue posible caracterizar las migrantes brasileñas en
cuanto a la región de Brasil donde eran originarias. Apenas 1/5 de ellas
había vivido en zona rural. Mientras las relaciones absorbancia/valor umbral muestren diferencias significativas, las dos pruebas podrán ser utilizadas para tamizaje en la enfermedad de Chagas, pues los resultados fueran negativos con los dos kits. Sin embargo, con las muestras recogidas
no es posible averiguar si existen diferencias significativas en muestras
positivas o borderline. La continuidad de este estudio es importante para
obtener una muestra más representativa de la población. Este deberá ser
extendido y adaptado a otras instituciones de salud, así como a la comunidad migrante.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Enfermedades transmisibles Emergentes. Transmisión vertical de enfermedad infecciosa.
Key words: Chagas disease. Communicable diseases, emerging.
Infectious disease transmission, vertical.
BIBLIOGRAFÍA
1. WHO Expert Committee. Control of Chagas Disease. Geneva:
who; 2002.
2. Cook GC & Zumla AI. Manson’s Tropical Diseases. China: Saunders Elsevier; 2009.
3. Reiche EMV et al. Doença de Chagas congênita: epidemiologia,
diagnóstico laboratorial, prognóstico e tratamento. Jornal de Pediatria.
1996; 72(3):125-132.
4.World Health Organization. Control and prevention of Chagas disease in Europe. Geneva: WHO; 2009.
5.Basile L et al. Chagas disease in European countries: the challenge
of a surveillance system. Eurosurv. 2011;16(37):1-10.
6-Wilson, L.S. et al. Cost-effectiveness of implementation methods
for ELISA serology testing of Trypanosoma cruzi in California blood
banks. Am J Trop Med Hyg. 2008;79(1), p.53-68.
7-Sicuri, E. et al. Economic evaluation of Chagas disease screening of
pregnant Latin American women and of their infants in a non endemic
area. Acta Trop. 2011, 118(2):110-117.
PÓSTER
DESIGN SPECIFIC PRIMERS BASED ON THE sod GENE FOR Trypanosoma cruzi AS A
SCREENING TOOL: VALIDATION METHOD USING STRAINS FROM COLOMBIA
CLASSIFIED ACCORDING TO THEIR DTU
Diseño de primers específicos del gen de la sod de Trypanosoma cruzi como herramienta de
detección: validación del método usando un stock de cepas de Colombia
clasificadas en función de su DTU
Francisco Olmo (1), Patricia Palmaa, Javier Escobedo-Ortegón (2), Manuel Sánchez-Moreno (1),
Ana Mejía-Jaramillo (3), Omar Triana (3), Clotilde Marín (1).
(1) Grupo de Parasitología Molecular. Departmento de Parasitología. Universidad de Granada. Granada
España.
(2) Laboratory of Zoonoses and VBD´s. CIR Dr Hideyo Noguchi. Universidad Autónoma de Yucatán.
Yucatán. Mexico.
(3) Grupo Biología y Control de Enfermedades Infecciosas BCEI-SIU. Instituto de Biología. Universidad
de Antioquia. Medellín. Colombia.
Background: The nomenclature of T. cruzi has been recently modified
and six Discrete Typing Units (DTU’s) have been proposed within T. cruzi
being: T. cruzi I (TcI), T. cruzi II (TcII), T. cruzi III (TcIII), T. cruzi IV (TcIV),
T. cruzi V (TcV) and T. cruzi VI (TcVI) to reflect the high genetic variability
of the species1. Strains were classified in function of the DTU to which they
belong to and then tested on a pair of primers designed in our laboratory based on the sod gene of the parasite. Also it was tested the specificity of this
primer pair in other species, both kinetoplastids and species used in research
(including human DNA). An analysis was performed by sequencing of the
fragments obtained to check the variability within the gene.
Methods: The new 21 stocks from different biologic origins and geographical areas from Colombia and 3 different T. cruzi reference strains from
South America. The isolates were cultured in vitro using Grace’s insect medium supplemented with 10% of FBSI, the cells were collected by centrifugation at 600 g for 10 min at room temperature. kDNA extraction was carried
out following the protocol described by2. Genomic DNA from cultured mammalian cells and human cells obtained by scraping the buccal mucosa were
isolated following the purification procedure of Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega). The three PCRs performed in order to obtain the
DTU were: SL, 24S rDNA3,4 and 18S rDNA [5]. Once classified, these
strains will be used for the tuning of a pair of primers designed in our laboratory to detect the presence of parasite DNA in biological samples. These two
nucleotide sequences have been deposited in the GenBank database with accession number DQ441589. Finally, The fragments amplified by PCR-SOD
of the 24 strains, were migrated in low melting point agarose gel, purified
with a column (Wizard SV gel purification system; Promega, Madison, USA)
and then sequenced. The sequencing was carried out, for the 300 bp fragments, using a capillary electrophoresis sequencer ABI3100 Avant (APPLOAD Byosystems). Finally, the chromatograms obtained were treated with the
program MEGA4 getting a size sequence approximately 270 bp for each
strain after removing the primers
Results: After performing the above three PCRs mentioned, a series of
bands each were obtained, which allowed us to identify those DTUs which
the new isolates belong to. Table 1 lists the identification names of the strains
together with their geographical origin and the species of which they were
isolated from. Then the pair of primers designed in our laboratory was set up,
using the same set of samples. As it can be seen in Fig 1A, all strains originate a band near the 300 bp that corresponds to a fragment within the sod gene
of the parasite. After obtaining these fragments, they were purified and sequenced as it has been seen above. In view to confirm the sod T. cruzi PCR
specificity, this pair of primers was essayed with several DNA isolates men-
Correspondencia
Grupo de Parasitología Molecular
Departmento de Parasitología
Universidad de Granada
Severo Ochoa s/n
18071 Granada
tioned above. The results are shown in Fig 1B, which display only the expected band around 300 bp in the samples corresponding to T. cruzi. All these
DNA sequences were deposited into the NCBI/GenBank database under the
Accession numbers ET064919–ET064942 (GSS category).
Conclusions: The results of this work shown a clear domain of T.
cruzi DTU I in Colombia, saving an isolate identified as DTU V and another as DTU VI. This result confirm the previous reports which showed
the high prevalence of DTU I in north of the Amazon where is located
Colombia6. The PCR designed based on the sequence of the sod gene of
T. cruzi allows detect the strains of the parasite in different samples. It
could become in a new tool to epidemiological survey and genetic typing
studies, since it is a highly specific technique capable of discriminating
the parasite DNA compared to other DNA samples from different species.
It also would allow establish a criterion for cure after observing the disappearance of the parasite DNA in chemotherapy experiments and new
drugs design against T. cruzi.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi. PCR. Colombia.
Key words: Trypanosoma cruzi. PCR. Colombia.
BIBLIOGRAPHY
1. Zingales B, Miles M A, Campbell DA, Tibayrenc M, Macedo AM,
Teixeira M, Schijman AG, Llewellyn MS, Lages-Silva E, Machado
CR, Andrade SG, Sturm NR. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: Rationale, epidemiological relevance and research applications. Infection, Genetics and Evolution. 2012
Mar;12(2):240-53.
2. Gonçalves AM, Neheme NS, Morel CM. Trypanosomatid characteritation by schizodeme analysis. Genes and Antigens of parasites (A
Laboratory Manual). Morel, C.M., Ed, 2nd ed. Fundaçao Oswualdo
Cruz, Rio de Janeiro, RJ, Brazil ; 1984
3. Souto RP, Fernandes O, Macedo AM, Campbell DA, Zingales B.
DNA markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Molecular and Biochemical Parasitology 1996; 83:141-152.
4. Souto RP, Zingales B. Sensitive detection and strain classification
of Trypanosoma cruzi by amplification of a ribosomal RNA sequence.
Molecular and Biochemical Parasitology 1993 Nov; 62(1):45-52.
5.Clark CG, Pung OJ. Host specificity of ribosomal DNA variation in
sylvatic Trypanosoma cruzi from North America. Molecular and Biochemical Parasitology 1994 Jul;66(1):175-9.
6.Franzén O, Ochaya S, Sherwood E, Lewis MD, Llewellyn MS, Miles MA, Andersson B. Shotgun sequencing analysis of Trypanosoma
cruzi I Sylvio X10/1 and comparison with T. cruzi VI CL Brener.
PLoS Neglected Tropical Diseases 2011 Mar ; 8:5(3):e984.
Francisco Olmo et al.
Table 1
Origin and classification of new isolates of Trypanosoma cruzi from Colombia
Strain of
Trypanosoma cruzi
AC 29
AF 1
B 114
B 138
B 142
Geographical
origin
Acandi-Choco
Rhodnius pallescens
Cordoba
Triatoma dimidiata
Cordoba
Triatoma dimidiata
Amalfi-Antioquia Panstrongylus geniculatus
Cordoba
Cas 13
Casanare
Cas 18
Casanare
Cas 15
Cas 19
Cas 20
*CL Br
Fer 1
Fer 3
HA
Biological
origin
Casanare
Casanare
Casanare
Triatoma dimidiata
Rhodnius prolixus
Rhodnius prolixus
Didelphis marsupialis
Rhodnius prolixus
Rhodnius prolixus
Brasil
Bolivar
Triatoma infestans
Rhodnius pallescens
Casanare
Homo sapiens
Bolivar
Rhodnius pallescens
Mg 4
Magdalena
Rhodnius pallescens
Mg 9
Magdalena
Triatoma dimidiata
Mg 8
Sebas 1
SN 1
SN 3
SN 7
Magdalena
Magdalena
Guajira
Guajira
Guajira
Triatoma dimidiata
Rhodnius pallescens
Rhodnius prolixus
Rhodnius prolixus
Triatoma dimidiata
PCR#1: SL
350
PCR#2:
PCR#3:
24S rDNA 18S rDNA
-
-
DTU
Tc I
300
125
no band
Tc VI
350
-
-
Tc I
350
350
350
350
350
350
350
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Tc I
Tc I
Tc I
Tc I
Tc I
Tc I
Tc I
300
350
125
-
no band
-
Tc VI
Tc I
350
-
-
Tc I
350
350
350
350
350
300
350
350
-
-
-
-
-
-
-
110
-
-
165
-
Tc I
Tc I
Tc I
Tc I
Tc I
Tc V
Tc I
Tc I
Figure 1
(a) PCR fragments amplified by the sod gene primers designed in our group in all
Trypanosoma cruzi strains. (b) PCR fragment with the same primers used in different
samples from different species.
66
PÓSTER
CHAGASIC CARDIOPATHY AND PARASITIC LOADS IN INDIGENOUS POPULATIONS
FROM NORTHEASTERN ARGENTINA
Cardiopatía chagásica y carga parasitaria en aborígenes del noreste de Argentina
Raúl Lucero (1), Daniel Hernández (2), Bettina Brusés (1), Carolina Cura (3), Laura Formichelli
(1), Daniel Merino (1), Margarita Bisio (3) y Alejandro G Schijman (3).
(1) Instituto de Medicina Regional. Universidad Nacional del Nordeste. Resistencia. Argentina.
(2) Facultad de Medicina., Universidad Nacional del Nordeste. Corrientes. Argentina.
(3) Laboratorio de Biología Molecular de la Enfermedad de Chagas. INGEBI-CONICET. Bs As. Argentina.
Background: Trypanosoma cruzi discrete typing units as well as reinfections through vectorial transmission have been claimed as factors involved in
the pleomorphism of chronic Chagas disease manifestations and severity of
cardiomyopathy (1, 2). The aim of our study was focused in the characterisation of T.cruzi infection in indigenous populations from Northeastern Argentina, which inhabit highly endemic regions with risk of active transmission.
Methods: Blood samples from 494 aboriginal individuals (1-78 years
old) living in six localities at the Provinces of Chaco and Formosa, NE Argentina were analysed. Patients were classified according to Kuschnir Groups
to allow establish associations with severity of cardiac disease. Triatomine
bugs were collected from domiciles and peridomiciles from some localities
and T.cruzi was searched in abdominal samples by microscopy. All subjects
were tested for T. cruzi infection by two serological methods (HAI and ELISA). Seropositive patients underwent kinetoplastid DNA – PCR analyses
(kDNA) from bloodstream samples. Identification of DTUs was performed in
all kDNA-PCR positive samples, using PCR targeted to nuclear genomic
markers.
Results: Seroprevalence ranged from 3.7% in Mapic to 56.7% in Las
Hacheras. Analysis of T.infestans collected from dwelings next to Las Hacheras (n = 30) showed 65% of infection by T. cruzi. PCR was carried out in 152
seropositive cases. Patients with cardiac compromise (Kuschnir Groups G1 to
G3) presented higher PCR positivity than asymptomatic cases (G0) (Chi2:
46,22 , p < 0.05) . Most of genotyped samples classified as TcV, or TcII/V/VI
group (Figure 1, map). One case was classified as TcII/VI group while TcI, III
and IV were not detected among the population.
Correspondencia
[email protected]
Conclusions: Serologic screening indicated a high seroprevalence in
some studied locations. This data together with detection of a high proportion of infected bugs shows that active vectorial transmission persists
in these areas. A major finding is the association between PCR positivity
and Kuschnir group, suggesting a role of parasite persistence in cardiac
disease progression. No association between bloodstream DTUs and heart compromise was found, given that most bloodstream strains belonged
to the same DTU.
Palabras clave: Enfermedad de Chagas. Cardiopatía. Argentina.
Key words: Chagas disease. Heart Diseases. Argentina.
BIBLIOGRAPHY
1. Storino R, Auger S, Caravello O, Urrutia MI, Sanmartino M, Jörg
M. Chagasic cardiopathy in endemic area versus sporadically infected
patients. Rev Saúde Pública. 2002. 36(6):755-8.
2. Zingales B, Miles MA, Campbell DA, Tibayrenc M, Macedo AM,
Teixeira MM, et al. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: rationale, epidemiological relevance and research applications. Infect Genet Evol. 2012;12(2):240-53.
Francisco Olmo et al.
Figure 1
Kinetoplastid DNA-based PCR positivity in asymptomatic and Chagas heart disease ab
original populations from Northeastern Argentina
Figure 2
Distribution of DTUs in aboriginal patients from Chaco
68

Respuesta inmune en la enfermedad de Chagas y relación con su

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