Tecniche di patologia molecolare finalizzate all`analisi di

Tecniche di patologia
molecolare finalizzate
all'analisi di mutazioni
dei geni predittivi di
risposta alla terapia
oncologica
Carmelo Lupo
Casa di Cura La Maddalena
Palermo
Test molecolari PREDITTIVI di
risposta al farmaco
Finalizzati alla ricerca di fattori molecolari predittivi di risposta a
terapie biologiche mirate in oncologia (Target Therapies)
nell'ambito della Medicina Oncologica Personalizzata.
La positività o la negatività a tali test permette di:
• valutare l'appropriatezza di terapie biologiche in base alle
caratteristiche di sensibilità o resistenza dei singoli tumori alle
terapie
• evitare terapie inutili e inutili effetti tossici ai pazienti
Tecniche di patologia
molecolare
ONCOLOGIA
MOLECULAR
PATHOLOGY
ANATOMIA
PATOLOGICA
Predittivo
Perchè
Same type of cancer
Same type of treatment
Perchè
Perchè
K-RAS N-RAS
adenocarcinoma del colon
Cetuximab/panitunumab
HER2/neu
20-25% Carcinoma mammella
Trastuzumab
EGFR
20-25% adk polmone
Erlotinib
Gefitinib
BRAF V600E
50-60% Melanoma
Vemurafenib
BRAF
1799 T>A
V600E
ALK
3-5% adk polmone
Crizotinib
Il carcinoma del colon e del retto
Il pathway RAS-RAF
Funzione biologica
RAS
Crescita Cellulare
Proliferazione Cellulare
BRAF
MEK
ERK
Differenziazione Cellulare
“RAS-RAF signaling” nelle cellule normali
L’attivazione della cascata “RASRAF signaling” accade attraverso
steps sequenziali:
Attivazione attraverso fattori di
crescita
Attivazione di RAS
Attivazione di RAF
Fosforilazione di MEK
Fosforilazione di ERK
Attivazione dei fattori di trascrizione
Risultati
Proliferazione cellulare
Sopravvivenza cellulare
Mutazioni di RAS
KRAS
NRAS
Esone 2 codone 12, 13
Esone 3 codone 59, 61
Esone 4 codone 117, 146
Il carcinoma del polmone
Lung cancer
NSCLC
Nature Medicine 18, 349–351 (2012)
EGFR
Meccanismi di resistenza ai TKI
• Resistenza primaria:
– Inserzioni esone 20
– Mutazioni KRAS
• Resistenza acquisita (6-10 mesi dall’inizio della terapia):
– T790M nel 50% dei pazienti
– Amplificazione di MET nel 20%
Mutazioni di K-ras
Mutazioni di K-ras
Presenti nel 15-30% degli adenocarcinomi
Elevata incidenza nei forti fumatori
Predittivi di scarsa risposta a inibitori TK
Mutazioni di EGFR e K-ras sembrano essere mutualmente
esclusive
Ahrendt SA et al. Cancer 2001; 92:1525-30.
Kosaka T et al. Cancer Res 2004; 64: 8919-23.
Eberhard DA et al. JCO 2005;23:5900-09.
Inibitori TK di EGFR e stato molecolare
• Stato molecolare
EGFR TK mutazioni:
EGFR amplificazione (FISH):
Probabilmente predittivo
EGFR (IHC):
Fortemente predittive di risposta agli inibitori TK
Non predittivo
KRAS mutazioni:
Altamente predittive di scarsa risposta agli inibitori
Riarrangiamento del gene ALK
In generale
• Mutazioni attivanti EGFR
–
–
–
–
–
–
–
Non fumatori (50%)
Donne
Est Asia (50% vs 10%)
Adenocarcinoma con pattern lepidico
Adenocarcinoma papillare
Adenocarcinoma micropapillare
Non componente mucinosa
• ALK
–
–
–
–
–
Non fumatori
Pazienti più giovani
2-8% degli adenocarcinomi
Pattern solido
Carcinoma con componente a cellule ad anello con castone
• Le mutazioni di EGFR, KRAS, EML4-ALK e BRAF
sembrano essere mutalmente esclusive
• EGFR e KRAS sono attualmente valutati con metodiche
molecolari di sequenziamento o PCR (mutazione specifica)
• EML4-ALK è valutata mediante FISH
• Non esistono test per predirre la risposta a terapie antiVEGF
Il melanoma
Mutazione di BRAF
Il DNA estratto per il test, viene estratto da campioni di
tessuto di melanoma umano fissati in formalina e inclusi
in paraffina.
Detection: rilevare la presenza della mutazione V600E
(T1799A).
Con minore frequenza sono state osservate anche
mutazioni dei dinucleotidi che interessano il codone 600
(V600K, V600R e V600D).
Campioni per diagnosi
• Citologici
• Microistologici
• Resezioni chirurgiche
Fondamentale l'analisi del contesto in cui si opera
Requisiti
• Requisiti strutturali
• Requisiti culturali
• Requisiti comportamentali
Le fasi nella preparazione del tessuto tumorale
1
2
Scelta della sezione tumorale più
rappresentativa del tumore
Taglio sezioni
3
La dissezione manuale
Processo di preparazione dei campioni
•
•
•
•
Prelievo bioptico/chirurgico
Fissazione del tessuto
Inclusione in paraffina
Taglio sezioni del tessuto tramite
microtomo
• Colorazione
Contestualizzare
Il ruolo dell’anatomopatologo nel valutare:
Dimensioni area tumorale (le biopsie hanno frequentemente materiale insufficiente)
Percentuale di cellule tumorali nell’area/sezione scelta
Aree di necrosi
Aree con caratteristiche istologiche diverse (grado, istotipo, infiltrazione)
Fissazione
Gli scopi principali della fissazione sono:
Preservare la morfologia cellulare e l’architettura tissutale
Permettere al campione di tollerare gli stress della
processazione
Mantenere un buon grado di reattività per le colorazioni
tradizionali
Preservare l’integrità antigenica
Mantenere le molecole antigeniche nella loro posizione
originale
La formalina
La fissazione con formalina determina legami crociati tra il
liquido fissativo e gruppi attivi delle proteine, con
mascheramento di molti siti antigenici.
Metodiche mutazionali disponibili
Metodi di screening
Sequenziamento
Pirosequenziamento
HRMA (high resolution melting analysis)
SSCP
Bersaglio Molecolare
Scorpion Arms
PNA/LNA clamp
SNAPshot PCR
mutant-Enriched PCR
PCR Real-Time
Strip Assays
BioChip film Array
Sequenziamento diretto del DNA
Sequenziamento diretto
• I prodotti di due distinte PCR devono essere sequenziati in
forward e reverse, in modo da ottenere un numero di 3-4
sequenze per campione.
• Il controllo qualitativo viene effettuato mediante
assemblaggio delle sequenze con un software dedicato
all’analisi delle sequenze, lettura dell’elettroferogramma e
confronto con la sequenza wild type.
• I software per l’analisi di sequenza devono essere impostati
con livelli soglia piu bassi di quelli utilizzati per l’analisi dei
polimorfismi nel DNA della linea germinale.
Sequenziamento diretto
• Un campione può essere definito positivo per mutazione se
questa è presente in almeno due diverse sequenze (una
forward ed una reverse) ottenute da PCR indipendenti.
• Nel caso venga evidenziata una nuova mutazione (mai
riportata precedentemente) o una mutazione rara (riportata
1-2 volte nei database internazionali) questa deve essere
verificata in due ulteriori amplificati PCR.
• Ad intervalli di 25-30 sequenze, deve essere sequenziato
un DNA di controllo per verificare l’assenza di
contaminazioni e la qualità della procedura.
Pirosequenziamento
Pyrosequencing
Pirosequenziamento
• Il Pirosequenziamento è una tecnologia di sequenziamento
mediante sintesi. La tecnica consente il monitoraggio in
tempo reale della sintesi di DNA mediante il rilevamento
della bioluminescenza prodotta al termine di una cascata di
reazioni enzimatiche innescata dall’incorporazione di un
nucleotide.
• Vantaggi rispetto al sequenziamento standard: maggiore
sensibilità (riportata tra il 5 ed il 10%) e possibilità di
sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando in
tal
modo
eventuali
problematiche
legate
alla
frammentazione del DNA.
PCR Real Time workflow
Quattro fasi di lavoro che possono essere concluse
in <8 ore
Step
1
Step
2
(1) H&E Staining
& Tumor Content
Determination
Macro dissect as
per package insert
Genomic
DNA Isolation
Step
3
Step
4
Automated /
Standardized
Reporting
DNA Sample
Preparation Kit
Automated
Analysis
cobas® 4800
v2.0
PCR setup
DNA
Quantification
BRAF V600
PCR Real-Time
Sequenziamento DNA
BRAF
1799 T>A
V600E
Quantificazione Acidi Nucleici
I criteri per lavorare in sicurezza
Laboratorio
• Accreditato
• Superamento controlli di Qualità AIOM SIAPEC/Europei
Campioni
• Campione più rappresentativo
• Definire la % delle cellule tumorali
• Procedere alla macrodissezione se necessario
Analisi Molecolare
• Scelta della metodologia/tecnologia
• Sensibilità
Report
• Chiaro e completo di informazioni
Conclusioni
Qualità di DNA (poco
ma di buona qualità, non grandi quantità di DNA
degradato inutilizzabili)
Ricerchiamo mutazioni somatiche, concetto di “idoneità
tissutale”
Tutte le figure professionali coinvolte nel percorso
diagnostico-terapeutico del paziente, devono lavorare in
sinergia per un corretto management del materiale
biologico
La sommatoria di questi elementi condiziona fortemente la
valutazione dell’analisi mutazionale
“It is not the strongest of the species that
survives, nor the most intelligent, but the
ones most responsive to change”