Scarica i riassunti - Società Italiana di Microbiologia

Transcript

Società italiana di Microbiologia
Anno 9 - N. 1
Ottobre 2007
RIASSUNTI
35°
Congresso Nazionale della
Società Italiana di Microbiologia
Catania,
30 Settembre 3 Ottobre 2007
Relazioni
IMMUNITÀ E FUNGHI: VECCHI E NUOVI PARADIGMI
Luigina Romani
Microbiologia, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Perugia
La risposta immune agli opportunisti patogeni in genere si realizza grazie all’interazione reciproca tra immunità innata e quella adattativa specifica. Responsabili della immunità adattativa sono i diversi “subsets” di linfociti Th, quali i linfociti Th1 che
sono essenziali per una efficace resistenza antimicrobica e per contrastare l’azione non protettiva dei linfociti Th2, se non quella patogenetica dei linfociti Th17. Ne deriva che la conoscenza dei meccanismi di induzione, regolazione e disregolazione della
risposta immune Th fornisce di già nuovi suggerimenti per strategie di intervento in ambito profilattico e terapeutico. Numerosi
dati sperimentali indicano che una opportuna manipolazione di tali risposte è di beneficio terapeutico nelle infezioni fungine
invasive e può condizionare la risposta alla chemioterapia. Tuttavia, il sistema immune innato ha un ruolo di primo piano nell’orientare la risposta immune acquisita Th. Considerata inizialmente una risposta immediata e non specifica, deputata alla cattura ed ingestione di microrganismi e sostanze estranee da parte di fagociti, è ora evidente che l’immunità innata possiede almeno altri due fondamentali caratteristiche, che sono una considerevole specificità, essendo in grado di discriminare tra patogeni
diversi e tra questi ed il “self” e la capacità di innesco dell’immunità acquisita. L’attuazione di tali funzioni è resa possibile dalla
presenza di una varietà di recettori presenti su cellule della reattività innata, denominati PRRs, o “pattern-recognition receptors”,
capaci di riconoscere motivi strutturali altamente conservati nell’ambito dei patogeni,. Il coinvolgimento di svariati PPRs, ivi
inclusi i Toll-like receptors (TLR), da parte di ligandi microbici diversi dà luogo a risposte cellulari “su misura” per i vari patogeni. L’esistenza di svariati polimorfismi a livello di TLR, nonchè la possible disregolazione di TLR selettivi in condizioni morbose, pone le basi per una rivisitazione della patologia infettiva in generale e aggiunge nuovi criteri nella valutazione del rischio
infettivo nel paziente critico.
MAP E INFEZIONI CRONICHE
Leonardo A Sechi
Dipartimento di Scienze Biomediche, Sezione di Microbiologia Sperimentale e Clinica. Università di Sassari.
Mycobacterium avium ss. paratuberculosis (MAP) è un patogeno intracellulare obbligato che causa una malattia enterica granulomatosa transmurale cronica nei ruminanti nota come Paratubercolosi o Malattia di Johne. Il batterio infetta gli animali
prima dei sei mesi di vita attraverso il latte contaminato e la malattia si sviluppa anche dopo diversi anni. MAP ha un tempo di
duplicazione estremamente lento (24-48 h), per visualizzare una colonia sono necessari più di 3 mesi. Sono stati identificati tre
tipi diversi di MAP che infettano prevalentemente diverse specie. Il tipo I e il tipo III vengono isolati prevalentemente da ovini,
i ceppi sono in genere pigmentati, sono scarsamente presenti nelle feci e molto difficili da isolare e coltivare in laboratorio. Il
tipo II infetta i bovini e i batteri si trovano in abbondanza nelle feci degli animali malati. I MAP del tipo II si isolano facilmente in terreni addizionati di micobactina J (un sideroforo) e si colorano positivamente con la colorazione di Ziehl Neelsen, mentre i ceppi ovini si isolano con difficoltà e spesso non rispondono positivamente alla colorazione. Il MAP è un batterio estremamente resistente, è capace di sopravvivere nel latte dopo trattamento UHT, infatti è stato isolato in diversi casi dal latte pastorizzato in commercio in diverse nazioni europeee.
Il MAP è stato associato sempre con più frequenza al morbo di Crohn, una infiammazione enterica cronica nell’uomo di cui
non si conosce con certezza ancora la causa. In diversi casi MAP è stato isolato in forma sferoplastica da campioni bioptici di
pazienti Crohn in una percentuale che varia dal 50% al 70% dei casi. Recentemente è stato isolato anche dal sangue nel 50%
dei pazienti Crohn.
Diversi lavori riportano una correlazione fra polimorfismi presenti in diversi geni dell’ospite (NOD2, NRAMP1 etc.) e la malattia. Infine, MAP è stato identificato anche in biopsie di pazienti affetti da Sarcoidosi, un’altra malattia cronica umana di origine sconosciuta. Si discuterà del possibile ruolo di MAP anche in altre malattie croniche umane.
2
35° CONGRESSO NAZIONALE DELLA
MIMICHE MOLECOLARI NELLO SVILUPPO DI NUOVI VACCINI ANTIBATTERICI
Giuseppe Teti
Dipartimento di Patologia e Microbiologia Sperimentale - Università degli Studi di Messina
Esistono situazioni nelle quali non è possibile impiegare, come vaccini, alcuni prodotti microbici a causa di loro proprietà sfavorevoli, quali, ad esempio, un’attività tossica o una scarsa immunogenicità. In questi casi è possibile ricorrere a mimiche molecolari, cioè a sostanze che, grazie ad una simile conformazione molecolare, “imitano” o riproducono alcune attività funzionali
del prodotto microbico in esame, senza possederne quelle sfavorevoli. Abbiamo recentemente studiato la possibilità di usare
mimiche della capsula del meningococco di gruppo B come vaccini protettivi. Il polisaccaride capsulare di questo microrganismo è del tutto incapace di indurre risposte immunitarie, anche dopo coniugazione con proteine, a causa della sua somiglianza
con l’acido polisialico umano. Partendo dall’osservazione che questo polisaccaride possiede sia epitopi cross-reattivi con l’acido polisialico, che epitopi non cross-reattivi, abbiamo usato un anticorpo monoclonale (denominato SEAM3) diretto contro un
epitopo non cross-reattivo per selezionare mimiche di questo epitopo. Usando librerie fagiche di frammenti anticorpali e di peptidi abbiamo selezionato molecole in grado di legare il SEAM3. Alcuni di questi composti erano in grado di indurre, dopo immunizazione nel topo, anticorpi in grado di uccidere i meningococchi di gruppo B in presenza di complemento e di proteggere gli
animali nei confronti dell’infezione sperimentale. Queste mimiche molecolari potrebbero essere utili per lo sviluppo di un vaccino diretto contro il meningococo di gruppo B.
CARATTERIZZAZIONE DI CEPPI BATTERICI ISOLATI DA LATTE E GIODDU COME POTENZIALI
PROBIOTICI.
Zanetti Stefania
Dipartimento di Scienze Biomediche Sezione di Microbiologia Sperimentale e Clinica, Università degli Studi di Sassari.
I probiotici contengono principalmente lattobacilli e bifidobatteri. Il successo commerciale di tali prodotti ha stimolato la nostra
curiosità dal momento che sono stati isolati lattobacilli da prodotti caseari sardi quali il gioddu. Si tratta di un latte fermentato
tipico della Sardegna preparato in modo artigianale con latte di pecora o di capra. Gli studi effettuati finora su questo prodotto,
si limitano alla caratterizzazione della componente termofila della microflora lattica, mentre non sono noti dati riguardanti la
caratterizzazione della sua componente mesofila, nella quale le specie batteriche più rappresentate sono quelle appartenenti al
genere Lactobacillus.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di selezionare ceppi di Lactobacillus spp. isolati da gioddu, e valutarne le potenziali
proprietà probiotiche.
Sono stati analizzati 7 campioni di latte di pecora e 7 campioni di gioddu, preparato anch’esso con latte di pecora. Dai suddetti campioni sono stati isolati 16 ceppi di Lactobacillus, identificati con metodi genotipici e fenotipici e caratterizzati per la presenza di proprietà funzionali utili per un loro utilizzo come probiotici. La valutazione “in vitro” di tali potenzialità ha riguardato: la simulazione del transito attraverso il tratto gastrointestinale mediante esposizione ai succhi gastrici e ai sali biliari; la
capacità di permanere nell’intestino mediante saggi di adesione a 2 linee cellulari intestinali (Caco-2 e MIM/PPK). Sono stati
valutati diversi aspetti correlati con la sicurezza, come l’antibiotico resistenza e la presenza di plasmidi, infine per chiarire anche
il loro ruolo ecologico sono state analizzate la capacità di produrre biofilm e sostanze con attività antibatterica.
Tutti i 16 ceppi tranne uno, che dovrà essere identificato in modo certo, appartengono a tre specie: Lactobacillus plantarum (8
ceppi), Lactobacillus paracasei (5 ceppi), Lactobacillus reuteri (2 ceppi). La maggior parte di essi ha mostrato capacità di
sopravvivere nel tratto gastro-intestinale e di aderire a cellule presenti in questo tratto, una certa variabilità è stata osservata per
quanto riguarda gli altri caratteri analizzati.
I dati ottenuti suggeriscono che non solo il gioddu, ma anche altri prodotti, non ancora analizzati, della tradizione lattiero-casearia sarda potrebbero essere fonti di ceppi batterici con interessanti proprietà probiotiche.
SOCIETÀ ITALIANA DI MICROBIOLOGIA
3
IL CITOMEGALOVIRUS UMANO
Tiziana Lazzarotto
U.O. di Microbiologia, Policlinico S. Orsola Malpighi, Università di Bologna, Bologna.
Nel corso dell’esistenza, dal 40 all’80% degli individui nei paesi industrializzati e la quasi totalità degli individui nei paesi in
via di sviluppo, vanno incontro ad infezione da Citomegalovirus (CMV) che generalmente nei soggetti normocompetenti
decorre in modo asintomatico.
Le infezioni sintomatiche invece, sono appannaggio di determinate categorie di soggetti nei quali il sistema immunitario per
motivi fisiologici (neonati o anziani) o per motivi farmacologici (nei soggetti sottoposti a trattamenti immunosoppressivi perché riceventi trapianto) o infine per motivi patologici (come nel caso di pazienti con infezione da HIV) non risponde adeguatamente agli stimoli antigenici.
I problemi diagnostici, sia nei pazienti immunocompetenti che immunocompromessi, sono piuttosto complessi e non si esauriscono con l’accertamento di una infezione virale attiva in quanto essa è spesso asintomatica. E’ quindi di fondamentale importanza disporre di mezzi diagnostici che diano informazioni circa i fattori di predittività per la comparsa di malattia, i fattori
per il controllo della progressione della malattia ed in caso di intervento terapeutico i fattori che permettano di controllare
l’efficacia della terapia antivirale o di rivelare precocemente l’eventuale insuccesso della terapia.
A questo fine si è visto che i test da impiegare non sono test qualitativi ma quantitativi perché la quantità del virus (o dei suoi
componenti) nel sangue e in altri liquidi organici è preferenzialmente correlata alla entità dell’infezione/malattia da CMV.
Il metodo correntemente più utilizzato nei laboratori per la sorveglianza dell’infezione da CMV è la PCR (reazione polimerasica a catena) con format Real Time (procedura di quantificazione cinetica) e il sangue intero è il campione di elezione per il
monitoraggio della fase ematica.
Molti studi sono in corso per valutare la risposta linfocita T CMV-specifica (CD4+ e CD8+) durante il follow up di alcune
categorie di pazienti, quali le donne in gravidanza, i neonati e i soggetti sottoposti a trapianto d’organo solido o midollo
osseo/cellule staminali.
Per i pazienti trapiantati i risultati ottenuti sono in accordo nell’affermare come in questi pazienti la ricostituzione precoce
della risposta immune linfocita T CMV-specifica possa prevenire o accorciare la durata delle infezioni da CMV, evitare l’insorgenza della malattia e di possibili recidive. Al contrario, il rallentamento o la deficienza nella sua ricostituzione è alla base
dei ripetuti episodi di infezioni ricorrenti che sono oggi riconosciuti come uno dei maggiori fattori di rischio di insorgenza di
rigetto acuto e/o cronico dell’organo trapiantato.
RESIDUI E SURPLUS AGRO-ALIMENTARI IMPIEGABILI NEL SETTORE DELLE BIOTECNOLOGIE MICROBICHE: PRODUZIONE DI MOLECOLE AD ATTIVITÀ BIOLOGICA
Matilde Manzoni, Manuela Rollini
DiSTAM, Sezione di Microbiologia Industriale, Università degli Studi di Milano
Lo sviluppo di un processo biotecnologico basato sull’impiego di microrganismi e finalizzato all’ottenimento di beni o servizi
in risposta a specifiche richieste di mercato, deve tener in giusta considerazione i fattori che maggiormente incidono sull’economicità di processo. In particolare, i costi di produzione devono risultare in giusto rapporto con il valore aggiunto del prodotto che si intende ottenere. Per tale motivazione i terreni colturali usati a livello industriale sono costituiti da materie prime in
forma grezza, tra cui i residui e i surplus agro-alimentari, materie prime rinnovabili, quali le farine di origine vegetale e gli idrolizzati di sostanze polimeriche.
La produzione di statine, molecole ad attività biologica, in particolare anticolesterolemica in grado di agire sulla sintesi del colesterolo endogeno, costituisce un esempio di impiego di materie prime grezze. Le statine trovano largo impiego a livello farmacologico per il controllo dell’ipercolesterolemia, condizione di rischio vascolare che costituisce nei paesi occidentali una delle
principali cause di mortalità. Le diverse statine sono attualmente ottenibili da processi di sintesi chimica o da processi microbiologici, impiegando ceppi di ifomiceti appartenenti ai generi Aspergillus e Monascus. Particolare interesse hanno rivestito
negli ultimi anni, in relazione ai bassi livelli di tossicità, le statine naturali che risultano più idonee nelle terapie farmacologiche, rispetto ad alcune molecole di sintesi chimica.
A livello biosintetico la struttura principale delle statine, prodotti finali o intermedi del metabolismo microbico secondario, ha
origine da unità di acetato secondo la via dei polichetidi. Elevate rese di fermentazione di statine risultano correlabili alla presenza nella formulazione del terreno colturale di materie prime grezze, contenenti fattori non sempre noti e quantificabili, in
grado di agire sia come induttori di specifiche attività enzimatiche, coinvolte a livello di biosintesi, sia come precursori direttamente incorporati nella struttura della molecola. In tale contesto nell’ottica di messa a punto della formulazione di terreni colturali industriali per la produzione di statine, con particolare riferimento a lovastatina, pravastatina e al suo precursore mevastatina, risultano particolarmente idonei quali ingredienti non solo i peptoni vegetali, ma anche i sottoprodotti del processo di
estrazione di olio da semi di oleaginose, quali farine di arachide, cotone e soia.
4
MODIFICAZIONI DEL BIOFILM SOTTOGENGIVALE NELL’ETÀ AVANZATA: NUOVE SFIDE
MICROBIOLOGICHE NELLE SOCIETÀ DEL BENESSERE
L. Selan, M. Artini
Dip. Scienze Sanità Pubblica, Università “La Sapienza”, Roma
Le patologie del cavo orale sono strettamente dipendenti dall’età e dall’igiene orale. La prevalenza della parodontite passa da
5% all’età di 15 anni a 80% all’età di 60 anni. Il miglioramento socio-economico e assistenziale nella società del benessere ha
determinato un aumento della vita media: ciò determina l’emergenza di crescenti quote di popolazione con una differente composizione del microbiota orale.
Studi recenti hanno posto in evidenza una relazione tra disfunzioni dell’ambiente orale e composizione del microbiota orale nell’anziano. Tale relazione prescinde dalla causa della disfunzione: neuro-motoria, metabolica, iatrogena, etc. Ad esempio alcuni
studi recenti (Kang JG, 2006) hanno dimostrato che le disfunzioni motorie (disordini della parola, disturbi neurovegetativi, etc)
in pazienti anziani ricoverati per periodi superiori ai tre mesi hanno portato ad una modificazione del microbiota orale mostrando una notevole prevalenza di specie normalmente non presenti o transienti nei biofilm orali. In particolare nei pazienti con
xerostomia si osserva una prevalenza di Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA), P. aeruginosa, S. agalactiae e
S. maltophilia. Simili risultati sono stati ottenuti in popolazioni di anziani con disordini della parola. Circa metà dei pazienti
anziani con ipoalbuminemia e disfunzione motoria della bocca hanno un’alta prevalenza di MRSA e P. aeruginosa nel microbiota orale. Pazienti anziani confinati a letto per lunghi periodi hanno mostrato una ridotta prevalenza di batteri commensali orali
(quali S. mutans, P. gingivalis, etc) e un aumento significativo di P. aeruginosa, MRSA e di Staphylococcus spp CNS. L’aumento
di MRSA -in particolare- risulta maggiore in soggetti anziani che presentano bassi livelli di albumina sierica.
In conclusione le alterate condizioni morfo-funzionali e biochimiche dell’ambiente orale nell’anziano creano condizioni
favorevoli alla colonizzazione da parte di specie batteriche patogene normalmente assenti in questa sede. Ciò crea condizioni
predisponenti per infezioni locali (parodontite refrattaria o necrotizzante) e danni a distanza dovuti a metastatizzazioni infettive
o rilascio di tossine. Il microbiota orale modificato nell’anziano può trasformarsi, infine, in un reservoir e in una fucina di ceppi
batterici multiresistenti. Studi approfonditi potranno permettere di identificare le condizioni predisponenti per questa colonizzazione al fine di poter identificare protocolli di prevenzione e terapia mirati all’interno del SSN.
I RETROVIRUS ENDOGENI, RUOLO PATOGENETICO E FISIOLOGICO
Maria Carla Re
Sezione di Microbiologia, Dipartimento di Medicina Clinica Specilistica e Sperimentale, Università degli Studi di Bologna
I Retrovirus sono stati isolati nella maggior parte dei vertebrati e associati a molti tipi di patologie che spaziano da forme tumorali, alterazioni del sistema immunitario e forme neurologiche di tipo degenerativo. Il loro peculiare ciclo replicativo, l’associazione con importanti patologie e il complesso rapporto virus-ospite hanno destato un continuo interesse scientifico tanto da
rappresentare una delle famiglie virali in assoluto più studiate negli ultimi 30 anni.
Nell’ambito dei retrovirus vi è compreso un gruppo denominato retrovirus endogeni, cioè retrovirus in grado di integrarsi nel
genoma di molti organismi, ivi compreso l’uomo, in tempi remoti ed ora facenti parte stabilmente del loro genoma. I retrovirus, in rare occasioni, possono penetrare nella linea germinale di un animale ed insediarsi in un cromosoma dell’ospite come se
costituissero un suo normale gruppo di geni. In tal caso il DNA di origine virale, presente negli spermatozoi o nelle cellule uovo
dell’ospite, verrà trasmesso dai genitori alla prole. Tutti gli esseri umani recano nei loro cromosomi delle vestigia evolutive del
DNA di retrovirus ancestrali che infettarono i nostri antenati comuni.
Quando un retrovirus endogeno si inserisce nel genoma vicino a un gene, può alterarne le funzioni e influenzare l’evoluzione
del suo ospite. Oltre l’8 per cento del nostro genoma è composto da questi residui infettivi, infezioni che gli scienziati ritengono essere avvenute 25-35 milioni di anni fa.
In realtà molte evidenze sperimentali testimoniano che i retrovirus endogeni sono normalmente innocui e spesso presentano
mutazioni che impediscono di espletare un vero e proprio meccanismo patogeno. Anzi, alcuni di essi forniscono una protezione da alcune infezioni e altri sono coinvolti nel meccanismo di riproduzione (è stato addirittura ipotizzato che virus endogeni
possano avere influito sull’evoluzione della placenta di alcuni mammiferi).
Recentemente si sono sviluppati una serie di studi al fine di verificare l’eventuale ruolo dei retrovirus endogeni in alcune patologie umane. A tale proposito, di grande interesse è la loro presenza (in particolare RNA sintetizzato da una forma attiva di un
retrovirus appartenente alla famiglia “W”) a livelli elevati nei fluidi cerebrospinali provenienti da individui schizofrenici.
Il ruolo di questi virus è estramamente affascinante e il loro significato nella patogenesi coinvolge e coinvolegerà anche gli
xenotrapianti, nei quali la presenza di retrovirus endogeni - p.e. di origine suina -potrebbe presentare ripercussioni di grande
importanza, nell’uomo.
5
PREREQUISITI DI POTENZIALI PROBIOTICI DI ORIGINE ALIMENTARE
R. Coppola, M. Succi
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agro-alimentari, Ambientali e Microbiologiche
Università degli Studi del Molise - Campobasso
Nel corso degli anni l’importanza e le finalità dei “microrganismi probiotici” sono andate gradualmente modificandosi.
Svariati sono i tipi di preparazioni probiotiche che vengono utilizzati in tutto il mondo. Ai “classici” formulati destinati a individui affetti da specifiche malattie sono andati affiancandosi prodotti costituiti da alimenti fermentati ottenuti integrando la
microflora tipica con microrganismi probiotici che conferiscono proprietà salutistiche o “funzionali”.
E’, tuttavia, fin troppo noto che la vitalità e la funzionalità delle colture batteriche risentono dei trattamenti di preparazione, confezionamento e conservazione delle materie prime e dei prodotti finiti ed è influenzata significativamente, nel caso delle preparazioni probiotiche, dalla risposta agli stress subiti nel corso del transito attraverso l’apparato digerente.
E’, perciò, necessario sottoporre ad opportuni screening i microrganismi candidati ad essere utilizzati come probiotici, a maggior ragione quando siano isolati da matrici alimentari.
In questa sede sono sinteticamente riportati alcuni dati relativi ad esperienze personali, oltre a quelli disponibili in letteratura,
relativamente alla caratterizzazione di batteri lattici e alla opportunità di disporre di metodiche (anche in vitro) di rapida esecuzione e di sicura affidabilità.
In questo contesto le matrici alimentari possono costituire una fonte di microrganismi utili, preziosa e rassicurante per il consumatore. Da ciò scaturisce la necessità di verificare, prima ancora che le proprietà probiotiche propriamente dette, la sussistenza
di requisiti fondamentali quali la resistenza ai bassi valori di pH, agli enzimi digestivi e ai sali biliari.
LA LEISHMANIOSI: ATTUALITÀ NELLA DIAGNOSI DI LABORATORIO
Calderaro A., Gorrini C., Peruzzi S., Piccolo G., Dettori G., Chezzi C.
Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Sezione di Microbiologia, Università degli Studi di Parma.
Obiettivo. La leishmaniosi cutanea e viscerale, causata da protozoi del genere Leishmania, è un’infezione endemica nelle regioni tropicali e subtropicali e anche in paesi della fascia temperata quali l’Italia. Gli individui affetti da leishmaniosi nel mondo sono 12 milioni, mentre l’incidenza di nuovi casi per anno è di circa 2 milioni, come riportato dall’Organizzazione Mondiale della Sanità.
La diagnosi di laboratorio di leishmaniosi viene eseguita mediante la messa in evidenza al microscopio della forma amastigote del protozoo nei macrofagi presenti direttamente nel campione biologico (biopsia midollare o cutanea) e mediante esame colturale che consente lo sviluppo dei promastigoti in opportuni terreni di coltura. Anche se l’esame colturale è ancora oggi considerato metodo di riferimento per la diagnosi di laboratorio di leishmaniosi, esso risente come l’esame microscopico di alcuni svantaggi: entrambi i metodi
sono indaginosi, di lunga durata, carenti di specificità e di sensibilità e richiedono personale esperto. L’esame colturale, inoltre, spesso consente soltanto diagnosi retrospettive e non permette l’identificazione di specie, oltre a richiedere che i campioni vengano idoneamente raccolti, conservati e inviati al laboratorio preservando la vitalità del parassita eventualmente presente. L’identificazione di
specie viene eseguita, nei laboratori di riferimento, mediante l’analisi degli isoenzimi (raggruppamento in zimodemi).
Recentemente, sono stati introdotti saggi molecolari per la ricerca di antigeni specifici o dell’acido nucleico di Leishmania spp., mentre saggi adeguati per la ricerca di anticorpi anti – Leishmania sono poco utili a differenziare un’infezione recente da una pregressa.
Il presente studio riporta i risultati dell’applicazione di un saggio molecolare per la ricerca del DNA di Leishmania spp. in campioni
pervenuti al nostro laboratorio con richiesta di indagini per la ricerca di Leishmania.
Materiali e Metodi. In un periodo di 8 anni sono stati sottoposti ad esame colturale e ad un saggio di Real-time PCR con chimica
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 54 campioni di aspirato midollare, 20 biopsie cutanee, 3 linfonodi, 2 campioni di
sangue midollare e 1 aspirato da sacca cutanea, appartenenti ad altrettanti pazienti con sospetta leishmaniosi.
Risultati. Sono stati diagnosticati 11 casi di leishmaniosi (4 l. viscerale, 7 l. cutanea). In particolare, tutti i campioni sono risultati
positivi sia all’esame colturale sia al saggio di PCR, ad eccezione di un campione di aspirato midollare risultato negativo in coltura
e nel quale la presenza di Leishmania spp. è stata rilevata solo grazie al saggio molecolare.
Conclusioni. L’applicazione di un saggio molecolare ha consentito di migliorare la sensibilità, la specificità e la rapidità rispetto ai
metodi diagnostici convenzionali, migliorando l’accuratezza della diagnosi di leishmaniosi. Inoltre, potendo la ricerca dell’acido
nucleico prescindere dalla vitalità del parassita, l’utilizzo del saggio molecolare non presenta il problema dell’idoneità dei campioni
richiesta dall’esame colturale.
6
SPECIFICITÀ DI PROTEASI DI LACTOBACILLUS HELVETICUS E LIBERAZIONE DI SEQUENZE
ANTIIPERTENSIVE DA CASEINE
Gianluigi Scolari, Marisa Vescovo e Carla Zacconi
Istituto di Microbiologia, Università Cattolica SC, Piacenza ITALY
L’ipertensione è uno dei fattori di rischio associati a patologie cardiovascolari quali: infarto miocardico, ictus ischemico acuto,
scompensi cardiaci, nefropatia diabetica terminale, la cui insorgenza può diminuire del 16% per una riduzione di 5 mm Hg della
pressione arteriosa.
L’ idrolisi che trasforma l’angiotensinogeno in agiotensina I (azione della renina) e la trasformazione di questa nel vasocostrittore angiotensina II (enzima ACE) costituisce uno degli elementi fondamentali del ben noto sistema di controllo della pressione sanguigna Renina-Angiotensina-Aldosterone.
Le terapie basate sugli antagonisti dei recettori dell’angiotensina o sugli inibitori dell’ACE hanno dato i risultati migliori nel
ridurre: vasocostrizione, stimolo del nervo simpatico, sintesi dell’aldosterone, oltre a migliorare il controllo della crescita della
muscolatura liscia delle pareti vascolari e il loro ispessimento.
Numerosi peptidi ottenuti da proteine alimentari sono dotati di attività biologiche (antimicrobica, antivirale, neuroattiva, ormonale, immunomodulante, ecc.) e, soprattutto, ACE-inibitrici associate a possibile effetto antiipertensivo.
Come dimostrato da numerosi studi su ratti spontaneamente ipertesi (SHR), ed alcuni “in umana”, le proteine del latte sono una
ricca fonte di peptidi (casokinine e lattokinine) ACE-inibitori ed antiipertensivi, la cui attività in vivo, pur essendo più blanda
dei farmaci ACE-inibitori, non presenta gli effetti collaterali di questi ultimi, quali: ipotensione, aumento dei livelli di potassio,
riduzione delle funzioni renali, tosse, desquamazione della cute, angioedema e malformazioni fetali.
Latte fermentato con opportuni ceppi batterici proteolitici (Lactobacillus helveticus, in particolare) può rivelarsi alimento
funzionale ricco di peptidi antiipertensivi e svolgere un ruolo di presidio non farmacologico nella terapia sistematica dell’ipertensione, come suggerito dall’OMS.
Studi condotti su ceppi di L. helveticus, di varia origine casearia, hanno permesso di:
- determinare il meccanismo di ancoraggio della/e proteasi alla parete cellulare;
- mettere a punto un sistema semplice di estrazione dell’enzima/i;
- determinare la specificità della/e proteasi di ceppo su frammenti caseinici (as1 cn f(1-23));
- stabilire una correlazione tra effetto ACE-inibitore dell’idrolizzato caseinico e specificità della/e proteasi di ceppo.
Studi in corso sono finalizzati a determinare la correlazione tra specificità delle proteasi ed effetto antiipertensivo su ratti SHR.
AMFOTERICINA B, VECCHIA MOLECOLA, NUOVA FORMULAZIONE: SEMPRE ATTUALE
NELLE MICOSI IN ONCOEMATOLOGIA?
GLI ASPETTI FARMACOLOGICI
Federico Pea
Istituto di Farmacologia Clinica e Tossicologia – Dipartimento di Patologia e Medicina Sperimentale e Clinica – Azienda
Ospedaliero Universitaria Udine
L’armamentario terapeutico delle infezioni fungine sistemiche si fonda sull’ impiego di farmaci di consolidata validità (amfotericina B, fluconazolo, itraconazolo e flucitosina), ma caratterizzati da alcuni limiti e su alcuni nuovi farmaci (voriconazolo,
caspofungin). I limiti di tollerabilità propri dei polieni sono stati superati grazie alla tecnologia farmaceutica mediante la preparazione di formulazioni lipidiche dell’amfotericina B (liposomiale, complesso lipidico, dispersione colloidale). Tali preparazioni infatti, modificando il comportamento farmacocinetico dell’amfotericina B, consentono di ottenere un valido effetto terapeutico senza che si verifichi un eccessivo accumulo a livello delle cellule tubulari renali, solitamente responsabile di nefrotossicità. Tuttavia, esistono significative differenze farmacocinetiche tra le diverse preparazioni che ovviamente incidono sul comportamento farmacodinamico dell’amfotericina B. Per quanto riguarda le correlazioni farmacocinetico-farmacodinamiche (PK/PD),
amfotericina B ha attività concentrazione-dipendente, ovvero l’ attività antifungina sembra migliorare con l’aumentare della
concentrazione plasmatica massima in rapporto alla minima concentrazione inibente dell’agente eziologico (Cmax/MIC). Ciò
suggerisce che la modalità di somministrazione più idonea possa essere la monosomministrazione giornaliera nel minor tempo
possibile compatibilmente con la tollerabilità imfusionale. Inoltre, modelli sperimentali animali suggeriscono che per la formulazione liposomiale di amfotericina B può essere utile ricorrere a schemi di somministrazione alternativi, ovvero alte dosi a giorni alterni od addirittura una volta alla settimana, sia a scopo profilattico che terapeutico nei confronti di Candida ed Aspergillo.
7
FARMACI ANTI-VIRUS EPATITICI
Giovanni Raimondo & Giuliana Amaddeo
Dipartimento di Medicina Interna – Università di Messina
La scoperta e la diffusione di farmaci efficaci per la terapia delle epatiti croniche da virus B e virus C hanno rappresentato una
delle più importanti conquiste scientifiche degli ultimi anni. Di fatto tali terapie, permettendo la clearance virale o la soppressione della replicazione dei virus, hanno determinato una significativa riduzione del rischio di evoluzione verso la cirrosi e le
sue complicanze.
Farmaci attualmente disponibili per il trattamento dell’epatite da virus B sono: l’interferone alfa (anche nella forma coniugata a
polietilenglicole – PEG –) e gli analoghi nucleot(s)idici (AN). L’interferone alfa permette la clearance virale in circa il 15-20%
dei casi dopo un trattamento di 48 settimane. Gli AN determinano la soppressione dell’attività virale inibendo la trascriptasi
inversa del virus: il loro limite è di selezionare forme geneticamente varianti che presentano farmaco-resistenza. Gli AN attualmente utilizzabili sono: la lamivudina potente inibitore, che però induce dopo 4-5 anni resistenza nel 70% dei casi; l’adefovir
(usato in monoterapia o in combinazione con la lamivudina) che ha un’azione più lenta ma determina resistenza in un numero
minore di casi; l’entecavir, che ha un’azione soppressiva veloce e potente ed ha scarsa propensione ad indurre resistenza.
Farmaci che entreranno in commercio nei prossimi anni sono la telbivudina (in atto disponibile solo nell’ambito di trials controllati) ed il tenofovir (già utilizzato per pazienti coinfetti HBV-HIV).
Per il trattamento dell’epatite C il gold standard è la terapia di combinazione con PEG-Interferone alfa e ribavirina (analogo
nucleosidico sintetico ad attività antivirale ad ampio spettro). La molecola di interferone “pegilata” presenta un più lento assorbimento, una minore degradazione enzimatica ed una rallentata clearance rispetto alla forma “tradizionale”. Esistono oggi in
commercio due tipologie di peg-interferone: alfa-2a (40 KD) e alfa-2b (12 KD). La terapia combinata, comunque, può essere
somministrata solo ad una parte dei pazienti HCV positivi per il suo grado di tossicità, che determina importanti effetti collaterali. Inoltre, il trattamento della malattia cronica da HCV rimane una sfida aperta per l’insuccesso della terapia nei pazienti cirrotici o infettati con “genotipo difficile”(1-4). Così sono oggi in sperimentazione nuovi approcci terapeutici, quali l’interferone
legato ad albumina che presenta una lunga durata d’azione, gli inibitori specifici per gli enzimi virali, farmaci che prevengono
il normale processamento delle proteine del virus dell’epatite, gli oligonucleotidi antisenso.
CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE NELLE MALATTIE CRONICHE
Rosa Sessa
Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica, Università degli Studi di Roma “La Sapienza”
Negli ultimi anni Chlamydophila pneumoniae, patogeno intracellulare obbligato, è stata implicata in diverse malattie infiammatorie croniche quali l’aterosclerosi, la sclerosi multipla, la sindrome di Alzheimer ed il tumore al polmone.
C. pneumoniae, responsabile di infezioni del tratto respiratorio, presenta un peculiare ciclo replicativo, caratterizzato dall’alternarsi di due forme funzionalmente e morfologicamente distinte: il corpo elementare ed il corpo reticolato. Recentemente, é stata
individuata nelle cellule infettate una nuova forma, metabolicamente inattiva, di C. pneumoniae in grado di persistere nella cellula ospite per un lungo periodo di tempo.
La capacità di C. pneumoniae di dar luogo a forme persistenti è fondamentale nella patogenesi delle malattie infiammatorie croniche dal momento che esse rappresentano una strategia di sopravvivenza del microrganismo nella cellula ospite, in quanto queste forme sono in grado di eludere la risposta immunitaria e al tempo stesso resistere all’azione degli antibiotici.
É stato evidenziato che C. pneumoniae è in grado di infettare diversi tipi di cellule come macrofagi, linfociti, cellule endoteliali vascolari e cerebrali, cellule muscolari lisce e cellule della microglia.
D’altra parte C. pneumoniae, in seguito ad un’infezione respiratoria, può accedere, mediante le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), al sistema circolatorio e così raggiungere sedi extrapolmonari come la parete vascolare, l’endotelio cerebrale, ecc.
Infatti diversi studi hanno riscontrato la presenza di C. pneumoniae nei PBMC, ed in particolare nei soggetti con aterosclerosi.
La recente introduzione della real-time PCR ha permesso di determinare la quantità di DNA di C. pneumoniae; ciò potrebbe
essere di aiuto nel definire lo stato di una infezione sostenuta da questo microrganismo.
Un possibile meccanismo attraverso il quale C. pneumoniae può mediare lo sviluppo di malattie croniche infiammatorie potrebbe essere quello di indurre una alterata risposta immunitaria. Infatti uno studio che abbiamo effettuato sull’interazione tra C.
pneumoniae, linfociti T e/o macrofagi, derivati da monociti umani, ha dimostrato che C. pneumoniae è in grado, da una parte,
di sopravvivere nei macrofagi e, dall’altra, di indurre apoptosi nei linfociti T: meccanismi che favoriscono la persistenza dell’infezione.
8
MECCANISMI MOLECOLARI DELL’ANTIBIOTICO RESISTENZA AI MACROLIDI IN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE.
Maria Pia Montanari, Eleonora Giovanetti.
Istituto di Microbiologia e Scienze Biomediche, Università Politecnica delle Marche, Ancona.
In S. pneumoniae, la resistenza ai macrolidi dipende da due principali meccanismi: una modificazione dell’rRNA 23S ad opera
di una metilasi codificata dai geni erm [essenzialmente erm(B), erm(A) essendo molto raro negli pneumococchi] oppure un
efflusso attivo del farmaco associato alla presenza dei geni mef.
In Italia, il 90% degli isolati erm(B)-positivi è resistente anche alla tetraciclina (TET-R). Questa associazione riflette la diffusa
presenza di elementi genetici quali Tn1545 o Tn3872, risultanti dall’inserzione di DNA contenente erm(B) in trasposoni coniugativi della famiglia Tn916, che tipicamente portano il gene tet(M). Ma inaspettatamente, come da noi recentemente dimostrato, anche nei ceppi tetraciclino-sensibili (TET-S) sono presenti elementi Tn916-like con un gene tet(M) in forma silente: il frammento contenente erm(B) che si inserisce in Tn916 può variare, dando origine a differenti strutture composite (Tn3872, Tn6002,
Tn6003), ma sempre è dimostrabile un linkage erm(B)/tet(M).
Negli pneumococchi con resistenza da efflusso sono state descritte tre sottoclassi mef: mef(A), mef(E) e mef(I), col gene mef
sempre adiacente a una variante d’un altro gene d’efflusso, msr(D). Il gene mef(A) si trova sul trasposone defettivo Tn1207.1
(7,2 kb), che si integra nel cromosoma in celB. mef(E) si trova sull’elemento mega (5,5 kb), correlato al precedente ma senza
un sito specifico di inserzione (anche se sono stati identificati siti preferenziali); una variante di mega può far parte di elementi compositi Tn916-like quali Tn2009 e Tn2010. mef(I) risiede su un nuovo elemento denominato mIc [mef(I)-carrying] di 30,5
kb, formato da porzioni di due trasposoni noti [Tn5252 e Tn916, ancora con un tet(M) silente], e da un nuovo frammento contenente mef(I).
Questi dati suggeriscono alcune principali considerazioni. (i) Della resistenza ai macrolidi sono responsabili in S. pneumoniae
elementi genetici molto eterogenei. (ii) Questi elementi portano spesso anche determinanti di resistenza ad altri antibiotici,
espressi o meno: tet(M) (tetraciclina), aadE e aphA3 (aminoglicosidi), sat4 (streptotricina), catQ (cloramfenicolo). (iii) La paradossale e insospettata presenza di forme silenti di tet(M) in ceppi TET-S indica che elementi della famiglia Tn916, finora associati solo a ceppi con fenotipo TET-R, sono in realtà molto più diffusi di quanto si è sempre ritenuto.
EVOLUZIONE DELLE RESISTENZE NEI PATOGENI GRAM-POSITIVI
Pietro E. Varaldo.
Istituto di Microbiologia e Scienze Biomediche, Università Politecnica delle Marche, Ancona.
L’evoluzione delle antibiotico-resistenze nei batteri (come tutti i progressi evolutivi, compresi quelli riguardanti la patogenicità) dipende dall’aumento della fitness, intesa come un insieme di proprietà in grado di aumentare la sopravvivenza o la diffusione di un organismo in una specifica nicchia ecologica. Per un batterio, specialmente in ambito ospedaliero, essere resistente
può essere più vantaggioso che essere virulento. Questi concetti si applicano molto bene ai patogeni Gram-positivi, in particolare a quelli coinvolti nelle infezioni nosocomiali, come gli stafilococchi meticillino-resistenti e gli enterococchi (oggetto di questa relazione).
Nessuna specie batterica è mai stata segnata da un’antibiotico-resistenza quanto lo Staphylococcus aureus dalla meticillino-resistenza (MRSA). Da più di un quarto di secolo MRSA è il patogeno nosocomiale per eccellenza. Eppure solo negli ultimi anni,
grazie ai progressi tecnologici della genetica e delle tecniche di tipizzazione, si è cominciato a comprenderne l’origine e addirittura a delinearne una storia evolutiva. Da tempo conosciamo la PBP 2a responsabile della meticillino-resistenza e il gene mecA
che la codifica, ma solo da pochi anni abbiamo cominciato a conoscere gli elementi cromosomici (SCCmec) di cui mecA fa parte
e a comprenderne il ruolo nella variabilità delle caratteristiche biologiche di MRSA. Negli ultimi anni stiamo poi assistendo a
nuove emergenze di enorme impatto, come la comparsa di MRSA clinici resistenti alla vancomicina, sia a basso (VISA) che ad
alto (VRSA) livello, e la diffusione di MRSA al di fuori del tradizionale contesto ospedaliero, ossia nella comunità (CA-MRSA).
Questi ceppi pongono anche al laboratorio difficili problemi diagnostici, e lo stesso vale per le resistenze di alcuni stafilococchi
coagulasi-negativi come S. haemolyticus e S. epidermidis.
Quanto agli enterococchi, batteri già poco sensibili a molti antibiotici e diventati diffusamente resistenti ad alto livello agli aminglicosidi, l’aspetto più rilevante e attuale è quello dei ceppi vancomicino-resistenti (VRE). Se i meccanismi e le basi genetiche
della resistenza sono stati ampiamente spiegati, restano invece da chiarire molte questioni epidemiologiche.
Rispetto a una decina d’anni fa, quando mancavano i farmaci per le nuove emergenze da Gram-positivi (VRE, MRSA, VISA,
VRSA, multi-resistenze), oggi la situazione è migliorata sostanzialmente con l’avvento di nuovi antibiotici. Addirittura possiamo permetterci il lusso di dibattere se la vancomicina sia un antibiotico ancora attuale o ormai obsoleto.
9
IPOTESI DI STRATEGIE TERAPEUTICHE INNOVATIVE NELLE INFEZIONI DA MALASSEZIA
FURFUR
Tufano M.A. Donnarumma G.
Seconda Università degli Studi di Napoli, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di
Microbiologia e Microbiologia clinica
Malassezia furfur, prima specie identificata nell’ambito del genere Malassezia, corrispondente alla più antica denominazione di
Pityrosporum ovale (Bizzozero 1846), è un lievito lipido-dipendente del microbiota cutaneo umano. M. furfur è l’agente eziologico della Pityriasis versicolor, della dermatite seborroica e di follicoliti associate ad eczema seborroico. E’ causa, meno frequentemente, di infezioni sistemiche in pazienti riceventi terapie lipidiche, portatori di cateteri e immunocompromessi. Inoltre
M. furfur è uno dei microrganismi maggiormente coinvolti nella patogenesi della psoriasi e della dermatite atopica, infiammazioni croniche della cute mediate da un punto di vista immunologico sicuramente da una anomalia a livello delle sottopopolazioni Th1 e Th2 delle cellule T helper, con uno sbilanciamento del rapporto Th1/Th2. Attualmente nella terapia dermatologica
è sempre maggiore la domanda di un’alternativa ai corticosteroidi topici che da cinquant’anni rappresentano il gold standard
della terapia topica antinfiammatoria ma che è limitata dagli effetti collaterali locali e sistemici di questa classe di farmaci. In
questa ottica, la ricerca farmaco-dermatologica si è rivolta soprattutto allo studio di valide alternative terapeutiche topiche scevre degli effetti collaterali dei corticosteroidi. Un particolare interesse è rivolto alle b-defensine (HBDs), peptidi antimicrobici
secreti dagli epiteli e considerati componenti integrali della difesa immune innata dell’ospite. Tra queste, HBD2, efficace nel
killing di C. albicans e M. furfur, sintetizzata sia in risposta all’adesione e invasione di microrganismi patogeni che in risposta
a citochine proinfiammatorie, è attualmente considerata un’ importante molecola effettrice della risposta immune innata. Tra le
molecole naturali, attualmente allo studio per il trattamento di patologie cutanee complicate da infezioni micotiche ricorrenti,
un particolare interesse è rivolto allo zucchero vegetale AV119. Recenti dati indicano che questa molecola oltre ad avere un effetto aggregante su M. furfur, inibendone la capacità invasiva, è in grado di indurre, in vitro, l’espressione genica della HBD2.
Infine, tra le molecole immunomodulatrici, riveste un ruolo di particolare interesse il Tacrolimus, un macrolide prodotto da
Streptomyces tsukubaensis, capace di sopprimere la reazioni infiammatoria mantenendo elevata, in un modello sperimentale in
vitro, l’espressione del peptide antimicrobico HBD2.
ASPETTI CLINICI DELLE PARODONTOPATIE: DIAGNOSI E TERAPIA
B. Rossetti
Catania
Le patologie parodontali riconoscono nell’alterazione del biofilm fisiologico del cavo orale l’eziologia primaria .
Il loro esordio e la loro evoluzione clinica possono tuttavia esprimersi clinicamente in maniera estremamente varia nei vari
pazienti e persino nelle varie zone del cavo orale dello stesso paziente , nonostante questi ospitino popolazioni batteriche simili quantitativamente e qualitativamente.
Ciò è reso possibile dalla variabilità della reazione dell’ospite alla presenza nel biofilm orale di batteri potenzialmente patogeni che media la progressione della distruzione dei tessuti di supporto dei denti.
A sua volta la risposta dell’ospite viene influenzata da numerosi fattori di rischio ambientali , acquisiti o genetici.
Nell’ultimo decennio l’evoluzione delle conoscenze scientifiche nell’ambito di numerose patologie sistemiche ha visto nascere
prima il sospetto poi la certezza di una correlazione tra le multiformi espressioni cliniche delle patologie parodontali ed un cluster sempre più esteso di patologie sistemiche tanto da far considerare le une come fattori di rischio delle altre (parodontopatie,
malattie immunitarie, aterosclerosi, sindromi dismetaboliche, diabete, obesità, etc.).
Tutto ciò ha portato alla necessità di rivedere completamente sia la diagnosi, con una revisione completa della classificazione
delle patologie parodontali, che la terapia, mirata ad intervenire sia sulla placca batterica sia sulla modulazione delle risposte
immunitarie dell’ospite.
Scopo di questa relazione è quello di focalizzare l’attenzione sulle più recenti acquisizioni etiopatogenetiche al fine di giungere ad una diagnosi certa ed a un approccio terapeutico personalizzato in grado di interferire in maniera ottimale sull’evoluzione
della patologia in atto e sulla modulazione della risposta dell’ospite per poi mostrare le attuali possibilità di riparazione degli
esiti della distruzione tissutale, tenendo presenti anche le prospettive aperte dalle ricerche sulle tecniche rigenerative di ingegneria tissutale .
10
NUOVE MOLECOLE PER L’INIBIZIONE DEI VIRUS ERPETICI
Massimiliano Galdiero
Dipartimento di Medicina Sperimentale II Università degli Studi di Napoli, Napoli
Viral entry represents one of the most attractive targets in the search for new drugs to treat HSV-1 infections. Recent advances
in the understanding of the cellular and molecular mechanisms of HSV-1 entry provide the basis for novel therapeutic strategies
that prevent viral penetration of the target cell-membrane. Considerable advances have been made in the last years also in the
design of derivatives acting as inhibitors of HSV-1 entry.
Herpesviruses infect their target cells by fusion of the viral envelope with the cellular plasma membrane at neutral pH. For penetration a set of envelope glycoproteins which are conserved throughout the Herpesviridae subfamilies is required; this includes
glycoproteins B (gB), D (gD), H (gH), and L (gL). We have recently reported that peptides corresponding to several regions of
gH specifically inhibit HSV-1 infection. Our results indicate that a number of potential sites for therapeutic intervention can be
found on HSV gH. Interestingly, some peptides are also able to inhibit infection when added to the virus before infection of the
cells. The molecular mechanism involved in viral entry as well as the structural and functional aspects of entry inhibitors could
be useful in the design of HSV-1 antivirals.
METAPNEUMOVIRUS: UNA REALTÀ EMERGENTE NELLA PATOLOGIA RESPIRATORIA DEL
PAZIENTE PEDIATRICO
Arnaldo Caruso,1 Sonia Caracciolo,1 Rosalinda Bruno,2 Stefania Marsico,2 Simona Fiorentini.1
1Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata, Sezione di Microbiologia, Università degli Studi di Brescia;
2Dipartimento Farmaco-Biologico, Sezione di Microbiologia, Università della Calabria.
Background: Epidemie di infezioni acute del tratto respiratorio (IATR) causate da Metapneumovirus (MPV) sono eventi rari.
Ad oggi è stato documentato, dal punto di vista clinico, un solo evento epidemico di infezione da MPV in Norvegia. Durante la
stagione autunnale-primaverile 2005-2006, un episodio epidemico di MPV avvenuto nel 2005-2006, ci ha permesso di studiare
le caratteristiche virologiche e cliniche dell’infezione virale.
Metodi: Lavaggi nasali erano ottenuti da bambini di età inferiore a 5 anni ospedalizzati per IATR. I campioni venivano valutati per la presenza di MPV mediante metodica di RT-PCR, avendo come bersaglio il gene virale F. I prodotti di amplificazione
erano sequenziati e le sequenze ottenute venivano utilizzate per la costruzione di un albero filogenetico.
Risultati: Un’epidemia di infezione da MPV (25.3%) veniva osservata nel 2005-2006, tra i mesi di Ottobre 2005 e Marzo 2006.
L’analisi filogenetica evidenziava che il 61.5% degli MPV appartenevano al ceppo A2a, 23.1% al ceppo A2b, 12.8% al sottogruppo B1 e 2.5% al sottogruppo B2. Le nostre ricerche non evidenziavano la presenza di sottogruppi A1 nei campioni saggiati. La frequenza di infezioni da MPV era simile in bambini con età inferiore o superiore ad 1 anno. Il picco epidemico di MPV
si sovrapponeva al picco di infezione da virus respiratorio sinciziale (RSV), così che le confezioni MPV/RSV erano frequenti
(19 su 39; 48.7%). Dal punto di vista clinico, 12 bambini su 20 con la sola infezione da MPV (60%) sviluppavano una bronchiolite, 4 (20%) mostravano un quadro di polmonite e 4 (20%) sviluppavano malattie a livello del tratto respiratorio superiore. La bronchiolite era più frequente nei bambini con età inferiore ad 1 anno (88.8%) che in bambini con età superiore ad 1 anno
(36.3%)(P<0.05). E’ interessante notare che 4 pazienti infettati con MPV su 11 (36.3%) con età superiore ad 1 anno mostravano un quadro severo di polmonite.
Conclusione: I nostri risultati forniscono un’ulteriore evidenza dell’importanza di MPV come patogeno associato alle infezioni del tratto respiratorio in bambini con età <5 anni. Il coinvolgimento del virus in alcuni casi di polmonite lascia ipotizzare la
presenza di ceppi aggressivi di MPV o una particolare suscettibilità di alcuni individui all’infezione virale.
11
RESIDUI A BASE DI CHERATINA E POTENZIALITA’ BIOTECNOLOGICHE
Francesco Canganella
Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica, Università della Tuscia, Viterbo
Da diversi anni il Laboratorio di Microbiologia Agraria e Ambientale dell’Università della Tuscia (VT) conduce ricerche volte
all’isolamento di microrganismi eterotrofi in grado di degradare sostanze organiche derivanti da attività agrarie, industriali o che
possano rappresentare fonte di contaminazione ambientale.
L’attività di ricerca è stata indirizzata soprattutto verso l’isolamento e la caratterizzazione di microrganismi con proprietà: 1)
cheratinolitiche, per quanto riguarda la possibile eliminazione delle penne di pollo, scarto zootecnico difficilmente eliminabile
per via biologica; 2) chitinolitiche, per il loro potenziale utilizzo nel comparto agro-alimentare per la biodegradazione degli scarti derivanti dalla lavorazione dei crostacei; 3) idrocarburo-degradative, per quel che concerne le applicazioni nel settore dell’estrazione petrolifera e delle bonifiche di ambienti contaminati da petrolio e derivati.
In tutti questi casi lo scopo delle attività sperimentali è quello di abbinare l’azione biodegradativa svolta dal microrganismo
(beneficio ambientale) alla biosintesi di molecole utili ai fini di applicazioni biotecnologiche (beneficio industriale).
In particolare i microrganismi cheratinolitici e chitinolitici potrebbero, se opportunatamente selezionati e valutati, produrre
enzimi o miscele di aminoacidi e vitamine con potenziali applicazioni nel settore farmaceutico e mangimistico.
Il primo caso è quello che ci ha visti maggiormente coinvolti negli ultimi anni: numerose indagini infatti sono state svolte al fine
di isolare microrganismi che presentassero una importante attività idrolitica con potenzialità biotecnologiche. Tra i risultati ottenuti tali ricerche hanno condotto anni fa all’isolamento di una nuova biovar di Clostridium sporogenes, una specie strettamente imparentata con il Clostridium novyi ed il Clostridium botulinum, in grado di degradare penne di pollo ad una temperatura di
42°C. Si tratta di un ceppo anaerobico e termotollerante assolutamente non patogeno, isolato originariamente dai fanghi di una
sorgente termale nei pressi di Viterbo.
- Bertsch, A., Coello, N. (2005): A biotechnological process for treatment and recycling poultry feathers as a feed ingredient. Bioresour. Technol. 96, 1703-1708.
- Friedrich, A., B., Antranikian, G. (1996): Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales.
Appl. Environ. Microbiol. 62, 2875-2882.
- Gupta R., Ramnani, P. (2006): Microbial keratinases and their perspective applications: an overview. Appl. Microbiol. Biotechnol. 4, 1-13.
- Ionata E., Canganella F., Bianconi G., Benno Y., Capasso A., Rossi M, La Cara F. A novel keratinase from Clostridium sporogenes bv. pennavorans bv. nov., a thermotolerant organism isolated from solfataric muds. Microbiological Research (2007) available online Nov 2006
- Van Der Poel, A., F., B., El Boushy, A., R. (1990): Processing methods for feather meal and aspects of quality. Nether. J. of Agricultural Science 38, 681-695.
LE REAZIONI AVVERSE DA ANTIBIOTICI, UNO STRUMENTO PER MIGLIORARE L’APPROPRIATEZZA PRESCRITTIVA IN MEDICINA GENERALE.
Achille Patrizio Caputi
Dipartimento Clinico e Sperimentale di Medicina e Farmacologia, Università degli Studi di Messina.
Per garantire al paziente la migliore gestione della sua patologia e limitare l’insorgenza o per lo meno la gravità delle reazioni
avverse da farmaci, è necessario che i professionisti sanitari si adoperino affinché le loro prescrizioni siano quanto più possibile “appropriate”, dove per appropriatezza non si intende semplicemente prescrivere un farmaco che ha l’indicazione per la patologia che si vuole trattare. Infatti, una prescrizione si definisce appropriata quando prende in considerazioni i 2 elementi principali della terapia: il farmaco ed il paziente.
Questo vuol dire che un medico, nel momento di redigere una prescrizione deve considerare le caratteristiche del farmaco (molecola, indicazione, dose, durata della terapia) e quelle del paziente (età, abitudini di vita, eventuale presenza di patologie concomitanti e relative terapie seguite, tradizionali o complementari).
Gli antibiotici, poi, rappresentano una situazione particolare in quanto un uso non corretto di questi farmaci può avere delle
ripercussioni non solo sul paziente che li assume (eventuali reazioni avverse), ma anche sull’ecosistema in cui vive.
Infatti, prescrivere antibiotici anche quando non sono necessari o usare indiscriminatamente le varie classi a disposizione (specialmente gli ultimissimi ritrovati a discapito di molecole più vecchie, di comprovata efficacia e maneggevolezza) espone al
rischio di insorgenza e diffusione di resistenze batteriche con ripercussioni importanti a vari livelli:
salute del paziente (inefficacia terapeutica, esposizione a più molecole, aumento del rischio di eventi avversi)
professione medica (con limitazione del “corredo” farmacologico a disposizione)
spesa sanitaria (che inevitabilmente aumenta perché si ricorre a più farmaci e si richedono più esami diagnostici).
Nella salvaguardia degli antibiotici, il medico di medicina generale ricopre un ruolo di primo piano, in quanto, forte di un rapporto più stretto e frequente con i suoi assistiti, può avviare una strategia educazionale che renda i pazienti più consapevoli del
rischio/beneficio degli antibiotici, in modo da “arginare” le richieste insistenti di terapia antibiotica anche quando non necessaria e favorire l’aderenza alla prescrizione per quanto riguarda la dose e la durata del trattamento.
12
I NANOBATTERI: RAPPRESENTANO UN REALE RISCHIO PER LA SALUTE DELL’UOMO?
Carla Pruzzo
DIBIO, Università di Genova
Negli anni ’90 Kajander e Ciftcioglu (PNAS, 95:8274, 1998) hanno descritto forme batteriche inusuali, Gram negative, contaminanti campioni di sangue umano e bovino; essendo caratterizzate da dimensioni che possono arrivare al valore minimo di 0,02
µm, per queste forme è stato coniato il neologismo “nanobatterio”. Tra le proprietà principali descritte dagli stessi autori sono
compresi un tempo di generazione di circa tre giorni, una spiccata resistenza al calore e la sensibilità agli aminoglicosidi; sulla
base della sequenza dell’RNA ribosomiale 16S, i nanobatteri sono stati assegnati al sottogruppo α-2 dei Proteobatteri. Per le
proprietà mineralizzanti, queste forme sono state anche definite “nano-particelle calcificanti”. Dal primo e comunque recente
lavoro scientifico che riporta la loro presunta esistenza, i nanobatteri hanno suscitato molti dibattiti e controversie; la comunità
scientifica è infatti divisa sulla possibilità che questa nano-forma di vita esista realmente. Di conseguenza, ancora più dibattuto
è il ruolo, proposto da alcuni autori, nella patogenesi di malattie infettive e nella formazione di calcificazioni patologiche (ad
esempio, calcoli renali, calcoli della colecisti, placche vascolari). Verrà presentata una rassegna dei dati di letteratura più recenti riguardanti la ricerca sui nanobatteri e il presunto rischio da essi rappresentato per la salute dell’uomo.
PRODUZIONE BIOLOGICA DI IDROGENO DA RESIDUI DELL’AGROINDUSTRIA
Roberto De Philippis
Dipartimento di Biotecnologie agrarie, Università degli Studi di Firenze
Il grande interesse sviluppatosi recentemente nei confronti dell’idrogeno come vettore energetico è giustificato non solo dal fatto
che l’utilizzazione di questo gas per la produzione di energia non dà origine all’immissione di gas inquinanti nell’atmosfera ma
anche dalla possibilità di utilizzare, per la sua produzione, fonti rinnovabili di energia. In anni recenti, è cresciuto l’interesse
scientifico nei confronti della produzione di idrogeno per via biologica, ottenuto tramite lo sfruttamento di alcuni gruppi di
microrganismi capaci di produrre H2 a partire da substrati di varia natura ed origine. Sono stati condotti infatti numerosi studi
utilizzando sia batteri chemioeterotrofi fermentanti che batteri fotoeterotrofi, allo scopo di mettere a punto processi di produzione di idrogeno che consentissero di produrre un combustibile non inquinante, utilizzando fonti rinnovabili quali sono i prodotti di scarto dell’agroindustria e i sottoprodotti agroalimentari. Nel caso dei batteri chemioeterotrofi fermentanti, la produzione di idrogeno, pur potendo stechiometricamente portare alla completa ossidazione dei substrati organici fermentescibili, nella
realtà, per ragioni termodinamiche, si ferma ben prima, rilasciando insieme all’idrogeno acidi organici a basso peso molecolare. I batteri fotosintetici anossigenici sono in grado però di utilizzare gli acidi organici prodotti dai chemioeterotrofi per produrre
a loro volta idrogeno, sfruttando l’energia luminosa per superare le limitazioni di natura termodinamica insite nel processo, rendendo così possibile l’utilizzazione di tutto il potere riducente presente nel substrato di partenza. Molte ricerche sono state quindi indirizzate verso lo studio di sistemi di produzione ibrida a due fasi, costituiti da un primo stadio, nel quale batteri anaerobi
chemioeterotrofi conducono la fermentazione di residui vegetali con produzione di H2 e acidi grassi, e da un secondo stadio,
nel quale batteri fotosintetici anossigenici conducono la fotodegradazione degli acidi grassi contenuti nel mezzo recuperato dalla
prima fermentazione. E’ stato infine recentemente dimostrato che l’idrogeno prodotto da batteri fotosintetici anossigenici a partire da acidi organici contenuti nel percolato di residui vegetali ha una purezza tale da consentire la produzione di energia elettrica tramite una cella a combustibile PEMFC.
Le ricerche condotte presso il Dipartimento di Biotecnologie agrarie sono state finanziate dal fondo FISR, Programma “Nuovi
sistemi di produzione e gestione dell’energia”, da Ente Cassa di Risparmio di Firenze, Progetto Firenze Hydrolab, e da Regione
Toscana, Programma Ricerca per l’ambiente - PRAA 2004-2006.
13
EPIDEMIOLOGIA E CARATTERISTICHE DI RESISTENZA DI UN PATOGENO EMERGENTE :
CLOSTRIDIUM DIFFICILE PCR RIBOTYPE 027
Paola Mastrantonio
Dipartimento Malattie Infettive, Parassitarie ed Immunomediate - Istituto Superiore di Sanità - Roma
Negli ultimi anni sono stati riportati in Nord America ed Europa numerosi outbreak ospedalieri da Clostridium difficile PCR
ribotype 027, associati ad un aumentato tasso di complicanze e mortalità. Si tratta di ceppi produttori sia di tossina A che di
tossina B, che possiedono i geni che codificano per la tossina binaria e che mostrano una delezione di 18 bp ed una mutazione che provoca uno slittamento nel sistema di lettura del gene tcdC , probabilmente responsabili di una espressione disregolata di entrambe le tossine.
Questi ceppi sono inoltre forti produttori di tossine e sono caratterizzati da un elevata resistenza ai fluorochinoloni , presumibilmente dovuta alla presenza di una mutazione nella gyrA (CaT) che risulta responsabile della sostituzione aminoacidica
Th82aIle.
Recentemente è stato condotto uno studio prospettico che ha avuto quale obiettivo principale la raccolta di informazioni sulle
caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei ceppi di C.difficile circolanti in 14 diversi paesi europei. Nei 411 ceppi di C.difficile isolati da pazienti diarroici con sospetta CDAD (C.difficile associated disease), la prevalenza del ceppo epidemico è
risultata del 6.2%. Tutti i ceppi 027 erano positivi per le tossine A, B e binaria, avevano la delezione di 18 bp nel gene tcdC
ed erano resistenti ad eritromicina e moxifloxacina. I pazienti dai quali sono stati isolati ceppi O27 mostravano una patologia
più grave (OR=2.52, 95% CI 0.92-6.85, p=0.04) rispetto a quelli in cui erano stati isolati altri tossinotipi ed hanno necessitato
tutti di prolungati trattamenti con metronidazolo o vancomicina (OR=7.23, 0.99-149, p=0.02).
L’ European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) ha recentemente riunito un comitato di esperti sollecitando
l’organizzazione di una rete europea per la rapida individuazione di outbreak ospedalieri e per il monitoraggio del clone ipervirulento PCR ribotype 027.
PATOLOGIE DA POLIOMAVIRUS NEGLI IMMUNOCOMPROMESSI
Rossana Cavallo
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia, Università di Torino
I Poliomavirus umani convivono con l’ospite e co-evolvono con esso data la loro alta prevalenza, la bassa morbilità, la capacità di andare in latenza e la riattivazione asintomatica. Recentemente il virus BK ha assunto particolare interesse nella patogenesi della nefropatia post-trapianto che rappresenta una causa emergente di perdita del rene trapiantato e che colpisce dall’1
al 10% dei pazienti. La patogenesi di tale nefropatia è determinata dall’interazione di numerosi fattori di rischio: una intensa
terapia immunosoppressiva; episodi di rigetto trattati con boli di steriodi; l’età del paziente; la presenza di un danno renale preesistente; e da alcune determinanti virali quali variazioni di epitopi immunologicamente rilevanti della proteina capsidica VP1 e
alterazioni della sequenza non-codificante di controllo. La riattivazione dell’infezione da virus BK nei pazienti sottoposti a trapianto di rene si osserva nel 10-68% dei casi e da un punto di vista clinico-diagnostico è importante discriminare i livelli di carica virale che possono comportare l’evoluzione verso la nefropatia. La diagnosi virologica, viene effettuata tramite la dimostrazione del DNA virale mediante PCR quantitativa su siero, urine e biopsia renale e la ricerca dell’RNA messaggero che codifica
per la proteina VP1 su urine, che è indice di attiva replicazione virale. Il parametro più significativo per identificare i pazienti
a rischio di nefropatia è la BKV viremia, che presenta un valore predittivo negativo del 100% ed un valore predittivo positivo
del 60%: un numero di copie virali > 10.000/ml è associato ad una aumentata probabilità di biopsia positiva per nefropatia. Il
controllo dell’infezione da Poliomavirus viene attuato con la diminuzione e/o cambiamento della terapia immunosoppressiva o
con impiego di farmaci ad attività antivirale quali la leflunomide e il cidofovir; è quindi importante una diagnosi virologica
accurata per discriminare le infezioni auto-limitanti da quelle a rischio evolutivo verso la nefropatia. A questo fine gli indici di
replicazione virale più accurata sona la BKV DNA-Viremia e la ricerca dell’mRNA del VP1 su urine. Questi dati molecolari
quantitativi sono indicativi dell’evoluzione verso la nefropatia ed è quindi utile nel post-trapianto lo screening e il monitoraggio della replicazione del virus BK per una diagnosi preventiva.
14
ASPETTI CLINICI DELLE INFEZIONI DA STAFILOCOCCHI COAGULATI NEGATIVI
Roberto Cauda
Istituto di Clinica delle Malattie Infettive, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Gli stafilococchi coagulasi negativi (CNS), come gruppo, sono tra i germi più frequentemente isolati nella pratica clinica e sono
tra le cause più usuali di infezioni nosocomiali.
Poiché questi germi sono normalmente presenti su cute e mucose (sane) è importante distinguere l’infezione/malattia, dalla semplice contaminazione.
Un’importante caratteristica dei CNS è quella di formare biofilm e ciò ha un’importante impatto per quel che attiene patogenicità e capacità di determinare malattia.
Le forme morbose causate da CNS sono diverse da quelle causate da Staphylococcus aureus, ed in genere sono caratterizzate
da un decorso più subdolo e meno acuto.
E’ importante ricordare, tra le forme causate da S. epidermidis, specie in prematuri, soggetti immunocompromessi, con malattie tumorali o trapiantati, tossicodipendenti: le endocarditi e le infezioni associate all’uso di cateteri vascolari.
Per quanto attiene poi la strategia terapeutica essa deve tenere anche conto della recente segnalazione di ceppi di CNS resistenti ai glicopeptidi (vancomicina e teicoplanina) e dell’opportunità di rimuovere quelle condizioni (cateteri, protesi ecc.) che favoriscono il persistere dell’infezione stessa.
ATTIVITÀ METABOLICHE HEALTH-PROMOTING DEI PROBIOTICI
Patrizia Brigidi
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Bologna, Bologna
L’intestino umano rappresenta un bioreattore anaerobico programmato con un enorme popolazione batterica (>1014 cellule batteriche). Questo microbiota ed il suo complessivo genoma, microbioma, contiene un numero di geni almeno 100 volte maggiore rispetto a quello dei geni presenti nel genoma umano, e fornisce specifiche caratteristiche genetiche e metaboliche che non
sono state evolute dall’ospite. Studi metagenomici dell’ecosistema intestinale hanno consentito di valutare come tale microbiota contribuisca, mediante alcuni attributi funzionali specifici, allo stato di salute o di malattia dell’ospite.
Tra i simbionti intestinali umani, Bifidobacterium e Lactobacillus, sono ampiamente utilizzati come probiotici in prodotti alimentari e farmaceutici per le loro specifiche attività metaboliche, trofiche e protettive. E’ stato infatti dimostrato in numerosi
studi clinici e su animale che questi probiotici possono influire su parametri fisiologici e metabolici quali la risposta immunitaria, l’effetto barriera, la biosintesi di metaboliti che alterano le condizioni luminali, il binding e la degradazione di potenziali
carcinogenici, la modificazione enzimatica di acidi biliari e l’esclusione competitiva.
L’analisi genomica funzionale di Bifidobacterium e Lactobacillus ha evidenziato che il loro glicobioma contiene un elevato
numero di geni coinvolti nella metabolizzazione di numerosi polisaccaridi non digeribili dall’uomo, comuni componenti delle
fibre assunte con la dieta. La fermentazione di tali fonti carbonate e dei glicani derivati dal muco dell’ospite, produce SCFAs
(principalmente acetato, propionato e butirrato) e gas (H2 e CO2). Gli SCFAs, che rappresentano circa il 10% delle calorie derivate dalle dieta occidentale, sono adsorbiti dall’ospite e costituiscono la principale fonte energetica per la proliferazione ed il
differenziamento dei colonociti, fortificando così la barriera della mucosa intestinale. Sono stati inoltre evidenziati geni coinvolti nella biosintesi di amino acidi essenziali e vitamine e di enzimi deputati alla detossificazione di xenobiotici, con importanti conseguenze per la salute dell’ospite.
15
COMPOSTAGGIO DI RIFIUTI AGRO-INDUSTRIALI PER IL MIGLIORAMENTO DELLA FERTILITÀ DEI SUOLI
O. Pepe
Dip. di Scienza degli Alimenti, Sezione di Microbiologia- Università di Napoli Federico II, Portici (NA)
Introduzione
Il compostaggio è un processo di biossidazione microbica, la cui efficacia e velocità dipendono strettamente dalle attività metaboliche
combinate e sequenziali di differenti popolazioni microbiche che determinano la trasformazione di materiali organici eterogenei e
complessi in un prodotto più stabile, parzialmente umificato, ad attività fertilizzante e ammendante, detto comunemente “compost”.
Per controllare il processo è fondamentale la conoscenza della composizione e della funzione della microflora presente che determina
l’avvio e l’andamento del processo, condizionando la qualità del prodotto finito. Lo scopo della presente ricerca è stato quello di studiare l’evoluzione della microflora durante il compostaggio di sottoprodotti agro-alimentari e di selezionare ceppi di azotofissatori da
aggiungere al compost in fase di maturazione per ottenere un fertilizzante di qualità per l’agricoltura intensiva e biologica.
Materiali e metodi
Due microcumuli da piazzale, di circa 12 quintali ciascuno, erano caratterizzati microbiologicamente, quantificando la microflora aerobia totale, i funghi filamentosi, i lieviti, gli attinomiceti, gli enterobatteri e differenti gruppi fisiologici (proteolitici, ammonizzanti,
nitrosanti, nitricanti, denitrificanti, azotofissatori aerobi e anaerobi, cellulosolitici aerobi, pectinolitici e amilolitici). 15 ceppi di azotofissatori erano preliminarmente caratterizzati mediante ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), amplificazione del
gene nifH e identificati mediante sequenziamento del 16S r-DNA. Successivamente, era valutata la loro attività azotofissatrice in
microcumuli di compost maturo (1,6 kg) posti sotto costante agitazione in biofermentatori automatici, monitorando l’incremento di
azoto totale durante un periodo di 30 giorni.
Risultati
All’inizio del processo, entrambi i cumuli mostravano una carica batterica totale aerobia ed anaerobia pari a circa 106-107 UFCg-1 che
aumentava di circa 1-2 log nel prodotto finito. Durante la fase termofila si osservava una diminuizione del numero di funghi filamentosi che ricolonizzavano la massa portandosi a 105 UFC g-1 alla fine del processo di compostaggio. Gli attinomiceti subivano una diminuzione graduale durante tutto il processo di biossidazione. Le analisi effettuate mostravano la presenza di tutti i gruppi fisiologici
anche se i microrganismi del ciclo dell’azoto mostravano un trend negativo rispetto a quelli del ciclo del carbonio. La successiva applicazione tecnologica dei ceppi di azotofissatori evidenziava una marcata capacità azotofissatrice del ceppo Pseudomonas pseudoalcaligenes 67b che determinava un incremento del tenore di azoto pari a circa il 50%.
IL RUOLO DELLE POMPE DI EFFLUSSO NELLA FARMACO-RESISTENZA DI PLASMODIUM
FALCIPARUM
Donatella Taramelli
Dipartimento di Sanità Pubblica-Microbiologia-Virologia. Università di Milano, Milano
Every year, forty percent of the world population is at risk of contracting malaria. Hopes for the eradication of this disease during the 20th century were dashed by the ability of Plasmodium falciparum, its most deadly causative agent, to develop resistance to available drugs, in particular to folate inhibitors and quinolines derivatives such as chloroquine. Resistance is now spread
worldwide.
Whereas the resistance to folate inhibitors is clearly linked to multiple mutations of the target enzymes (DHFR and DHPS), the
mechanism of resistance to chloroquine, mefloquine and quinine is less clear. Research in this area has identified the P. falciparum chloroquine resistance transporter (PfCRT) and the multidrug resistance-1 (PfMDR1) transporter as key determinants of
decreased in vitro susceptibility to several principal antimalarial drugs. Transfection-based in vitro studies are consistent with
clinical findings of an association between mutations in the pfcrt gene, and between amplification of the pfmdr1 gene and failure of chloroquine or mefloquine treatment, respectively. Many countries are now switching to artemisinin-based combination
therapies, as suggested by WHO. These combination incorporate an artemisinin derivatives with a partner drug with long half
life, some of these companion drug (mefloquine, amodiaquine) have an in vitro efficacy that can be modulated by changes in
pfcrt or pfmdr1. Here, we will discuss on the recently identified P. falciparum transporters in the context of antimalarial mode
of action and mechanisms of resistance.
16
VIRUS E TUMORI
Giorgio Palu
Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Padova
La natura del cancro è quella di una malattia su base genetica ed ambientale; sono in gioco quindi fattori quali “ nature and nurture “. In questo scenario il corredo genetico di un individuo può essere predisposto alla trasformazione neoplastica per mutazioni sia ereditarie, sia acquisite o per alterazioni epigenetiche dei diversi set di geni coinvolti nel processo neoplastico: oncogeni, geni oncosoppressori, geni per il riparo del DNA.
L’ambiente, a sua volta, interagisce col genoma durante tutta la vita con insulti genotossoci che possono attivare o disattivare i
geni di cui sopra.
Una noxa ambientale importante sono gli agenti infettivi, più in particolare i virus.
I virus sono coinvolti nell’oncogenesi non solo come agenti di malattie genetiche acquisite (apporto di nuovi oncogeni), ma
anche come causa di infezione cronica tissutale. Questa è un importante stimolo per attivare de novo il genoma e sovvertire i
meccanismi di regolazione trascrizionale che presiedono all’omeostasi cellulare.
Circa il 20% dei tumori umani sono associati a virus, riconosciuti come agenti necessari anche se non sufficienti per permettere lo sviluppo tumorale.
Scopo di questa rassegna è di ricapitolare le basi patogenetiche del cancro in tumori di cui è riconosciuta l’eziologia virale: cancro della cervice e di altri distretti mucogenitali e HPV, epatoma e virus epatitici, leucemie, linfomi , epiteliomi e sarcomi associati a retrovirus ed herpesvirus.
Verrà inoltre discusso il ruolo del microbiologo-virologo nello studio degli eventi molecolari collegati all’infezione virale che
iniziano e promuovono il cancro e che risultano fondamentali per lo sviluppo di nuovi farmaci e vaccini, per la diagnosi, l’epidemiologia e la prevenzione delle infezioni virali collegate al cancro.
HBV, cccDNA E RESISTENZE
Carlo-Federico Perno, Fabbio Marcuccilli, Ada Bertoli, Marco Ciotti, Ilaria Lenci, Daniele Di Paolo, Mario Angelico
Universita’ di Roma Tor Vergata
Il cccDNA rappresenta una forma di persistenza del genoma del virus HBV nella cellula infettata, ed e’ l’elemento piu’ temibile per la terapia antivirale, visto che la sensibilita’ del cccDNA al trattamento antivirale e’ pressoche’ nulla. In queste circostanze il cccDNA e’ destinato a rimanere pressoche’ perenne nelle cellule epatiche, e a rappresentare una potenziale sorgente di replicazione virale anche a distanza di anni dall’infezione, a meno che la cellula infettata muoia (o venga eliminata dal sistema immunitario). In questo senso, il cccDNA e’ il fattore che, piu’ di altri, va considerato nella valutazione della presenza o meno del
virus in soggetti che, venuti a contatto con HBV, non si sa se sia rimasto oppure sia stato eliminato. Tale problema e’ particolarmente cogente in pazienti trapiantati di fegato per patologie collegate ad HBV. Mentre la recrudescenza dell’infezione da
HCV dopo trapianto e’ pressoche’ certa, nel caso di HBV, grazie ai sistemi profilattici oggi in uso (lamivudina, immunoglobuline iperimmuni) essa e’ ridotta al 10% dei trapiantati. La profilassi anti-reinfezioe va oggi continuata per tutta la vita, non essendoci elementi certi che permettano di discriminare i pazienti che, dopo il trapianto, hanno eliminato il virus, e quelli che invece
lo mantengono sotto forma di cccDNA latente nelle cellule epatiche, pronto a ricominciare il proprio ciclo replicativo non appena interrotta la profilassi.
Urgono pertanto strumenti diagnostici in grado di discriminare questi pazienti a rischio dagli altri che, essendo guariti, possono
interrompere le profilassi.
Un aiuto in questo campo deriva dalla real time PCR. Nel nostro laboratorio e’ stato messo a punto un sistema rapido ed efficace di riconoscimento del cccDNA nelle cellule epatiche, prelevate in corso di biopsia svolta nella routine clinica post-trapianto. La descrizione completa della metodologia, e i risultati ottenuti, saranno discussi nella relazione.
17
EVOLUZIONE DEL RAPPORTO PATOGENI-ARTROPODI VETTORI
Domenico Otranto
Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali, Facoltà di Medicina Veterinaria, Università degli Studi di Bari.
Il Phylum Artropoda comprende il maggior numero di specie tra i Metazoi. Solo gli Insetti contano oltre 1 milione di specie di
cui circa 14.000 (appartenenti a 400 generi) hanno sviluppato la capacità di alimentarsi di sangue su un ospite vertebrato. Gli
artropodi –parassiti (Insecta e Aracnida) non solo possono causare lesioni dirette agli uomini e agli animali a seguito della loro
puntura (tramite immissione di saliva contenente sostanze immunogene, allergizzanti o neurotossine) ma possono essere efficienti vettori di un vasto numero di malattie (arthropod borne diseases –ABDs) ad eziologia batterica, virale, protozoaria ed
elmintica. Le ABDs sono responsabili di circa il 17% del numero totale di casi di malattie infettive nell’uomo in tutto il mondo
e l’incidenza di alcune di esse (e.g. malaria, leishmaniosi e dengue) è destinata ad aumentare soprattutto come effetto delle modificazioni ecologiche, dell’introduzione di nuovi vettori in zone indenni e dei cambiamenti climatici. In questo preoccupante quadro di insieme, gli animali domestici svolgono un ruolo rilevante in quanto reservoires di agenti potenzialmente patogeni anche
per l’uomo e una fonte di infezione attraverso le punture degli artropodi competenti (meta-zoonosi). Le relazioni tra artropode
vettore ed agente patogeno costituiscono uno degli aspetti più interessanti per conoscere la diffusione delle ABD, i rischi correlati alla loro presenza in diversi ambienti e per pianificare strategie per il loro controllo. Gli artropodi vettori non possono essere considerati alla stregua di “aghi di siringa” (vettori passivi di patogeni) ma hanno evoluto nel corso della loro storia biologica una serie di meccanismi comportamentali, biochimici ed ecologici che li rende degli organismi perfetti nel trasmettere patogeni. In questo contesto l’abilità di una particolare specie di ectoparassita di agire come vettore dipende dal fatto che il patogeno sia in grado di sopravvivere e di superare le numerose barriere che incontra sia nell’ospite invertebrato sia in quello vertebrato. Le relazioni tra artropode vettore -animale recettivo ed agente patogeno sono alla base di complesse interazioni che permettono il mantenimento delle ABD e che, nel contempo, costituiscono la base biochimica per la preparazione di nuove strategie di controllo. In questo contesto sono in corso studi per la preparazione di vaccini che abbiano come target antigeni strutturali delle ghiandole salivari o delle membrane peritrofiche deputate all’assorbimento delle sostanze nutritive dell’artropode.
ANTIBIOTICO RESISTENZA E CARATTERISTICHE DI VIRULENZA IN CEPPI DI S. PYOGENES
ISOLATI DA MALATTIA INVASIVA E DA PORTATORE
G.Orefici *, L.Baldassarri*, M.Imperi*, M.Pataracchia*, S.Recchia* , F.Cardona**, R. Creti
*Istituto Superiore di Sanità, Roma.** Istituto di Neuropsichiatria Infantile- Università La Sapienza, Roma
In Italia sono state condotte due sorveglianze sulla malattia invasiva da S.pyogenes: la prima fra il 1994 e il 1996 sulla base di
una richiesta del Ministero della Salute , la seconda nell’ambito di un progetto Europeo negli anni 2003-2005. Una serie di caratteristiche importanti per la virulenza (tipo M, geni per la resistenza ai macrolidi, per alcune tossine eritrogeniche e per le
Fibronectin Binding Proteins (FBP), formazione di biofilm) dei ceppi isolati (80 nella prima sorveglianza e 90 nella seconda)
sono state studiate paragonandole alle caratteristiche di ceppi isolati nello stesso periodo da portatori (79 per la prima sorveglianza e 100 per la seconda).
Alcuni tipi M come M1 e M3, hanno avuto un ruolo di rilievo sia nella prima che nella seconda sorveglianza e sono stati responsabili da soli del 16% di tutte le morti, mentre altri (come M 89 che era stato il più frequentemente isolato nella prima indagine), sono quasi spariti nella seconda, non ostante abbiano continuato ad essere isolati nei portatori.
La resistenza ai macrolidi, sostanzialmente costante nei portatori (circa il 40%), si è modificata nel tempo per i ceppi da malattia invasiva con una diminuzione delle resistenze totali (dal 30% a circa il 20%) ,con una sostanziale riduzione dei ceppi che
portavano il gene erm B ed un aumento significativo dei ceppi che portavano mef A. Un comportamento differente nei due gruppi è stato visto anche per la presenza dei geni per speA e speC , praticamente costanti nel tempo nei portatori per entrambe ma
con un aumento sensibile sia per speA (25-39%) che per spe C (30-47%) nei ceppi da malattia invasiva.
La distribuzione dei geni per le FBP : prtF1, prtF2, fba non era diversa nei ceppi da malattia invasiva o da portatore; considerando invece la capacità di invadere le cellule l’efficienza era maggiore nei ceppi da portatore. I ceppi erm+ erano sempre
prtF1 e prtF2 positivi.
289 ceppi da malattia invasiva, portatore e faringite sono stati esaminati per la formazione di biofilm. Di questi 162 erano eritromicina resistenti, 127 erano sensibili. I ceppi sensibili erano significativamente migliori nella formazione di biofilm. I ceppi
prtF1 positivi ed erm+ formavano significativamente meno biofilm , inoltre i ceppi con migliori capacità di invadere le cellule
formavano meno biofilm indipendentemente dal sito di isolamento.
Questi risultati fanno pensare che la circolazione dei ceppi di GAS sia clonale poiché indipendentemente dal sito di isolamento
e dal tipo di paziente lo stesso ceppo (in cui il tipo emm sembra costituire il comune denominatore) ha mantenuto negli anni la
stessa stringa di fattori di virulenza e antibiotico resistenza .
18
ESPRESSIONE ED ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE DI GENI mef IN STREPTOCOCCUS
PYOGENES
Vitali Luca Agostino
Dipartimento di Biologia Molecolare, Cellulare e Animale, UNICAM, Camerino
La presenza di un meccanismo di efflusso dei macrolidi negli streptococchi è stato descritto fin dal 1996. Questo sistema conferisce al batterio un fenotipo di resistenza caratterizzato da MIC comprese tra 1-32 mg/L nei confronti dei soli macrolidi a 14
e 15 atomi, ma non nei confronti di quelli a 16 atomi, delle lincosammidi e delle streptogramine di gruppo B (o di loro analoghi). Questo fenotipo è stato denominato resistenza di tipo M, per sottolinearne la differenza con l’altro diffuso meccanismo di
resistenza MLSB che conferisce un elevato livello di resistenza (MIC>128mg/mL) a tutto il gruppo dei macrolidi, delle lincosammidi e delle streptogramine B. In Streptococcus pyogenes, il gene responsabile di questo meccanismo è il mef. Nel corso
degli anni sono state descritte diverse varianti di questo gene, indicate come mef(A), mef(E) e mef(I). In ogni caso la proteina
Mef è altamente idrofobica e presenta 12 segmenti transmembrana. Diversi sono gli elementi genetici mobili e i loci nei quali
il gene può essere inserito. Tuttavia, l’unico provato meccanismo di trasferimento genetico orizzontale implicato nella diffusione del mef sembrerebbe essere la coniugazione. Essa sarebbe, quindi, responsabile della notevole diffusione di questo sistema
di efflusso sia a livello intra-specifico che inter-specifico, nei diversi paesi del mondo.
Nel caso dello S. pyogenes mancano studi specifici di espressione del gene mef, anche se è stato riportato che per il corretto e
completo funzionamento del sistema di efflusso sarebbe necessaria la presenza di un gene associato, denominato mel o msr o
mat.
Infine, in altri streptococchi, è stato osservato che ceppi con varianti del mef mostrano valori di MIC significativamente differenti. Questa osservazione è interessante e indicherebbe un’evoluzione della famiglia mef e del meccanismo di resistenza sotteso.
Alla luce di questi fenomeni è utile continuare studi di sorveglianza di questo fenotipo di resistenza, della diffusione e diversificazione dei geni implicati e dei meccanismi di efflusso espressi.
VACCINI ANTIVIRALI DI “NUOVA GENERAZIONE
Roberto Manservigi
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Università di Ferrara
La vaccinazione è il più efficace intervento medico nei riguardi delle malattie di origine virale.
I vaccini virali prevengono o modificano la severità della malattia e interrompono o riducono la possibilità di trasmissione del
patogeno ad altre persone recettive. A questo riguardo, vaccini contro la poliomielite, il morbillo, la varicella e l’epatite B
hanno avuto un enorme impatto sulla salute pubblica negli ultimi 50 anni. I progressi ottenuto nella virologia di base e la comprensione dei meccanismi immunitari nell’uomo fanno prevedere ulteriori progressi nel controllo delle malattie virali infettive all’inizio del 21esimo secolo. Nuovi target virali, che comprendono il virus dell’immunodeficienza acquisita, il virus respiratorio sinciziale, il virus dell’epatite C, il virus dell’herpes simplex e il citomegalovirus, rappresentano sfide che richiedono
una sempre più approfondita ricerca di base. Di alcuni vaccini virali è stata recentemente dimostrata la reale possibilità di un
passaggio dalla ricerca di base all’utilizzo clinico, per il controllo della malattia nella popolazione sana ed a rischio. Questi
ultimi comprendono vaccini vivi attenuati contro virus a RNA, come i rotavirus e i virus dell’influenza A e B e vaccini a subunità contro i papillomavirus umani. A tutt’oggi, le tecniche di ingegneria genetica ed una maggiore conoscenza dei meccanismi che sono alla base della immuno-protezione hanno permesso la generazione di mutanti e ricombinanti virali, l’espressione di proteine vaccinali in vettori virali o plasmidici, la purificazione e la sintesi di antigeni virali e l’induzione di una varietà di risposte immuni mediante la manipolazione del DNA, RNA e proteine. La ricerca e la sperimentazione clinica di nuovi
vaccini permetterà di allargare la sfera della popolazione in grado di poter essere vaccinata, ed inoltre richiederà lo sviluppo
di nuove vie di somministrazione in alternativa all’iniezione. Tutto questo comporterà nuovi problemi nella produzione, regolamentazione e distribuzione del vaccino.
19
ASPETTI FARMACODINAMICI E FARMACOCINETICI DI NUOVI ANTIBIOTICI
Teresita Mazzei
Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica Università degli Studi di Firenze
Il criterio più importante per una scelta razionale di un chemioterapico antimicrobico si basa sulle caratteristiche farmacodinamiche, e cioè dello spettro di attività antimicrobica, del tipo di batteriocidia e della potenza antibatterica. L’efficacia clinica e
batteriologica di antibiotici tempo-dipendenti quali le beta-lattamine e l’eritromicina ha dimostrato significative correlazioni con
elevati valori del T > MIC: almeno al 40 – 50 % dell’intervallo fra le dosi per garantire elevate percentuali di guarigioni, sia nei
modelli animali di infezione che in caso di otite media acuta, sinusite e osteomielite nell’uomo. I fluorochinoloni e gli aminoglucosidi, che producono una batteriocidia concentrazione-dipendente, devono raggiungere un rapporto Cmax/MIC del valore
intorno a 10-12 per ottenere la massima efficacia, oppure una AUC24/MIC ≥ 125 per migliorare la guarigione nelle gravi infe-
zioni ospedaliere.
Fra le nuove molecole antimicrobiche interessanti per un impiego clinico nelle infezioni gravi emerge indubbiamente un antibiotico appartenente alla classe delle glicilglicine, la tigeciclina.
La tigeciclina possiede in C9 un gruppo tert–butil-glicilamido che conferisce alla molecola interessanti correlazioni struttura
attività quali: una maggior potenza antimicrobica rispetto alle tetracicline, la possibilità di un superamento delle resistenze di
classe, (sia alterato bersaglio che pompe di efflusso), miglioramenti farmacocinetici (lunga emivita ed aumento del volume di
distribuzione).
Dal punto di vista farmacodinamico tigeciclina possiede una attività battericida tempo dipendente, sia un T > MIC di circa il
50% che una elevata AUC/MIC correlano con l’efficacia. Tigeciclina possiede inoltre un effetto post-antibiotico nei confronti
di vari microrganismi variabile dalle 4 alle 9 ore e dimostrato, anche se di minor durata, persino nei confronti di E. coli resistente per pompe di efflusso.
Tigeciclina è disponibile solo in forma iniettabile, mentre sia doxiciclina che minociclina sono disponibili anche in formulazione orale. Tigeciclina presenta un volume di distribuzione superiore a quello delle altre molecole (> 10 l/kg), un legame farmacoproteico del 68% ed una lunga emivita di eliminazione plasmatici (36 ore). La posologia consigliata è di 100 mg e.v. seguita
da 50 mg ogni 12 ore.
Tigeciclina presenta una cinetica plasmatica lineare sia dopo dose singola che dopo dose ripetuta.
RAPPORTO OSPITE / MICRORGANISMO: RISPOSTA IMMUNITARIA NELLE INFEZIONI BATTERICHE
Mario Campa
Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia, Università degli Studi di Pisa
I sistemi di difesa dell’ospite nei confronti di un agente patogeno si articolano in meccanismi immunitari innati/naturali e immunitari acquisiti, che vengono attivati in sequenza nel corso dell’infezione. I primi rappresentano le prime linee di difesa sulle
quali l’ospite può contare già dalle primissime fasi dell’infezione, mentre i secondi entrano in gioco soltanto dopo alcuni giorni.
Sebbene, in alcuni casi, i fattori dell’immunità innata possano essere efficaci nel controllare l’infezione, in molti altri casi una
completa eradicazione dell’agente infettivo è possibile soltanto grazie alla risposta immunitaria specifica. Nel corso di un
comune processo evolutivo, così come l’ospite ha sviluppato potenti sistemi di difesa deputati essenzialmente a controllare e,
possibilmente, uccidere ed eliminare dai tessuti l’agente invasore, così il parassita ha messo a punto complesse e sofisticate
strategie in grado di eludere sia la risposta immunitaria innata, sia quella acquisita dell’ospite, con il risultato di determinare
infezione (acuta/cronica) e malattia. Molto interessanti appaiono i meccanismi che consentono di evadere la risposta immunitaria specifica dell’ospite, in particolare quelli elaborati da alcuni batteri intracellulari.
In questi ultimi anni, è apparsa sempre più evidente l’integrazione tra la risposta filogeneticamente più ancestrale, la risposta
immunitaria innata, e la risposta immunitaria acquisita. Oggi si sa, infatti, che alcune cellule dell’immunità naturale sono coinvolte nel controllo di molti aspetti della resistenza acquisita dell’ospite, quali il riconoscimento di determinanti microbici nonself che assicura, così, la discriminazione self/non-self, la produzione di molecole ad attività antimicrobica, nonché l’induzione
della risposta immunitaria specifica attraverso la maturazione delle cellule dendritiche e la differenziazione dei linfociti T. Va
sottolineato, d’altra parte, che molte delle funzioni effettrici della risposta immunitaria specifica sono mediate, a loro volta, da
elementi dell’immunità innata.
Appare chiaro, pertanto, che un agente patogeno di successo debba essere anzitutto capace di interferire con i fattori dell’immunità innata. In questo contesto, risultano particolarmente importanti gli attuali studi volti a comprendere come alcuni batteri
patogeni riescano a modulare tale risposta e ad influenzare, quindi, anche la risposta immunitaria specifica.
20
NUOVE PROSPETTIVE PER LO STUDIO DI TRICHOMONAS VAGINALIS E DELLA TRICOMONIASI, ALLA LUCE DEI RISULTATI DEL SEQUENZIAMENTO DEL GENOMA DEL PROTOZOO
Pier Luigi Fiori1, Daniele Dessì1, Paola Rappelli1, Nicia Diaz1, Federica Riu1, Antonella Mura1, Jane M. Carlton2 and
“T.vaginalis Genome Project 2007”.
1Dip. Scienze Biomediche, Università di Sassari
2Institute for Genomic Research, Rockville, MD, and New York University, USA
Trichomonas vaginalis è un protozoo flagellato responsabile della malattia a trasmissione sessuale di origine non virale più diffusa nel mondo. L’infezione è strettamente correlata con complicanze in corso di gravidanza (parto pre-termine, rottura precoce delle membrane), con un forte aumento del rischio di trasmissione del virus HIV e con l’insorgenza di neoplasie dell’apparato genitale femminile.
Grazie al lavoro di un consorzio di ricerca internazionale, il genoma diT.vaginalis è stato recentemente completamento sequenziato. I risultati ottenuti hanno rivelato una inaspettata ed estrema complessità organizzativa e strutturale: il genoma è infatti
composto da circa 160 megabasi, a dimostrazione di una massiva amplificazione del materiale genetico. Tale espansione, legata principalmente ad un elevato numero di elementi transponibili e duplicazioni geniche, si riflette sull’enorme numero di geni
(circa 60.000) che rendono il protozoo l’organismo con il maggiore numero di geni, ben superiore a quello del suo ospite umano.
Tra le famiglie geniche amplificate, spiccano le kinasi (927 membri), le proteine di superficie BspA-like (658 membri) e le
small GTPasi (328 membri). E stata dimostrata l’acquisizione di 152 geni mediante meccanismi trasferimento laterale da
eubatteri ed archea, nonché la presenza di numerose sequenze altamente ripetute di origine virale (derivate da poxvirus e da
batteriofagi). La presenza e l’espressione di geni Dicer-like, di due geni Argonaute e di 41 DEAD-DEAH-box elicasi, suggerisce una via attiva per l’RNA interference. E’ stata identificata una famiglia di geni codificanti per saposin-like proteins
(TvSaplip), che sono considerate i principali effettori di patogenicità e sono i candidati a rivestire il ruolo di proteine formanti poro (trichopores).
Il gran numero di risultati emersi dall’analisi del genoma descrive il quadro di un organismo complesso che ha saputo adattarsi al passaggio da una nicchia ecologica ad un’altra (dall’intestino all’apparato genitale) espandendo il suo genoma ed acquisendo geni da altri microorganismi. In generale, la caratterizzazione di vie metaboloche fino ad oggi sconosciute e la caratterizzazione dei meccanismi di patogenicità, pongono le basi per lo sviluppo di terapie mirate e di sistemi diagnostici finalmente efficienti.
POMPE DI EFFLUSSO NELLE RESISTENZE DEI MICETI
M. Sanguinetti
Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Nelle ultime decadi, i funghi patogeni sono diventati importanti cause di infezione per un crescente numero di pazienti immunocompromessi. La resistenza intrinseca osservata in alcuni generi insieme con lo sviluppo di resistenza durante il trattamento
in altri, costituisce un serio ostacolo per il successo della terapia antimicotica. Tra i meccanismi molecolari attraverso cui i funghi acquisiscono farmaco-resistenza, la superespressione delle pompe di efflusso che facilitano l’estrusione dei farmaci citotossici dalla cellula è responsabile del diminuito accumulo del farmaco e della sua diminuita concentrazione intracellulare. Dalle
iniziali osservazioni che l’azolo-resistenza nei funghi può essere causata dalla ‘upregulation’ di geni che codificano per trasportatori di efflusso multifarmaco, notevoli progressi sono stati raggiunti principalmente con Saccharomyces cerevisiae e
Candida albicans e attualmente con Candida glabrata e Cryptococcus neoformans. Sarà quindi discusso il ruolo che tali trasportatori proteici di membrana svolgono nella resistenza ai farmaci in varie specie di funghi patogeni, come anche la loro
importanza come bersagli selettivi di farmaci per il disegno di nuovi agenti antifungini, e , infine, come potenziali fattori di virulenza.
21
LE INFEZIONI DEL SEGMENTO ANTERIORE DELL’OCCHIO
Giovanni Russo1 – Andrea Russo2
1Dipartimento Scienze Microbiologiche; 2Dipartimento di Specialità Medico-Chirurgiche, Sezione di Oftalmologia - Azienda
Policlinico “G. Rodolico” Università di Catania
Oltre il 70% di tutte le infezioni dell’occhio riguardano il segmento anteriore e le strutture perioculari.
Nell’occhio non esiste un vero e proprio ecosistema microbico, per cui i microrganismi in esso presenti devono essere considerati transitori. Tuttavia, gran parte di essi sono in grado di causare malattia. La flora congiuntivale normale può essere influenzata, sia dal punto di vista qualitativo che da quello quantitativo, da fattori endogeni (lagrime, movimenti palpebrali, isozima,
IgA, ecc.) e da fattori esogeni (inquinamento, calore, radiazioni, farmaci). La congiuntivite può essere causata, con frequenze
diverse, da diversi batteri, quali streptococchi, stafilococchi, Neisseriae, Moraxella, Haemophilus, Chlamydiae, virus, quali adenovirus, herpes, varicella-zoster, ecc. Anche funghi e parassiti possono essere causa di congiuntiviti. Le principali vie di infezione sono la via aerea, i contatti mani-occhio, la diffusione dagli annessi.
La cheratite microbica è un’infezione oculare comune, localmente pericolosa, che può essere provocata da batteri
(Pseudomonas, Serratia, Haemophilus, staflilococchi, ecc.), funghi (Candida, Aspergillus, ecc.), virus (herpes, varicella-zoster,
adenovirus, ecc.) o parassiti (particolare rilievo assume in atto Acanthamoeba). Le cheratiti possono essere causate anche da un
uso improprio delle lenti a contatto o dei loro liquidi di conservazione. Infatti, le superfici delle lenti possono costituire un substrato idoneo alla formazione di biofilm microbici.
Sono inoltre descritte le principali infezioni degli annessi oculari e i rischi di complicanze gravi, soprattutto a seguito di interventi chirurgici o di traumi, quali l’endoftalmite.
RAPPORTO OSPITE/MICRORGANISMO: RISPOSTA IMMUNITARIA NEI PAZIENTI ONCOLOGICI
G. Rasi
Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare – CNR, Roma
Il processo neoplastico può essere promosso o esacerbato da infiammazioni ed infezioni. Dati recenti hanno stabilito che l’infiammazione è una componente critica per la progressione del tumore. Molti tumori originano da siti di infezione o di infiammazione cronica. È ora chiaro che il microambiente, largamente condizionato dalle cellule infiammatorie, è una componente
essenziale del processo neoplastico, regolandone la proliferazione, la sopravvivenza e la migrazione delle cellule. Gli attuali
progressi della medicina molecolare hanno chiaramente documentato il legame tra infezioni, immunità innata, infiammazione e
cancro.
Tuttavia la comprensione dei meccanismi è ancora largamente incompleta e l’ampliamento delle conoscenze talvolta, infittendo la rete dei legami tra le cellule e gli eventi molecolari, complica anziché favorire l’interpretazione del già complesso network del cross-talk cellulare.
Saranno esaminate le principali pathways di attivazione descritte nella trasformazione e nella crescita neoplastica in relazione
al possibile ruolo di microrganismi. In particolare sarà esaminato il rapporto tra ospite e parassita in alcuni situazioni paradigmatiche, quali il carcinoma della cervice e l’HPV ed il carcinoma epatocellulare ed i virus epatitici.
Ulteriore area di crescente interesse è costituita dallo studio dei retrovirus endogeni (HERVs). Il loro possibile ruolo nel melanoma e nelle linfopatie può aprire nuove opportunità terapeutiche.
La risposta immunitaria è naturalmente condizionata anche in senso inverso, la crescita neoplastica condiziona e favorisce lo
sviluppo di microrganismi. Lo studio delle specifiche alterazioni della risposta immune in corso di crescita neoplastica è condizione indispensabile per la gestione della strategia terapeutica, considerata la frequente presenza in questa situazione di microrganismi resistenti alle comuni terapie.
22
AGENTI VIRALI DI ENTERITE: ASPETTI BIOLOGICI, DIAGNOSI DI LABORATORIO ED EPIDEMIOLOGIA
Chezzi C., Medici M.C., Arcangeletti M. C.
L’enterite rappresenta una delle patologie più comuni in età pediatrica in tutto il mondo: nei paesi in via di sviluppo costituisce
la terza causa di morte, stimata in due-tre milioni ogni anno, pari al 17% di tutti i decessi nei bambini di età inferiore ai 5 anni;
nei paesi sviluppati risulta essere la seconda causa di ricoveri ospedalieri e di visite mediche. L’eziologia delle enteriti riconosce agenti di natura diversa: batteri, parassiti e virus con incidenze variabili a seconda dello sviluppo socio-economico dei vari
paesi. Il riconoscimento definitivo di un ruolo eziologico di agenti virali nelle enteriti dell’uomo è acquisizione relativamente
recente, nonostante numerose osservazioni deponessero da tempo in tal senso. Grazie a diverse applicazioni metodologiche
(elettromicroscopia, immunoelettromicroscopia, elettroforesi di acidi nucleici, amplificazione e sequenziamento genici) e a precisi riscontri clinici, oggi un discreto gruppo di agenti virali è noto tra le possibili cause di enterite: rotavirus, norovirus, adenovirus, astrovirus e coronavirus, per citare i più frequenti. La maggior parte di questi virus, a dispetto della loro spiccata capacità replicativa in vivo, risulta scarsamente o per nulla coltivabile in vitro; questo spiega il ritardo con cui i virus causa di enterite sono stati identificati e studiati nei loro aspetti biologici ed epidemiologici. Nel corso degli ultimi anni, anche utilizzando
le informazioni derivanti dalle ricerche nei riguardi dei corrispondenti agenti virali coinvolti in enteriti negli animali, ma soprattutto impiegando sofisticati metodi diagnostici di laboratorio e di studio, le conoscenze al riguardo sono aumentate in maniera
significativa. Così, per i principali virus implicati nelle enteriti sono sufficientemente noti i caratteri morfo-strutturali, il genoma, le caratteristiche antigeniche, le sorgenti di infezione, le modalità di trasmissione, la storia naturale e la patogenesi dell’infezione e della conseguente malattia. Nel caso dei rotavirus i dati ottenuti hanno anche consentito di realizzare vaccini e di prevedere idonee campagne di immunizzazione. Dopo una breve presentazione delle caratteristiche biologiche dei principali virus
causa di enterite vengono esposti i risultati dell’attività diagnostica di laboratorio svolta dagli autori nel corso degli ultimi 20
anni in parallelo con l’evoluzione delle metodologie disponibili, alcuni aspetti epidemiologici riguardanti l’infezione da rotavirus nei bambini ospedalizzati per enterite, i genotipi di rotavirus circolanti in epoca prevaccinale, due casi fatali di enterite da
rotavirus, i genotipi di norovirus in casi sporadici e in un episodio epidemico nosocomiale in età pediatrica e le caratteristiche
di un focolaio di gastroenterite da norovirus in una casa protetta per anziani.
DIAGNOSTICA DEGLI STAFILOCOCCHI COAGULASI-NEGATIVI
Giovanni Fadda
Istituto Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Nelle ultime decadi gli stafilococchi coagulasi-negativi, normali commensali umani, sono stati riconosciuti quali importanti
patogeni potenziali, responsabili di infezioni associate a protesi ortopediche, cateteri vascolari e liquorali, e valvole cardiache.
Oltre a Staphylococcus epidermidis, la specie più frequentemente isolata, numerose altre specie sono state associate con infezioni umane. Una rapida e affidabile identificazione di specie è essenziale per una accurata diagnosi e il pronto trattamento delle
infezioni da essi causate, e per la sorveglianza epidemiologica. Il metodo di riferimento di Kloos e Schleifer è indaginoso e grava
sulla diagnostica routinaria microbiologica; inoltre possono essere necessari fino a cinque giorni per ottenere i risultati. Il potere discriminatorio dei metodi fenotipici automatici, comunemente utilizzati nei laboratori, è insufficiente per l’accurata identificazione di tutte le specie e sottospecie. Al fine di superare i limiti dell’approccio fenotipico, negli ultimi anni sono stati sviluppati numerosi metodi molecolari che hanno differenti target quali l’ rRNA 16S, il gene sodA, il gene gap, il gene rpoB, ed il
gene tuf.
23
LA RISPOSTA INNATA ALLE INFEZIONI VIRALI: RUOLO DEL FATTORE NUCLEARE KAPPA-B
Antonio Mastino1, Maria Teresa Sciortino1, Maria Antonietta Medici1, Francesca Marino-Merlo1, Daniela Zaccaria1, Maria
Giuffrè-Cuculletto1, Assunta Venuti1, Sandro Grelli2, Claudia Matteucci2,4, Emanuela Balestrieri2, Antonella Minutolo2,
Beatrice Macchi3.
1Dipartimento di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari, Università di Messina, Messina; 2Dipartimento di
Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, e 3Dipartimento di Neuroscienze, Università di Roma “Tor Vergata”, Roma;
4Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Roma.
Gli studi degli ultimi anni hanno reso sempre più evidente come il parassitismo intracellulare obbligato dei virus ha determinato, nel corso dell’evoluzione, la selezione da una parte di una rete di complessi meccanismi difensivi dell’ospite e, dall’altra, di
altrettanti complessi sistemi virali di inibizione di tali meccanismi. Tra le nuove acquisizioni in tema di risposta innata alle
infezioni virali, oltre alla recente definizione della RNA interference (RNAi) quale meccanismo di difesa innata antivirale da
aggiungersi a quelli già noti rappresentati dal sistema interferone e dall’apoptosi, di particolare interesse è l’identificazione di
alcuni dei meccanismi molecolari attraverso cui la cellula riconosce la presenza dei virus ed innesca le vie di segnale che determinano gli eventi finali di risposta. Tali meccanismi molecolari comprendono alcuni Pattern Recognition Receptors (PRR), tra
cui i Toll-like receptors (TLR) TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 e TLR9 e le RNA helicases RIG-I e MDA5, responsabili dell’innesco del segnale di riconoscimento, molecole coinvolte a valle dei PRR nella trasduzione del segnale intracellulare
(MyD88, Ma1, TRIF, TRAM, SARM, TRAF3, TRAF6, IRAK-1) e fattori di trascrizione specifici. tra cui le famiglie degli
Interferon Regulatory Factors (IRF) e dei Nuclear Factors Kappa-B (NF-kB), che hanno il compito di regolare gli eventi di
trascrizione genica delle proteine che svolgono le funzioni effettrici della risposta innata. Dopo aver focalizzato l’attenzione su
quanto noto sul ruolo di NF-kB nei meccanismi di difesa innata alle infezioni virali, verranno presentati alcuni dati sperimentali originali riguardanti NF-kB ed i virus HSV-1 e HTLV-1.
LE ECHINOCANDINE: UNA CLASSE INNOVATIVA DI FARMACI ANTIFUNGINI
Oliveri S.
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche - U.O. Laboratorio Analisi, A.O.U. Policlinico”G. Rodolico”
Catania - Università di Catania
Le echinocandine sono una classe di antifungini il cui primo composto di base è stato isolato nel 1974 da una coltura di
Aspergillus. La caspofungina è stata introdotta per prima nella pratica clinica seguita dalla micafungina e dalla anidulafungina.
L’innovazione riguarda indubbiamente il loro meccanismo di azione in quanto esse hanno come target il complesso enzimatico
preposto alla sintesi dei ß-(1,3)-D-glucani, e comunemente riportato come ß-(1,3)-D-glucano sintetasi. In particolare agiscono
come inibitori non competitivi legandosi alla subunità Fks1p dell’enzima. Il blocco della sintesi dei ß-(1,3)-D-glucani causa la
perdita dell’integrità della parete e determina, in alcuni funghi, lisi della cellula come conseguente diminuzione alla pressione
osmotica intracellulare. Caspofungina, micafungina e anidulafungina mostrano infatti attività fungicida in vitro e in vivo verso
Candida spp.. Nei confronti di Aspergillus spp. sembra che in vivo la loro azione sia prevalentemente fungistatica, anche se in
vitro su A. fumigatus è stata osservata un’azione selettiva fungicida sulle cellule apicali delle ife, essenziali per lo sviluppo del
micelio.
La caspofungina ha un certo effetto sull’alterazione e la formazione del biofilm di Candida.
I valori estremamente bassi delle MIC90 osservate sulla maggior parte dei ceppi responsabili di candidosi invasive supportano
l’efficacia in vivo di questi antifungini concentrazione-dipendenti. Diversamente che da Candida, per Aspergillus viene suggerita la determinazione della minima concentrazione efficace (MEC) che come criterio di end-point utilizza l’alterazione della
morfologia delle ife rilevata microscopicamente. I valori di MEC sembrano correlare molto meglio con l’attività in vivo rispetto ai valori di MIC. Anche per Aspergillus spp. sono stati riportati valori di MEC90 molto bassi ad eccezione di A. flavus per la
anidulafungina.
Le echinocandine sarebbero anche potenzialmente attive verso altre specie di funghi filamentosi ed alcuni funghi dimorfi. Non
mostrano attività verso Cryptococcus neoformans, Trichosporon e Fusarium spp. e verso gli Zigomiceti. Dato il loro meccanismo di azione verosimilmente non danno luogo a cross-resistenza con le altre classi di antifungini e non presentano tossicità per
l’uomo. È stata evidenziata una scarsa correlazione tra esito della terapia e riscontro di elevati valori di MIC in vitro. Tuttavia
mutazioni nel gene FKS1 danno luogo sia all’aumento delle MIC sia all’insuccesso terapeutico.
24
ENTEROCOCCHI NELLE INFEZIONI GRAVI: RUOLO DI RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI E
VIRULENZA
Annalisa Pantosti
Istituto Superiore di Sanità, Roma
Gli enterococchi sono stati considerati per anni innocui commensali del tratto gastro-intestinale dell’uomo e degli animali nonchè utili “starter” per la produzione di formaggi e di altri alimenti fermentati. Il loro ruolo come agenti di infezioni nosocomiali
è emerso nelle ultime decadi e la comparsa alla fine degli anni 80’ di ceppi resistenti alla vancomicina (VRE) ha provocato
preoccupazione e rinnovata attenzione verso questi microrganismi. Negli Stati Uniti negli anni 90’ c’è stato un rapido aumento delle infezioni da VRE, che attualmente sono al terzo posto tra le infezioni nei reparti di terapia intensiva. La maggior parte
di queste infezioni sono sostenute da Enterococcus faecium. In Europa, l’epidemiologia dei VRE ha avuto un’evoluzione differente. Fino agli anni 90’ il serbatoio di questi ceppi è stato rappresentato dal tratto intestinale degli animali di allevamento, in
seguito all’uso come promotore di crescita di avoparcina, un antibiotico della classe dei glicopeptidi. Dopo il bando di questo
antibiotico la presenza di ceppi VRE nella comunità è andata diminuendo. Tuttavia negli ultimi anni la percentuale di ceppi
VRE isolati da infezioni nosocomiali è aumentata considerevolmente in alcuni paesi europei tra cui l’Italia. I dati riportati dalla
sorveglianza dell’antibiotico-resistenza EARSS mostrano che in Italia la proporzione dei ceppi VRE isolati dal sangue è notevolmente maggiore nella specie E. faecium (intorno al 20%) che nella specie E. faecalis (2-3%). Questi dati sono confermati
da uno studio recente su 4800 casi di infezioni gravi osservate in 45 ospedali italiani. In questo studio Enterococcus faecalis
rappresentava il 5° patogeno in ordine di frequenza, ma nessun ceppo era resistente alla vancomicina. Per contro tra i ceppi di
E. faecium, isolato più raramente, il 30% erano VRE.
Grazie a differenti metodi di tipizzazione molecolare, all’interno dei ceppi VRE della specie E. faecium è stato identificato un
particolare complesso clonale, denominato CC17, che è stato riconosciuto responsabile della diffusione dei ceppi VRE nosocomiali a livello mondiale, inclusa l’Italia. Questo complesso clonale ad alto rischio si è presumibilmente evoluto attraverso il
meccanismo della ricombinazione, e presenta, oltre alla resistenza alla vancomicina, anche resistenze multiple, sia intrinseche
che acquisite, e un’isola di patogenicità che porta il gene esp, codificante una proteina di superficie associata a proprietà adesive e produzione di biofilm. All’interno del CC17 è stata già segnalata resistenza anche ai nuovi antibiotici con attività verso
i VRE.
LE “DIVERSE FACCE” DI STAPHYLOCOCCUS SPP
Stefania Stefani
Dipartimento di Microbiologia e Ginecologia - Università di Catania - Catania
Gli Stafilococchi, microrganismi ubiquitari, causano prevalentemente infezioni cutanee suppurative ma possono diventare agenti eziologici di infezioni gravi (polmoniti, meningiti, osteomieliti) o sindromi dovute alla produzione di tossine (tossinfezioni
alimentari). La virulenza e la patogenicità di tali microrganismi è un fenomeno multifattoriale dovuto alla produzione di fattori
di adesione, enzimi di diffusione (invasine) o tossine.
Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, sono i microrganismi più frequentemente isolati da infezioni associate
all’impianto di cateteri venosi ed urinari, protesi polimeriche, valvole cardiache e materiali inerti in generale. L’instaurarsi di
questo tipo di infezione è correlata all’adesività di tali microrganismi, capaci di produrre un esopolisaccaride (EpS), componente
strutturale di una matrice extracellulare detta “slime”, coinvolta nella produzione di biofilm.
La formazione di tale struttura, così come la produzione di numerosi altri fattori di virulenza, è complessa e fortemente dipendente dalle condizioni ambientali e dalla densità cellulare. Numerosi studi evidenziano, infatti, che S.aureus, regola la produzione dei suoi determinanti di virulenza mediante sistemi di regolazione globale Quorum-Sensing dipendenti. Il sistema di controllo globale più noto e studiato è agr-locus (accessori-gene-regulator). S.aureus può essere collocato all’interno di quattro agrgroups diversi (I-II-III-IV), in base al tipo di autoinduttore prodotto, numerosi studi ipotizzano, inoltre, una correlazione tra
appartenenza ad un specifico agr-type, produzione di fattori di virulenza e possibilità di causare patologie diverse.
Oltre alla patogenicità intrinseca del microrganismo, un altro aspetto da considerare nelle infezioni da Stafilococchi è il pattern
di antibiotico-resistenza. E’ noto, infatti, che il trattamento delle infezioni sostenute da S.aureus è estremamente condizionato
dalla prevalenza di ceppi detti “meticillino-resistenti” o MRSA. Gli Stafilococchi MDR (Microbial-Drug-Resistance), hanno
infatti, acquisito nel tempo determinanti di resistenza che li rendono resistenti a quasi tutte le classi antibiotiche compresi, più
di recente, i glicopeptidi.
Adesività, tossigenicità ed antibiotico-resistenza rappresentano, quindi, le diverse facce dell’intricato sistema di meccanismi di
patogenicità che Staphylococcus spp. mettono in atto per esplicare la loro virulenza, che li colloca tra i microrganismi più temibili non solo in ambiente nosocomiale.
25
ANTIBIOTICI, FITNESS E VIRULENZA NEGLI STAFILOCOCCHI
Stefani Stefania.
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Ginecologiche, Università degli Studi di Catania.
Numerose evidenze supportate da diversi dati di letteratura ipotizzano una correlazione, negli stafilococchi, tra background
genetico, capacità di acquisire determinanti di resistenza ed appartenenza ad uno specifico genotipo agr. Quest’ultimo è strutturalmente un cluster di geni regolati da due diversi promotori P2 e P3, di cui il primo regola un sistema di regolazione globale di
tipo Quorum-Sensing, mentre il secondo controlla la produzione di una molecola di RNA detta RNAIII, che rappresenta l’effettore di tale sistema. agr-locus è, quindi, coinvolto nella regolazione dell’espressione di numerosi fattori di virulenza, fra cui
esotossine (hla, hld) e fattori di adesione (icaA, fnbA). Inoltre, tale locus, mediante la produzione di quattro diverse molecole
autoinduttrici (AIPs) esercita un meccanismo di interferenza microbica capace di modulare la capacità di un ceppo di colonizzare i diversi siti di infezione per competizione con la flora microbica residente.
Sebbene gli stafilococchi presentino una struttura di popolazione principalmente clonale, evidenze recenti hanno fatto ipotizzare che la loro fitness elevata possa derivare dal background genetico di cloni virulenti nei quali si è inserito mecA a livello cromosomico, che si sono evoluti nei diversi cloni maggiormente adattatisi nel tempo.
La caratterizzazione molecolare ha fornito numerosi dati sulle relazioni intercorrenti tra i cloni multi-resistenti più diffusi in
ambito ospedaliero e i maggiori cloni internazionali. Tuttavia, di recente si è assistito alla comparsa, in comunità, di cloni ipervirulenti, privi di geni per la resistenza oltre a quello per la meticillina, e spesso associati alla presenza di molteplici geni della
virulenza, in particolare quelli della Panton-Valentine leucocidine (PVL). Inoltre, nuovi cloni epidemici, paradossalmente sensibili alla maggior parte di antibiotici non-b-lattamici, con differenti background genetici rispetto a quelli dei cloni precedentemente endemici, si stanno diffondendo in diversi ospedali.
Ad oggi non esistono studi sulla possibile origine e sulla capacità di diffondere di questi microrganismi, contrastati anche dalla
loro abilità di risiedere nella popolazione in modo asintomatico. Solo attraverso l’analisi comparata delle modalità di diffusione dei determinanti di resistenza e di virulenza sarà possibile mettere in evidenza la fitness che caratterizza tali nuovi lineages.
QUANTO I MICRORGANISMI SONO IN GRADO DI CONDIZIONARE UNA SCELTA TERAPEUTICA?
Stefania Stefani
Dipartimento di Scienze Microbiologiche, Università degli Studi di Catania (I)
I microrganismi responsabile delle infezioni intra-addominali acquisite in comunità (cIAI) sono a tutti noti: l’infezione scaturisce dalla interazione di batteri Gram-negativi - aerobi, anaerobi e facoltativi -, con varie specie di streptococchi ed enterococchi, assieme a numerosissime specie batteriche aerobiche Gram-positive. L’infezione “polimicrobica” è una caratteristica di queste infezioni, confondendo spesso l’isolamento del vero patogeno con il presuntivo contaminante. Laddove i reperti microbiologici siano stati prelevati con adeguate condizioni di anaerobiosi e trattati dal laboratorio nel modo adeguato, si isolano in media
1.4-2.0 specie aerobie e 2.4-3.0 specie anaerobie per paziente. Secondo lavori ormai definiti “storici” vengono identificati tre
livelli organizzativi dei microrganismi del colon: 1) la microflora dominante, anaerobia a cui, con la sola eccezione di B.fragilis, è attribuito il compito di difesa dalle infezioni; 2) quella sub-dominante, formata dai bacilli Gram-negativi anaerobi facoltativi spesso responsabili delle manifestazioni cliniche; e 3) quella transeunte, cioè microrganismi esogeni acquisiti per diversi
motivi dall’esterno, incapaci di colonizzare l’intestino, ma considerati patogeni opportunisti.
Una delle possibili e più importanti modificazioni a questa stratificazione riguarda proprio l’uso degli antibiotici che oltre ad
influenzare una delle componenti microbiche rispetto alle altre (ad esempio l’uso delle penicilline fa aumentare la presenza degli
enterobatteri o l’uso delle cefalosporine aumenta i cocchi Gram-positivi e C.difficile etc), influenza l’incremento di microrganismi resistenti agli antibiotici. E così l’uso di cefalosporine di 2° e 3° generazione selezionano VRE, microrganismi produttori di ESBL e sono associate con un incremento delle infezioni da C.difficile, mentre l’uso di fluorchinoloni seleziona l’aumento di MRSA, Enterobatteri e Pseudomonas resistenti a questi stessi antibiotici, nonché ceppi produttori di ESBL.
Inoltre, la diagnosi eziologia diventa importante quando ci si trovi di fronte ad alcuni casi quali: 1) ci siano sospetti di presenza di microrganismi diversi da quelli definiti “flora normale”; 2) sospetto della presenza di microrganismi resistenti; 3) presenza di corpi estranei; 4) pazienti ospedalizzati (hIAI) con diversi fattori di rischio e in raparti di terapia intensiva.
In tutti questi casi, includendo quindi quelli in pazienti ospedalizzati, sono generalmente raccomandate analisi di colture intraoperatorie, in cui l’isolamento dei patogeni e la determinazione delle loro sensibilità è importante per cambiare una eventuale
terapia empirica non-corretta.
26
INFEZIONI BATTERICHE CRONICO-DEGENERATIVE: I MICOPLASMI
Pio Maria Furneri
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università degli Studi di Catania, Catania
I micoplasmi sono i più piccoli procarioti in grado di vita autonoma e le dimensioni del loro genoma sono così ridotte da rappresentare un modello di studio. Con il termine generico di micoplasmi si descrivono batteri appartenenti alla classe dei
Mollicutes. I micoplasmi differiscono fenotipicamente dagli altri batteri per la loro ridotte dimensioni e per la mancanza della
parete cellulare. L’elevata dipendenza dai nutrienti utilizzati nel mezzo di coltura e la plasticità metabolica dovuta l’assenza di
molti elementi regolatori nel loro genoma rendono i micoplasmi dei parassiti perfetti per le cellule eucariotiche. La capacità di
questi microrganismi di passare attraverso le cellule dell’ospite e la loro presupposta partecipazione all’attivazione dell’HIV
hanno, inoltre, stimolato lo studio sulla patogenesi delle infezioni da loro prodotte. Un’altra caratteristica importante dei micoplasmi, che si manifesta nei rapporti ospite-parassita, è la loro capacità di sfuggire alla risposta immunitaria dell’ospite attraverso variazioni degli antigeni di superficie. Tutte queste capacità di adattamento che consentono loro di vivere in varie nicchie
ecologiche, nonostante un genoma così piccolo e l’assoluta dipendenza metabolica dai nutrienti del mezzo di coltura, non è,
però, del tutto compresa.
Le malattie da micoplasmi sono apparentemente di tipo acuto, non inducono una risposta immunitaria protettiva dalle reinfezioni, sono spesso localizzate. Le infezioni sistemiche sono rare e circoscritte a particolari condizioni dell’ospite. I micoplasmi
sono dei potenti attivatori di risposte autoimmunitarie grazie alla somiglianza antigenica con molti antigeni umani e animali. E’
proprio la risposta immunitaria a complicare spesso le malattie da micoplasmi.
La persistenza dei micoplasmi dopo la terapia in presenza di guarigione clinica è frequentemente associata sia alle patologie dell’apparato respiratorio che a quelle dell’apparato genitourinario. Inoltre, la persistenza dei micoplasmi in altri organi e apparati
(liquido sinoviale, CNS, etc) è stata associata all’insorgenza di patologie di tipo cronico. Le infezioni croniche da micoplasmi
riguardano più distretti dell’organismo umano come pure quelli di molti animali. La persistenza delle infezioni è stata correlata essenzialmente a due fattori: a) la loro capacità di penetrare e di sopravvivere all’interno delle cellule, anche se non è stata
ancora del tutto dimostrata la moltiplicazione intracellulare; b) la modulazione del sistema immunitario dell’ospite.
I micoplasmi sono stati coinvolti nell’artrite, nell’artrite reumatoide, nell’asma bronchiale, nella sindrome da affaticamento cronico, nella fibromialgia, in patologie del sistema nervoso centrale, nell’AIDS, e anche nell’eziologia di alcune forme tumorali.
GENOTIPI ERM E VIRULENZA IN STREPTOCOCCUS PYOGENES
Pio Maria Furneri
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università degli Studi di Catania, Catania
Streptococcus pyogenes (SGA) causa molteplici malattie (faringite, setticemia, shock tossico, e fascite necrotizzate) ed altrettante sequele
(malattia cardiaca reumatica e glomerulonefrite), può sopravvivere e replicarsi in diversi siti anatomici ed è provvisto di numerose armi d’attacco e di difesa. Negli ultimi anni è stata rilevata un’aumentata resistenza all’eritromicina in SGA. La resistenza all’eritromicina, dovuta a
modificazioni del target, dipende dalla metilazione di un residuo di adenina del rRNA 23S operata da una mutilasi, che è il prodotto di una
classe di geni chiamati erm (erythromycin resistance methylase). Negli ultimi 50 anni sono state descritti numerosi geni erm in differenti specie batteriche. In SGA sono state finora descritti solo due geni erm: erm(A) ed erm(B). L’azione modificante della metilasi estende la resistenza anche ai lincosamidi e alle streptogramine B, ciò poiché il sito d’attacco ribosomiale è comune fra questi antibiotici. L’espressione di
questo gene è di tipo costitutivo o inducibile. Quando il fenotipo è inducibile la regolazione è affidata all’attenuazione traduzionale. Questo
particolare fenotipo è largamente rappresentato all’interno degli streptococchi, ed insieme all’efflusso è il più comune. Più rara è l’espressione costitutiva, dovuta probabilmente ad una modifica strutturale della zona regolatrice del gene stesso. Dei due geni erm, dei quali il più frequente è il tipo B, è stata spesso studiata la frequenza epidemiologica in associazione a molteplici fattori di virulenza di SGA.
Sono diversi fattori di virulenza di SGA che giocano un ruolo nell’insorgenza della malattie streptococciche: la proteina M, la proteina di F,la
C5a peptidasi, la ialuronidasi e le tossine pirogeniche (speA, speB, speC, speF, speG, speH, speJ, ssa e smeZ), che si comportano da superantigeni. Fra questi, la proteina M, è la più, frequentemente, usata nelle indagini epidemiologiche.Infatti, della proteina M sono stati caratterizzati oltre 155 alleli differenti e lo studio genotipico dei geni emm ha evidenziato relazioni filogenetiche fra i ceppi e distribuzioni clonali
fra gli isolati. La tipizzazione M è correlabile alla presenza d’altri fattori di virulenza, quali il fattore d’opacità, l’antigene T, e tutti gli altri fattori appartenenti al gruppo dei prodotti degli “emm-like gene”. Inoltre, la dimostrata capacità di SGA di penetrare all’interno delle cellule dell’apparato respiratorio e di sopravviverci, ha spinto lo studio dei ricercatori anche alla proteina F . Essa, codificata dal gene prtF1, al pari d’altre proteine leganti la fibronectina, è necessaria per l’internalizzazione di SGA. Negli ultimi anni è stato messo in evidenza che la distribuzione della frequenza del determinante genetico del fattore di virulenza proteina M sia, significativamente, differente fra microrganismi di
diversi fenotipi di resistenza e fra le popolazioni sensibili e resistenti di SGA. Inoltre, è stato evidenziata una correlazione tra la resistenza ai
macrolidi e la presenza della proteina F1, e una corrispondenza tra l’M tipo e la resistenza stessa. Infine, studi condotti per dimostrare l’associazione epidemiologica tra geni di resistenza e le tossine pirogeniche hanno concluso, che le differenti incidenze dei geni di antibioticoresistenza e dell’esotossina fra le popolazioni di SGA non sembrano avere un’importanza clinica intrinseca. Tuttavia, esse possono riflettere
la tendenza di queste caratteristiche ad essere associate con determinati emm-tipi, indipendentemente dagli organi o apparati dai quali sono
stati isolati gli SGA che li contenevano.
27
I FUNGHI: ANCORA UNA VOLTA I MIGLIORI PATOGENI OPPORTUNISTI
S. Oliveri
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche - U.O. Laboratorio Analisi, A.O.U. Policlinico”G. Rodolico”
Catania - Università di Catania
Nonostante i grandi progressi ottenuti negli ultimi anni, i funghi continuano ad essere considerati i migliori patogeni opportunisti dal momento che l’insorgenza di una infezione fungina invasiva (IFI) dipende dall’intersecarsi di molti fattori, alcuni concomitanti, altri sequenziali.
In generale i fattori di rischio per l’insorgenza di IFI nei trapiantati possono essere riferiti: a) all’alterazione delle barriere mucocutanee (procedure chirurgiche, dispositivi per l’accesso vascolare, cateteri di drenaggio, tubi endotracheali); b) alla sorgente
dell’infezione (colonizzazione, stile di vita, infezione subclinica nel paziente e/o nell’organo trapiantato, localizzazione geografica, condizioni favorenti l’aumento della carica conidiale nell’ambiente); c) allo stato di immunosoppressione, derivante dalla
terapia specifica e/o da infezioni virali.
Tuttavia, se l’immunosoppressione in generale rappresenta un inevitabile fattore di rischio per le complicazioni infettive post
trapianto, nelle IFI, è il grado dell’immunosoppressione, fortemente influenzato da diversi parametri, che gioca un ruolo determinante. Di contro, alcuni immunosoppressori mostrano proprietà antifungine che in certi casi determinano sinergia con il trattamento specifico. Gli inibitori della calcineurina possiedono una potente attività anticriptococcica (minore verso Candida e
Aspergillus). Gli inibori TOR (target of rapamycin) hanno attività verso tutti quei funghi il cui sviluppo è fortemente influenzato dall’attività TOR che includono Candida, Cryptococcus, Fusarium, Penicillium e Saccharomyces.
Le IFI sono in genere associate ad un alto tasso di mortalità e rappresentano ancora una grande sfida per la difficoltà nell’effettuare una rapida ed accurata diagnosi.
Più dell’80% delle IFI nei trapiantati sono causate da Candida e Aspergillus, e il loro coinvolgimento si diversifica in relazione
alla tipologia di trapianto. Ad essi si aggiungono altri funghi opportunisti quali Cryptococcus, Zigomiceti e più raramente ialoifomiceti ( Fusarium, Scedosporium) e feoifomiceti (Alternaria, Exophiala ed altri). Casi di infezioni primarie o da riattivazione da funghi dimorfi (Blastomyces, Coccidioides e Histoplasma), sono riportati in pazienti che vivono o sono transitati nelle
relative aree endemiche.
La più ampia conoscenza delle caratteristiche biologiche dei funghi coinvolti ci aiuta a comprendere meglio alcuni aspetti patogenetici e a migliorare sia le tecniche diagnostiche che gli approcci terapeutici.
IMPIEGO DI TECNICHE COLTIVAZIONE-INDIPENDENTE PER LO STUDIO DI LATTOBACILLI IN
ECOSISTEMI COMPLESSI
Cinzia Caggia, Cinzia Randazzo, e Cristina Restuccia.
Dipartimento di Orto-Floro-Arboricoltura e Tecnologie Agroalimentari (DOFATA) - Sezione Tecnologie Agroalimentari,
Università degli Studi di Catania, Catania
La conta su piastra e l’MPN (Most Probably Number) hanno rappresentato, per anni, le uniche tecniche quantitative per la misurazione dell’attività cellulare in studi di ecologia microbica.
Numerosi studi sono stati dedicati all’ottimizzazione dei metodi basati sulla coltivazione dei microrganismi, come ad esempio
la variazione delle temperature e dei tempi di incubazione e le variazioni di composizione dei terreni di coltura.
I metodi di identificazione e tipizzazione degli isolati sono essenzialmente effettuati sui ceppi coltivabili, che rappresentano solo
una piccola porzione della popolazione microbica presente in ecosistemi complessi. Infatti, spesso i microrganismi sono sottoposti a stress ambientali che costringono le cellule microbiche “coltivabili” ad entrare in una fase in cui presentano attività metabolica, ma non formano colonie nei comuni terreni di coltura. Pertanto, per casi come questi, operare una stima reale della comunità microbica richiede la conoscenza del suo dinamismo in relazione ai cambiamenti fisici e chimici operati dall’ambiente.
L’applicazione di tecniche molecolari “coltivazione-indipendente”, non richiedenti la preliminare coltivazione dei microrganismi, risulta essere un valido ed utile strumento per meglio comprendere le interazioni tra i microrganismi, i microrganismi e
l’ambiente e la loro funzionalità in ecosistemi complessi quali il tratto gastrointestinale e le matrici alimentari.
La D/TGGE (“Denaturing/Thermal Gradient Gel Elecrtrophoresis”) è una tecnica di fingerprinting genetico sensibile, veloce e
riproducibile in grado di separare le specie microbiche presenti in ecosistemi complessi. L’approccio molecolare permette di studiare specie microbiche che, a causa della mancanza di informazioni sulle esigenze nutritive, non sono coltivabili nei comuni
terreni di laboratorio. Il DNA microbico, generalmente ribosomiale, viene estratto direttamente dal campione in esame ed amplificato utilizzando appropriati primer. La separazione elettroforetica dei frammenti del DNA viene effettuata utilizzando gel di
poliacrilamide contenenti un gradiente lineare termico (TGGE) o chimico (DGGE). Pertanto, la diversità genetica della popolazione microbica e le specie dominanti sono visualizzate con un’unica amplificazione e migrazione.
Recentemente la messa a punto di tecniche PCR-DGGE gruppo-specifiche permette di monitorare la diversità e il dinamismo
della popolazione di svariati gruppi microbici quali i lattobacilli, microrganismi di fondamentale importanza in ecosistemi quali
il tratto gastrointestinale e le matrici alimentari.
28
L’IMPORTANZA DI ASSICURARE LA MIGLIORE TERAPIA DELLE INFEZIONI SEVERE IN OSPEDALE: DAL LABORATORIO AL LETTO DEL PAZIENTE - MICROBIOLOGIA
Annamaria Speciale
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche - Università degli Studi di Catania - Italia
Le infezioni complicate della cute e dei tessuti molli (SSTI) e la polmonite comunitaria (CAP) sono in aumento in tutto il
Mondo, sono responsabili di elevata morbilità, mortalità e di aumento dei costi assistenziali e richiedono spesso ricovero in
ospedale.
Tale fenomeno è attribuibile a svariate cause, quali l’aumento dell’età media della vita, l’aumento di soggetti immunocompromessi, di trapiantati o di pazienti sottoposti a chemioterapia.
Le SSTI, emergenti ed in incremento tra le infezioni gravi che richiedono ricovero e terapia antibiotica endovenosa, sono causate da una grande varietà di patogeni. Staphylococcus aureus è, di gran lunga, il microrganismo prevalente; molto comuni
sono, inoltre, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, altri batteri enterici e batteri anaerobi. Nell’ambito di queste specie,
il problema della resistenza alla meticillina negli stafilococchi, la resistenza alla vancomicina negli enterococchi, o la produzione di ESBL negli enterobatteri, in associazione alla limitata disponibilità di nuovi antibiotici, suggeriscono una scelta mirata, in relazione all’antibiotico-sensibilità del patogeno o dei patogeni isolati. Molecole quali cefalosporine ad ampio spettro,
penicilline protette, quinopristin-dalfopristin, linezolid, glicopeptidi, daptomicina, carbapenemici, fluorochinoloni di nuova
generazione, quali moxifloxacina, sono molecole di provata efficacia.
Per quanto riguarda la CAP, gli studi epidemiologici più recenti confermano che i microrganismi più frequentemente isolati in
pazienti di qualsiasi età che richiedono ricovero in ospedale, sono Streptococcus pneumoniae ed Haemophilus influenzae.
L’incremento di isolamento di ceppi di S. pneumoniae penicillino-resistenti e con resistenze multiple, nonché il concomitante
isolamento di patogeni “atipici”, ha fortemente condizionato la scelta terapeutica, che, attualmente, per la documentata attività
antibatterica verso S. pneumoniae, e verso gli altri patogeni isolati con maggiore frequenza, suggerisce l’impiego di un fluorochinolone respiratorio o di una cefalosporina a spettro esteso, in monoterapia o in associazione.
VACCINI POLISACCARIDICI E TRANSFILETICI
Antonio Cassone
Dipartimento Malattie Infettive, Parassitarie ed Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Roma.
I vaccini polisaccaridici e glicoconiugati hanno costituito una risorsa fondamentale e di straordinario successo per la prevenzione di gravi malattie causate da batteri capsulati, alcune a carattere francamente epidemico sia nell’infanzia che nell’età adulta. Quantunque una definita risposta anticorpale antipolisaccaride capsulare sia riguardata come un correlato di protezione dalle
autorità regolatorie, in realtà i meccanismi con cui detti vaccini, in particolare i glicoconiugati, proteggono dalle malattie dell’infanzia non sono affatto chiari. E’ emerso recentemente, ad esempio, che l’help della risposta anticorpale da parte delle cellule T è estremamente complesso, può riguardare varie popolazioni di linfociti T compresa la popolazione Th17 e richiede una
fine regolazione. Inoltre alcuni polisaccaridi largamente secreti in vivo durante l’invasione batterica o fungina hanno dirette
capacità interattive non solo con le APC ma anche con i linfociti stessi provocandone in alcuni casi la deplezione. Molta ricerca è anche in corso per la definizione dello switch isotipico che è soprattutto rilevante per quelle classi di immunoglobuline
notoriamente prodotte in seguito a vaccinazione con polisaccaridi quali le IgG2. Infine alcuni di questi componenti, per la loro
varia distribuzione nel mondo microbico, possono in teoria costituire vaccini di nuova generazione attraverso cui un singolo
polisaccaride vaccinale può stimolare risposte protettive verso agenti microbici non correlati. La proof of concept di questo
approccio è stata data per il vaccino glicoconiugato fra laminarina, un beta-glucano di alghe e il tossoide difterico (CRM197)
che nella sperimentazione in vivo ha generato anticorpi protettivi contro funghi patogeni assai lontani evolutivamente fra loro
quali Candida, aspergillus e criptococcus (vaccino universale o transfiletico).
29
LA PRESCRIZIONE ANTIBIOTICA IN MG TRA LINEE GUIDA ED APPROPRIATEZZA PRESCRITTIVA
M.Fidelbo
Catania
L’appropriatezza prescrittiva
La prescrizione in Medicina Generale ha parametri di appropriatezza che prescindono dai normali canoni di corrispondenza clinica tra malattia e terapia, proprio per il ruolo che il Medico di Medicina Generale (MMG) ha nel SS Nazionale e SS Regionale.
Essa infatti è condizionata da alcuni mandati che il MMG riceve da più “committenti”: personali e della realtà socioeconomica.
Egli infatti subisce una serie di condizionamenti conflittuali. Innanzitutto sente forte il conflitto tra la propria coscienza, con il
desiderio di risolvere od alleviare il problema di salute del paziente, e le risorse disponibili del SSR . Questo conflitto si inasprisce quando la prescrizione non rientra fra i LEA, ed ancor più quando le condizioni socioeconomiche del paziente non consentono il ricorso a terapie palliative, o utili ma non indispensabili. In questo il MMG meridionale ha una peculiarità e specificità che lo distinguono dai colleghi di altre regioni, proprio per le condizioni sociali meno abbienti in cui si trova ad operare.
Ma egli “deve osservare nell’esercizio della professione”… “principi e regole” del nuovo Codice di Deontologia Professionale
(art 1) e “ non deve soggiacere a interessi, imposizioni e suggestioni di qualsiasi natura” (art 4). “La prescrizione di un accertamento diagnostico e/o di una terapia non può che far seguito a una diagnosi circostanziata, o quanto meno, ad un fondato sospetto diagnostico. Su tale presupposto al medico è riconosciuta autonomia nella programmazione, nella scelta e nella applicazione
di ogni presidio diagnostico e terapeutico, anche in regime di ricovero”..”Le prescrizioni e i trattamenti devono essere ispirati
ad aggiornate e sperimentate acquisizioni scientifiche, tenuto conto dell’uso appropriato delle risorse, sempre perseguendo il
beneficio del paziente secondo criteri di equità.” (art 13). Si riconosce quindi al medico autonomia, ed un certo margine anche
nell’uso off-label dei farmaci, purchè scientifico ed equo. Lo stesso non viene confermato dalle disposizioni legislative. Queste
due posizioni contrastanti , mentre per il medico specialista ospedaliero non comporta alcun problema, per il MMG rappresenta un ulteriore conflitto che và composto nel rapporto tra coscienza e condizione sociosanitaria del paziente. Rimane ancora
insoluto il conflitto tra la certezza scientifica della prevenzione farmacologia di alcune patologie non ricomprese nei LEA o non
previste nelle Note farmaceutiche AIFA. Altro dilemma è rappresentato dalla necessità di discernere tra accertamento diagnostico o terapia. Basti pensare ad alcune situazioni cliniche e sociali, ove l’infezione per es delle vie respiratorie in pazienti a
domicilio indurrebbero accertamenti paraclinici per il sospetto diagnostico, ma il MMG procede con una terapia antibiotica
iniettiva anziché orale. Altro conflitto è rappresentato dal rapporto con gli specialisti: l’assenza di controlli su di essi circa l’applicazione di linee guida, la assenza di deontologia fra medici, il rischio di fare cattiva figura in caso di omessa prescrizione terapeutica (es : cortisonica, antibiotica iniettiva). A tal proposito viene da chiedersi se la terapia antibiotica iniettiva è realmente più
efficace della orale? Se la risposta è no, perché se ne abusa in sede di ricovero insinuando così nell’immaginario collettivo che
dove si curano le cose importanti ( strutture di ricovero ) , si fanno le “iniezioni”?! Se la risposta è sì, nel meridione, ove si prescrive maggiore terapia iniettiva antibiotica, come risultato dovremmo avere una minore ospedalizzazione, mentre così sembra
non essere, in quanto il tasso di ospedalizzazione è maggiore: andrebbe precisato se questo maggiore tasso è per problemi diagnostici o terapeutici.
Altre peculiarità culturali meridionali oltre la terapia iniettiva, è quella ormonale, cortisonica, e morfinica: al sud tali prescrizioni vengono viste con molta diffidenza dall’utenza. Se ne deve dedurre che il MMG ha fallito nel suo mandato? Se vediamo
le prescrizioni possiamo notare che alcuni parametri si sono modificati nettamente, ma molto rimane ancora da fare! Es: terapia
antibiotica orale, terapia morfinica, IPP.
Risalta quindi il mandato del MMG di modificare la cultura sanitaria dell’utente: il SSN e SSR non ne sono capaci, o, ricercando il consenso politico, non vogliono; pertanto delegano un loro parasubordinato ( il più facile da controllare e sanzionare!).
Così tra gli altri mandati che il SSN e SSR conferiscono al MMG c’è l’appropriatezza che deve attuarsi attraverso un forte impegno nel counselling con il paziente.
Proprio da questo rapporto di parasubordinazione nasce anche un altro genere di conflitto con il paziente, il quale non si trova
più, come era nel passato, in una condizione di soggezione e stima; infatti egli viene spesso, su sollecitazione di amici e parenti medici o del farmacista, a richiedere terapie inappropriate; ma egli è anche in maniera indiretta un pagatore della prestazione,
in quanto ha libertà di scelta del medico. Così il MMG si trova nel paradosso di un rapporto di libertà professionale parasubordinata, che paga con forti condizionamenti.
Se valutiamo quale è stato l’atteggiamento del SSN e dello Stato sulla appropriatezza prescrittiva nei confronti della categoria dei MMG,
notiamo un atteggiamento più sanzionatorio che collaborativo, e più attento all’impiego delle risorse, che alla salute dell’utente.
Basti pensare alla Sentenza della Procura di Salerno.
L’accertamento è partito dall’individuazione dei medici di base che, nell’ambito del Distretto presentavano i valori di spesa farmaceutica pro-capite, nel IV trimestre 2003, più alti rispetto alla media (aziendale, distrettuale e nazionale), con riferimento specifico però a determinate categorie di farmaci ricompresi nelle note elaborate dalla CUF . La sentenza riguarda uno dei medici
coinvolti, citato in giudizio dalla procura regionale per risarcire la ASL di Salerno 2 di un danno quantificato in euro 2.660,66
oltre rivalutazione monetaria, interessi legali e spese di giustizia.
Nei confronti del Medico erano state accertate irregolarità per mancata conformità delle prescrizioni rispetto alle note CUF n.
1,9, 13, 48, 55, 66, 79. In particolare: con riferimento alle note n.48 (inibitori della pompa protonica per patologie a carico dell’apparato gastro-duodenale) e 55 (antimicrobici per trattamento iniettivo di infezioni) si è riscontrata la lunghezza del ciclo terapeutico rispetto alle caratteristiche farmacocinetiche del medicinale; con riferimento alle note n.13 (farmaci per la cura delle dislipidemie) e 66 (artropatie, osteoartrosi, dolore neoplastico, gotta) la troppo giovane età degli assistiti rispetto alle caratteristiche del farmaco.
Ciascun medico di base è tenuto ad adeguarsi alle indicazioni e limitazioni delle note CUF, in mancanza essendo tenuto a rim-
30
borsare il costo del farmaco prescritto secondo l’art.1, comma 4, L. 425/1996 che recita: “le aziende sanitarie locali e le aziende ospedaliere curano … i controlli obbligatori, basati su appositi registri o altri idonei strumenti, necessari ad assicurare che la
prescrizione dei medicinali rimborsabili a carico del Servizio sanitario nazionale sia conforme alle condizioni e alle limitazioni
previste dai provvedimenti della Commissione unica del farmaco e che gli appositi moduli del Servizio sanitario nazionale non
siano utilizzati per medicinali non ammessi a rimborso. Qualora dal controllo risulti che un medico abbia prescritto un medicinale senza osservare le condizioni e le limitazioni citate, … il medico è tenuto a rimborsare al Servizio sanitario nazionale il farmaco indebitamente prescritto”.
Il legislatore ha voluto individuare un meccanismo diretto a creare le condizioni perché la spesa pubblica farmaceutica possa, a
monte, essere destinata a soddisfare il requisito del beneficio terapeutico e dunque utile per la collettività. Con detto meccanismo si traducono dunque in veri e propri precetti giuridicamente vincolanti le note CUF, anche se all’origine sono linee guida
di natura medico-scientifica liberamente disattendibili - rientrando in tal caso la scelta nell’ambito insindacabile del merito connesso all’esercizio della professione medica - qualora l’esborso venga sopportato dal privato.
Inoltre, l’art.15 bis, comma 1, lett.c) del DPR 270/2000 impone espressamente al medico l’obbligo di “operare secondo i principi di efficacia e di appropriatezza degli interventi in base ai quali le risorse devono essere indirizzate verso le prestazioni la
cui efficacia è riconosciuta secondo le evidenze scientifiche e verso i soggetti che maggiormente ne possono trarre beneficio”,
restando l’ambito insindacabile della prescrizione secondo “scienza e coscienza” (comma 2) residuale rispetto a quello legato
all’osservanza dei predetti principi, trasposti sul piano operativo nelle note CUF.
Pertanto, qualora dall’espletamento di tali attività derivi un danno all’amministrazione, questa deve promuovere davanti alla
Corte dei conti - e non all’autorità giudiziaria ordinaria - l’azione per il ristoro del pregiudizio che assuma di aver subito, in
quanto la responsabilità del sanitario dipende non dall’esercizio della sua professione, bensì dal comportamento illegittimo,
doloso o colposo posto in essere nell’ambito del rapporto di pubblico servizio” (Corte di Cassazione – Sezioni Unite - 13 novembre 1996 n. 9957; in terminis 21 dicembre 1999 n. 922).
La sentenza
Da tale sistema emerge, ad avviso della Procura l’evidente antigiuridicità della condotta dannosa tenuta dal Medico considerato che “rientra, infatti, nei suoi precisi doveri di servizio, siccome nascenti dal rapporto di collaborazione parasubordinato intrattenuto con l’azienda, quello di concorrere alla più oculata gestione della spesa farmaceutica. Quanto, infine, al nocumento così
arrecato, di esso dovrà rispondere in qualità di medico di base e, dunque, in rapporto convenzionale libero-professionale con
l’ASL SA 2, il quale costituisce relazione di servizio idonea a fondare la responsabilità in parola.”
Per quanto concerne il connotato soggettivo della condotta, la Procura afferma che il Medico “ha, infatti, consapevolmente (o
con gravissima negligenza) violato le regole che presidiano alla corretta prescrizione dei farmaci a carico del SSN … si consideri che nell’effettuare la prescrizione il medico di base deve sempre rapportarsi al prontuario farmaceutico nazionale, contenente le predette note, onde verificare la compatibilità della somministrazione suggerita al paziente con le modalità, la posologia e le patologie indicate nelle stesse. Laddove ciò non avvenga, la negligenza del medico risulta in re ipsa poichè vi sarà l’evidente prova della non adeguata conoscenza del contenuto delle note in questione o il preordinato intendimento di non adoperarle”.
In data 27 dicembre 2005 il convenuto ha depositato una nota, in allegato alla quale deposita i cedolini di pagamento delle competenze retributive relative ai mesi dal maggio all’ottobre 2005, dai quali risulta che la ASL SA 2 ha provveduto a recuperare
mensilmente alla voce “recupero somme per farmaci” l’importo costante di euro 443,44 mensili, per un totale di euro 2.660,64.
La Corte dei Conti - Sezione Giurisdizionale per la regione Campania- ha dichiarato quindi cessata la materia del contendere
fino a concorrenza della sorte capitale di euro 2.660,66; condannando il convenuto al pagamento della rivalutazione monetaria
secondo gli indici ISTAT dalla data dell’addebito amministrativo (26 ottobre 2004) fino alla data di ogni singolo recupero, nonché degli interessi legali dalla data del deposito della presente decisione fino al soddisfo. Le spese del giudizio seguono la soccombenza e sono liquidate in favore dell’Erario.
Questa che sembra una difesa d’ufficio della categoria dei MMG, meridionali in particolare, si colora però anche di tinte non
troppo chiare quando passiamo ad esaminare i comportamenti prescrittivi antibiotici. Infatti confrontando la prescrizione antibiotica tra le varie categorie di antibiotici e fra nord e sud si assiste ad una crescita sperequativa di una certa consistenza a favore dei chinolonici, che non trova ragion d’essere nella epidemiologia e nell’eziologia delle infezione al sud. Rimangono pertanto sospesi i giudizi su alcuni comportamenti dettati da cultura clinica e da marketing.
Quali soluzioni?
Risulta difficile, allo stato dei fatti, immaginare una composizione dei vari conflitti sull’appropriatezza prescrittiva. Pare auspicabile l’osservanza e l’applicazione da parte di tutti i medici di Protocolli e Linee guida uniformi e condivisi non solo sul territorio, ma anche da parte dei medici specialisti che abbiano o no un qualunque rapporto con il SSN e SSR. La condivisione è un
percorso lungo e faticoso che si basa innanzitutto sul coinvolgimento di tutte le figure professionali e sulla Formazione . Inoltre
non deve essere tralasciato, come spesso invece avviene, il coinvolgimento dell’utenza con campagne di informazione, all’acquisizione di un livello di coscienza sulla limitazione delle risorse in sanità.
Bibliografia
Sentenza n. 1710 , 28 novembre 2006 - Corte dei Conti - Sezione Giurisdizionale Campania –Legge 425/1996 Conversione in
legge, con modificazioni, del decreto-legge 20 giugno 1996, n. 323, recante disposizioni urgenti per il risanamento della finanza pubblica.
DPR 270/2000 Regolamento di esecuzione dell’accordo collettivo nazionale per la disciplina dei rapporti con i medici di medicina generale. Art. 15-bis - Appropriatezza delle cure e dell’uso delle risorse.
Dirittosanitario.net
31
INFEZIONI POST-TRAPIANTO - INFEZIONI PARASSITARIE
Ildebrando Patamia
Dipartimento di Medicina Interna e Medicina Specialistica, Università di Catania e U.O Laboratorio Analisi, A.O.U.P.C.
“Gaspare Rodolico”
L’impatto delle parassitosi sulla popolazione mondiale è di grande rilievo. Le oltre 300 specie di parassiti in grado di infettare
l’uomo fanno sentire il loro peso soprattutto nelle regioni tropicali e subtropicali per ragioni ambientali e sociali. L’incremento
demografico nei Paesi in via di sviluppo, spesso non accompagnato da crescita socio-sanitaria, crea il pabulum ideale per il
manifestarsi delle parassitosi. La situazione dei Paesi industrializzati è, evidentemente, molto diversa. Purtuttavia è costante,
anche in essi, il riscontro di patologie parassitarie in parte autoctone, in parte d’importazione (ritenute esclusivo appannaggio
dei Paesi della fascia intertropicale). Tale situazione è da porre in relazione con l’incremento di traffici con il Terzo Mondo, con
il turismo esotico, con i movimenti migratori di intere popolazioni. Nuovi problemi vengono suscitati dall’incontro dei parassiti con soggetti immunocompromessi sia per cause patologiche (neoplasie, HIV) sia iatrogene (ad es. trapiantati d’organo in terapia immunosoppressiva). La complessità del rapporto ospite/parassita (protozoo, elminta) è ben nota. L’acquisizione di un’infezione parassitaria, le possibili manifestazioni cliniche della stessa, sono legate sia alla capacità (in genere molto sviluppata)
del parassita di eludere la risposta immunitaria dell’ospite, allo stato immunitario del soggetto parassitato. I destinatari di trapianto d’organo possono acquisire una patologia parassitaria in modi differenti: attraverso l’organo trapiantato, per una nuova
infezione, per la riattivazione di un’infezione latente come conseguenza dell’immunosoppressione farmacologicamente indotta.
Toxoplasmosi, Leishmaniosi viscerale, Malattia di Chagas, Malaria, sono le patologie parassitarie di preminente interesse nel
soggetto sottoposto a trapianto d’organo. Rilevanti anche le numerose patologie indotte da protozoi ed elminti intestinali. Spesso
assai gravi sono le manifestazioni cliniche delle patologie summenzionate nell’ospite trapiantato. Inoltre molti dei presidi terapeutici in uso nella terapia delle parassitosi hanno potenziale tossicità e, comunque, è sempre da tenere in considerazione la possibile interazione negativa di questi con i farmaci adoperati per indurre immunosoppressione. Queste considerazioni devono
indurre i clinici a valutare con estrema attenzione ogni sintomo o segno che induca il sospetto di una patologia parassitaria nell’immunocompromesso ed in particolare nel soggetto ricevente un trapianto d’organo.
LE NUOVE FRONTIERE DEI VIRUS: MALATTIE INFETTIVE E DEGENERATIVE
RUOLO DEI VIRUS NELLE PATOLOGIE CARDIACHE
Guido Scalia
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università degli Studi di Catania e U.O. di Virologia
Clinica; Laboratorio Centralizzato; Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico “Gaspare Rodolico” di Catania.
Le cardiopatie non ischemiche costituiscono un ampio capitolo nell’ambito delle patologie cardio-vascolari. In un rilevante
numero di casi non è possibile comprendere quale sia la loro etiologia. Sempre più frequentemente vengono chiamati in causa
i virus quali agenti patogeni che intervengono sia direttamente nell’insorgenza di alcune di queste patologie, sia indirettamente,
quali cause scatenanti altri eventi che indurrebbero l’evento morboso. Questa apparente maggiore frequenza è probabilmente
legata al fatto che l’avanzamento in tema di diagnosi virologica ha consentito un più approfondito ed accurato studio di questa
categoria di pazienti le cui patologie altrimenti avrebbero potuto essere definite “essenziali”. Tali tecniche possono consentire
un approccio diagnostico meno invasivo rispetto a quanto non avvenisse nel passato; è a questo settore, infatti, che il virologo
clinico deve dedicarsi: ottenere sistemi diagnostici poco invasivi che consentano di porre diagnosi in tempi brevi e con l’impiego
di campioni patologici facilmente ottenibili.
I virus più frequentemente associati con le patologie cardiache sono certamente alcuni Enterovirus ed i virus influenzali. In effetti, però, un’attenta disamina della letteratura evidenzia un vasto numero di virus chiamati in causa quali agenti etiologici di
patologie dell’apparato cardiocircolatorio.
Molto interessante appare il possibile ruolo del parvovirus B19 in questo tipo di patologie, specie in quelle che riguardano
soggetti in età pediatrica.
A questo proposito, bisogna tenere in considerazione il possibile ruolo di quei virus che possono indurre infezione congenita
specie in corso di infezione acquisita dalla donna nelle ultime settimane di gestazione. Nei casi di SIDS (sudden infant death
syndrome), infatti, vengono spesso chiamati in causa i virus quali responsabili di infezione asintomatica e fulminante acquisita
dal bambino nel corso della sua vita extrauterina, ma essi dovrebbero essere tenuti in grande considerazione anche nei casi di
SIDS perinatale.
Il ruolo della virologia clinica anche in questo settore sembra essere di grande rilievo sia in fase diagnostica sia nell’affiancare
il clinico nel management del paziente.
32
MODELLI DI STUDIO DELL’ATTIVITA’ PREBIOTICA E PROBIOTICA
G. Mandalari1, M. Wickham2, A. Narbad2, G. Bisignano1
1Dip. Farmaco-Biologico, Università di Messina; 2Institute of Food Research, Colney Norwich (UK).
Con il termine “prebiotico” vengono indicati gli oligosaccaridi non digeribili degli alimenti che sono selettivamente fermentati
nel colon, aumentando il numero di bifidobatteri e lattobacilli, noti per il loro effetto protettivo contro agenti patogeni. Sia i batteri probiotici che i composti con effetto prebiotico devono superare una serie di barriere nel tratto gastrointestinale, come succhi gastrici e sali biliari. Nonostante la dose minima di probiotici sia di 107 CFU/g di alimento, il passaggio attraverso il tratto
gastrointestinale potrebbe interferire negativamente con la capacita’ di colonizzare il colon e modificare la microflora. Tuttavia,
numerosi studi hanno dimostrato che la maggior parte dei batteri probiotici colonizzano il colon transitoriamente ed il grado di
sopravvivenza dipende da numerosi fattori, tra i quali il grado di acidita’ dello stomaco ed il tempo di esposizione ad acidi e sali
biliari.
Esperimenti in vitro con colture pure e miste, modelli animali e studi epidemiologici sono stati usati per valutare gli effetti benefici di probiotici, prebiotici e sinbiotici, questi ultimi costituiti da una associazione di pro- e prebiotici. Un modello completo di
digestione (Model Gut) e’ stato messo a punto al fine di simulare le reazioni che avvengono durante il passaggio di alimenti prebiotici e batteri probiotici contenuti in acqua, yoghurt ed alimenti nel tratto gastro-intestinale. I prodotti di digestione post-duodenale vengono poi trasferiti in un modello di colon intestinale, che simula la parte prossimale, trasversa e distale del colon.
Tuttavia la necessita’ di studi clinici soprattutto per gli infanti e gli anziani crea ulteriori sfide per interventi di prevenzione e a
scopo terapeutico.
Mandalari G. et al. In vitro evaluation of the prebiotic activity of a pectic oligosaccharide-rich extract enzymatically derived
from bergamot peel. Appl Microbiol Biotechnol. 2007 Jan;73(5):1173-9.
LE INFEZIONI POST-TRAPIANTO
GLI AGENTI EZIOLOGICI BATTERICI: IL LORO RUOLO, DOVE, COME E QUANDO
Giuseppe Nicoletti, Daria Nicolosi
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche – Università di Catania
Le infezioni batteriche nei trapiantati sono in aumento, parallelamente con l’aumento di questi soggetti. Le infezioni si possono suddividere in tre tipi: 1) quelle correlate al tipo di intervento chirurgico e alle tecniche operatorie; 2) quelle correlate alla
prolungata ospedalizzazione (le infezioni di questi due primi tipi sono classificabili come nosocomiali); 3) quelle correlate al
trattamento immunosoppressivo per evitare i fenomeni di rigetto, anche quando il soggetto è stato dimesso.
Le infezioni contratte in ospedale sono sostenute da batteri poliantibiotico-resistenti e, nell’ultima decade, l’antibiotico-resistenza tra i patogeni opportunisti nei soggetti trapiantati è aumentata notevolmente; inoltre il trapianto di fegato è quello che si
è dimostrato più soggetto alle infezioni batteriche.
Vengono riportati i dati emersi dal progetto “Infezioni gravi” nel biennio 2003-2004 relativi al Centro trapianti: sono stati isolati 224 ceppi batterici, di cui 201 nosocomiali e 23 comunitari. In particolare le specie più frequentemente isolate sono state E.
coli, P. aeruginosa, S. epidermidis, E. faecalis, S. aureus, di cui vengono riportati i dati di antibiotico-resistenza; le infezioni che
si sono verificate più spesso sono state: l’ascesso viscerale, la setticemia, la colangite/colecistite, l’infezione associata a catetere endovascolare.
33
STAFILOCOCCHI COAGULASI-NEGATIVI: TASSONOMIA ED EPIDEMIOLOGIA
Giuseppe Nicoletti, Daria Nicolosi
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche – Università di Catania
Vengono elencate tutte le specie di stafilococchi, di isolamento sia umano che animale o ambientale. In particolare, per tutte le
specie di stafilococchi classificati come coagulasi-negativi, di cui si conoscono isolamenti umani, si elencano l’habitat, i meccanismi di patogenicità (quando conosciuti) e le principali patologie riportate in letteratura.
Vengono inoltre riferiti i dati epidemiologici relativi all’isolamento in Italia negli anni 2003-2004 ottenuti dal progetto “Infezioni
gravi”: un totale di 584 stafilococchi coagulasi-negativi, di cui 345 S. epidermidis, 105 S. haemolyticus, 73 S. hominis, 15 S.
capitis e 46 ceppi di altre dieci specie. Di tutti gli isolati vengono riportati i reparti di isolamento, le patologie da essi sostenute e l’antibiotico-resistenza. In linea generale i reparti dove si verificano le infezioni da stafilococchi coagulasi-negativi sono
stati soprattutto quelli di Terapia intensiva, di Ematologia e di Medicina, mentre le patologie più frequenti sono risultate le setticemie, le infezioni da catetere venoso centrale e le infezioni urinarie.
Oltre il 70% dei ceppi isolati è oxacillino-resistente, ma nessuno dei ceppi isolati si è dimostrato resistente a vancomicina o a
linezolid.
UNA ANAGRAFE PER I PROBIOTICI? EVOLUZIONE DELLE TECNICHE DI IDENTIFICAZIONE E
TIPIZZAZIONE
Lucia Aquilanti1, Andrea Carbini2, Gloria Silvestri1, Francesca Clementi1
Dipartimento di Scienze degli Alimenti1 e Dipartimento di Scienze Applicate ai Sistemi Complessi2, Università Politecnica delle
Marche, Ancona
La selezione di ceppi probiotici destinati all’alimentazione umana è un processo multifasico che deve tener conto di proprietà
funzionali e tecnologiche, sicurezza d’uso ed identità tassonomica. Sebbene questo ultimo aspetto sia stato per lungo tempo considerato solo marginalmente, c’è oggi una crescente consapevolezza verso l’idea che la corretta identificazione, a livello di specie e di ceppo, di un probiotico sia uno dei requisiti necessari per garantirne efficacia e sicurezza d’uso.
Per molto tempo la tassonomia batterica si è avvalsa di metodi fenotipici, basati sull’analisi morfologica della cellula e della
colonia, l’analisi delle caratteristiche di crescita e del profilo fermentativo, la presenza di particolari attività enzimatiche, l’utilizzo di composti organici, l’analisi delle proteine di parete, etc.
Spesso, tuttavia, tali metodi generano risultati caratterizzati da una bassa riproducibilità e una notevole difficoltà di interpretazione, questa ultima particolarmente limitante quando si vogliono identificare singoli ceppi. L’integrazione della caratterizzazione fenotipica con quella genotipica, basata sull’uso di tecniche di genetica molecolare mirate all’identificazione a livello di
specie, come ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) e sequenziamento del DNA codificante per il 16S
rRNA, o alla tipizzazione a livello di ceppo, come PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA), ERIC (Enterobacterial Ripetitive Intergenic Consensus)-PCR, e AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism), ha consentito di poter operare con una maggiore rispondenza e riproducibilità.
Dato il rapido evolversi delle metodologie molecolari, sempre nuovi strumenti si rendono disponibili per la classificazione tassonomica dei probiotici. A titolo di esempio, tra i metodi analitici più nuovi, l’analisi, via PCR inversa, delle sequenze di inserzione (IS) è risultata una valida alternativa alle più consolidate tecniche di tipizzazione.
Alla luce della limitata qualità microbiologica e della inadeguatezza nella etichettatura di numerosi prodotti probiotici, come è
emerso recentemente dalla letteratura scientifica, molte delle tecniche di genetica molecolare oggi disponibili, come le tecniche
di ibridazione con sonde genetiche o il fingerprinting genico, hanno mostrato di poter costituire un valido supporto anche per
l’enumerazione e il monitoraggio di specie filogeneticamente collegate e, persino, di singoli ceppi.
34
INFEZIONI PARODONTALI E MALATTIA CARDIOVASCOLARE
Cocuzza C, Broccolo F, Musumeci R, Formica F, Careddu AM, Paolini G, Parati G
Università degli Studi di Milano-Bicocca.
L’aterosclerosi è una patologia infiammatoria cronica ad eziologia multifattoriale che rappresenta la principale causa di mortalità nei paesi sviluppati, essendo alla base della malattia ischemica cardiaca e cerebrale. Numerosi studi sono stati condotti per
individuare i maggiori fattori di rischio in grado di favorire la comparsa delle lesioni aterosclerotiche; negli ultimi anni l’attenzione dei ricercatori si è anche focalizzata sul possibile ruolo di alcuni agenti infettivi nello sviluppo e progressione di questa
patologia. Patogeni, sia batterici che virali, sono stati implicati nell’eziopatogenesi dell’aterosclerosi quali Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Citomegalovirus (CMV) e più recentemente anche i microrganismi responsabili della malattia parodontale (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum).
In questo studio sono stati ricercati e quantificati questi agenti microbici mediante saggi normalizzati di Real-Time PCR, in campioni di plasma provenienti da una coorte di pazienti affetti da aterosclerosi di grado severo nel distretto coronarico (ACoAD,
n=43) e carotideo (ACaAD, n=28), in soggetti che presentavano solo fattori di rischio per lo sviluppo di aterosclerosi, ma senza
evidenza clinica di malattia (RF n=23) ed in un gruppo di controllo (C n=23) .
Nei campioni di plasma dei pazienti con aterosclerosi è stata osservata la presenza del genoma di numerosi degli agenti microbici ricercati, con una diversa prevalenza in base al distretto (tabella 1). Da sottolineare anche la presenza di alcuni degli agenti patogeni ricercati nel plasma di pazienti con soli fattori di rischio rispetto al gruppo di controllo.
In conclusione, i risultati ottenuti permettono di ipotizzare un possibile ruolo dei patogeni parodontali, CMV and Chlamydophila
pneumoniae nell’eziopatogenesi della malattia aterosclerotica.
35
36
Comunicazioni orali
37
CONFRONTO DI DUE SISTEMI MOLECOLARI NELL’IDENTIFICAZIONE DI MYCOBACTERIUM
ULCERANS IN CAMPIONI PROVENIENTI DAL BENIN
Molicotti Paola, Cannas Sara, Ortu Silvia, Cubeddu Marina, Sechi Leonardo A., Zanetti Stefania, Leigheb Giorgio*
Dipartimento di Scienze Biomediche Sezione di Microbiologia Clinica dell’ Università degli studi di Sassari.
* Università degli studi di Novara
L’ulcera del Buruli (BU) o ulcera di Daintree è una malattia infettiva della pelle; è stata descritta per la prima volta nel 1897 in
una regione dell’Uganda, il Buruli e diagnosticata nel 1948 in Australia. É una patologia diffusa prevalentemente in Africa dove
si sono registrati 12.033 casi dal 1978 al 2001.
L’Organizzazione Mondiale della Sanità dopo aver eseguito numerosi studi epidemiologici su questa infezione ha fornito ampia
descrizione sulle caratteristiche cliniche ed indicazioni sulla diagnosi .
L’ulcera del Buruli è una patologia causata dal Mycobacterium ulcerans ed è la terza infezione micobatterica più comune dopo la
tubercolosi e la lebbra. La patologia si manifesta con noduli, papule, placche o edema non dolorosi che evolvono in ulcere che spesso portano a sequele invalidanti se non viene adeguatamente trattata. La malattia è presente principalmente nelle aree tropicali; colpisce senza distinzione di razza a qualsiasi età, con prevalenza nei ragazzi al di sotto dei 15 anni. La diagnosi viene effettuata principalmente sulla base clinica; la diagnosi microbiologica risulta problematica per i lunghi tempi di crescita del Mycobacterium ulcerans rendendone difficile l’isolamento per tale motivo l’analisi molecolare è il mezzo di indagine più immediato.
Scopo del lavoro: valutare la diversa specificità della PCR IS2606 e della Nested PCR IS2404 nell’identificazione del
Mycobacterium ulcerans.
Materiali e metodi: sono stati analizzati 126 campioni provenienti dal Benin per l’identificazione molecolare di M. ulcerans
con la PCR IS2606 e con la Nested PCR IS2404. I campioni erano così suddivisi: 64 biopsie umane, 42 mosquitoes e 20 campioni che comprendono diversi organismi (cimici, crostacei, ecc.), tutti potenziali vettori della malattia.
Risultati: con la Nested PCR IS2404 sono risultati positivi in totale 19 campioni così distribuiti: 18 biopsie (28%) e 1 cimice
(5%); con la PCR IS2606 26 campioni totali così ripartiti: 4 mosquitoes (9.5%) e 22 biopsie (34.4%).
Il sequenziamento di tutti gli ampliconi ha confermato l’identificazione di 17 ceppi risultati positivi ad entrambe le PCR mentre i 9 amplificati ottenuti solo con la IS2606 sono risultati essere aspecifici. L’analisi delle sequenze dei 17 ceppi di M. ulcerans identificati non ha evidenziato mutazioni ceppo specifiche.
Conclusioni: i risultati ottenuti, indicano una sensibilità paragonabile delle due PCR ma una maggiore specificità della Nested
PCR IS2404 rispetto alla PCR IS2606 nella diagnosi del M. ulcerans.
EPIDEMIOLOGIA DELLE INFEZIONI DA E. histolytica E DA E. dispar IN UN’AREA NON ENDEMICA
(PARMA, ITALIA) NEL PERIODO 2003-2006.
Obiettivo. L’impossibilità di differenziare morfologicamente Entamoeba histolytica (Eh), agente eziologico di amebiasi, da
Entamoeba dispar (Ed), non patogena, ha indotto l’Organizzazione Mondiale della Sanità a raccomandare fortemente un’accurata revisione dei dati di prevalenza di tali infezioni utilizzando metodi in grado di differenziare le due specie.
Nel presente studio riportiamo i casi di amebiasi e di infezione da Ed diagnosticati nel nostro laboratorio (Sezione di
Microbiologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma) nel periodo 2003-2006 mediante metodi molecolari (PCR convenzionale e real-time) affiancati a quelli tradizionali.
Materiali e Metodi. Campioni di feci (7281) e/o liquido aspirato da ascesso epatico (7) (appartenenti a 5322 pazienti con
sospetta parassitosi intestinale) sono stati sottoposti ad esame macroscopico, microscopico ed esame colturale per protozoi e
nematodi intestinali. Dai campioni (511) appartenenti a pazienti (306) che presentavano sospetto clinico e/o fattori di rischio per
amebiasi o nei quali l’esame microscopico aveva evidenziato la presenza di strutture di morfologia riferibile a Eh/Ed o di parassiti intestinali a trasmissione fecale-orale, è stato inoltre estratto il DNA e sottoposto a PCR (convenzionale e/o real-time) per
l’identificazione di E. histolytica e E. dispar.
Risultati. Nel periodo 2003-2006 sono stati diagnosticati nel nostro laboratorio 22 casi (7.2%) di infezione da Ed e 8 (2.6%) di
amebiasi (5 casi di amebiasi extraintestinale e 3 di amebiasi intestinale; 5 con amebiasi importata da aree di endemicità e 3 con
infezione acquisita in Italia).
Conclusioni. L’applicazione dei saggi di PCR, affiancati ai metodi tradizionali, si è rivelata indispensabile per una diagnosi
accurata consentendo di instaurare prontamente una terapia mirata nei 5 pazienti con amebiasi extraintestinale, evitando un
decorso clinico infausto. I saggi di PCR si sono rivelati più sensibili e specifici dei metodi tradizionali: in mancanza dei saggi
molecolari, 4 degli 8 casi di amebiasi non sarebbero stati diagnosticati poiché negativi alle indagini tradizionali. Pertanto, sebbene rara, la presenza di infezioni da Eh in un’area non endemica per amebiasi quale l’Italia enfatizza la necessità per il nostro
Paese di laboratori di parassitologia dotati di adeguati saggi diagnostici molecolari. Inoltre, i saggi di PCR si sono dimostrati
utili per ottenere informazioni riguardanti l’epidemiologia delle infezioni da E. histolytica nella nostra area, permettendoci di
comprendere come l’amebiasi non sia limitata a soggetti immigrati, adottati o che abbiano viaggiato in zone endemiche, ma sia
presente anche in italiani apparentemente privi di fattori di rischio.
38
L’IMPATTO DELL’INFEZIONE DA SPIROCHETE INTESTINALI A CONFRONTO CON LE INFEZIONI SOSTENUTE DA ALTRI AGENTI ENTEROPATOGENI IN UNA POPOLAZIONE SELEZIONATA NELL’AREA DI PARMA
Obiettivo. La colonizzazione della mucosa intestinale umana da Brachyspira aalborgi e Brachyspira pilosicoli è nota come
Spirochetosi Intestinale (SI). Ad oggi, sono disponibili pochi dati riguardanti l’epidemiologia della SI. Il presente studio riporta i casi di SI diagnosticati nel nostro laboratorio (Sez. di Microbiologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma) negli
ultimi 5 anni in una popolazione selezionata per sintomi e fattori di rischio, a confronto con i casi di infezione da altri agenti
enteropatogeni.
Materiali e Metodi. Sono stati analizzati 241 campioni appartenenti a 234 pazienti con sintomi gastrointestinali ad eziologia
sconosciuta: di 225 pazienti erano disponibili campioni di feci e per 7 di questi pazienti anche numerose biopsie coliche; per 2
pazienti erano disponibili solo biopsie coliche. Il DNA estratto dai campioni è stato sottoposto ad un saggio RFLP-PCR avente
come bersaglio il 16SrDNA di spirochete intestinali umane. I campioni positivi alla PCR sono stati utilizzati per l’isolamento
delle brachyspire in terreno selettivo BAM-SR. Sugli stessi campioni sono state condotte indagini microbiologiche e virologiche per la ricerca di agenti di infezioni gastrointestinali.
Risultati. Sono stati identificati mediante RFLP-PCR 16 casi (5 bambini e 11 adulti) di infezione da Brachyspira spp.: 11 da B.
aalborgi, 3 da B. pilosicoli e 2 da B. aalborgi + B. pilosicoli. Sono stati inoltre identificati 10 pazienti con infezioni da virus
gastroenterici (4.2%), 13 con infezioni da batteri enteropatogeni diversi da spirochete (5.5%), e 24 con infezioni da parassiti
intestinali (10.2%).
Conclusioni. Nei casi descritti, la terapia con metronidazolo ha eradicato l’infezione e risolto i sintomi. Il presente studio ha
fornito informazioni sulla distribuzione delle spirochete nella popolazione analizzata suggerendo come la SI possa essere più
frequente di quanto sospettato e spesso non diagnosticata poiché si presenta con una sintomatologia aspecifica. La SI dovrebbe
pertanto essere considerata nella diagnosi differenziale quando il paziente riferisca sintomi gastrointestinali, in particolare diarrea di lunga durata. Inoltre, il saggio 16SrDNA RFLP-PCR si è rivelato uno strumento adeguato non solo a scopo diagnostico
ma anche a scopo epidemiologico, richiedendo per la sua esecuzione la raccolta di soli campioni di feci ed evitando al paziente procedure diagnostiche invasive.
DIMINUITA SENSIBILITÀ ALLA PENICILLINA IN CEPPI DI NEISSERIA MENINGITIDIS ISOLATI
IN ITALIA
Cecilia Fazio*, Paola Stefanelli, Arianna Neri, Stefania Starnino, Paola Mastrantonio.
Dipartimento Malattie Infettive, Parassitarie ed Immunomediate Istituto Superiore di Sanità, Roma
I dati raccolti dal Sistema di Sorveglianza Nazionale per le Meningiti Batteriche indicano che in Italia l’incidenza media annua
di meningite meningococcica si mantiene su valori costanti, con 0,3-0,4 casi ogni 100.000 abitanti. Tuttavia, la percentuale di
ceppi di Neisseria meningitidis con diminuita sensibilità alla penicillina (PenI, Minimal Inhibent Concentration >0,094mg/L)
è quasi raddoppiata dal 2002 al 2006, passando dal 24% al 40% del totale degli isolati clinici. Numerosi studi hanno messo in
evidenza la correlazione tra valori di MIC per la penicillina superiori o uguali a 0,094mg/L e la presenza di mosaicismo nel gene
penA, codificante per le Penicillin Binding Protein (PBP) di classe 2, dovuto a traslocazioni di frammenti di DNA dello stesso
gene provenienti da altre specie di Neisseriae commensali, normalmente presenti nel tratto nasofaringeo umano.
In questo studio sono stati esaminati 127 ceppi di N. meningitidis PenI isolati tra il 2002 e il 2006 nel nostro Paese allo scopo
di correlare nel tempo la presenza di mosaicismo nel gene penA con determinati fenotipi e genotipi evidenziati nei ceppi in
esame.
Per la definizione del fenotipo, sono stati identificati il sierogruppo capsulare, il sierotipo/sottotipo proteico e la MIC alla penicillina di ogni ceppo. Per la determinazione del genotipo, la MultiLocusSequenceTyping (MLST), l’analisi di sequenza del gene
penA e la definizione dell’allele penA presente in ciascun isolato clinico sono state ottenute utilizzando il sito www.neisseria.org.
Dallo studio è emersa una graduale diminuzione dei cloni precedentemente descritti come predominanti nel 2002 e nel 2004,
ovvero i ceppi con fenotipo C:2b:P1.5 e C:2b:P1.5,2, appartenenti all’ ST8-Complex/Cluster A4. Parallelamente si è osservato
un recente aumento di ceppi PenI nei sierogruppi B e Y, appartenenti a differenti clonal complex. Con l’analisi della sequenza
dell’intero gene penA sono state individuate 19 varianti geniche, comprendenti 14 diversi alleli. Oltre all’allele 12 presente in
tutti i ceppi appartenenti all’ ST8-Complex/Cluster A4, tranne uno, gli alleli 14, 9 e 20 sono risultati i più frequenti tra ceppi
appartenenti a diversi fenotipi e genotipi.
I ceppi di meningococco PenI circolanti al momento in Italia sono caratterizzati da una maggiore eterogeneità molecolare rispetto ai ceppi PenI isolati negli anni precedenti.
39
ASPETTI MOLECOLARI DEI LINFOMI MALT HCV-ASSOCIATI
M. Libra1, G. Malaponte1, P. Merito1, G. Pappalardo1, P. Gangemi2, F. Nicoletti1, M.C. Mazzarino1, F. Stivala1
1Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Catania; 2Divisione di Anatomia Patologica, Ospedale Vittorio Emanuele,
Catania
L’infezione da virus dell’epatite C (HCV) è associata alla Sindrome della crioglobulinemia mista di tipo II (MC) e allo sviluppo di Linfomi Non-Hodgkin B (NHL). I meccanismi responsabili per lo sviluppo dei disordini linfoproliferativi tra i pazienti
HCV positivi rimangono a tutt’oggi poco chiari.
In questi ultimi anni si è consolidata l’ipotesi che la stimolazione cronica delle cellule B, da parte degli antigeni associati al virus
C, causa dapprima l’espansione di cellule B non maligne, cui può seguire l’evoluzione verso NHL. In questo contesto numerose alterazioni geniche sono state osservate fra cui la traslocazione t(14;18)(IgH/Bcl-2). Questo tipo di alterazione è stata osservata nei PBMC di pazienti HCV+ con MC. Nostri precedenti studi hanno riferito che tale tipo di traslocazione era osservata nel
tessuto neoplastico di pazienti HCV+ con NHL ad istotipo vario tra cui MALT. Tuttavia il meccanismo patogenetico con cui
questo evento si verifica rimane ancora oggi poco chiaro; probabilmente oltre a questo tipo di traslocazione, altre alterazioni
geniche possono essere responsabili ed essere coinvolte nella patogenesi dei linfomi MALT HCV-associati.
Nel presente studio 48 campioni consecutivi di linfomi MALT (23 pz HCV- e 5 HCV+) sono stati analizzati per la suddetta traslocazione. Questa anomalia genetica è stata evidenziata in 2 casi di linfoma MALT in pazienti HCV+. L’analisi della sequenza
nucleotidica della traslocazione t(14;18) rivelava che Bcl-2 era giunto a JH6 in ciascun paziente. L’analisi di sequenza dei geni
Ig in questi due pazienti con linfoma MALT rivela che le combinazioni dei geni delle catene pesanti erano quelli comunemente associate con i linfomi a cellule B in pazienti infettati da HCV. Particolarmente speculativo il fatto che tutti i campioni che
presentavano la traslocazione t(14;18) (Ig H; Bcl-2) presentavano la mutazione di Bcl-6 all’interno dei motivi RGWY. È noto
che il protooncogene Bcl-6 è un target delle ipermutazioni somatiche nei centri germinativi delle cellule B; esso è inoltre un
repressore trascrizionale che regola la maturazione delle stesse cellule B. Le mutazioni di Bcl-6 indicano che le cellule B sono
transitate nei centri germinativi (GC).
I dati del presente studio suggeriscono che la concomitanza della traslocazione t(14;18) (Ig H; Bcl-2) con le mutazioni di Bcl6 può contribuire allo sviluppo dei linfomi HCV associati nel sottotipo MALT post-centro germinativo.
ESPRESSIONE E FUNZIONALITA’ DEI TLR NELLE CELLULE ENDOTELIALI LINFATICHE
UMANE
Emirena Garrafa, Alberto Prandini, Edoardo Cervi°, Stefano Bonardelli°, Stefano M.Giulini° and Arnaldo Caruso.
Istituto di Microbiologia, Università degli Studi di Brescia. °: Clinica Chirurgica, Università degli Studi di Brescia
Il sistema immunitario innato è un meccanismo universale di difesa contro le infezioni. Funziona grazie alla presenza di recettori particolari: i Toll Like Receptor (TLR) che riconoscono strutture microbiche altamente conservate dette PAMPs grazie ai
quali l’organismo umano è in grado di discriminare tra antigeni self e non self. I TLR giocano un ruolo fondamentale nel riconoscimento di un antigene non self e nell’induzione di una risposta immunitaria. Le cellule del sistema immunitario (macrofagi, cellule dendritiche, eosinofili, neutrofili, linfociti B), cellule epiteliali, cellule vascolari ematiche, cardiomiociti e adipociti
riconoscono i patogeni attraverso la via dei TLR inducendo produzione di chemochine, citochine, aumentata espressione di
molecole costimolatorie.
Non è stata ad oggi indagata espressione e funzionalità dei TLR delle cellule endoteliali linfatiche umane (LECs). In questo
lavoro descriviamo per la prima volta che LECs esprimono costitutivamente mRNA dei TLR1, 2, 3, 4, 6 e 9 ma non dei TLR5,
7, 8 e 10. La stimolazione delle LECs con i diversi ligandi determina una diversa risposta in termini di secrezione di citochine
e chemochine e di attivazione di molecole di superficie. Solo gli agonisti dei TLR 3 e 4 sono in grado di indurre secrezione di
Rantes e IL-6, mentre lo stimolo con gli agonisti dei TLR costitutivamente espressi induce, in misura diversa, la secrezione di
IL-8 e di MCP-1 ad eccezione della stimolazione con l’agonista per il TLR 2 che, pur non inducendo alcuna modificazione delle
citochine e delle chemochine analizzate comporta una modificazione di alcuni marcatori di attivazione quali CD62E e CD86.
Insieme, questi dati sottolineano un ruolo importante delle LECs nell’immunità innata come evidenziato dalla diversa espressione dei TLR e dalla differente risposta a seguito dello stimolo analizzato.
40
IMPLICAZIONI MICROBIOLOGICHE NELL’ETIOLOGIA E NEL TRATTAMENTO DI MUCOSITI E
PERIMPLATITI
S. Pappalardo*
*: Prof.ssa Sabrina Pappalardo – Professore Associato – Insegnamenti: orso Integrato di Terapia Odontostomatologica e di
Malattie Odontostomatologiche.
Dipartimento di specialità Medico-Chirurgiche. Sezione di Odontostomatologia 2. AOU Policlinico “Gaspare Rodolico”,
Catania. Università degli studi di Catania.
I tessuti di sostegno che circondano gli impianti osteointegrati, così come i tessuti parodontali, possono essere soggetti a processi flogistici. Le patologie che interessano i tessuti perimplantari, sono distinte in mucositi e perimplantiti. Questi processi
patologici sono assimilabili alla malattia parodontale (gengiviti e parodontiti). La mucosite è, infatti, un processo infiammatorio reversibile dei tessuti molli perimplantari, mentre la perimplantite è un processo flogistico irreversibile che colpisce, oltre ai
tessuti molli, anche le strutture di supporto profonde, causando riassorbimento osseo.
Dagli studi in letteratura effettuati fino ad oggi, si evince che l’unica causa di insorgenza della malattia perimplantare, è di origine infettiva.
REGOLAZIONE EPIGENETICA IN Candida albicans : POTENZIALE TARGET PER STRATEGIE
TERAPEUTICHE INNOVATIVE
Giovanna Simonetti1, Claudio Passariello1, Noemi Di Vincenzo1, Antonello Mai2 , Enrico Garaci3, Anna Teresa Palamara1
1Dip. Scienze di Sanità Pubblica “G.Sanarelli”, 2Dip. Studi Farmaceutici “Sapienza”, Università di Roma, 3Dip. Medicina
Sperimentale, Università di Roma Tor Vergata
In condizioni ambientali variabili o in circostanze fisiologiche particolari, che richiedono un repentino cambiamento delle condizioni metaboliche, Candida albicans può modificare velocemente lo stato trascrizionale dei geni, tramite meccanismi epigenetici. Questa variabilità si manifesta con lo switching fenotipico, la germinazione e la capacità di acquisire resistenza agli antifungini. Alcuni dati, ottenuti in precedenza nel nostro laboratorio, hanno dimostrato che la modulazione epigenetica in Candida
albicans, ottenuta attraverso l’utilizzo di inibitori delle istone deacetilasi (HDACi), determina inibizione dell’acquisizione di
resistenza indotta in vitro dal fluconazolo, della germinazione indotta da siero e dell’adesione a cellule epiteliali. E’ stata dimostrata, inoltre, una implicazione di istone metiltrasferasi (HMT) sulla virulenza. Sulla base di queste premesse, è stata valutata
in vitro, in Candida albicans, l’azione di HDACi, con attività selettiva sulle diverse classi di deacetilasi umane e l’attivita di
HMTi, sull’induzione di resistenza al fluconazolo e sulla formazione di tubi germinativi.
I risultati ottenuti mostrano una diversa attività degli HDACi da noi testati. In particolare, inibitori di HDAC di classe II umana
(HDA1 di lievito) causano una inibizione dell’induzione di resistenza in vitro indotta in breve tempo. Al contrario inibitori selettivi di HDAC4 umana e di HDAC di classe I umana (RPD3 di lievito) non hanno dato risultati significativi. Inoltre gli HMTi
testati hanno mostrato inibire la germinazione indotta da siero e la resistenza indotta dal fluconazolo in vitro.
Nello studio dei meccanismi molecolari coinvolti nelle attività biologiche abbiamo evidenziato una una iperacetilazione di
Hsp90. Questa potrebbe inibire il legame con la subunità catalitica della calcineurina necessaria per l’attivazione della cascata
coinvolta nell’acquisizione di tolleranza a stress ambientali e di resistenza ai farmaci antifungini.
In conclusione, la regolazione dello stato epigenetico potrebbe contribuire alla versatilità di Candida albicans permettendo di
regolare processi importanti per la patogenesi di infezioni opportunistiche.
41
PORINA P2 DI HAEMOPHILUS INFLUENZAE DI TIPO B: CORRELAZIONE STRUTTURA-FUNZIONE
Mariateresa Vitiello, Marina D’Isanto, Emiliana Finamore, Katia Raieta, Maria Grazia Pisciotta, Marilena Galdiero
Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sez. di Microbiologia e Microbiologia Clinica, Facolta’ di Medicina e Chirurgia,
Seconda Università degli Studi di Napoli
La componente proteica della membrana esterna dei batteri gram-negativi consiste di circa 20 proteine antigenicamente distinte, definite outer membrane proteins (OMPs). Oltre al ruolo strutturale, le OMPs possiedono altre funzioni tra cui quelle di trasporto e pertanto vengono suddivise in permeasi e porine. Negli ultimi anni abbiamo dimostrato che le porine giocano un ruolo
fondamentale nella comunicazione tra il batterio e l’ambiente circostante. In particolare, nell’interazione con l’ospite, le porine
assumono un ruolo importante nella patogenesi delle infezioni batteriche poichè coinvolte nei processi di aderenza ed invasione attivando la risposta infiammatoria ed immunologica. Recenti studi hanno proposto che la capacità dei batteri gram-negativi
di causare ricorrenti infezioni possa essere attribuita alla variabilità antigenica dei loop esposti in superficie delle OMPs.
La porina P2 di Haemophilus influenzae di tipo b (Hib) è una delle porine meglio caratterizzate dal punto di vista funzionale.
L’analisi delle sequenze geniche della porina P2 mostra come le regioni transmembrana sono relativamente conservate tra i vari
ceppi di Hib, mentre esiste una considerevole eterogenicità nelle regioni dei loop esposti in superficie. I dati ottenuti, in accordo con il modello tridimensionale della porina P2 di Hib da noi realizzato, ci hanno fornito importanti informazioni sulle
sequenze amminoacidiche principalmente coinvolte nell’interazione con la cellula ospite.
STUDIO MOLECOLARE DELLE VARIANTI FARMACO-RESISTENTI PRESENTI NEL PLASMA E
NEI LINFOMONOCITI DI INDIVIDUI HIV-1 INFETTI NON SOTTOPOSTI A TRATTAMENTO ANTIRETROVIRALE
Isabella Bona, Federica Alessandrinia, Elisa De Crignisa, Marco Borderib, Roberta Gorinia, Davide Gibellinia, Maria Carla Rea
Sezione di Microbiologiaa e Sezione di Malattie Infettiveb, Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale,
Università di Bologna - Via Massarenti, 9 - 40138 Bologna
Introduzione: lo studio delle mutazioni conferenti farmacoresistenza è una realtà accettata nei soggetti infetti da virus dell’immunodeficienza acquisita di tipo 1 (HIV-1) in fallimento terapeutico, ma l’utilità applicativa di tale approccio in soggetti naive
con infezione acuta e cronica è ancora dibattuta. I test commerciali a disposizione prevedono di effettuare l’analisi genotipica
sul plasma, non tenendo in considerazione la capacità del virus di entrare in latenza, sin dai primi stadi dell’infezione, nei cosiddetti reservoirs virali, dove eventuali ceppi virali mutati possono perdurare per molti anni. A tale scopo, abbiamo studiato la presenza di mutazioni genomiche virali nel distretto plasmatico e intracellulare di alcuni soggetti HIV-1 infetti, in assenza di trattamento farmacologico, al fine di valutare il significato delle mutazioni eventualmente presenti nei due compartimenti (plasma
e PBMCs).
Metodi: sono stati analizzati i profili di resistenza e suscettibilità farmacologica nel plasma e nei PBMCs di 56 soggetti HIV-1
sieropositivi naive con infezione acuta o cronica utilizzando il kit TRUGENE HIV-1 GENOTYPING (Siemens).
Risultati: il sequenziamento diretto delle regioni PR e RT ha mostrato nel 73% dei casi un profilo genetico sovrapponibile nei
due comparti, con la presenza di virus wild type nella maggior parte dei campioni. D’altro canto è stato possibile mettere in evidenza nel rimanente 27% dei casi la presenza di mutazioni chiave conferenti farmacoresistenza esclusivamente nel comparto
intracellulare, a fronte della rilevazione di un virus plasmatico sensibile.
Conclusioni: Pur confermando l’importanza dell’esecuzione del test di farmacoresistenza prima di iniziare un trattamento antivirale, l’analisi convenzionale eseguita solo su plasma non consente una valutazione delle mutazioni presenti a livello del virus
cellula- associato. La possibilità di verificare mutazioni “archiviate” a livello cellulare rappresenta –a nostro avviso- un passo
importante per un corretto ed efficace monitoraggio farmacologico, sebbene l’applicazione di un test di resistenza anche sul
DNA provirale possa determinare un aumento dei costi e dei tempi di esecuzione dell’indagine.
42
LA PROTEINA DI MATRICE P17 DI HIV-1 INDUCE LE CELLULE DENDRITICHE PLASMACITOIDI
AD ACQUISIRE UN FENOTIPO MIGRATORIO IMMATURO
Simona Fiorentini1, Elena Riboldi2, Manuela Avolio1, Fabio Facchetti3, Stefania Marsico4, Silvano Sozzani2, Arnaldo Caruso1
Università di Brescia, 1Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata Sezione di Microbiologia, 2Dipartimento di
Biotecnologie Sezione di Immunologia, 3Sezione di Anatomia Patologica; 4Università della Calabria, Dipartimento FarmacoBiologico, Sezione di Microbiologia
Difetti numerici e funzionali delle cellule dendritiche plasmacitoidi (pDCs) caratterizzano la progressione dell’infezione da
HIV-1. L’origine di queste alterazioni rimane però al momento non completamente chiarita. La proteina di matrice p17 di HIV1 è capace di modulare molteplici risposte cellulari e la sua attività biologica dipende dall’espressione sulla superficie delle cellule di un recettore specifico (p17R). Nel nostro studio abbiamo dimostrato che le cellule pDCs circolanti esprimono p17Rs sulla
loro superficie e che cellule isolate da sangue periferico sono sensibili all’azione biologica di p17. Infatti, a seguito del trattamento con la proteina virale, le pDCs vanno incontro ad una differenziazione fenotipica caratterizzata dall’espressione del recettore chemochinico CCR7. Saggi di chemotassi hanno permesso di dimostrare che le cellule trattate con p17 divengono capaci
di migrare in risposta a CCL19, il ligando specifico per CCR7. Questi risultati suggeriscono che, a seguito dell’interazione con
p17, le pDCs possano acquisire la capacità di migrare agli organi linfoidi secondari. In contrasto, p17 non induce il rilascio di
interferoni di tipo I né aumenta l’espressione dei tipici marcatori di maturazione delle cellule dendritiche CD80, CD83 o MHC
classe II. L’analisi dell’espressione genica differenziale di pDCs trattate e non con p17 ha indicato che la stimolazione con la
proteina virale diminuisce l’espressione di molecole la cui funzione è critica per mantenere una sintesi proteica efficace così
come per proteggere le cellule dall’apoptosi.
In base ai risultati ottenuti si può proporre un modello in cui p17 può indurre le pDCs circolanti ad esprimere CCR7 aiutando
in questo modo il loro reclutamento, ed un eventuale sequestro, a livello linfonodale. Nel microambiente linfonodale esse sarebbero però alterate nelle loro funzioni, essendo prone all’apoptosi ed incapaci di maturare e di produrre IFN-?. Questi fenomeni
potrebbero quindi svolgere un ruolo importante nello sviluppo dei difetti a carico delle pDCs che si osservano nell’infezione da
HIV-1.
VEICOLAZIONE IN VIVO DELLA GLICOPROTEINA B DEL VIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1 PER
VACCINAZIONE CONTRO LE INFEZIONI ERPETICHE SESSUALMENTE TRASMESSE
1Laura Vannucci, 1Flavia Chiuppesi, 1Giulia Freer, 2Ilaria Volpi 2Carla Peggy Marconi, 2Roberto Manservigi, 1Mauro
Bendinelli e 1Mauro Pistello
1Centro Retrovirus e Sezione Virologia, Dipartimento di Patologia Sperimentale, Università di Pisa; 2Dipartimento di
Medicina Sperimentale e Diagnostica, Università di Ferrara
L’infezione genitale da virus herpes simplex (HSV) è aumentata di oltre il 30% negli ultimi 25 anni e si colloca al quinto posto
tra le infezioni sessualmente trasmesse (STI) più diffuse al mondo. Causata da HSV di tipo-1 (HSV-1) e tipo-2 (HSV-2), l’infezione è persistente e può decorrere in modo asintomatico o causare dolore ricorrente, ulcerazioni ed aumentata suscettibilità ad
altre STI. Il virus è rilasciato periodicamente nel tratto genitale e quindi trasmesso inconsapevolmente a partner sessuali e progenie. Il suo impatto sociale è tale da imporre l’adozione di strategie preventive basate non solo su educazione sessuale, quanto sullo sviluppo di vaccini in grado di proteggere dall’infezione o dalle loro sequele. Sfortunatamente i vaccini ad oggi sviluppati hanno dato risultati modesti probabilmente a causa di una risposta cellulo-mediata poco efficace che, nel caso dei vaccini
anti-HSV, è considerata essenziale.
Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale di terza generazione derivato dal virus dell’immunodeficianza felina in grado di trasdurre in modo stabile ed ad alta efficienza cellule dendritiche e linfociti T murini. Nel vettore e’ stata clonata la glicoproteina
B di HSV-1 (gB1) che per grado di conservazione tra ceppi HSV-1 e cross-reattivita’ con HSV-2 e’ un possibile candidato vaccinale contro entrambi i sierotipi. Il vettore ricombinante, denominato SWII-gB1 e prodotto con un sistema split-component per
minimizzare il rischio che si formino particelle virali infettanti, si è dimostrato in grado di veicolare geni eterologhi in cellule
di varie specie e di esprimere in modo stabile e ad alti livelli sia il gene reporter codificante la green fluorescent protein sia l’immunogeno gB1.
SWII-gB1 inoculato in topi C57BL/6 ha indotto una robusta e duratura risposta cellulo-mediata anti-gB1 ed è in fase di valutazione il livello di protezione conferita mediante sfida per via vaginale con un ceppo HSV-1 virulento.
43
PREVALENZA DEI GENOTIPI DEL VIRUS DELL’EPATITE B NELLA POPOLAZIONE DELLA
SICILIA ORIENTALE
a,cRusso R, a,cPalermo CI, a,cCostanzo CM, a,cZappalà D, a,cVizzini L, bCacopardo B, a,cScalia G
a Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche e bDipartimento di Medicina Interna e Medicina
Specialistica, Istituto di Malattie Infettive, Università di Catania, cU.O. di Virologia Clinica; Laboratorio Centralizzato; cLab.
Echo, U.O. Cardiologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico “Gaspare Rodolico” di Catania.
L’infezione da virus HBV è un importante problema di salute in tutto il mondo. E’ stimato che siano infette diversi milioni di
persone e di queste un numero estremamente rilevante presenta un’infezione cronica.
I soggetti affetti da epatite cronica HBV-correlata hanno un alto rischio di sviluppare carcinoma epatocellulare (HCC), cirrosi o
entrambe. Inoltre molti soggetti infetti sono ignari di essere portatori di tale infezione; tra coloro i quali sono cronicamente infetti, solo una minoranza viene sottoposta ad un follow-up di routine che possa valutare lo stato della loro patologia. La progressione della malattia è influenzata da vari fattori, incluso il genotipo virale.
Il virus è stato classificato secondo 8 genotipi (A-H) basati sulla differenza delle sequenze nucleotidiche. La maggior parte dei
genotipi ha distribuzioni geografiche specifiche: i genotipi A e D hanno maggiore frequenza relativa in Europa e Nord America,
i genotipi B e C in Asia ed Oceania.
Dati recenti suggeriscono che la terapia antivirale può ridurre il rischio di progressione della malattia. E’ stato studiato l’impatto dei genotipi di HBV sulla risposta alla terapia ed è descritta una minore possibilità di risposta favorevole all’IFN-? dei genotipi D e C rispetto ai genotipi A e B. La determinazione del genotipo di HBV potrebbe, quindi, essere utile nel predire l’andamento della risposta alla terapia antivirale nei pazienti con epatite cronica.
Nel nostro studio abbiamo preso in considerazione un campione di popolazione residente in Sicilia orientale positivo per DNA
di HBV determinandone i genotipi. Il 79% dei campioni analizzati erano positivi per il genotipo D, mentre il genotipo A era rilevabile nel 15% dei casi. Un siero presentava infezione mista da genotipi D e G ed uno dei campioni evidenziava un genotipo
non classificabile tra quelli previsti.
L’epidemiologia di HBV nel mondo indica il genotipo D come maggiore responsabile di tale infezione nel bacino del
Mediterraneo, dell’Europa orientale e dell’Asia centrale. I nostri risultati confermano che anche nella nostra area geografica tale
genotipo presenta la maggiore frequenza relativa.
PROTECTIVE EFFICACY OF VACCINE PREPARATIONS BASED ON DIFFERENT ADJUVANT
SYSTEMS AND HBV ANTIGENS IN MARMOTA MONAX MODEL
Stefania Catonea, Emilio D’Ugoa, Andrea Canitanoa, Roberto Giuseppettia, Claudio Argentinia, Reinhard Gluckb, Maria
Rapicettaa
aViral Hepatitis Unit, Department of Infectious, Parasitic, and Immune-Mediated Disease, Istituto Superiore di Sanità, Viale
Regina Elena, 00169 Rome, Italy; bBerna Biotech Ltd., Rehhagstrasse 79, CH-3018 Bern, Switzerland
Introduction: Woodchuck Hepatitis B Virus (WHV), the closest genetically related virus of human hepatitis B (HBV) and its
host Marmota monax, constitute a well recognized animal model for the evaluation of immunogenicity and protection level of
HBV vaccines. This work was aimed at evaluating these aspects for an HBV vaccine based on virosomes carrying Core
(HBcAg) and S (HBsAg) antigens and adjuvanted with RC529. The data were compared with the results obtained for a CHOpreS/S vaccine that was able to protect woodchucks from WHV productive infection.
Methods: Six woodchucks, negative for all WHV markers, divided into two groups (first group: w3987, w3992, w3996; second group: w3993, w3995, w3997), were vaccinated with five doses and two different dosages of HBsAg/HBcAg virosomal
preparation. A WHV standard preparation (w197) was applied as challenge virus and injected one month after the last vaccination. A negative woodchuck was used as control. HBV and WHV viral and antibody markers were evaluated before and after
challenge by Real Time PCR and by Immunometric assays.
Results: After vaccination, HBcAb and HBsAb appeared and were present throughout the study period in all animals, except
w3987, with HBsAb levels usually considered protective for humans. After WHV challenge HBeAg positivity was observed in
two (w3987 and w3992) and HBeAb positivity in all animals. The titre of WHV-DNA at the end of the observation period was
6 logs lower than in control (103 copies/ml against 109). These data are partially comparable to those observed for CHOS/PreS/S vaccine. In that study WHV-DNA was negative.
Discussion: The virosomal HBsAg/HBcAg vaccine preparation was able to induce protective HBsAb levels and partially control the infection in WHV/Marmota monax model. From comparison with the results of the application of CHO-S/PreS/S,
HBcAg seems to play a less efficient role in protection from WHV infection.
44
PREVALENCE OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS GENOTYPES IN A COHORT FROM CENTRAL
ITALY
1Svicher Valentina, 2Giuliani Laura, 2Coletti Anna, 2Calugi Graziella, 1,2Perno Carlo Federico, and 2Marco Ciotti.
Laboratorio di Virologia Molecolare, Policlinico Universitario Tor Vergata, Viale Oxford 81, 00133 Roma,. Cattedra di
Virologia, Universita’ di Roma Tor Vergata, Via Montpellier 1, 00133, Roma, Italia
Background: Human papillomavirus (HPV) is the etiological agent of cervical cancer. In Italy we diagnose 3500 new cases of
cervical cancer per year with 1800 deaths a year. Therefore, HPV DNA screening has become a critical assay to identify women
with persistent HPV infection that are at risk of developing high grade cervical lesions which, if left untreated, could progress
to cancer.
Material and methods: Between 2003-2006, we enrolled a cohort of 1284 women attending our gynecological department for
routine Pap-test screening. Of them, 1271 underwent to cervical scraping for HPV-DNA test.
Results: HPV-DNA screening revealed the presence of HPV-DNA in 321/1271 women (25.2%). Among the 321 positive
women, the genotyping assay showed the presence of a single genotype in 252/321 cases (78.5%) and multiple genotypes in
35/321 (11 %) women. Thirty-four women (34/321; 10.5%) were genotyped as having a “high risk” or “low risk” type based on
a PCR genotyping assay previously used in our lab. Some of the identified genotypes recurred in multiple infections with statistic significance, namely: HPV51 (p<0.001), HPV35 (p<0.01), and HPV40 (p<0.05). When the prevalence of the single genotypes was calculated based on the age of the patients, we found that HPV35 and HPV6 significantly occurred in women less
than 25 years old (p<0.03), while HPV53 usually occurred in women more than 45 years old (p<0.03). Furthermore, pairwise
correlation analysis showed that the following genotypes were significantly correlated with each other: HPV70/61, HPV6/35,
HPV68/66 and HPV33/66.
Conclusion: In our cohort we observed a wide distribution of HPV types. Among the high risk types, HPV16 was the most frequently found followed by HPV53, HPV31 and HPV66. The low risk types were mostly represented by HPV6, HPV61 and
HPV11. Future studied are need to elucidate whether the higher prevalence of HPV53 observed in women more than 45 years
old is due to a higher capacity of HPV53 to establish a persistent infection compared to other oncogenic types in the population of women object of our study.
UPREGULATION OF INTERFERON INDUCED GENES IN INFANTS WITH VIRUS-ASSOCIATED
ACUTE BRONCHIOLITIS
Carolina Scagnolari1, Simona Trombetti1, Alessandra Pierangeli1, Simona Cicetti1, Carla Selvaggi1, Silvia Antonelli1,
Rosanna Grossi2, Paola Di Marco1, Fabio Midulla2, and Guido Antonelli1.
1 Department of Experimental Medicine, Virology Section, “Sapienza” University of Rome;
2 Pediatric Department, “Sapienza” University of Rome;
To determine whether there is an airway IFN response in infants with acute bronchiolitis and to establish whether the rate of
such a response is related to the severity of illness, the expression of some IFN-induced genes was measured in nasopharyngeal washes from 39 infants with acute bronchiolitis. The results indicate that in infants with a virus-associated acute bronchiolitis there is a strong activation of IFN system and that the severity of illness is inversely related to the level of expression of
IFN-induced genes. This suggests that the IFN response plays an important role in determining virus–associated respiratory disease in early life.
45
RILEVAZIONE DI LEGIONELLA SPP. E LEGIONELLA PNEUMOPHILA IN CAMPIONI AMBIENTALI CON UNA METODICA IN PCR REAL-TIME
M. Vinci, R. Puccio, T. Lo Russo, A. Giancotti, A. Quirino, A. G. Lamberti, G. Barreca, R. Capicotto, M. C. Liberto, G. Matera,
A. Focà.
Centro Regionale per la Diagnostica delle Legionellosi – U.O. Microbiologia Clinica, Policlinico Universitario “Mater
Domini”, Università “Magna Graecia”, Catanzaro
La legionellosi è una malattia infettiva ad espressività clinica variabile causata da Legionella spp, batterio gram-negativo aerobio ubiquitario negli ambienti acquatici naturali, capace di colonizzare gli impianti idrici di singoli edifici e delle comunità. Per
tale motivo, le infezioni da esso causate, sono considerate un problema emergente in Sanità Pubblica, tanto da dover richiedere
un costante monitoraggio. Scopo di questo studio è stato quello di mettere a punto un test di PCR in real-time, per la rilevazione di Legionella spp. e di Legionella pneumophila in campioni ambientali, migliorativo rispetto al metodo colturale che attualmente rappresenta la tecnica di elezione per la determinazione di tale microrganismo. Cinquecentoventi campioni ambientali
provenienti da 4 differenti siti: hotel, aeroporti, case di cura e presidi ospedalieri, sono stati analizzati presso l’U.O. di
Microbiologia Clinica, Università degli Studi “Magna Graecia”di Catanzaro (Centro Regionale per la Diagnosi di Legionellosi
per la Calabria), in un periodo compreso tra gennaio 2006 e luglio 2007. I campioni dopo filtrazione venivano analizzati mediante tecniche colturali e molecolari. Per valutare la presenza dei geni di Legionella genere-specifico (16S rRNA) e specie-specifico (mip) in PCR real-time, è stato utilizzato il SYBR Green in associazione al LightCycler (Roche Diagnostics, Italy). I risultati ottenuti dopo filtrazione del campione ed estrazione automatizzata del DNA, mostravano un aumento della sensibilità del
metodo molecolare del 4.8% rispetto al metodo colturale. Considerando che uno screening analitico su campioni ambientali è
indispensabile per prevenire la diffusione del microrganismo e l’incidenza di casi clinici di Legionellosi, possiamo concludere
che l’associazione delle due metodiche da noi utilizzate consente una ottimizzazione delle procedure sia qualitative che quantitative, consentendo di rilevare la Legionella in campioni ambientali, riducendo inoltre i tempi di esecuzione e di refertazione.
RISPOSTE IMMUNITARIE TH2 E TREG ATIPICHE DURANTE INFEZIONI DA ASCARIS LUMBRICOIDES NELL’UOMO
G. Matera1, A. Giancotti1, S. Scalise1, M.C. Pulicari1, R. Maselli2, C. Piizzi2, G. Pelaia2, V. Tancrè1, L.A. Rametti1, P. Doldo3,
V. Cosco3, P. Cosimo3, R. Capicotto1, A. Quirino1, M.C. Liberto1, A. Focà1
1Cattedra di Microbiologia, 2Cattedra di Pneumologia, 3Cattedra di Gastroenterologia, Università “Magna Græcia”,
Catanzaro.
Ascaris lumbricoides è uno dei più frequenti parassiti metazoi che infestano l’uomo e l’ascaridiasi raggiunge una prevalenza di
circa 1472 milioni di casi al mondo con una mortalità di 20.000 casi all’anno. Nel ciclo biologico di Ascaris lumbricoides si
possono evidenziare coinvolgimenti dell’apparato respiratorio e digerente. La risposta dell’immunità acquisita agli elminti è
caratterizzata da una cascata patogenetica di tipo Th2 con produzione di IL-4, IL-5, ed incremento di IgE e di eosinofili, simile
a quella generata da malattie atopiche, ma coordinata anche da cellule Th1 e Treg e da citochine ad esse correlate (TNFa, IFNg,
IL-10 e TFGb). Scopo del presente studio è quello di valutare variazioni dei parametri allergici ed infiammatori in pazienti infettati da Ascaris. I soggetti arruolati nello studio sono stati divisi in 3 gruppi sperimentali: Controlli Negativi (CN), Pazienti
Sieropositivi non infetti (PS) e Pazienti Infetti (PI), ed includevano individui ricoverati presso le Unità Operative di
Pneumologia e di Gastroenterologia del Policlinico Universitario MaterDomini di Catanzaro dal Gennaio 2000 al Gennaio 2007.
Campioni di sangue venoso periferico sono stati testati per il dosaggio di IL-4, IL-10, IFN-g, IgE totali, IgE anti-Ascaris, e per
la conta degli eosinofili e di alcune sottopopolazioni linfocitarie. E’ stato osservato un significativo decremento delle IgE totali
e di quelle specifiche anti-Ascaris nei pazienti infetti rispetto a quelli sieropositivi, così come un incremento dei livelli sierici di
IL-4 rispetto ai soggetti sieropositivi ed al gruppo controllo. Inaspettatamente, i livelli di IL-10 erano ridotti rispetto ai controlli, sia nel gruppo degli individui sieropositivi che in quello degli infetti, mentre IFN-g era significatamene diminuito solo nel
gruppo degli infetti. L’incremento delle cellule CD25+ era registrato solo negli infetti e non era presente alterazione percentuale
delle cellule CD20+, CD56+, CD69+ e del rapporto CD4+/CD8+ in alcun gruppo sperimentale. La mancata correlazione tra i
livelli di IL-10 e IL-4 potrebbe essere dovuta ad una modulazione a livello recettoriale. I dati ottenuti suggeriscono un possibile
meccanismo di “escape” immunologico attuato dall’elminta nei confronti della risposta effettrice dell’ospite.
46
MODULAZIONE DELL’APOPTOSI NF-KB-DIPENDENTE DA PARTE DELL’INIBITORE NUCLEOSIDICO DELLA RT AZIDOTIMIDINA
Claudia Matteucci1,2, Emanuela Balestrieri1, Antonella Minutolo1, Arianna Ascolani3, Michela Ascolani3, Beatrice Macchi3,4,
Antonio Mastino5
1Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche e 3Dipartimento di Neuroscienze, Università di Roma “Tor
Vergata”, Roma; 2Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Roma; 4IRCCS,
S.Lucia, Roma; 5Dipartimento di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari, Università di Messina, Messina.
E’ ben noto che l’inibitore nucleosidico della trascrittasi inversa (RT) 3’-azido-3’-deossitimidina (AZT) svolge un importante
ruolo nel trattamento e la prevenzione dell’infezione da HIV, in combinazione con altri farmaci antiretrovirali. Oltre alla sua
azione antivirale diretta, quale inibitore della RT, l’AZT determina comunque una serie di effetti pleiotropici sulle cellule bersaglio, a cui vanno attribuiti anche gran parte dei suoi effetti tossici. Dati preliminari da noi ottenuti hanno indicato che l’AZT
era in grado di indurre elevati livelli di apoptosi in linee cellulari cronicamente infettate con HTLV-1 quando utilizzata in combinazione con un inibitore farmacologico di NF-kB, ma non se utilizzata da sola. Considerando il complesso ruolo svolto da NFkB nella risposta innata alle infezioni virali, abbiamo voluto ulteriormente approfondire le relazioni tra AZT e NF-kB. I principali risultati possono essere così riassunti: a) PBMC e diverse linee cellulari linfoidi e mieloidi sono risultati piuttosto resistenti all’induzione di apoptosi da parte di sola AZT; la linea monocitoide U937 è risultata relativamente sensibile all’induzione di
apoptosi sintesi-proteica-dipendente da parte di AZT, ed è stata prescelta per gli ulteriori studi; b) l’AZT induceva un’attivazione dose e tempo dipendente della capacità di legame al DNA, p65 mediata, del complesso NF-kB in cellule U937; c) l’analisi
dell’espressione di una serie di geni legati all’apotosi, mediante un sistema di gene-array, rivelava che l’induzione di NF-kB in
cellule U937 era associata all’attivazione trascrizionale di geni sia pro-apoptotici che anti-apoptotici, NF-kB-dipendenti; d) l’inibizione specifica dell’attivazione di NF-kB in cellule U937, mediante trattamento con inibitori farmacologici o trasfezione stabile con IkBa murino dominante-negativo, potenziava sensibilmente l’induzione di apoptosi da parte di AZT. Questi risultati forniscono nuove informazioni riguardanti gli effetti dell’AZT sulla rete dei segnali cellulari coinvolti nella risposta innata alle infezioni che potranno essere molto utili per il suo impiego razionale.
UN COMPONENTE MICROBICO POLISACCARIDICO INDUCE L’APOPTOSI DEI LINFOCITI T VIA
“DEATH RECEPTOR PATHWAY”
Claudia Monari1, Francesca Paganelli1, Francesco Bistoni1, Anna Vecchiarelli1
1Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Sezione di Microbiologia, Università degli Studi di Perugia
Un polisaccaride microbico, il glucuronoxilomannano (GXM), principale componente della capsula del Cryptococcus neoformans, è un potente immunosoppressore. In un precedente lavoro abbiamo dimostrato che il GXM è in grado di inibire le risposte infiammatorie sia in vitro che in vivo. Inoltre il GXM induce l’up-regolazione dell’espressione del Fas Ligand (FasL) sulla
superficie delle cellule mononucleate e mediante tale processo favorisce l’apoptosi delle cellule T che esprimono il Fas.
In questo studio abbiamo valutato i meccanismi coinvolti nell’induzione dell’apoptosi sopra descritta. I risultati ottenuti evidenziano che: i) il legame del FasL con il Fas produce una attivazione della caspasi 8 e della caspasi 9; ii) l’inibizione della
caspasi 8 attenua l’attivazione della caspasi 9, che è successiva e dipendente dalla caspasi 8; iii) la caspasi 8 inizia l’attivazione della via mitocondriale che porta all’ attivazione della caspasi 9; iv) la caspasi 8 e la caspasi 9 attivano per vie indipendenti
la caspasi 3; v) il GXM è in grado di indurre l’apoptosi e l’attivazione della caspasi 8 anche in un modello sperimentale in vivo.
Complessivamente i nostri dati dimostrano che l’apoptosi mediata dal GXM è inducibile anche in un sistema in vivo e che il
meccanismo di attivazione coinvolge un “cross-talk” tra “death receptor pathway” e “mitochondrial pathway”.
47
IL PROGETTO AURORA IN PUGLIA DOPO 6 MESI DI ATTIVITÀ
Montagna MT, De Giglio O, Lovero G, Iatta R, Caggiano G & Gruppo Progetto Aurora *
DIMO, Sez Igiene - Università degli Studi di Bari
* Ceci G e Battista M (BA), Del Gaudio T (Andria), Di Taranto A (FG), Fracchiolla S e Morelli E (TA), Labonia M
(S.G.Rotondo), Lopatriello N (Triggiano), Pizzolante M (LE), Tauro L (Acquaviva), Totaro C (San Severo), Venitucci C
(Bisceglie)
Il Progetto Aurora è uno studio di sorveglianza attiva sulle infezioni fungine invasive (IFI) in Puglia della durata di 12 mesi. Ha
lo scopo di verificare l’incidenza territoriale delle IFI, valutarne l’etiologia per un corretto approccio terapeutico, identificare i
relativi fattori di rischio. A tal fine, sono stati selezionati 22 ospedali comprendenti 21 reparti di Rianimazione, 9 di terapia intensiva neonatale (UTIN), 13 di onco-ematologia (9 per adulti e 4 pediatrici) e 22 laboratori di microbiologia. Per ogni ospedale è
stato indicato un clinico/reparto ed un microbiologo di riferimento.
Tutti i dati dei pazienti arruolati sono inseriti in un data-base tramite scheda elettronica riportante i dati clinici e microbiologici.
Nel periodo febbraio-luglio 2007 sono stati reclutati 61 casi, di cui 60 accertati (91,6% candidemie, 1,6% fungemia da G. capitatum, 5% aspergillomi, 1,6% meningite criptococcica) e 1 di aspergillosi probabile.
Il 39,3% dei casi proviene da Rianimazione, l’11,5% da UTIN, 6,6% da Onco-Ematologia per adulti, il 42,6% da altri reparti
(Malattie dell’Apparato Respiratorio, Chirurgia Generale, Medicina, Malattie Infettive, Oncologia, Neurologia,
Gastroenterologia, Medicia Fisica e Riabilitazione, Nefrologia e Chirurgia Pediatrica).
Gli agenti etiologici di fungemia sono risultati C. albicans (40%), C. parapsilosis (36,4%), C. glabrata (12,7%), C. tropicalis
(3,6%), C. norvegensis (1.8%), C. krusei (1,8%), C. intermedia (1,8%), Geotrichum capitatum (1,8%). Una emocoltura è risultata mista (C.albicans + C.norvegensis)
A. fumigatus è stato isolato nei 3 pazienti con aspergilloma e nel caso di aspergillosi polmonare.
Questo studio permetterà sia di effettuare una valutazione epidemiologica più puntuale sulle IFI in Puglia che di promuovere,
ove necessario, corrette procedure comportamentali e interventi di prevenzione anche in ambito micologico.
POLIMORFISMO ED ESPRESSIONE DEL GENE PPE44 IN ISOLATI CLINICI DI MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
Laura Rindi, Irene Peroni, Nicoletta Lari, Daniela Bonanni, Carlo Garzelli
Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia, Università di Pisa.
Le proteine PPE di Mycobacterium tuberculosis, definite sulla base del motivo aminoacidico Pro-Pro-Glu, costituiscono una
famiglia di 69 proteine polimorfiche ricche in glicina ritenute una probabile fonte di variabilità antigenica del bacillo tubercolare. Nel nostro laboratorio, nell’ambito di ricerche sul ruolo immunologico della proteina PPE44 nell’infezione tubercolare, è
stato studiato l’eventuale polimorfismo e l’espressione del gene ppe44 in isolati clinici rappresentativi delle principali linee filogenetiche di M. tuberculosis. L’analisi PCR-RFLP mediante tre diversi enzimi di restrizione ha mostrato profili di digestione
identici in tutti gli isolati; inoltre, la sequenza nucleotidica del gene ppe44 degli isolati non ha evidenziato mutazioni, ad eccezione di una sostituzione nucleotidica in posizione 581 (TTC?TCC, Phe?Ser) ritrovata unicamente negli isolati di genotipo
Beijing. L’espressione di ppe44 negli isolati clinici, determinata mediante real-time RT-PCR quantitativa, normalizzata rispetto
al gene di riferimento costitutivamente espresso sigA e confrontata con quella del ceppo di riferimento H37Rv, è risultata notevolmente variabile negli isolati clinici, rivelandosi paragonabile a quella di H37Rv in circa il 25% degli isolati, significativamente aumentata nel 60% degli isolati e diminuita nel rimanente 15%; gli isolati di genotipo Beijing hanno mostrato elevati
livelli di espressione di ppe44. Tali risultati dimostrano quindi una sostanziale conservazione del gene ppe44 ed, al tempo stesso, una marcata variabilità dell’espressione di ppe44 tra gli isolati clinici. Per valutare se tale variabilità di espressione sia potenzialmente in grado di influenzare la risposta immunitaria dell’ospite, è stata determinata la risposta anticorpale anti-PPE44 in
pazienti con tubercolosi in atto ed in soggetti sani con infezione tubercolare latente. E’ stata così dimostrata un’ampia variabilità nella risposta immunitaria verso PPE44 in pazienti con infezione tubercolare sia per quanto riguarda i titoli anticorpali, sia
per quanto riguarda la proporzione dei soggetti rispondenti. Tali risultati suggeriscono che l’espressione differenziale dei geni
ppe possa costituire una fonte di variabilità antigenica che può quindi avere implicazioni nella immunopatogenesi della tubercolosi.
48
IMMUNOGENICITA’ E ATTIVITA’ PROTETTIVA DELLA PROTEINA PPE44 (Rv2770c) DI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN MODELLI MURINI
Laura Rindi1, Marta Romano2, Daniela Bonanni1, Nicoletta Lari1, Kris Huygen2, Carlo Garzelli1
1Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia, Università di Pisa, Pisa.
2Mycobacterial Immunology, Pasteur Institute, Brussels, Belgium.
Il genoma di Mycobacterium tuberculosis codifica per 69 proteine polimorfiche definite PPE sulla base del motivo aminoacidico Pro-Pro-Glu; il ruolo delle proteine PPE nell’infezione tubercolare non è noto, ma si ritiene che abbiano un importante significato immunologico, probabilmente come fonte di variabilità antigenica. Nel presente lavoro è stata studiata, in modelli murini, l’immunogenicità della proteina PPE44 (Rv2770c), inoculata sia come plasmide esprimente il gene ppe44 (ppe44-DNA) sia
come proteina ricombinante emulsionata nell’adiuvante dimetil dioctadecil ammonio bromuro (rPPE44-DDA); è stata quindi
valutata l’attività protettiva di vaccini sperimentali basati su PPE44 nei confronti di un challenge con M. tuberculosis.
Topi BALB/c, immunizzati per via intramuscolare con ppe44-DNA sviluppavano una riposta immune anti-PPE44 polarizzata
verso un fenotipo Th2, come indicato dal rapporto IgG1/IgG2a e dalla modestissima produzione di IFN-gamma in colture di
splenociti stimolati con rPPE44; al contrario, in topi C57BL/6 immunizzati con ppe44-DNA il rapporto IgG1/IgG2c, gli alti livelli di IFN-gamma e la mancata produzione di IL-4 in vitro suggerivano una prominente polarizzazione Th1. Risultati analoghi
sono stati ottenuti in topi C57BL/6 inoculati per via sottocutanea con rPPE44-DDA. Topi C57BL/6 immunizzati con ppe44DNA o con rPPE44-DDA hanno mostrato, dopo challenge endovenoso o intratracheale con M. tuberculosis H37Rv, una
riduzione significativa delle CFU nel polmone e nella milza rispetto agli animali di controllo; l’attività protettiva di PPE44 è
risultata paragonabile a quella ottenuta a seguito di immunizzazione con Mycobacteriun bovis BCG.
Tali risultati sottolineano l’importanza delle proteine PPE quali antigeni protettivi nell’infezione tubercolare.
Ricerca finanziata dall’Istituto Superiore di Sanità (Programma di Ricerca Nazionale sull’AIDS).
IL BLOCCO DELLA TRASCRIZIONE DI RNA RIBOSOMIALE INTERFERISCE CON LA LOCALIZZAZIONE NUCLEOLARE DELLA PROTEINA PP65 DI CITOMEGALOVIRUS UMANO E PROVOCA
UNA INIBIZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA VIRALE
Arcangeletti M.C.a, Rodighiero I.a, Ferraglia F.a, De Conto F.a, Covan S.a, Motta F.a, Gatti R.b, Orlandini G. b, Razin S.V.c,
Dettori G.a, Chezzi C.a
a Sezione di Microbiologia. Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio. Università degli Studi di Parma.
b Sezione di Istologia ed Embriologia Generale. Dipartimento di Medicina Sperimentale. Università degli Studi di Parma.
c Institute of Gene Biology. Russian Academy of Science. Moscow, Russia.
La fosfoproteina pp65 di citomegalovirus umano (HCMV) è uno dei principali componenti del tegumento virale. Il suo accentuato tropismo nucleare a tempi precocissimi dopo l’infezione - in particolare il suo accumulo preferenziale a livello nucleolare - unitamente ad una attività protein-chinasica, la rendono candidata ideale quale fattore di regolazione dell’espressione genica di HCMV.
In questa ricerca sono state studiate le possibili implicazioni funzionali relative alla compartimentalizzazione nucleolare di pp65
durante le fasi precoci dell’infezione sperimentale di fibroblasti embrionali umani (MRC5) con lo stipite AD169 di HCMV.
In particolare, per verificare quanto la deplezione nucleolare di pp65 influisse sul normale avvio del ciclo litico virale, sono state
impiegate due sostanze (actinomicina D e cisplatina) che, quando utilizzate a bassa concentrazione provocano lo “svuotamento” delle proteine nucleolari ed hanno una concomitante e ancora più rapida azione interferente selettivamente sulla trascrizione di rRNA (mediata dall’enzima RNA polimerasi I), lasciando apparentemente inalterata l’attività dell’enzima RNA polimerasi II, utilizzato anche da HCMV per la trascrizione dei propri geni. Tali caratteristiche sono state inizialmente verificate e confermate in cellule MRC5 non infettate, in assenza o in presenza di actinomicina D o di cisplatina, valutando da un lato la deplezione delle proteine nucleolari e dall’altro, la presenza di regioni introniche di trascritti primari di rRNA (enzima coinvolto:
RNA polimerasi I) e di actina (RNA polimerasi II), mediante RT-PCR semi-quantitativa.
Analoghi risultati sono stati ottenuti in MRC5 infettate con AD169; in particolare, durante le fasi precoci dell’infezione si osserva anche una netta deplezione nucleolare di pp65 ed una concomitante, significativa inibizione dell’espressione delle proteine
precocissime virali, suggerendo una possibile relazione funzionale tra l’insediamento nucleolare di HCMV, la sintesi di rRNA
e l’avvio del programma di espressione genica virale.
49
IL GSH-C4 INIBISCE LA REPLICAZIONE DEL VIRUS INFLUENZALE DI TIPO A INTERFERENDO
CON IL PROCESSO DI MATURAZIONE DELL’EMOAGGLUTININA
R. Sgarbanti1, L. Nencioni1, M. Magnani2, E. Garaci3, A.T. Palamara1
1Dip. Sc. San. Pubblica, Univ. Roma “La Sapienza”; 2Ist. Biochimica, Univ. Urbino; 3Dip. Med. Sper. Sc. Bioch., Univ. Roma
“Tor Vergata”
L’emoagglutinina (HA), glicoproteina del virus influenzale presente sotto forma di omotrimero nell’envelope virale, è la principale responsabile dell’adesione e dell’entrata del virus nella cellula ospite. Il folding dell’HA avviene nel reticolo endoplasmatico (RE) dove la formazione dei legami disulfidici è favorita da condizioni ossidanti. La proteina così foldata passa nel
Golgi dove subisce ulteriori processi di glicosilazione. Una variazione dello stato redox intracellulare in senso pro-ossidante è
stata riscontrata in varie infezioni virali, tra cui quella provocata dal virus influenzale. Risultati preliminari ottenuti dal nostro
gruppo di ricerca hanno dimostrato che il GSH-C4, derivato butanoile del GSH principale antiossidante intracellulare, inibisce
significativamente la replicazione del virus influenzale e l’espressione della proteina HA provocando allo stesso tempo un
abbassamento del suo peso molecolare.
Obiettivo dello studio è stato quello di chiarire il meccanismo con cui il GSH-C4 interferisce con la replicazione del virus
influenzale studiando in particolare il suo effetto nel processo di maturazione dell’HA.
I risultati ottenuti mediante western blot, effettuato in condizioni non riducenti, dimostrano che in cellule NCI infettate e trattate con GSH-C4 l’espressione dell’HA in forma trimerica è diminuita rispetto alle cellule di controllo. Allo stesso tempo l’osservazione mediante immunofluorescenza ha messo in evidenza che la localizzazione della HA sulla membrana cellulare, fenomeno normalmente osservato 8 ore dopo l’infezione nelle cellule di controllo, è fortemente diminuita nelle cellule trattate con
GSH-C4. Western blot effettuati dopo trattamento con Endo H, enzima capace di tagliare i residui di mannosio solo all’interno
del reticolo, dimostrano che il trattamento con GSH-C4 aumenta la quota dell’HA che si trova nel RE rispetto a quella presente nel Golgi. La permanenza della proteina nel RE sembra dovuta ad un difetto nella formazione dei legami disulfidici piuttosto che ad un difetto nella glicosilazione, come dimostrato da esperimenti effettuati con inibitori degli enzimi coinvolti nella glicosilazione. Tale ipotesi è supportata dal fatto che l’aggiunta di GSH-C4 a cellule infettate corregge lo stress ossidativo che si
instaura durante l’infezione innalzando i livelli citoplasmatici di GSH rispetto alle cellule di controllo.
ANALISI DELL’ESPRESSIONE GENICA GLOBALE NEL DIFFERENZIAMENTO SWARMING DI
BACILLUS CEREUS
Emilia Ghelardi1, Sara Salvetti1, Karoline Fægri2, Kim Susanna2, Francesco Celandroni1, Anne-Brit Kolstø2, Sonia Senesi3
1Dipartimento di Patologia Sperimentale, BMIE e 3Dipartimento di Biologia, Università di Pisa; 2Department of
Pharmaceutical Biosciences, University of Oslo, Norway.
Bacillus cereus è un microrganismo patogeno opportunista di crescente interesse medico. La patogenicità di B. cereus è nota
risiedere nella grande varietà di tossine ed enzimi citolitici prodotti. Più recentemente, però, è stato dimostrato che la capacità
di B. cereus di migrare attivamente su superfici solide mediante motilità swarming contribuisce significativamente alla virulenza di questo microrganismo. Infatti, questo tipo di motilità, che prevede la produzione di cellule swarm, lunghe, multinucleate
ed iperflagellate, è associata a rapida invasione dei tessuti infettati da B. cereus (1) ed a maggiore secrezione di emolisina BL
(2), una tossina trimerica con attività enterotossica, emolitica e necrotizzante.
Nel presente lavoro, mediante microarray a DNA, è stata effettuata un’analisi comparativa dell’espressione genica globale nel
ceppo di riferimento ATCC 14579, propagato in condizioni inducenti e non inducenti il differenziamento swarming, nell’ottica
di identificare le basi molecolari che regolano lo swarming e la virulenza di B. cereus. I risultati ottenuti indicano che l’espressione di circa il 10 % dei geni cromosomici è diversamente regolata durante attiva migrazione swarming (P < 0.005). Tra i geni
iper-espressi, sono stati identificati: (i) geni coinvolti in varie vie metaboliche, in accordo con il diverso comportamento fisiologico delle cellule swarm rispetto alle cellule vegetative; (ii) geni flagellari e chemiotattici, con un incremento significativo dell’espressione dei geni codificanti la flagellina (circa 4 volte), in accordo con la iperflagellazione delle cellule swarm; e (iii) geni
codificanti tossine quali l’emolisina BL (circa 2 volte). Nel complesso, i dati ottenuti suggeriscono che lo swarming richieda
diversa attività di geni coinvolti in molte funzioni cellulari, ma non geni swarming-specifici. Inoltre, l’iper-espressione dei geni
per l’emolisina BL durante il differenziamento swarming rende ragione dell’aumentata secrezione della tossina, indicando che
le cellule swarm rappresentano una condizione cellulare di maggior virulenza.
1. Callegan MC, Novosad BD, Ramirez R, Ghelardi E, Senesi S. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47: 4461-7, 2006.
2. Ghelardi E, Celandroni F, Salvetti S, Ceragioli M, Beecher DJ, Senesi S, Wong AC. Appl. Environ. Microbiol. 73: 4089-92, 2007.
50
DETERMINAZIONE DEI POLYOMAVIRUS BK, JC E SV40 SU BIOPSIE RENALI DI TRAPIANTATI
1Cristina Costa, 1Massimiliano Bergallo, 1Francesca Sidoti, 1Sara Astegiano, 2Gianna Mazzucco, 3Giuseppe P. Segoloni,
1Rossana Cavallo
1Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia, Laboratorio di Virologia; 2Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia
Umana; 3Dipartimento di Medicina Interna, Unità Trapianto Rene, Università di Torino
Background. I polyomavirus umani BK e JC rivestono un ruolo rilevante nella patologia del trapiantato renale, quale agenti di
nefropatia associata a polyomavirus (PVAN). Il ruolo di SV40 in questo contesto resta da definire, sebbene in uno studio sia
stato individuato quale responsabile di 2 casi di PVAN e sia stato ipotizzato come agente causale in alcune nefropatie e neoplasie. In questo studio è stata determinata la prevalenza di positività per BK, JC e SV40-DNA in biopsie renali di trapiantati ed è
stato studiato il ruolo clinico mediante correlazione con i dati istopatologici.
Materiali e metodi. Sono state studiate 138 biopsie renali consecutive ottenute da 109 trapiantati di rene. La prevalenza di BK,
JC e SV40 è stata valutata mediante real time PCR quantitativa; le sezioni bioptiche sono state sottoposte a esame istopatologico standard e test in immunoperossidasi con anticorpo anti-SV40.
Risultati. La real time PCR era positiva per BK in 37 su 138 biopsie (26.8%), per JC in 24 su 138 (17.4%) e per SV40 in 13 su
138 (9.4%). SV40-DNA era rilevabile solo in concomitanza con BK e JC e con carica virale bassa. Una diagnosi di PVAN è
stata posta in 2 casi, entrambi positivi per BK, ma negativi per JC e SV40. Nessuna altra nefropatia è risultata significativamente
associata a BK, JC o SV40.
Conclusioni. I nostri risultati confermano il tropismo renale di SV40, con una bassa carica virale indice di latenza, e l’occorrenza di altre infezioni successive all’uso dei vaccini anti-polio, sebbene con vie di trasmissione ignote. Il ruolo patogeno di
SV40 nel trapianto renale resta da stabilire, sebbene la concomitanza di positività per BK e/o JC renda difficile distinguerne
l’impatto individuale.
APPLICAZIONE DELLA RISONANZA PLASMONICA DI SUPERFICIE E DELLA TECNOLOGIA
BASATA SUGLI PSEUDOVIRIONI ALLA RICERCA DI NUOVI MICROBICIDI CONTRO I PAPILLOMAVIRUS UMANI GENITALI
David Lembo1, Manuela Donalisio1, Maura Cornaglia1, Fabrizio De Robertis1, Andrea Civra1, Pasqua Oreste2, Marco
Rusnati3, Santo Landolfo1.
1Dipartimento di Sanità Pubblica e di Microbiologia, Università di Torino; 2Glycores 2000, Milano; 3Università di Brescia.
La ricerca di molecole microbicide nei confronti dei papillomavirus umani (HPV) genitali è stata finora ostacolata dall’impossibilità di coltivare il virus nei normali sistemi di coltura cellulare e dalla conseguente mancanza di adeguati saggi di neutralizzazione ad alta resa che consentirebbero di vagliare ampie collezioni di molecole. In questo studio abbiamo integrato tre tecnologie innovative allo scopo di identificare composti in grado di inibire competitivamente l’adesione degli HPV genitali ai loro
recettori di superficie, gli eparan solfati proteoglicani. Utilizzando un metodo di solfatazione chimica selettiva del polisaccaride capsulare K5 di Escherichia coli, che ha una struttura simile al precursore biosintetico dell’eparina e degli eparan solfati,
abbiamo generato una serie di derivati N-, O-, e N,O-solfati a diverso grado di solfatazione. La capacità di tali composti di interferire con il legame del capside virale ad eparina immobilizzata e di neutralizzarne l’infettività è stata valutata rispettivamente
mediante la risonanza plasmonica di superficie e con saggi cellulari di neutralizzazione sviluppati recentemente. Entrambi questi saggi sono basati sull’impiego di preparazioni altamente purificate di pseudovirioni, strutture costituite da un capside virale
ricombinante del tutto simile ad un capside autentico che, in luogo del genoma virale, alloggia un plasmide indicatore, il cui prodotto è facilmente rilevabile in colture cellulari infettate. I risultati ottenuti con entrambi i saggi sono in ottimo accordo e dimostrano che due composti O-solfati ed N,O-solfati ad alto grado di solfatazione sono dei potenti inibitori dell’infezione da alcuni
tra i più diffusi HPV genitali responsabili di lesioni benigne e maligne quali HPV-6, HPV-16 e HPV-18 con IC50 nell’ordine di
ng/ml. Questi composti non hanno attività anticoagulante, citotossica o pro-infiammatoria e sono attivi anche contro HIV e
HSV-2. Queste caratteristiche li candidano come ingredienti di preparazioni microbicide ad ampio spettro che possono trovare
impiego come adiuvanti nei programmi vaccinali anti HPV e in quei paesi dove l’alto costo del vaccino ne impedirà l’accesso
ad un’ampia fascia di popolazione. Ulteriori studi sono necessari per verificarne l’efficacia in vivo.
51
L’HERPESVIRUS UMANO DI TIPO 8 (HHV-8) INCREMENTA IL FATTORE CELLULARE TRASCRIZIONALE ATF4
Caselli E., Gentili V., Grigolato J, Ngakeu A., Cassai E., Di luca D.
Sezione di Microbiologia, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Università di Ferrara, Ferrara, Italy.
Nell’ambito dello studio delle alterazioni cellulari indotte dall’infezione con HHV-8 in cellule umane, risultati di gene array ottenuti dal nostro gruppo hanno mostrato che il maggiore transattivatore genico del virus (ORF50) induce modifiche dell’espressione di un ristretto gruppo di geni cellulari, tra cui il fattore Activating Trancriptional Factor 4 (ATF4 o CREB2), che risulta
fortemente upregolato. ATF4 è un fattore di regolazione trascrizionale coinvolto nella risposta della cellula allo stress e viene
attivato durante la Unfolded protein Response (UPR), che consegue a stress del reticolo endoplasmico. Diversi stimoli, tra cui
molte infezioni virali, sono in grado di scatenare tale risposta, che ha lo scopo di inibire la replicazione e la trascrizione virali.
Tuttavia, recentemente si è osservato che alcuni virus (HCMV, BDV) riescono, mediante l’upregulation di ATF4, a limitare alcuni aspetti dannosi dell’UPR a proprio vantaggio.
Sulla base di tali osservazioni abbiamo pertanto studiato la regolazione del fattore ATF4 durante l’infezione in vitro con HHV8, valutandone l’eventuale significato funzionale per la replicazione virale. I risultati hanno mostrato che l’infezione con HHV8 in cellule umane di diversa origine induce un notevole incremento dell’espressione di ATF4, che si mantiene a livelli elevati
fino a 72 ore post infezione, come evidenziato dai saggi Western blot, IFA, rtPCR semiquantitativa e PCR quantitativa real time.
Inoltre, tale incremento virus-indotto è funzionale alla replicazione del virus stesso. Infatti cellule con incrementata espressione
basale di ATF4 (ottenuta mediante transfezione genica di un plasmide esprimente ATF4) sostengono la replicazione di HHV-8
in modo molto più efficace rispetto alle cellule parentali, come evidenziato dall’aumento del carico virale intracellulare, fino a
100 volte superiore rispetto alle cellule di controllo. Il meccanismo molecolare con cui ATF4 promuove la replicazione virale
sembra essere di tipo non-trascrizionale, come mostrato dai risultati di saggi reporter condotti su diversi promotori precoci e tardivi di HHV-8. E’ probabile pertanto che nel meccanismo d’azione sia coinvolta l’interazione con altri fattori cellulari che sono
tuttora oggetto di studio nel nostro laboratorio.
In conclusione, ATF4 sembra rappresentare un fattore di grande importanza ed interesse per la comprensione dei meccanismi
che regolano il ciclo replicativo di HHV-8.
ATTIVITÀ ANTIFUNGINA DEL PEPTIDE hLF(1-11) DERIVATO DALLA LATTOFERRINA UMANA
VERSO UN’INFEZIONE DISSEMINATA SOSTENUTA DA CANDIDA ALBICANS
Antonella Lupetti,1 Carlo P. J. M. Brouwer,3 Sylvia J. P. Bogaards,2,3 Mick M. Welling,4 Emile de Heer,5 Mario Campa,1 Jaap
T. van Dissel,2 Robert E. H. Friesen,3 Peter H. Nibbering2*
1Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia, Università di Pisa, Pisa,
2Dipartimento di Malattie Infettive, Leiden University Medical Center (LUMC), Leiden, 3AM-Pharma, Bunnik, 4Dipartimento
di Radiologia, Divisione di Medicina Nucleare, LUMC, e 5Dipartimento di Patologia, LUMC, Olanda.
Studi recenti hanno dimostrato che il peptide N terminale della lattoferrina umana, hLF(1-11), svolge un’efficace attività candidacida in vitro. Nel presente studio sono stati valutati l’attività antifungina di tale peptide cationico verso un’infezione disseminata sostenuta da un ceppo di Candida albicans fluconazolo resistente e i meccanismi alla base di tale attività. I risultati
hanno evidenziato che il peptide hLF(1-11) è efficace verso infezioni disseminate sostenute da C. albicans a dosi comprese tra
0.4 ng e 0.4 µg per kg di peso corporeo. L’attività antifungina si riduce, invece, somministrando dosaggi superiori di peptide ed
è stato osservato che l’iniezione di alte dosi di hLF(1-11) nei topi infettati viene accompagnata da un aumentato livello sierico
di IL-10. In accordo con questa osservazione, gli anticorpi neutralizzanti l’IL-10 aumentano l’effetto antifungino di hLF(1-11)
verso le infezioni sostenute da C. albicans, suggerendo che aumentati livelli di IL-10 contribuiscano alla riduzione dell’attività
di tale peptide. L’analisi istologica rivela che i foci infettivi renali di topi trattati in modo efficace contengono principalmente
blastoconidi, mentre le forme ifali sono abbondanti nei topi non trattati o trattati in modo inadeguato. In accordo con questi dati,
il peptide hLF(1-11) inibisce in vitro lo switching fenotipico di C. albicans in modo dose dipendente.
In conclusione, il peptide hLF(1-11) è efficace verso infezioni disseminate sostenute da C. albicans e tale efficacia può essere
spiegata dall’attività che il peptide svolge, da un lato, sulla vitalità e virulenza di C. albicans e, dall’altro, sulle cellule del sistema immunitario dell’ospite.
52
ATTIVAZIONE PRIMARIA IN VIVO DI LINFOCITI T CD4+ E CD8+ IN SEGUITO A VACCINAZIONE
MUCOSALE
Donata Medaglini, Annalisa Ciabattini, Elena Pettini, Anna Maria Cuppone, Gianni Pozzi.
Laboratorio di Microbiologia Molecolare e Biotecnologia (LAMMB), Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di
Siena, Siena
L’attivazione primaria di linfociti T CD4+ e CD8+ è stata studiata in vivo in seguito ad immunizzazione mucosale con ceppi
ricombinanti di Streptococcus gordonii. A tale scopo è stata utilizzata la metodica di trasferimento adottivo di linfociti T transgenici. Ceppi ricombinanti di S. gordonii, esprimenti sulla superficie la P27 del Virus dell’Immunodeficienza delle Scimmie
(SIV) o l’antigene ESAT6-Ag85 di Mycobacterium tuberculosis fusi agli epitopi T-helper e T-citotossici (323-339 e 257-264
rispettivamente) dell’ovalbumina (OVA), sono stati utilizzati per studiare l’attivazione primaria di linfociti T CD4+ e CD8+ nel
tessuto linfoide associato alla mucosa nasale (NALT), nei linfonodi (cervicali, mesenterici ed iliaci), nel polmone e nella milza
di topi immunizzati per via mucosale. In seguito ad immunizzazione intranasale i ceppi ricombinanti hanno indotto l’attivazione antigene-specifica di linfociti T CD4+ e CD8+ nel NALT, nei linfonodi e nella milza. L’attivazione delle cellule T OVA-specifiche è stata osservata prima nel NALT e nei linfonodi cervicali già 3 giorni dopo l’immunizzazione. Nella milza, la percentuale di linfociti CD4+ e CD8+ proliferanti ha raggiunto il picco di attivazione al giorno 5. E’ importante sottolineare che in
seguito ad immunizzazione intranasale è stata osservata attivazione di linfociti CD4+ e CD8+ anche nei linfonodi iliaci e mesenterici. L’assenza di picchi precoci di proliferazione sia nei linfonodi iliaci che nella milza suggerisce la possibile migrazione di
cellule T attivate dal sito di immunizzazione. È stata osservata inoltre una significativa modulazione, nel tempo e nelle diverse
divisioni cellulari, dell’espressione di molecole di attivazione e di migrazione.
L’attivazione primaria delle cellule T antigene-specifiche osservata in seguito ad immunizzazione intranasale è stata posta a
confronto con quella indotta in seguito ad immunizzazione vaginale con S. gordonii ricombinante. In seguito ad immunizzazione vaginale non è stata osservata alcuna migrazione ed attivazione delle cellule T sia nei linfonodi (iliaci e cervicali) che
nella milza.
Questi dati suggeriscono che il NALT è un sito ottimale per l’attivazione di linfociti CD4+ e CD8+ naïve, capace di disseminare cellule effettrici in siti distanti come il tratto genitale; al contrario quest’ultimo non risulta efficiente nel attivazione primaria delle cellule T.
VARIABILITY OF THE HBV POL GENE REVERSE-TRANSCRIPTASE DOMAIN IN VIRAL ISOLATES FROM UNTREATED AND LAMIVUDINE-RESISTANT CHRONIC HEPATITIS B PATIENTS
D.Ferraro2 T.Pollicino1, G. Isgrò1, R.DiStefano2, , S.Maimone1, S.Brancatelli1, G.Squadrito1, V.DiMarco3, A.Craxì3,
G.Raimondo1.
1Clinical and Molecular Hepatology, Messina University; 2Dipartimento di Igiene e Microbiologia, Palermo University;
3Gastroenterology and Hepatology, Palermo University - ITALY
Background: Different HBV variants carrying point mutations at level of the reverse transcriptase (rt) domain had been detected in patients under treatment with nucleos(t)ide analogues. At present, few information is available about the occurrence of
these drug-resistant mutants in untreated patients.
Aim: genomic characterization of HBV isolates from individuals (1) naive for antiviral therapy (naive-group) or (2) who had
developed lamivudine resistance.(Lam-group)
Patients and methods: We analysed, by amplification, cloning and sequencing procedures, the entire rt-domain in viral isolates
from 84 untreated and 49 LAM-resistant consecutive HBsAg carriers with chronic liver disease.
Results and conclusions:All the cases had serum HBV DNA levels > 20,000 UI/mL. Thirty-two of the 84 naive-group cases
(38.1%) carried single or multiple mutations potentially predisposing to antiviral resistance. In particular, we found the following mutations: rtV173M in 2 cases (2.4%), rtA181D in 1 case (1.2%), rtV214A/E in 3 cases (3.6%), rtQ215S/P/H in 12 cases
(14.3%), rtL217R in 8 cases (9.5%), rtS219S in 4 cases (4.8%), rtF221Y/L in 15 cases (17.8%), rtI233V in 4 cases (4.8%),
rtP237T in 3 cases (3.6%), rtN238T/H/D in 4 cases (4.8%). In the Lam-group, besides the mutations typically inducing LAM
resistance, 28/49 (57.1%) carried single or multiple mutations conferring resistance to other antivirals. In particular, 4 cases
(8.2%) had either the rtT184S or the rtM250V/L mutations favouring resistance to Entecavir, whereas various combined mutations predisposing to Adefovir resistance were detected in 26 cases: rtV84M in 1 case (2%), rtA181S/T in 2 cases (4.1%),
rtV214A/T in 2 cases (4.1%), rtQ215S/E/P in 12 cases (24.5%), rtL217R in 3 cases (6.1%), rtS219A in 3 cases (6.1%), rtF221Y
in 6 cases (12.2%), rtI233V in 1 case (2%), rtP237HT in 2 cases (4.1%), rtN238T/H/D in 12 cases (24.5%). In conclusion, our
study shows that HBV mutants predisposing to drug resistance may be present as major infecting population in untreated
patients, and that variants emerging during LAM treatment may also carry mutations potentially inducing resistance to either
Adefovir or Entecavir.
53
INFEZIONI URINARIE NEI REPARTI DI RIABILITAZIONE. EPIDEMIOLOGIA E RESTISTENZE
BATTERICHE
D. Carcò1, M. Cantarella2, T. Pace1, M.G. Privitera1, G.Deinite3, G. Nicoletti º
1Istituto Oncologico del Mediterraneo, Viagrande; 2 Casa di cura Musumeci, Catania; 3Casa di cura Carmide, Catania; º
Laboratorio centralizzato Azienda Ospedaliero-universitaria G.Rodolico, Catania
Le infezioni delle vie urinarie rappresentano una frequente localizzazione delle infezioni nosocomiali che si colloca al 4°posto
con una incidenza del 10.5% (Progetto Nazionale per la sorveglianza delle infezioni batteriche gravi in ambito comunitario e
ospedaliero dell’ISS). La mappa geografica evidenzia che il primato spetta al Sud e alle isole dove il 48% dei pazienti si infetta in ospedale per cause secondarie rispetto a quelle del ricovero. Nello specifico l’incidenza delle cistiti da catetere urinario è
del 7% .
Gli Autori presentano i primi risultati di una valutazione del pattern epidemiologico e di resistenza antibiotica delle infezioni
urinarie nel reparto di Riabilitazione della Casa di Cura Carmide di Catania, nel periodo gennaio 2007 - agosto 2007. Sono stati
presi in esame tutti i pazienti ricoverati provenienti da reparti ospedalieri di neurologia ed ortopedia, sottoposti ad urinocoltura
al momento del ricovero. Sono stati valutati: la presenza di catetere vescicale al momento del ricovero (71%), la diagnosi di
ammissione (esiti di eventi cerbrovascolari acuti 89%; esiti di frattura femorale 69%), la durata del ricovero nel reparto di provenienza, la distribuzione per sesso. E’ stata riscontrata una incidenza di IVU nel 64% dei pazienti in esame prevalentemente
correlata a Gram- rispetto a Gram+ . I microorganismi più frequentemente isolati sono stati E.coli (24%), E.faecalis (13%),
S.aureus (9,5%), K.ozaene (6%), P.aeruginosa (4,8%), K.pneumoniae (2,7%), E.faecium (1,3%). Si è messa in evidenza una
marcata resistenza di E.coli all’amoxacillina (sino al 72%) ed una sua sensibilità alla assiociaziome amoxacillina+ac. clavulanico (sino al 70 %); E. faecalis presenta resistenza alla ciprofloxacina (sino al 64%) ed una buona sensibilità ai glicopeptidi;
St.aureus presenta netta resistenza alla oxacillina e sensibilità alla vancomicina; per tutti i batteri gram- non fermentanti isolati
si osservano percentuali di sensibilità ai derivati della penicillina, agli aminoglicosidi ed alle cefalosporine superiori al 90%:
questo dato richiede attenta valutazione. Tredici pazienti trattati in seguito alla positività della prima urinocoltura hanno presentato diversa flora microbica al controllo successivo, presumibilmente legata a manovre non corrette effettuate dal personale.
INFEZIONE OCCULTA DA HBV NEL PAZIENTE IMMUNOCOMPROMESSO:STUDIO DELL’ETEROGENEITA’ VIRALE
Pizzillo P, Ferraro D, Vultaggio A, Urone N, Iannitto* E, Di Marco° V, Di Stefano R.
Dipartimento di Igiene e Microbiologia, * Dipartimento di Oncologia, Sezione di Ematologia, °Cattedra di Gastroenterologia,
Di.Bi.MI.S. - Università di Palermo
Background: Un’infezione occulta da HBV è definita dalla presenza del genoma virale nel fegato e/o nel sangue di soggetti
HBsAg-vi. Numerose evidenze dimostrano che la persistenza virale è principalmente correlata alla forte soppressione della
replicazione e dell’espressione genica.
Obiettivi: Studiare la composizione e l’evoluzione della quasispecie di HBV, dall’infezione occulta alla riattivazione,in pazienti con malattia oncoematologica.
Pazienti e metodi: Nove pazienti con malattia linfoproliferative ed infezione occulta, in 3 dei quali era stata osservata la riattivazione della infezione dopo 8 – 17 mesi di trattamento immunosoppressivo, sono stati selezionati per lo studio dell’eterogeneità virale della regione PreS/S di HBV. L’HBV-DNA è stato amplificato mediante nested-PCR da campioni di siero prelevati
prima del trattamento immunosoppressivo e al momento della riattivazione. Gli ampliconi sono stati clonati nel vettore pGEMT. L’HBV-DNA estratto da 10 colonie ricombinanti per paziente è stato sottoposto a sequenziamento genico. L’analisi filogenetica è stata eseguita con il software MEGA 3.1.
Risultati e conclusioni: La diversità nucleotidica e aminoacidica dei cloni dei singoli pazienti è, rispettivamente, 0-2.6%, e 012.3% nell’infezione occulta e 0-4.8% 0-6.4% nella riattivazione. Durante l’infezione occulta sono state riscontrate mutazioni
in singoli cloni che potrebbero essere coinvolte nell’escape immunitario del virus. In particolare, l’inserzione di una A in posizione nt707, che provoca lo shift del frame di lettura, e la sostituzione C577T, che provoca la formazione di un codone di stop.
Lo studio dell’evoluzione della quasispecie condotto mediante confronto tra i cloni in fase occulta e di riattivazione non ha
mostrato significative differenze in termini di diversità nucleotidica e aminoacidica. Nella riattivazione da HBV la quasispecie
è sovrapponibile alla popolazione predominante della fase di infezione occulta e non comporta la seleziona di un clone dotato
di una fitness vantaggiosa, che giustifichi la ripresa della replicazione virale.
54
ESPRESSIONE DI MSRV (RETROVIRUS ENDOGENO ASSOCIATO ALLA SCLEROSI MULTIPLA)
COME MARCATORE PROGNOSTICO DELLA TERAPIA CON INTERFERONß
Serra C1, Mameli G1, Castellazzi M2, Astone V1, Poddighe L1, Biolchini A1, Mei A1, Fainardi E2, Neri W2, Granieri E2, Dolei A1
1Dip. Scienze Biomediche,Univ.di Sassari; 2Centro di Sclerosi Multipla,Dip. Neurologia,Univ. di Ferrara.
L’eziopatogenesi della sclerosi multipla (SM) è sconosciuta; si ipotizza che sia innescata da virus in soggetti geneticamente predisposti e non esiste ancora un marcatore prognostico utile al singolo paziente. In plasma,liquor e cervello dei pazienti la presenza di MSRV,della famiglia HERV-W dei retrovirus endogeni,è strettamente correlata con la progressione e la remissione della
SM (Dolei et al., 2002; Sotgiu et al, 2002; Sotgiu et al,2006a,Mameli et al., 2007a),nonché alla progressione da neurite ottica
a SM (Sotgiu et al, 2006b). Non è chiaro se MSRV sia cofattore o epifenomeno,ma il virus ha proprietà gliotossiche/apoptotiche,fusogene e superantigeniche,e causa neuropatologia T-mediata in topi SCID umanizzati. Noi avevamo osservato che l’interferon-beta (IFNß),usato comunemente in terapia di pazienti con SM recidivante-remittente (RRSM),è un forte inibitore del
rilascio di MSRV da colture di PBMC da donatori MSRV+,mentre citochine nocive nella MS inducono espressione di HERVW (Serra et al., 2003; Mameli et al., 2007b).
Per valutare l’effetto di IFNß su MSRV in vivo,abbiamo studiato pazienti con RRSM,prima e durante trattamento con IFN-ß. Lo
studio è stato condotto per un periodo di 12 mesi su 11 pazienti (F/M: 6/5i,età media 33,9±8,6 anni). Al tempo 0 e ogni 3 mesi
è stato fatto l’esame clinico di laboratorio,per quantificare MSRV sierico,mediante real time RT-PCR HERV-Wenv-specifica.
I dati mostrano che al tempo 0 la positività per MSRV e la carica virale erano correlati alla durata della SM. A 3 mesi il numero di copie virali nel plasma non era più valutabile. L’inibizione di MSRV era stabile per tutti i 12 mesi di studio,tranne per un
paziente che dai 6 mesi riprendeva la produzione di MSRV,fino a valori pre-terapia. L’esame clinico evidenziava che fin dai 3
mesi,in tutti pazienti si riduceva l’indice di progressione (PI) della malattia,tranne il paziente che aveva ripreso a produrre
MSRV,che tra 6 e 9 mesi aveva avuto forte aggravamento e risalita del PI.
Va chiarito il ruolo di MSRV,ma la sua carica ematica è direttamente correlata alla durata della SM; la terapia abbatte rapidamente la carica virale; la ripresa della produzione virale si associa a progressione clinica e fallimento terapeutico: quindi la rilevazione di MSRV è da considerare il primo marcatore prognostico,per monitorare progressione clinica e efficacia terapeutica.
Fondazione Italiana Sclerosi Multipla Onlus (FISM grant N. 2005/R/11); MIUR PRIN 2005; FISM Training Research
Fellowship N. 2005/B/2 (GM).
ISOLATI DI HSV-1 DELETI NEL GENE UL49 IN GRADO DI DARE LUOGO AD INFEZIONE PRODUTTIVA, GENERATI CON IL SISTEMA BAC-DNA, PRESENTANO NECESSARIAMENTE MUTAZIONI SPONTANEE NELLA PROTEINA VHS (UL41)
Maria Teresa Sciortino1, Brunella Taddeo2, Maria Antonietta Medici1, Maria Giuffrè-Cuculletto1, Bernard Roizman2,
Antonio Mastino1
1Dipartimento di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari, Università di Messina, Messina.
2The Marjorie B. Kovler Viral Oncology Laboratories, The University of Chicago, Chicago, USA.
Abbiamo costruito un mutante del virus herpes simplex 1 (HSV-1) deleto nel gene UL49, che codifica per la proteina VP22,
utilizzando il sistema del cromosoma batterico artificiale (BAC) per eliminare l’ open reading frame (ORF) di UL49 dal DNA
virale. Successivamente, utilizzando lo stesso sistema BAC, abbiamo generato anche il mutante riparato, reinserendo la stessa
ORF nel DNA genomico deleto in UL49. In seguito a trasfezione di cellule Vero con il DNA deleto in UL49 (BAC-DUL49) si
generavano principalmente foci di cellule degenerate da cui non poteva essere recuperata progenie virale infettante. Solo in tre
casi, dopo trasfezione di cellule Vero con BAC-DUL49 è stato possibile recuperare isolati virali in grado di dar luogo ad infezione produttiva su cellule permissive. Tali cloni virali isolati sono stati quindi caratterizzati. Essi producevano virus che presentava un ritardo nella cascata dell’espressione dei geni virali, la produzione di placche più piccole ed una resa virale inferiore rispetto al virus di tipo selvatico. Inoltre, presentavano tutti indistintamente la mancanza della proteina vhs funzionale ad
attività RNasica, codificata dal gene UL41. Un clone virale mutante non esprimeva per niente la proteina vhs, mentre gli altri
due cloni esprimevano forme troncate, compatibilmente con una delezione spontanea in frame. Al contrario, nelle cellule infettate con il virus ottenuto in seguito a trasfezione con BAC-DUL49 riparato, si accumulava regolarmente proteina vhs, indicando che nel DNA parentale BAC-DUL49 il gene UL41 era intatto. Inoltre, esperimenti di cotrasfezione dimostravano che
l’interazione tra le proteine VP22 e vhs, in presenza dell’altra proteina tegumento VP16, era indispensabile per consentire il
recupero di cellule con accumulo di vhs. Questi risultati indicano che l’espressione della proteina vhs in assenza della proteina VP22 è letale per le cellule infettate e quindi incompatibile con la capacità replicativa di HSV-1.
55
L’INFEZIONE DA HSV-1 INDUCE IL PROCESSAMENTO DELLA PROTEINA APP IN CELLULE NEURONALI: STUDIO DEI MECCANISMI COINVOLTI
De Chiara G.1, Marcocci M.E.2, Civitelli L.2, Mollinari C. 1, Merlo D.1, Manservigi R.3, Garaci E.4, Palamara A.T.2
1Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze, ISS, Roma-Italy; 2Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica,Università
di Roma “La Sapienza”, Roma-Italy; 3Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Università di Ferrara, Ferrara-Italy;
4Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Roma, Roma-Italy.
E’ noto che l’iperproduzione del peptide beta amiloide (Ab) costituisce un fattore determinante per la deposizione nello spazio
interneuronale delle placche senili, specifici marcatori istopatologici della malattia di Alzheimer (AD). Ab è un prodotto del clivaggio della proteina precursore dell’amiloide APP e qualsiasi agente in grado di promuovere la sua formazione può contribuire alla patogenesi di AD. Recentemente è stata proposta l’ipotesi che il virus Herpes Simplex di tipo 1 (HSV-1) possa svolgere
un ruolo cofattoriale nello sviluppo di AD (Wozniak et al,.2005; Cribbs et al., 2000). In particolare, Itzhaki et al. (2005) hanno
mostrato che l’infezione da HSV-1 induce la formazione di un nuovo frammento di APP, tuttavia non sono tuttora stati chiariti
i meccanismi molecolari alla base di tale anomalo processamento.
Lo scopo del presente studio è stato quello di definire gli effetti delle infezioni da HSV-1 nel processamento di APP in cellule
di neuroblastoma umano (SH-SY5Y) e in colture primarie di neuroni corticali di ratto. In entrambi i modelli sperimentali, l’infezione da HSV-1 induce la diminuzione dell’espressione di APP e provoca l’accumulo di alcuni frammenti (APPfs) di peso
molecolare inferiore (35- 45 Da), riconosciuti da diversi anticorpi diretti contro il dominio Ab della proteina. Come previsto, i
livelli di mRNA di APP risultano diminuiti nelle cellule infettate da HSV-1 a causa dello shut-off della sintesi proteica indotto
dall’infezione virale. Tuttavia, l’uso di mutanti di HSV-1, deleti in specifici geni i cui prodotti (ICP34.5 e VHS) svolgono un
ruolo importante nel controllo dei meccanismi di traduzione, e di specifici inibitori di enzimi cellulari coinvolti nel processamento di APP, ha permesso di dimostrare che l’accumulo di APPfs è dovuto ad un aumentato clivaggio della proteina precursore ad opera di enzimi cellulari. Sono attualmente in corso ulteriori studi per identificare la sequenza dei prodotti di clivaggio.
ANALISI E SEQUENZIAMENTO DELLA REGIONE REGOLATRICE DEL GENE ERM(A) AD
ESPRESSIONE COSTITUTIVA O INDUCIBILE
Carolina Ferranti1, Valeria Giummarra, Gian Carlo Rappazzo2, Gianna Tempera1, Lucia Silvana Roccasalva1, e Pio Maria
Furneri1
1Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche e 2Dipartimento di Biologia Animale, Università degli
Studi di Catania, Catania
Introduzione. In Streptococcus pyogenes (SGA) i geni responsabili della resistenza all’eritromicina dovuta alla metilazione dell’A2058 sono raggruppati in una superfamiglia di geni chiamati erm. L’espressione di tali geni provoca una resistenza ai macrolidi, lincosamidi e streptogramine B
(MLSB). Negli Streptococchi la resistenza agli antibiotici MLSB può essere costitutiva (fenotipo cMLS), oppure inducibile (fenotipo iMLS), ed è
mediata in genere, in SGA da metilasi appartenenti al genotipo erm(B). Recentemente Seppala e collaboratori hanno isolato un nuovo gene erm
denominato erm(TR) [oggi designato con la sigla erm(A)], da un ceppo SGA resistente all’eritromicina e con fenotipo inducibile. La sequenza del
nuovo gene presenta un’omologia dell’82.5% con il gene ermA, del quale possiede una simile sequenza leader probabilmente coinvolta nella regolazione post trascrizionale dell’espressione della metilasi. L’espresione di erm(A) è regolata similarmente a quella dell’ erm(C), che è il prototipo dei
geni erm inducibili. La struttura dell’attenuatore di erm(A) è più complessa di quella di erm(C). Il comportamento costitutivo o inducibile sembra essere regolato da una serie di cambiamenti (mutazioni di vario genere) che avvengono nella zona dell’attenuatore.
Scopo. Lo scopo di questo lavoro consiste nella caratterizzazione fenotipica e genotipica, sequenziamento della regione dell’attenuatore e delle zone
a valle del gene erm(A) di 21 ceppi di SGA resistenti ad eritromicina, dei quali 15 con fenotipo inducibile e 6 con fenotipo costitutivo.
Metodi. L’analisi fenotipica è stata condotta con procedure standard in accordo al CLSI. L’analisi genotipica è consistita nell’identificazione dei geni
di resistenza mediante PCR, e del sequenziamento degli amplificati del gene erm(A)
Risultati. I ceppi cMLSB presentavano: 3 ceppi erm(A), 2 ceppi erm(A)/erm(B), e 1 ceppo erm(A)/erm(B)/mef(A). I ceppi iMLSB presentavano: 9
ceppi erm(A), 3 ceppi erm(A)/erm(B), 2 ceppi erm(A)/mef(A), e 1 ceppo erm(A)/erm(B)/mef(A). Nei ceppi con fenoitpi
L’allineamento delle nostre sequenze e la sequenza depositata dell’erm(A) ha evidenziato:
ceppi iMLSB mutazioni puntiformi e due delezioni: le mutazioni più frequentemente riscontrate sono la transizione C140T (11 ceppi) e la trasversione C412A (11 ceppi); altre mutazioni trovate sono la trasversione G405T (4 ceppi), la transizione C246T (2 ceppi), la trasversione A137C (2 ceppi),
la trasversione T19G (1 ceppo), e infine, due delezioni, una guanina in posizione 8 (1 ceppo) ed una guanina in posizione 405 (1 ceppo).
ceppi cMLSB mutazioni puntiformi e una addizione: le mutazioni più frequentemente riscontrate sono la trasversione C412A (4 ceppi), la trasversione A137C (2 ceppi), la transizione G85T (1 ceppo), e la transizione C246T (1 ceppo), e infine l’addizione di una citosina in posizione 388
56
MUTAZIONI PUNTIFORMI NEL GENE CODIFICANTE PER ESAT-6 ATTENUANO IL CEPPO
BCG::RD1 MA NON NE ALTERANO LA CAPACITÀ PROTETTIVA VERSO M. TUBERCULOSIS
D. Bottai 1, 2, P. Brodin 2, C. Demangel 2, S. Esin 1, G. Batoni 1, M. Campa 1, S.T. Cole 2, R. Brosch.2
1Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia, Università di Pisa; 2Unité
de Génétique Moléculaire Bactérienne, Institut Pasteur, Paris.
Studi di genomica comparativa hanno evidenziato l’assenza in BCG di una regione, denominata RD1, presente in
Mycobacterium tuberculosis e codifcante per numerosi antigeni, tra cui ESAT-6 e CFP10. E’ stato dimostrato che l’introduzione di tale regione nel genoma di BCG conferisce al ceppo ricombinante BCG::RD1: i) notevole aumento della virulenza; ii)
maggiore capacità protettiva rispetto al BCG contro un’infezione con M. tuberculosis.
Scopo del presente lavoro è stata la costruzione di nuove varianti del ceppo BCG::RD1, caratterizzate da un ridotto grado di
virulenza e da un’inalterata capacità protettiva. Mutazioni puntiformi nel gene codificante per ESAT-6 sono state introdotte in
BCG::RD1, in modo da ottenere la sostituzione di aminoacidi altamente conservati. In particolare, i residui Leu28-Leu29,
Trp43, Gly45 e Met93 sono stati sostituiti con i residui Ala-Ser, Arg e Thr ed i ceppi così ottenuti sono stati denominati, rispettivamente, BCG L28A/L29S, BCG W43R, BCG G45T e BCG M93T.
La virulenza di tali ceppi è stata valutata in topi C57BL/6 e SCID infettati, rispettivamente, per via aerogena e per via endovenosa. Dopo 4 settimane dall’infezione, il numero di CFU ottenute nella milza e nel polmone dei topi infettati con i ceppi BCG
L28A/L29S, BCG W43T, BCG G45T e BCG M93T è risultato paragonabile a quello ottenuto nei topi infettati con BCG e di
circa 1.5 log inferiore rispetto a quello ottenuto nei topi infettati con BCG::RD1. Per valutare l’efficacia protettiva dei ceppi
BCG L28A/L29S, BCG W43T, BCG G45T e BCG M93T, topi C57BL/6 sono stati vaccinati per via intradermica e, dopo 2 mesi,
infettati per via aerogena con due ceppi di M. tuberculosis, H37Rv e Beijing. Dopo 30 giorni dall’infezione, una riduzione di
circa 0.5 log nel numero di CFU è stata osservata nella milza di topi vaccinati con BCG L28A/L29S, BCG W43T, BCG G45T,
BCG M93T e BCG::RDl rispetto a quelli vaccinati con BCG, indicando che il livello di protezione conferito dai ceppi oggetto di studio è comparabile a quello conferito da BCG::RD1.
In conclusione, i dati ottenuti indicano che i ceppi BCG L28A/L29S, BCG W43T, BCG G45T e BCG M93T presentano un buon
compromesso tra ridotta virulenza ed elevato livello di protezione e costituiscono promettenti candidati per un nuovo vaccino
antitubercolare.
ANALISI FUNZIONALE DEL GENOMA DI PARVOVIRUS B19 IN DUE SISTEMI SPERIMENTALI:
INFEZIONE IN VITRO E TRASFEZIONE CON CLONI RICOMBINANTI
Giorgio Gallinella, Francesca Bonvicini, Claudia Filippone, Elisabetta Manaresi, Giovanna Gentilomi, Marialuisa Zerbini,
Monica Musiani
Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale – Sezione di Microbiologia
Università di Bologna, Bologna, Italia
Il Parvovirus B19 è un virus a DNA monocatenario lineare, comprendente una sequenza interna unica codificante per le proteine virali (IR) fiancheggiata da due sequenze terminali ripetute e invertite (ITR). La trascrizione del genoma di Parvovirus B19
è sotto il controllo di un singolo promotore (p6) che dirige la sintesi di un pre-mRNA, successivamente sottoposto a diversi
eventi di splicing alternativo e maturazione, da cui originano le diverse classi di i messaggeri virali.
Scopo del lavoro è stata l’analisi funzionale del genoma virale in un sistema modello di cellule permissive, UT7/Epo-S1,
mediante saggi di infezione in vitro con sieri viremici e di trasfezione con cloni ricombinanti genomici e subgenomici, seguiti
da valutazione quantitativa degli acidi nucleici virali in real-time PCR.
Il saggio di infezione in vitro è stato condotto in cellule sincronizzate e non, per correlare il ciclo replicativo virale rispetto a
quello cellulare. L’analisi dell’espression genica, utilizzando differenti combinazioni di primer, ha permesso di rivelare e quantificare le diverse classi di messaggeri virali e di studiare il differente utilizzo dei segnali di splicing e poliadenilazione a diversi time-point dopo infezione in vitro.
Il saggio di trasfezione è stato condotto utilizzando cloni contenenti l’intera regione genomica codificante e frazioni di diversa
lunghezza delle sequenze terminali, ed è stato seguito da un saggio di infettività sui lisati ottenuti dalle cellule trasfetttate.
L’osservazione in parallelo in termini di attività traduzionale, trascrizionale, replicativa relative ai vari cloni ha permesso di analizzare il ruolo delle sequenze terminali nel ciclo replicativo virale. I cloni utilizzati hanno mostrato capacità di generare particelle virali trasducenti, ad eccezione del clone completamente privo delle regioni terminali, mentre la completa attività replicativa e infettante è legata alla presenza di regioni terminali integre.
I due sistemi sperimentali hanno consentito di monitorare la cinetica di sintesi degli acidi nucleici e individuare regioni critiche
implicate nell’infettività virale, permettendo una migliore comprensione della biologia cellulare e molecolare del virus e delle
interazioni virus-cellula.
57
CARATTERIZZAZIONE DI BIOSURFATTANTI BATTERICI UTILIZZABILI IN CAMPO MEDICO-FARMACEUTICO E SIERO DI LATTE QUALE SORGENTE ALTERNATIVA PER LA LORO
PRODUZIONE
Rivardo F°., De Benedictis E.°, Turner R. J.*, Ceri H.*, Martinotti M.G.,°
° Dipartimento di Scienze Chimiche, Alimentari, Farmaceutiche e Farmacologiche (DiSCAFF) Università del Piemonte
Orientale e * Department of Biological Sciences, Biofilm Research Group, University of Calgary, Canada.
Il termine biosurfattante si riferisce a qualsiasi composto, prodotto da microrganismi, in grado di ridurre la tensione superficiale. I biosurfattanti rispetto alla controparte chimica dei surfattanti presentano speciali vantaggi dovuti alla scarsa tossicità ed alla
natura biodegradabile; inoltre, sono noti per parecchie attività biologiche in qualità di antibiotici, fungicidi, agenti antivirali e
antitumorali, immunomodulatori ed altro. Malgrado le loro notevoli potenzialità, i biosurfattanti competono ancor oggi sul mercato con i surfattanti sintetici a causa dell’ alto costo di produzione. Per questo motivo riuscire a produrre biosurfattanti su sorgenti rinnovabili, oltre ad essere ecologicamente utile, potrebbe offrire anche vantaggi economici di produzione. Scopo di questo lavoro è stata la caratterizzazione chimica e biologica di biosurfattanti batterici e l’utilizzo di siero di latte come substrato
per la loro produzione. Quattordici isolati sporigeni Gram-positivi su un totale di 350 batteri analizzati, hanno evidenziato capacità di produrre biosurfattanti con abbassamenti di tensione superficiale che raggiungevano 25-31 mN/m. Alcuni biosurfattanti
purificati sono stati caratterizzati tramite Spettrometria di Massa come molecole a basso peso molecolare. L’attività biologica di
un biosurfattante purificato prodotto dall’isolato V9T14 è stata saggiata per rimuovere, in associazione con differenti antibiotici, il biofilm formato da un ceppo di E. coli uropatogeno. L’associazione con ceftriaxone, tobramicina, ciprofloxacina era in
grado di aumentare la rimozione di 1 o più logaritmi di UFC batteriche rispetto all’azione del singolo antibiotico, a seconda dell’antibiotico utilizzato. La produzione di biosurfattante da parte dell’isolato V9T14 è stata valutata utilizzando come substrato
di crescita unicamente siero di latte e confrontando i risultati con quelli ottenuti su terreno sintetico. La produzione aveva un
picco a 24 ore su entrambi i substrati ed i prodotti presentavano lo stesso valore di riduzione di tensione superficiale. I risultati sulla struttura chimica e sull’attività biologica indicano che il siero di latte potrebbe garantire la produzione di un biosurfattante a basso costo con proprietà simili a quello ottenuto su terreno sintetico.
AGENTI LEGANTI CARBOIDRATI (CBAs) INIBISCONO POTENTEMENTE L’INTERAZIONE TRA
HIV-1 E MACROFAGI PRIMARI UMANI E LA TRASMISSIONE VIRALE A CELLULE LINFOCITARIE
Michela Pollicita1,2, Stefano Aquaro2,4, Willy J. Peumans3, Els JM Van Damme3, Carlo Federico Perno2, Dominique Schols1,
Jan Balzarini1
1Rega Institute for Medical Research, K.U.Leuven, Leuven, Belgio
2Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Roma, Tor Vergata, Italia
3Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di Ghent, Belgio
4Dipartimento Farmaco-Biologico, Università della Calabria, Rende (CS), Italia
I monociti-macrofagi (M/M) costituiscono un importante bersaglio cellulare per HIV-1 ed un reservoir cruciale in cui il virus
sopravvive per un lungo periodo di tempo, producendo e rilasciando grandi quantità di particelle virali infettanti in grado di diffondere in tutti i distretti corporei. M/M infettati da HIV-1 possono interagire con linfociti T CD4+ e trasferire l’infezione a queste cellule causandone la deplezione. L’importante ruolo rivestito dai M/M nella trasmissione, nella disseminazione e nella persistenza di HIV-1 anche in pazienti trattati con successo con terapia antiretrovirale, e l’insorgenza di resistenza in molti casi a
tale terapia, suggerisce la necessità di identificare nuovi trattamenti contro la replicazione di HIV-1. Gli agenti leganti i carboidrati (CBAs) sono stati recentemente proposti come innovativi composti anti-HIV capaci di legare selettivamente i glicani della
proteina dell’envelope (gp120) di HIV-1. Una pre-esposizione di HIV-1 alle CBAs impedisce l’interazione tra il virus e i recettori cellulari. Le CBAs specifiche per il mannosio (le lectine vegetali HHA, GNA, NPA e CA; la lectina eucariotica cianovirina-N (CV-N)) e la N-acetilglucosamina-specifica (UDA) agiscono come “agenti schermanti” della gp120 di HIV-1, prevenendo l’interazione virus-cellula ospite e quindi l’infezione e la conseguente trasmissione virale. Il nostro lavoro ha evidenziato che
le CBAs prevengono efficacemente l’interazione e il legame tra una varietà di ceppi di laboratorio e isolati di HIV-1 e M/M primari umani. Una pre-esposizione di HIV-1 alle CBAs è in grado di inibire la replicazione virale in M/M infettati con HIV-1 Bal
e di prevenire la formazione di sincizi in coculture di CD4+ T-linfociti C8166 e M/M esposti a HIV-1 NL4.3. La capacità delle
CBAs di prevenire il legame di HIV-1 ai M/M e la conseguente trasmissione virale ai CD4+ T-linfociti potrebbe essere considerata una proprietà importante nell’eventuale scelta di tali composti come microbicidi ad uso clinico, capaci di bloccare la trasmissione sessuale dell’HIV con un segnale di stop molecolare posto all’ingresso delle mucose del corpo.
58
SELEZIONE IN VITRO DI VARIANTI VIRALI DI VIRUS DELL’ INFLUENZA AVIARIA H7N3 DELL’ANATRA IN PRESENZA DI SIALOGANGLIOSIDI
Simone Giannecchini,1, Valeria Clausi,1 Laura Campitelli,2 Isabella Donatelli,2 and Alberta Azzi,1
1Virology Unit, Department of Public Health, University of Florence, 2Department of Infectious, Parasitic and Immune-mediated diseases, Istituto Superiore Sanità, Rome, Italy
Alcuni virus dell’influenza aviaria possono infettare e causare malattia direttamente nell’uomo; pertanto, comprendere quali fattori rendano possibile la trasmissione interspecie, oltre ad essere un problema veterinario, interessa la salute pubblica. La delezione nello stalk della Neuraminidasi (NA) e la presenza di nuovi siti potenziali di glicosilazione nella Emoagglutinina (HA)
sono i principali cambiamenti molecolari osservabili nei virus dell’influenza aviaria trasmessi dagli uccelli acquatici al pollame
domestico. E’ possibile che differenze nel microambiente recettoriale presente in differenti animali inducano tali cambiamenti
nell’adattamento alla nuova specie. In un lavoro precedente, è stato osservato che virus H7N3 del tacchino, derivati “in toto„
dalla trasmissione interspecie dall’anatra, differivano dai ceppi isolati dall’anatra nel Nord Italia prima di un episodio epidemico soltanto in due amminoacidi nell’HA e in pochi amminoacidi, oltre ad una delezione di 23 amminoacidi, nella NA. In particolare, questi cambiamenti aminoacidici erano associati a differenze replicative tra i virus delle due specie, quali la fusione e il
rilascio dalla cellula ospite. Per investigare il ruolo di differenti molecole sialoglicoconiugate, con funzioni di analoghi recettoriali, distribuite nei tessuti degli animali, nell’adattamento del virus ad una nuova specie, il virus H7N3 dell’anatra è stato sottoposto ad una selezione in cellule Madin-Darby canine kidney in presenza o assenza di mono-, di-, e tri-sialogangliosidi, analoghi del recettore virale. Dopo numerosi passaggi nelle suddette condizioni, sono state selezionate varianti virali, in presenza
di monosialogangliosidi, insensibili all’inibizione da parte di questa molecola del legame del virus al recettore, mantenendo inalterate le attività della NA. L’analisi delle sequenze di HA e NA delle varianti virali ha evidenziato alcune mutazioni nella HA,
ma nessun cambiamento nella NA. Di nota, in due varianti virali selezionate con monosialogangliosidi è emersa la medesima
mutazione aminoacidica che introduce un potenziale sito di glicosilazione nella HA. I risultati ottenuti sono in linea con l’ipotesi che l’adattamento della HA virale possa essere il presupposto per successivi cambiamenti nella NA durante le prime fasi
della trasmissione interspecie.
RUOLO DEL GENE CGSNQ2 NELLA RESISTENZA IN VITRO ED IN VIVO AGLI AZOLI DI CANDIDA
GLABRATA
R. Torelli1, B. Posteraro1, S. Ferrari2, M. La Sorda1, D. Sanglard2, M. Sanguinetti1 e G. Fadda1
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italia, e 2Institute of Microbiology, University of
Lausanne and University Hospital Center, Lausanne, Switzerland
L’attività delle pompe di efflusso del tipo ‘ATP-binding cassette (ABC) transporter’ riveste un ruolo centrale nella multi-farmaco resistenza della maggior parte dei funghi patogeni per l’uomo. In Candida glabrata, gli ‘ABC transporter’ CgCDR1 e, ad un
grado minore, CgCDR2 sono ritenuti i maggiori contribuenti della resistenza agli azoli, come dedotto dai loro livelli elevati di
espressione riscontrati in diversi ceppi clinici azolo-resistenti. Un precedente studio condotto nel nostro laboratorio su ceppi di
C. glabrata resistenti agli azoli supportava il significato di tali meccanismi nell’ambito clinico. Tuttavia, due dei ceppi studiati
non esibivano l’espressione alterata di CgCDR1/CgCDR2, ma entrambi superesprimevano un gene che codifica per un’altra
pompa di efflusso, CgSNQ2, un gene molto simile a SNQ2 di Saccharomyces cerevisiae, che è il principale ‘ABC transporter’
associato con la resistenza pleiotropica ai farmaci (PDR). Tale evidenza suggeriva la possibilità che CgSNQ2 fosse responsabile dell’acquisizione della resistenza agli azoli in C. glabrata. Uno dei due isolati (BPY55) è stato usato per delucidare tale fenomeno. L’analisi dell’intera sequenza genica di CgSNQ2 ha confermato che esso è l’omologo del gene di S. cerevisiae SNQ2.
Pertanto, la distruzione di CgSNQ2 in BPY55 causava una riduzione nella azolo-resistenza, mentre la reintroduzione del gene
in BPY2012 (mutante deleto di CgSNQ2) annullava totalmente questo effetto. L’espressione di CgSNQ2 in un ceppo di S. cerevisiae mancante della pompa di efflusso PDR5, omologo dei geni CDR1 di C. albicans e CgCDR1 C. glabrata, mediava la resistenza non solo agli azoli ma anche alla 4-nitrochinolina N-ossido (4-NQO), che è noto essere il substrato specifico di SNQ2.
Infine, abbiamo dimostrato che il gene era coinvolto nella risposta in vivo al fluconazolo in un modello murino di candidosi
sistemica, ma non era in grado di influenzare la virulenza di C. glabrata.
59
CGPDR1 CONTROLLA L’ESPRESSIONE DEL GENE CGSNQ2 COINVOLTO NELLA RESISTENZA
AGLI AZOLI IN CANDIDA GLABRATA
M. Sanguinetti1, R. Torelli1, B. Posteraro1, S. Ferrari2, M. La Sorda1, D. Sanglard2, and G. Fadda1
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italia, e 2Institute of Microbiology, University of
Lausanne and University Hospital Center, Lausanne, Switzerland
Recenti studi hanno dimostrato che la superespressione coordinata dei geni di Candida glabrata CgCDR1/CgCDR2, i principali contribuenti della resistenza agli azoli, è controllata da un comune fattore di trascrizione, CgPdr1p, codificato da un gene omologo a quelli dei regolatori di Saccharomyces cerevisiae Pdr1p-Pdr3p, noto come CgPDR1. In particolare, veniva stabilita l’importanza di tale gene nella resistenza acquisita di C. glabrata, attraverso la caratterizzazione di mutanti Cgpdr1D derivativi di
ceppi clinici e di laboratorio. Tali evidenze erano in accordo con la presenza nei promotori dei geni CgCDR1/CgCDR2 di elementi regolatori di DNA, chiamati appunto elementi della risposta pleiotropica ai farmaci (PDRE), che sono stati per primi identificati nel promotore del gene PDR5 di S. cerevisiae, che codifica per un importante ‘ABC transporter’ funzionalmente simile
a CDR1 di C. albicans o CgCDR1 di C. glabrata. L’analisi della sequenza nucleotidica del gene ‘ABC transporter’ CgSNQ2
derivato dal ceppo clinico azolo-resistente BPY55, da noi clonato e caratterizzato quale nuovo responsabile della resistenza
acquisita agli azoli in C. glabrata, permetteva di identificare nel suo promotore quattro elementi PDRE che sono da considerare potenziali siti di legame per il gene regolatore CgPDR1. A supporto di ciò, nel gene CgPDR1 di BPY55 veniva identificata
una singola mutazione ‘gain-of-function’, che a sua volta risultava nella sostituzione aminoacidica, P822L. Inoltre, la distruzione del gene era in grado di conferire sensibilità agli azoli al ceppo SFY55 (mutante deleto di CgPDR1) e di annullare l’espressione di CgSNQ2, perciò suggerendo che tale gene è controllato da CgPDR1. In conclusione, i risultati ottenuti indicano
che l’allele mutato CgPDR1 causava in BPY55 la selettiva superespressione di CgSNQ2, sebbene non possa essere escluso che
modificazioni occorse in specifici PDRE abbiano alterato la coordinata ‘upregulation’ degli altri due geni CgCDR1/CgCDR2
nel ceppo studiato.
LA PROTEINA INTERNALINO-SIMILE ELRA È COINVOLTA NELLA RISPOSTA INFIAMMATORIA
DELL’OSPITE E NELLA VIRULENZA DI ENTEROCOCCUS FAECALIS
B. Posteraro1, S. Brinster2, H. Bierne3, A. Alberti2, S. Makhzami2, E.Pradel4, M. Sanguinetti1, P. Serror2 e G. Fadda1
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italia; 2Unité des Bactéries Lactiques et pathogènes
Opportunistes UR13888, INRA, Jouy-en-Josas, France,3Unité des Interactions Bactéries-Cellules, Institut Pasteur, INSERM
U604, INRA USC2020, Paris, France; 4Centre d’Immunologie de Marseille Luminy, INSERM/CNRS/Université de la
Méditerranée, Marseille, France.
Enterococcus faecalis è un importante patogeno nosocomiale associato con elevata morbilità e mortalità nei pazienti con gravi
immunocompromissioni o con severe malattie di base. Il suo genoma codifica per numerose proteine che potrebbero essere coinvolte nella virulenza del microrganismo. Il presente lavoro descrive per la prima volta la caratterizzazione di ElrA, una proteina di E. faecalis, internalino-simile, appartenente alla famiglia proteica WxL. Tale proteina contiene un peptide segnale N-terminale, un dominio ripetuto ricco in leucina che potrebbe interagire con le cellule dell’ospite e un dominio WxL C-terminale
che interagisce con il peptidoglicano. È stato mostrato che la distruzione del gene elrA attenuava in maniera significativa la virulenza enterococcica in un modello di peritonite murina. Inoltre, il mutante con la delezione elrA esibiva una ridotta capacità di
internalizzazione e di produzione di IL-6 da parte dei macrofagi peritoneali murini infettati in vivo. Pertanto, i risultati indicano che il prodotto del gene elrA è coinvolto nel processo di infezione di E. faecalis in vivo e suggeriscono che tale proteina di
superficie possa contribuire alla virulenza di E. faecalis attraverso la stimolazione della risposta infiammatoria dell’ospite.
60
CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA E MOLECOLARE DEI CEPPI DI ESCHERICHIA COLI PRODUTTORI DI B-LATTAMASI A SPETTRO ESTESO ISOLATI DA PAZIENTI CON BATTERIEMIA
Rosaria Porta, Teresa Spanu, Barbara Fiori, Michela Sali, Antonella Zumbo, Paola Cerini, Rosa Martucci, Tiziana D’Inzeo,
Fiammetta Leone, Patrizia Mazzella, Maurizio Sanguinetti, Giovanni Fadda
La produzione di b-lattamasi a spettro esteso (ESBL) nei batteri gram-negativi è emersa quale causa crescente di resistenza ad
oximino-cefalosporine e monobattamici, particolarmente in Escherichia coli. Inizialmente, la maggior parte di questi enzimi
derivavano da mutazioni di geni TEM e SHV. Successivamente sono emersi altri enzimi, inclusi anch’essi nella classe A di
Ambler, quali ceftazidimasi tipo PER, VEB, TLA-1, e GES/IBC e cefotaximasi tipo SFO-1, BES-1, e CTX-M, identificati sempre maggior frequenza. Spesso i ceppi ESBL-positivi sono resistenti ad aminoglicosidi, trimetoprim-sulfametossazolo e chinoloni, rendendo maggiormente problematico il trattamento delle infezioni severe quali le batteriemie. In questo studio descriviamo la prevalenza e le caratteristiche microbiologiche dei ceppi di E. coli produttori di ESBL, responsabili di batteriemia nei
pazienti ricoverati nel Policlinico Universitario “A. Gemelli”.
PREVALENZA DELL’INFEZIONE DA MICROSPORIDI IN CAMPIONI FECALI DI PAZIENTI IMMUNOCOMPROMESSI: RISULTATI PRELIMINARI
Luca Masucci, Rosalia Graffeo, Carla Mauro, Antonella Zumbo, Paola Cerini, e Giovanni Fadda
I microsporidi, protozoi intracellulari obbligati appartenenti al Phylum Microspora, sono microrganismi eucarioti primitivi in
quanto privi di mitocondri, apparato del Golgi, perossisomi. Parassitano vertebrati ed invertebrati. Sette generi sono agenti eziopatogenetici per l’uomo. Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon specie E. intestinalis, E. hellem e E. cunicoli sono stati
descritti come patogeni opportunisti in pazienti infetti da HIV e in pazienti immunocompromessi quali trapiantati d’organo.
Il nostro studio preliminare ha preso in considerazione 39 pazienti con un range di età compreso tra 3 e 87 anni di cui 13 femmine e 26 maschi divisi in due gruppi. Il primo gruppo comprende 19 pazienti di cui 6 stranieri e 13 italiani con immunodeficit ricoverati presso i reparti di malattie infettive che presentavano diarrea e febbre e il secondo 20 pazienti stranieri i cui campioni di feci avevano aspetto diarroico. La ricerca sui campioni di feci è stata condotta mediante microscopia previa colorazione permanente, esame colturale e amplificazione degli acidi nucleici (PCR) come riportato in letteratura.
I risultati hanno portato ad evidenziare in un paziente italiano immunocompromesso la presenza di E. intestinalis.
61
UN NUOVO SISTEMA PER LA RICERCA DI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX IN
CAMPIONI BIOLOGICI
G. Delogu1, V. Drouillon3, F. Ardito1, M. Benecchi2, R. Torelli1, P. Lagrange3, C. Chezzi2, J-L. Herrmann4, G. Fadda1, G.
Dettori2
1 Università Cattolica del Sacro Cuore, Istituto di Microbiologia, Rome, Italy; 2 University Hospital Parma, Section of microbiology, Parma, Italy; 3 Saint Louis Hospital, Infectious diseases Laboratory, PARIS Cedex 10, France; 4 Infectious diseases
Laboratory, Raymond Poincaré Hospital, Garches, France
La possibilità di ricercare ed identificare rapidamente Mycobacterium tuberculosis complex (Mtb) direttamente su campioni biologici è un requisito importante al fine di una corretta gestione dei pazienti con un sospetto di tubercolosi (TB). Un nuovo metodo basato sull’utilizzo della Transcription Reverse-transcription Concerted reaction (TRC) è stato valutato in uno studio multicentrico. La tecnologia TRC consente una amplificazione one step seguita dal monitoraggio mediante real-time di rRNA 16S
di Mtb direttamente su campioni di origine respiratoria e non. Le prestazioni cliniche del suddetto saggio sono state valutate in
tre laboratori in modo indipendente. La sensibilità e specificità del metodo sono state determinate su campioni di espettorato
cui erano state aggiunte quantità note di Mtb. I risultati ottenuti con TRC sono stati confrontati con analisi batterioscopiche e
colturali (MGIT e Lowenstein-Jensen), nonché con un metodo di ricerca molecolare ProbeTec (Becton Dickinson, USA). Nel
presente studio sono stati analizzati 633 campioni clinici. La sensibilità del test TRC è stata determinata in 50 CFU per ml di
campione biologico. Dei 633 campioni clinici analizzati con il metodo colturale, 135 erano positivi per Mtb, 487 negativi, 10
positivi micobatteri non tubercolari, ed 1 campione è risultato contaminato. Dei 135 campioni positivi alla coltura, 61 erano
positivi al batterioscopico (sensibilità 45,2%) e 118 positivi con il TRC (sensibilità 87,2%). Dei 74 campioni con batterioscopico negativo/coltura per Mtb positiva, TRC è risultato positivo in 59 casi (sensibilità 79,7%). Dei campioni positivi per micobatteri non tubercolari, nessuno è risultato positivo con il TRC (specificità 100%). I risultati di questo studio dimostrano che è
possibile dimostrare la presenza di Mtb nei campioni biologici in meno di due ore utilizzando un sistema ad elevata sensibilità
e specificità basato sulla real-time PCR.
SPECIFIC MUTATIONS RELATED TO RESISTANCE TO HIV-1 INTEGRASE INHIBITORS ARE
ASSOCIATED WITH REVERSE TRANSCRIPTASE MUTATIONS IN HAART-TREATED PATIENTS
F Ceccherini-Silberstein1, I Malet2, L Fabeni1, V Svicher1, S Dimonte1, C Gori3, S Bono1, A Artese4, R D’Arrigo3, A
Antinori3, S Alcaro4, A d’Arminio Monforte5, V Calvez2, AG Marcelin2, CF Perno3
1University of Rome Tor Vergata; 2Hôpital Pitié-Salpétrière, Paris, France; 3INMI “L. Spallanzani”, Rome; 4University of
Catanzaro; 5University of Milan, Italy.
Background: A tight interaction between HIV integrase (IN) and reverse transcriptase (RT) is mandatory for the successful
completion of HIV replication process. HIV-1 integrase-inhibitors (INIs) belong to a new promising anti-HIV drug-class soon
available in clinical practice. However, already 45 IN mutations have been associated with resistance to different INIs. Their
potential role in clinical practice has yet to be established, in view also of lack of information about their prevalence in INInaïve patients and their relationship with HAART-treatment and with RT-mutations.
Methods: Gene sequences of the entire IN and RT (1-320 residues) from plasma samples of a well-defined cohort of 448 HIV1 infected individuals (134 drug-naïve and 334 failing HAART), all INI-naïve, were compared and analyzed.
Results: The IN protein sequence was invariant in 178 out of 288 residues (62% conservation) in untreated patients, and paradoxically more conserved in HAART-treated patients (194 out of 288 residues, 67% conservation). Residues required for successful HIV-1 integration within the catalytic triad, the HHCC zinc-binding site and residues crucial for LEDGF/p75 binding
were fully conserved.
Regarding the prevalence of INI-resistance mutations, 29 out of 45 mutations were absent (0%) in both untreated and HAARTtreated patients. Differently, some INI-resistance mutations increased their frequency in HAART-failing patients and showed
associations with specific RT-resistance mutations. M154I and V165I mutations occurred at 6% frequency in untreated patients,
reaching in HAART-treated patients 21.3% (p<0.001) and 13.4% (p=0.022), respectively. M154L was absent (0%) in drug-naïve
patients, at 5.7% frequency in HAART-treated patients (p=0.003), and was positively associated with INI-resistance mutation
V165I (p<0.001) and RTI-resistance mutations F227L (p=0.01) and T215Y (p=0.05).
Conclusions: The association between selected INI- and RTI-mutations supports the hypothesis of a tight interaction of these
two HIV-proteins, and a potential co-evolution of some of their mutations. Beside theoretical implications, these results support
the importance of IN-sequencing in RTI-treated patients starting INI-containing regimens.
62
SPECIFICI PATTERN MUTAZIONALI NELLA GLICOPROTEINA GP41 DI HIV-1 SONO ASSOCIATI
A SUCCESSO IMMUNOLOGICO IN PAZIENTI INFETTI CON HIV-1 TRATTATI CON T-20
V Svicher1, S Aquaro1,2, R D’Arrigo3, A Artese4, S Dimonte1, S Alcaro4, G Di Perri5, S Lo Caputo6, U Visco-Comandini3,
F Mazzotta6, S Bonora5, A Antinori3, P Narciso3, F Ceccherini-Silberstein1, CF Perno1
1Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”; 2Università della Calabria, Rende (CS); 3INMI “L. Spallanzani”, Roma;
4Università di Catanzaro “Magna Graecia”; 5Ospedale “Amedeo di Savoia”, Torino; 6Ospedale “SM Annunziata”, Firenze
La glicoproteina gp41 di HIV-1 media il processo di fusione del virus e svolge un ruolo chiave nei meccanismi che regolano la
cito-patogenicità di HIV-1. E’ stato ben dimostrato che mutazioni che alterano la capacità fusogenica di gp41 o che alterano il
legame del dominio intracellulare di gp41 con la calmodulina modulano la capacità di tale glicoproteina di indurre l’apoptosi
dei linfociti T CD4+, ma non la capacità replicativa del virus. E’ pertanto presumibile che la pressione esercitata sul virus dal
T-20, il primo inibitore anti-HIV della fusione in uso clinico, possa selezionare specifici pattern mutazionali in grado di modulare l’effetto citopatico di HIV-1. A tal fine abbiamo analizzato le correlazioni tra le mutazioni della gp41 e i parametri viroimmunologici, studiando una ampia coorte di 73 pazienti trattati con T-20. Nonostante un fallimento virologico osservato durante il trattamento con il T-20 di 48 settimane, i pattern mutazionali V38A+T18A e V38A+N140I sono risultati associati a un guadagno immunologico rispettivamente di +112cellule/ul e +209cellule/ul ma non a variazioni significative di viremia. Studi di
dinamica molecolare hanno mostrato che la copresenza delle mutazioni V38A e N140I abroga alcune interazioni tra i residui
della gp41 importanti per la capacità fusogenica di gp41. L’analisi nucleotidica ha invece evidenziato che i codoni codificanti i
residui 38 e 18 in gp41 sono complementari nella struttura secondaria del Rev-Responsive-Element (che è sequenza di RNA
all’interno del gene env) ed in particolare nel dominio di legame con la proteina regolatoria Rev. In netto contrasto, la selezione da parte del T-20 della mutazione T268A, localizzata nel dominio di legame di gp41 con la calmodulina, è risultata associata ad una drastica riduzione dei linfociti T CD4+.
In conclusione, il T-20 può selezionare pattern mutazionali in grado di modulare l’effetto citopatico di HIV-1 mediante meccanismi che agiscono a livello proteico e di RNA e che sembrano non influenzare la capacità replicativa del virus. Questo concetto è importante per il corretto uso del T-20 e per il disegno di nuovi inibitori dell’entrata.
DIAGNOSI E CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE MEDIANTE PCR DI ISOLATI DI ACANTHAMOEBA SPP.
Di Cave D1,2, Monno R3 , De Filippis P1, D’Orazi C2., Berrilli F1
1Università degli Studi di Roma “Tor Vergata”
2Azienda Ospedaliera Universitaria Policlinico Tor Vergata
3Università degli Studi di Bari
Al genere Acanthamoeba appartengono amebe a vita libera a distribuzione cosmopolita e ampiamente diffuse nell’ambiente in
particolare nel suolo e nell’acqua. Questi protozoi opportunisti possono causare diverse patologie nell’uomo tra cui gravi cheratiti (AK). Inoltre è ormai noto che queste amebe a vita libera possono ospitare diverse specie di batteri endosimbionti, contribuendo alla loro diffusione.
Studi molecolari hanno permesso la classificazione del genere Acanthamoeba in 15 differenti genotipi definiti da T1 a T15. Sulla
base di questa classificazione la maggior parte delle infezioni umane da AK sono state al momento prevalentemente associate
al genotipo T4.
La diagnosi di laboratorio è complessa e si basa principalmente sull’identificazione microscopica diretta e/o colturale delle cisti
da “scraping”corneali, biopsie, lenti a contatto e liquido di conservazione delle lenti stesse. Recentemente sono state utilizzate
metodiche di PCR per l’identificazione di Acanthamoeba spp., rivelate utili per una diagnosi rapida e sensibile di casi umani di
AK e per l’identificazione del genotipo.
Nel presente lavoro vengono riportati i risultati ottenuti dallo studio di 11 campioni , 4 ottenuti da pazienti affetti da cheratite
amebica diagnosticata su base clinica e mediante identificazione morfologica, 7 da diversi campioni di acque domiciliari. Su
tutti i campioni in esame è stata eseguita una PCR per l’amplificazione di un frammento di 458-bp della piccola subunità nucleare (18S rRNA). Degli 11 campioni analizzati, 5 sono risultati positivi per DNA di Acanthamoeba, 4 provenienti dagli isolati
umani, 1 dall’acqua. L’analisi delle sequenze ottenute ha permesso l’attribuzione di tutti gli isolati al genotipo T4.
Considerando l’importanza di una diagnosi precoce nelle infezioni umane da AK, i risultati ottenuti confermano l’utilità della
PCR quale strumento diagnostico valido nella ricerca di Acanthamoeba e proponibile per una routine di laboratorio. Viene inoltre sottolineato il ruolo della diagnosi molecolare per la rilevazione di amebe potenzialmente patogene in indagini ambientali.
63
EFFETTO DI COMPOSTI NUCLEOSIDICI CARBOCICLICI FOSFONATI SULL’ATTIVITÀ DELLA
TRASCRITTASI INVERSA DI HTLV-1 OTTENUTA DA LINFOCITI DI PAZIENTI TSP
Emanuela Balestrieri1, Claudia Matteucci1,2, Arianna Ascolani3, Antonella Minutolo1, Michela Ascolani3, Giovanni Romeo4,
Ugo Chiacchio5, Steve Jacobson6, Beatrice Macchi2, Antonio Mastino7.
1 Dip. di Medicina Sper. e Sci. Bioch.. e 3Dip. di Neuroscienze, Univ. di Roma “Tor Vergata”, Roma; 2Ist. di Neurobiol. e
Medicina Mol., C.N.R., Roma; 4Dip. Farmaco-Chimico, Univ. di Messina, Messina; 5Dip. di Sci. Chimiche, Univ. di Catania,
Catania; 6 Viral Immunology Section, NINDS/NIH Bethesda, USA; 7Dip. di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari.,
Univ. di Messina, Messina.
E’ stata recentemente dimostrata nel nostro laboratorio la capacità di alcuni composti nucleosidici di inibire direttamente la trascrittasi inversa (RT) di HTLV-1, ottenuta in forma di lisato crudo da cellule di una linea cronicamente infetta, mediante un saggio cell free. Ai fini di un eventuale trasferimento clinico dei dati ottenuti, abbiamo voluto verificare se tale saggio potesse essere utilizzato per valutare: ì) l’attività dell’RT da colture di linfociti infettati con HTLV-1, ìì) l’attività inibitoria di composti
nucleosidici verso l’RT di HTLV-1 ottenuta da colture di linfociti di pazienti infetti. A tale scopo abbiamo utilizzato come fonte
di RT di HTLV-1: ì) supernatante di linfociti di donatori sani infettati in vitro con HTLV-1, ìì) supernatante di linfociti di pazienti HTLV-1+ affetti da TSP non trattati o trattati con AZT e IFN, prima e dopo terapia. Quali composti nucleosidici sono stati saggiati AZT, 3TC Tenofovir (TFV) ed alcuni composti nucleosidici fosfonati di nuova sintesi. I risultati hanno mostrato che: i) è
effettivamente possibile evidenziare un’attività RT, con il nostro saggio, utilizzando lisato da colture di linfociti infettati in vitro
con HTLV-1 o di pazienti TSP HTLV-1+; ii) i vari composti presentavano diversa attività a seconda della fonte di RT utilizzata. In particolare i composti carbociclici fosfonati di nuova sintesi mostravano una maggiore efficacia rispetto al TFV nell’inibire l’RT sia dei pazienti TSP che delle linee HTLV-1+. Per l’RT ottenuta dai pazienti analizzati prima e dopo terapia, non è stata
messa in evidenza alcuna differenza nella sensibilità alle diverse sostanze. In conclusione i nostri dati mostrano che il saggio di
inibizione dell’RT di HTLV-1 messo a punto permette di effettuare uno screening rapido dell’attività dell’RT di HTLV-1 da campione di origine diversa e che tale saggio potrebbe essere quindi utilizzato per valutare l’attività inibitoria dei diversi composti
direttamente sull’RT di pazienti infettati con HTLV-1.
CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA E GENOTIPICA DI LACTOBACILLUS SP. ISOLATI DA
TAMPONI VAGINALI
Valeria Giummarra1, Annalisa Mangiafico1, Carolina Ferranti1, Cinzia Randazzo2, Cinzia Caggia2, Gianna Tempera1,
Salvatore Rugolo1, Lucia Silvana Roccasalva1 e Pio Maria Furneri1.
1Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Catania, labmicro
2Dipartimento di Orto-Floro-Arboricoltura e Tecnologie Agroalimentari (DOFATA), Università degli Studi di Catania.
Introduzione. I lattobacilli sono dei bacilli gram positivi, aerobi facoltativi o raramente aerobi obbligati, pleomorfi e quasi sempre immobili. Nella vagina, nell’età compresa tra la pubertà e la menopausa, si ritrovano varie specie di Lactobacillus (generalmente, la più abbondante è Lactobacillus acidophilus, ma si riscontrano anche Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei,
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus plantarum). L’identificazione delle specie di Lattobacillus
richiede,in molti casi, la valutazione di numerose caratteristiche fisiologiche e biochimiche.
Metodi. 150 ceppi di Lactobacillus sp sono stati isolati da tamponi vaginali in M.R.S. agar (Oxoid), 37°C per 24-48 h in giare
per anaerobiosi (5% di CO2). Identificati mediante prove biochimiche, valutazione della produzione di H2O2 e tipizzati mediante analisi di restrizione RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) della 16S rRNA impiegando gli enzimi Hae III,
Msp I ed Alu I.
La sensibilità in vitro a ciprofloxacina, ofloxacina, ampicillna, eritromicina, clindamicina, vancomicina, e kanamicina è stata
valutata mediante test di sensibilità agli antibiotici (MIC), utilizzando le linee guida stabilite dal Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI ).
Risultati. La maggior parte degli isolati apparteneva, nell’ordine alle specie L. rhamnosus, L. acidophilus e L. plantarum. La
maggior parte dei L. acidophilus risultano essere positivi alla prova della perossidasi, a differenza delle altre specie che risultano per la maggior parte negative. La maggior parte dei lattobacilli sono resistenti ai chinoloni e sensibili ad antibiotici a
largo spettro quali l’ampicillina, eritromicina e vancomicina, ad eccezione di L. acidophilus che è naturalmente resistente alla
vancomicina.
64
LE COMPLICANZE INFETTIVE NEL PAZIENTE SOTTOPOSTO A TRAPIANTO DI RENE
V. Scriffignano1, M. Veroux2, G. Giuffrida2, A. Sciacca1, E. Grasso1, P. Grassi1, M. Gagliano2, PF Veroux2, G. Nicoletti1.
Laboratorio Analisi1 , Dipartimento di Scienze Chirurgiche, Trapianti d’Organo e Tecnologie Avanzate2, Azienda Policlinico
Universitario, Università di Catania.
Introduzione. Il trattamento immunosoppressivo dopo trapianto di rene, può determinare un incremento di complicanze infettive. Abbiamo valutato l’incidenza e il tempo di comparsa delle complicanze infettive in una popolazione di 52 pazienti (45 da
cadavere e 7 da vivente, età media 44±13 anni) sottoposti a trapianto di rene singolo (n=47), doppio (n=4) o combinato renepancreas (n=1) nel periodo compreso tra dicembre 2005 e dicembre 2006. Materiali e metodi. Il protocollo imunosoppressivo
è stato a base di TAC, MMF e STR in 37 pazienti (71%), di CyA, MMF e STR in 8 pazienti (15%), a base di SRS, MMF e STR
in 5 pazienti (10%) e a base di CTN, CyA e STR nei rimanenti 2 pazienti (4%). Il follow-up è stato suddiviso in tre periodi; <6
settimane (perioperatorio), da >6 settimane a <6 mesi (precoce) e >6 mesi (tardivo). Risultati. Nella fase pre-trapianto tutti i 52
pazienti sono risultati HBsAg negativi, 5 (10%) sono risultati positivi per HCVAb e 41 (79%) hanno avuto il contatto primario con il CMV (IgG). Nella fase post-trapianto nessun paziente ha manifestato nuovi casi d’infezione da HBV e HCV, mentre
3 (6%) hanno presentato nella fase precoce di follow-up una reattività anti-HCV. Nove pazienti (17%) hanno manifestato un’infezione attiva da CMV nella fase precoce, considerate infezione primaria in 4 pazienti, e riattivazione in 5 pazienti; 17 pazienti (33%) hanno presentato infezioni batteriche (urinarie in 16, ematiche in 1)
Tipo di infezione
N (%)
Batteriche
* = in concomitanza alle infezioni urinarie
E. coli
E. foecalis
K. pneumoniae
P. aeruginosa
2 (3.8%)
1 (2%)
Infezioni urinarie
16 (30,7%)
7 (13%)
6 (11.5%)
Drenaggio Addominale*
2 (3.8%)
P. aeruginosa
S. aureus
1 (2%)
1 (2%)
2 (3.8%)
S. agalactiae
1 (2%)
1 (2%)
Lesioni Cutanee*
Emocoltura (E.coli)
1 (2.0%)
Escreato (S.haemolyticus)*
1 (2.0%)
M. pneumoniae*
2 (3.8%)
Fungine (C. albicans)
5 (9.6%)
Infezioni urinarie
4 (7.6%)
Drenaggio addominale
1 (2.0 %)
P. Carinii
1 (2.0%)
S. aureus
Conclusioni I protocolli immunosoppressivi impiegati hanno determinato una incidenza relativamente bassa di complicanze
infettive, prevalentemente di scarso significato clinico. La più alta incidenza si evidenzia entro il sesto mese dal trapianto, quando il regime immunosoppressivo esercita al massimo il suo effetto deprimente sul sistema immunitario del paziente.
65
CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA E GENOTIPICA DI CEPPI DI STREPTOCCUS PYOGENES
ISOLATI DA INFEZIONI INVASIVE
Valeria Giummarra, Carolina Ferranti, Gianna Tempera, Daria Nicolosi, Lucia Silvana Roccasalva, e Pio Maria Furneri
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università degli Studi di Catania
Introduzione. Streptoccus pyogenes è responsabile di varie sindromi cliniche, dalle meno-severe quali le infezioni della pelle
e di faringite a quelle invasive quali la bacteremia, l’artrite, la febbre reumatica, la sindrome da shock tossico o la fascite necrotizzante. La dimostrata capacità di SGA di penetrare all’interno delle cellule dell’apparato respiratorio e di sopravviverci, ha
spinto lo studio dei ricercatori anche alla proteina F . Essa, codificata dal gene prtF1, al pari d’altre proteine leganti la fibronectina, è necessaria per l’internalizzazione di SGA. Negli ultimi anni è stato messo in evidenza che la distribuzione della frequenza del determinante genetico del fattore di virulenza proteina M sia, significativamente, differente fra microrganismi di
diversi fenotipi di resistenza e fra le popolazioni sensibili e resistenti di SGA. Inoltre, è stato evidenziata una correlazione tra la
resistenza ai macrolidi e la presenza della proteina F1, e una corrispondenza con l’emm-tipo, cioè l’identificazione dell’isotipo di proteina M. e la resistenza stessa. Infine, studi condotti per dimostrare l’associazione epidemiologica tra geni di resistenza e le tossine pirogeniche hanno concluso, che le differenti incidenze dei geni di antibiotico-resistenza e dell’esotossina fra le
popolazioni di SGA non sembrano avere un’importanza clinica intrinseca.
Scopo. La finalità di questo lavoro è stata quella di caratterizzare ceppi provenienti da infezioni di tipo invasivo studiando: genotipo e fenotipo di resistenza ai macrolidi; la presenza di proteine di internalizzazione quali prtF1, prtF2 e pfbP1; l’emm-tipo
Metodi. 37 ceppi sono stati raccolti durante una policentrica nazionale sulle malattie gravi e isolati da infezioni di tipo invasivo e precisamente da ascessi (60%), pielonefrite (8%), setticemia (6%), endoftalmite (6%), cellulite/flemmone (5%), ulcera diabetica (3%), endometrite (3%), osteomielite (3%), polmonite (3%), pleurite (3%). I campioni si presentavano sotto forma di pus
o sangue (ascessi), tessuto o liquido sinoviale (cellulite/flemmone), urine da cateteri (pielonefrite), sangue setticemia), liquido
pleurico (pleurite), etc. L’analisi fenotipica è stata condotta con le procedure indicata dal CLSI. La ricerca dei genotipi di resistenza ai macrolidi e alle tetracicline, dei geni per le proteine di internalizzazione, e degli emm-tipi è stata fatta mediante PCR.
Ove necessario si è proceduto al sequenziamento degli amplificati.
Risultati. 22 ceppi erano sensibili all’eritromicina, mentre 14 erano resistenti. Il fenotipo più rappresentato è stato M seguito
dal costitutivo e inducibile. Di conseguenza il genotipo più frequente è stato quello mef(A) seguito dai due erm(B) ed erm(A).
Per quanto attiene all’emm-tipo gli isotipi più frequenti sono stati 1, 5, 12, e 22. Sia prtF1 e prtF2 erano presenti nella larga maggioranza dei ceppi, pressoché simile la prevalenza di pfbP1.
66
Poster
67
CARATTERIZZAZIONE DI BATTERI DEGRADANTI IDROCARBURI MONOAROMATICI: NUOVI
POTENZIALI SPAZZINI DEL MARE?
Deriu Antonella, Sechi Leonardo A., Usai D., Zanetti Stefania
Dipartimento di Scienze Biomediche Sezione di Microbiologia Sperimentale e Clinica, Università degli Studi di Sassari.
Le coste della Sardegna sono ad alto rischio ambientale, sia a causa del continuo transito di petroliere e navi passeggeri nello
stretto di Bonifacio, sia per la presenza dello stabilimento petrolchimico di Porto Torres, uno dei centri di maggiore importanza per la elaborazione dei prodotti petroliferi (produzione prodotti chimici organici ed inorganici, stoccaggio idrocarburi e GPL).
Nel recente passato due gravi incidenti hanno fatto emergere i problemi di contaminazione dell’area costiera oggetto dello studio: il rilascio accidentale di orimulsion nella centrale termoelettrica di Fiume Santo e l’esplosione della Panam Serena,
petroliera che scaricava 6.500 tonnellate di benzene nel porto industriale. La vocazione turistica della città, l’economia di una
parte della popolazione basato sulla pesca e la presenza del Parco Nazionale dell’Asinara, rendono urgente l’attuazione di interventi di messa in sicurezza e bonifica ambientale.
Scopo primario del lavoro è stato quello di identificare e caratterizzare dal punto di vista molecolare e fenotipico, i microrganismi isolati nell’area costiera antistante lo stabilimento petrolchimico di Porto Torres; valutare la loro capacità di poter
crescere utilizzando benzene, toluene, xilene e cloro-benzene (B,T,X,Cl-B) come unica fonte di carbonio e verificarne la
attività degradativa.
I microrganismi identificati erano prevalentemente bacilli gram negativi, appartenenti alla classe G-PROTEOBACTERIA . Tutti gli
isolati erano in grado di formare spessi biofilm su piastre di polistirene, il 30% di questi erano in grado di produrre enzimi extracellulari, oltre il 70% erano resistenti ad antibiotici di uso umano. Alcuni ceppi appartenenti ai generi Vibrio, Pseudomonas,
Halomonas ed Alcaligenes hanno mostrato efficiente capacità di metabolizzare i B,T,X,Cl-B la cui completa degradazione è
stata confermata da analisi gas-cromatografiche.
UTILIZZO DI TEST SIEROLOGICI NELLE INFEZIONI DA CHLAMYDIA TRACHOMATIS E
CHLAMYDIA PNEUMONIAE
A. Lambiase, M. Del Pezzo, V. Grisolia, G. Minei, F. Rossano
Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L.Califano”
Facoltà di Medicina e Chirurgia. Università di Napoli “Federico II”
Infezioni sostenute da C. pneumoniae e C. trachomatis risultano di difficile diagnosi a causa di una serie di fattori come la variegata espressività sintomatologica. I test sierologici risultano un valido aiuto quando vi sia impossibilità di valutare la presenza
del batterio o di sue componenti dal sito d’infezione, tanto da divenire la base della diagnostica di infezioni da Chlamydia. Il
dosaggio degli anticorpi di classe IgA ed IgM per la rilevazione dello stato di infezione acuta e quello degli anticorpi di classe
IgG per la valutazione dello stato di malattia e per il follow-up terapeutico attraverso metodica ELISA, risulta essere un sistema dotato di elevata sensibilità e specificità. I kit basati su tale metodica ed impiegati di routine nel nostro laboratorio per effettuare tali dosaggi (Eurospital) utilizzano, per la diagnosi di C. pneumoniae, corpi elementari purificati del ceppo TW183, e per
la diagnosi di C. trachomatis, peptidi sintetici specifici del batterio. Scopo della presente nota è fornire dati che siano indicativi
della nostra esperienza nell’utilizzo di tale metodologia. Per quanto riguarda la ricerca di anticorpi anti-C. pneumoniae, considerando che il batterio risulta agente eziologico del 10% di malattie respiratorie acute, ricerchiamo la presenza di immunoglobuline di classe IgA in quanto presenti sia nella fase acuta di infezioni primarie sia nella fase acuta delle reinfezioni. Qualora si
sospetti un’infezione primaria di C. pneumoniae, la ricerca delle IgM, purchè fatta nella fase iniziale, può avere un buon valore diagnostico. La ricerca delle IgG su coppie di sieri prelevati a distanza di 3-4 settimane può dare valide indicazioni per definire la fase della malattia.
Anche per quanto riguarda la ricerca di anticorpi anti-C. trachomatis, ricerchiamo la presenza di immunoglobuline di classe IgG e
IgA la cui contemporanea determinazione facilita la diagnostica delle infezioni croniche, in particolare se profonde. Confrontando
la metodica ELISA con quella della microimmunofluorescenza indiretta (MIF), abbiamo riscontrato alti livelli di concordanza fra
test, oltre che buoni livelli di sensibilità (94,5%) e specificità (92%). Questi dati sono per noi indicativi di sicurezza dei risultati,
in particolar modo perché la metodica ELISA risulta essere caratterizzata da una interpretazione di tipo non soggettivo, da facilità
di esecuzione oltre che da possibilità di automazione che, come è noto, riduce notevolmente il margine di errore.
Verkooyen RP et al. J Med Microbiol 1997; 46(11): 959-64
De Barbeyrac B et al. Ann Biol Clin 2006; 64(5): 409-19
68
TEST IMMUNOCROMATOGRAFICO PER LA DIAGNOSI SIEROLOGICA DI LEISHMANIOSI
VISCERALE: PARAGONE CON L’IMMUNOFLUORESCENZA INDIRETTA
*1Monno R., 1Di Molfetta E., 1Bottalico P., 1Bruno R., 1Fumarola L.
Dip. Medicina Interna e Medicina Pubblica, Università degli Studi di Bari, Policlinico, P.zza G. Cesare 11, 70124 Bari
In questo studio un metodo immunocromatografico (Cartridge Rapid Test, DID, Italy) è stato comparato al test di
Immunofluorescenza indiretta (IFA) per la diagnosi sierologica di VL.
Sono stati analizzati 264 soggetti: 19 pazienti con VL (tre dei quali HIV positivi), 67 con sospetta VL, 122 affetti da altre malattie infettive, 16 con disordini immunologici e un gruppo di 40 soggetti sani. Il test immunocromatografico è risultato positivo
in tutti i 19 pazienti con VL diagnosticata su base clinica (splenomegalia, febbre, pancitopenia, ipergammaglobulinemia) e
microbiologica (presenza di amastigoti di Leishmania in strisci di midollo osseo colorati con Giemsa e/o presenza di anticorpi
anti-Leishmania a livelli significativi mediante Immunofluorescenza indiretta) e/o risposta alla terapia. Il test immunocromatografico è risultato negativo in tutti gli altri 245 individui. La sensibilità e specificità del test immunocromatografico è risultata pertanto del 100%. In particolare il test immunocromatografico è risultato positivo sul primo campione di siero prelevato da
un paziente HIV positivo, che invece era risultato borderline con l’IFA suggerendo che il test immunocromatografico può svelare gli anticorpi anti-Leishmania più precocemente rispetto all’IFA. Il follow-up eseguito su 7 pazienti con VL ha dimostrato
che gli anticorpi anti-Leishmania rimangono a livelli rilevabili con entrambi i metodi sino a 12-24 mesi. Inoltre i titoli anticorpali contro l’antigene ricombinante K39 sono molto elevati come dimostrato dal fatto che i sieri risultano ancora reattivi al test
immunocromatografico sino a diluizioni di 1: 20,480.
In conclusione il test immunocromatografico risulta essere sensibile, specifico, non invasivo, utile per diagnosticare rapidamente una VL in aree, come la nostra (Puglia, Sud Italia), a bassa endemicità per VL.
MOTIVI DI FOSFORILAZIONE EPIYA NELLA PATOGENESI DI HELICOBACTER PYLORI
Rossella Grande, Emanuela Di Campli, Soraya Di Bartolomeo, Mara Di Giulio, Luigina Cellini.
Dipartimento di Scienze Biomediche-Facoltà di Farmacia-Università “G. d’Annunzio”- Chieti
I ceppi di Helicobacter pylori che possiedono l’isola di patogenicità cagPAI, sono associati a patologia gastroduodenale severa. Un ruolo importante viene attribuito alla proteina CagA, antigene immunodominante di CagPAI che, traslocata all’interno
delle cellule epiteliali, può essere fosforilata da parte delle chinasi della cellula ospite, in corrispondenza dei motivi di fosforilazione della tirosina contenenti la sequenza EPIYA. Scopo di questo lavoro è stato quello di caratterizzare genotipicamente
diversi cloni di H.pylori isolati in pazienti dispeptici correlando la presenza di sequenze di fosforilazione con la severità della
patologia e la resistenza ai farmaci antimicrobici.
Due biopsie gastriche sono state prelevate da 21 pazienti sottoposti ad esofagogastroduodenoscopia (EGDS) per l’esame istologico e colturale. Da ciascun campione positivo all’esame colturale sono state caratterizzate singole colonie per: la sensibilità
ai farmaci comunemente usati in terapia (CMI), l’analisi dei pattern genotipici mediante AFLP, la valutazione della combinazione allelica m/s del gene vacA, la presenza dei geni iceA1/2 e la presenza dei motivi EPIYA P1P2P3 nel gene cagA.
Dall’esame colturale dei campioni bioptici sono stati isolati 7 ceppi coltivabili di H.pylori provenienti da 2 pazienti con patologie gastriche severe (cancro gastrico e Linfoma di MALT) e da 5 pazienti con gastrite; per ogni ceppo isolato sono stati analizzati diversi cloni. Pazienti con patologia gastrica severa mostravano infezione multipla caratterizzata da ceppi con DNA fingerprinting diversi, multiresistenti e con pattern genotipici caratterizzati dalla presenza dei più significativi fattori di virulenza,
mentre i cloni isolati da pazienti con gastrite mostravano pattern genotipici unici (infezioni singole). Relativamente ai motivi di
fosforilazione EPIYA, soltanto nei cloni isolati dai pazienti con cancro gastrico e Linfoma di MALT, si è rilevato un alto numero di motivi di fosforilazione con la ripetizione del P3 in numero uguale o superiore a 2.
I dati ottenuti in questo studio correlano la presenza e la ripetizione dei motivi di fosforilazione EPIYA alla severità della patologia associata a ceppi di H.pylori multiresistenti con fingerprinting diverso nello stesso paziente con conseguente difficoltà nell’individuazione della terapia eradicante.
69
MONITORAGGIO DEL CARICO DEL DNA DELL’EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) MEDIANTE
REAL–TIME POLIMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) IN PAZIENTI SOTTOPOSTI A TRAPIANTATO DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE
SACCHI M.C.§, Gotta F*., Frattini L. *, Fossati M.C. *, Allione B§., Levis A. §, Debbia E.# , Caraccio V*.
*Microbiologia , §Dipartimento di Oncoematolgia, Azienda ospedaliera “SS.Antonio e Biagio e C.Arrigo, Alessandria
#DISCAT Sezione di Microbiologia, Università di Genova
INTRODUZIONE: La malattia linfoproliferativa EBV-associata post-trapianto (post-transplant lymphoproliferative disordersPTLD) rappresenta una seria complicazione che può svilupparsi dopo trapianto sia d’organo che di cellule staminali emopoietiche. Dati di letteratura hanno documentato l’esistenza di una forte correlazione tra l’infezione da EBV, il grado di immunsoppressione e l’insorgenza di PTLD. L’incidenza di PTLD dopo trapianto di cellule staminali emopoietiche (HSCT) è generalmente più bassa rispetto a quella che si osserva dopo il trapianto d’organo. Tuttavia, il rischio è significativamente elevato in
alcuni gruppi di pazienti (trapiantati da donatore non familiare e da donatore mismached, T-depleti) con un’importante morbilità e mortalità. La determinazione quantitativa del carico del DNA dell’EBV da sangue intero è stata utilizzata come un marker
prognostico per lo sviluppo di PTLD.
PAZIENTI E METODI: Il valore diagnostico del monitoraggio frequente del carico dell’EBV è stato valutato in tutti i pazienti sottoposti a HSCT che sono afferiti al nostro Dipartimento di ematologia dal gennaio 2006 fino ad oggi. La determinazione
quantitativa del DNA dell’EBV è stata effettuata su campioni di sangue intero mediante la tecnica di real-time polimerase chain
reaction (RT_PCR), usando lo strumento LightCycler (Roche Diagnostic, spa). Nel nostro studio i livelli di EBV-DNA sono stati
valutati in un range tra 102 e 106 copie/ml di sangue. Il livello soglia dell’EBV-DNA definito nel nostro laboratorio per la
terapia presintomatica (pre-emptive therapy) dei pazienti sottoposti a HSCT è, per il sangue, 5.000 copie/ml.
RISULTATI: La riattivazione dell’EBV è stata osservata in 10 pazienti su 19 (53%): 6 (28%) pazienti avevano ricevuto un trapianto da donatore non familiare mentre 13 (68%) da donatore familiare. Nessuno dei 19 pazienti trapiantati aveva sviluppato
la PTLD durante il periodo di studio. In due pazienti senza PTLD, che avevano ricevuto il trapianto da un donatore non familiare, è stata iniziata l’immunoterapia mediante anticorpo monoclonale anti-CD20 (rituximab) quando il carico dell’EBV-DNA
superò il livello soglia.
CONCLUSIONI: I risultati ottenuti hanno dimostrano che la preventiva modulazione dell’immunosoppressione guidata dal
carico dell’EBV-DNA può essere considerata un approccio sicuro ed un valido strumento diagnostico per monitorare i pazienti sottoposti a trapianto di HSCT a rischio di sviluppo di PTLD dopo il trapianto.
L’IFN-b È FONDAMENTALE NEL POLARIZZARE LA RISPOSTA CITOCHINICA VERSO IL TIPO 1
NEL CORSO D’ INFEZIONE DA CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS
1Elisabetta Gerace, 1Carmelo Biondo, 1Angelina Midiri, 1Maria Gambuzza, 1Maria Falduto, 1Giuseppe Teti, 2Tomas
Leanderson & 1Giuseppe Mancuso
1Dipartimento di Patologia e Microbiologia Sperimentale, Università degli Studi di Messina, Italia,
2Immunology Group, University of Lund, Sweden.
Gli IFNs di tipo I (IFN alfa e IFN beta) rappresentano un gruppo di citochine caratterizzate essenzialmente per la loro attività
anti-virale. In questo studio abbiamo esaminato il ruolo degli IFNs nelle difese antifungine dell’ospite, utilizzando come sistema-modello l’infezione da Cryptococcus neoformans, un micete patogeno opportunista. Topi geneticamente privi del recettore
per l’IFN-α/ß (IFN-α/ßR) o di interferon beta (IFN-ß) sono risultati più suscettibili all’infezione endovenosa o intratracheale
con criptococchi a paragone con i rispettivi topi controllo wild-type (WT). La risposta immune a livello polmonare dei topi IFNα/ßR-/-, misurata in real-time PCR, si caratterizzava per un incremento nell’espressione di geni codificanti per l’IL-4, l’IL-13,
e l’IL-10, un decremento nell’espressione di TNF-α, IFN-γ, iNOS, e IP-10, e livelli simili di IL-12p40, rispetto a quella dei topi
controllo WT. Inoltre, all’analisi istopatologica dei polmoni erano presenti evidenti infiltrati eosinofili nei topi topi IFN-α/ßR-/-,
sebbene in misura inferiore a quelli presenti nei topi geneticamente privi del recettore per l’IFN-γ. Nonostante nei polmoni dei
topi infetti non sia stato possibile evidenziare alcuna produzione di IFN di tipo I, tuttavia, un piccolo, ma significativo aumento nella produzione di IFN-ß era riscontrabile nei surnatanti di macrofagi e cellule dendritiche, derivate dal midollo osseo ed
infettate con C. neoformans. Pertanto, i dati da noi ottenuti indicano che la produzione di IFN di tipo I è fondamentale per polarizzare in senso protettivo la risposta immune anti-criptococcica.
70
CARATTERIZZAZIONE DI UN PEPTIDE BASATO SU UN ANTICORPO ANTI-IDIOTIPICO IN GRADO DI
INDURRE ANTICORPI ANTI-CAPSULARI SPECIFICI PER IL MENINGOCOCCO DI GRUPPO B
Alessia Ruggeri1, Maria Gambuzza1, Elisabetta Gerace1, Angelina Midiri1, Roberta Galbo1, Manuela Garibaldi1, Giuseppe
Teti1 & Concetta Beninati1.
Dipartimento di Patologia e Microbiologia Sperimentale. Università di Messina, Messina.
Neisseria meningitidis (meningococco) di gruppo B (MenB) è causa di meningite batterica e shock settico. La composizione
chimica del polisaccaride capsulare (CP) di questo batterio è sovrapponibile a quella della parte glucidica di glicoproteine
umane, essendo entrambe costituite da polimeri a(2-8) di acido N-acetil-neuraminico. Ciò rende difficile l’allestimento di un
vaccino basato sul CP, che è il principale fattore di virulenza. Tuttavia, utilizzando monoclonali murini ottenuti dopo immunizzazione con il CP, si è evidenziata la presenza di epitopi non cross-reattivi con i tessuti dell’ospite. Nostri studi precedenti hanno
descritto un frammento anticorpale ricombinante anti-idiotipico (scFv G1), ottenuto, in collaborazione con il gruppo del prof.
Luciano Polonelli dell’Università di Parma, dopo immunizzazione con uno di questi monoclonali (Seam 3). L’scFv G1 è in
grado di evocare risposte anticorpali protettive, specifiche per la capsula del MenB. La capacità di legare l’antigene risiede spesso, almeno in parte, su una regione ristretta dell’anticorpo. Sulla base della sequenza dell’scFv G1 abbiamo identificato, in questo studio, una sequenza peptidica che si estende da un’estremità all’altra della regione CDR3 della catena pesante dell’immunoglobulina. I nostri risultati dimostrano che il peptide induce risposte battericide, specifiche per MenB, se utilizzato come
immunogeno in un costrutto a DNA e che queste risposte risultano maggiori se si co-immunizza l’animale con un plasmide codificante per l’ IFN-g. Inoltre i sieri di animali immunizzati con il mini-gene codificante per il peptide CDR3 dell’scFv G1 (CDR3
G1) mostrano moderata attività protettiva in un modello di infezione da MenB in rattini. In conclusione il peptide CDR3 G1 può
essere utile nell’allestimento di un vaccino basato sulla capsula di MenB.
SELEZIONE DI PEPTIDI IN GRADO DI INDURRE IMMUNO-PROTEZIONE NEI CONFRONTI DI
NEISSERIA MENINGITIDIS GRUPPO B
Milena Arigò1, Carla Lo Passo2, Angelina Midiri1, Giuseppe Mancuso1, Carmelo Biondo1, Roberta Galbo1, Salvatore
Papasergi1, Franco Felici2, Giuseppe Teti1 & Concetta Beninati1.
1Dipartimento di Patologia e Microbiologia Sperimentale.
2Dipartimento di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari. Università di Messina, Messina.
Neisseria meningitidis è una delle cause più comuni di meningite batterica e shock settico, soprattutto nei bambini di età compresa fra i 2 ed i 10 anni. Per il sierogruppo B (MenB), non è disponibile un vaccino basato sul polisaccaride capsulare (CP), il
maggiore fattore di virulenza. La difficoltà di allestire un vaccino basato sul CP di MenB è dovuta alla sua somiglianza, dal
punto di vista chimico ed immunologico, con l’acido polisialico presente su cellule neuronali umane. Sono stati tuttavia individuati, mediante anticorpi monoclonali, degli epitopi del CP che non presentano cross-reattività con tessuti umani e che sono
potenzialmente in grado di evocare anticorpi protettivi. Partendo da tale base scientifica abbiamo utilizzato un anticorpo monoclonale, Seam 3, in grado di reagire con un epitopo di CP non cross-reattivo, per selezionare dei cloni da librerie fagiche esprimenti come prodotti di fusione a proteine di superficie, peptidi con sequenze casuali. Durante questo studio sono stati isolati
diversi cloni raggruppabili in due gruppi sulla base di altrettante sequenze consenso. Due peptidi rappresentativi, denominati 9M
e 7M, erano in grado non solo di legare il Seam3, ma anche di indurre degli anticorpi anti-MenB CP nel siero di topi in seguito ad immunizzazione con coniugati emocianina-peptide o con mini-geni clonati in un vettore per l’immunizzazione a DNA.
L’impiego di un protocollo eterologo di vaccinazione che prevedeva l’ immunizzazione genica (prime) seguita da un richiamo
con il coniugato proteico (boost) utilizzando il peptide 9M era in grado di indurre anticorpi battericidi di maggiore titolo ed in
grado di proteggere rattini sottoposti a challenge con MenB. In conclusione il peptide 9M è un promettente candidato per lo sviluppo di un vaccino nei confronti del MenB.
71
L’IFN DI TIPO I È FONDAMENTALE PER LA DIFESA DELL’OSPITE NEI CONFRONTI DI BATTERI EXTRACELLULARI
1Graziella Di Salvo, 1Giuseppe Mancuso, 1Angelina Midiri, 1Roberta Galbo, 1Maria Gambuzza,
2Tomas Leanderson, 1Giuseppe Teti & 1Carmelo Biondo
1Dipartimento di Patologia e Microbiologia Sperimentale, Universita` degli Studi di
Messina, Messina, Italy; 2Immunology Group, University of Lund, Lund, Sweden
E’ noto da tempo che le cellule dell’ospite possono produrre interferone (IFN) in seguito stimolazione con diversi prodotti
microbici. Tuttavia, le conseguenze funzionali, nel corso dell’infezione batterica, di tale risposta sono in gran parte sconosciute. In questo studio, noi dimostriamo che l’IFN-α/ß è un fattore fondamentale per le difese dell’ospite nei confronti di diverse
specie di di batteri extracellulari, compresi streptococco di gruppo B (GBS), pneumococco ed Escherichia coli. Ciò è indicato
dalla marcata suscettibilità all’infezione in topi geneticamente privi del recettore per l’IFN di tipo I. Il grado di suscettibilità
all’infezione da GBS in questi topi era superiore a quella dimostrata da topi difettivi per il recettore per l’IFN di tipo II.
L’aumentata suscettibilità all’infezione da GBS di topi knock out per entrambi i tipi di recettore suggerisce inoltre che i due tipi
di IFN hanno ruoli complementari e non ridondanti nelle difese dell’ospite. I macrofagi sono il principale tipo cellulare responsabile della produzione di IFN di tipo I in seguito a stimolazione con GBS. Inoltre, la mancanza di l’IFN di tipo I determina nei
macrofagi una ridotta produzione di IFN-γ, NO e TNF-α in seguito a stimolazione con batteri vivi o con LPS. In conclusione,
i nostri dati suggeriscono un ruolo fondamentale per l’IFN di tipo I nell’attivazione dei macrofagi e nella resistenza dell’ospite
nei confronti di differenti batteri patogeni.
ATTIVAZIONE DI MONOCITI DI LINEA MEDIANTE STIMOLAZIONE CON LOOP 7 DELLA PORINA P2 DI HAEMOPHILUS INFLUENZAE: ANALISI MEDIANTE APPROCCIO PROTEOMICO
Marilena Galdiero, Massimiliano Galdiero, Mariateresa Vitiello, Marina D’Isanto, Maria Rao, Emiliana Finamore
Seconda Università degli Studi di Napoli.
Una delle componenti più abbondanti della membrana esterna di Haemophilus influenzae di tipo b (Hib) è la proteina P2 con
funzione di porina capace di indurre il rilascio di diverse citochine coinvolte nel processo infiammatorio. Hib è una delle principali cause di meningite batterica ingravescente nei bambini di età compresa tra 6 mesi e 5 anni, caratterizzata da infiammazione della barriera ematoencefalica ed invasione del Sistema Nervoso Centrale (SNC). Il loop 7 è il più attivo tra i loop superficiali della proteina P2 nell’attivare il pathway delle Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), come dimostrato in nostri precedenti lavori. E’ noto che la virulenza di un particolare microrganismo, così come per Hib, è il risultato di un insieme di interazioni tra il microrganismo e la cellula ospite. Infatti i segnali che portano all’attivazione dell’infiammazione sono spesso generati sulla superficie cellulare, in seguito all’interazione tra un recettore ed il rispettivo ligando.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di analizzare, mediante un approccio proteomico, i profili proteici di monociti umani
di linea, cellule U937, stimolati con la porina P2 in toto, il loop 7 della porina P2 di Hib e con l’LPS, per individuare in dettaglio i protagonisti della cascata di trasduzione del segnale attivata in seguito alla stimolazione, verificando così le eventuali differenze tra i profili indotti dalla porina in toto, il loop 7 e LPS.
72
FATTORI DI PATOGENICITÀ IN CEPPI DI ESCHERICHIA COLI ISOLATI DA PROCESSI INFETTIVI
IN SEDI DIVERSE.
Raimondi A., S. Caroppo (*), R. Ticozzi, A. Pessina, G. Fortina (*)
Dip. di Sanità Pubblica, Microbiologia, Virologia - Università degli studi di Milano.
(*) : Lab. Microbiologia e Virologia, Azienda “Ospedale Maggiore della Carità” – Novara.
Escherichia coli, il batterio commensale più rappresentativo della flora aerobia facoltativa intestinale dell’uomo è anche, paradossalmente, l’organismo isolato più frequentemente come causa di infezioni intestinali e di infezioni extraintestinali da gramnegativi. Esistono elementi distintivi tra ceppi commensali e ceppi patogeni sia per l’aspetto filogenetico sia per la presenza di specifici fattori di patogenicità (FP).
I geni codificanti molti dei FP noti sono di provenienza esogena, acquisiti, nel corso dell’evoluzione, dal genoma di altre specie.
Talvolta sono veicolati da plasmidi e fagi, spesso sono integrati nel cromosoma batterico in associazioni definite isole di patogenicità. La loro presenza è predominante nei ceppi ascrivibili ai due gruppi filogenetici B2 e D.
Nei ceppi di E. coli responsabili di infezioni extraintestinali, diversamente dai ceppi patogeni intestinali, è poco noto il rapporto tra specifici fattori di patogenicità e sindrome. Per studiare l’influenza di specifici FP nell’insorgere di processi infettivi in
determinate sedi extraintestinali, abbiamo esaminato la distribuzione di ventinove FP in 94 isolati clinici di E. coli, 25 provenienti da emocolture, 32 da UTI, 25 da feci e 12 da campioni respiratori (BAL o aspirato endotracheale).
I FP esaminati comprendevano determinanti di adesività, tossine, tipi capsulari, siderofori, fattori di invasività, di resistenza serica ecc. e la loro presenza è stata evidenza mediante amplificazione di specifici marcatori genici.
La distribuzione media dei FP per ceppo è risultata pari a 8 nei gruppi filogenetici B2 e D, e 3 nei gruppi filogenetici B1 ed A.
I filogruppi B2 e D risultano presenti con uguale frequenza nei ceppi di isolamento ematico ma forse con diversa derivazione,
se si considera che il gruppo B2 è particolarmente frequente nei ceppi di origine urinaria mentre il D in quelli di isolamento
fecale.
Alcuni FP come le fimbrie di tipo S e F1C, il fattore necrotizzante di tipo1 e l’α-emolisina sono stati rilevati esclusivamente in
ceppi del gruppo B2, mentre le fimbrie di tipo P, alcuni fattori capsulari ed il fattore d’invasione dell’endotelio cerebrale sono
presenti anche in ceppi di filotipo D. Altri FP come l’aerobactina ed il fattore di sieroresistenza risultano ugualmente diffusi in
tutti i gruppi filogenetici o addirittura ( l’adesina non fimbriale tipo M e la colicina C) prevalenti tra i filotipi commensali B1
ed A.
LA LATTOFERRINA BOVINA INIBISCE L’ENTRATA E LA DIFFUSIONE INTRACELLULARE DEL
VIRUS DELL’HERPES SIMPLEX DI TIPO 1 IN CELLULE GMK
Maria Grazia Ammendolia, Magda Marchetti, Fabiana Superti
Dipartimento di Tecnologie e Salute, Istituto Superiore di Sanità, Roma
La lattoferrina è una glicoproteina monomerica, del peso molecolare di circa 80 kDa, appartenente della famiglia delle transferrine. Questa proteina, sintetizzata dai neutrofili e dalle cellule della mucosa epiteliale, è stata isolata per la prima volta dal
latte e può essere ritrovata in molte altre secrezioni esocrine come lacrime, saliva, bile e succo pancreatico. La lattoferrina svolge un ruolo importante, oltre che nel metabolismo del ferro, anche nei meccanismi di difesa dell’ospite verso diversi patogeni,
sia direttamente che attraverso la regolazione della risposta infiammatoria. Sebbene l’attività antivirale della lattoferrina rappresenti un’importante funzione biologica, i meccanismi attraverso i quali questa proteina svolge la sua azione non sono stati
ancora completamente identificati. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la lattoferrina inibisce le fasi precoci dell’infezione da virus dell’herpes simplex di tipo 1 e 2 attraverso un meccanismo di competizione con le particelle virali per il legame ai glicosamminoglicani presenti sulla membrana cellulare.
Nella presente ricerca abbiamo ulteriormente analizzato il meccanismo dell’attività antierpetica della lattoferrina in vitro. I
risultati ottenuti hanno dimostrato che questa proteina è in grado di prevenire non solo l’adsorbimento virale alle cellule ospiti
ma anche l’internalizzazione del virus e la sua diffusione da cellula a cellula. In particolare i nostri studi hanno dimostrato che
l’attività antierpetica della lattoferrina si esplica attraverso la sua interazione specifica con alcune proteine strutturali virali.
I risultati di questo studio, dimostrando per la prima volta che la lattoferrina è in grado di agire anche sulle fasi tardive dell’infezione da virus dell’herpes simplex e quindi di prevenire le infezioni causate dal virus associato alle cellule, confermano questa proteina come un candidato eccellente per il trattamento delle infezioni erpetiche.
73
RICERCA DELL’ANTIGENE GALATTOMANNANO PER LA DIAGNOSI PRECOCE DI ASPERGILLOSI INVASIVA IN PAZIENTI ONCOEMATOLOGICI
Francesca Gallè°, Loredana Ortega De Luna°, Andrea Camera*, Marco Picardi*, Maria Rosaria Catania°, Francesco Grimaldi*,
Emanuela Morelli*, Simona Avilia*, Fabio Rossano°
°Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L. Califano”
*Cattedra di Ematologia, Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche
Università degli Studi di Napoli “Federico II”
L’aspergillosi è l’infezione fungina invasiva (IFI) a maggiore incidenza di morbilità e mortalità nei pazienti oncoematologici
con neutropenia assoluta. Le difficoltà di isolamento del micete e la necessità di una diagnosi precoce hanno favorito lo sviluppo di test diagnostici per questo tipo di complicanza, fra cui il metodo immunoenzimatico per la rilevazione dell’antigene galattomannano nel siero. Allo scopo di verificarne l’efficacia è stato avviato uno studio articolato in tre fasi: validazione della metodica su soggetti sani; analisi retrospettiva su campioni di siero di pazienti con leucemia acuta o linfoma; studio prospettico su
pazienti emopatici sottoposti a chemioterapia.
Nella prima fase, effettuata su campioni provenienti da 10 soggetti sani, la mediana del valore indice (I) è risultata 0,035 (range
0,02–0,14), confermando il cut-off indicato per la metodica, pari a 0,5. Sono stati quindi considerati positivi i test con I≥0,5 in
almeno due determinazioni consecutive.
Sia nello studio retrospettivo che in quello prospettico i campionamenti sono stati effettuati in 6 fasi: basale (prima di qualsiasi
terapia), basale dopo terapia (pazienti già sottoposti a chemioterapia), neutropenia, neutropenia febbrile, IFI possibile e IFI probabile/provata.
Lo studio retrospettivo è stato effettuato su 101 campioni provenienti da 29 pazienti. La mediana del valore indice è risultata
rispettivamente: 0,065; 0,012; 0,05; 0,04; 0,05; 0,785 per ciascuna fase di campionamento. In questa coorte 1 paziente con rinosinusite, nodulo polmonare ed isolamento di Aspergillus spp. dal faringe è risultato positivo in 2 campionamenti (I=0,77 e 0,80).
Lo studio prospettico è stato effettuato su 57 campioni provenienti da 18 pazienti. La mediana del valore indice per ciascuna
fase di prelievo è risultata rispettivamente 0,027; 0,055; 0,043; 0,043; 0,130; 1,282. In questa coorte sono stati individuati precocemente 2 pazienti positivi: uno con aspergillosi polmonare estesa (6 campioni positivi, mediana 1,104), l’altro con aspergillosi polmonare e cerebrale (3 campioni positivi, mediana 4,052). Finora dunque la metodica si è rivelata sensibile nella diagnosi precoce di aspergillosi invasiva, senza fornire falsi positivi.
RUOLO DEL TOLL-LIKE RECEPTOR 2 E DEL MYELOID DIFFERENTIATION FACTOR 88 SULLA
SEPSI E ARTRITE INDOTTE DA STREPTOCOCCO DI GRUPPO B
Manuela Puliti1, Francesco Bistoni1, Paolo Mosci1, Graziella Orefici2 e Luciana Tissi1
1 Sezione di Microbiologia, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università degli Studi di Perugia,
Perugia, e 2 Dipartimento di Malattie Infettive, Parassitarie e Immunomediate, Istituto Superiore di Sanità, Roma.
Gli streptococchi di gruppo B (GBS) sono una delle principali cause di severe infezioni nei neonati, infanti o gestanti.
Recentemente questi microrganismi sono stati riconosciuti quali causa di infezioni invasive anche in adulti con severe malattie
concomitanti. Le manifestazioni cliniche di tali infezioni includono batteremia, infezioni della pelle, dei tessuti molli e del tratto urinario, polmonite, endocardite, meningite, oftalmite ed infezioni osteo-articolari. I toll-like receptors (TLRs) sono proteine
transmembrana che riconoscono la presenza di prodotti microbici o tessuti dell’ospite danneggiati. Il loro reclutamento scatena
le risposte antimicrobiche e la produzione di citochine attraverso l’attivazione di una cascata di eventi intracellulari mediati da
molecule adattatrici come il myeloid differentiation factor 88 (MyD88). Il presente studio ha esaminato il possibile ruolo di
TLR2 e MyD88 in un modello sperimentale di sepsi ed artrite settica indotta da streptococco di gruppo B. A tale scopo sono
stati utilizzati topi deficienti per TLR2 o MyD88. I topi sono stati inoculati con diverse dosi infettanti di GBS e sono state valutate la mortalità, la comparsa di lesioni articolari , la crescita di microrganismi negli organi e la produzione di citochine. Sia i
topi TLR2 che quelli MyD88 deficienti erano altamente suscettibili all’infezione con GBS. L’incidenza e la severità dell’artrite
erano meno pronunciate nei topi MyD88 -/- rispetto ai controlli nei primi cinque giorni dall’infezione, tuttavia queste differenze scomparivano nei giorni seguenti. Questo miglioramento transitorio dell’artrite era associato ad un minor numero di GBS isolati dalle articolazioni e da una più bassa produzione locale di IL-6 e TNF-α. Al contrario, i topi deficienti per TLR2 mostravano sempre una incidenza ed una severità delle lesioni articolari più gravi di quelle riscontrate nei controlli, associate con una
maggiore crescita di GBS negli organi ed una maggiore produzione di citochine proinfiammatorie. In conclusione, i nostri risultati dimostrano un ruolo cruciale di TLR2 e MyD88 nelle difese dell’ospite contro l’infezione da GBS. In particolare, MyD88
sembra avere una funzione essenziale nella infiammazione articolare indotta da GBS.
74
FECALIZZAZIONE AMBIENTALE: INDAGINE CONOSCITIVA NELLA CITTÀ DI BARI E RISCHI
PER LA SALUTE PUBBLICA
*Tarsitano E., *Greco G., *Lorusso E., *Bellacicco A.L., **Maugeri M.
*Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali (DiSBA), Facoltà di Medicina Veterinaria-Università degli Studi di Bari
**Assessorato Ambiente e Sviluppo sostenibile, Igiene pubblica, Verde pubblico, Tutela degli animali, Comune di Bari
I problemi legati alla fecalizzazione ambientale da deiezioni canine non opportunamente rimosse a causa di cattive abitudini da
parte dei proprietari dei cani è una delle problematiche sanitarie dai caratteri rilevanti tanto da rappresentare fattore di molestia
per le popolazioni oltre che determinare l’insorgenza e la diffusione di potenziali patologie. Il numero di animali domestici è
notevolmente aumentato nelle città italiane e quindi le feci dei cani non rimosse dalle strade possono costituire un importante
fattore di contaminazione ambientale. La sopravvivenza di agenti patogeni nelle feci di cani può comportare: la diffusione per
via aerea (dopo essiccamento e polverizzazione delle feci), mediante il pulviscolo sollevato dal vento e dal traffico veicolare,
con possibile inquinamento, di alimenti non sufficientemente protetti; il trasporto nelle abitazioni tramite le scarpe imbrattate di
feci.. Un altro aspetto è connesso al numero di animali sinantropici, come Columbia livia, che nella città di Bari, ma anche in
molte altre città italiane, ha raggiunto valori tali da richiedere interventi di controllo mirati. Il loro adattamento all’habitat urbano con colonizzazione di nuove nicchie ecologiche ha portato all’accumulo di ingenti quantità di guano nelle piazze, sugli edifici, sui monumenti e in tutti i luoghi utilizzati per la nidificazione. E’ noto che il guano può comportare rischi sanitari per l’uomo e per gli altri animali in quanto può essere fonte di infezioni micotiche; virali, batteriche (in particolare salmonella e clamidie), oltre che rappresentare un substrato idoneo per artropodi ectoparassiti.
In tale ottica è stata condotta un’indagine conoscitiva per definire l’eventuale circolazione di organismi patogeni di origine batterica, virale e parassitaria nella popolazione canina della città di Bari in considerazione della elevata presenza nell’area urbana
di cani sia di proprietà che randagi. L’indagine è stata estesa anche alla popolazione di colombi della città.
Sul materiale campionato (feci di cani e guano di colombi) nella città di Bari sono state effettuate analisi batteriologiche, virologiche e parassitologiche. Microrganismi patogeni sono stati ritrovati in 23 (34,85%) delle 66 aree della città monitorata. I dati
complessivi hanno evidenziato che le aree pubbliche esaminate sono contaminate da potenziali agenti patogeni e che esistono
potenziali rischi per la salute pubblica
MORTALITÀ NEONATALE DI CUCCIOLI DI CANE CAUSATA DA UN CEPPO DI MRSA
M. Corrente, M. Camero, M. D’Abramo, A.L. Bellacicco, M. Tempesta, C. Buonavoglia
Dipartimento di Sanità e Benessere degli animali- Facoltà di Medicina Veterinaria
Università degli Studi di Bari, Valenzano (BA) Italia
Dodici cuccioli nati, mediante cesareo, da una cagna boxer sono morti nell’arco di 10 giorni successivi al parto. La carcassa di
un cucciolo, sottoposta all’esame autoptico, mostrava segni di setticemia, con gravi lesioni emorragiche. Sugli organi dell’animale (cuore, fegato, reni, polmone, milza) sono stati effettuati esami virologici per Canine Herpesvirus e Canine Parvovirus
tipo 1, e esami batteriologici, mediante semina su Agar Sangue, Brain heart infusion broth e Mac Conkey, in aerobiosi e anaerobiosi. Da tutti gli organi, tranne che dal polmone, è stato isolato in purezza Staphylococcus aureus, resistente a tutti i beta-lattamici testati. Un test di PCR specifico per il gene mecA ha confermato che lo stipite di S. aureus era meticillino-resistente
(MRSA). I test virologici sono risultati negativi. Sono stati effettuati in seguito tamponi nasali e cutanei alla madre dei cuccioli, al maschio, al proprietario dei cani, di professione infermiere presso una sala chirurgica di un ospedale, e alla proprietaria.
Gli esami eseguiti hanno messo in evidenza MRSA nelle cavità nasali e sulla cute sia dei cani che dei due proprietari. In totale
sono stati isolati 18 ceppi di MRSA, tutti con lo stesso resistotipo (resistenti a: ciprofloxacin,clindamicina, cotrimossazolo, eritromicina, gentamicina, tetracicline, sensibili a imipenem, teicoplanina, vancomicina) e di tipo SCCmec II (Staphylococcal chromosome cassette). Questo pattern è tipico dei cosiddetti Hospital-acquired (HA) MRSA, diffusi in ambito ospedaliero. L’analisi
dei risultati permette di ipotizzare che un clone di HA-MRSA abbia colonizzato l’ambiente familiare e sia stato poi trasmesso
dall’uomo ai cani, provocando mortalità neonatale. Risulta inoltre evidente che ceppi di HA-MRSA, acquisiti in ospedali dove
non sono applicate norme specifiche per la prevenzione di MRSA, possono essere veicolati da portatori sani in ambito extranosocomiale, e possono costituire una grave minaccia per gli animali che vivono a stretto contatto con gli uomini. Per gli MRSA
può valere il concetto : “Cave hominem…”?
75
PRODUZIONE DI ß-DEFENSINA 2 IN CELLULE INFETTATE SPERIMENTALMENTE CON SALMONELLA TYPHIMURIUM
Romano Carratelli Caterina, Galeota Lanza Alfonso, Rizzo Antonietta
Dipartimento di Medicina Sperimentale. Sezione di Microbiologia e Microbiologia Clinica. Facoltà di Medicina e Chirurgia.
Le defensine, peptidi cationici antimicrobici stabilizzati da legame disolfuro, presentano grande importanza per le difese dell’ospite contro i batteri, i funghi e i virus. In aggiunta all’attività antimicrobica, è stato dimostrato che la - defensina 2 può svolgere la funzione di legando per il Toll-like receptor 4 (TLR) sulle cellule dendritiche immature ; d’altra parte, i TLRs funzionano come molecole di riconoscimento per i diversi componenti microbici, mediando l’attivazione della risposta immune innata . Ken-ichi Ogushi et. al. hanno dimostrato che la flagellina di Salmonella enteritidis può indurre espressione di mRNA di defensina 2 in cellule di linea di carcinoma umano del colon (Caco-2) attraverso la via di attivazione NF-kB. Le Salmonelle spp
sono batteri gram-negativi che, nell’uomo, causano gastroenteriti e febbri enteriche con reclutamento di cellule infiammatorie
a livello di lamina propria e di epitelio. In questo lavoro, si è studiato l’effetto della S. typhimurium sull’induzione di espressione di hBD-2 e il ruolo del TLR4 nel mediare il segnale in monociti periferici umani e in cellule leucemiche U937. I risultati ottenuti dimostrano che l’esposizione delle cellule U937 o di monociti periferici alla S. typhimurium viva o uccisa al calore o
al suo esoprodotto risultava in un’aumentata espressione di mRNA hBD2 e aumentata secrezione di hBD2 nel terreno di coltura correlata ad una aumentata espressione di TLR4. Le cellule U937 e i monociti preincubati per 1 ora con anticorpi antiTLR4 e stimolati con S. typhimurium vive o uccise o con il suo esoprodotto per 24h mostravano una diminuita secrezione di
hBD2 nel terreno di coltura determinata mediante dosaggio ELISA e una significativa diminuzione di hBD2 mRNA, espressione valutata mediante dosaggio RT-PCR. In conclusione, il nostro studio dimostra che la S. typhimurium e il suo esoprodotto inducono produzione di hBD2 mediante attivazione di TLR4 nelle cellule di linea e nei monociti, confermando il ruolo protettivo del TLR4 nell’infezione intestinale e suggerisce che i TLRs possono partecipare ad attivare i meccanismi di difesa dell’ospite.
IL RUOLO DEL FUSARIUM SPP. IN UN PAZIENTE CON LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA
*Grimaldi E., °GiulianoM., *Capasso C., °Bavarese R., °Affinita M.C., °Pota E., °Di Martino M., °Fusco C., *Romano
Carratelli C.
*Dipartimento di Medicina Sperimentale Servizio di Micologia, °Dipartimento di Pediatria, Servizio di Oncologia Pediatrica,
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Seconda Universita’ degli Studi di Napoli
Il Fusarium spp. è, insieme ad altri funghi ialini (Aspergillus, Acremonium, Penicillium,Scedosporium ecc.), agente eziologico
di Ialoifomicosi. Le manifestazioni cliniche della Ialoifomicosi sistemica causata da Fusarium spp. includono lesioni ulcerative cutanee e sottocutanee, endoftalmiti, osteomieliti ed artriti. Il Fusarium possiede molti fattori di virulenza che includono la
produzione di micotossine che sopprimono l’immunità umorale e cellulare con produzione di collagenasi e proteasi che possono favorire l’approfondimento delle lesioni tissutali. Le lesioni cutanee, in più del 50% dei pazienti, rappresentano la sintomatologia di esordio anticipando la fungemia anche di 5 giorni.
In un adolescente di 14 anni e 5 mesi cui è stata posta, nel gennaio 2007, diagnosi di Leucemia Mieloide Acuta (M5a). Per tale
motivo il paziente è stato inserito nel protocollo AIEOP LAM 2002/0. In fase di marcata aplasia midollare, in corso di neutropenia febbrile, sono comparse lesioni cutanee simil papulose localizzate agli arti inferiori ed al braccio destro, dolenti alla digitopressione e ricoperte da cute iperemia. Nei giorni successivi si è registrato un aumento del numero e delle dimensioni delle
lesioni e comparsa di escara centrale.
Nel sospetto clinico di una micosi sistemica è stato sostituito il Fluconazolo con Anfotericina B liposomiale e Caspofungin,
senza ottenere risultati. Solo dopo 10 giorni un’ulteriore emocultura ed un tampone sulle lesioni cutanee hanno dato esiti positivi per Fusarium spp, per cui i due antimicotici sono stati sostituiti con il Voriconazolo ottenendo una negativizzazione dell’emocoltura successiva
Dopo un breve periodo (2 gg.) di temperatura subfebbrile e con le lesioni cutanee in fase di cicatrizzazione, il paziente è stato
dimesso con una terapia costituita da Voriconazolo per via orale e con terapia oftalmica locale. I vari controlli micologici effettuati dopo la dimissione sono risultati sempre negativi per Fusarium.
La segnalazione di questo caso vuole confermare l’importanza della diagnosi precoce nell’identificazione del Fusarium nel sangue in pazienti neutropenici febbrili in grave aplasia e la difficoltà di eradicazione dello stesso con i farmaci attualmente in uso.
76
EFFETTI DELL’ALCOOL SULLA SECREZIONE DI CITOCHINE E DEFENSINE IN CELLULE
INFETTATE SPERIMENTALMENTE CON CHLAMYDIA PNEUMONIAE.
Romano Carratelli Caterina, Paolillo Rossella, Rizzo Antonietta
Dipartimento di Medicina Sperimentale. Sezione di Microbiologia e Microbiologia Clinica. Facoltà di Medicina e Chirurgia.
L’alcoolismo è frequentemente associato con una alterata risposta immune e un’aumentata predisposizione dell’ospite a malattie infettive causate da microrganismi patogeni e opportunisti. L’effetto dell’etanolo (ETOH) sul sistema immunitario determina la diminuizione di cellule linfoidi negli organi centrali e periferici con conseguente deficit funzionale delle cellule immuocompetenti correlato ad una modificata secrezione del profilo delle citochine e chemochine. Nel presente lavoro, si analizza
l’effetto dell’ ETOH sui vari aspetti di difesa antimicrobici dell’ospite su un modello sperimentale costituito da cellule leucemiche U937 e da monociti umani infettate con Chlamydia pneumoniae, microrganismo intracellulare obbligato associato sia a
malattie respiratorie sia a malattie infiammatorie croniche come l’arteriosclerosi. La rilevante azione della C. pneumoniae è
messa in rapporto al suo ruolo da inducer di infiammazione cronica. I risultati da noi ottenuti dimostrano che l’etanolo usato a
varie concentrazioni modifica sia la risposta immune antigene-specifica, sia i meccanismi effettori della risposta immune cellulare . In particolare, le cellule U937 e i monociti umani in presenza di ETOH a concentrazioni di 0,8-1.8% e infettate con C.
pneumoniae con un MOI di 4 IFU/cellula presentavano: una diminuzione della proliferazione cellulare, evidenziata con il test
dell’MTT ed una diminuita secrezione di IL-2, IL-4, IL-6 e TNF-α, e valori quasi simili al controllo dell’espressione della ?defensina e del VEGF, esaminate rispettivamente mediante dosaggio RT-PCR e ELISA. Le cellule U937 e i monociti infettati
con C. pneumoniae con MOI=4 in presenza di ETOH a concentrazioni elevate (3%) mostravano,da un lato, un’aumentata proliferazione cellulare, un aumento della produzione del VEGF, una aumentata espressione della ß-defensina e dall’altro una marcata diminuzione della produzione delle citochine infiammatorie rispetto al controllo.
In conclusione, i nostri risultati dimostrano che l’ETOH presenta un effetto immunomodulante sulla produzione di citochine, di
VEGF e di ß-defensina in cellule infettate sperimentalmente con C. pneumonae, suggerendo che il consumo di alcool può presentare una relazione bifasica dovuta, parzialmente, all’azione contrastante di una bassa ed alta concentrazione di alcool sulla
produzione di mediatori dell’infiammazione.
SINTESI E IMMUNOCARATTERIZZAZIONE DI UN VACCINO RAMIFICATO-POLIPEPTIDICO
CONTRO HSV-1
Marina D’Isanto, Mariateresa Vitiello, Katia Raieta, Maria Caiazza, Aikaterini Kampanaraki, Massimiliano Galdiero
Lo stato di latenza dell’Herpes simplex di tipo 1 (HSV-1) consente al virus di persistere indefinitamente all’interno dell’ospite.
Si ritiene che siano i più frequenti responsabili di encefalite virale sporadica, di meningite asettica e di gravi forme sistemiche
neonatali. Da ciò si comprende il reale bisogno di un vaccino terapeutico capace di prevenire l’instaurarsi dello stato di latenza
o di agire sulla progenie virale riattivata nei neuroni infetti. Nel nostro lavoro abbiamo valutato l’efficienza protettiva di un vaccino anti-HSV-1 costruito utilizzando un core lipidico e peptidi sintetizzati secondo le sequenze amminoacidiche delle glicoproteine virali necessarie per le prime fasi dell’infezione e per la fusione cellulare indotta dal virus. Il complesso peptidico unito
al core lipidico polisinico (LCP) offre la possibilità di realizzare un vaccino privo di adiuvanti tossici tradizionali e contemporaneamente la possibilità di inserire più copie di peptidi provenienti da differenti glicoproteine.
La sintesi in fase solida è stata effettuata utilizzando una strategia sintetica con chimica Boc associata a chimica Fmoc. Regioni
potenzialmente antigeniche sono state selezionate utilizzando i seguenti criteri: a) regioni ad alta propensione antigenica secondo differenti metodi di predizione basati sui profili di idrofobicità, flessibilità ed accessibilità; b) regioni capaci di formare probabili loop di superficie; c) regioni ad alta variabilità di sequenza e/o contenenti siti di inserzione/delezione confrontando la
sequenza di HSV-1 con altri α-herpervirus; d) regioni contenenti ipotetici epitopi per le cellule T (TEPITOPE).
77
UTILIZZO DI UNA METODICA MOLECOLARE PER L’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE DI CANDIDA
CLINICAMENTE RILEVANTI
Giuseppe Tripodi, Daniela Belletti, Sergio Gaeta, Carmelo Biondo, Giuseppe Teti & Demetrio Delfino
Dipartimento di Patologia e Microbiologia Sperimentale. Università di Messina; 98122 Messina
L’identificazione delle specie appartenenti al genere Candida, nella comune diagnosi micologica di laboratorio, viene effettuata tramite l’utilizzo di test biochimici ed, in alcuni casi, mediante l’analisi morfologica. Tuttavia, in circa il 2% dei casi, non è
possibile un’identificazione rapida e certa con i metodi su citati. Si è quindi pensato di sviluppare un protocollo d’identificazione molecolare tale da permettere, in tempi brevi, l’identificazione delle specie di Candida che occupano un ruolo sempre più
rilevante nella pratica clinica. Abbiamo messo a punto una PCR Multiplex che comporta l’impiego di due set di primer speciespecifici, di cui uno relativo ad un gene ribosomiale ed un altro relativo alla topoisomerasi II, entrambi abbinati ad un protocollo di estrazione del DNA da colonia. Questo metodo permette l’identificazione delle seguenti specie di Candida: C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. guilliermondii, C. krusei, C. kefyr e C. lusitaniae. Tale metodica è stata impiegata inizialmente per la conferma di test biochimici e morfologici. I risultati hanno evidenziato sovrapponibilità tra le due metodiche. Inoltre, in alcuni casi, la PCR Multiplex ha permesso di ottenere un’identificazione non ambigua a
livello di specie di isolati per i quali l’identificazione biochimica aveva generato un risultato dubbio.
INFEZIONI DI FERITE CHIRURGICHE: INCIDENZA E ANTIBIOTICO-RESISTENZA
Pulcrano G., Del Pezzo M., Roscetto E., Petti A., Marzullo M., Rossano F.
Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L. Califano”, Università degli Studi di Napoli “Federico II”
Le infezioni nosocomiali sono un problema di fondamentale importanza, sia per l’incidenza sempre maggiore che per le gravi
conseguenze per la salute dei pazienti ricoverati. Tra le infezioni nosocomiali, quelle post-chirurgiche rappresentano complessivamente il 15-20% dei casi. Le infezioni delle ferite chirurgiche si verificano durante l’intervento o durante il periodo postoperatorio e essere di natura endogena o esogena. Le infezioni di natura endogena sono sostenute da microrganismi della flora
commensale presente in vari distretti dell’organismo e generalmente sensibili alla maggior parte degli antibiotici. I microrganismi esogeni, introdotti direttamente dall’ambiente esterno o trasportati dal personale medico, sono più facilmente causa di infezioni in pazienti immunocompromessi e possono essere resistenti a molti antibiotici. Questi microrganismi possono contaminare accidentalmente le ferite o sostituirsi ai microrganismi commensali durante il periodo di degenza pre-operatoria e contaminarle successivamente.
In questo lavoro sono stati analizzati tamponi da ferite infette nel periodo gennaio-dicembre 2006. L’80% dei campioni analizzati sono risultati positivi all’esame colturale e nel 33% dei casi l’infezione era sostenuta da più di un germe contemporaneamente. Nel 9% dei casi si trattava di un infezione sostenuta da miceti.
I microrganismi più frequentemente isolati sono stati Stafilococchi ed Enterococchi per quanto riguarda i Gram positivi e
Pseudomonas aeruginosa per quanto riguarda i Gram negativi. Inoltre è stato isolato un germe anaerobio (Clostridium bifermentans) da una toracotomia.
E’ stato successivamente analizzato il pattern di antibiotico-resistenza dei germi isolati evidenziando la presenza di meticillinoresistenza prevalentemente negli Stafilococchi coagulasi negativi mentre la maggior parte dei ceppi di S. aureus esaminati risultavano sensibili alla meticillina. Tra i Gram negativi sono stati rinvenuti ceppi multiresistenti soprattutto nei reparti di
Rianimazione e tra i pazienti immunocompromessi.
Sono in corso studi per stabilire il meccanismo genetico alla base dei fenomeni di resistenza riscontrati nei ceppi analizzati.
78
LE ß DEFENSINE: UNA NUOVA CLASSE DI ANTIMICROBICI
1De Luca C., 1Pulcrano G., 2Scudiero O, 1D’Agostino M., 1Catania M.R., 1Rossano F.
1 Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L. Califano”, Università di Napoli “Federico II”
2 Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche, CEINGE Biotecnologie Avanzate S.C.ar.l.
Gli antibiotici hanno sempre svolto un ruolo importantissimo nel trattamento delle malattie infettive e delle procedure medicoinvasive. Tuttavia, lo sviluppo e la diffusione di ceppi batterici sempre più resistenti anche agli antibiotici di ultima generazione impone la ricerca di nuove classi di antibatterici. Negli ultimi anni si è visto che una risorsa può essere rappresentata da antibiotici “naturali”, quali le defensine che normalmente sono prodotte da batteri, funghi, piante, vertebrati ed invertebrati.
Le defensine sono una famiglia di peptidi antimicrobici, espressi costitutivamente o in seguito ad induzione di stimoli infiammatori, che contribuiscono all’ mmunità innata, attraverso un’azione battericida diretta, ed all’immunità adattativa, mediante
funzioni effettrici e regolatorie. Esse si distinguono in α-, ß- e θ-defensine; nell’uomo sono espresse solo le α-e le ß.
Le ß-defensine sono dei piccoli peptidi cationici di 29-45 amminoacidi, che contengono 6 cisteine legate da tre ponti disolfuro. La struttura terziara è organizzata in tre catene antiparallele che contengono le cisteine e che sono separate nello spazio da
regioni idrofobiche ed idrofiliche. Tale struttura forma il core detto “defensin-like” ed è stato provato che esiste un’importante
relazione tra struttura ed attività antimicrobica.
Nell’uomo sono state isolate circa 30 ß-defensine (human-B-Defensin, hBD), ma le più studiate sono hBD1, hBD2, hBD3 e
hBD4. Anche se tali peptidi mostrano una struttura simile, essi svolgono un’azione antibatterica diversa. In generale hBD1 agisce contro i batteri gram negativi, mentre hBD3 è molto efficace anche contro i batteri gram positivi ed i miceti.
Nel nostro studio abbiamo saggiato l’azione antibatterica di hBD1 e hBD3 sia su ceppi ATCC che su ceppi clinici multiresistenti
(E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans), per verificare l’esistenza di eventuali differenze nell’azione antibatterica.
Risultati preliminari confermano l’azione battericida di hBD1 su batteri gram negativi alla concentrazione di 12.5mM e di hBD3
su gram negativi, gram positivi e miceti a concentrazioni inferiori (2.5mM-0.6mM).
Ulteriori studi verranno condotti per sfruttare la grande potenzialità di tali peptidi nelle applicazioni in campo terapeutico.
CONFRONTO TRA BIOFILM FORMATI DA CEPPI DI PSEUDOMONAS AERUGINOSA PROVENIENTI DA DISTRETTI DIVERSI
1Pulcrano G., 1Lambiase A., 1Del Pezzo M., 2Sarpi O., 1Catania M.R., 1Rossano F.
1 Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L. Califano”, Università degli Studi di Napoli “Federico II”
2 Area Funzionale di Microbiologia AOU Policlinico “Federico II”, Napoli
I biofilm sono una struttura complessa, costituita da microcolonie di batteri circondate da una matrice esopolisaccaridica e organizzate sulla superficie di differenti mucose o su superfici abiotiche. La formazione del biofilm è un processo sequenziale e finemente regolato. Analisi di microscopia hanno evidenziato che il primo evento nella formazione di un biofilm è rappresentato
dalle interazioni dei batteri con una superficie libera, in risposta a vari segnali tra cui stimoli nutrizionali provenienti dall’ambiente esterno. Successivamente si formano microcolonie: in questo stadio, le cellule formanti il biofilm sono nettamente differenti da quelle planctoniche ed esprimono una varietà di geni indispensabili all’adesione. L’ultima tappa è la maturazione del
biofilm.
Pseudomonas aeruginosa è un batterio opportunista che può formare biofilm su una varietà diversa di superfici: l’epitelio delle
vie respiratorie di pazienti affetti da fibrosi cistica, la superficie di ferite o bruciature oppure superfici sintetiche come lenti a
contatto e cateteri. P. aeruginosa in questa fase di adesione aumenta l’espressione di geni come algC, richiesto per la sintesi del
polisaccaride extracellulare; inoltre acquisisce un’aumentata resistenza agli antibiotici causando infezioni persistenti e croniche.
Nel nostro studio è stata valutata la formazione di biofilm in vitro da parte di ceppi di P. aeruginosa isolati da pazienti affetti da
fibrosi cistica e ceppi provenienti da pazienti sottoposti a ventilazione forzata; il saggio è stato effettuato crescendo i batteri in
piastre di polistirene e verificando la formazione di biofilm. Il biofilm formato in ogni piastra è calcolato dopo la rimozione delle
cellule allo stato planctonico, tramite colorazione con cristalvioletto. I risultati hanno evidenziato che i ceppi isolati da pazienti affetti da fibrosi cistica mostrano una spiccata capacità a formare biofilm rispetto a quelli isolati in altri distretti.
Nei ceppi testati è stata successivamente analizzata la struttura del gene pilA che codifica per il pilo di tipo IV, coinvolto nelle
prime fasi della formazione del biofilm. I risultati ottenuti hanno mostrato che differenze nella struttura di pilA sono correlabili con diverse velocità di formazione del biofilm.
79
EFFETTI CLINICI E MICROBIOLOGICI DI CHIPS DI CLOREXIDINA NEL TRATTAMENTO DI
PARODONTITI SEVERE: STUDIO MULTICENTRICO
S. D’Ercole1, G. Catamo1, M. Annunziata3, M. D’Angelo4, D. D’Archivio2, R. F. Grassi5, L. Guida3, G. Nardi6, M.
Paolantonio2, G. Perinetti2, G. Pizzo4, R.Piccolomini1
1Dipartimento di Scienze Biomediche, Università “G. d’Annunzio”, Chieti
Dipartimenti di Parodontologia, 2Università “G. d’Annunzio”, Chieti; 3Università di Napoli; 4Università di Palermo;
5Università di Bari; 6Università “La Sapienza”, Roma
Introduzione. La terapia meccanica, in modo particolare lo scaling e root planing (SRP), rappresenta il principale approccio terapeutico per la malattia parodontale. Diversi studi consigliano l’aggiunta di chips di clorexidina (CHX); ma ad oggi si hanno
risultati contrastanti circa gli effetti clinici e sulla flora subgengivale. Lo scopo di questo studio è stato quello di fornire ulteriori
dati sugli effetti clinici e microbiologici di chips di CHX usati in aggiunta allo SRP.
Metodi. 116 pazienti affetti da parodontite da lieve a moderata, età media 33-65 anni, sono stati reclutati dai Dipartimenti di
Parodontologia delle Università di Chieti, Bari, Napoli, Palermo. Per ciascun paziente, sono stati selezionati due siti sperimentali, con profondità di tasca (PPD) di > 5mm e sanguinamento al sondaggio (BOP). Un sito è stato trattato solo con SRP, mentre l’altro sito ha ricevuto SRP e chip di CHX. Gli indici, PPD, livello di attacco relativo (RAL) e BOP sono stati valutati prima
di ogni trattamento e dopo 3 e 6 mesi. Il prelievo microbiologico è stato effettuato al baseline e dopo 15 gg, 1, 3 e 6 mesi. Esso
è stato processato nel Laboratorio di Microbiologia Clinica dell’Università “G. d’Annunzio” di Chieti, mediante tecnica colturale per la Conta Batterica Totale (CBT) e mediante multiplex PCR per l’identificazione A. actinomycetemcomitans, C. rectus,
E. corrodens, F. nucleatum, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola and T. forsythensis.
Risultati. PPD è risultato più basso nel gruppo SRP+CHX se comparato al gruppo SRP soltanto a 3 e 6 mesi, mentre RAL è
similare tra i trattamenti a 3 mesi e più basso nel gruppo SRP+CHX a 6 mesi. La percentuale di siti positivi per BOP è simile
tra i trattamenti ai vari tempi. La CBT decrementa significativamente con entrambi i trattamenti, soprattutto quando vengono
considerate tasche con PPD > 7 mm. A 15 gg e 1 mese, la CBT per il gruppo SRP+CHX è significativamente più basso del gruppo solo SRP (p<0,01 e p<0,05). Nel tempo, entrambi i trattamenti riducono la percentuale dei siti positivi per la detenzione degli
8 batteri parodontopatogeni, sebbene una riduzione maggiore sia spesso presente nel gruppo SRP+CHX.
Conclusioni. L’aggiunta del chip di CHX comporta una significativa riduzione di PPD e un guadagno di attacco clinico, se comparato al solo trattamento SRP. Questi risultati sono concomitanti ad un significativo effetto di SRP+CHX sulla flora microbica subgengivale.
AV119, UNO ZUCCHERO DI ORIGINE NATURALE, MODULA L’ESPRESSIONE DI HBD-2 IN CHERATINOCITI UMANI VIA PKC E PTK
I. Paoletti, E. Buommino, L. Tudisco, A. Fusco, G. Donnarumma, MA Tufano
Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Microbiologia e Microbiologia Clinica, Facoltà di Medicina e Chirurgia,
Seconda Università degli Studi di Napoli
AV119 è uno zucchero brevettato in grado di determinare l’aumento dell’espressione della b-defensina (HBD-2) in cheratinociti umani. L’HBD-2 è un peptide antimicrobico cationico relativamente ricco in arginina non glicosilata, espresso in diversi tipi
di cellule epiteliali, cute compresa. È particolarmente efficace nel killing di batteri Gram-negativi (Escherichia coli, e
Pseudomonas aeruginosa) e lieviti (Candida albicans, Malassezia furfur) mentre ha un effetto batteriostatico su Staphylococcus
aureus e su molti batteri Gram positivi. A concentrazioni minori ha anche attività chemiotattica.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di determinare il pathway intracellulare coinvolto nell’up-regolazione di HBD-2 indotta dallo zucchero AV119.
A tal fine è stato valutato l’effetto di vari inibitori quali Genestein, inibitore delle tirosin chinasi (PTKs), Calphostin C, inibitore della protein chinasi C (PKC) e H89, inibitore della protein chinasi A, (PKA) sulla capacità dello zucchero di modulare l’espressione dell’HBD-2 in cheratinociti umani. Le cellule sono state pre-incubate per un’ora con gli inibitori e, successivamente, stimolate con lo zucchero alla concentrazione di 0.1% per 24 ore.
I livelli di mRNA per l’HBD-2 sono stati valutati mediante Real-time PCR mentre il rilascio della proteina nei surnatanti cellulari è stato determinato mediante saggio ELISA.
I risultati ottenuti indicano che AV119 è in grado di indurre l’aumento dell’espressione di HBD-2 nei cheratinociti, che raggiunge il massimo dopo 24 ore di trattamento. In aggiunta, quando i cheratinociti vengono pre-incubati con Genestein e
Calphostin C (usati da soli o in combinazione) e successivamente stimolati con AV119 si osserva una forte riduzione dell’espressione della b-defensina. In presenza di H89, invece, sia i livelli di mRNA che l’espressione proteica di HBD-2 sono paragonabili ai valori indotti da AV119. I dati ottenuti da questi esperimenti preliminari ci permettono di ipotizzare che l’aumento
dell’espressione dell’HBD-2 in cheratinociti umani è dipendente dall’attività sia delle PTKs che di PKC e quindi che AV119
agisce mediante la fosforilazione di queste protein chinasi
80
PATHWAY DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE PROINFIAMMATORIO INDOTTO DA PORINE DI
SHIGELLA FLEXNERI IN CELLULE CACO-2
Grimaldi E., Donnarumma G., Perfetto B., Auricchio L., Tufano M.A.
Dipartimento Di Medicina Sperimentale Sezione Di Microbiologia E Microbiologia Clinica – Seconda Università degli Studi
di Napoli
La membrana esterna dei batteri Gram negativi presenta proteine idrofobiche, porine, che, rilasciate durante la replicazione batterica e durante la batteriolisi, possono interagire con la membrana plasmatica delle cellule dell’ospite. Porine purificate posseggono attività immunomodulatorie e procoagulanti e sono considerati determinanti di patogenicità in misura dose dipendente. In cellule epiteliali intestinali, l’attivazione del fattore trascrizionale NF-kB è mediata dal riconoscimento tra prodotti batterici, generati in seguito ad infezione di batteri enteroinvasi, e alcuni recettori appartenenti alla famiglia dei Toll-like receptors
(TLRs). Per verificare il coinvolgimento di porine purificate da Shigella flexneri nel processo infiammatorio, abbiamo valutato
l’attività di queste proteine sulla produzione di alcune citochine (IL-8, IL-6, TNF-a, IL-1b) e sull’induzione di peptidi antimicrobici (HBD-2) in cellule epiteliali intestinali di carcinoma di colon (Caco-2). Nel nostro modello sperimentale l’attivazione
del fattore NF-kB, l’induzione delle citochine e delle defensine è stata valutata verificando sia l’upregolazione del recettore
TLR2 sia il coinvolgimento di MyD88 nella trasduzione del segnale. L’attivazione del fattore NF-kB è stata valutata mediante
EMSA e tecniche di Western Blot. Tecniche di RT-PCR sono state utilizzate per la valutazione delle citochine IL-8, IL-6, TNFα e IL-1ß e delle defensine HBD-1, HBD-2.
I nostri risultati mostrano una chiara attivazione di TLR2 e la conseguente attivazione del fattore trascrizionale NF-kB.
Abbiamo inoltre evidenziato un incremento dell’espressione dell’mRNA di IL-8, TNF-α, IL-1ß e HBD-2. Tali dati confermano
il ruolo immunomodulatorio delle porine e sottolineano il loro diretto coinvolgimento nell’attivazione di NF-kB e nella conseguente modulazione della risposta immune innata dell’epitelio intestinale.
IL 3-O-METHYLFUNICONE (OMF), METABOLITA SECONDARIO ISOLATO DA PENICILLIUM
PINOPHILUM, MODULA L’APOPTOSI IN CELLULE TUMORALI UMANE DI MELANOMA.
*E. Buommino, *A. De Filippis, *M. Petrazzuolo, *N. Lanzieri, °R. Nicoletti, *M.A.Tufano
*Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Microbiologia e Microbiologia Clinica, Seconda Università degli Studi di
Napoli
°C.R.A. – Istituto Sperimentale del Tabacco, Scafati, Italia
Il melanoma è un tumore cutaneo molto aggressivo, notoriamente resistente a molteplici terapie antitumorali convenzionali. Il
3-O-methylfunicone (OMF) è un metabolita secondario isolato dal fungo Penicillium pinophilum. Studi precedenti hanno dimostrato che l’OMF inibisce la proliferazione cellulare e induce l’apoptosi in cellule tumorali HeLa, mentre inibisce la motilità e
riduce l’espressione dell’integrina aVb5 in cellule tumorali di mammella MCF-7. Sulla base dei risultati precedenti abbiamo
voluto verificare se tale metabolita avesse la capacità di modulare l’apoptosi in cellule di melanoma, essendo tali cellule particolarmente resistenti a farmaci in grado di modulare il ciclo cellulare e la morte programmata. In aggiunta, abbiamo voluto verificare se l’OMF avesse la capacità di regolare l’espressione di noti marcatori tumorali espressi in cellule di melanoma, quali
melan A e tyrosinasi. Come modello sperimentale sono state utilizzate cellule di melanoma A375P e le metastasi da esse derivate A375M, allo scopo di individuare anche una differente regolazione nel tumore primario o nella sua metastasi.
Mediante RT-PCR e Western-blot sono stati analizzati alcuni geni che regolano il ciclo cellulare, quali p53, p27 e p21 e le cicline ad assi associati. Inoltre, è stato analizzato il pathway delle caspasi, PARP-1, survivin, nota proteina inibitrice dell’apoptosi,
associata alla sopravvivenza cellulare.
Dai dati ottenuti si evince che l’OMF contrasta efficacemente la progressione tumorale delle cellule A375P e A375M, riducendo l’espressione genica di survivin. Inoltre, l’OMF modula p21, attiva le caspasi 3 e 9, e induce il clivaggio di PARP-1, proteine che regolano il pathway apoptotico. Infine, tale metabolita riduce fortemente i livelli di hTERT, melanA e tirosinasi.
I dati ottenuti chiaramente mostrano che l’OMF è in grado di contrastare la progressione tumorale di cellule di melanoma, sia
derivanti dal tumore primario che dalla sua metastasi.
Studi in “vivo” su modelli murini potranno chiarire l’efficacia di tale molecola nella realizzazione di terapie anti-cancro miranti a contrastare efficacemente quello che è considerato attualmente tra i tumori più difficile da eradicare.
81
EFFETTO DEL TACROLIMUS NELLE INFEZIONI CUTANEE
Donnarumma G., De Gregorio V., Paoletti I., Auricchio L., Donnarumma M., Tufano M.A.
Seconda Università degli Studi di Napoli, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di
Microbiologia e Microbiologia clinica
L’epitelio cutaneo protegge i tessuti sottostanti sia dall’invasione dei microrganismi che da insulti di natura chimica, fisica e
meccanica. Non si tratta tuttavia di una barriera inerte, in quanto i cheratinociti, cellule epiteliali dell’epidermide, producono
numerose citochine, chemochine e peptidi antimicrobici appartenenti alla famiglia delle beta-defensine, contribuendo in tal
modo alle difese dell’ospite contro diversi microrganismi. Le defensine sono piccoli peptidi cationici ad attività battericida/batteriostatica, ma anche importanti molecole effettrici della risposta immune innata, giocando un importante ruolo nella difesa
delle mucose e della cute. Tra le defensine, la beta-defensina 2 (HBD2) è particolarmente efficace nel killing di batteri Gramnegativi (Pseudomonas aeruginosa), lieviti (Candida albicans e Malassezia furfur) ed ha effetto batteriostatico su
Staphylococcus aureus.
Alcune patologie dermatologiche, quali la psoriasi e la dermatite atopica, infiammazioni croniche della cute mediate da cellule
T, sono in stretta correlazione con infezioni fungine, come ad esempio infezioni da M. furfur, lievito lipofilo che fa parte del
microbiota cutaneo umano.
Tra le molecole immunomodulatrici, da utilizzare in terapia dermatologica, riveste un ruolo di particolare interesse il
Tacrolimus, un macrolide prodotto da Streptomyces tsukabaensis, capace di sopprimere la reazione infiammatoria.
In questo studio è stata valutata la capacità di Tacrolimus di modulare l’espressione di citochine pro-infiammatorie, immunomodulatorie, chemochine e HBD2, in monostrati semiconfluenti di cellule epiteliali di linea (HaCat) trattati con Tacrolimus
(1000 nM) e contemporaneamente infettati M. furfrur (MOI 30:1) per 24h.
I dati ottenuti hanno mostrato che Tacrolimus, nel nostro modello sperimentale in vitro, ha un effetto anti-infiammatorio e non
interferisce con l’aumentata espressione di molecole immunomodulanti, come HBD2, che una volta indotte, in corso di infezioni, potrebbero continuare ad avere un’attività antimicrobica durante una terapia dermatologica immunosoppressiva.
MICROSCOPIA TIME-LAPSE, TECNICA INNOVATIVA PER LA VALUTAZIONE DELL’EFFETTO
ANTIVIRALE DI UNA NUOVA MOLECOLA NATURALE, L’ECTOINA
Perfetto B., Canozo N., Melito A., *D’Agostino A., *Schiraldi C., * De Rosa M., Tufano MA.
Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Microbiologia e Microbiologia Clinica, *Sezione di Biotecnologie e
Biologia Molecolare, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Seconda Università degli Studi di Napoli.
Il ruolo di una nuova molecola naturale, l’ectoina, è stato testato in vitro sulla replicazione virale di HSV-1 in cheratinociti umani
di linea, HaCat. L’aggiunta di ectoina su monostrato cellulare 24 ore prima dell’infezione virale determina una riduzione dell’infettività virale che risulta in una evidente diminuzione del numero di placche di lisi tra il 45±5% ed il 60±7%, tale riduzione risulta essere concentrazione dipendente. Lo stesso effetto inibitorio si ottiene trattando il virus con l’ectoina, per 1,50 h a
37°C prima di infettare il monostrato. In linea con tali osservazioni, è stato valutato l’effetto della sostanza sulla produzione
delle proteine virali precoci e tardive come gD, ICP27 e VIP 16 con la tecnica del western blot.
L’ immunoblot ha inoltre evidenziato in presenza di ectoina un aumento dell’espressione di HSP-70, proteina ritenuta cruciale
nel folding e nel rilascio di particelle virali.
La valutazione della concentrazione ottimale di ectoina è stata ottenuta oltre che con metodi tradizionali (saggio delle placche)
anche con l’utilizzo di una stazione di microscopia ottica, dotata di “stage incubator” motorizzato che ha consentito di analizzare in maniera differenziale i campioni in “time lapse”. E’ stato possibile monitorare campi di vista definiti con precisione
micrometrica (in tridimensionale, assi xyz) ogni 10-15 minuti nel corso dell’intero esperimento, le immagini registrate sono state
poi analizzate con “image pro-plus 5.1” e l’evento infettivo è stato caratterizzato, in particolare è stato individuato il momento
iniziale della lisi, che è risultato ritardato per le cellule pretrattate a tutte le concentrazione, e la progressione dell’area è stata
quantificata a tempi sperimentali successivi dimostrando una dicotomia: inizialmente per circa 15-20 h la velocità di progressione del danno diviene minore all’ aumentare della concentrazione di ectoina, dopo le 42 h sperimentali il fenomeno invece si
allinea a quanto rilevato per il controllo. I dati ottenuti suggeriscono che l’ectoina agisce sia sulla cellula ospite inducendo un
meccanismo di difesa cellulare sia sul virus, determinando così un inibizione dell’infettività virale.
82
CORRELAZIONE TRA I DIFFERENTI FENOTIPI DI ERITROMICINO-RESISTENZA DI STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE E L’ATTIVITÀ IN VITRO DI TELITROMICINA ED AZITROMICINA
Allizond V., Banche G., Mandras N., Li Vigni N.1, Scalas D., Roana J., Savoia D.2, Barbui A.3, Tullio V., Carlone N.A., Cuffini A.M.
Dip. di Sanità Pubblica e Microbiologia, Università di Torino
1Lab. Analisi di Microbiologia, ASL 12, Biella
2Dip. di Scienze Cliniche e Biologiche, Università di Torino
3 Lab. Microbiologia, ASO S. Giovanni Battista, Torino
Due differenti meccanismi sono responsabili della resistenza ai macrolidi in Streptococcus pneumoniae: il primo è dovuto all’efflusso attivo dell’antibiotico attraverso la membrana cellulare (fenotipo M, geni mef); il secondo è causato da mutazioni in proteine ribosomiali o nei geni per il 23S rRNA dovute ad una metilasi, con conseguente blocco del legame di macrolidi, lincosamidi e streptogramina B al ribosoma batterico (fenotipo MLSB, geni erm). Modifiche all’anello macrolattonico, comune a tutti
i macrolidi, hanno condotto all’introduzione in terapia dei ketolidi, quali la telitromicina, che vantano l’appartenenza ad una
classe di antibiotici rivolti al trattamento delle infezioni causate anche da patogeni resistenti.
Nel presente studio è stato valutato il fenotipo di resistenza ai macrolidi su recenti isolati clinici di S. pneumoniae provenienti
dagli Ospedali S. Giovanni Battista di Torino, S. Luigi Gonzaga di Orbassano e degli Infermi di Biella, mediante l’utilizzo del
test del triplo disco. Inoltre, è stata determinata l’attività antibatterica in vitro della telitromicina confrontata con quella dell’azitromicina, per correlare i dati di MIC ed MBC con il profilo di resistenza degli stessi isolati.
I nostri dati, concordi con quelli della letteratura, evidenziano una prevalenza di isolamento di ceppi eritromicino-sensibili che
presentano bassi valori di MIC (≤ 0.5 µg/ml) sia nei confronti dell’azitromicina che della telitromicina. Tutti gli S. pneumoniae
eritromicino-resistenti, la maggior parte dei quali appartengono al fenotipo MLSB, presentano MIC ≥ 8 e MIC ≤ 1 µg/ml nei
confronti dell’azitromicina e del ketolide, rispettivamente.
Questi risultati sottolineano l’importanza del monitoraggio delle resistenze, associato alla determinazione dei fenotipi di resistenza, al fine d’instaurare un’appropriata terapia antibiotica: designare i ketolidi come reale innovazione, deriva proprio dalla
loro accertata capacità di esprimere effetto antibatterico anche verso pneumococchi eritromicino-resistenti che possiedono geni
erm o mef.
ONICOMICOSI ASSOCIATE A FUNGHI FILAMENTOSI: PHOMA SPP., CHAETOMIUM SPP. E
MICROASCUS CINEREUS
Banche G., Tullio V., Roana J., Allizond V., Mandras N., Scalas D., Andreotti S., Cuffini A.M, Carlone N.A.
Dip. di Sanità Pubblica e Microbiologia, Università di Torino
Le onicomicosi sono comuni infezioni delle unghie dovute a miceti; i differenti pattern con i quali i funghi colonizzano questi
annessi cutanei dipendono dal genere implicato e dalla sensibilità dell’ospite. La prevalenza delle onicomicosi nella popolazione è tutt’ora sottostimata sebbene siano aumentati i casi riportati in letteratura anche grazie all’uso di tecniche diagnostiche avanzate ed all’identificazione dei fattori di rischio sia endogeni (sesso, età, disordini nella circolazione periferica, diabete, traumi
alle unghie ed igiene personale inadeguata) sia esogeni (clima, area geografica ed immigrazione). Nonostante i dermatofiti ed i
lieviti rappresentino gli agenti eziologici più comuni responsabili di micosi ungueali, queste infezioni possono anche essere
dovute ad altri miceti filamentosi che stanno acquistando sempre maggiore importanza dal punto di vista clinico, poiché sono
in grado di provocare infezioni cutanee e degli annessi, che imitano quelle causate dai dermatofiti.
In questo lavoro sono descritti 3 casi di onicomicosi dei piedi in pazienti adulti di razza caucasica. L’esame obiettivo delle lesioni e l’osservazione microscopica dello scraping dei campioni ungueali, trattati con KOH al 10%, indicavano eziologia fungina,
successivamente confermata dall’esame colturale. L’aspetto macroscopico delle 3 colonie isolate su Sabouraud Dextrose Agar
e quello microscopico delle strutture riproduttive ha permesso di identificare i funghi in esame quali Phoma spp. (Coelomycetes)
e gli ascomiceti Chaetomium spp. e Microascus cinereus (forma anamorfica di Scopulariopsis cinerea).
Dal momento che l’identificazione è fondamentale per meglio definire l’epidemiologia delle onicomicosi e per valutare l’effettiva patogenicità di questi funghi, questi miceti non dovrebbero essere considerati come contaminanti ambientali ma essere inseriti nella diagnosi differenziale dei campioni biologici di origine cutanea. Inoltre, funghi di questo tipo generano spesso infezioni difficili da trattare: per evitare recidive e l’instaurarsi di infezioni croniche è necessaria una diagnosi corretta al fine di sviluppare terapie nuove e mirate.
83
STUDIO DELLA FLORA MICROBICA INTESTINALE NEL LATTANTE ALIMENTATO CON LATTE
ARTIFICIALE ARRICCHITO CON PROBIOTICI, DOPO TERAPIA ANTIBIOTICA
Roana J.,Tullio V., Mandras N., Banche G., Savino F.1, Bailo E1., Cuffini A.M., Carlone N.A.
Dip. Sanità Pubblica e Microbiologia,Università di Torino
1Dip. Scienze Pediatriche e dell’Adolescenza OIRM-Università di Torino
L’equilibrio esistente tra specie batteriche appartenenti alla flora microbica intestinale rappresenta un sistema delicato e facilmente influenzabile da fattori interni ed esterni all’ospite.L’omeostasi, ad esempio,potrebbe essere alterata qualitativamente e
quantitativamente a seguito della terapia antibiotica che potrebbe eradicare i microrganismi sensibili stimolando la proliferazione di quelli opportunisti.
Una dieta a base di latte materno può indurre lo sviluppo di una flora ricca di bifidobatteri che impedisce lo sviluppo di batteri
potenzialmente patogeni.Se i probiotici (bifidobatteri) vengono assunti come supplementi ai cibi possono migliorare la salute
umana e mantenere l’omeostasi intestinale. I probiotici inclusi nel latte artificiale usato nell’alimentazione dei neonati potrebbero mimare alcuni degli aspetti benefici del latte materno.Pertanto, una formula addizionata con probiotici potrebbe prevenire
un dismicrobismo intestinale e ridurre gli effetti collaterali degli antibiotici.
Scopo di questo lavoro è stato quello di valutare la differenza qualitativa e quantitativa della flora microbica intestinale in 72
lattanti (età 90±67 giorni) che, dopo terapia con ceftriaxone, sono stati alimentati con formula addizionata con probiotici (PF)
o con latte adattato convenzionale (CF) o allattati al seno (BF).
I campioni di feci sono stati prelevati al termine del trattamento antibiotico (4° giorno) e dopo 15 giorni di vari tipi di allattamento (PF o CF o BF).I campioni sono stati coltivati su terreni selettivi per la crescita di lattobacilli, anaerobi Gram negativi ed
Enterobacteriaceae.Le analisi statistiche sono state effettuate usando il T di Student’s.
In ogni gruppo analizzato sono state osservate differenze nella composizione della flora intestinale rispetto ai controlli sani (CS)
non sottoposti a terapia antibiotica.Tra gli anaerobi Gram negativi, Bacteroides aumenta in modo significativo nei gruppi CF e
PF; le Enterobacteriaceae sono significativamente più alte nei gruppi BF e PF rispetto a CF(p<0.05); i lattobacilli aumentano
nei gruppi BF e PF ma non c’è differenza significativa rispetto a CF.Nel nostro studio si è osservato che, rispetto al latte convenzionale, quello materno e quello arricchito con probiotici contribuiscono meglio a ristabilire la flora microbica intestinale
dopo trattamento antibiotico.
VALUTAZIONE IN VITRO DELL’ATTIVITÀ DELL’ESTRATTO DI SEMI DI POMPELMO NEI
CONFRONTI DI LIEVITI ISOLATI DA PROTESI FONATORIE
Mandras N., Tullio V., Cavalot A.L.1, Banche, G., Allizond V, Andreotti S., Scalas D., Cuffini A.M., N.A. Carlone
Dip. di Sanità Pubblica e Microbiologia, Università degli Studi di Torino
1Dip. di Fisiopatologia Clinica, Sez. ORL, Università di Torino
I pazienti che hanno subito l’asportazione totale della laringe respirano attraverso il tracheostoma e possono parlare grazie a protesi fonatorie tracheoesofagee. La colonizzazione e l’invasione della protesi da parte di lieviti, con conseguente formazione di
biofilm, costituiscono la principale causa di malfunzionamento della protesi in situ. Miconazolo e nistatina, antimicotici attualmente impiegati a scopo profilattico per prevenire il precoce deterioramento della protesi fonatoria, non sempre si dimostrano
efficaci, evidenziando fenomeni di resistenza (miconazolo) e possibili effetti collaterali (nistatina). A seguito di queste problematiche la fitoterapia sta tentando in questi ultimi anni di apportare il proprio contributo nella cura delle infezioni fungine, in
particolare di quelle recidivanti, come nel caso dei pazienti laringectomizzati. Alla luce di queste considerazioni lo scopo di questo lavoro è stato valutare la colonizzazione fungina di protesi fonatorie in silicone (Blom-Singer e Provox® 2), rilevare la presenza di potenziali patogeni emergenti e determinare se un prodotto di origine naturale, come l’estratto di semi di pompelmo,
possa essere utilizzato a scopo profilattico e conservativo, in sostituzione degli antimicotici più comunemente utilizzati.
L’attività dell’estratto di semi di pompelmo (GSE® BIOTIC DERMOGEL) è stata saggiata in vitro valutandone la MIC e la
MFC.
I risultati ottenuti su 56 protesi fonatorie rimosse da 30 pazienti mostrano una predominante colonizzazione da parte di Candida
spp. (94%) e la presenza di patogeni emergenti come i generi Pichia e Saccharomyces. I valori di MIC e MFC risultano molto
bassi verso tutti i lieviti saggiati, con percentuali comprese tra 0.000235 e 0.03% (v/v) per le MIC e tra 0.0019 e 0.06% (v/v)
per le MFC, indicando in tal modo un’ottima attività antifungina del GSE®. Alla luce dei dati ottenuti si può ritenere che l’estratto di semi di pompelmo potrà rappresentare in futuro un promettente “strumento di supporto” per prevenire la colonizzazione micotica delle protesi fonatorie. Ulteriori studi risultano tuttavia indispensabili per confermare la validità di questi risultati, verificare le potenzialità di questo fitoterapico, stabilire i meccanismi d’azione dei suoi componenti e l’eventuale tossicità
in vivo su animali, stabilendo così le dosi di sicurezza ed efficacia.
84
CONFRONTO DELL’ATTIVITÀ IN VITRO DI LIEVITI E LIEVITO-SIMILI NEI CONFRONTI DEL
VORICONAZOLO NEL PERIODO 2002-2005
Tullio V., Mandras N., Allizond V., Banche G., Roana J., Gaido E. 1, Robbiano F. 1, Cuffini A.M. Carlone N.A.
Dipartimento di Sanità Pubblica e Microbiologia, Università degli Studi di Torino
1Lab. Microbiologia, ASO S. Giovanni Battista, Torino
L’incidenza delle infezioni fungine è aumentata significativamente nelle due passate decadi, in particolare tra gli immunocompromessi. Sebbene Candida albicans continui ad essere comunemente implicata in forme di candidosi invasive e non invasive,
il numero di infezioni umane causate dalle specie non-albicans continua a registrare un aumento significativo. Le ragioni di questo cambiamento sono diverse e probabilmente multifattoriali. Tra queste l’uso, a scopo profilattico, di agenti antifungini come
il fluconazolo in pazienti immunocompromessi, può essere implicato nel cambio di specie con ridotta sensibilità al fluconazolo, come nel caso di C.glabrata o C.krusei. In conseguenza dell’aumento dell’importanza della resistenza si evidenzia la necessità di sviluppare nuovi agenti antifungini più attivi contro specie resistenti. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’attività in vitro del voriconazolo, derivato triazolico, confrontandola con quella del fluconazolo, nei confronti di 878 lieviti
e lievito-simili isolati da campioni clinici provenienti da 3 ospedali torinesi, nel periodo compreso tra il 2002 e il 2005. La valutazione della sensibilità agli agenti antifungini è stata effettuata utilizzando il metodo della diffusione in agar con dischetto,
approvato dal CLSI (M44-A). La lettura degli aloni di inibizione è stata eseguita con il BIOMIC, un sistema di videolettura
automatizzato che rende la lettura più semplice e uniforme assicurando risultati obiettivi degli endpoint degli aloni.
La C.albicans è risultata la specie più frequente, seguita da C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Il fluconazolo è
risultato molto attivo nei confronti di C.albicans, C.parapsilosis e C.tropicalis. Le specie non comuni (tra cui C. lusitaniae, C.
famata, C. norvegensis, C. dubliniensis, C. giulliermondii, C. humicola) sono risultate sensibili al fluconazolo (100%). Il voriconazolo ha mostrato una attività maggiore del fluconazolo verso tutti i lieviti saggiati risultando particolarmente attivo verso
C.glabrata e C.krusei, specie per lo più resistenti al fluconazolo. I lieviti non-candida e i funghi lievito-simili sono risultati sensibili sia al fluconazolo che al voriconazolo. I risultati ottenuti mostrano che il voriconazolo è una scelta terapeutica perseguibile per una terapia empirica in diverse infezioni fungine.
BATTERI AUTOCTONI DELL’AMBIENTE ACQUATICO ISOLATI NEL MAR LIGURE E ANTIBIOTICO
RESISTENZA.
E. Debbiaa, A.M. Schitoa, C. Pruzzob and G.C. Schitoa
DISCAT, Sezione di Microbiologiaa e DIBIOb, Università di Genova
Molti studi sull’antibiotico resistenza nell’ambiente acquatico hanno riguardato i batteri di origine umana e animale, sia indicatori di inquinamento fecale che associati a malattie infettive trasmesse con l’acqua e i prodotti ittici. Nelle acque costiere sono
presenti microorganismi indigeni, potenzialmente patogeni per l’uomo (e. g. Vibrio spp, Aeromonas spp.) le cui caratteristiche
di resistenza agli antibiotici sono meno note, nonostante il loro possibile ruolo quali ceppi serbatoio di geni R. In questo lavoro
abbiamo analizzato la resistenza agli antibiotici di ceppi appartenenti alla specie V. alginolyticus isolati da campioni di acqua e
plancton di diverse dimensioni nel corso di campionamenti avvenuti tra il 2002 e il 2006 nel Mar Ligure. Gli antibiotici saggiati sono stati: ampicillina, amoxicillina-acido clavulanico, cefotaxime, cefotetan, ceftazidime, ciprofloxacina, doxiciclina, imipenem, levofloxacina, meropenem, streptomicina e trimetoprim-sulfamethossazolo. I risultati ottenuti hanno dimostrato la presenza di ceppi resistenti ad almeno un antibiotico in tutte le matrici ambientali e stazioni analizzate. Complessivamente, non è
stato possibile mettere in evidenza un’associazione tra presenza di una particolare resistenza e matrice ambientale. Nessuna
variazione significativa è stata osservata nella percentuale di ceppi resistenti nei diversi campionamenti. L’analisi del DNA di
50 ceppi ha rilevato la presenza di plasmidi in 4 isolati, ma non è stata osservata associazione tra la loro presenza e resistenza
agli antibiotici. E’ in corso un’indagine sulle caratteristiche di resistenza di ceppi isolati da matrici ambientali provenienti da
zone costiere con diverso impatto antropico.
85
ANALISI DELLE CARATTERISTICHE DI PATOGENICITÀ DI CEPPI DI VIBRIO ALGINOLYTICUS
ISOLATI NEL MAR LIGURE
C. Pruzzoa, A.M. Schitob, E. Debbiab, and G.C. Schitob
DIBIOa e DISCAT - Sezione di Microbiologiab, Università di Genova
Vibrio alginolyticus è ampiamente diffuso nell’ambiente acquatico dove è presente sia in forma libera nella colonna d’acqua che
in associazione con substrati biotici e abiotici. Per queste caratteristiche, è stato ipotizzato un suo ruolo come serbatoio ambientale di geni di virulenza derivanti da diverse specie di Vibrio. In questo lavoro abbiamo analizzato la presenza di V. aginolyticus
in campioni di acqua e plancton raccolti nel Mar Ligure nell’estate 2005 e abbiamo caratterizzato gli isolati per quel che riguarda la presenza di geni di virulenza e la capacità di aderire a cellule epiteliali intestinali in coltura. L’isolamento di V. alginolyticus è stato effettuato secondo tecniche colturali tradizionali (arricchimento in acqua peptonata e semina su terreno TCBS). Le
colonie sospette sono state identificate con test biochimici. Su tutti gli isolati (n = 200) e su ceppi di riferimento di V. cholerae,
V. vulnificus e V. parahaemolyticus sono state eseguite reazioni di PCR utilizzando coppie di primer diretti contro i geni tdh e
trh di V. parahaemolyticus, vvhA e vllY di V. vulnificus, ctx, zot, ace, tcpA, toxR, toxT e toxS di V. cholerae. Venti isolati hanno
prodotto amplificati delle dimensioni attese per geni di V. cholerae (quattordici per toxR, uno per ace e cinque per toxR e ace
contemporaneamente) e venticinque per trh di V. parahaemolyticus. Tre di questi ultimi risultavano positivi anche per toxR e
ace. I geni di V. vulnificus non sono stati amplificati in nessuno dei ceppi esaminati. L’analisi delle capacità adesive nei confronti di monostrati cellulari (Caco e Intestino 407) ha messo in evidenza, nei 200 ceppi in esame, una efficienza di adesione
variabile; in particolare, dieci isolati hanno mostrato una efficienza elevata (> 350 cfu/monostrato), paragonabile a quella dei
ceppi di V. cholerae O1 e V. parahaemolyticus di controllo. Questi dati sostengono la necessità di un continuo monitoraggio delle
caratteristiche di patogenicità dei batteri indigeni dell’ambiente acquatico costiero.
IL “CODICE DA ISTONI” ED IL SUO UTILIZZO PER LA REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE
GENICA DI CITOMEGALOVIRUS IN CORSO DI INFEZIONE LATENTE E LITICA IN VITRO
Arcangeletti M.C.a, Ioudinkova E.b, Rynditch A.c, De Conto F.a, Motta F.a, Covan S.a, Pinardi F.a, Razin S.V. b, Dettori G.a,
Chezzi C.a
b Institute of Gene Biology. Russian Academy of Science. Moscow, Russia.
c Institute of Molecular Biology and Genetics. National Academy of Sciences of Ukraine. Kiev, Ukraine.
La linea cellulare monocitaria THP-1 non differenziata può essere infettata con il ceppo Towne di citomegalovirus umano
(HCMV); tuttavia, HCMV persiste in cellule THP-1, senza dare luogo alla produzione di progenie virale (modello di infezione
latente). Al contrario, le cellule THP-1 diventano permissive all’infezione litica da HCMV (modello di infezione litica) dopo
induzione del differenziamento cellulare mediante trattamento delle medesime con un estere del forbolo, denominato 12-O-tetradecanoilforbolo-13-acetato. I due modelli sperimentali sopra descritti sono stati impiegati per studiare il possibile ruolo svolto
da specifiche modificazioni degli istoni nella regolazione dell’espressione genica di HCMV. Allo scopo, mediante l’applicazione di un protocollo di immunoprecipitazione della cromatina, realizzato con l’ausilio di anticorpi in grado di riconoscere l’istone H3 acetilato o dimetilato a livello di lisina in posizione 9 (K9), è stato dimostrato che nel modello latente l’enhancer dei geni
precocissimi di HCMV non sembra essere significativamente associato ad H3 acetilato o dimetilato. Per quanto riguarda l’analisi relativa ai geni di HCMV codificanti per le proteine virali DNA polimerasi (precoce), pp65 (precoce- tardiva) e pp150 (tardiva), sono state osservate differenze sostanziali nei due modelli in esame: nel modello di infezione litica i geni virali sono associati prevalentemente alla forma acetilata in K9 dell’istone H3, mentre nel modello di infezione latente vi è associazione significativa alla forma dimetilata dello stesso istone. Questi dati suggeriscono che la metilazione dell’istone H3 in posizione K9 sia
coinvolta nella repressione genica di HCMV; al contrario, l’associazione dei geni virali con l’istone H3 acetilato è verosimilmente necessaria per l’attività trascrizionale. È plausibile supporre che gli stessi tipi di modificazioni istoniche siano utilizzati
per marcare i geni attivi o repressi nell’ambito sia della cromatina cellulare, sia del genoma virale.
86
INCIDENZA DI RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI IN CEPPI DI PSEUDOMONAS AERUGINOSA ISOLATI NELL’AREA LIGURE-PIEMONTESE
Maioli E., Pallenzona, A., Bandettini R., Bona R., Bottaro L.C., Dono M., Dusi A., Illiberi O., Mazzarello M.G., Usiglio D.,
Devoto GL., Reali S., Santoriello L., Serra D., Marchese A., Debbia E.A.
Gruppo Ligure Gram-negativi, Sezione di Microbiologia – DISCAT, Università di Genova
Introduzione. Pseudomonas aeruginosa è un patogeno opportunista caratterizzato da refrattarietà intrinseca a molti antimicrobici e una notevole capacità di acquisire resistenza nei confronti di potenti molecole antibatteriche. Per tale motivo è stato condotto nel 2007 uno studio nell’area Ligure-Piemontese al fine di stimare l’incidenza attuale di resistenze agli antibiotici di questo germe.
Metodi. A 12 laboratori, distribuiti omogeneamente nel territorio, è stato richiesto, per un periodo di circa 2 mesi, di collezionare tutti gli isolati consecutivi di P.aeruginosa. Per ogni isolato è stato registrato il materiale di provenienza, il sospetto clinico d’infezione e la sensibilità agli antibiotici. Tutti i microrganismi sono stati collezionati, in ceppoteca, per ulteriori studi.
Risultati. Sono stati esaminati 181 ceppi, di cui 116 nosocomiali e 65 comunitari. Gli stipiti di origine nosocomiale hanno
dimostrato percentuali di resistenza pari a 15,5 per piperacillina-tazobactam (TAZ), 32,7 ceftazidime (CAZ), 23,6 cefepime
(CEP), 14,6 imipenem (IPM), 10,4 amikacina (AN) e 39,6 ciprofloxacina (CIP). Gli isolati comunitari hanno manifestato valori pari a 19,1 (TAZ) 33,8 (CAZ), 27,1 (CEP), 18,5 (IPM), 20 (AN) e 44,4 (CIP).
Conclusioni. Gli isolati di P.aeruginosa qui esaminati hanno evidenziato un elevato tasso di resistenza a tutte le classi di farmaci compresi AN, IPM e TAZ che appaiono tra gli antibiotici più attivi. Questi risultati rivelano come la definizione di patogeno comunitario per P.aeruginosa debba essere riconsiderata. La diffusione di stipiti ospedalieri in ambito non nosocomiale
tramite pazienti affetti da patologie croniche (es. fibrosi cistica) o pazienti che pur non degenti in strutture quali case di cura,
effettuano periodici controlli durante lunghe terapie, rende sempre più difficile una netta distinzione tra i ceppi comunitari e non.
Tale aspetto dovrà essere opportunamente approfondito, con ulteriori studi epidemiologici e clinici.
LUPUS NEPHRITIS AND HUMAN POLYOMAVIRUS BK INFECTION
1 Merlino C., 1Costa C., 1Bergallo M., 1Terlizzi M.E., 1Sidoti F., 1Astegiano S., 2Colla L., 2Mesiano P., 3Segoloni G.P.,
1Cavallo R.
1Dept. of Public Health and Microbiology, Virology Unit, University of Turin;
2Dept. of Internal Medicine Nephrology Section Molinette Hospital Turin;
3Dept. of Internal Medicine Renal Transplant Unit Molinette Hospital Turin, Italy
Introduction: Polyomavirus BK (BKV) reactivation can occur in immunocompromised patients and a role for BKV in the
pathogenesis of Systemic Lupus Erytematosus (SLE) has been suggested (1). Aim of the study was to evaluate the prevalence
of BKV reactivation and the possible association with clinical and histological parameters indicating duration, type and activity of SLE nephritis (SLEN).
Methods: BKV-DNA was evaluated by PCR in serum (sBKV) and urine (uBKV) samples from 40 patients with SLEN and 29
healthy controls. Renal function, urinary activity, clinical index of SLE activity (SLEDAI score), CD4+/CD8+ ratio, histological classes and duration of SLEN were compared according to the BKV-DNA-positivity.
Results: sBKV was present in 15% of SLEN patients and 13.8% of controls; uBKV in 32% of SLEN patients and 17.2% of
controls. There was no significant difference in terms of kidney function, urinary activity, SLEDAI score and CD4+/CD8+ ratio.
Duration of nephropathy tended to be shorter in patients with BKV viremia and/or viruria; proteinuria/creatininuria ratio tended to be higher in patients with positive sBKV and uBKV. BKV-DNA-positivity tended to be more frequent in patients treated
with an immunosuppressive agent versus those on steroid treatment.
Conclusions: BKV reactivation can occur in patients with SLEN, although prevalence data do not significantly differ from those
obtained in the control group. The trend toward an association between BKV and degree of proteinuria and less duration of
SLEN could indicate a major susceptibility to BKV reactivation in more active phases of the disease. The role of BKV reactivation in terms of clinical parameters and histological pattern, as well as the role of therapeutic protocols in the onset of BKV
reactivation and, conversely, the therapeutic implication of BKV reactivation in SLEN patients remain to be defined and should
be addressed in further studies on a larger number of patients. 1-Sundsfjord A, Osei A, Rosenqvist H, et al. BK and JC viruses
in patients with systemic lupus erythematosus: prevalent and persistent BK viruria, sequence stability of the viral regulatory
regions, and nondetectable viremia. J Infect Dis 1999; 180: 1-9.
87
RICERCA DI PARVOVIRUS B19 E SUE VARIANTI (V9 E K71) IN CAMPIONI DI CUTE TRAMITE
NESTED PCR
1Costa Cristina, 1Bergallo Massimiliano, 2Ponti Renata, 2Novelli Mauro, 1Sidoti Francesca,1 Merlino Chiara, 3Castagnoli
Carlotta, 3Cambieri Irene, 2Maria Grazia Bernengo 1Cavallo Rossana.
1Dipartimento di Sanità pubblica e Microbiologia, S.C.D.U. Virologia, Università di Torino;
2Dipartimento di Scienze Biomediche e Oncologia Umana, Sezione Dermatologia, Università di Torino;
3 Dipartimento di chirurgia plastica e unità ustionati “Banca della cute” Ospedale CTO Torino.
Introduzione: Il Parvovirus B19 è un piccolo virus appartenente al genere Erythrovirus e alla famiglia Parvoviridae. Nell’uomo
è causa della quinta malattia e, meno frequentemente, di altre patologie talora gravi quali idrope fetale, miocarditi, vasculiti,
malattie neurologiche e epatiti.
Scopo del lavoro: Recentemente sono state isolate varianti di B19 con differenze genotipiche maggiori del 10%. Tali differenze si localizzavano prevalentemente nella regione VP1 del genoma. Attualmente si conoscono tre genotipi di parvovirus B19:
genotipo 1 rappresentato da B19; 2 da K71 (isolato B19 LaLi); 3 da V9. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare
la presenza di DNA virale appartenente ai tre genotipi su campioni di cute sana e patologica.
Metodi: Sono stati analizzati 180 campioni di cute: 42 provenienti da soggetti sani afferenti alla Banca della Cute dell’Ospedale
CTO di Torino, 58 da pazienti con linfomi primitivi cutanei (PCL) e 80 da pazienti con dermatosi infiammatorie (ID) afferenti
al laboratorio di Dermatologia dell’Ospedale S. Giovanni Battista di Torino. Da tali campioni è stato estratto il DNA ed è stata
eseguita una nested PCR per ogni genotipo. I risultati sono stati analizzati con il test del Chi quadro.
Risultati: Il 40% (17/42) dei campioni di cute sana è risultato positivo per B19 o K71, in particolare 11 per B19 e 6 per K71.
Il 33% (19/58) dei campioni di PCL è risultato positivo per B19, K71 o V9, in particolare 13 (22.4%) per K71, 7 (12.1%) per
B19 e 1 (1.7%) per V9. Il 36.3% (29/80) dei campioni di ID è risultato positivo per B19, K71 o V9, in particolare 21 (26.3%)
per K71, 6 (7.5%) per B19 e 3 (3.8%) per V9. La differenza di positività tra campioni di cute sana e patologica non era significativa.
Conclusioni: La presenza di DNA di K71 in molti campioni di cute sana o patologica conferma il particolare tropismo cutaneo
di questo genotipo già ipotizzato in letteratura. Questo dato suggerisce che la cute possa costituire il reservoir di tale virus dopo
l’infezione primaria. L’assenza di una differenza significativa tra positività su cute sana e patologica suggerisce cautela nell’associare a tali virus un ruolo patogenetico in ambito dermatologico. Ulteriori studi son necessari per determinare la rilevanza clinica della prevalenza delle varianti di B19 sulla cute.
RICERCA DEL MIMIVIRUS SU LAVAGGIO BRONCOALVEOLARE: PATOGENO EMERGENTE?
1Bergallo Massimiliano, 1Costa Cristina, 1Terlizzi M.Elena, 1Sidoti Francesca, 1Astegiano Sara, 1Negro Ponzi Alessandro,
1Cavallo Rossana.
1Dipartimento di Sanità pubblica e Microbiologia, S.C.D.U. Virologia Università di Torino;
Introduzione: Il Mimivirus è stato inizialmente isolato da colture di Acanthamoeba polyphaga derivanti da acque ospedaliere
in Gran Bretagna. Per la sua struttura, dimensione (600 nm circa) e l’organizzazione genomica, è stato inizialmente classificato come un batterio cocco gram-positivo denominato Bradford coccus. Oggi il Mimivirus è inserito nella famiglia dei grandi
virus a DNA nucleoplasmatici (NCLDV).
Scopo del lavoro: Recentemente il Mimivirus è stato descritto come patogeno umano, il 2-5% di pazienti ricoverati in terapia
intensiva con polmonite e sintomi respiratori sono risultati positivi a tale virus . Lo scopo del presente lavoro è stato quello di
ricercare il Mimivirus in pazienti ricoverati presso le terapie intensive e rianimazioni dell’Ospedale S.Giovanni Battista di
Torino sottoposti a lavaggio bronco-alveolare per la presenza di sintomatologia respiratoria.
Metodi: Sono stati analizzati 30 lavaggi bronco-alveolari provenienti da altrettanti pazienti adulti ricoverati presso le rianimazioni e terapie intensive dell’Ospedale S.Giovanni Battista di Torino che presentavano sintomatologie respiratorie e/o erano
sottoposti a ventilazione assistita. Tali campioni sono stati processati tramite nested PCR messa a punto nel nostro laboratorio.
Risultati: Nessuno dei 30 campioni ha rivelato la presenza di Mimivirus DNA nel lavaggio broncoalveolare.
Conclusioni: Il numero esiguo di campioni su cui è stato possibile eseguire il test analitico non permette di formulare alcuna
ipotesi eziopatogenetica esauriente. La letteratura internazionale e in particolare francese nell’ultimo anno ha posto particalare
attenzione al Mimivirus come patogeno umano respiratorio emergente. Il controllo delle acque ospedaliere provenienti dalle terapie intensive ed in particolare delle colture di amebe che ne derivano permetteranno di chiarire meglio il ruolo patogenetico di
tale virus nell’uomo e definirne la rilevanza epidemiologica.
88
PRIMARY CUTANEOUS T CELL LYMPHOMAS: HHV7 INVOLVEMENT INVESTIGATED BY REAL
TIME QUANTITATIVE PCR AND COMPARISON WITH HEALTHY SUBJECT.
Massimiliano Bergallo°, Cristina Costa°, Renata Ponti*, Pietro Quaglino*, Maria Elena Terlizzi°, Francesca Sidoti°, Chiara
Merlino°, Mauro Novelli*, Daniela Alotto§, Maria Grazia Bernengo*, Rossana Cavallo°
*Department of Biomedical Science and Human Oncology, Dermatology Section, Turin University, Italy
°Department of Public Health and Microbiology, Virology Unit, Turin University, Italy
§Department of Plastic Surgery and Burn Unit “Skin Bank”, CTO Hospital, Turin, Italy
Primary cutaneous T cell lymphomas (CTCL) encompass a wide variety of lymphomas that share a primary origin in the skin.
Several studies suggested a role for super-antigenic activation of T lymphocytes (i.e. viral antigens) leading to accumulation of
skin-homing T cells. However, although viruses are known to provide chronic immune stimulation, evidences of their association with CTCL are still lacking. Few studies have investigated the potential role of Human Herpes-virus 7 (HHV7) in CTCLs.
HHV7 is a CD4+ T-lymphotropic herpes-virus which could easily infects CTCLs that have the phenotype of T-helper memory
cells (CD3+, CD4+). We investigate the presence of HHV7 DNA on CTCL and healthy skin samples (HS) by a quantitative real
time polymerase chain reaction in order to evaluate it potential pathogenic role in this clinical context. Fifteen of 42 (36%) HS
controls yielded positive results for HHV7-DNA. Twenty of 147 (13.6%) patients with CTCL were found to be positive for
HHV7-DNA: 10/37 (27.0%) Sézary syndrome, 4/11 (36.4%) CD30+ anaplastic large-cell lymphoma and 6/25 (24.0%) lymphomatoid papulosis, while HHV7-DNA was negative in all the mycosis fungoides patients. These results seem to exclude a
pathogenic role of HHV7 in CTCLs, suggesting the possibility of skin as a latency site.
DETERMINAZIONE DI BETA E GAMMA HERPERVIRUS NEL TRAPIANTO POLMONARE TRAMITE REAL-TIME PCR: EFFETTO DELLA PREVENZIONE PER IL CMV SULL’EPSTEIN-BARR VIRUS
NEL MICROAMBIENTE ALVEOLARE
M. Bergallo°, C. Costa°, P. Solidoro+, D. Libertucci+, S.Astegiano, A. Cavallo*, M. Rinaldi#, S. Baldi+, R. Cavallo°
°SCDU Virologia, SC Pneumologia+, *SC Chirurgia Toracica, #SC Cardiochirurgia; ASO S. Giovanni Battista di Torino,
“Molinette”.
Introduzione - Il Citomegalovirus (CMV) costituisce una nota ed importante causa di mortalità e morbilità nel trapianto polmonare. Altri virus
della famiglia dei Beta-Herpesvirus quali l’Herpesvirus 6 (HHV-6) e l’Herpesvirus-7 (HHV-7) e dei Gamma-Herpesvirus quali il Virus di
Epstein-Barr (EBV) appaiono molto rappresentati nel microambiente alveolare dei pazienti sottoposti a trapianto polmonare. In particolare
l’EBV è correlato all’insorgenza di disordini linfoproliferativi EBV associati (post-transplant lymphoproliferative disorders o PTLD), mentre
a tutt’oggi non e’ noto un ruolo di HHV-6 e HHV-7 nel danno polmonare (infezione o rigetto) dopo trapianto d’organo.
Scopo - Abbiamo valutato la positività delle colture virali per il CMV nel lavaggio bronco-alveolare (BAL) di pazienti sottoposti a trapianto
polmonare e la positivita’ su BAL della DNA-PCR di EBV, HHV-6, HHV-7 confrontando i nostri risultati con i dati della letteratura.
Materiali e Metodi - Sono stati analizzati 50 BAL effettuati in corso di broncoscopia di follow-up ai mesi 1,3,6,9,12,18,24 in pazienti sottoposti a trapianto polmonare asintomatici. Tutti i pazienti erano stati sottoposti a terapia preventiva per CMV con ganciclovir o valganciclovir
ed immunoglobuline specifiche per CMV ed EBV (Cytotect Biotest)
Risultati - La positività dell’isolamento in coltura di CMV è stata del 34% (17/50), di EBV-DNA del 6% (3/50), di HHV6-DNA del 28%
(14/50), di HHV7-DNA del 12% (6/50).
Per quanto riguarda la coinfezione con CMV le positività sono state le seguenti: EBV=0/17 (0%), HHV-6=6/17 (35%), HHV-7=3/17 (18%).
Conclusioni - I risultati ottenuti paiono deporre per un numero assai ridotto di riscontri di EBV-DNA, sia da solo sia in coinfezione con CMV.
E’ verosimile che questa differenza (6% rispetto sino al 48% di positività di altri centri e 0% di coinfezione rispetto sino a più del 30%) sia da
correlare alla terapia preventiva per il CMV (antivirali e immunoglobuline) attiva anche sull’EBV. Il dato è molto promettente in termini di
prevenzione dei PTLD EBV-associati in pazienti immunocompromessi per trapianto di organo solido. E’ interessante notare infine l’emergente
prevalenza di positività HHV-6, analoga a quella riferita in letteratura sia in termini di positività che di coinfezione con CMV, meritevole di
approfondimenti negli anni a venire.
Bibliografia essenziale
Bauer et al; J Clin Microbiol, 2007, 45: 324-328 - Hornef et al; Transplantation, 1995, 60: 474-480
89
PORPORA TROMBOCITOPENICA IDIOMATICA CRONICA
HELICOBACTER PYLORI IN ETÀ PEDIATRICA
P.T.I.C. E INFEZIONE DA
C. Geraci1, G.Russo2, F.Branciforte2, V.Miraglia2, L.Vaccaro, V.Scriffignano1, 1P.Grassi1, I.Patamia1, E.Grasso1, G.Guardo1,
A .Sciacca1, G.Nicoletti1 .
Laboratorio Analisi1,Centro Riferimento Regionale Ematologia Pediatrica2- Azienda Policlinico Università di Catania
Nell’ultimo decennio l’infezione da Helicobacter pylori è stata associata ad un numero elevato di disordini sistemici e/o localizzazione extra digestiva: ictus cerebrale, orticaria cronica idiomatica, acne rosacea, artrite reumatoide, deficit staturale. Per
molte di esse le evidenze sono ancora frammentarie e iniziali ma le prospettive di ricerca in questo campo risultano a dir poco
sconfinate. L’infezione da H.pylori è stata associata anche alla porpora trombocitopenia idiopatica cronica un disordine autoimmune con differente meccanismo patogenetico negli adulti e nei bambini.
OBIETTIVO DEL LAVORO
In uno studio multicentrico, che ha incluso diversi ospedali italiani , ci siamo proposti di valutare:
- La prevalenza dell’infezione da Helicobacter pylori nei pazienti con PTI cronica
- L’ efficacia dello schema Amoxicillina + Claritromicina + Omeprazolo come terapia eradicante di prima linea nei nostri
pazienti con infezione da HP e P.T.I.C .
- L’effetto sulla P.T.I.C dell’eventuale eradicazione batterica;
MATERIALI
Nel nostro studio sono stati esaminati 30 bambini affetti da P.T.I.C., 16 maschi e 14 femmine , età media 8,5 anni. Tutti e 30
sono stati sottoposti a screening per la ricerca dell’ antigene dell’ Helicobacter pylori nelle feci.
RISULTATI
Dei 30 bambini esaminati 6 presentavano positività all’ Helicobacter pylori .Tutti e sei i positivi sono stati sottoposti a terapia eradicante secondo lo schema terapeutico descritto in precedenza. L’ avvenuta eradicazione dell’ H.p. è avvenuta in 5 pazienti. I risultati, in termini di conta piastrinica, sono stati i seguenti: 2 pazienti hanno avuto una risposta completa, 1 paziente ha
avuto una risposta parziale, 2 non hanno avuto risposta.
L’aumento della conta piastrinica in soggetti con P.T.I.C., in concomitanza della eradicazione batterica di H.p., costituirebbe
una evidenza sufficientemente fondata della correlazione tra la presenza di H.pylori e PTIC.
Per attribuire l’etiologia di H.p. alla P.T.I. bisognerebbe studiare pazienti di varie classi di età, è noto infatti come l’infezione
da Helicobacter pylori aumenta con l’età.
LE INFEZIONI CATETERE VASCOLARE CORRELATE:QUATTRO ANNI DI OSSERVAZIONE (2004-2007)
A.Amodeo,E.Grasso,G.Guardo, C.Torrisi, P.Grassi, C.Geraci, G.Trapanotto, A.Sciacca, G.Nicoletti
Laboratorio analisi Azienda Policlinico Universitario.
L’incrementato ricorso alla caterizzazione venosa centrale si è accompagnato alla rilevazione di un aumento statistico delle complicazioni associate alla sua esecuzione, di natura sia meccanica che infettiva.
Obiettivo: Determinare l’incidenza di infezioni catetere correlate, i microrganismi coinvolti e rilevarne l’ antibiotico sensibilità.
Materiali e metodi: Sono stati presi in considerazione i controlli microbiologici effettuati su cateteri vascolari pervenuti da
pazienti ricoverati presso i reparti di Terapia Intensiva, Terapia intensiva neonatale, Ematologia pediatrica; nel periodo compreso tra 2004-07.
Per la ricerca dei batteri nei cateteri è stato utilizzato un metodo semi quantitativo in cui come soglia di positività è stata considerata la presenza di 15 ufc. Il materiale appena pervenuto in laboratorio è stato seminato su agar triptosio + 5% sangue di
montone e cromagar per Candida. Le emocolture sono state effettuate utilizzando i flaconi BD BACTEC. L’identificazione e
l’eventuale antibiogramma su Phoenix BD o Vitek 2 Bio Merieux.
Nella nostra indagine per singolo paziente è stato considerato solo il primo campione positivo.
Dal confronto e dalla conseguente correlazione tra l’esame colturale di un segmento del cvc e i risultati delle emocolture si è
avuta la conferma di diagnosi “infezione sistemica da catetere endovascolare”
Risultati: Negli anni di osservazione su 1482 indagini microbiologiche eseguite su cvc, 222(14,9%) sono risultate positive. Tra i
microrganismi isolati nettamente predominante è lo St. epidermidis 38,2 % seguito da Candida spp 13.5%, P. aeruginosa 9.9 %
e St.aureus 5,8%. Con percentuali di gran lunga inferiori si riscontrano E faecalis e Corinebatteri spp 2,7%, A baumanni 3,6%.
Tra gli enterobatteri si evidenziano E.coli 3,1%, E.cloaca 2,2%, E.aerogenes, K. Pneumoniae e P.mirabilis con lo 0,9% e
C.freundi, S.marcescens con lo 0,1%.
Nel 16.6% dei casi è stato possibile correlare la positività del cvc e l’emocoltura.
La presenza di batteriemia rilevata dall’emocoltura e la sua associazione a una positività del cvc è spesso segno di un quadro clinico importante e non di una semplice colonizzazione del catetere. Conoscere i microrganismi responsabili di infezione
in un reparto è importante per gli studi epidemiologici , bisogna infatti sempre tenere presente che per ridurre e/o fronteggiare le infezioni da cvc non si può prescindere da una conoscenza precisa di quella che è la realtà locale.
90
SENSIBILITÀ AGLI ANTIBIOTICI: UN ANNO DI OSSERVAZIONE ENTEROBATTERI e GRAM
NEGATIVI NON FERMENTANTI A CONFRONTO
P.Grassi , E.Grasso, G.Guardo ,V.Scriffignano , C. Geraci ,A.Amodeo, I.Patamia, A .Sciacca , G.Nicoletti
Laboratorio Analisi - Azienda Policlinico Università di Catania
La resistenza agli antibiotici è un evento naturale che può tuttavia essere facilitato dall’uso eccessivo degli antibiotici stessi. È
ben noto che all’immissione di un antibiotico nell’uso terapeutico segue, con una distanza di tempo variabile, l’insorgenza di
resistenza. Diviene perciò sempre più necessario disporre di dati aggiornati sulla prevalenza delle resistenze batteriche .
MATERIALI: Abbiamo esaminato i dati di antibiotico resistenza relativi agli enterobatteri e gram negativi non fermentanti isolati nel 2006. Tutti i ceppi batterici sono stati isolati da materiali biologici, provenienti dai reparti di lungo degenti ed esattamente Oncoematologia Pediatrica, Terapia Intensiva, Terapia Intensiva Neonatale (T.I.N.) e Trapianti. Sono stati presi in esame
anche gli isolati da pazienti ambulatoriali non ricoverati. Gli antibiogrammi sono stati eseguiti con apparecchiatura Vitek2.
RISULTATI: Farmaci quali ampicillina, piperacillina, indicati come farmaci di prima scelta, non possono più essere consigliati per gli enterobatteri. Gli aminoglicosidi quali amikacina, gentamicina e netilmicina risultano pressoché sempre attivi con sensibilità differenti, più alte verso le molecole più vecchie. L’imipenem mostra il 100% di sensibilità tranne che per P. mirabilis.
Nei disinfettanti urinari si evidenziano resistenze variabili. I chinoloni presentano notevole resistenze soprattutto nei confronti
di E.coli (58%) . E. cloacae è generalmente sensibile agli antibiotici tranne i ceppi isolati in T. I. N.
Per i gram negativi non fermentanti quali P.aeruginosa e Acinetobacter, nel repato di terapia intensiva neonatale e trapianti, la
resistenza agli antibiotici ad ampio spettro è giunta a livelli preoccupanti (piperacillina 67-100 %), (ceftazidime 70-100%),
(ciprofloxacina 52-100% ) . In entrambi i reparti di terapia intensiva si sono riscontrate per l’imipenem e il meropenem resistenze dell’80 %, lo stesso si riscontra con l’aztreonam. L’amikacina, in tutti i reparti, mostra % di sensibilità elevate per P.aeruginosae mentre nei confronti di Acinetobacter, nei reparti di T.I. e trapianti, le % di sensibilità sono del 25% e 67%.
Enterobatteri produttori di EBSL sono stati isolati non solo in terapia intensiva, utin neonatale ma anche nei pazienti ambulatoriali esterni .
L’aumento dei fenomeni di resistenza rende necessario lo sviluppo di dati epidemiologici locali per ottimizzare la scelta dei
farmaci da adottare per la tempestiva introduzione di una terapia empirica che viene di sicuro intrapresa nei reparti a rischio.
STREPTOCOCCUS AGALACTIAE E SUO POSSIBILE RUOLO COME PATOGENO
G.Guardo , E.Grasso, P.Grassi, A.Amodeo, C. Geraci, G.Trapanotto, A.Sciacca, G.Nicoletti
Laboratorio Analisi - Azienda Policlinico Università di Catania
Streptococcus agalactiae è nell’uomo frequente colonizzatore del tratto respiratorio e genito-urinario . Nel tratto genitale femminile, in pazienti asintomatiche presente con o senza reazione anticorpale, è in grado di infettare il liquido amniotico e penetrare
nella placenta rendendosi responsabile di sepsi e meningite neonatale. I caratteri clinici associati all’infezione sono nascita
prematura, ipotensione o shock, apnea, marcata neutropenia ed alta concentrazione di antigene polisaccaride capsulare in circolo. Un importante meccanismo da cui può avere inizio il processo flogistico è la formazione di immunocomplessi circolanti. Se
questi ultimi sono in numero e grandezza tale da non essere spazzati dal sistema reticoloendoteliale, essi si depositano sul letto
vascolare attivando il complemento e provocando flogosi locale con danni tissutali.
In S.agalactiae, inoltre, è stata repertata una lipoproteina, probabilmente appartenente alla famiglia delle adesine Lral (lipoprotein receptor antigen 1), che media l’attacco del batterio con colonizzazione dell’epitelio danneggiato e traslocazione dello
streptococco nel sangue.
Sono stati inclusi nello studio 2243 t. faringei, 250 t. vaginali e 2157 urine provenienti da pazienti ricoverati (1786) e da ambulatoriali esterni (2864) , 53% femmine, 47/%maschi .
S.agalactiae si è riscontrato rispettivamente in 21 (0,93 %) t. faringei, in 74 (29,6%) t. vaginali e solamente in 9 (0,4%) urine.
Su 2166 campioni appartenenti a pazienti di sesso maschile, 15 sono quelli risultati positivi: ciò significa che solamente lo 0,7%
degli uomini può andare incontro a infezioni da S.agalactiae. Questa percentuale aumenta sensibilmente nelle donne raggiungendo il 3.6%: 89 campioni su 2484 analizzati contenevano Streptococchi di gruppo B.
Si tratta d’altronde di un risultato che ci si poteva logicamente aspettare, essendo il tratto genitale femminile l’habitat più idoneo alla crescita degli Streptococchi di gruppo B.
Percentuali abbastanza simili, invece, sono quelle riguardanti la positività dei campioni ospedalieri ed ambulatoriali.
Studi epidemiologici europei riportano una percentuale di colonizzazione da parte degli Streptococchi di gruppo B che oscilla
dal 3% al 20%; studi americani riportano invece una percentuale del 26%.
Nello stesso periodo della nostra osservazione non si è avuta nessuna sepsi neonatale o infezione nei reparti di neonatologia.
91
ETIOLOGIA DELLE INFEZIONI NELLE LESIONI TROFICHE E NELLE ULCERE DEI SOGGETTI
DIABETICI
E.Grasso1, G.Failla 2,G.Guardo1, P.Grassi1, A.Amodeo1, C.Geraci1, A.Sciacca1, G.Nicoletti1
Laboratorio Analisi1, Chirurgia vascolare2- Azienda Policlinico Università di Catania
Le lesioni trofiche e le ulcere del piede nei soggetti diabetici compromettono drammaticamente la
qualità di vita, in tutte le componenti fisiche, psicologiche e socio relazionali. Molti pazienti presentano problemi al sistema
vascolare periferico e neuropatie periferiche che potrebbero compromettere le normali difese dell’ospite nei confronti di tessuti infetti. Le parestesie associate ad una riduzione delle sensazioni, come il dolore, spesso ritardano il riconoscimento di un’infezione da parte del paziente. L’area di massima pressione dell’avampiede corrisponde alla zona più comune per lo sviluppo
delle ulcere. Queste hanno un incidenza del 5-15% e rappresentano, quando si complicano con una infezione, una delle più
comuni cause di ricovero ospedaliero. Si associano a morbilità e mortalità elevata e a un elevato rischio di amputazione dell’arto
interessato. Sono state prese in considerazione 140 colture effettuate da tamponi provenienti da lesioni superficiali e profonde
con vario grado di gravità comprendenti le ulcere superficiali, le ulcere profonde con ischemia ed infezione, le ulcere complicate con interessamento osseo ed estese a gran parte del piede. I tamponi effettuati in reparto sono stati immediatamente inviati in laboratorio dove si è proceduto alla semina su terreni selettivi e di arricchimento per la ricerca dei comuni batteri Gram
pos., Gram neg., miceti e batteri anaerobi. Le piastre per la ricerca degli anaerobi sono state subito inserite nei contenitori singoli per la creazione di anaerobiosi. Le infezioni sono spesso polimicrobiche, e includono anche quelli della normale flora cutanea, organismi di origine fecale, e microrganismi ambientali come Pseudomonas.
I batteri maggiormente riscontrati sono stati : S. aureus(32.8%), P.aeruginosa (24.3%), Stafilococchi coagulasi negativi(8.5%),
Enterobacteriacae(21.4%), Enterococchi(1.4%), Corynebatteri (10%).
Nella nostra casistica il 26% di S. aurei sono meticillino resistenti mentre per gli Stafilococchi coagulasi negativi la resistenza è del 75%; teicoplanina e vancomicina presentano 100% di sensibilità così pure linezolid che presenta alta biodipsonibilità. La sensibilità verso i chinoloni quali Ciprofloxacina e Levofloxacina è rispettivamente dell’88% e del 50% .
Per P. aeruginosa le percentuali di sensibilità sono così distribuite: Piperacillina 76%; Piperacillina/Tazobattame 76%;
Meropenem 96%; Imipenem 85%; Ciprofloxacina 61%. Nel nostro studio oltre ai patogeni più comunemente isolati sono stati
considerati i microrganismi normalmente presenti nella flora cutanea così pure le lesioni superficiali che, alla luce delle difficili situazioni di trofismo dei tessuti di questi pazienti, non devono esser considerate banali.
CARATTERIZZAZIONE DI CEPPI INVASIVI DI STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE DI SIEROTIPI
NON VACCINALI RESISTENTI AGLI ANTIBIOTICI
D’Ambrosio F.1, Gherardi G.2, Monaco M.1, Camilli R.1, Del Grosso M.1, D’Ancona P.1, Manganelli R.3, Dicuonzo G,2
Pantosti A.1
1Istituto Superiore di Sanità, Roma, 2Università Campus Bio-Medico, Roma, 3Università di Padova, Padova.
Questo studio si è proposto di caratterizzare i ceppi di Streptococcus pneumoniae antibiotico-resistenti appartenenti a sierotipi
non inclusi nel vaccino glicoconiugato eptavalente (PCV7), circolanti in Italia, definendo la loro composizione clonale. Ceppi
invasivi di S. pneumoniae isolati in Italia sia da adulti che da bambini sono stati sottoposti a sierotipizzazione. Le prove di sensibilità agli antibiotici sono state effettuate mediante E-test. I profili di Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) e la Multilocus
Sequenze Typing (MLST) sono stati usati per identificare i gruppi clonali. Tra i ceppi isolati nel periodo 1999-2003, circa il 50%
apparteneva a sierotipi non vaccinali. I ceppi non sensibili alla penicillina (PNSSP) erano il 4,6% tra i sierotipi non vaccinali,
tutti nella categoria intermedia, mentre erano il 16,4% tra i sierotipi vaccinali. Inoltre il 13,9% dei sierotipi non vaccinali erano
sensibili alla penicillina, ma multiresistenti (MDR-PSSP), cioè resistenti a eritromicina, clindamicina e tetraciclina, contro il
38,2% dei sierotipi vaccinali. Tra i sierotipi non vaccinali PNSSP (18 ceppi), i sierotipi prevalenti erano il 19A e il 35F (5 isolati ciascuno), seguiti dal 15A (2 isolati). Sono stati identificati il clone internazionale Sweden15A-25/ST63 (sierotipi 19A e
15A) e il nuovo clone 35F/ST676. Tra i sierotipi non vaccinali MDR-PSSP, i sierotipi prevalenti erano 19A (14 isolati), 15B/C
(11 isolati), e 3 (8 isolati). Sono stati identificati i cloni Sweden15A-25/ST63, Netherlands15B-37/ST199 (sierotipo 19A),
Greece21-30/ST193 (sierotipi 19A e 15B/C) e Netherlands3-31/ST180 (sierotipo 3), ed il nuovo clone 15B/C /ST1577. In conclusione in era pre-vaccinale in Italia i sierotipi non inclusi nel PCV-7 mostravano un basso grado di resistenza alla penicillina
e di multiresistenza rispetto ai sierotipi vaccinali. Tra i sierotipi non vaccinali sono stati identificati sia cloni internazionali che
nuovi cloni. Risultati preliminari sulla distribuzione dei sierotipi di pneumococchi evidenziano un aumento dei ceppi antibiotico-resistenti appartenenti al sierotipo 19A, il sierotipo non vaccinale che negli Stati Uniti è aumentato drammaticamente in
seguito all’introduzione del PCV-7.
92
IDENTIFICAZIONE DI BORRELIA BURGDORFERI s.l. NEL SIERO DI PAZIENTI CON BORRELIOSI
DI LYME MEDIANTE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)
Santino I, Berlutti F, Pantanella F, del Piano M.
Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica, Sapienza Università di Roma.
Borrelia burgdorferi è l’agente eziologico della Borreliosi di Lyme, un’infezione multisistemica che colpisce diversi organi e
che si presenta in tre stadi evolutivi. La diagnosi si basa sui dati clinici e deve essere avvalorata dalle indagini di laboratorio
anche se non sempre l’isolamento e la sierologia sono in grado di confermare l’infezione da Borrelia. Attualmente il grado di
sensibilità della PCR nella diagnosi di Borreliosi di Lyme è di difficile valutazione a causa della mancanza di standardizzazione e dei diversi trattamenti utilizzati per i campioni biologici presi in esame.
In tale lavoro presentiamo un sistema di PCR da noi ottimizzato in grado di rilevare la presenza di DNA di Borrelia nel siero di
pazienti con sintomi riferibili alla Borreliosi di Lyme.
L’indagine è stata condotta su 265 pazienti con sospetta infezione da Borrelia afferenti al Servizio Speciale Analisi
Microbiologiche 2 dell’Azienda Policlinico Umberto I. La ricerca degli anticorpi anti-Borrelia è stata eseguita con l’Elisa e con
il Western Blot. 20 (7.5%) dei 265 pazienti inclusi nello studio presentavano anticorpi anti-borrelia ad entrambi i test.
La ricerca del genoma di Borrelia è stata effettuata nel siero dei 20 pazienti risultati positivi ai tests sierologici, nel siero di 9
pazienti sierologicamente negativi ed in un gruppo di soggetti sani presi come gruppo di controllo. L’amplificazione genica è
stata eseguita mediante PCR utilizzando primers specifici per sequenze di Borrelia burgdorferi s.l. e, successivamente, il DNA
è stato ulteriormente analizzato per determinare la genospecie di appartenenza utilizzando primers specifici per B.burgdorferi
sensu stricto, B.garinii, B.afelii, B.valaisiana.
La presenza di DNA di Borrelia burgdorferi s.l. è stata rilevata in tutti i 20 (100%) sieri dei pazienti risultati positivi sierologicamente, in 2 (23%) dei 9 sieri negativi ai test sierologici ed in nessuno dei sieri appartenenti al gruppo di controllo.
Per quanto riguarda la genospecie in 11 sieri è stata riscontrata la presenza di B.afelii, in 4 di B.garinii, inoltre in 5 sieri sono
state individuate coinfezioni, infine in 2 campioni non è stato possibile determinare la genospecie di appartenenza, mentre in
nessun siero è stata riscontrata la presenza di B.burgdorferi sensu stricto.
Questi risultati suggeriscono che la metodica di PCR da noi ottimizzata si è dimostrata efficace e utile nel confermare la diagnosi dell’infezione da Borrelia.
IDENTIFICAZIONE DI CEPPI DI A. baumannii APPARTENENTI A CLONI EPIDEMICI MEDIANTE
SEQUENZIAMENTO DI GENI COINVOLTI NELLA PRODUZIONE DI BIOFILM
L. Dolzania, R. Bressana, G. Di Bonaventurab, C. Lagatollaa, S. Morassuttoa, G. Lubinia, L. Furlanisa ed E. A. Tonina
aDipartimento di Scienze Biomediche, sez. di Microbiologia, Università di Trieste
bDipartimento di Scienze Biomediche, Università “G. D’Annunzio” di Chieti-Pescara
A. baumannii è un importante patogeno opportunista, che può causare gravi infezioni nosocomiali in pazienti immunocompromessi ed è responsabile di epidemie in ambito ospedaliero. Queste sono generalmente sostenute da ceppi multiresistenti o panresistenti, che diventano successivamente endemici nelle strutture interessate. La quasi totalità dei ceppi epidemici appartiene a
tre cloni principali, diffusi in tutta Europa. I cloni pan-europei sono stati definiti con il metodo AFLP, ma sono distinguibili
anche mediante ribotipizzazione e analisi di macrorestrizione. Si tratta in ogni caso di tecniche laboriose e poco adatte al confronto tra laboratori, qualità che sarebbe auspicabile per migliorare i sistemi di sorveglianza e per acquisire una conoscenza più
approfondita sulle modalità di comparsa e di diffusione di questi ceppi. Recentemente, è stato proposto di identificare i ceppi
appartenenti a cloni epidemici sulla base di variazioni di sequenza nei geni ompA (determinante di una porina), csuE (essenziale per la produzione di biofilm) e blaOXA-51-like (determinante della carbapenemasi intrinseca di A. baumannii).
Il presente lavoro consiste nello studio del polimorfismo di due geni coinvolti nella produzione di biofilm, ai fini di acquisire
nuovi e migliori strumenti per la tipizzazione. Oltre al già citato gene csuE, è stato considerato csuC, il cui prodotto è correlato
a fattori che favoriscono l’assemblaggio dei pili. Lo studio costituisce anche un primo tentativo di mettere in relazione la presenza di alleli specifici con una maggiore o minore capacità di produrre biofilm.
Il lavoro si è basato su una trentina di ceppi di A. baumannii, isolati da pazienti ricoverati in diversi ospedali europei ed assegnati ai tre cloni pan-europei, o considerati sporadici, in base all’analisi di macrorestrizione. Il sequenziamento dei due geni in
questi ceppi ha dimostrato che entrambi hanno alleli altamente differenziati e clone-specifici. Tuttavia, in csuE vengono talvolta riscontrate mutazioni puntiformi, che possono interferire con l’interpretazione dei risultati. Il gene csuC è altamente conservato nell’ambito di ceppi appartenenti ad uno stesso clone e pertanto il suo sequenziamento costituisce un valido strumento
per l’identificazione di ceppi appartenenti a cloni epidemici.
93
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI STIPITI DI H.PYLORI ISOLATI A PALERMO MEDIANTE ANALISI DEI MOTIVI EPIYA DI CAGA
Calà C.*, Reina A.*, Bonura C.*,Giammanco A.
*Dipartimento di Igiene e Microbiologia, **Istituto di Clinica Medica Università degli Stidi di Palermo.
Tra i geni di H.pylori, il gene cagA (cytotoxin associated gene A) è quello più frequentemente associato a quadri patologici
gravi quali l’ulcera peptica ed il carcinoma gastrico.
Tale gene, localizzato nell’isola di patogenicità PAI, codifica per una proteina in grado d’interagire con diversi pathway metabolici della cellula ospite.
Studi recenti suggeriscono la possibilità che il grado di virulenza del batterio possa associarsi alla presenza di particolari motivi aminoacidici EPIYA (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala), localizzati nella regione C-terminale della proteina CagA e fosforilati da diversi
membri della famiglia delle chinasi Src.
In particolare dallo studio molecolare delle sequenze aminoacidiche fiancheggianti i motivi EPIYA sono stati definiti 4 distinti
segmenti EPIYA A-B-C-D, che potrebbero variamente presentarsi negli stipiti in relazione alle aree geografiche di provenienza. Sembra infatti che gli isolati batterici dei paesi occidentali presentino segmenti A-B-C mentre quelli dell’ est asiatico segmenti A-B-D. Inoltre, in alcuni degli stipiti occidentali la ripetizione della regione EPIYA-C si correlerebbe ad una più elevata
attività biologica della proteina CagA e quindi ad una maggiore virulenza del microrganismo.
Per confermare tali acquisizioni sono necessari ulteriori dati ed a tal fine la caratterizzazione dei motivi EPIYA è stata eseguita
anche su 20 stipiti di H.pylori cagA+, isolati da campioni bioptici provenienti da soggetti, pervenuti alla nostra osservazione,
per diversa patologia gastrica (10 gastrite cronica attiva, 9 ulcera peptica, 1 carcinoma).
La caratterizzazione di tali isolati è stata eseguita utilizzando i 2 metodi descritti in letteratura che prevedono il sequenziamento o l’analisi elettroforetica dei patterns di amplificazione della regione 3’-OH del gene cagA.
I dati da noi ottenuti hanno dimostrato che l’analisi elettroforetica dei patterns di amplificazione, considerata da alcuni autori un
metodo alternativo per la rapidità di esecuzione e per il ridotto costo, non è in grado di sostituire il sequenziamento.
Infatti le diversità relative alle ripetizioni del motivo C, evidenziate dall’analisi del pattern, non sono state confermate dal
sequenziamento, che invece ha rilevato la presenza di un profilo EPIYA A-B-C omogeneo in tutti i 20 stipiti.
ANALISI GENOTIPICA DI HELICOBACTER PYLORI IN CAMPIONI BIOPTICI
Calà C.*, Bonura C.*, Reina A.*, Taormina S.*, Peralta S.**, Giammanco A.*
*Dipartimento di Igiene e Microbiologia, **Istituto di Clinica Medica Università degli Stidi di Palermo.
L’infezione della mucosa gastrica ad opera di H.pylori, agente frequentemente responsabile di gastrite cronica e ulcera peptica,
viene associata, con il persistere negli anni, ad un aumentato rischio d’insorgenza del carcinoma gastrico.
Diversi fattori di virulenza del microrganismo sono implicati nella patogenesi gastrica di cui, in particolare quelli associati ai
diversi genotipi vacA (s1m1, s1m2, s2m2) fra loro correlati a cagA e babA2. Essi sembrano, infatti, condizionare l’evoluzione
della patologia indotta dal batterio ed in particolare il profilo genico vacAs1cagA+babA2+, piuttosto che quello vacAs2cagAbabA2-, è maggiormente associato ai quadri clinici più gravi e ad un più elevato grado d’infiltrazione granulocitica della mucosa interessata.
Di recente sono stati studiati altri geni quali hopQ, hopZ, oipA, sabA, codificanti proteine coinvolte nell’adesione di H.pylori
all’epitelio gastrico e nell’induzione di una risposta infiammatoria con rilascio di citochine quale ad esempio IL-8.
Al fine di studiare anche nella nostra area geografica la circolazione dei genotipi virulenti, abbiamo preso in esame 91 pazienti
palermitani positivi per H.pylori ed affetti da patologia gastrica (38 con gastrite cronica non attiva, 23 con gastrite cronica attiva, 27 con ulcera peptica, 2 con gastrite atrofica ed 1 con carcinoma gastrico).
In particolare sono stati presi in considerazione i geni vacA, cagA, babA2 e hopQ. Essi, a causa delle difficoltà di coltivazione
del microrganismo e per ridurre i lunghi tempi di risposta, sono stati analizzati, tramite tecniche molecolari, utilizzando DNA
estratto dalle biopsie gastriche.
Sebbene in 19 campioni non sia stato possibile amplificare il gene hopQ, i risultati ottenuti hanno evidenziato che nei soggetti
con gastrite cronica non attiva era più frequente il profilo genico vacAs2m2cagA-babA2-hopQII, mentre nei soggetti con patologia gastrica più grave (gastrite cronica attiva, ulcera) il profilo vacAs1m1cagA+babA2+hopQI/II. L’unico caso di carcinoma
gastrico presentava profilo vacAs1m2cagA+babA2-hopQI.
Per confermare i dati, abbiamo successivamente preso in considerazione anche i 32 isolati batterici di H.pylori provenienti da
31 dei 91 pazienti esaminati. Gi stipiti sono stati anche saggiati per i geni delle adesine ( hopZ, oipA,sabA) tramite l’analisi del
numero di “repeats CT”, che sembrerebbero determinarne lo stato on o off associato al grado di virulenza del microrganismo.
94
ATTIVITA’ IN VITRO DELLA DAPTOMICINA NEI CONFRONTI DI STIPITI NOSOCOMIALI DI
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ED ENTEROCOCCUS SPP. ISOLATI A PALERMO
Palmeri A., Amato T., Vella A., Distefano S., Giammanco A.
Dipartimento di Igiene e Microbiologia “G. D’Alessandro”, Università degli Studi di Palermo.
Come rilevato dalla rete di sorveglianza sia nazionale che mondiale, è frequente l’isolamento di stipiti di S.aureus e di
Enterococcus spp. che, circolando nell’ambito di pazienti ospedalizzati, pongono spesso problemi terapeutici anche gravi, di difficile risoluzione e per i quali è considerato necessario poter disporre di farmaci alternativi pienamente efficaci in grado di controllarne la diffusione. Secondo l’ultimo rapporto EARSS (The European Antimicrobial Resistance Surveillance System), per
quanto concerne le infezioni nosocomiali sostenute da S.aureus, quelle associate a stipiti MRSA (Staphylococcus aureus meticillino-resistente), , interessano il 38% dei casi italiani; mentre tra le infezioni sostenute da Enterococcus spp., quelle associate
a stipiti resistenti ai glicopeptidi (VRE) raggiungono il 20% dei casi. Sulla base delle indicazioni nazionali ed al fine di contenere la loro diffusione anche presso la nostra struttura ospedaliera è stata rivolta particolare attenzione al rilevamento della presenza nei nostri isolati di multiresistenze. Le percentuali di resistenza nel periodo Gennaio-Dicembre 2006 sono state sicuramente inferiori a quelle nazionali corrispondendo infatti rispettivamente al 10% ed al 5% degli stipiti presenti ma non meno
preoccupanti per le implicazioni terapeutiche ed epidemiologiche che le caratterizzano. Anche noi, quindi, abbiamo valutato
come molecola attiva da utilizzare in occasione di quadri clinici gravi la Daptomicina, lipopeptide ciclico con azione specifica
nei confronti dei Gram-positivi, introdotta in terapia per i casi di difficile risoluzione associati a microrganismi quali S.aureus
ed Enterococcus spp. anche multiresistenti. Abbiamo, in particolare, saggiato 100 stipiti di S.aureus di cui 10 MRSA, 38
Betalattamasi produttori e 52 sensibili, e 100 stipiti di Enterococcus spp., di cui 5 VRE, 30 HLGR (resistenti a gentamicina alto
livello), 30 HLSR (resistenti a streptomicina alto livello) e 35 sensibili. Gli stipiti VRE di Enterococcus spp. erano tutti appartenenti alla specie E.faecium. Le valutazioni di sensibilità alla Daptomicina sono state eseguite, come descritto in letteratura, utilizzando l’E-Test.
ALTERATA REATTIVITA’ MACROFAGICA IN CORSO DI INFEZIONE MISTA DA VIRUS E FUNGHI: VALUTAZIONI FUNZIONALI, CITOFLUORIMETRICHE E DI ESPRESSIONE GENICA
Claudio Cermelli1, Samuele Peppoloni1, Andrea Ardizzoni1, Enrico Tagliafico2, Elisabetta Blasi1
1Dip. Scienze di Sanità Pubblica, 2Dip. Scienze Biomediche, Università Modena-Reggio Emilia
Base: I casi clinici di infezioni miste da funghi e virus sono in aumento, soprattutto negli ospiti immunocompromessi.
Ciononostante, gli eventi biomolecolari che caratterizzano l’andamento di infezioni polimicrobiche sono tuttora poco conosciuti: scarse sono le conoscenze sulle interazioni che si verificano tra i patogeni e sui derivanti effetti, sinergistici o antagonistici. Nell’ambito del presente lavoro, abbiamo indagato sulla reattività macrofagica nel corso di infezioni miste, sostenute da
virus HSV-1 e funghi opportunisti patogeni.
Metodi: Sulla base di recenti studi (Cermelli C. et al., 2006), cellule THP-1 infettate per 18 ore con HSV-1 venivano esposte a
Candida albicans o Cryptococcus neoformans e quindi saggiate per fagitosi, killing (CFU), marker fenotipici (citofluorimetria)
ed espressione genica (microarray di RNA).
Risultati: La fagocitosi di entrambi i miceti risulta significativamente aumentata nei monociti infettati da HSV-1 mentre l’attività antifungina è diminuita (significativa sopravvivenza e replicazione intracellulare dei due miceti). Al citofluorimetro, cellule THP-1 infettate mostrano a) significativa downregolazione di TLR2 e TLR4, importanti molecole coinvolte nel riconoscimento dei miceti; b) ridotta espressione di CD38 e CD69, marker di attivazione cellulare; 3) aumento dei marker di apoptosi e
necrosi. Il profilo di espressione genica indica un drastico calo (circa il 50%) nella quantità di geni espressi e una modulazione dell’espressione dei geni che comunque restano accesi nelle cellule infettate da HSV-1 rispetto ai controlli (> 7.500 geni
sovra- o sotto-espressi di almeno 3 volte). In particolare, l’analisi genica per cluster mostra uno spegnimento dei geni coinvolti nella fagocitosi opsonizzata e un aumento dell’espressione di quelli associati alla fagocitosi non opsonizzata. I geni di TLR2
and TLR4 risultano downregolati così come molti geni coinvolti nel killing intracellulare.
Conclusioni: Questi dati dimostrano che HSV-1 è in grado di alterare la funzione del macrofago fino a renderlo inerme o addirittura promotore della sopravvivenza e della replicazione del fungo, sottolineando la possibilità di effetti sinergici in vivo nel
corso di infezioni miste.
Lavoro supportato dal MIUR-PRIN 2005 (n. 2005068754-003).
95
VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA’ A VANCOMICINA E DAPTOMICINA DI CEPPI DI S. AUREUS
METICILLINO RESISTENTI (MRSA) DI RECENTE ISOLAMENTO CLINICO
Migliavacca R.1, Nucleo E.1, De Luca C.1, Spalla M.2, Caronte I.3, Matti C.2, Daturi R.2, Pagani L.1.
1Università di Pavia; 2Fondazione IRCCS “S. Matteo”, Pavia; 3Università di Milano.
Introduzione: I ceppi di S. aureus meticillino-resistente (MRSA) sono tra i principali e più diffusi patogeni nosocomiali.
Sebbene i glicopeptidi rappresentino gli antibiotici di prima scelta per il trattamento delle infezioni da MRSA, l’incidenza degli
isolati con ridotta sensibilità a tale farmaco (VISA ed h-VISA) è in aumento.
Nuove molecole antibiotiche, tra cui il lipopeptide Daptomicina, sono state recentemente introdotte per ampliare l’armamentario terapeutico nei confronti dei patogeni Gram positivi MDR emergenti.
Metodi: Nel periodo agosto 2006 - agosto 2007 sono stati raccolti, da pazienti ricoverati presso l’Ospedale IRCCS San Matteo
di Pavia, 55 stipiti di S. aureus ?-lattamasi produttori.
Identificazione ed antibiogramma di tali isolati sono state ottenute mediante Vitek System II (BioMèrieux). La sensibilità in vitro
nei confronti di cefoxitina (FOX), vancomicina (VA) e daptomicina (DPC) è stata valutata mediante Kirby-Bauer (per FOX) ed
E-test (per VA e DPC). Gli isolati con ridotta sensibilità alla VA (MIC >1.5 mg/L) sono stati sottoposti ad ulteriore “screening”
impiegando BHI agar addizionato con 4 e 6 mg/L di VA.
Risultati: Gli isolati sono stati ottenuti prevalentemente da tamponi ferita (47%) ed emocolture (22%), seguiti da escreato (11%)
e materiali vari (20%).
42/55 (76.4%) stipiti di S. aureus sono risultati MRSA; il 90.4% di questi mostrava MIC >1.5 mg/L per VA. Il 31.5% e 5.2%
di detti 38 isolati con ridotta sensibilità alla VA hanno mostrato crescita, rispettivamente, sui terreni contenenti 4 e 6 mg/L di
VA. Gli stipiti positivi all’agar screen provenivano prevalentemente da reparti di chirurgia, medicina, oncologia ed urologia. Gli
isolati sono risultati sempre sensibili alla DPC (MIC 0.047-0.75 mg/L).
Conclusioni: I risultati confermano come l’ampio uso di glicopeptidi abbia provocato un aumento di ceppi con ridotta sensibilità alla vancomicina; ciò implica un’attenta valutazione in rapporto all’esito terapeutico, potendo rappresentare una potenziale
causa di fallimento terapeutico. Da qui l’opportunità, per ceppi che, in vivo, siano in grado di evolvere verso una resistenza intermedia ed omogenea (VISA), di optare per molecole quali la DPC, verso la quale non sono stati registrati, all’oggi, che rari casi
di resistenza.
CARICA VIRALE E GENOTIPIZZAZIONE DI HIV SU CARTA DA FILTRO (DBS)
Matteoli B., Parenti S., Albani M., Iuliano R., Frateschi S., Maggi F., Morganti R., Vatteroni ML., Ceccherini-Nelli L.
Sezione di Virologia, Dipartimento di Patologia Sperimentale BMIE, Università di Pisa.
La quantificazione e la genotipizzazione virale HIV permettono di predire la progressione clinica dell’infezione, l’efficacia della
terapia anti-retrovirale, l’efficacia individuale della risposta immune e la diffusione epidemica dei vari ceppi, ma richiedono procedure di difficile attuazione nei paesi con scarse risorse. Abbiamo valutato la possibilità di una collaborazione alla quantificazione virale ed alla genotipizzazione di campioni prelevati in Repubblica Centroafricana (Ospedale Giovanni Paolo II,
Associazione “NOI PER L’AFRICA ONLUS”) ed acquisiti come spot su carta da filtro (DBS) di sangue essiccato ed inattivato.
Per la messa a punto del metodo, 200 µl di sangue intero di 29 pazienti, afferiti al laboratorio di Virologia per la determinazione della carica di HIV-1, sono stati essiccati a temperatura ambiente su FTA® Classic Card (Whatman), reidratati con tampone
TE (10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA, pH 8,0) “overnight”, incubati a 56ºC per 30min, e processati con COBAS
AmpliPrep/COBAS® TaqMan HIV-1 Test (Roche). 29/29 (100%) DBS sono risultati positivi per genoma HIV con cariche virali entro un 1log10 rispetto a quelle determinate nel plasma. I risultati sono stati confermati in 3 sedute diverse.
Il metodo è stato quindi applicato all’analisi di 13 DBS ottenuti da pazienti sospetti HIV positivi, con sangue prelevato in
Repubblica Centroafricana ed inviato al nostro laboratorio. 12/13 (92,3%) sono risultati positivi per genoma di HIV: 6 (46%)
contenevano 104 copie/ml (range 11.700-91.600) e 4 (30,7%) 103 copie/ml (range 1.920-4.880). In 2 (15%) la carica virale era
rilevabile, ma sotto l’intervallo lineare di sensibilità del saggio di quantificazione (40-10.000.000 copie/ml).
Il genotipo HIV è stato determinato su 6/9 campioni disponibili, lavati con WPR (Whatman Purification Reagent) e tampone
TE, posti nella miscela di amplificazione per la regione p17 gag del DNA provirale e sequenziati. L’analisi filogenetica ha permesso di attribuire 4 isolati al sottotipo A, 1 al sottotipo B, 1 al sottotipo G. L’isolato di tipo G è risultato portatore della mutazione A426G recentemente associata ad una diminuita efficienza di replicazione virale.
I DBS rappresentano uno strumento pratico ed economico per il prelievo, la conservazione, il trasporto di campioni di sangue,
specialmente nei paesi in via di sviluppo ed ad alta prevalenza di infezione da HIV, e consentono la valutazione della carica virale ed il genotipo di HIV.
96
ROTAVIRUS DI GRUPPO C: CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI DUE CEPPI RIVELATI IN
CASI DI ENTERITE PEDIATRICA
Medici M.C.1, Abelli L.A.1, Martinelli M.1, Martella V.2, Buonavoglia C.2, Dettori G.1 e Chezzi C.1
1Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio – Università degli Studi di Parma,
2Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali - Università di Bari.
L’infezione da rotavirus di gruppo C (GCRV) è descritta in forme enteriche sporadiche o epidemiche sia in bambini che in adulti in tutto il mondo. Molti aspetti dell’epidemiologia e dell’ecologia di questi virus sono tuttora poco noti. In questo studio è
descritta la caratterizzazione molecolare di due ceppi GCRV identificati in bambini ricoverati con enterite a Parma nel periodo
2004-2005.
Un totale di 273 campioni di feci risultate positive per particelle rotavirus-simili alla microscopia elettronica (prevalenza:
31,9%) sono stati analizzati mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide (PAGE) dell’RNA virale, rivelando in 2 casi un profilo elettroforetico 4:3:2:2 caratteristico di GCRV. Nei rimanenti 271 casi è stato invece osservato un profilo elettroforetico
(4:2:3:2), tipico dei rotavirus di gruppo A (GARV).
L’analisi delle sequenze dei geni VP4, VP6 e VP7 ha rivelato circa il 100% di identità tra i due stipiti GCRV. L’analisi filogenetica ha mostrato che i ceppi sono tipicamente umani, in quanto segregano con i GCRV umani in tutti i tre geni.
La prevalenza di infezione da GCRV è stata 0,23% mentre quella da GARV è stata 31,66%. Nonostante la bassa prevalenza di
infezione da GCRV osservata nei due anni di studio, i risultati ottenuti confermano recenti segnalazioni sulla circolazione di
GCRV in Europa, dimostrando che tale patogeno enterico è presente anche in Italia. Dati siero-epidemiologici e molecolari sembrano suggerire la possibile trasmissione zoonosica dei GCRV. L’analisi dei due stipiti GCRV rivelati in questo studio dimostra
tuttavia la loro chiara appartenenza al cluster umano. Al fine di acquisire dati più esaustivi, sarebbe opportuno includere i GCRV
negli algoritmi diagnostici delle enteriti umane, e monitorare l’epidemiologia dell’infezione in un lungo arco di tempo e in livello di tutte le classi di età.
CARATTERIZZAZIONE DI STIPITI DI ROTAVIRUS DI GRUPPO A CIRCOLANTI IN ITALIA IN
EPOCA PRE-VACCINALE
Medici M.C.1, Abelli L.A.1, Martella V.2, Martinelli M.1, Buonavoglia C.2, Dettori G.1 e Chezzi C.1
1Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio – Università degli Studi di Parma,
2Dipartimento di Sanità e Benessere degli Animali - Università di Bari.
In Italia l’impatto delle forme enteriche da rotavirus di gruppo A (GARV) nei bambini di età <5 anni è stimato in circa 80.000
visite mediche, 10.000 ricoveri e 11 decessi ogni anno. Vaccini mono- o poli-valenti per la prevenzione dell’enterite da GARV
sono in fase di commercializzazione ed hanno come target i ceppi epidemiologicamente predominanti, quali P[8],G1, P[8]G3,
P[8]G4 e P[4]G2. In questo studio è descritta la caratterizzazione molecolare di stipiti GARV associati a diarrea infantile a
Parma nel periodo 2004-2005.
Sono stati sottoposti a PAGE gli RNA estratti da 273 campioni di feci positivi alla microscopia elettronica per particelle rotavirus-simili (prevalenza 31,9%) appartenenti a bambini ricoverati con enterite. L’analisi elettroforetica dell’RNA ha consentito l’identificazione di GARV in 271 campioni e di rotavirus di gruppo C (GCRV) in 2 casi.
La genotipizzazione di 270 stipiti GARV è stata effettuata mediante nested RT-PCR. La maggior parte degli stipiti sono stati
caratterizzati come P[8]G1 (42,8%) e P[8]G9 (29,9%). I virus P[8]G1 sono stati predominanti nel 2004 (67,5%), mentre i virus
P[8]G9 hanno predominato nel 2005 (41,5%). Inoltre è stato identificato un ceppo inusuale P[14]G8, e-tipo lungo. Tali virus
derivano probabilmente da riassortimento tra ceppi umani e animali (ruminanti). La fluttuazione dei P e G tipi dei GARV (continuo avvicendamento dei ceppi circolanti) rientra nelle caratteristiche epidemiologiche dei rotavirus e sembra un meccanismo
atto a ridurre la pressione immunitaria specifica. L’identificazione di un’epidemia da virus P[8]G9 nel 2005 e di un virus atipico P[14]G8, non inclusi nelle valenze vaccinali, sottolinea l’importanza della sorveglianza epidemiologica per rotavirus.
L’introduzione dei vaccini potrebbe infatti creare una forte pressione selettiva e modificare l’epidemiologia di questi virus, favorendo la comparsa di genotipi nuovi o rari.
97
EFFETTO POSTANTIBIOTICO DELL’ASSOCIAZIONE TOBRAMICINA-OLIO ESSENZIALE DI
MELALEUCA ALTERNIFOLIA SU E. COLI
M. D’Arrigo1, G. Ginestra1, G. Donia1, G. Mandalari1, P.M. Furneri2, G. Bisignano1
1Dip. Farmaco-Biologico, Università di Messina;
2Dip. di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università di Catania.
La capacità di descrivere gli effetti di farmaci in associazione è una delle maggiori sfide nella farmacologia ed è di fondamentale importanza nello studio della terapia di combinazione. La somministrazione associata non riguarda solo i chemioterapici di
sintesi, ma coinvolge anche i principi attivi contenuti in sostanze naturali, come gli oli essenziali.
L’olio essenziale di Melaleuca alternifolia (TTO) è un biocida ad ampio spettro che agisce a livello della membrana; viene utilizzato per lo più come prodotto farmaceutico o cosmetico per uso esterno o come prodotto veterinario. Inoltre TTO potrebbe
essere utilizzato come aerosol in associazione alla tobramicina nella terapia di patologie che interessano le vie respiratorie inferiori ed in particolare per la cura di polmoniti da E. coli. Si potrebbero limitare gli effetti tossici dovuti ad un prolungato uso
dell’ amminoglucoside studiando l’effetto postantibiotico dell’ associazione antibiotico-olio essenziale.
Lo scopo del presente lavoro e’ stato quello di valutare l’associazione in vitro di tobramicina e TTO nei confronti di E.coli ATCC
25922.
L’effetto postantibiotico (PAE) e’ stato calcolato mediante il Bioscreen C.
Dai risultati ottenuti mediante il metodo della scacchiera e dalla curva di mortalità dell’associazione antibiotico-TTO e’ stato
evidenziato un effetto sinergico contro E. coli. Dopo 8h e 4h la carica batterica ha subito un decremento di oltre 5log10 di esposizione alla tobramicina alla minore e maggiore concentrazione utilizzata in associazione con l’olio essenziale, risultando questa interazione più efficace dell’azione delle singole sostanze. Il PAE, calcolato attraverso la formula T – C, ovvero come la differenza tra il tempo necessario alla coltura esposta all’azione delle sostanze test e al corrispondente controllo per ricrescere ad
un punto definito (A50) sulla curva OD, dove A50 è definita come il 50% della massima OD del controllo, è risultato maggiore nell’associazione tobramicina-olio (10,8h) rispetto all’olio da solo (9,16h) e alla tobramicina da sola (1,2h) .
Questi risultati dimostrano che mediante associazione tobramicina-olio essenziale di Melaleuca alternifolia sarebbe possibile
allungare il periodo che intercorre tra una somministrazione e l’altra del farmaco, diminuendo gli effetti collaterali che potrebbero scaturire da una lunga cura farmacologica.
ATTIVITA’ANTIMICROBICA ED EFFETTO ANTI-GENOTOSSICO DI ESTRATTI DI BERGAMOTTO
(CITRUS BERGAMIA RISSO) E DI LIMONE (CITRUS LEMON (L.)
G. Mandalari1, G. Ginestra1, M. D’Arrigo1, A. Narbad2, K. Waldron2, C.B. Faulds2, G. Bisignano1
1Dip. Farmaco-Biologico, Università di Messina; 2Institute of Food Research, Colney Norwich (UK).
Il bergamotto (Citrus bergamia Risso), utilizzato prevalentemente per l’estrazione dell’olio essenziale dalla buccia, trova applicazioni nelle industrie alimentari e cosmetiche, nonchè in campo farmaceutico. Le polpe di limone (Citrus lemon L.) e bergamotto rimangono come scarto principale dei frutti processati, ma contengono ancora composti ad alto valore aggiunto potenzialmente utilizzabili, come i flavonoidi. I flavonoidi sono metaboliti secondari noti per i loro effetti benefici contro malattie
cardiovascolari, allergie, fragilità capillare e cancro.
Nel presente lavoro frazioni di bergamotto e limone ricche in flavonoidi sono state analizzate per la loro attività antimicrobica
nei confronti di batteri Gram+, Gram- e lieviti e per il loro effetto anti-genotossico.
Gli estratti ricchi in flavonoidi sono stati ottenuti mediante estrazione sequenziale in etanolo della polpa di bergamotto e di limone ed analizzati per la loro attività antimicrobica contro batteri Gram+ (Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria innocua ATCC
33090, Lactococcus lactis MG 1614, Staphylococcus aureus FI 10139), Gram- (Escherichia coli MG 1655 (K12), Salmonella
enterica var. Typhimurium LT2, Pseudomonas putida ATCC 795) e Saccharomyces cerevisiae NCYC 505.
Studi di attività mutagena e antimutagena sono stati condotti con il sistema SOS Chromotest su Escherichia coli PQ37 in presenza ed in assenza del sistema bioattivante S9. Le frazioni di limone e di bergamotto ricche in flavonoidi sono risultate attive
contro i batteri Gram- e potrebbero di conseguenza essere utilizzati come antimicrobici naturali. L’attività antimicrobica delle
frazioni del bergamotto è risultata superiore dopo trattamento con Pectinase 62L, che ha rilasciato flavonoidi agliconi attivi.
I campioni non sono mutageni nei confronti del ceppo Escherichia coli PQ37, ma evidenziano una significativa capacità di inibizione della genotossicità che è risultata concentrazione dipendente. Gli stessi risultati sono stati ottenuti utilizzando il sistema
bioattivante S9.
In conclusione estratti di limone e bergamotto ricchi in flavonoidi potrebbero essere impiegati come fitofarmaci e come additivi alimentari.
Mandalari G. et al. Antimicrobial activity of flavonoids extracted from bergamot (Citrus bergamia Risso) peel, a by-product of
the essential oil industry. J. Appl. Microb. 2007 (in press).
98
DIFFUSIONE EPIDEMICA DI ESCHERICHIA COLI CTX-M-15 NEL REPARTO DI TERAPIA
INTENSIVA NEONATALE DEL PRESIDIO OSPEDALIERO DI TREVISO
Pagani L.1, Migliavacca R.1, Campion L.2, Nucleo E.1, De Luca C.1, Bessegato A.2, Spalla M.3, Caronte I.4, Toscani P.2,
Rigoli R.2.
1Università di Pavia; 2Azienda Unità Locale Socio-Sanitaria n°9 di Treviso; 3Fondazione IRCCS “S. Matteo”, Pavia;
4Università di Milano.
Introduzione: Presso le Unità di Terapia Intensiva Neonatale (NICU) le infezioni nosocomiali rappresentano un grave problema. L’incidenza delle infezioni dovute a microrganismi resistenti agli antibiotici ?-lattamici è notevolmente aumentata negli
ultimi anni ed è spesso associata ad “outbreak” clonali. Scopo di questo studio è stato caratterizzare e genotipizzare stipiti di
E.coli isolati dalla NICU del Presidio Ospedaliero di Treviso.
Materiali e Metodi: Nel periodo Dicembre 2006 - Aprile 2007 sono stati effettuati campionamenti da pazienti ricoverati presso la NICU. L’identificazione ed i test di sensibilità sono stati eseguiti con il sistema Vitek II (BioMèrieux); successivi test fenotipici e molecolari sono stati condotti al fine di rilevare le ES?L prodotte. La PFGE è stata utilizzata per stabilire le relazioni
clonali tra gli isolati.
Risultati: 37 dei campioni prelevati da 30 pazienti sono risultati positivi per la crescita di Gram-negativi. Di questi, 35 risultavano positivi per E. coli. Tali isolati sono stati ottenuti prevalentemente da tamponi rettali (21/35) e tamponi orofaringei (10/35).
34/35 E. coli presentavano un fenotipo di resistenza tipico dei ceppi produttori di cefotaximasi ed erano, in 32 casi, sensibili ad
amikacina, cefoxitina e carbapenemici. Tali 32 isolati, correlati clonalmente, producevano l’enzima CTX-M-15. 1/35 E. coli
mostrava sensibilità verso tutti gli antibiotici testati e non risultava correlato al clone epidemico. La presenza di quest’ultimo si
è inoltre riscontrata in altre strutture ospedaliere sul territorio nazionale.
Conclusioni: Di particolare rilievo emerge l’appartenenza allo stesso clone di E. coli nel 91.4% degli isolati clinici. E’ interessante specificare che nessun paziente, nel periodo di studio, veniva trattato per tale specie poiché non patologico; risulta tuttavia difficile, nei pazienti colonizzati a livello intestinale, considerare E. coli normale flora batterica, quando produttore dell’enzima CTX-M-15. Pertanto è ipotizzabile una trasmissione orizzontale del ceppo.
Considerando la persistenza di E.coli nell’arco dei 4 mesi di studio e la colonizzazione di 30 pazienti, è plausibile la presenza
di una contaminazione di tipo ambientale. E’ necessario quindi attuare adeguate misure di controllo e prevenzione al fine di evitare rischi di infezione.
EFFETTO DI TIMOSINA α1 SULLA FAGOCITOSI DI CONIDI ASPERGILLARI DA PARTE DI
MACROFAGI UMANI IN VITRO
Gaziano R.1, Serafino A.2, Andreola F.2, Psaila R.2, Kellici S.3, Garaci E.1, Sinibaldi Vallebona P.1.
1Dipartimento di. Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Roma “Tor Vergata” 2Istituto di Neurobiologia
e Medicina Molecolare, CNR, Roma
3Dipartimento di . Farmacia, Università Statale di Tirana(Albania)
La Timosina a1 (Ta1) è un peptide timico di cui è nota l’attività verso le cellule effettrici della risposta immune. Attualmente
viene impiegata, in combinazione, nel trattamento di infezioni virali croniche e neoplasie. Recentemente è stata descritta la sua
capacità di modulare la funzione delle cellule dendritiche, prospettandone quindi un ruolo anche nella regolazione dell’immunità innata. Scopo di questo studio è di verificare se Ta1 sia in grado di incrementare l’attività fagocitaria di macrofagi umani,
derivati da sangue periferico (MDMs), nei confronti di conidi aspergillari. Tale attività è stata valutata mediante microscopia
confocale, in seguito a somministrazione di biglie di polistirene o ad infezione in vitro con conidi di Aspergillus niger . L’effetto
di Ta1 sull’adesione e l’internalizzazione dei conidi è stata valutata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) ed a
trasmissione (TEM) rispettivamente. I dati ottenuti hanno evidenziato che Ta1 è capace di stimolare l’attività fagocitaria dei
macrofagi, non solo nei confronti di uno stimolo aspecifico, come le biglie, ma anche nei confronti di uno stimolo specifico,
come i conidi. Infatti, le osservazioni effettuate in microscopia ottica e confocale dimostrano che il trattamento con Ta1 è in
grado di incrementare, già dopo 30min dall’infezione, il numero di conidi adesi alla membrana cellulare e dopo 1,5 ore anche
quello dei conidi internalizzati, rispetto ai controlli non trattati. Tale risultato ha trovato conferma nelle analisi in microscopia
elettronica al SEM ed al TEM, che mostrano inoltre come i macrofagi pre-trattati con Ta1 siano, in seguito all’infezione, morfologicamente più attivati rispetto al controllo non trattato. Poiché la fagocitosi rappresenta il meccanismo di difesa più efficace, messo in atto dall’organismo, nei confronti delle infezioni fungine, e le infezioni da Aspergillus rappresentano le più temute tra le patologie nosocomiali e le principali cause di morte dei pazienti trapiantati di midollo, l’individuazione di una sostanza capace di potenziare le difese immunitarie nei confronti di una patologia di tale rilievo, potrebbe certamente rappresentare
una notevole conquista nel settore della farmacologia.
99
L’OLIO ESSENZIALE DI ARTEMISIA ARBORESCENS INATTIVA HSV-1 E HSV-2 E INIBISCE LA DIFFUSIONE LATERALE IN CELLULE VERO
Manuela Saddi, Rita Meleddu, Adriana Sanna, Lorenza Chisu, Alessandro De Logu
Sezione di Microbiologia Medica, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università di Cagliari
Le manifestazioni primarie e secondarie delle infezioni sostenute da HSV sono particolarmente diffuse in particolare tra gli individui affetti da AIDS o affetti da immunosoppressione per cause iatrogene o patologiche. Recentemente si è osservato un aumento dell’incidenza della resistenza ai farmaci antivirali. La resistenza all’acyclovir si manifesta nel 20% dei ceppi isolati degli
individui precedentemente esposti al farmaco. Ceppi resistenti all’acyclovir e trattati con vidarabina e foscarnet possono inoltre
sviluppare multi-resistenza in seguito a mutazioni dei geni che codificano per la DNA polimerasi. Sono pertanto necessari nuovi
strumenti terapeutici e profilattici per il trattamento delle infezioni sostenute da HSV-1 e -2. Diversi oli essenziali sono stati
descritti per l’attività in vitro nei confronti di diversi virus. Viene descritta l’attività dell’olio essenziale ottenute da foglie di
Artemisia arborescens nei confronti di HSV-1 e HSV-2. La tossicità cellulare è stata determinata in cellule Vero mediante riduzione di MTT. I valori di IC50 sono stati determinati mediante plaque reduction assay. Al fine di determinarne il meccanismo
d’azione sono stati effettuati saggi mediante yield reduction assay, inhibition of plaque development assay, attachment assay,
penetration assay e post-attachment virus neutralization assay. Mediante riduzione di MTT è stato determinato un valore di
CC50 in cellule Vero di 132 mg/ml. I saggi di neutralizzazione virale in condizioni standard (37°C per 1 ora) hanno evidenziato valori di IC50 di 2.4 mg/ml e 4.1 mg/ml rispettivamente per HSV-1 (CC50/IC50 55) e HSV-2 (CC50/IC50 32.2).
L’inattivazione di HSV-1 dipende dal tempo e dalla temperatura di esposizione. I saggi di inibizione dello sviluppo di placche
in cellule Vero hanno evidenziato una significativa riduzione del diametro determinata dopo 48, 72 e 96 ore di incubazione e
indicano che l’olio essenziale di A. arboresces inibisce inoltre la diffusione laterale di HSV-1 e HSV-2. Studi sono in corso per
identificare e isolare i componenti responsabili della attività antivirale. I flavoni già descritti in Artemisia (4’,6,7-triidrossi-3’,5’dimetossi- e 5’,5-diidrossi-3’,4’,8-trimetossiflavone, artemetina, bonanzina, eupalitina, crisosplenetina) presentano valori di
IC50 significativamente più elevati e possono essere quindi solo in parte responsabili dell’attività neutralizzante dell’olio essenziale di A. arborescens.
EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE DI HHV-8 IN PAZIENTI DIABETICI. STUDIO DI UNA POSSIBILE RELAZIONE TRA HHV-8 E DIABETE MELLITO DI TIPO 2
A. Ingianni1, F. Carta1, M. A. Madeddu1, A. Reina2, M. Manai3 A. Desogus1,4, R. Pompei1,4
1Sezione di Microbiologia Applicata, Università degli Studi di Cagliari. 2Servizio di Immunoematologia, Ospedale Brotzu di
Cagliari. 3Servizio di Diabetologia e Malattie metaboliche, Ospedale S.Giovanni di Dio, Cagliari. 4Biotecne, Cagliari.
L’Herpes virus umano di tipo 8 (HHV-8) appartiene alla sottofamiglia delle Gammahepesvirinae. E’ associato a tutte le forme
del Sarcoma di Kaposi, alla malattia multicentrica di Castelmann, ai linfomi primari diffusi (PEL), ai linfomi primitivi della
cavità sierosa (BCBL). Negli ultimi anni diversi studi epidemiologici hanno dimostrato una elevata incidenza di HHV-8 specialmente in alcune aree geografiche come la Sicilia, il nord della Sardegna e la valle del Po; alcuni ricercatori sostengono che
alcune malattie endemiche (per es. la malaria, la talassemia, la G6PD carenza ed altro) possano avere creato una popolazione
selezionata con una accresciuta sensibilità nei confronti di tale virus. In questo studio è stata valutata una possibile relazione tra
HHV-8 e diabete mellito di tipo 2 (DM2). A tale scopo è stata verificata la presenza del DNA di HHV-8 in 215 (108 maschi, 107
femmine) individui affetti da DM2 provenienti dal servizio di Diabetologia e Malattie metaboliche dell’Ospedale S.Giovanni di
Dio di Cagliari e, come controlli, 108 (83 maschi, 25 femmine) donatori di sangue del Servizio di Immunoematologia
dell’Ospedale Brotzu di Cagliari. Nei pazienti DM2 sono state verificate altre patologie correlate, quali ipertensione, infarto,
piede diabetico, retinopatia, ipercolesteremia, etc.; inoltre, per una più accurata analisi dei dati, tutti i campioni sono stati suddivisi per sesso ed in 4 classi di età: <40, 41-50, 51-60, >60. Sul DNA estratto dai linfociti isolati dal sangue periferico è stata
verificata la presenza di DNA di HHV-8 mediante nested PCR con 2 set di primers specifici per il gene orf26 e successiva conferma con southern-blot con sonda specifica. Sono risultati positivi per il DNA di HHV-8, 75 su 215 pazienti DM2 (35%) e 13
su 108 controlli (12%); la differenza di tali percentuali è risultata significativa (p<0,001), invece non si è avuta alcuna differenza significativa nelle percentuali riscontrate nei diversi sessi dei DM2 (DM2 maschi 36,1%, DM2 femmine 33,6%). Per
quanta riguarda i risultati ottenuti nelle diverse classi di età dei DM2, si è potuto notare che l’incidenza di HHV-8 era più elevata nella classe di età <40 (55,5%) e diminuiva progressivamente con l’aumentare dell’età con il 44,4%, 34,5% e 32,3% rispettivamente nelle classi 41-50, 51-60 e >60. L’unica patologia associata ai pazienti DM2 positivi per HHV-8, rispetto a quelli
negativi per tale virus, risultata statisticamente significativa è stata la retinopatia ipertensiva.
100
INDUZIONE DI ANTICORPI OMOLOGHI E CROSS-REATTIVI NEI CONFRONTI DI VIRUS
INFLUENZALI DI TIPO B DA PARTE DEL VACCINO INFLUENZALE NELL’INVERNO 2003/04
Iorio A.M., Camilloni B., Neri M., Lepri E.
*Dip. Sp. Med. Chir. e Sanità Pubblica, Università di Perugia
Particolare preoccupazione sta causando il sempre più frequente verificarsi della contemporanea circolazione nella stessa stagione invernale di virus influenzali di tipo B appartenenti a due lineaggi distinguibili sia dal punto di vista antigenico che
genetico (ceppi di riferimento: B/Victoria/2/87 e B/Yamagata/16/88). Nei vaccini influenzali in uso viene infatti incluso un
solo tipo di virus influenzale B, ed è quindi importante avere dati relativi alla capacità dei ceppi vaccinali B di indurre anticorpi di tipo omologo e cross-reattivi.
A tale fine nell’inverno 2003/04 è stata esaminata in due gruppi di soggetti, uno di età media (40 anni) e uno di età avanzata
(82 anni), la induzione di anticorpi inibenti la emoagglutinazione (IEA) da parte di un vaccino influenzale trivalente a subunità e adiuvato con MF-59 (Chiron/Novartis) nei confronti di differenti tipi di virus influenzali di tipo B. In particolare sono
stati utilizzati sia virus B del lineaggio B/Victoria (B/Hong Kong/330/1, ceppo vaccinale, e B/Malaysia/2506/04) sia del
lineaggio B/Yamagata (B/Sichuan/379/99 e B/Shangai/361/02), già in circolazione o non ancora in circolazione fra la popolazione al momento della vaccinazione.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che in tutti e due i gruppi esaminati erano presenti in fase pre-vaccinale anticorpi nei
confronti di tutti i virus di tipo B esaminati. I valori erano leggermente più elevati nei soggetti anziani rispetto a quelli di
media età. La somministrazione del vaccino ha indotto in tutti e due i gruppi incrementi significativi dei titoli anticorpali nei
confronti di tutti i virus B studiati, con risposte però più basse negli anziani rispetto ai soggetti di media età. Esaminando
infatti il parametro dell’incremento medio o “mean fold increase” (MFI) della media geometrica dei titoli anticorpali (MGT)
(rapporto fra valore MGT dopo e prima della vaccinazione) i valori riscontrati negli anziani sono risultati compresi nel range
1,7 e 1,9 e quelli nei volontari di età media nel range 2,1 e 3,3. Un andamento simile si è osservato anche considerando le
risposte positive (range nei soggetti anziani 11,0% e 14,3%, range nei soggetti di età media 23,1% e 38,5%).
In conclusione i risultati ottenuti indicano che la vaccinazione con un vaccino influenzale adiuvato con MF59 e contenente
come ceppo vaccinale B un virus B del lineaggio B/Victoria, è in grado di indurre significativi incrementi degli anticorpi IEA,
anche se a livelli diversi, sia in soggetti anziani che in soggetti di età media, nei confronti di un ampio numero di differenti
virus influenzali di tipo B, compresi anche virus del lineaggio B/Yamagata.
STUDIO COMPARATIVO DELL’INTERNALIZZAZIONE DI UNO STIPITE UMANO DI VIRUS
INFLUENZA A (NWS/33) IN DUE MODELLI CELLULARI DI MAMMIFERO IN VITRO
De Conto Floraa, Covan Silviaa, Arcangeletti M.Cristinaa, Gatti Ritab, Orlandini Guidob, Dettori Giuseppea, Chezzi Carloa.
b Sezione di Istologia ed Embriologia Generale. Dipartimento di Medicina Sperimentale. Università degli Studi di Parma.
Le modalità d’ingresso dei virus influenzali nella cellula ospite sono state in buona parte caratterizzate da un punto di vista biochimico e molecolare, ma diversi aspetti riguardanti il ruolo svolto da specifici elementi cellulari nell’ambito di questa fase cruciale del ciclo replicativo virale rimangono ancora sconosciuti.
La ricerca intrapresa si è focalizzata sull’internalizzazione di uno stipite umano di virus influenza A (NWS/33) in due linee cellulari di mammifero in vitro: MDCK (rene di cane) e LLC-MK2 (rene di scimmia). Le cellule MDCK costituiscono un modello permissivo per tale virus, mentre in LLC-MK2 l’infezione è caratterizzata da una più bassa efficienza. Nello studio sono state
impiegate sostanze in grado di inibire l’endocitosi in vescicole rivestite da clatrina (cloropromazina, CPZ), l’endocitosi mediata da caveolae (nistatina, NYS) e la macropinocitosi (5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride, EIPA). In cellule LLC-MK2 si è osservato che le sostanze CPZ e NYS non solo non impediscono l’ingresso del virus, ma addirittura promuovono l’espressione della
nucleoproteina virale e l’emergenza di progenie virale, a differenza di EIPA che invece ne ostacola l’internalizzazione. Al contrario, nel modello MDCK, CPZ ha un forte effetto inibitorio sulla fase d’ingresso del virus, mentre NYS ed EIPA sono sostanzialmente ininfluenti su tale processo.
I dati ottenuti depongono per l’esistenza di vie alternative d’ingresso utilizzate dal virus NWS/33 dipendentemente dall’ospite
cellulare. In particolare, mentre in cellule MDCK l’internalizzazione del virus avviene classicamente mediante endocitosi in
vescicole rivestite di clatrina, sembra invece verosimile che in cellule LLC-MK2 il suo ingresso sia facilitato qualora avvenga
attraverso macropinocitosi. Inoltre, il ripristino della produttività dell’infezione osservato nel suddetto modello di scimmia
mediante l’uso di inibitori dell’endocitosi in vescicole rivestite di clatrina o in caveolae, depone per una sorta di azione di sequestro del virus nelle suddette strutture cellulari, che non verrebbero utilizzate o dalle quali il virus verrebbe rilasciato in presenza di inibitori, favorendo di conseguenza l’evoluzione del ciclo di replicazione virale.
101
INFEZIONI NEONATALI DA GBS: RISULTATI DI UNO STUDIO PILOTA IN EMILIA ROMAGNA
R. Creti 1, A. Berardi 2, G. Gherardi 3, M. Imperi 1, L. Baldassarri 1, M. Pataracchia 1, G. Orefici 1.
1 Dip. MIPI, ISS, Roma; 2 Un. Modena e Reggio Emilia; 3 Un. Campus Bio-Medico, Roma.
Lo Streptococco di gruppo B (GBS) è tra le cause principali di infezioni neonatali. La malattia si presenta in due forme: la prima
è rappresentata da una sindrome polmonare acuta entro i primi 2-3 giorni dalla nascita (early onset disease, EOD) che può
accompagnarsi a sepsi o meningite con un’elevata letalità (oltre il 50%); la seconda, (late onset disease, LOD) si manifesta con
meningite purulenta che insorge entro tre mesi con una letalità più bassa (30%) ma con gravi reliquati neurologici.
In Italia non sono mai stati effettuati studi di prevalenza, né una valutazione dei sierotipi causa di infezioni e delle loro caratteristiche a livello nazionale. Negli ultimi tre anni, in Emilia-Romagna, dove le linee guida del CDC riguardo screening microbiologico (ricerca di GBS nei tamponi genito-rettali alla 35-37a settimana di gestazione) e profilassi (ampicillina durante il parto
per le donne portatrici e/o in presenza di fattori di rischio) vengono praticati con accuratezza, si è osservata un’incidenza di 0.5
per mille nati vivi, in linea con i valori riportati in altri paesi europei.
La collaborazione su GBS tra ISS e GdL - Emilia Romagna ha permesso la caratterizzazione dei sierotipi, fattori di virulenza,
clonalità e resistenza ai macrolidi di 25 ceppi responsabili di EOD e 29 di LOD isolati da Febbraio ‘05 a Maggio ‘07.
Il sierotipo III, associato alla proteina di superficie Rib, è stato quello più frequentemente isolato (39 ceppi) e responsabile
dell’89.6% e del 60% delle LOD e EOD, rispettivamente. I ceppi appartenevano quasi esclusivamente allo stesso pulsotipo e
Sequence Type 17, già descritto come il clone maggiormente responsabile delle infezioni neonatali nel mondo. Altri cloni minori appartenevano ai sierotipi V, Ia, Ib, II. Solo 2 ceppi erano costitutivamente resistenti sia a eritromicina che clindamicina ed
uno solo ad eritromicina.
Sono stati accertati sia un episodio di epidemia nosocomiale che l’isolamento dello stesso clone da quattro coppie madre-bimbo
per cui è stato possibile avere campioni di tamponi vaginali e latte materno.
I risultati ottenuti da questo studio pilota ha posto le basi per l’avvio di un programma di Sorveglianza Nazionale della Malattia
Invasiva Neonatale da GBS di durata biennale, coordinato dall’ISS e finanziato dal Centro Nazionale per la Prevenzione e il
Controllo delle Malattie, che coinvolge, oltre alla rete romagnola, neonatologi, pediatri e microbiologi di altri 10 ospedali su territorio nazionale.
PERSISTENZA DI GENOTIPI SIMILI DI ASPERGILLUS FUMIGATUS IN UN REPARTO EMATOLOGICO OSPEDALIERO
Cavallo M.1, Gindro R.1, Rinaldi M.1, Andreoni S.2, Martinotti M.G.1
1DiSCAFF, Università degli Studi del Piemonte Orientale “A. Avogadro” (Novara)
2Azienda Ospedaliera “Maggiore della Carità” (Novara)
Aspergillus fumigatus è un micete saprofita presente in natura nell’acqua, nel suolo e in materiali vegetali in via di decomposizione, responsabile di allergie, aspergillomi e di aspergillosi invasive. Le ridotte dimensioni delle spore, la loro alta concentrazione nell’aria e le scarse esigenze nutrizionali hanno reso questa specie fungina particolarmente pericolosa in reparti ospedalieri ospitanti pazienti immunodepressi a causa di possibili relazioni con aspergillosi delle vie aeree profonde molto spesso letali. Una relazione tra la contaminazione ambientale e l’incidenza di aspergillosi invasiva in pazienti ematologici è stata dimostrata anche in situazioni non epidemiche. Dal luglio 2004 al novembre 2005, 1211 isolati di A. fumigatus sono stati collezionati effettuando campionamenti dell’aria presso il reparto di Clinica Medica Generale dell’Ospedale “Maggiore della Carità” di
Novara. Tra questi, 205 sono stati scelti e genotipizzati mediante RAPD-PCR, al fine di valutare una eventuale persistenza di
stipiti geneticamente correlabili e di individuare potenziali sorgenti di contaminazione aspergillare. L’analisi RAPD ha evidenziato la presenza di 184 genotipi diversi: 168 osservati una sola volta, 12 due volte, 3 tre volte e 1 quattro volte. Genotipi uguali sono stati osservati a distanza di mesi nella stessa stanza, nel relativo bagno o in entrambi così come nelle stanze e nel corridoio del reparto. La stanza nella quale uno stesso genotipo si è ripresentato più volte è risultata anche quella che ha evidenziato la maggior presenza di genotipi osservati una sola volta. In due casi è stata rilevata la presenza di ceppi con uguali profili
genetici sia nel controllo esterno che nel corridoio del reparto. Nell’insieme, i risultati evidenziano la presenza nel reparto di
sorgenti multiple di A. fumigatus. Nelle aree dove la persistenza degli stessi ceppi è maggiore si potrebbe ipotizzare la presenza di sorgenti localizzate (es. bagno). In conclusione la RAPD-PCR può rappresentare un utile strumento per monitorare la persistenza nel tempo di ceppi di A. fumigatus al fine di attuare misure preventive per ridurre sia la contaminazione ambientale che
il rischio di infezioni in pazienti immunodepressi.
Lavoro eseguito con fondi “Progetto di Ricerca Sanitaria Finalizzata e Applicata 2003” della Regione Piemonte.
102
ATTIVITÀ IN VITRO DI ANIDULAFUNGINA, CASPOFUNGINA, VORICONAZOLO, ITRACONAZOLO E FLUCONAZOLO NEI CONFRONTI DI ISOLATI CLINICI DI CANDIDA SPP.
Milici M.E1., Maida C.M.1, Farinella V.1, Pizzillo P.1, Oliveri S.2
1 Dipartimento di Igiene e Microbiologia – Università di Palermo
2 Dipartimento di Scienze Ginecologiche e Microbiologiche - Università di Catania
Ad oggi, i farmaci maggiormente impiegati per il trattamento delle infezioni fungine sistemiche sono stati l’Amfotericina B ed
i derivati imidazolici. Tossicità ed aumento delle resistenze hanno reso necessario lo sviluppo di nuove molecole da utilizzare
nelle terapie antifungine, quali le echinocandine. Scopo del presente studio è stato quello di valutare l’attività in vitro di
Anidulafungina (AND), Caspofungina (CAS), nuove echinocandine recentemente approvate per il trattamento di micosi sistemiche, e di Voriconazolo (VOR), Itraconazolo (ITZ) e Fluconazolo (FLC) nei confronti di 110 isolati clinici di Candida spp.,
provenienti da pazienti con micosi profonde, così distribuiti: Candida albicans (80 isolati), C. tropicalis (11), C. parapsilosis
(8), C. glabrata (7), C. krusei (2), C. guilliermondii (2). I saggi in vitro sono stati effettuati con metodica di riferimento, secondo le indicazioni del documento M27-A2 del CLSI, le letture effettuate dopo 48h di incubazione per i derivati imidazolici, dopo
24h per le echinocandine e le MIC90 e MIC50, rispettivamente determinate. I range ottenuti per AND per tutte le specie sag-
giate sono stati compresi tra ≤ 0.03 e 1 µg/ml (A.M. 0.07 µg/ml, 50% ≤ 0.03 µg/ml per C. albicans; A.M. 0.125 µg/ml, 50% ≤
0.03 µg/ml per le altre specie). Per CAS, range compresi tra ≤ 0.03 e 2 µg/ml per tutte le specie e medie di 0.27 µg/ml per C.
albicans e di 0.86 µg/ml (50% 0.5 µg/ml) per tutte le altre specie. Il VOR ha mostrato MICs comprese tra ≤ 0.03 e ≥ 16 µg/ml
per tutti i lieviti, medie di 2.07 µg/ml (50% ≤ 0.03 µg/ml) per C. albicans e di 2.74 µg/ml per le specie diverse. Anche ITZ ha
mostrato range compresi tra ≤ 0.03 e ≥ 16 µg/ml per tutti i microrganismi saggiati e medie di 5.55 µg/ml per C. albicans e di
11.44 µg/ml (50% ≥ 16 µg/ml) per specie diverse dalla albicans. Infine, il FLC ha mostrato range compresi tra ≤ 0.125 e ≥ 64
µg/ml, con medie di 12.1 e 37.35 µg/ml per C. albicans e non albicans, rispettivamente. Inoltre, dei sette ceppi di C. albicans
FLC-resistenti inclusi nello studio (MICs vs FLC ≥ 64 µg/ml), tre sono risultati resistenti a ITZ e VOR (MICs ≥ 16 µg/ml) mentre nessuno ha mostrato resistenze nei confronti delle echinocandine saggiate (MICs ≤ 0.5 µg/ml). I risultati ottenuti in vitro suggeriscono che l’AND potrebbe essere considerato un ottimo farmaco per il trattamento terapeutico di micosi sistemiche.
VALUTAZIONE DELLA RESISTENZA A RIFAMPICINA ED ISONIAZIDE IN ISOLATI CLINICI DI
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Platia M.A., Bonura C., Immordino R., Pitarresi G.L., Distefano S., Vella A., Giammanco A.
Dipartimento di Igiene e Microbiologia “G. D’Alessandro”, Università degli Studi di Palermo.
La diffusione di ceppi di Mycobacterium tuberculosis farmacoresistenti rende necessaria, per la scelta di una terapia efficace, la
determinazione della sensibilità ai chemioterapici degli isolati clinici. I metodi molecolari vengono sempre più frequentemente
applicati a questo scopo anche per la rapidità di risposta e per la possibilità di rivelare modificazioni genetiche non necessariamente correlate ad espressione fenotipica della resistenza farmacologica. Tra essi, il sequenziamento nucleotidico dei geni codificanti le proteine implicate nel meccanismo di azione di un antibiotico è certamente il metodo più diffusamente utilizzato.
Recenti studi hanno dimostrato che la resistenza farmacologica di un ceppo di Mycobacterium tuberculosis è causata dall’insorgenza di mutazioni in regioni specifiche del genoma. Tuttavia, mentre le mutazioni associate alla resistenza alla rifampicina
ricadono nell’unico gene rpoB, quelle associate alla resistenza all’isoniazide possono interessare più geni, essendo numerosi i
geni coinvolti nel complesso sistema implicato in questo tipo di resistenza, tra cui i geni katG, inhA, ahpC, kasA, furA, iniA,
iniB, iniC, la regione intergenica oxyR-ahpC e la regione regolativa a monte dell’operone mabA-inhA.
L’obiettivo della nostra indagine è stato quello di valutare la resisenza farmacologica in 49 ceppi di Mycobacterium tuberculosis isolati nel nostro laboratorio. Per l’isolamento, la coltivazione dei ceppi e l’esecuzione del test fenotipico di sensibilità ai farmaci antimicobatterici abbiamo utilizzato il terreno liquido BD BBL MGIT (Becton Dickinson). Per la caratterizzazione molecolare abbiamo utilizzato il sequenziamento nucleotidico del gene rpoB, nel caso del rilevamento di eventuali mutazioni correlabili con la resistenza alla rifampicina, mentre, nel caso del rilevamento della resistenza all’isoniazide, almeno in questa fase
iniziale, abbiamo studiato mediante sequenziamento i geni katG e ahpC, la regione intergenica oxyR-ahpC e la regione regolativa a monte dell’operone mabA-inhA.
Complessivamente nove ceppi sono risultati fenotipicamente resistenti all’isoniazide, e di questi 8 presentano una mutazione
nella sequenza codificante del gene katG ed 1 nella regione regolativa a monte dell’operone mabA-inhA. Tre ceppi presentano
una mutazione nella sequenza codificante del gene rpoB, ma solo due esibiscono resistenza fenotipica alla rifampicina.
103
IDENTIFICAZIONE E DIFFERENZIAZIONE DELLE SPECIE DEL GENERE STAPHYLOCOCCUS (S.) MEDIANTE ANALISI DEL GENE CHE CODIFICA PER LA CATALASE (katA).
Giuseppe Blaiotta, Vincenzina Fusco, Danilo Ercolini, Olimpia Pepe & Salvatore Coppola.
Dipartimento di Scienza degli Alimenti, Università degli Studi di Napoli Federico II, Portici (NA).
Gli stafilococchi sono un gruppo di microrganismi largamente diffusi in natura, con specie patogene e specie in grado di svolgere un ruolo positivo nella produzione di alcuni alimenti fermentati. Tuttavia, molte specie, grazie alla loro costante ricorrenza nel mondo animale (uomo e animali domestici), alla loro capacità di colonizzare diversi tipi di substrati con la formazione di
biofilm protettivi, possono comportarsi da patogeni opportunisti. Infatti, recenti studi hanno messo in evidenza la potenziale
patogenicità di alcune specie coagulasi negative (patogeni emergenti). Pertanto, l’identificazione, in maniera rapida ed accurata, delle specie batteriche appartenenti al genere Staphylococcus rappresenta un’esigenza di fondamentale importanza in diversi campi della microbiologia (clinica, veterinaria ed alimentare). Attualmente, al genere Staphylococcus sono ascritte 50 specie
e sottospecie alcune delle quali descritte solo recentemente (www.bacterio.cict.fr). Studi condotti in passato hanno ampiamente
dimostrato l’inadeguatezza dei metodi tradizionali di identificazione di questo gruppo di microrganismi. L’applicazione dei
metodi molecolari di identificazione dei microrganismi ha apportato numerosi vantaggi in questo senso: maggiore accuratezza,
rapidità e bassi costi.
In questo studio il polimorfismo interspecifico del gene katA è stato valutato allo scopo di verificare la possibilità di una sua
applicazione come marker molecolare per l’identificazione e differenziazione delle specie del genere Staphylococcus. Un set di
primer degenerati, disegnati sulla base di sequenze katA gia disponibili (5 specie) su pubblici data-base, è stato impiegato per
amplificare e sequenziare una regione interna al gene katA di 43 nuovi ceppi di Staphylococcus spp.. In totale 60 sequenze katA,
rappresentanti di 25 specie del genere Staphylococcus, sono state analizzate. Un buon polimorfismo interspecifico (maggiore
del 4%) è stato rilevato mediante cluster analysis delle sequenze analizzate. L’analisi di restrizione con le endonucleasi di restrizione Cfo I, Alu I e Taq I del prodotto PCR da noi ottenuto evidenziava la possibilità di una rapida differenziazione dei ceppi
sia a livello di specie che di sottospecie. Questi risultati candidano il gene katA a ottimo marker molecolare per l’identificazione e la differenziazione delle specie del genere Staphylococcus.
EPARINA SODICA STIMOLA LA FORMAZIONE DI BIOFILM DA PARTE DI PROVIDENCIA STUARTII
G. Di Bonaventura1, C. Picciani1, A. Pompilio1, D. D’Antonio2, R. Piccolomini1
1Dip. Scienze Biomediche, Università “G. D’Annunzio”, Chieti; 2Dip. Ematologia e Oncologia, Ospedale Civile “Spirito
Santo”, Pescara.
Background: Eparina è un glicosaminoglicano eterogeneo comunemente utilizzato, per la sua attività anticoagulante, nel lock
del catetere. Providencia stuartii è un patogeno emergente isolato principalmente dalle vie urinarie di pazienti ospedalizzati, sebbene sia in grado di causare anche batteremie primarie e/o secondarie. In presenza di catetere, P. stuartii è in grado di colonizzarlo organizzandosi come biofilm. Scopo: Considerato il diffuso utilizzo di eparina nella gestione dei cateteri, abbiamo ritenuto interessante valutare se questo polisaccaride è in grado di modulare la formazione di biofilm da parte di P. stuartii su superfici abiotiche. Materiali e Metodi: Un ceppo di P. stuartii isolato dal sangue di un paziente neutropenico portatore di catetere
vascolare è stato considerato nel presente studio. Una sospensione OD550=0.5 è stata preparata in tryptic soy broth (TSB) oppure in TSB contenente differenti concentrazioni di eparina sodica (range: 0,01–1.000 UI). L’inoculo veniva quindi seminato nei
pozzetti di una microtiter in polistirene TC-treated. Dopo 24 h di incubazione a 37°C il biofilm veniva lavato in PBS e colorato con cristalvioletto. La quantità di biofilm prodotta è stata determinata misurando la OD490 del colorante estratto mediante
acido acetico glaciale 33%. Poiché la formulazione di eparina testata (VISTER; Marvecspharma Services) conteneva clorocresolo, eccipiente dotato di attività antibatterica, la quantità di biofilm prodotta è stata così normalizzata:
biofilmN=biofilm(OD490)/planktonic growth(OD550). La significatività statistica (P<0.05) è stata rilevata mediante ANOVAtest + Dunnett’s multiple comparison post-test. Risultati: P. stuartii è in grado di produrre biofilm su polistirene in TSB
(biofilmN=0,170±0,016). In presenza di eparina si osserva sempre un incremento del biofilm prodotto (range ratio vs ctrl: 1,43,5). L’effetto è dose-dipendente, sebbene in presenza di eparina 0.01 UI e 10 UI la quantità di biofilm non è statisticamente
maggiore rispetto al controllo. Eparina non ha alcun effetto sulla crescita di P. stuartii, indipendentemente dalla concentrazione
testata, suggerendo che l’incremento nel biofilm prodotto non deriva da un’aumentata velocità di crescita. Conclusioni: I nostri
risultati, seppur preliminari, dimostrano per la prima volta che la produzione di biofilm da parte di P. stuartii su superfici plastiche viene stimolata da eparina sodica a concentrazioni clinicamente rilevanti. Poiché numerosi patogeni utilizzano l’eparina
ed altri glicosaminoglicani della matrice extracellulare per aderire ed invadere le cellule dell’ospite, è probabile che l’induzione nella formazione biofilm sia espressione dell’adattamento di P. stuartii all’ospite. Ulteriori studi sono necessari per verificare se eparina, stimolando la produzione di biofilm, è in grado di favorire infezioni batteriche persistenti.
104
INTERAZIONE IN VITRO TRA STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA E CELLULE EPITELIALI
BRONCHIALI IB3-1: IMPLICAZIONI IN FIBROSI CISTICA
G. Di Bonaventura1, A. Pompilio1, E. D’Addetta1, C. Picciani1, M. Nicoletti1, B. Colonna2, R. Zappacosta3, M. Liberatore4,
M. Iezzi4, R. Piccolomini1.
1Dip. Scienze Biomediche, 3Dip. Oncologia e Neuroscienze, 4Centro Scienze Invecchiamento, Università “G. D’Annunzio”,
Chieti. 2 Dip. Biologia Cellulare e Sviluppo, Università “La Sapienza”, Roma.
Background: Stenotrophomonas maltophilia viene frequentemente isolato dalle vie respiratorie dei pazienti affetti da fibrosi cistica (FC).
Tuttavia, il contributo del microrganismo alla fisiopatologia della malattia polmonare nella FC non è stato ancora chiarito. Sebbene S. maltophilia sia in grado di aderire a superfici plastiche formando biofilms – consorzi cellulari in grado di eludere sia la risposta immune dell’ospite che la terapia antibiotica - a tutt’oggi non è stata dimostrata la formazione di biofilm sugli epiteli respiratori di soggetti FC. Scopo: Studiare
l’interazione tra S. maltophilia e l’epitelio bronchiale in un paziente FC. Materiali e Metodi: Sono stati considerati 12 ceppi di S. maltophilia isolati dall’espettorato di pazienti FC. Monostrati di cellule epiteliali bronchiali immortalizzate isolate da paziente pediatrico FC (IB3-1;
ATCC CRL-2777) sono stati preparati in chamber-slides ed infettati con S. maltophilia 108 CFU/ml (MOI: 1.000). Dopo 2h di incubazione
(37°C, 5% CO2), il livello di adesione batterica è stato valutato mediante conta vitale. E’ stato inoltre studiato il ruolo svolto dai flagelli nell’adesione mediante: i) saggi di motilità batterica (swimming, twitching); ii) impiego di 2 isolati clinici fliI- (aflagellati). La significatività statistica (P<0.05) è stata rilevata mediante ANOVA-test + Neumann-Keuls post-test. Risultati: Tutti gli isolati testati colonizzano l’epitelio
bronchiale, sebbene il grado di adesione sia ceppo-specifico (range: 1.8x105-7.5x106 cfu/chamber; media±DS: 2.1x106±1.7x106 cfu/chamber). In particolare, gli isolati TC9 e TC10 (responsabili di infezioni monomicrobiche e persistenti) mostrano un livello di adesione (5.6x106
vs 5.0x106 rispettivamente; P>0.05) significativamente maggiore rispetto agli altri ceppi testati. L’analisi microscopica evidenzia la formazione di clusters di cellule batteriche (microcolonie) di rilevanti dimensioni, suggestivi per la formazione di biofilm. Il grado di adesione non
correla con la motilità flagellare. Di contro, i ceppi fliI- hanno mostrato un grado di adesione significativamente (P<0.001) minore rispetto ai
relativi wild-types (TC9: 2.5x106 vs 5.6x106, fliI- vs wt; TC10: 1.7x106 vs 5.0x106, fliI- vs wt). Conclusioni: I nostri risultati dimostrano,
per la prima volta, che S. maltophilia è in grado di colonizzare l’epitelio bronchiale di pazienti FC mediante le strutture flagellari che fungono da adesine. La capacità esibita da S. maltophilia di organizzarsi sull’epitelio respiratorio sottoforma di biofilms potrebbe avere particolare
rilevanza per la refrattarietà alla terapia antibiotica e, quindi, per la persistenza dell’infezione nel paziente FC.
Progetto finanziato in parte dalla Fondazione per la Ricerca sulla Fibrosi Cistica (FFC# 7/2005 con l’adozione della famiglia
Pizzinato e FFC# 7/2007)
EFFICACIA DI OLI ESSENZIALI IN AMBIENTE ACIDO SU BIOFILM PRODOTTO DA S. AUREUS E
S. EPIDERMIDIS
A. Nostro1, L. Cellini2, M. Di Giulio2, A.R. Blanco3, A. Marino1, G. Bisignano1.
1Dipartimento Farmaco-Biologico. Università degli Studi di Messina
2Dipartimento di Scienze Biomediche. Università “G. D’Annunzio” Chieti-Pescara
3 SIFI S.p.A, Catania
Negli ultimi anni sono stati condotti importanti studi che avvalorano il ruolo chiave del biofilm nella patogenesi delle infezioni
e testimoniano la scarsa efficacia dei comuni chemioterapici. In tale contesto, diviene sempre più necessaria l’individuazione di
agenti antimicrobici attivi nei confronti di microrganismi sia in forma planctonica che in forma sessile. Sulla base di nostri precedenti risultati che riportano l’attività inibente di oli essenziali su comunità sessili di Stafilococchi, scopo del presente studio
è stato quello di valutare l’influenza della variazione di pH sull’attività antibiofilm di aldeide cinnamica, carvacrolo, citronellolo, eugenolo nei confronti di due forti produttori di slime: Staphylococcus aureus 815 e Staphylococcus epidermidis ATCC
35984. Gli effetti degli oli sono stati rilevati sia come inibizione della capacità di aderire e produrre biofilm, mediante valutazione della biomassa adesa su micropiastre in polistirene, sia come efficacia sul biofilm preformato su supporti permeabili in
poliestere (Transwell), mediante computo degli elementi vitali sopravvissuti ai diversi trattamenti e mediante studi ultrastrutturali della morfologia.
I risultati evidenziano, a pH neutro, una differente attività degli oli essenziali nei confronti di S. aureus e S. epidermidis. Infatti,
concentrazioni subinibenti degli oli risultano marcatamente efficaci nel ridurre la formazione del biofilm (inibizione ≥70%
rispetto al controllo) in S. aureus e scarsamente attivi nei confronti di S. epidermidis. Solamente carvacrolo e citronellolo a dosi
pari a 1/2 MIC determinano una riduzione della biomassa formata dal 10 al 40%. Condizioni acidiche (pH 5.5) influenzano la
produzione di biofilm in entrambe le specie batteriche potenziando l’efficacia degli oli essenziali, in maniera particolare nei confronti di S. epidermidis.
Trattamenti con carvacrolo (0,5% v/v) in ambiente acido incrementano nettamente anche l’attività sul biofilm preformato. A
partire dalla terza ora di esposizione si registra una riduzione delle UFC ≥ 4 unità logaritmiche rispetto all’inoculo iniziale. Le
immagini in microscopia elettronica a scansione (SEM) evidenziano la presenza di un biofilm fortemente disorganizzato e disgregato. L’ambiente acido, quindi, potrebbe agire sulle molecole alterandone la solubilità e la diffusibilità e/o sulla membrana
cellulare modificandone la permeabilità.
105
COINVOLGIMENTO DEL RECETTORE HVEM NELL’ATTIVAZIONE DI NF-kB DA PARTE DELLA
GLICOPROTEINA D DI HSV-1
Maria Teresa Sciortino1, Maria Antonietta Medici1, Francesca Marino-Merlo1, Daniela Zaccaria1,
Cuculletto1, Assunta Venuti1, Sandro Grelli2, Antonio Mastino1
Maria Giuffrè-
1Dipartimento di Scienze Microbiologiche, Genetiche e Molecolari, Università di Messina, Messina.
2Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Roma “Tor Vergata”, Roma.
Abbiamo precedentemente dimostrato che la glicoproteina D (gD) di HSV-1 induce l’attivazione del fattore nucleare kB (NFkB) in cellule monocitoidi U937, ma i meccanismi coinvolti in tale attivazione non erano stati definiti. D’altra parte, dati da
noi recentemente pubblicati indicano come il recettore cellulare HVEM/HveA possa essere coinvolto in tale attivazione. Per
avere ulteriori informazioni sul coinvolgimento del recettore HVEM nell’attivazione di NF-kB da parte di gD di HSV-1, dopo
aver clonato il cDNA per HVEM e costruito un vettore per la sua espressione in cellule eucariote, abbiamo generato dei trasfettanti esprimenti HVEM sulla superficie cellulare a partire da cellule cellule CHO, naturalmente resistenti all’infezione da HSV1, che non mostravano livelli rilevabili di tale recettore sulla membrana. Qui riportiamo che: a) l’esposizione ad HSV-1 inattivato agli UV induceva un’attivazione MOI-dipendente di NF-kB in cellule monocitoidi U937 e THP-1, in assenza di neoespressione di proteine virali; b) l’esposizione ad HSV-1 inattivato agli UV non induceva l’attivazione di NF-kB in cellule
CHO trasfettate con il vettore vuoto, non esprimenti il recettore HVEM sulla loro superficie; c) l’espressione di HVEM sulla
superficie cellulare, indotta mediante trasfezione stabile in cellule CHO, rendeva tali cellule sensibili all’attivazione di NF-kB
dopo esposizione ad HSV-1 inattivato agli UV; d) l’esposizione ad una forma solubile ricombinante di HSV-1 induceva un’attivazione tempo e dose dipendente di NF-kB in cellule CHO trasfettanti esprimenti HVEM, ma non in cellule CHO trasfettate
con il vettore vuoto; e) un anticorpo monoclonale che preveniva il legame di gD ad HVEM riduceva l’attivazione di NF-kB da
parte di gD di HSV-1 in cellule esprimenti HVEM. Questi ed altri risultati stabiliscono che il recettore HVEM è coinvolto nell’attivazione di NF-kB da parte di gD di HSV-1.
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI RARI CEPPI DI ROTAVIRUS CON SPECIFICITÀ G3P[9]
IN BAMBINI OSPEDALIZZATI A PALERMO CON GASTROENTERITE.
De Grazia S., Giammanco G.M., Ramirez S., Aiello P., Colomba C., Arista S.
Dipartimento di Igiene e Microbiologia, Università di Palermo
I rotavirus di gruppo A sono importanti patogeni enterici dell’uomo e degli animali. I rotavirus esibiscono, usualmente una restrizione d’ospite, sebbene siano stati descritti eventi di trasmissione interspecie e riassortimento genico tra virus umani ed animali. L’analisi di sequenza dei geni codificanti per le due proteine del capside esterno VP7 e VP4, per la proteine del capside interno VP6 e per la proteina non strutturale NSP4 è utile per stabilire l’origine di ceppi di rotavirus e per valutare la loro evoluzione. Attualmente sono stati descritti in natura: 15 genotipi G (G1-G15) in base a VP7, 27 genotipi P (P[1]-P[27]) in base a VP4,
4 sottogruppi (SGI I, II, I+II e nonI/nonII) in base a VP6 e 5 genotipi (A-E) in base a NSP4. I rotavirus umani esibiscono, in
genere, genotipi G1-G4 e G9 in associazione con P[8], SGII e NSP4B mentre i rotavirus G2 sono associati a P[4], SGI e NSP4A.
Sono stati sporadicamente descritti episodi di infezioni in bambini ed animali attribuibili a ceppi di rotavirus con inusuali associazioni genotipiche.
Durante uno studio epidemiologico retrospettivo, sulla circolazione dei rotavirus a Palermo dal 1985 al 2005, sono stati identificati tre ceppi (PAF96/94, PAH136/96 e PAI58/96) con specificità G3P[9] in campioni fecali di bambini ospedalizzati con
gastroenterite acuta presso l’Ospedale dei Bambini “G. di Cristina”. Tali ceppi sono stati sottoposti ad amplificazione genica
(RT-PCR) ed analisi di sequenza dei geni codificanti per le proteine VP7, VP4, VP6 ed NSP4 al fine di acquisire informazioni
inerenti l’origine di tali ceppi.
L’analisi di sequenza ha confermato la specificità G3P[9] dei ceppi palermitani e ha rivelato una elevata omologia con il ceppo
di riferimento AU-1. Tuttavia, una più stretta correlazione è stata osservata tra i ceppi PAF96/94, PAH136/96 e PAI58/96 e ceppi
di rotavirus G3P[9] isolati in USA nel 1997-1999 e in Tailandia nel 2004. L’analisi di sequenza di NSP4 ha mostrato che i ceppi
palermitani esibiscono un genotipo B, diversamente da tutti gli altri ceppi AU-like finora descritti, probabilmente attribuibile ad
eventi di riassortimento genico.
I risultati ottenuti confermano la rapida evoluzione dei rotavirus e sono utili ai fini del monitoraggio epidemiologico e per l’applicazione di idonee misure vaccinali.
106
INTERAZIONE TRA SPORE DI BACILLUS SUBTILIS E MACROFAGI UMANI
Mara Ceragioli1, Giuseppina Cangiano2, Emilia Ghelardi1, Ezio Ricca2, Sonia Senesi3
1Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia e 3Dipartimento di Biologia,
Università di Pisa; 2Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, Università Federico II, Napoli.
Le spore di Bacillus subtilis si trovano comunemente nel tratto gastrointestinale (GIT) degli animali, dove si verifica il completo
ciclo vitale del microrganismo: le spore, in seguito a germinazione nel piccolo intestino, vanno incontro ad alcuni cicli di replicazione, a cui segue una nuova fase di sporificazione. Recenti studi, in modelli animali, hanno dimostrato che la presenza di
questo microrganismo nell’intestino contribuisce allo sviluppo del tessuto linfoide associato a tale distretto e che la somministrazione di spore di B. subtilis, ricombinanti per il frammento C della tossina tetanica (TTFC), inducono l’attivazione di una
forte risposta immunitaria nei confronti dell’antigene eterologo (1).
Allo scopo di approfondire le conoscenze sulle interazioni tra spore e cellule del sistema immunitario, nel presente lavoro, sono
stati effettuati esperimenti di co-coltivazione di macrofagi umani e spore ricombinanti di B. subtilis che presentano sulla loro
superficie il frammento C della tossina tetanica (TTFC) o la subunità B della tossina termolabile di Escherichia coli (LTB), in
associazione con le proteine delle tuniche CotB e CotC. L’efficienza di fagocitosi delle spore da parte dei macrofagi è stata calcolata come rapporto tra le spore internalizzate sul totale delle spore utilizzate per la co-coltivazione, mentre la cinetica di killing delle spore fagocitate è stata determinata contando il numero di CFU all’interno dei macrofagi a diversi tempi dal termine
della fagocitosi. I risultati ottenuti hanno indicato che le spore di B. subtilis ricombinanti vengono rapidamente fagocitate ed
uccise dai macrofagi umani. Mediante l’impiego di D-alanina e L-alanina, rispettivamente in grado di bloccare o stimolare la
germinazione delle spore, è stato inoltre dimostrato che solamente le spore germinate sono suscettibili al killing intra-macrofagico. La fusione del gene per la Green Fluorescent Protein (GFP) con il gene abrB, espresso da B. subtilis durante la crescita
vegetativa, ha permesso di mettere in evidenza che B. subtilis non è capace di andare incontro ad esocrescita all’interno dei
macrofagi. Mediante Trypan Blue Exclusion Test è stato, infine, dimostrato che le spore fagocitate non sono in grado di danneggiare i macrofagi umani.
Mauriello et al., Vaccine 2007, 25:788-793.
VALIDAZIONE DELLA BIOLUMINESCENZA: METODO RAPIDO DA APPLICARE AL CONTROLLO
DI QUALITÀ NEL SETTORE FARMACEUTICO OFTALMICO
Marino A., Sangiorgio G., *Rizza S., *Falzone D.,**Ceresa L., Bisignano G.
Dipartimento Farmaco-Biologico. Università degli Studi di Messina.
*SIFI SpA, Aci S. Antonio (Catania)
**Pall Life Sciences, Pall Italia, Buccinasco ( Milano )
Introduzione. Il controllo di qualità microbiologico rappresenta uno dei punti cardine del processo di produzione di un prodotto farmaceutico. I metodi microbiologici tradizionali descritti nella Farmacopea Europea, pur essendo generalmente economici,
a causa dei lunghi tempi di risposta risultano sempre più inadeguati alle esigenze del settore farmaceutico. E’ormai evidente per
l’industria la necessità di ricercare metodologie che consentano di valutare, in tempi rapidi e in modo accurato, la presenza di
un’eventuale contaminazione microbica durante tutto il processo. Attualmente sono disponibili tecnologie alternative in grado
di fornire risposte accurate, sensibili, specifiche e soprattutto in “real time” o “close-to-real-time”. Questi metodi innovativi che
portano ad innegabili vantaggi sia sulla qualità e accuratezza dell’analisi sia sulla disponibilità rapida dei risultati, affinché possano essere applicati in routine, devono essere innanzitutto “validati”. Fra i nuovi metodi indicati, la tecnologia della bioluminescenza dell’ATP, ha già ottenuto dal punto di vista regolatorio l’approvazione come tecnica per il rilascio di alcuni prodotti
farmaceutici non-sterili (AAPS News Magazine, 2004; PDA Letter, 2004). Obiettivo. Studio di validazione della tecnologia
della bioluminescenza quale metodo rapido da affiancare ai metodi tradizionali per migliorare il controllo di qualità microbiologico dei prodotti oftalmici in bulk. Metodi. Conta microbica totale (Farmacopea Europea); Sistema di Microbiologia Rapida
Pallchek. Prodotto. Nettacin collirio monodose in bulk (SIFI SpA). Microrganismi recovery: P. aeruginosa ATCC 9027, S.
aureus ATCC 6538, C. albicans ATCC 10231, A. niger ATCC 16404, Bacillus spp. (wild strain). Risultati. I dati ottenuti dimostrano che la tecnologia della bioluminescenza in termini di precisione e sensibilità è equivalente ai metodi tradizionali di conta
su piastra, con l’utile vantaggio però, di ottenere risultati in tempi molto più brevi (24 ore) rispetto ai lunghi tempi di attesa dei
metodi tradizionali (5-7 giorni). Conclusioni. La tecnologia dell’ATP-bioluminescenza può essere considerata un metodo alternativo valido per l’ottimizzazione del rapporto costi-benefici del controllo di qualità al fine di ottenere una tempestiva verifica
del processo produttivo anche di prodotti particolarmente critici quali quelli oftalmici.
107
SOMMINISTRAZIONE INTRANASALE DI DNA CODIFICANTE ANTIGENI DI MYCOBACTERIUM
TUBERCOLOSIS MEDIANTE ESCHERICHIA COLI INVASIVO NON PATOGENO
A. Zumbo1, G. Delogu1, M. Sali1, R. Manganelli2 e G. Fadda1
1 Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore Roma
2 Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Scienze Biomediche, Università di Padova
Numerosi batteri invasivi come L. monocytogenes, S. typhimurium, Y. enterocolica sono stati utilizzati come sistema di delivery
di vaccini a DNA a livello mucosale. Per ridurre il rischio legato alla somministrazione di batteri vivi e assicurare un elevato
delivery di plasmide nelle cellule dell’ospite, sono stati sviluppati ceppi di E. coli invasivi ma incapaci di moltiplicarsi in vivo.
In questo studio abbiamo valutato la capacità di un ceppo di E. coli invasivo e non patogeno (BM2710) ed in grado di fungere
da sistema di delivery per vaccini a DNA, di indurre a seguito di una somministrazione intranasale, un attività protettiva contro
l’infezione da M. tuberculosis.
Topi C57BL/6 sono stati immunizzati con E. coli trasformati con due plasmidi replicativi codificanti per htpX o fbpA, due antigeni di M. tuberculosis, denominati pEC15 e pEC18. Lo stesso ceppo di E. coli è stato inoltre trasformato con un plasmide codificante per un multigene (pJWAg85b_ES6). Ulteriori gruppi di controllo sono rappresentati da topi infettati (gruppo Naive) e
infettati con BCG. L’immunizzazione intranasale è stata eseguita iniettando 30?l (1x108 CFU/topo) della sospensione batterica
nelle cavità nasali. Per il vaccino a DNA sono stati utilizzati 200?g di plasmide iniettati per via intramuscolare. I vaccini sono
stati somministrati al tempo 0, a 3 e a 6 settimane; a 10 settimane gli animali sono stati infettati per via aerogena con 500
CFU/topo M. tuberculosis Erdman. I polmoni e le milze sono stati asportati dopo 28 e 70 giorni dall’infezione per determinarne il numero di CFU.
Nel polmone e nella milza è stata rilevata una significativa riduzione delle CFU nei topi immunizzati con vaccini a DNA e con
il vaccino BCG. Inoltre, il ceppo di E. coli trasformato con pEC15 ha indotto una significativa riduzione nel polmone ma non
nella milza, mentre si è rivelata scarsa l’attività protettiva indotta dai ceppi di E. coli trasformati con pEC18 e pJWAg85B-ES6.
In questo studio abbiamo dimostrato per la prima volta che ceppi di E. coli invasivi e trasformati con vaccini a DNA sono in
grado di indurre nel modello murino una efficace risposta immunitaria tale da controllare in parte la crescita di M. tuberculosis.
Nonostante il livello di protezione dopo immunizzazione con E. coli sia risultato inferiore rispetto a quello indotto con la somministrazione del corrispondente vaccino a DNA, questi dati sono da considerare incoraggianti e tali da stimolare nuovi studi.
LA MORTALITÀ DI PAZIENTI CON FUNGEMIA È INFLUENZATA DALLA CAPACITÀ DEI CEPPI
DI CANDIDA DI PRODURRE BIOFILM
R. Porta,1 M. Tumbarello,2 T. Spanu1, B. Posteraro,1 E. M. Trecarichi,2 B. Fiori,1 M. La Sorda,1 R. Cauda,2 M. Sanguinetti1
e G. Fadda1
Istituti di Microbiologia1 e Malattie Infettive2, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma, Italia
Le infezioni nosocomiali del sangue sostenute da Candida sono tra le infezioni con i tassi più alti di mortalità. Nel nostro
Ospedale è stata condotta un’analisi retrospettiva di coorte per stimare i fattori di rischio per mortalità di pazienti con candidemia. Sono stati pertanto raccolti ed analizzati i dati clinico-epidemiologici di 294 pazienti con fungemia da Candida relativi ad
un periodo di 5 anni. La maggior parte dei pazienti (42.1% maschi; età media ± SD, 65 ± 12 anni) sono stati ammessi con una
diagnosi chirurgica (162 pazienti [55.1%]), erano portatori di catetere venoso centrale (213 [72.4%]), affetti da cancro (118
[40.1%] o diabete (58 [19.7%]. Centocinquantaquattro pazienti (52.3%) erano deceduti entro 30 giorni. Dei 294 pazienti, 168
(57.1%) sono stati infettati da Candida albicans, 64 (21.7%) da Candida parapsilosis, 28 (9.5%) da Candida tropicalis e 26
(8.8%) da Candida glabrata. Quando i ceppi di lievito sono stati saggiati per la capacità di formare biofilm, la produzione di
biofilm è stata maggiormente osservata nei ceppi di C. tropicalis (20 di 28 pazienti [71.4%]), seguiti da C. glabrata (6 di 26
[23.1%]), C. albicans (38 di 168 [22.6%]) e C. parapsilosis (14 di 64 [21.8%]). L’analisi multivariata ha permesso di identificare la terapia antifungina inadeguata, l’infezione con specie di Candida formanti biofilm e l’indice APACHE come predittori
indipendenti di mortalità. In conclusione, insieme con altri fattori ben stabiliti, la produzione di biofilm da parte di ceppi di
Candida è stata perciò associata con la mortalità più elevata dei pazienti con candidemia, probabilmente a causa della più difficile eradicazione del microrganismo dal sangue.
108
IMPORTANZA DEL SEQUENZIAMENTO GENICO DI HIV IN SOGGETTI SOTTO TRATTAMENTO
ANTIRETROVIRALE CON BASSI LIVELLI PLASMATICI DI HIV- RNA.
R. Santangelo1, S. Marchetti1, A. Di Franco, M. Sali, L. Bracciale2, M. Colafigli2, S. Di Giambenedetto2, A. De Luca2,
P. Cattani1, G. Fadda1.
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
2Istituto di Clinica delle Malattie Infettive, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Da diversi anni l’utilizzo di farmaci antiretrovirali, ha permesso di inibire la replicazione virale, diminuendo la mortalità dei
pazienti affetti da HIV. Nella pratica clinica le metodiche per la quantizzazione della carica virale nel plasma presentano un limite di sensibilità pari a 50 copie/ml e tradizionalmente una carica virale di 1000 copie/ml è considerata necessaria per poter effettuare una analisi del genotipo virale. In realtà il sequenziamento di cariche virali inferiori a 1000 copie/ml si è dimostrato possibile ed estremamente utile al fine di prevenire un fallimento terapeutico e la selezione di ulteriori mutazioni di resistenza.
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di verificare la possibilità e l’importanza clinica del sequenziamento dell’RNA virale
in campioni con bassi livelli plasmatici di HIV–RNA. Pertanto sono state implementate le metodiche di amplificazione genica
al fine di aumentarne la sensibilità e l’efficienza ed è in corso il follow-up dei pazienti con genotipi resistenti.
E’ stato quindi condotto uno studio su 115 pazienti con infezione da HIV, afferenti all’ambulatorio di Malattie Infettive del
Policlinico Universitario “A. Gemelli“ dell’ Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma, nel periodo 2006-2007. I pazienti
analizzati presentavano nel 60% dei casi una carica virale non determinabile (inferiore a 50 copie/ml), nel 39% dei casi una viremia inferiore alle 1000 copie/ml. L’RNA virale è stato amplificato e sequenziato in circa il 13% dei pazienti con viremia non
determinabile e in circa il 69% dei pazienti con una carica virale compresa tra le 50 e le 1000 copie/ml. Il sequenziamento genico in pazienti con cariche virali basse o non determinabili ha permesso in diversi casi di individuare mutazioni maggiori di farmaco-resistenza estremamente importanti per la gestione del paziente. In conclusione la diagnosi precoce delle mutazioni
potrebbe avere una notevole rilevanza clinica evitando l’aumento severo della viremia e diminuendo il rischio di fallimento terapeutico.
INTERFERON CONSENSUS SEQUENCE_BINDING PROTEIN (ICSBP) È ESSENZIALE PER IL
CONTROLLO DELL’INFEZIONE DA M. TUBERCULOSIS NEL TOPO
M. Sali1, G. Delogu1, A. Zumbo1, L. Gabriele2 e G. Fadda1
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore Roma
2Laboratorio di Virologia, Istituto Superiore di Sanità, Roma
Interferon consensus sequence_binding protein (ICSBP) è un fattore di trascrizione che gioca un ruolo fondamentale nella
modulazione della risposta immunitaria, in particolare nel differenziamento e maturazione delle cellule deputate alla produzione di citochine ed agisce come un importante regolatore dei geni IFN indotti.
Topi icsbp-/- risultano carenti delle cellule deputate alla produzione di IFN di tipo I e presentano una ridotta risposta immunitaria di tipo Th1 e risultano essere maggiormente suscettibili all’infezione da parte di vari patogeni tra cui Listeria monocytogenes e Toxoplasma gondii.
In questo studio è stata testata la sensibilità dei topi icsbp-/- all’infezione da Mycobacterium tuberculosis per valutare la relazione tra l’espressione di icsbp (e dei geni da lui controllati) e l’instaurarsi dell’infezione da parte del micobatterio.
I topi wild type (WT) e icsbp-/- sono stati infettati per via aerogenica, con una bassa dose del ceppo virulento M. tuberculosis
Erdman (circa 100 batteri/topo).
Dopo 8, 15 e 30 giorni dall’infezione si è proceduto al sacrificio dei topi e all’estrazione del polmone (lobo destro) e della milza
da ciascun gruppo per la determinazione delle CFU/organo per valutare la colonizzazione degli organi.
Sia nei topi WT e icsbp-/- ad 8 e 15 gg. dall’infezione è possibile vedere piccoli tubercoli definiti di dimensioni comparabili, a
30 giorni, invece, è possibile vedere nei ceppi icsbp-/- formazioni granulomatose di dimensioni notevolmente superiori a quelle presenti nei polmoni dei topi WT. Dalla conta delle CFU si è visto una crescita comparabile del M. tuberculosis all’interno
dell’ospite fino al quindicesimo giorno dopodiché si nota un’impennata nella moltiplicazione del micobatterio nei topi icsbp-/. I nostri dati suggeriscono che la maggiore sensibilità dei topi icsbp-/- rispetto a quelli WT è da ascrivere ad una incapacità dei
primi di sviluppare una adeguata risposta immuniataria specifica nei confronti di M. tuberculosis. Per caratterizzare ulteriormente tale aspetto, si è provveduto ad immunizzare i topi con vaccini a DNA e con BCG per valutare la capacità dei topi icsbp/- e WT di controllare l’infezione. In topi icsbp-/- l’immunizzazione con BCG ha conferito un elevato livello di protezione, mentre la vaccinazione con vaccini a DNA non è stata in grado di indurre alcuna attività protettiva.
109
ANALISI DELLE MUTAZIONI DI RESISTENZA AI FARMACI ANTIRETROVIRALI OTTENUTE DAL
SEQUENZIAMENTO GENICO DI DNA PROVIRALE ESTRATTO DA SANGUE INTERO E DI RNA
ESTRATTO DA PLASMA DI SOGGETTI HIV POSITIVI.
S. Marchetti 1, R. Santangelo1, L. Bracciale2, M. Colafigli2, S. Di Giambenedetto2, A. De Luca2, P. Cattani1, G. Fadda1.
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
2Istituto di Clinica delle Malattie Infettive, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
Il virus dell’immunodeficienza umana (HIV-1) infetta prevalentemente i linfociti T CD4+ e le cellule appartenenti alla linea
monocito-macrofagica. Il virus penetra nella cellula, il suo RNA viene retro-trascritto in DNA e successivamente integrato nel
genoma della cellula ospite (DNA provirale) dove può rimanere inattivo dal punto di vista trascrizionale, per periodi di tempo
anche molto lunghi.
Lo studio del “reservoir” di HIV nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) è considerato un interessante marcatore della risposta alla terapia antiretrovirale.
Lo scopo di questo studio è stato quello di verificare se l’analisi del DNA provirale ottenuto da campioni di sangue intero, potesse rilevare varianti resistenti archiviate potenzialmente in grado di compromettere l’attività delle opzioni terapeutiche future.
Nel presente lavoro è stato condotto uno studio su 122 pazienti con infezione da HIV, afferenti all’ambulatorio di Malattie
Infettive del Policlinico Universitario “A. Gemelli“ dell’Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma, nel periodo 2006-2007.
Il 24% dei pazienti analizzati presentava livelli di HIV-RNA inferiore alle 50 copie/ml. L’RNA virale è stato sequenziato in circa
il 15% di questi pazienti, mentre nel 99% è stato possibile amplificare e analizzare la sequenza del DNA virale evidenziando in
alcuni casi mutazioni maggiori di farmaco-resistenza. Di tutti i pazienti con cariche virali maggiori di 50 copie/ml è stato possibile analizzare sia la sequenza dell’RNA che del DNA virale. In conclusione il campione di sangue intero risulta essere un
materiale idoneo per il sequenziamento del DNA virale, fornendo informazioni aggiuntive all’analisi dell’RNA ottenuto dallo
stesso campione; informazioni risultate importanti ai fini della valutazione della farmaco-resistenza. Inoltre l’analisi del DNA
può avere un valore pratico di estrema importanza in pazienti con cariche virali basse non sequenziabili con i sistemi correnti
di genotipizzazione.
PARASSITOSI INTESTINALI RARE CONTRATTE DA PAZIENTI ITALIANI IN ITALIA
Luca Masucci, Rosalia Graffeo e Giovanni Fadda
La diagnosi di laboratorio parassitologica sta ponendo in evidenza l’aumento di infezioni parassitarie in Italia.
Tale incremento è riconducibile ad un cambiamento culturale da parte di soggetti extracomunitari immigrati, che vengono consigliati dal medico di base o da specialisti a sottoporsi ad esami di ricerca di laboratorio che difficilmente effettuano nei loro
paesi.
Tuttavia abbiamo cominciato a riscontrare un aumento anche in pazienti italiani.
Riportiamo due casi di parassitosi intestinali che rappresentano una rarità in soggetti italiani perché contratte nel nostro paese:
Ciclosporiasi e Imenolepiosi.
Primo caso. Donna di 63aa con diarrea secretoria cronica da circa due mesi. Dall’indagine anamnestica risulta che non ha viaggiato al di fuori dell’Italia negli ultimi 12 mesi. L’esame microscopico diretto e previa colorazione mette in evidenza la presenza di oocisti di Cyclospora cayetanensis sul secondo campione di feci dei tre forniti al laboratorio. E’ stata eseguita una ricerca
del genoma mediante amplificazione degli acidi nucleici (PCR) che ha dato esito positivo anche sul terzo campione risultato
invece negativo alla microscopia. La sintomatologia è regredita dopo terapia con sulfametossazolo.
Secondo caso. Uomo di 56aa affetto da miastenia gravis. All’esame parassitologico delle feci sono evidenziate uova di
Hymenolepis nana. Il paziente riferisce di non aver mai viaggiato all’estero.
110
RUOLO DI TRE PEROSSIDASI (NADH PEROSSIDASI, ALCHIL-IDROPEROSSIDO REDUTTASI E
TIOLO PEROSSIDASI) NELLA RISPOSTA ALLO STRESS OSSIDATIVO E NELLA SOPRAVVIVENZA
ALL’INTERNO DEI MACROFAGI DI ENTEROCOCCUS FAECALIS
A. Florio1, S. La Carbona2, J. C. Giard2, N. Sauvageot2, A. Benachour2, B. Posteraro1, Y. Auffray2, M. Sanguinetti1, A.
Hartke2 e G. Fadda1
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del S. Cuore, Roma, Italia; 2Laboratoire de Microbiologie de l’Université de
Caen, Caen, France
Il patogeno opportunistico Enterococcus faecalis è corredato di ben note attività perossidasiche. Nel suo genoma sono contenuti
tre loci che codificano per una NADH perossidasi (ef1211, Npr), un’alchil-idroperossido reduttasi (ef2738 e ef2739, Ahp) ed una
proteina appartenente alla famiglia AhpC/TSA (ef2932). Nonostante la bassa omologia di quest’ultima con gli enzimi caratterizzati di altri organismi, è stato possibile dimostrare che il locus ef2932 codifica una tiolo perossidasi (Tpx) e che tale gene è
parte del regulone controllato da HypR. La caratterizzazione di mutanti di delezione dei tre geni ha mostrato che tutte e tre le
perossidasi sono importanti per la difesa contro l’H2O2 esogena. Al contrario, l’esposizione alla H2O2 endogena prodotta
durante la crescita su terreni contenenti, rispettivamente, come unica fonte di carbonio, glicerolo, lattosio, galattosio o ribosio
ha mostrato che Npr era indispensabile per la crescita aerobica su glicerolo e per la crescita ottimale sugli altri substrati. La crescita su glicerolo era anche dipendente da Ahp. Inoltre, l’analisi della sopravvivenza degli stessi ceppi all’interno di macrofagi
peritoneali murini ha messo in evidenza che Tpx era il più importante fattore con attività antiossidante per la protezione del
microrganismo nei confronti dell’ambiente intracellulare fagociti. Infine, è stata analizzata la virulenza dei tre mutanti in confronto al ceppo ‘wild type’ in un modello di peritonite murina.
MYCOBACTERIUM BOVIS IPER-ESPRIME IL GENE HBHA NEL TESSUTO POLMONARE MA NON
NELLA MILZA RISPETTO AD UN CEPPO CLINICO DI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
G. Delogu1, M. Sanguinetti1, M. Sali1, G. Pecorini1, S. Zanetti2, e G. Fadda1
1Istituto di Microbiologia, Università Cattolica del Sacro Cuore Roma
2 Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Sassari
La proteina Heparin-binding hemagglutinin (HBHA) è un importante fattore di virulenza di Mycobacterium tuberculosis, coinvolto nel processo di disseminazione dal sito di infezione primaria. E’ noto che Mycobacterium bovis, agente eziologico della
tubercolosi nei mammiferi di allevamento e selvatici, è molto più virulento di M. tuberculosis nel modello murino. Studi recenti suggeriscono che la maggiore virulenza di M. bovis sia dovuta alla maggiore capacità di disseminare dal sito di infezione primaria. Al fine di verificare il coinvolgimento della proteina HBHA in tale processo, abbiamo studiato la virulenza di un ceppo
di M. tuberculosis clinico e di un ceppo di M. bovis clinico nel modello murino, valutando la colonizzazione dei tessuti, il danno
tissutali e in ultimo la capacità di uccidere i topi. Abbiamo inoltre valutato l’espressione del gene codificante per HBHA (hbhA)
mediante reverse real time PCR direttamente sui tessuti dell’ospite a vari tempi dopo l’infezione, nonché in rilevamnti modelli
in vitro. I nostri studi indicano che l’espressione del gene hbhA in M. bovis risulta essere molto più elevata rispetto a quanto
osservato in M. tuberculosis. L’ iperespressione di hbhA in M. bovis è osservata nel tessuto polmonare ma non nella milza ed è
più marcata nelle prime fasi dell’infezione. I nostri studi suggeriscono che la maggiore virulenza di M. bovis rispetto ad M.
tuberculosis possa essere in parte dovuta ad una maggiore espressione della proteina HBHA.
111
VALUTAZIONE DEL “CHROMID ESBL AGAR” PER LO SCREENING DEI CEPPI DI ESCHERICHIA
COLI, KLEBSIELLA PNEUMONIAE E PROTEUS MIRABILIS PRODUTTORI DI B-LATTAMASI A
SPETTRO ESTESO
Teresa Spanu, Barbara Fiori, Michela Sali, Antonella Zumbo, Paola Cerini, Rosaria Porta, Tiziana D’Inzeo, Maurizio
Sanguinetti, Giovanni Fadda
L’inadeguatezza della terapia antimicrobica empirica è un significativo fattore di rischio per la mortalità associata con le infezioni sistemiche causate dai ceppi di Enterobacteriaceae produttori di b-lattamasi a spettro esteso (ESBL). Una rapida e affidabile rilevazione delle ESBL è importante per instaurate efficaci terapie. Obiettivo di questo studio è stata la valutazione del
“chromID™ ESBL agar” (bioMérieux, Inc, Hazelwood, Mo.), un nuovo terreno cromogeno contenente cefpodoxime, per la
screening dei ceppi produttori delle ESBL direttamente dai flaconi delle emocolture. Lo studio è stato condotto saggiando 400
flaconi di emocolture positive per batteri gram-negativi. I risultati ottenuti con il “CHROMID ESBL AGAR” rispetto a quelli
ottenuti con i metodi di confronto (piastre di MacConkey contenenti 2 µg/ml di ceftazidime e metodi genotipici per la identificazione delle ESBL) suggeriscono che tale metodica è affidabile accurata per lo screening rapido dei ceppi di ESBL-produttori responsabili di batteriemie.
RICERCA E TIPIZZAZIONE DI PAPILLOMAVIRUS (HPV) IN DUE CASI DI TUMORE METASTATICO POLMONARE SECONDARIO A CARCINOMA DELLA CERVICE
P. Cattani, A. Siddu, A. Di Franco, G. F. Zannoni1, S. Marchetti, S. Manzara, R. Santangelo, G. Fadda.
1Istituto di Anatomia Patologica, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma
I Papillomavirus umani (HPV), in particolare i genotipi ad “alto rischio”, sono strettamente associati a neoplasie del tratto genitale, in particolare al carcinoma della cervice uterina nel quale il DNA virale è determinabile in quasi il 100% dei casi. Con una
frequenza variabile ma inferiore, il DNA di HPV è stato riscontrato anche in lesioni carcinomatose della testa e del collo e in
carcinomi del polmone, con una netta prevalenza dei genotipi HPV 16 e 18.
In questo lavoro sono stati studiati per la presenza di HPV due casi di carcinoma del polmone secondario a carcinoma della cervice nell’ipotesi di determinare la probabile origine genitale della neoplasia.
Mediante PCR sulle regioni geniche L1, E2, E6 ed E7, utilizzando sequenze primer consensus (MY09-11) e sequenze tipo-specifiche, sono state studiate due pazienti con carcinoma squamoso scarsamente differenziato del polmone, analizzando campioni costituiti da fettine di tessuto paraffinato della lesione polmonare e del precedente carcinoma cervicale.
La ricerca dell’HPV ha rilevato la presenza di DNA virale del genotipo 16 in un caso, e dei genotipi 18 e 35 nell’altro. In entrambi i casi, DNA dello stesso genotipo di HPV è stato riscontrato sia nel campione polmonare sia in quello cervicale.
Quello che sembra interessante sottolineare è che, in entrambi i casi, i virus presentano significative delezioni delle regioni L1
ed E2 evento che può rendere impossibile la rilevazione con i primer consensus (regione L1), normalmente utilizzati per la ricerca generica di HPV. Inoltre, i saggi di amplificazione delle regioni E2, E6 ed E7 suggeriscono la presenza dei virus in forma
integrata in entrambi i campioni dello stesso paziente.
La presenza di HPV 35, non riscontrato a nostra conoscenza nel carcinoma del polmone, in associazione al genotipo 18 in uno
dei due casi, sembra avvalorare l’ipotesi di una origine cervicale della neoplasia polmonare.
L’associazione di HPV con il carcinoma primario del polmone è tuttora oggetto di studio, soprattutto in relazione alla bassa prevalenza riscontrata in questo tipo di neoplasie. Tuttavia, un’attenta ricerca del DNA di HPV, in un corretto contesto clinico e
anatomo-patologico, potrebbe indirizzare i clinici sia nell’individuazione del sito di origine che nel trattamento del paziente.
112
PRESENZA DI BIOFILM DI H. PYLORI IN BIOPSIE GASTRICHE E MUCOSE OROFARINGEE DA
PAZIENTI CON MALATTIA DA REFLUSSO GASTROESOFAGEO RESISTENTI A TERAPIA ANTIBIOTICA
F. Ardito, G. Branca, R. Torelli, G. Cammarota*, J. Galli**, L. Calò**, M. Imperiali**, G. Fadda.
Istituto di Microbiologia, *Dipartimento di Medicina Interna; **Istituto di Otorinolaringoiatria; Università Cattolica del S.
Cuore Policlinico “A. Gemelli” Roma
Abbiamo esaminato 34 pazienti con malattia da reflusso gastroesofageo e infezione gastrica da H. pylori resistente a terapia antibiotica.
MATERIALI E METODI: Sono stati esaminati frammenti di mucosa gastrica ottenuti mediante esofago-gastro-duodenoscopia
(EGDS) e mucose orofaringee ottenute mediante tamponi faringo-tonsillari. Ogni campione di biopsia gastrica è stato opportunamente trattato e diviso in due frammenti: un frammento processato per le colture batteriche e l’altro frammento preparato per
l’analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) per la rivelazione di biofilm.
I tamponi provenienti da mucose orofaringee sono stati processati con il test rapido enzimatico all’ureasi per la determinazione
dell’H. pylori .
RISULTATI: Nove pazienti erano resistenti a levofloxacina, metronidazolo e claritromicina, 5 resistenti a metronidazolo e claritromicina, 5 resistenti a metronidazolo, 5 a claritromicina e 2 a levofloxacina. Nessun paziente era resistente ad amoxicillina
e tetraciclina.
Tutte le biopsie gastriche, positive alla coltura per H. pylori, presentavano biofilm. Tutti i tamponi orofaringei erano positivi al
test rapido enzimatico.
CONCLUSIONI: E’ possibile ipotizzare che la presenza di biofilm in sede gastrica e la contemporanea presenza di H. pylori in
sede tonsillare possano giocare un ruolo nella resistenza alla terapia antibiotica.
RILEVAMENTO DI ANTICORPI ANTI ASPERGILLUS MEDIANTE IFA IN DIVERSE TIPOLOGIE DI
PAZIENTI
Baglieri R., Rapisarda M.F., Greco A.M., Trovato L., Oliveri S.
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche
U.O. Laboratorio Analisi, A.O.U. Policlinico”G. Rodolico” Catania
Università di Catania
Tra le tecniche immunologiche per la ricerca di anticorpi anti-Aspergillus, quella in immunofluorescenza indiretta (IFA), è stata
da tempo accantonata per i problemi legati alla scarsa specificità a causa delle reazioni crociate e della modalità di preparazione dell’antigene. La doppia diffusione in gel di agarosio (DD) è invece altamente specifica pur presentando una sensibilità variabile in relazione alle diverse patologie.
A partire dal lavoro di Gordon (1) abbiamo provato a mettere a punto una tecnica in IFA ottimizzando la preparazione dell’antigene sui vetrini e aumentando la specificità del test mediante l’adsorbimento dei sieri con i conidi di Penicillium sp.. Il metodo innanzitutto è stato provato su un pool di sieri di soggetti normali e successivamente utilizzato in parallelo a quello della DD su pazienti ricoverati in particolare nelle U.O. di Broncopneumoallergologia e Otorinolaringoiatria.
Nella popolazione sana la maggioranza dei sieri dei soggetti sani è risultata positiva agli anticorpi IgG anti-Aspergillus. Nelle diverse classi di età la più alta frequenza di negatività si è osservata nella classe 0-10 anni, e la più bassa (5%) nella classe 40-50.
L’adsorbimento del siero con i conidi del Penicillium lanosum Westling, ha determinato una riduzione del titolo anticorpale antiAspergillus nel 50% dei sieri esaminati. Al contrario, l’adsorbimento con i conidi dell’Aspergillus ha indotto, a parte un’eccezione, un drastico calo degli anticorpi anti-Penicillium con titoli più bassi di diverse diluizioni.
Nei due gruppi di pazienti esaminati si è riscontrata una discreta correlazione con la ricerca in DD, ma in alcuni casi, la migliore sensibilità e la possibilità di una migliore quantificazione della risposta anticorpale, sono stati particolarmente utili nel monitoraggio di alcuni pazienti.
Vogliamo anche riportare quanto verificato con un paziente della U.O. di Oncoematologia pediatrica che presentava una lesione perilabiale per la quale era stata esclusa l’eziologia virale e batterica. Pur non essendo stata riconosciuta una particolare patologia ascrivibile a miceti, il perdurare del titolo IgG anti-Aspergillus di 640 ha indotto ad iniziare una terapia con voriconazolo
in vena per una settimana, e per os sino a due mesi, con una riduzione del titolo anticorpale a 160, miglioramento del paziente
e successiva dimissione.
1) Gordon M.A. et al. (1977) J Clin Microbiol, 6: 161-165
113
SAGGIO DI SENSIBILITA’ IN VITRO DI CEPPI DI MALASSEZIA SP. ISOLATI DA PAZIENTI CON
PITYRIASIS VERSICOLOR
Rapisarda M.F., Greco A.M., Baglieri R., Trovato L., Oliveri S.
U.O. Laboratorio Analisi, A.O.U. Policlinico”G. Rodolico” Catania
Università di Catania
Il genere Malassezia comprende lieviti commensali dell’uomo e degli animali in grado di provocare diverse patologie. Le specie più frequentemente isolate nei casi di Pityriasis versicolor sono M. globosa, M. sympodialis e M. furfur (1). Diversi sono gli
studi effettuati per valutarne la sensibilità in vitro ma due in particolare fanno riferimento al metodo CLSI (2,3), utilizzando terreni addizionati di fonti lipidiche.
Obiettivo del nostro lavoro è stato quello di confrontare i valori delle MIC ottenuti con questi terreni utilizzando ceppi isolati
da pazienti con Pityriasis versicolor afferenti all’ambulatorio di Micologia Medica dell’A.O.U. Policlinico di Catania. Sono stati
saggiati 18 ceppi, 12 di M. globosa e 6 di M. furfur isolati su un terreno da noi modificato, e identificati, secondo le procedure
standard, comprendenti sia prove morfologiche che fisiologiche. La sensibilità in vitro è stata valutata verso ciclopiroxolamina,
fluconazolo, itraconazolo e ketoconazolo, utilizzando il metodo delle microdiluizioni in brodo e facendo riferimento al documento del CLSI. I terreni utilizzati sono stati il Christensen urea con 0,1% di Tween 80 e 0,5% di Tween 40 e RPMI 1640 supplementato con 20g/L di glucosio, 4g/L di ox-bile, 1 ml/L di glicerolo, 0,5 g/L di glicerolo monostearato 0,4 ml/L di Tween 40.
I valori degli intervalli delle MIC (µg/ml) per M. globosa in RPMI e in Christensen urea sono stati rispettivamente 0,125-8 e
0,25-8 per la ciclopiroxolamina, 1-32 e 1-16 per il fluconazolo, 0,03-0,25 e 0,03-16 per itraconazolo, 0,03-0,5 e 0,03-16 per il
ketoconazolo. Per M. furfur 0,5-4 per la ciclopiroxolamina in entrambi i terreni, 1-16 e 2-32 per il fluconazolo, 0,03-0,125 e
0,25-16 per l’itraconazolo, ed infine 0,03-1 e 0,03-4 per il ketoconazolo. Fra i due terreni utilizzati per il saggio in vitro vi è
sovrapponibilità degli intervalli dei valori di MIC relativamente a ciclopiroxolamina e fluconazolo per entrambe le specie, mentre itraconazolo e ketoconazolo, mostrano intervalli decisamente più ristretti soprattutto per M. globosa. L’analisi delle medie
geometriche evidenzia le maggiori discordanze per l’itraconazolo relativamente a M. furfur e per il ketoconazolo relativamente
a M. globosa.
1) Batra R. Et al. (2005) FEMS Yeast Research, 5: 1101-1113
2) Velegraki A. et al. (2004) J Clin Microbiol, 42: 3589-3593
3) Rincòn S. et al. (2006) J Clin Microbiol, 44: 3429-3431
OCRATOSSINA A PRODOTTA DA ASPERGILLUS NIGER NEL SUCCO D’ARANCIA CITRUS SINENSIS [L.] OSBECK
Previti R., Crocetta M.C., Nostro A., Crisafi G., Pizzimenti F., Marino A.
Dipartimento Farmaco-Biologico. Università degli Studi di Messina.
Introduzione. L’Ocratossina A (OTA) è una micotossina prodotta dai generi Aspergillus e Penicillium con proprietà nefrotossiche, cancerogene, teratogene e immunosoppressive (Matrella, R. et al. Food Control, 2006). La presenza di questa tossina è
stata rilevata in diversi tipi di alimenti e bevande compresi vino e succhi di frutta. Nell’area mediterranea grazie al clima mite,
la coltivazione degli agrumi ha ampia diffusione e gli Aspergillus spp., cosiddetti “storage fungi”, rappresentano un alto rischio
di contaminazione per questi prodotti e per i loro derivati (Lo Grieco, A. et al. E. J. of Plant Path., 2003). Obiettivo. Valutare
l’influenza della temperatura sia sulla sopravvivenza di Aspergillus niger ATCC 16404 e di Aspergillus niger (wild type) sia
sulla loro capacità di produrre Ocratossina A nel succo d’arancia fresco Citrus sinensis (L.) Osbeck cv Tarocco. Metodi.
Challenge test a 4°C, 20°C, 26°C; Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa della tossina. Monitoraggio: 4
settimane. Risultati. A niger (wild type) sopravvive a lungo nel succo d’arancia pur riducendo gradatamente la carica iniziale
dalla prima settimana di studio alla quarta del 27,81% a 4°C, del 33,13% a 20°C, del 20,63% a 26°C. A niger ATCC 16404,
invece, alle temperature più elevate, si riproduce, incrementando la sua concentrazione alla quarta settimana del 29,61% a 20°C
e del 32,66% a 26°C mentre a 4°C mostra un andamento simile a quello riscontrato per il ceppo wild type (riduzione del
53,81%). Nel succo d’arancia A niger (wild type) produce OTA già dalla prima settimana, raggiungendo la massima concentrazione di 8,4 ng/ml a 26°C e di 1,93 ng/ml a 4°C. Il valore massimo di 6,45 ng/ml si evidenzia a 20°C nella seconda settimana.
La produzione di OTA per A. niger ATCC 16404 è massima alla terza settimana sia a 20 °C che a 26°C ( 3,44 ng/ml e 3,22
ng/ml rispettivamente) mentre è minima a 4°C. Conclusioni. Il succo d’arancia fresco sembra essere per A. niger un buon substrato per la produzione di OTA soprattutto a temperature ambientali elevate quali quelle dei paesi con un clima mediterraneo.
Ulteriori studi sono necessari affinché si possa definire il tenore massimo consentito di OTA in questo tipo di bevande al fine di
tutelare la salute del consumatore.
114
ANALISI DEI TRASCRITTI DELL’AGR-LOCUS IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PRODUTTORE DI
BIOFILM
Cafiso Viviana, Bertuccio Taschia, Demelio Vanessa, Spina Daniela, Chiarenza Simona, Vizzari Giuseppe, Purrello Simona e
Stefania Stefani
Dipartimento di Microbiologia e Ginecologia–Università di Catania - Catania
Il biofilm rappresenta il più importante fattore di patogenicità nelle infezioni croniche sostenute da Staphylococcus aureus. La
produzione di biofilm è dovuta alla produzione di una adesina intercellulare detta PIA codificata dai geni del cluster “ica” (intercellular-adhesin), la cui espressione è regolata da segnali ambientali e da sistemi di regolazione globale quali agr-locus (accessory-gene-regulator).
Scopo del nostro lavoro è stato quello di valutare in un campione di S.aureus, appartenenti a diversi agr-types: i) la produzione
di biofilm mediante saggio quantitativo; ii) l’agr-typing mediante ScaI-RFLP; iii) l’espressione di agr-locus ed icaA mediante
RT-PCR; iv) l’espressione di geni di adesione (atl e dltA) e di geni del metabolismo (ureD-ssa-clpC) in agr-type I e II mediante RT-PCR; v) la quantificazione dell’espressione di agr-locus in agr-I e II mediante real-time RT-PCR.
I nostri risultati mostrano una forte correlazione tra produzione di grandi quantità di biofilm ed appartenenza ad agr-II. Gli RFLP
di agr-locus e le analisi di sequenza, hanno identificato due nuove varianti di agr- IA ed IB- date dall’inserzione di una copia di
IS256. L’analisi dei trascritti di agr-locus rivelava una normale funzionalità in agr-I-IV ed IA, dimostrata dalla trascrizione di
mRNA specifici, al contrario un’alterata funzionalità, era evidente nei type II-III ed IB per assenza di mRNA di agr-P2. I dati
quantitativi mostravano che, ad elevata densità cellulari, gli mRNA di rnaIII di agr-II erano significativamente meno abbondanti
di quelli di agr-I.
Nei forti produttori, l’analisi degli mRNA di icaA ed atl ne mostrava una precoce trascrizione, unita alla presenza di mRNA tardivi di dltA. Un pattern di espressione opposto si evidenziava nei ceppi medi o deboli produttori. Nessuna differenza era evidente, invece, nell’espressione dei geni metabolici, ad eccezione della presenza di mRNA tardivi di clpC nei medi produttori.
In conclusione, i nostri dati dimostrano che la produzione di grandi quantità di biofilm è legata ad una alterata funzionalità di
agr-locus, probabilmente dovuta ad una diversa capacità di induzione di agr-II rispetto all’I, che porta ad una precoce espressione dei geni di adesione mentre non influenza in modo determinante l’espressione di geni metabolici.
CARATTERIZZAZIONE DI UNA VARIANTE DELL’ELEMENTO SCCMEC, IN UN ISOLATO DI
STAPHYLOCOCCUS INTERMEDIUS METICILLINO-RESISTENTE, CAUSA DI BATTERIEMIA.
Campanile F., Bongiorno D., Borbone S., Stefani S.
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Ginecologiche
Staphylococcus intermedius, microrganismo di origine zoonotica, annoverato come specie nel 1976, prende il suo nome dalle
caratteristiche fenotipiche che denotano la sua natura a metà tra S. epidermidis e S. aureus, con il quale, dalle prime analisi cliniche di laboratorio, viene spesso confuso, sottostimando la sua reale incidenza. Sebbene S. intermedius, sia spesso associato a
svariate patologie negli animali, rarissimi sono i casi riportati in letteratura che lo descrivono come una specie patogena per l’uomo. Gli isolati di tale specie sono spesso sensibili alla penicillina, alla meticillina e a diverse classi di antibiotici non ?-lattamici; pertanto, è difficile comprendere come questo microrganismo, da semplice commensale degli animali, sia riuscito a divenire prima patogeno degli animali stessi, e poi, anche se in rari casi, patogeno per l’uomo.
Sebbene l’elemento genetico mobile responsabile della meticillino-resistenza – il gene mecA, veicolato da diverse cassette cromosomiche – sia stato descritto in diverse specie stafilococciche, in letteratura non sono stati riportati dati relativi ad isolati di
S.intermedius che portano elementi SCCmec-like.
Il nostro lavoro riporta un raro caso di batteriemia, conseguente all’impianto di catetere venoso, associato ad un isolato di S.
intermedius che, sotto la pressione selettiva degli antibiotici, è diventato resistente alla meticillina per acquisizione del gene
mecA. Inoltre, abbiamo verificato l’associazione tra la presenza del gene mecA e una variante dell’elemento mobile SCCmec,
caratterizzandone dettagliatamente la struttura genica.
Il nostro studio, inoltre, risponde ad alcuni quesiti che stanno alla base del trasferimento genico orizzontale e all’origine di
SCCmec, dimostrando come le cassette cromosomiche non siano solo correlate all’antibiotico-resistenza, ma rappresentino un
sistema di scambio di informazioni geniche in Staphylococcus spp.
115
ATTIVITÀ IN VITRO DI TIGECICLINA E ALTRI ANTIBIOTICI VERSO ACINETOBACTER BAUMANNII ISOLATI DA INFEZIONI GRAVI IN ITALIA
M. Mezzatesta, M. Trovato, F. Gona, V. Nicolosi, D. Nicolosi, G. Nicoletti, A. Cassone, G. Fadda, G. Schito, S. Stefani
Catania, Roma, Genoa, IT
Un studio multicentrico recente (2003-2004), svolto in 45 laboratori distribuiti in Italia, ha avuto come obiettivo il monitoraggio di microrganismi responsabili di infezioni gravi e la rilevazione dell’antibiotico-resistenza; Acinetobacter baumannii è risultato il terzo patogeno più frequentemente isolato nei reparti di terapia intensiva e la sua crescente importanza giustifica la ricerca di nuove molecole antibiotiche attive verso questo microrganismo.
In questo studio sono stati saggiati 108 ceppi di A.baumannii e le MIC di tigeciclina e degli antibiotici utilizzati in paragone
sono stati determinati con il metodo delle microdiluizioni secondo le procedure di CLSI. Per i ceppi resistenti ai carbapenemi è
stato eseguito uno screening fenotipico con il metodo Etest che rileva la presenza di metallo-enzimi (MBL). La caratterizzazione dei geni responsabili della resistenza ai carbapenemi è stata effettuata mediante PCR.
La resistenza al ceftazidime, ciprofloxacina e aztreonam è risultata largamente diffusa nel 90% dei ceppi saggiati, la resistenza
all’imipenem era pari al 51% e al meropenem 59%; amikacina e gentamicina erano attive solo verso il 30% dei ceppi mentre
la colistina è risultata molto attiva.
Tigeciclina ha una MIC90 pari a 2 mg/L e i ceppi mostravano una distribuzione di sensibilità unimodale, dimostrando che questo nuovo antibiotico è il più attivo tra le tetracicline. Tra i 72 ceppi resistenti al meropenem (MIC > 16 mg/L), negativi per la
presenza dei metallo-enzimi, sono stati identificati solo 57 ceppi OXA 51 e 58 spesso tra loro associate.
In conclusione tigeciclina mostra una ottima attività verso i ceppi A.baumannii MDR mantenendo una MIC90 di 2mg/L nella
maggior parte dei ceppi carbapenemi-resistenti. I risultati evidenziano che la resistenza ai carbapenemi, in Italia, è dovuta principalmente alla diffusione dei geni delle oxacillinasi 51 e 58.
AMMONIA-OXIDISING BACTERIA AS A MODEL IN MICROBIAL ECOLOGY
M.Coci1, G. N. Pilloni1, S.Stefani1, H.J.Laanbroek2, G. Nicol3, M. Schmid4
1 Department of Microbiological Sciences, University of Catania, Italy
2 Department of Microbial Wetland Ecology, NIOO-KNAW Centre for Limnology, The Netherlands
3 School of Biological Sciences, University of Aberdeen, Scotland
4 Department of Microbial Ecology, University of Nijmegen, The Netherlands
Ammonia-oxidising bacteria (AOB) are aerobic chemolito-autrotrophic bacteria responsible of the conversion of ammonia into
nitrite during the first step of the nitrification process. Traditionally nitrification has been restricted to the Bacteria domain.
However, the recent isolation of marine Creanarcheota able to oxidize ammonia is changing the knowledge on the microbial
aspect of the nitrogen cycle, revealing that a lot is still undiscovered. Moreover, species belonging to the “classical” ammoniaoxidising bacteria are known to clearly differentiate their niches according to their specific physiological properties that better
respond to certain environmental conditions. The description of clear “eco-distribution” patterns showed by AOB made them a
model in microbial ecology studies.
Our study focused on the niche differentiation of AOB in shallow freshwater lakes dominated by submerged macrophytes such
as Potamogeton pectinatus and Chara spp. Diversity, numbers of AOB as well as their potential activity were assessed in the
benthic, pelagic and epiphytic compartments of 7 different shallow lakes, along restoration and trophic gradients.
PCR-DGGE assay on 16S rRNA and amoA genes were used to assess the diversity. Real-Time PCR were used to assess the
numbers of AOB and Fluorescent In Situ Hybridation technique was used to visualize for the first time ever these bacteria on
the leaves of submerged macrophytes. Finally, multivariate analyses were used to linked diversity, numbers and activity data
with the environmental parameters of the compartment and lakes revealing the ability of AOB to respond to natural and anthropogenic perturbations.
116
VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ ANTIBATTERICA SU ESTRATTI DI SEMI DI CIRUS BERGAMIA
RISSO & POITEAU
°°A.Pizzimenti, °A. Nostro,°A. Marino,°°°L. Barilà, °°°°A. Piperno, °F.Pizzimenti
° Dipartimento Farmaco-Biologico-Facoltà di Farmacia- Università degli Studi di Messina
°° Dottorato di ricerca in Patologia infettiva degli ovi-caprini-Dip.di Sanità Pubblica VeterinariaFacoltà di Medicina Veterinaria –Università degli Studi di Messina.
°°° Dottorato di ricerca in Chimica e sicurezza degli alimenti - Facoltà di Farmacia - Università degli Studi di Messina
°°°° Dip.Farmaco-Chimico- facoltà di Farmacia –Università degli Studi di Messina.
Da tempo la sez. di microbiologia del Dip. Farmaco–Biologico studia principi attivi di origine vegetale che potenzialmente possono esplicare attività antimicrobica.
In precedenti ricerche condotte già da diversi anni è stata valutata l’attività antibatterica su gram positivi e gram negativi (
F.Pizzimenti et al.) dell’olio essenziale di bergamotto e dei sottoprodotti della sua lavorazione. E’ stata anche testata l’attività
antimicrobica su Aspergillus niger (F.Pizzimenti et al.) e sui dermatofiti quali Microsporum canis, Epidermophyton floccosum
e Tricophyton mentagrophytes (F.Pizzimenti et al.).
Come prosieguo della ricerca sul bergamotto, abbiamo focalizzato l’attenzione sulla valutazione dell’attività antibatterica delle
frazioni grezze ,mediante tecniche analitiche, di estratti ottenuti dai semi di bergamotto.
Le estrazioni sono state effettuate con solventi a varia polarità mediante cloroformio, metanolo a freddo, metanolo a caldo.
La valutazione dell’attività antibatterica è stata effettuata in particolare su ceppi batterici gram positivi e gram negativi di isolamento clinico e ATCC, tra l’altro usati in precedenti ricerche.
Per ogni ceppo batterico e per tutte le frazioni grezze ottenute sono stati valutati i diametri degli aloni di inibizione ed i valori
delle MIC. Contemporaneamente è stato condotto uno studio per determinare le strutture molecolari presenti nelle varie frazioni testate, mediante tecniche di NMR e NMR-MS, in modo da mettere in relazione l’attività antibatterica riscontrata con le molecole presenti negli estratti.
I risultati ottenuti mostrano una buona attività su tutti i ceppi testati, con gli estratti metanolici soprattutto con quello a freddo.
I valori delle MICs sono compresi tra 100mg/ml ed 1mg/ml. Nessuna attività è stata riscontrata con l’estratto cloroformico.
Lo spettro H NMR dell’estratto metanolico a freddo effettuato in D2O indica la presenza di una complessa miscela di prodotti.
L’analisi dello spettro indica tuttavia la presenza di tre diverse classi di composti: Composti di natura glucidica (90-95%),composti di natura lipidica (5-9%), composti di natura aromatica (0-1%).
REALIZZAZIONE DI UN MICROARRAY BASATO SULLA TECNICA ARRAYED-PRIMER EXTENSION
(APEX) PER L’IDENTIFICAZIONE DEI PRINCIPALI AGENTI FUNGINI RESPONSABILI DI
INFEZIONI SUPERFICIALI E SISTEMICHE
Tavanti1, D. Campa2, F. Gemignani2, C. S. Mogavero1, I. Bellini2, F. Bottari2, R. Barale2,
S. Landi2, S. Senesi1
1Sezione di Microbiologia e 2Sezione di Genetica, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa
Nonostante numerosi studi abbiano contribuito ad approfondire le conoscenze sulle infezioni fungine, i sistemi diagnostici
attualmente disponibili richiedono ancora lunghi tempi di esecuzione e non sempre permettono, soprattutto per le specie di
recente definizione, una accurata discriminazione. In tale ottica, è stato allestito un pannello di identificazione su vetrino
(microarray), basato sulla metodica arrayed primer extension (APEX), per la diagnostica molecolare dei principali miceti patogeni per l’uomo. Sono state, pertanto, disegnate sonde oligonucleotidiche specie-specifiche, complementari alle regioni internal transcribed spacer 1 e 2 (ITS1 and ITS2) di 24 specie fungine appartenenti a 10 generi diversi, comprendenti Candida (albicans, dubliniensis, famata, glabrata, tropicalis, kefyr; krusei, guilliermondii, lusitaniae, metapsilosis, orthopsilosis, parapsilosis, and pulcherrima), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus and terreus), Trichophyton (rubrum and tonsurans),
Trichosporon cutaneum, Epidermophyton floccosum, Fusarium solani, Microsporum canis, Penicillium marneffei, and
Saccharomyces cerevisiae. Le sonde sono state quindi posizionate su vetrino, secondo uno schema predefinito, ed il sistema di
identificazione, così ottenuto, è stato saggiato per la sua specificità, utilizzando un pannello di ceppi fungini di riferimento. Il
microarray è stato quindi validato utilizzando una serie di isolati clinici sottoposti alla procedura di identificazione senza che
l’operatore conoscesse l’esito dell’iter diagnostico tradizionale. La metodica APEX applicata alla tecnologia dei microarray si
è dimostrata altamente discriminativa, consentendo una identificazione inequivocabile per ciascuna specie. In particolare, questo
sistema ha permesso di identificare specie altamente correlate, quali C. parapsilosis, C. orthopsilosis and C. metapsilosis, ancora non discriminabili con i sistemi tradizionali. Grazie alle caratteristiche di riproducibilità, specificità e facilità di interpretazione, il sistema di identificazione proposto vede un potenziale impiego nella diagnostica dei principali miceti patogeni.
117
CANDIDA PARAPSILOSIS, C. METAPSILOSIS E C. ORTHOPSILOSIS MOSTRANO UN DIVERSO
GRADO DI PATOGENICITA’ IN VITRO NEI RIGUARDI DEL MACROFAGO
Carlotta Orsi1, Bruna Colombari1, Rachele Neglia1, Sonia Senesi2, Arianna Tavanti2 e Elisabetta Blasi1
1Dipartimento di Scienze di Sanità Pubblica, Università di Modena e Reggio Emilia
2Dipartimento di Biologia, Università di Pisa
Base: C. parapsilosis è un patogeno umano emergente; commensale della cute, è al secondo posto tra le specie di Candida
isolate da emocoltura. La recente identificazione di due specie distinte, C. metapsilosis e C. orthopsilosis (1), precedentemente considerate varianti della stessa specie C. parapsilosis, suggerisce una approfondita analisi delle caratteristiche fenotipiche
di tali microrganismi e in particolare del loro grado di patogenicità, vista la diversa distribuzione nei campioni clinici e nell’ambiente. Evidenze iniziali dimostrano differenti effetti di C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis su epitelio
umano ricostruito in vitro. Il presente studio intende valutare il comportamento delle tre specie di Candida, C. parapsilosis, C.
metapsilosis e C. orthopsilosis, nell’interazione con l’immunoeffettore macrofagico.
Metodi: vari ceppi di C. parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis, precedentemente tipizzati (1), sono stati impiegati in
saggi di infezione di macrofagi murini in vitro e quindi comparati per suscettibilità a fagocitosi e killing, capacità di indurre
risposta secretoria e di provocare danno alla cellula macrofagica in diverse condizioni sperimentali, secondo protocolli
descritti altrove (2).
Risultati: i ceppi saggiati hanno mostrato a) suscettibilità simile alla fagocitosi ma diversa sensibilità al killing nel test a 2 ore
(tale differenza scompare a tempi più lunghi), b) diversa capacità di indurre la produzione di TNFα ma non di altre citochine,
c) diverso effetto citotossico sul macrofago, valutato mediante colorazione con trypan blu o come rilascio di LDH.
Conclusioni: Questi dati forniscono evidenze iniziali su una diversa espressione di patogenicità delle tre specie di Candida, C.
parapsilosis, C. metapsilosis e C. orthopsilosis, nei riguardi dell’immunoeffettore macrofagico.
1) Tavanti A. et al. J Clin Microbiol, 43: 284, 2005
2) Blasi E. et al. Microb Pathog, 41: 251, 2006
Lavoro supportato dal MIUR-PRIN 2005 (finanziamento a EB n. 2005068754-003).
APPLICAZIONE DEI MICROARRAY PROTEICI NELLA DIAGNOSTICA AVANZATA DI PATOLOGIE MICROBICHE E VIRALI
Andrea Ardizzoni1, Samuele Peppoloni1, Claudio Cermelli1, Marisa Meacci2, Andrea Crisanti3, Francesca Baldracchini3,
Angelo Manzoni4, Franca Santoro4, Giuseppina Gallucci4, Elisabetta Blasi1.
1Dip. Scienze di Sanità Pubblica, Università di Modena e Reggio Emilia; 2Dip. Integrato Servizi Diagnostici e di Laboratorio,
Università di Modena e Reggio Emilia; 3Dep. Biological Sciences, Imperial College London (UK); 4Seac-Radim S.p.a.
L’immobilizzazione di matrici microscopiche (microarray) di acidi nucleici su substrato solido ha rappresentato un passo avanti cruciale per lo sviluppo di saggi multiparametrici che consentissero l’analisi dei livelli di espressione genica di un organismo.
Tuttavia l’analisi dell’espressione genica non fornisce indicazioni sull’abbondanza e funzione di biomolecole fondamentali nella
definizione di un fenotipo e/o nell’evoluzione di un processo patogenetico. Pertanto sono stati messi a punto microarray contenenti proteine, anticorpi, lipidi, carboidrati con applicazioni in ricerca e in diagnostica. In questa ottica nel presente lavoro, ci si
è proposti di mettere a punto un sistema di diagnostica avanzata, basato sulla tecnologia del microarray proteico, per la determinazione simultanea e multiparametrica di IgG e IgM specifiche nei confronti di antigeni microbici importanti nella diagnostica prenatale. Microarray di IgG e IgM umane ed antigeni microbici vengono deposti su vetrini da microscopio con superficie
chimicamente reattiva per mezzo di un sistema robotizzato ad alta precisione. I microarray cosí prodotti vengono incubati con
siero e successivamente con anticorpi marcati con fluorofori per la rilevazione del segnale. I vetrini vengono infine analizzati
con uno strumento che combina microscopia laser confocale e ricostruzione digitale dell’immagine. L’intensitá del segnale in
corrispondenza degli antigeni viene quantificata utilizzando come riferimento le curve di calibrazione generate depositando sul
vetrino quantitá decrescenti di IgG e IgM. Esperimenti di validazione hanno messo in evidenza come il saggio immunologico
per la rilevazione delle IgG dirette contro gli antigeni del complesso ToRCH avesse sensibilitá di 0.5 µg/mL e una precisione
tra 1,7% e 14,6% per tutti gli antigeni analizzati. Utilizzando campioni di siero provenienti da pazienti, si è ottenuta una eccellente concordanza tra microarray ed ELISA che sottolinea l’efficacia del sistema microarray. Considerati i notevoli vantaggi in
termini di costo e convenienza, riteniamo che la tecnologia del microarray proteico possa essere, in un prossimo futuro, introdotta come sistema di routine nei laboratori di analisi.
118
SENSIBILITÀ ANTIBIOTICA DI CEPPI DI LACTOBACILLUS SPP. ISOLATI DA PRODOTTI PROBIOTICI
Fazio D., Milazzo I., Pisano M., Caccamo C., Puglisi S., Blandino G.
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Ginecologiche. Università degli Studi di Catania.
Gli studi sull’antibiotico-sensibilità di Lactobacillus spp. presenti in letteratura sono difficilmente paragonabili, perché effettuati con differenti metodologie in assenza di protocolli standardizzati. Recentemente il “Clinical and Laboratory Standards
Institute” (CLSI) Approved Standard M-45/A, (2006) ha pubblicato le linee guida per effettuare il test di sensibilità agli antibiotici ed i criteri interpretativi di sensibilità ad alcuni antibiotici per Lactobacillus spp..
In questo studio abbiamo saggiato la sensibilità a differenti classi di antibiotici di 15 ceppi appartenenti a 6 specie di
Lactobacillus, isolati da 10 prodotti probiotici commercializzati in Italia ed identificati come precedentemente descritto
(Milazzo et al. 2006).
L’antibiotico-sensibilità è stata determinata utilizzando due differenti metodiche: la tecnica della microdiluizione in
CAMHB-LHB (Oxoid) (CLSI, M-45/A, 2006) ed il metodo E-test (A-biodisk) in MRS agar, frequentemente utilizzato per
saggiare l’antibiotico-sensibilità dei lattobacilli. Le MIC sono state interpretate utilizzando sia i breakpoint clinici suggeriti
dal CLSI (2006), sia quelli microbiologici suggeriti dal “Feed Additives and Products” (FEEDAP) (2005) per Lactobacillus
spp..
Paragonando le MIC ottenute con le due differenti metodiche, la tecnica della brododiluizione ha dato, frequentemente, valori identici a quelli ottenuti con E-test, oppure, in pochi casi, valori maggiori di 1 o 2 log2.
Sulla base di entrambi i breakpoint utilizzati, è stato possibile determinare che tutti i ceppi saggiati sono sensibili ad ampicillina e, ad eccezione di un ceppo di L. salivarius (che ha mostrato una atipica resistenza), ad eritromicina, che i ceppi di
L. paracasei, L. salivarius e L. plantarum sono intrinsecamente resistenti a vancomicina, e che la sensibilità a gentamicina è
variabile. Cefaclor, cefotaxime e ciprofloxacina, per i quali CLSI e FEEDAP non prevedono breakpoint, hanno presentato un
ampio range di MIC.
Questo studio ha confermato la validità del metodo E-test, in paragone alla tecnica della microdiluizione in CAMHB–LHB
standardizzata dal CLSI (2006), per discriminare tra resistenza intrinseca e resistenza atipica in importanti specie di
Lactobacillus spp.
Inoltre, i criteri interpretativi di sensibilità suggeriti dal CLSI per Lactobacillus spp. sono utili al clinico nelle terapie di infezioni gravi da Lactobacillus e possono anche contribuire a definire meglio i valori epidemiologici di “cut-off” in questa specie.
VALUTAZIONE DEI SAGGI VIDIA® TOXO IgM/IgG PER LA RICERCA DI ANTICORPI ANTITOXOPLAMA GONDII
Calderaro A., Piccolo G., Peruzzi S., Gorrini C., Dettori G., Chezzi C.
Obiettivo. Nel presente studio è stata valutata la “performance” analitica dei nuovi saggi VIDIA TOXO IgM/IgG a confronto
con quella dei sistemi VIDAS (BioMérieux), AXSYM (Abbott) e LIAISON (DiaSorin) per la rivelazione degli anticorpi IgM e
IgG anti Toxoplasma gondii utilizzando campioni clinici in uno studio di tipo retrospettivo e prospettico.
Materiali e metodi. Sono stati saggiati con tutti e 4 i sistemi contemporaneamente, 405 campioni di siero: 204 pervenuti presso il nostro laboratorio nel periodo 2005-2006 e congelati al momento del loro arrivo (studio retrospettivo) e 201 pervenuti nell’anno 2006 e saggiati al momento del loro arrivo o il giorno successivo (studio prospettico). Questi campioni appartenevano
rispettivamente a: 243 donne in gravidanza, 6 donne in gravidanza con infezione da HIV, 39 individui adulti sani, 31 bambini,
71 pazienti immunocompromessi e 15 donatori di sangue.
La sensibilità e la specificità dei saggi VIDIA TOXO IgM/IgG è stata determinata in confronto ai sistemi AXSYM, LIAISON
e VIDAS (attualmente utilizzato nel nostro laboratorio), tenendo conto dei risultati positivi, negativi, falsi positivi e falsi negativi ottenuti. I campioni di siero per i quali è stato ottenuto un risultato dubbio (sia per IgM che per IgG, anche dopo la ripetizione dell’indagine) con uno qualsiasi dei 4 sistemi allo studio sono stati esclusi dall’analisi.
Risultati. Per quanto riguarda gli anticorpi IgM la sensibilità è risultata pari al 100% per i sistemi VIDIA e VIDAS, e all’82.35%
e al 94.12% per i sistemi AXSYM e LIAISON, rispettivamente. La specificità è risultata pari al 100% per i sistemi VIDIA,
VIDAS e LIAISON e al 99.73% per il sistema AXSYM. Per quanto riguarda gli anticorpi IgG la sensibilità è risultata pari al
100% per tutti e quattro i sistemi in studio e la specificità è risultata pari al 100% per i sistemi VIDAS e LIAISON e al 99.25%
e 98.49% per i sistemi VIDIA e AXSYM.
Conclusioni. Nel nostro studio il sistema VIDIA per la rivelazione di anticorpi anti Toxoplasma gondii ha mostrato un’eccellente sensibilità e una buona specificità e si è rivelato di semplice e rapida esecuzione.
119
STUDIO DEL MECCANISMO D’AZIONE DELL’OLIO DI MELALEUCA ALTERNIFOLIA (TEA TREE
OIL) NEI CONFRONTI DEL VIRUS DELL’INFLUENZA A
R. Timpanaro1, A. Garozzo1, G. Bisignano2, B. Bisignano1, A. Stivala1, A. Castro1
1 Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università di Catania
2 Dipartimento Farmaco-biologico, Università di Messina
In precedenti ricerche è stata dimostrata l’attività antivirale dell’olio di Melaleuca alternifolia (Tea tree oil) nei confronti del
virus dell’Influenza A/Puerto Rico 8/34 H1N1 (PR8) in cellule MDCK. La Melaleuca alternifolia è una pianta della famiglia
delle Myrtaceae presente solamente in alcune zone dell’Australia e nota fin dai tempi più antichi per le sue proprietà antisettiche.
Gli esperimenti di aggiunta delle sostanze durante il ciclo replicativo del virus influenzale hanno dimostrato un’attività inibente del TTO fino a concentrazioni di 0,00125%. I costituenti del TTO che hanno dimostrato attività antinfluenzale sono stati il
terpinem 4-ol, a-terpineolo ed il terpinolene. Non è stata dimostrata per tutti i composti una attività virucida nei confronti del
virus influenzale o un’attività protettiva nei confronti delle cellule MDCK.
Questa ricerca si basa sullo studio del meccanismo d’azione di questi composti nei confronti del virus dell’Influenza A.
Allo scopo di determinare quale fase del ciclo replicativo virale fosse inibita da questi composti sono stati condotti esperimenti di aggiunta della sostanza a tempi diversi dall’infezione. I risultati ottenuti hanno dimostrato un’interferenza sulle prime fasi
del ciclo replicativo virale; la massima riduzione dell’infettività è stata dimostrata quando la sostanza veniva aggiunta entro 2
ore dall’infezione.
Lo studio dell’interferenza del TTO e dei suoi componenti sulla fase d’adsorbimento, studiata con il test dei centri infettanti e
con l’inibizione dell’emoagglutinazione, ha dimostrato che questi composti non interferiscono sull’adsorbimento del virus.
Gli esperimenti atti a dimostrare una interferenza del TTO e dei suoi componenti sull’attività della neuraminidasi virale, con il
test di inibizione della neuraminidasi utilizzando oseltamivir come controllo positivo e ribavirina come controllo negativo,
hanno dimostrato che questi composti non inibiscono l’attività dell’enzima.
Infine, è stata studiata la possibile interferenza di questi composti sul compartimento intracellulare (lisosomi ed endosomi) utilizzando il test di colorazione vitale delle cellule MDCK con arancio d’acridina. Il trattamento delle cellule MDCK con TTO
provoca un innalzamento del pH intra-lisosomiale, dipendente dalla concentrazione e dal tempo d’incubazione, responsabile dell’attività antivirale.
ONICOMICOSI: ANALISI DEI DATI RELATIVI A QUATTRO ANNI DI ATTIVITA’ DELL’AMBULATORIO DI MICOLOGIA CLINICA A CATANIA
Greco A.M., Motta L.R., Trovato L., Oliveri S., Nicoletti G.
U.O. Laboratorio Analisi, A.O.U. Policlinico “G. Rodolico”, Università di Catania
Diversi studi epidemiologici sono stati pubblicati sulle onicomicosi e dati variabili si riscontrano sulla distribuzione degli agenti eziologici in relazione alla popolazione esaminata e alle tecniche di prelievo e di laboratorio utilizzati. In questo studio riportiamo l’analisi dei dati ottenuti in quattro anni (settembre 2003-agosto 2007) di attività dell’ambulatorio di Micologia clinica
presso il Policlinico di Catania.
Sono stati osservati, per sospetta onicomicosi, 825 pazienti: 250 maschi e 575 femmine. L’indagine micologica ha riguardato
le mani per 74 M (29,6%) e 198 F (34,4%) e i piedi per 176 M (70,4%) e 377 F (65,5%).
La diagnosi è stata confermata in 421 pazienti (51 %): 56 % nei maschi e 48,9% nelle femmine.
La positività dell’esame micologico, distribuita per sito e per sesso, nei maschi è stata pari a 45,9% e 60,2 %, rispettivamente
per le mani e per i piedi, mentre nelle femmine il 66,6% nelle mani e il 39,5% nei piedi.
Complessivamente, dai casi confermati di onicomicosi, sono stati isolati 507 ceppi: 291 (57,4%) lieviti e 216 (42,6%) ifomiceti, di cui il 45,8 % sono dermatofiti e il 54,2% non-dermatofiti.
Analizzando la distribuzione dei lieviti e degli ifomiceti relativamente al sito e al sesso abbiamo osservato che l’11,3 % di lieviti e il 3,7% di ifomiceti (37,5% dermatofiti e 62,5% non-dermatofiti) sono stati isolati dalle mani dei maschi, mentre nelle
femmine il 53% di lieviti e il 7,4% ifomiceti (31,2% dermatofiti e 68,7% non dermatofiti). Dai piedi dei maschi sono stati isolati il 10,6% dei lieviti e il 38,9% di ifomiceti (42,8% dermatofiti e 57,1% non dermatofiti) mentre nelle femmine il 25,1% di
lieviti e il 50% di ifomiceti (51% dermatofiti e 49% non dermatofiti).
Tra i lieviti, la Candida parapsilosis è stata la specie più frequentemente isolata (53%), seguita da C. albicans (25,1%) e altri
lieviti (21,9%). Tra i dermatofiti, Trichophyton mentagrophytes e Trichophyton rubrum sono le specie quasi esclusivamente isolate (99%), con una lieve prevalenza di T. mentagrophytes. Tra gli ifomiceti non dermatofiti il 43,6% appartengono al genere
Aspergillus, 30,8% al genere Scopulariopsis, 11,9% ad Acremonium, 9,4% a Fusarium ed il resto ad altri generi.
Dai dati epidemiologici si conferma il trend di crescita degli ifomiceti non dermatofiti quali agenti eziologici di onicomicosi e
l’importante ruolo di Candida parapsilosis sia a livello delle mani che dei piedi.
120
FREQUENZA DI CEPPI PANTON VALENTINE-POSITIVI IN STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILLINA-RESISTENTI
C. Grimaldi1,2, M. Cainarca2, M. La Francesca1, E. Borghi1 e G. Morace1
1Dipartimento di Sanità Pubblica – Microbiologia – Virologia, Cattedra di Microbiologia, Polo Universitario San Paolo,
Università degli Studi di Milano; 2 Laboratorio di Microbiologia, Azienda Ospedaliera San Paolo, Polo Universitario - Milano,
Italia.
I ceppi di Staphylococcus aureus meticillina- resistenti (MRSA) acquisiti in comunità (CA-MRSA) sono frequentemente produttori della leucocidina di Panton Valentine (PVL), una potente tossina dermonecrotica che conferisce a tali ceppi una particolare predisposizione a causare infezioni della cute e dei tessuti molli ed è inoltre associata a casi di polmonite necrotizzante.
L’importanza della PVL quale fattore di virulenza e la sua stretta correlazione con le infezioni da CA-MRSA, delle quali appare essere uno dei marker più tipici, ci hanno portato ad indagare la frequenza dei ceppi di S. aureus PVL positivi su un totale di
31, isolati da pazienti ambulatoriali afferenti all’Azienda Ospedaliera San Paolo di Milano nel periodo ottobre 2006- luglio 2007.
Come gruppo di controllo sono stati utilizzati 10 ceppi isolati nello stesso periodo da pazienti ospedalizzati.
I 41 ceppi sono stati caratterizzati fenotipicamente sia per l’accertamento della meticillina-resistenza sia per la positività al Dtest (resistenza inducibile a macrolidi-lincosamidi-streptogramina B). La possibile produzione della leucocidina è stata indagata mediante PCR, utilizzando primer derivati dalla letteratura. Quattro ceppi, esclusivamente appartenenti a MRSA isolati da
pazienti ambulatoriali (12.9%), presentavano una banda compatibile con la produzione di leucocidina; tale frequenza è in accordo con i dati della recente letteratura. Tre ceppi su quattro provenivano da campioni purulenti di origine cutanea, confermando
il ruolo patogenetico svolto dalla tossina.
Il lavoro prosegue sia con la ricerca della esotossina in tutti gli altri ceppi MRSA isolati nello stesso periodo da pazienti ospedalizzati, sia caratterizzando tutti i ceppi per l’elemento mobile responsabile della farmaco-resistenza (staphylococcal chromosomal cassette – SCCmec).
IDENTIFICAZIONE E SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI DI CEPPI DI LACTOBACILLUS spp.
ISOLATI DA PRODOTTI PROBIOTICI VAGINALI
Puglisi S., Fazio D., Pisano M., Samperi S., Ferranti C., Giummarra V., Mangiafico A., Blandino G.
Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Ginecologiche, Università degli Studi di Catania.
La normale flora batterica vaginale, principalmente costituita da specie di Lactobacillus, costituisce un importante e sofisticato
meccanismo di difesa dai microrganismi patogeni. Variazioni fisiologiche, attività sessuale, uso di contraccettivi orali, presenza
di stati patologici e terapie farmacologiche in atto, possono alterare l’ecosistema vaginale, e i prodotti probiotici ad uso vaginale, contenendo lattobacilli, possono contribuire a ripristinare il corretto equilibrio in tale ecosistema. Ma la sicurezza dei probiotici deve essere garantita tramite la ricerca di determinanti di resistenza agli antibiotici.
Recentemente il “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) Approved Standard M-45/A, (2006) ha pubblicato le linee
guida per effettuare il test di sensibilità agli antibiotici ed i criteri interpretativi di sensibilità ad alcuni antibiotici per
Lactobacillus spp..
In questo studio abbiamo saggiato la sensibilità a differenti classi di antibiotici di 4 ceppi appartenenti a 3 specie di
Lactobacillus (L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosus), isolati da 4 prodotti probiotici per uso vaginale. Di ogni prodotto è
stata determinata, mediante la tecnica della conta vitale, la carica dei lattobacilli, i quali sono stati identificati sia con un metodo fenotipico, in base all’esito di specifiche reazioni biochimiche (API 50 CH-L), sia con un metodo genotipico, estraendone il
DNA, amplificandolo mediante PCR, analizzando gli amplificati per elettroforesi su gel d’agarosio e visualizzandoli al transilluminatore UV.
L’antibiotico-sensibilità è stata determinata su micropiastra utilizzando la tecnica della microdiluizione in CAMHB-LHB (CLSI,
M-45/A, 2006) ed in LSM, incubando le piastre in condizioni aerobiche, anaerobiche e di microaerofilia. Le MIC sono state
interpretate utilizzando sia i breakpoint clinici suggeriti dal CLSI (2006), sia quelli microbiologici suggeriti dal “Feed Additives
and Products” (FEEDAP) (2005) per Lactobacillus spp., e da Florez et al. (2006).
Da questo studio è emersa corrispondenza tra i valori dichiarati in etichetta e la conta totale dei lattobacilli, e tra specie dichiarate in etichetta e specie isolate. Inoltre, lo studio ha confermato la resistenza intrinseca a vancomicina e aminoglicosidi, la sensibilità ad ampicillina, eritromicina, tetracicline e cloramfenicolo, nonché l’assenza di resistenza trasferibile nei ceppi in esame.
121
SENSIBILITÀ ANTIMICROBICA DI BATTERI ANAEROBI E AEROBI FACOLTATIVI ISOLATI DA
INFEZIONI OROFACCIALI
Blandino G.1, Milazzo I.1, Fazio D.1, Puglisi S.1, Pisano M.1, Speciale A.1, Pappalardo S.2.
1Dipartimento di Scienze Microbiologiche e Ginecologiche, Università degli Studi di Catania.
2Dipartimento Specialità Medico-Chirurgiche, Policlinico dell’Università degli Studi di Catania
Le infezioni orofacciali sono spesso polimicrobiche e possono essere causate sia da microrganismi esogeni che da quelli endogeni di origine parodontale. Informazioni riguardanti la sensibilità antibiotica dei patogeni più frequentemente coinvolti nelle
infezioni oro-facciali odontogeniche possono essere utili nella scelta di una efficace terapia antibiotica.
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare la sensibilità antibiotica di batteri anaerobi ed aerobi facoltativi, isolati da
pus prelevato da 55 pazienti con infezioni orofacciali.
Per i batteri anaerobi e aerobi facoltativi le MIC sono state determinate mediante microdiluizione in brodo secondo le lineeguida dell’NCCLS (1997), e per gli streptococchi viridanti come descritto dal CLSI (2006).
Nella Tabella sono elencati i batteri isolati, gli antibiotici saggiati, e le percentuali di sensibilità agli antibiotici. Tutti i ceppi di
streptococchi erano sensibili alle penicilline, a cefoxitin, imipenem e ciprofloxacina. Il 100% dei ceppi appartenenti a specie
anaerobiche gram-positive era sensibile ad imipenem e levofloxacina.
La produzione di b-lattamasi è stata dimostrata in tutte le specie anaerobiche gram-negative tranne C. rectus. Amoxicillina-clavulanato, cefoxitin, imipenem e metronidazolo inibivano il 100% dei ceppi appartenenti a specie anaerobiche gram-negative.
Questo studio dimostra che amoxicillina-clavulanato, cefoxitin, clindamicina e levofloxacina mantengono ancor oggi una buona
efficacia terapeutica nelle infezioni polimicrobiche oro-facciali.
Specie
(n.isolati b-lattamasi +/n. isolati)
Sensibilità (%)
P
A/C
CX
IP
E
DA
LEV
MTR
Streptococchi viridanti (0/18)
100
-
100*
100
83,3
88,8
100
-
G. morbillorum (0/5)
100
-
100
100
100
100
100
100
Actinomyces sp. (0/35)
97,1
-
100
100
85,7
94,2
100
40
Peptostreptococcus sp.(0/60)
93,3
-
93,3
100
53,3
93,3
100
100
Eubacterium sp. (0/6)
83,3
-
100
100
83,3
100
100
100
Propionibacterium sp. (0/2)
100
-
100
100
100
100
100
0
P. gingivalis (2/32)
93,7
100
100
100
90,6
93,7
93,7
100
Prevotella sp. (8/30)
73,3
100
100
100
90
100
93,3
100
F. nucleatum (1/18)
94,4
100
100
100
38,8
100
100
100
C. rectus (0/7)
100
100
100
100
85,7
100
100
100
B. forsythus (3/9)
66,6
100
100
100
88,8
100
100
100
B. ureolyticus (1/7)
85,7
100
100
100
42,8
85,7
100
100
Veillonella sp. (1/6)
83.3
100
100
100
83,3
100
100
100
P: penicillina, A/C: amoxi/clav, CX: cefoxitin; IP: imipenem, E: eritromicina, DA: clindamicina, LEV: levofloxacina, MTR:
metronidazolo; *cefotaxime.
122
RILEVAMENTO DI DNA DI PARVOVIRUS B19 IN TRE CASI DI MIOCARDITE ACUTA IN
SOGGETTI PEDIATRICI.
a,cZappalà D., a,cPalermo C.I., dG Sorge, dA. Sorge, bG. Bartoloni, eC. Lucenti, a,c Costanzo C.M., a,cRusso R.,
a,cScalia G.
aDipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche e bDipartimento ”Ingrassia” Università degli Studi
di Catania; cU.O. di Virologia Clinica; Laboratorio Centralizzato; dDipartimento di Pediatria, Azienda OspedalieroUniversitaria Policlinico “Gaspare Rodolico” di Catania; eU.O. Pediatria e Neonatologia, A.O. “Gravina”
Caltagirone (CT)
Il parvovirus B19 è l’agente etiologico del megaloeritema epidemico e di svariate altre patologie riconducibili direttamente o
indirettamente all’effetto anemizzante dato dall’infezione delle cellule eritroidi da aprte di questo virus. L’infezione cellulare è
mediata dal recettore P che si trova sulla superficie di molte linee cellulari. Si è dimostrato che tale recettore e presente anche
sulla superficie delle cellule miocardiche, fatto che conforta i recenti rilievi che evidenziano la presenza di DNA di parvovirus
B19 in alcuni casi di miocardite acuta.
Anche se tale rilievo appare essere occasionale, il nostro laboratorio ha messo a punto una metodica di seminested PCR che
viene impiegata per la ricerca del DNA di parvovirus B19 in tutti i casi di miocardite ad etiologia sconosciuta. In quest’ottica,
si è rilevata la presenza di DNA di parvovirus B19 in tre casi di miocardite acuta di grande rilievo in tre soggetti in età pediatrica.
Le indagini di laboratorio consistevano, oltre che nella ricerca del DNA specifico, anche nella valutazione delle IgG e delle IgM
anti-VP2 di parvovirus B19 mediante l’impiego di due kit commerciali di immunoenzimatica..
Le indagini sono state effettuate in dieci campioni patologici provenienti dai tre piccoli pazienti, di età compresa tra i sei mesi
ed i due anni, che provenivano da tre paesi diversi della provincia di Catania ma insistenti in una ristretta area geografica.
Nessuno dei bambini aveva mostrato segni clinici riferibili a “quinta malattia”.
Le IgG specifiche apparivano elevate in tutti i bambini mentre solo uno di essi presentava IgM.
I risultati relativi alla ricerca del DNA di parvovirus sono riassunti nella tabella e furono ulteriormente confermati mediante una
metodica commerciale di nested PCR.
I risultati ottenuti sembrano confermare che alcune forme di miocardite acuta potrebbero essere dovute a parvovirus B19 anche
in assenza di una sinomatologia evidente. Ciò dovrebbe portarci ad una maggiore attenzione nei confronti di questo virus in quei
casi di miocardite acuta che non presentino altra etiologia.
Patient
Serum
Blood
Biopsy
Liquor
Urine
S.S.
+
+
N.D.
N.D.
N.D.
D.A.
-
+
+
-
-
G.A.
+
+
+
N.D.
N.D.
123
LA DIAGNOSI DELLE INFEZIONI DA VIRUS COXSACKIE DI TIPO B IN PAZIENTI AFFETTI DA
MIOCARDITI O DA PERICARDITI
a,bCostanzo C.M., a,bPalermo C.I., a,b Zappalà D., a,b Russo R., cMonte I., a,b Scalia G.
aDipartimento di Scienze Microbiologiche e Scienze Ginecologiche, Università degli Studi di Catania; bU.O. di Virologia
Clinica; Laboratorio Centralizzato; cLab. Echo, U.O. Cardiologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria Policlinico “Gaspare
Rodolico” di Catania.
Il cardiotropismo di alcuni virus è ben noto sin dagli anni ’70 ed in questa direzione si sono sviluppati, anche in quegli anni,
numerosi studi.
L’avvento delle tecniche di biologia molecolare hanno fornito a questo settore, specie per ciò che attiene ai virus Coxsackie,
nuovo impulso diagnostico e si sono sviluppati numerosi studi che tendono a chiarire i meccanismi patogenetici.
I virus Coxsackie di gruppo B sono stati frequentemente collegati a miocarditi e/o a pericarditi. Tali patologie non sono necessariamente collegate ad una infezione primaria tanto che talvolta, data la capacità di persistenza di tali virus, la sintomatologia
può manifestarsi anche a seguito di una riattivazione dell’infezione, in soggetti certamente preimmuni.
Classicamente la diagnosi di infezione primaria, basandosi sulla sierologia, viene eseguita titolando le IgM specifiche ed evitando indagini più invasive e non sempre dirimenti; la diagnosi di reinfezione, invece risulta complessa specie nei casi in cui i
titoli delle IgG specifiche siano costantemente alti.
Il nostro gruppo si occupa da anni di questo tipo di indagini ed applica una sequenza di indagini che, logicamente, si adatta alla
situazione contingente del paziente da seguire, utilizzando tecniche sierologiche e biomolecolari.
Si propongono i dati relativi ad oltre cento pazienti affetti da miocardite (29%) o da pericardite (71%) e ad un gruppo di soggetti sani comparabili per età, sesso, provenienza e caratteristiche socio-economiche.
Da ciascun paziente si otteneva almeno un campione di siero che di norma veniva raccolto immediatamente dopo la diagnosi
cardiologica.
Ciascun campione veniva analizzato titolando in immunofluorescenza le IgG, le IgM e le IgA verso Coxsackie da B1 a B6 ed
effettuando anche la ricerca dell’RNA enterovirale.
Mentre i titoli delle IgG e delle IgM non apparivano significativamente diversi nei soggetti con patologia rispetto a quelli di controllo, i dati relativi alla titolazione delle IgA ed al rilevamento dell’RNA sembra possano essere considerati un valido ausilio
nella diagnostica di miocardite e pericardite a sospetta etiologia virale.
L’INFEZIONE DI CELLULE MICROVASCOLARI UMANE DA PARTE DI METAPNEUMOVIRUS
AUMENTA SELETTIVAMENTE LA SINTESI DI RANTES ED IP-10.
Sonia Caracciolo1, Daniele Rossi1, Rosalinda Bruno2, Arnaldo Caruso1, Simona Fiorentini1
1Università di Brescia, Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata Sezione di Microbiologia; 2Università della
Calabria, Dipartimento Farmaco-biologico, Sezione di Microbiologia;
L’infezione da metapneumovirus umano è una delle cause principali di patologie a carico del tratto respiratorio durante i primi
anni di vita con manifestazioni cliniche che vanno da un raffreddore comune a malattie più gravi, quali bronchite e bronchiolite. Data la recente identificazione (2001) del metapneumovirus, poco ancora si conosce sulla patogenesi di questo agente infettivo. Il virus ha come principale bersaglio le cellule epiteliali dell’apparato respiratorio dove induce effetti citopatici. E’ però
plausibile che durante l’infezione acuta anche altri tipi cellulari possano essere esposti ad una massiccia presenza di virus. I
nostri risultati dimostrano che hMPV è in grado di infettare le cellule microvascolari polmonari umane (HMVEC-LBI) in modo
persistente. Basse dosi di hMPV (0.1 M.O.I.) sono infatti sufficienti ad instaurare un’infezione produttiva nel 20-30 % delle cellule esposte al virus e questa percentuale rimane costante per tutto il tempo dell’osservazione (fino a 21giorni post-infezione).
Inoltre le HMVEC-LBI rilasciano continuamente particelle virali infettanti come dimostrato dalla quantificazione dei genomi di
hMPV presenti nei sopranatanti di coltura e dalla loro capacità di reinfettare nuovi bersagli cellulari (LLC-MK2). Dal terzo giorno post-infezione abbiamo osservato un aumento selettivo, da parte delle colture hMPV-infette , del rilascio delle chemochine
RANTES ed IP-10, due molecole chiave nello sviluppo di processi infiammatori a livello polmonare. L’induzione dell’espressione dei corrispondenti mRNA era evidente a partire da 24 ore post-infezione. La produzione di queste chemochine si manteneva ad alti livelli fino alla fine della coltura. RANTES veniva rilasciato in modo costante per tutta la durata dell’infezione (1.1
± 0.3 ng/ml). La produzione di IP-10 mostrava invece un andamento bifasico con un picco di produzione osservato a 3giorni
post-infezione (6.5 ± 1.3 ng/ml) ed un secondo picco a 15 giorni post-infezione (4.3 ± 1.6 ng/ml). Questi risultati lasciano ipotizzare che l’endotelio infetto possa svolgere un ruolo importante nello sviluppo delle patologie indotte da hMPV. L’endotelio
potrebbe infatti servire da serbatoio virale e, attraverso il rilascio IP-10 e RANTES, contribuire allo sviluppo del danno polmonare durante le fasi acute e croniche delle infezione da hMPV.
124
IL DOMINIO PE È RESPONSABILE DELLA TRASLOCAZIONE E LOCALIZZAZIONE DI PROTEINE SULLA SUPERFICIE DEI MICOBATTERI
Alessandro Cascioferro1, Giovanni Delogu2, Marisa Colone3, Michela Sali2, Annarita Stringaro3, Giuseppe Arancia3,
Giovanni Fadda2, Giorgio Palù1, e Riccardo Manganelli1.
1Dipartimento di Istologia, Micriobiologia e Biotecnologie Mediche, Università di Padova, Padova; 2Istituto di Microbiologia,
Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma; 3Dipartimento di Tecnologia e Salute. Istituto Superiore di Sanità, Roma.
Il genoma di Mycobaterium tuberculosis codifica per 100 proteine della famiglia PE. Tali proteine, a funzione sconosciuta, sono
caratterizzate da un dominio N-terminale ben conservato conosciuto come dominio PE. La proteina PE maggiormente studiata
è PE_PGRS33, coinvolta nella modulazione del sistema immunitario. Mediante l’uso di proteine chimeriche tra il dominio PE
e la proteina GFP o l’epitopo HA, abbiamo precedentemente suggerito che questa proteina fosse associata alla superficie e che
nel dominio PE risiedesse il segnale per la tale localizzazione. Al fine di meglio caratterizzare la localizzazione dei membri di
questa famiglia di proteine, abbiamo espresso in Mycobacterium smegmatis due proteine PE (PE_PGRS33 e Rv3097c) fuse con
l’epitopo HA ed abbiamo analizzato la loro localizzazione confrontandola con quella di una chimera formata dal solo dominio
PE con l’epitopo HA. Tutte le chimere sono risultate associate alla parete, ma solo le due chimere più grandi erano esposte direttamente all’esterno suggerendo che il dominio PE si localizzi nella parte più interna della parete, mentre ciò che ad esso è fuso
sporga verso l’esterno. A conferma di questa ipotesi il fatto che quando abbiamo fuso al dominio PE tre frammenti di misura
diversa della stessa proteina, solo quello più grande era direttamente esposto verso l’esterno. Infine, i batteri ricombinanti sono
stati trattati con detergenti a varie temperature per permettere il rilascio delle proteine associate alla pseudo-membrana esterna
tipica dei micobatteri. la proteina PE_PGRS33 è risultata estraibile in queste condizioni, suggerendo una sua localizzazione a
livello della membrana esterna. Ciò rappresenta un’informazione interessante in quanto fino ad oggi nei micobatteri a crescita
lenta nessuna proteina era stata localizzata in questo compartimento cellulare.
L’INCIDENZA DELLE INFEZIONI DA CATETERE VASCOLARE: DUE ANNI DI OSSERVAZIONE
R. Palermo*, M. Scutella’*, A. Di Stefano*, R. Gisi*, P. Picciano*, M. Barisciano*, E. Ciotoli*, R. Di Marco**
*P.O. “A. Cardarelli” Unita’ Operativa di Medicina di Laboratorio, Campobasso
**Dip di Scienze per la Salute, Univ. degli studi del Molise, Campobasso.
L’uso di biomateriali nella pratica medica solleva il problema molto serio della colonizzazione microbica del dispositivo di
impianto con la possibilità di causare una sepsi. L’incidenza delle infezioni correlate a cateteri venosi può variare significativamente a seconda delle caratteristiche chimico-fisiche dei dispositivi, del loro tempo d’impianto, del sito d’inserzione chirurgica
e del tipo di unità ospedaliera. Scopo del nostro lavoro e’ stato quello di valutare l’incidenza delle infezioni da catetere venoso
ed arterioso nel nostro Presidio Ospedaliero nel biennio 2005-06 anche in relazione ai diversi microorganismi responsabili dell’infezione.
I dati, riguardanti un numero di esami colturali confrontabili nel 2005 e 2006 raccolti e analizzati statisticamente, evidenziano
una percentuale di positività del 50.7% nel 2005 e del 42.1% nel 2006. La maggiore percentuale di positivita’ si evidenzia nei
reparti di terapia intensiva dove si fa largo utilizzo si cateteri vascolari. Infatti nel reparto di Rianimazione si registrava un 20%
di positività nel 2005 e 37.5% nel 2006 mentre nella Patologia Neonatale la percentuale era del 11.4% nel 2005 e del 25% nel
2006. I dati mostrano come le specie microbiche che risultano essere più frequentemente implicate sono Staphylococcus aureus
(29% nel 2005 e 30% nel 2006) e Staphylococcus epidermidis (33% nel 2005 e 38% nel 2006). Altri germi come Pseudomonas
aeruginosa, Enterobacter aerogenes, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis risultano responsabili di infezione da
catetere vascolare in percentuale nettamente inferiore rispetto a quelle causate dagli Stafilococchi
A parità di numero di esami colturali eseguiti, nel 2006 si e’ verificata una riduzione della percentuale di positività che e’ passata dal 50.7% del 2005 al 42.1% del 2006 Probabilmente l’applicazione più attenta delle norme di prevenzione nonche’ l’utilizzo di nuovi dispositivi refrattari all’adesione microbica hanno determinato una riduzione dell’incidenza delle infezioni da
catetere vascolare.
Il più efficace approccio alle infezioni da corpo estraneo rimane quindi la prevenzione unitamente alla realizzazione di dispositivi costituiti da biomateriali con adesi antibiotici o altre sostanze in grado di ritardare, e se possibile eliminare, la colonizzazione microbica.
125
STUDY OF THE GENOTYPIC RESISTANT PATTERN IN HIV-INFECTED POSTPARTUM WOMEN
AND CHILDREN FROM RURAL WESTERN CAMEROON
O. Turriziani, G.Russo, M. Lichtner, M.Bucci, A. Stano, G.Tsague, P.Maida,V. Vullo, G.Antonelli.
Department of Experimental Medicine, Virology Section, “Sapienza” University of Rome
Department of Infectious and Tropical Diseases, “Sapienza” University of Rome.
Dschang Hospital District, Cameroon.
The distribution of antiretroviral therapy resistance mutations among HIV-1 strains was evaluated in 40 postpartum women and
in 12 HIV-positive babies (7 newborns and 5 children) living in rural western Cameroon. Most of the women and all newborn
received a single dose of NVP to prevent HIV-1 mother to child transmission. Of the 52 viral strain examined 3 were subtype
B and 45 were classified into eight HIV-1 non-B subtypes, while four samples remained unclassifiable. Sequence analysis for
genotypic drug resistance in the RT gene revealed the presence of mutations associated with non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors resistance in 20% of the samples derived from NVP treated women, and in 57 % of treated newborns. Mutations
associated to nucleoside reverse transcriptase inhibitors (M184V in one case and V118I in four cases) were found in 4 samples,
although derived from antiretroviral ARV naïve subjects. As expected a higher frequency of mutations was found in protease
gene region. Seventy-nine percent of the sequences analyzed harboured 5 to 7 mutations. The secondary mutations showed
the typical PI resistance associated pattern for non-subtype B viruses, being M36I the predominant mutation (92,5% in women,
83% in babies). The other mutations frequently detected were K20I, L63P, H69K and I13V.
These findings confirm that resistance mutations can be detected in ARV naïve patients infected with non-B subtype and highlight the urgent need for studies assessing the impact of these mutations on the efficacy of subsequent antiretroviral therapy and
on the appearance of drug-resistance strains.
CONFRONTO TRA REAL-TIME PCR E ANTIGENEMIA PER LA DEFINIZIONE DELLA CARICA
VIRALE DI CITOMEGALOVIRUS IN PAZIENTI IMMUNODEPRESSI.
C.P. Pollara , E.Cariani#, F. Perandin, L. Terlenghi, A. Rodella, C. Bonfanti, N. Manca
Dipartimento di Diagnostica di Laboratorio, Servizio di Medicina di Laboratorio, Sezione di Microbiologia e Virologia,
Università degli Studi di Brescia e A.O. Spedali Civili, Brescia.
#Laboratorio di Patologia Clinica, Ospedale Civile S. Agostino-Estense, Modena
Introduzione. Il monitoraggio e la determinazione della carica virale in soggetti immunocompromessi sono importanti marcatori prognostici per seguire sia l’evoluzione dell’infezione da CMV che l’efficacia della terapia. Le tecniche utilizzate per
documentare la presenza di CMV sono diverse quali l’isolamento, l’antigenemia e la quantizzazione di CMV DNA.
Recentemente è stato messo a punto un nuovo metodo la Real-Time PCR, tecnologia più innovativa in grado di quantificare
il DNA con un range dinamico maggiore rispetto ai metodi di PCR end-point . Scopo del lavoro è stato quello di correlare i
livelli di antigenemia con la presenza di CMV DNA per definire i cut off di riferimento mediante quantizzazione della carica
virale in Real-time PCR.
Metodi. Retrospettivamente sono stati saggiati 475 campioni seriali provenienti da 156 pazienti immunocompromessi (trapiantati d’organo, pazienti con disfunzioni ematologiche, HIV/AIDS). In parallelo sono state eseguite la ricerca dell’antigene
pp65 e la carica virale .
Risultati. 136 campioni su 475 sono risultati positivi per la presenza di CMV, provenienti da 48 pazienti che avevano sviluppato una infezione attiva.106 campioni sono risultati CMV DNA positivi e antigene pp65 negativi, 27 campioni positivi per
entrambi e 3 campioni solo antigene pp65 positivi. L’infezione sintomatica è stata riscontrata in 5 pazienti (4 bambini trapiantati di midollo e 1 trapiantato di rene) su 48 considerati con infezione da CMV.
L’analisi statistica (curva ROC ) sui pazienti sintomatici ha identificato come cut off predittivo di infezione sintomatica per
l’antigene pp65 il valore pari a 13 cellule positive/200000 e per il CMV DNA pari a 7500 copie/ml; nei 48 pazienti il cut
off di riferimento di CMV DNA è risultato di 11500 copie/ml, ma diversi livelli plasmatici di CMV DNA sono stati osservati
a seconda del gruppo a rischio .
Conclusioni. L’introduzione della Real-time PCR nella diagnosi di infezione da CMV ha permesso
di ottenere una quantizzazione del DNA piu’ affidabile. I livelli di CMV DNA ottenuti sono statisticamente correlati ai valori
di antigenemia. E’ stato possibile ricavare livelli di cut off di CMV DNA predittivi di positività per l’antigene pp65 nei diversi
gruppi di pazienti.
126
TIPIZZAZIONE MEDIANTE PCR DI UREAPLASMA PARVUM E UREAPLASMA UREALYTICUM
M.A. De Francesco, R. Negrini, M. Gelmi, G. Pinsi, G. Ravizzola, N. Manca
Cattedra di Microbiologia, Università degli studi di Brescia
SMEL- U. O. Microbiologia e Virologia, Spedali Civili, Brescia
Ureaplasma parvum e Ureaplasma urealyticum sono specie incluse nel genere Ureaplasma. Tali microrganismi sono comuni commensali che si
trovano sulle mucose, soprattutto nel tratto respiratorio ed urogenitale. Tuttavia essi sono stati associati a diverse patologie umane quali l’uretrite
acuta e cronica non gonococcica, cistite, pielonefrite, vaginiti, cervicite cronica. E’ stato dimostrato che tali microrganismi possono svolgere un
ruolo importante nella genesi dell’aborto spontaneo, nella rottura prematura delle membrane (RPM), nel parto pretermine, nelle infezioni placentari, nelle corioamnioniti, nelle endometriti purperali ed infine nelle infezioni del tratto respiratorio e meningite neonatale. Inoltre, l’infezione da
micoplasma può essere responsabile dell’infertilità femminile e maschile. A causa della frequenza con cui il genere Ureaplasma si isola da soggetti sani asintomatici, è stata avanzata l’ipotesi che solo certi sottotipi della specie sono associati a determinate infezioni.
Esistono 14 serovars di U. urealyticum che sono suddivisi in due distinti clusters o biovars: biovar 1 o parvo biovar, e biovar 2 o T960. I ceppi del
biovar 1 (serovars 1, 3, 6, e 14) sono inclusi nella specie di U. parvum; mentre i ceppi del biovar 2 o T960 (serovars 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e
13) vengono inclusi nella specie di U. urealyticum. Lo scopo di questo studio è stato valutare: 1) la distribuzione delle due specie di Ureaplasma,
dei sottotipi di U. parvum in un gruppo di pazienti afferenti all’ambulatorio microbiologico degli Spedali Civili di Brescia; 2) la associazione dei
vari sierotipi di Ureaplasma con una specifica sintomatologia clinica, l’età e cambiamenti della flora vaginale (riduzione od assenza di lattobacilli), nonché la presenza di microrganismi associati. Di 806 soggetti analizzati, 139 erano positivi per U. urealyticum con una frequenza di isolamento
del 21%. All’interno dei 139 soggetti positivi per U. urealyticum sono stati selezionati 92 pazienti e tipizzati mediante PCR. In 80 soggetti (87%)
è stato isolato U. parvum, mentre in 12 (13%) è stato identificato U. urealyticum. I campioni positivi per U. parvum sono stati ulteriormente sottotipizzati nei vari biovars mediante PCR. Il serovar maggiormente rappresentato era il serovar 1 (32 soggetti, 40%), seguito dal serovar 3/14 (29
soggetti, 36 %) e dal serovar 6 in 19 soggetti (24 %). Il 43% dei soggetti era asintomatico con analisi della ricerca di ureaplasma effettuata solo
per screening in corso di gravidanza o per infertilità. Il microrganismo maggiormente associato agli ureaplasma era Gardnerella vaginalis responsabile di vaginosi batterica; rara l’associazione con Candida spp. e assente la contemporanea infezione con il genere Clamidia. Il serovar maggiormente implicato nel determinare una sintomatologia clinica in assenza di altri microrganismi patogeni ed accompagnato spesso da una riduzione della flora lattobacillare era il 3/14 indicando che questo particolare sierotipo potrebbe essere dotato di una maggiore virulenza rispetto agli
altri. Al contrario il serovar 6 era presente solo in soggetti asintomatici, mentre il serovar 1 era presente in uguale percentuale sia nei soggetti sintomatici, spesso associato ad altri microrganismi patogeni, che nei soggetti asintomatici.I risultati del presente studio dimostrano l’importanza di
associare la ricerca specifica dei vari sierotipi di ureaplasma alle indagini microbiologiche di base. Tali analisi consentirebbero sia di confermare
una associazione tra specifici serovars e patologie uro-genitali che di evitare terapie inutili o inefficaci dirette verso altri patogeni.
DIAGNOSI SIEROLOGICA DI INFEZIONI DA HIV 2: CONFRONTO TRA WESTERN BLOT NEW LAV
BLOT II E PEPTI-LAV 1-2.
Rodella A1., Terlenghi L1., Pollara C.P1., Gargiulo F1., Bonfanti C2., Perandin F2., Torti C3., Costarelli S.3., Manca N2.
1U.O. Microbiologia, Azienda Ospedaliera, Spedali Civili di Brescia; 2Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata,
Sezione di Microbiologia, Università degli Studi di Brescia;
3Istituto di Malattie Infettive e Tropicali, Università degli Studi di Brescia;
Il virus dell’ Immunodeficienza Umana di tipo 2 (HIV-2) è stato scoperto nel 1986. Questo virus è endemico soprattutto
nell’Africa occidentale ma è presente anche in alcune zone dell’Asia, India, Stati Uniti ed Europa occidentale. In seguito a flussi migratori anche in zone non endemiche quali l’Italia, iniziano a comparire casi di sospetta infezione. La diagnosi sierologica
di infezione da HIV2 prevede l’impiego di saggi immunoenzimatici per la ricerca degli anticorpi e l’utilizzo di metodi di conferma Western Blot (WB). L’elevato grado di omologia dei virus HIV1 e HIV2 rende spesso difficile l’interpretazione del test
di conferma WB.
In questo studio abbiamo analizzato 28 campioni, provenienti da altrettanti pazienti con sospetta infezione da HIV2, utilizzando il test di conferma New Lav Blot II (Bio-Rad) che impiega come fase solida un lisato virale HIV2. Secondo i criteri WHO
12/28 campioni sono stati classificati positivi per HIV2 e 16/28 indeterminati.
Gli stessi campioni sono stati analizzati anche con il saggio Pepti-Lav 1-2 (Bio-Rad), un metodo di immunoblotting che utilizza due peptici sintetici gp 41 e gp 36 specifici rispettivamente per HIV 1 e HIV 2.
I risultati ottenuti sono i seguenti: 6/12 campioni positivi al WB HIV 2 erano reattivi per la proteina gp36 del Pepti-Lav 1-2
confermando l’infezione da HIV2, 2/12 erano reattivi sia per gp36 HIV 2 che per gp41 di HIV 1 e 4/12 campioni riconoscevano solo la proteina ricombinante specifica per HIV 1. I 16 campioni risultati indeterminati con WB HIV2, analizzati con Pepti
Lav 1-2, hanno dato i seguenti risultati: 14/16 reattivi solo per gp41 confermando l’infezione da HIV1 , 2/16 presentavano un
pattern anticorpale tipico da coinfezioneHIV1-2 in quanto reattivi per i due peptici virali.
Questo studio, seppur preliminare, indica che per documentare casi di infezione da HIV2 o di confezione HIV1-2 può essere
utile affiancare al test WB l’utilizzo di saggi che impiegano peptici sintetici in grado di discriminare HIV 1, HIV 2.
L’implemento e l’utilizzo di metodi di isolamento virale e di biologia molecolare permetterà di discriminare non solo se l’individuo è infettato dall’uno o dall’altro virus ma anche dai vari sottotipi A e B di HIV 2.
127
PREVALENZA, CARATTERIZZAZIONE VIROLOGICA E RISPOSTA TERAPEUTICA IN UNA COORTE DI PAZIENTI HIV-2 INFETTI
Silvia Costarelli1, Carlo Torti1, Anna Rodella2, Luigina Terlenghi2, Fausto Baldanti3, Stefania Paolucci3, Giuseppe Lapadula1,
Nino Manca2, Eugenia Quiros-Roldan1, Ilaria Izzo1, Giampiero Carosi1
1Istituto di Malattie Infettive e Tropicali, Università di Brescia; 2Istituto di Microbiologia, Università di Brescia; Servizio di
Virologia, 3IRCCS Policlinico S. Matteo, Pavia
Introduzione. La prevalenza di HIV-2 in Italia non è nota. La mancanza di metodiche standardizzate e l’incompleta conoscenza dell’efficacia dei farmaci antiretrovirali complicano il management di HIV-2.
Obiettivi. Valutare:
- la prevalenza di HIV-2 in pazienti HIV-positivi; - l’ impiego di metodiche virologiche nel monitoraggio; - la risposta ai regimi antiretrovirali.
Materiali e metodi.
Sono stati valutati tutti i pazienti extra-comunitari HIV-positivi presso la Clinica di Malattie Infettive di Brescia e pazienti con andamento viro-immunologico “discordante” (carica virale HIV-1 negativa o bassa e decremento dei CD4+). Per porre diagnosi di infezione da HIV-2 è stato utilizzato il test W-B specifico per HIV2 (New-lav BlotII , Bio-Rad). La carica virale di HIV-2 è stata determinata secondo F. Damond et al. (J Clin Microbiol, 2002) e il test di resistenza tramite PCR del gene pol.
Risultati.
16/151 (11%) pazienti sono risultati HIV-2 positivi (14/141 dall’Africa sub-sahariana). Tre pazienti non erano in terapia per elevati
CD4+ (1 di questi mostrava le seguenti mutazioni/sostituzioni in RT di HIV-2:
69N+75I+101A+118I+181I+188L+190A+210N+215S+219D e 63E+71V+77I in Pro). Due pazienti hanno iniziato la HAART (uno
ha risposto a terapia includente lopinavir/ritonavir, uno ha fallito la terapia includente fosamprenavir/ritonavir ma il salvataggio con
saquinavir/ritonavir è risultato efficace). Cinque pazienti erano experienced al momento dello screening. Di questi, 3 hanno risposto
a regimi includenti lopinavir/ritonavir e 1 a saquinavir/ritonavir. L’ultimo paziente con follow-up disponibile è stato impropriamente
trattato con farmaci inefficaci su HIV-2, accumulando numerose mutazioni/sostituzioni aminoacidiche e rendendo di fatto inefficaci
i regimi di salvataggio con i farmaci attualmente disponibili.
Conclusioni.
Accurati programmi di screening e l’utilizzo di metodi virologici dovrebbero essere implementati vista l’alta prevalenza di questa infezione nella popolazione degli immigrati. Farmaci la cui efficacia anti-HIV-2 è attualmente discussa (es. lopinavir/ritonavir) si sono dimostrati efficaci nella nostra popolazione. Sono necessari ulteriori studi per valutare i regimi maggiormente attivi in pazienti HIV-2 positivi.
VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ ANTIBATTERICA DELL’OZY NELLA PRARADONTOPATIE.
A. Pallenzona, S. Cagnacci,E.A. Debbia
SEz. Microbiologia DISCAT, Università di Genova.
Obbiettivo: L’Ozy è uno strumento utilizzato nella disinfezione delle mucose del cavo orale e di altre superfici corporee. In
questo studio sono stati valutati gli effetti del campo elettromagnetico e dell’ozono generati da Ozy su pazienti affetti da parodontopatie.
Materiali e Metodi: Il prelievo della placca di 4 pazienti è stato eseguito mediante l’introduzione nella tasca gengivale di 2 coni
di carta lasciati per almeno 30”. Il trasporto dei campioni al laboratorio è avvenuto utilizzando un appropriato terreno pre-ridotto per consentire la sopravvivenza dei germi anaerobi. L’impiego di diversi terreni ricchi e selettivi ha permesso di valutare
mediante diluizioni seriali del campione la carica batterica totale e delle specie patogene.
Risultati: In 3 campioni provenienti da 3 dei 4 pazienti arruolati il trattamento con ozono terapia ha provocato una riduzione di
circa il 50% della carica totale batterica, con variazioni oscillanti dal 35-60% in funzione della singola specie. In due casi l’esame batteriologico non ha più evidenziato la presenza di specie patogene. Nel campione proveniente dal quarto paziente l’effetto dell’ozono terapia ha causato una riduzione non significativa della carica batterica totale.
Conclusioni: L’ozono terapia si è dimostrata efficace nel ridurre la carica batterica patogena e non a livello delle tasche parodontali favorendo il processo di guarigione in 3 pazienti su quattro. Ulteriori studi sono necessari per valutare questo tipo di terapia su un numero maggiore di soggetti.
128
ANALISI DELLE VARIAZIONI NELLA COLONIZZAZIONE DA CANDIDA SP. IN TERAPIA INTENSIVA NEONATALE
Trovato L., Oliveri S., °Betta P., °Romeo M.G., Nicoletti G.
U.O. Laboratorio Analisi, A.O.U. Policlinico “G. Rodolico” Catania
°U.O. Terapia Intensiva Neonatale, A.O.U. Policlinico “G. Rodolico” Catania
La colonizzazione da Candida è uno dei fattori di rischio significativamente associato allo sviluppo di infezioni sistemiche.
Circa il 60% dei nati pretermine ricoverati in Terapia Intensiva Neonatale (TIN) risulta colonizzato dopo il primo mese di vita.
In questo studio di tipo retrospettivo riportiamo l’analisi dei dati relativi allo studio della colonizzazione nei nati pretermine
ricoverati presso la TIN del Policlinico di Catania negli anni 2005, 2006 e nei primi 6 mesi del 2007.
Nell’anno 2005, dei 302 nati pretermine ammessi in TIN, 250 (82,8%) sono stati sottoposti ad indagini micologiche riguardanti lo studio della colonizzazione per un totale di 1743 esami. Il 30,4% sono risultati colonizzati da Candida e la specie più frequentemente isolata è stata C. albicans con il 76,3%, seguita da C. parapsilosis (13%), C. glabrata (7,8%), C. tropicalis e C.
krusei con l’1,3%. Nel 2006 gli ammessi in TIN sono stati 379 e di questi l’80,9% sono stati sottoposti ad indagini micologiche
per un numero di esami pari a 2017. Dei 341 pazienti, solo il 16,7% sono risultati colonizzati e C. albicans si conferma la specie più frequentemente isolata (64,9%) seguita da C. parapsilosis (24,5%), C. glabrata (8,7%) e C. krusei con l’1,7%. Infine,
nel primo semestre 2007 i ricoverati sono stati 230 con 96,5% di essi sottoposti ad indagini micologiche per un numero complessivo di esami pari a 1243. Nei 165 pazienti presi in esame si è osservata una percentuale di colonizzazione pari a 12,1%.
Oltre alla riduzione della percentuale di colonizzazione è stata rilevata una variazione relativa alla frequenza della specie. La C.
glabrata, infatti, con una percentuale pari al 50% è risultata la specie più isolata, seguita da C. albicans (20%), C. parapsilosis
(15%), C. guilliermondi, C. kefyr e C. lusitaniae con lo 0,05% rispettivamente. Fra i diversi fattori che concorrono a spiegare
tale fenomeno, riteniamo che i più importani siano l’uso della profilassi antifungina con fluconazolo, la supplementazione con
il probiotico Lactobacillus reuteri, implementata nell’anno 2007, dal momento che la reuterina, prodotta da questo ceppo, avrebbe un’azione inibente specifica nei confronti di C. albicans, ed infine una possibile diffusione in reparto di C. glabrata a partire da un caso specifico di sepsi sviluppatosi in un nato pretermine con fistola retto vescicale.
PREVALENZA DEL GENE AAC(6’)-Ib NELLA SUA VARIANTE –cr IN CEPPI DI ESCHERICHIA COLI
DI ISOLAMENTO URINARIO RACCOLTI NEL 2004 E NEL 2006
1Rosario Musumeci, 1Valentina Galimberti, 1Anna Careddu, 2Giuseppe Giltri, 2Simone Bramati e 1Clementina Cocuzza
1 Laboratorio di Microbiologia, Facoltà di Medicina e Chirurgia – Università di Milano-Bicocca
2 Unità di Microbiologia, Azienda Ospedaliera San Gerardo – Monza
Negli ultimi anni è stata riportata da Robicsek e coll, in Asia prima, negli Stati Uniti e in Europa più recentemente, la diffusione di ceppi batterici quali Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp, esprimenti un particolare enzima aminoglucoside acetil-transferasi, codificato dal gene aac(6’)-Ib e responsabile delle resistenza agli aminoglucosidi kanamicina, amikacina e tobramicina.
Tra le trenta varianti conosciute di questo gene, la variante aac(6’)-Ib-cr, isolato per la prima volta in Cina nel 2003, è caratterizzato da due mutazioni caratteristiche Trp102Arg e Asp179Tyr.
A tale variante è stata recentemente associato da Robicsek e coll, un nuovo meccanismo di resistenza specifico per la classe dei
fluorochinoloni, grazie alla proprietà di acetilare l’azoto non sostituito nell’anello piperazinico in posizione C7 della struttura
fondamentale, proprio di alcuni membri di questa classe antibiotica. La conseguente modifica della molecola sarebbe alla base
della diminuzione dell’attività battericida di molecole quali norfloxacina e ciprofloxacina, con un conseguente aumento della
resistenza a tali composti stimato, tra le varie specie saggiate, in circa quattro volte il valore normale della) concentrazione minima inibente di antibiotico (MIC). Le caratteristiche di tale variante genica aac(6’)-Ib-cr sono quelle di far acquisire al clone batterico che esprime tale gene la resistenza ad alto livello a diversi membri della classe degli aminoglucosidi (tobramicina, amikacina, gentamicina), di essere trasferibile orizzontalmente attraverso plasmidi che recentemente sono stati caratterizzati anche
per trasferire geni associati a beta-lattamasi a spettro esteso (ESbL).
Sono stati valutati ceppi di Escherichia coli collezionati da urinocolture positive raccolti nel 2004 e nello stesso periodo del 2006
presso l’Ospedale San Gerardo di Monza.
La positività per il gene aac(6’)-Ib-cr è stata confermata solo nei ceppi con valori di MIC alla norfloxacina e alla ciprofloxacina rispettivamente > 16 e > 4 mg/ml e ha evidenziato una prevalenza, per i ceppi del 2004, del 5,8% (3/52), mentre per i ceppi
del 2006 tale percentuale è salita al 11,6% (8/69). Tra i primi, due su tre risultano essere ESbL-positivi, mentre tra i secondi 7/8
sono ESbL-positivi.
129
VALUTAZIONE DEL SISTEMA AUTOMATICO NUCLISENS EASYMAG PER L’ESTRAZIONE
DEGLI ACIDI NUCLEICI DA DIFFERENTI MATRICI BIOLOGICHE.
Perandin F. 1, Pollara C.P. 2,Pinsi G. 2, Gargiulo F. 2, Rodella A. 2, Terlenghi L. 2, Manca N. 1
1Dipartimento di Medicina Sperimentale ed Applicata, Sezione di Microbiologia, Università degli Studi di Brescia; 2U.O.
Microbiologia, Azienda Ospedaliera Spedali Civili di Brescia.
Lo sviluppo e la disponibilità di sistemi di amplificazione genica che consentono di rivelare e quantificare la presenza di acido
nucleico da vari tipi di campioni biologici ha reso necessario introdurre metodi di estrazione accurati in grado di estrarre DNA
ed RNA da differenti matrici biologiche.Nel nostro studio abbiamo comparato il sistema manuale QIAamp (Qiagen) e Roche
con il sistema Nuclisens EasyMAG (Biomerieux) analizzando 349 campioni suddivisi in 209 campioni di siero di CMV, 70
campioni di siero di EBV, 29 campioni di plasma di HIV e 41 campioni per micobatteri provenienti da coltura solida/liquida ed
espettorati. L’estrazione dei campioni di CMV, EBV ed HIV è stata condotta parallelamente con sistema QIAamp utilizzando,
sia nel sistema manuale sia in quello automatico, per CMV ed EBV 200 µl di siero ed eluito il DNA in 50 ul, per HIV 1 ml di
plasma ed eluito l’RNA in 25 µl. I campioni di micobatteri sono stati estratti manualmente con il sistema Roche-modificato che
prevede l’impiego di 200 µl di campione il cui DNA viene eluito nel medesimo volume mentre, con il sistema automatizzato,
200 µl di campione sono stati portati ad 1 ml con fisiologica e bollito per 10 minuti, quindi sottoposto ad estrazione ed eluito
il DNA in 25 µl. La quantificazione di CMV ed EBV è stata eseguita con il sistema commerciale di Real-time PCR (Nanogene)
ed i risultati ottenuti sono i seguenti:
CMV
Manuale
Automatico
EBV
Manuale
Automatico
POS
31
49
POS
11
11
NEG
178
160
NEG
59
59
TOT
209
209
TOT
70
70
I campioni di plasma di HIV (range di viremia: 100x103-100 copie/ml) sono stati sequenziati con il sistema Visibile Genetics
(Siemens): 5 su 29 campioni con viremia inferiore a 250 copie/ml presentavano un elettroferogramma illeggibile e 24 campioni con viremia superiore hanno prodotto una sequenza leggibile di pari qualità a quella ottenuta dai campioni sottoposti ad estrazione manuale. I campioni di micobatteri sono stati amplificati ed identificati con il sistema INNOLipa (Innogenetics): tutti i
campioni processati a partire da terreno di coltura liquido (15) e solido (10) sono stati amplificati ed identificati correttamente
mentre i campioni estratti direttamente da espettorato (16) sono stati identificati nel 50 % dei casi (8/16), mentre in 3 è stato
definito solo il genere (18%) e 5 hanno dato risultato negativo.
L’estrattore Nuclisens easyMAG si è dimostrato valido nell’estrazione di CMV, EBV, ed HIV sebbene in quest’ultimo virus sia
stata riscontrata una minor sensibilità per i campioni con meno di 250 copie/ml. Per quanto riguarda i micobatteri, il sistema ha
dato buoni risultati quando l’estrazione è stata condotta dalla coltura mentre sono stati osservati dati sconfortanti per i campioni provenienti da espettorato. Inoltre il sistema EasyMAG non ha mai prodotto cross-contaminazioni, tutti gli estratti erano privi
di inibitori di amplificazione ed il tempo di impegno dell’operatore è notevolmente ridotto.
130
INDICE DEGLI AUTORI
A
L.A.
M.C.
P.
M.
A.
S.
F.
B.
V.
D.
G.
T.
M.G.
A.
F.
S.
S.
M.
M.
A.
S.
G.
S.
L.
G.
M.C.
F.
A.
C.
M.
S.
A.
A.
M.
A.
M.
S.
V.
Y.
L.
S.
M.
A.
Abelli
Affinita
Aiello
Albani
Alberti
Alcaro
Alessandrini
Allione
Allizond
Alotto
Amaddeo
Amato
Ammendolia
Amodeo
Andreola
Andreoni
Andreotti
Angelico
Annunziata
Antinori
Antonelli
Antonelli
Aquaro
Aquilanti
Arancia
Arcangeletti
Ardito
Ardizzoni
Argentini
Arigò
Arista
Arnaldo
Artese
Artini
Ascolani
Ascolani
Astegiano
Astone
Auffray
Auricchio
Avilia
Avolio
Azzi
97
76
106
96
60
62
42
70
83
89
8
95
73
90
99
102
83
17
80
62
45
45
58
34
125
23
62
95
44
71
106
40
62
5
47
47
51
55
111
81
74
43
59
Baglieri
Bailo
Baldanti
Baldassarri
Baldi
Baldracchini
Balestrieri
Balzarini
Banche
Bandettini
Barale
Barbui
Barilà
Barisciano
Barreca
Bartoloni
Batoni
Battista
Bavarese
Bellacicco
Belletti
Bellini
Benachour
Bendinelli
Benecchi
Beninati
Berardi
Bergallo
113
84
128
18
89
118
24
58
83
87
117
83
117
125
46
123
57
48
76
75
78
117
111
43
62
71
102
51
63
84
91
85
92
84
63
126
63
49
113
118
86
101
63
64
64
87
88
89
82
B
R.
E.
F.
L.
S.
F.
E.
J.
G.
R.
R.
A.
L.
M.
G.
G.
G.
M.
R.
A.L.
D.
I.
A.
M.
M.
C.
A.
M.
114
F.
M.G.
F.
A.
T.
A.
P.
H.
A.
C.
G.
B.
F.
G.
A.R.
G.
E.
S.J.P.
I.
R.
D.
S.
C.
D.
S.
S.
C.
F.
S.
M.
E.
D.
P.
F.
L.C.
L.
S.
G.
S.
F.
R.
P.
S.
F.
P.
R.
C.P.J.M.
R.
M.
E.
C.
Berlutti
Bernengo
Berrilli
Bertoli
Bertuccio
Bessegato
Betta
Bierne
Biolchini
Biondo
Bisignano
Bisignano
Bistoni
Blaiotta
Blanco
Blandino
Blasi
Bogaards
Bon
Bona
Bonanni
Bonardelli
Bonfanti
Bongiorno
Bono
Bonora
Bonura
Bonvicini
Borbone
Borderi
Borghi
Bottai
Bottalico
Bottari
Bottaro
Bracciale
Bramati
Branca
Brancatelli
Branciforte
Bressan
Brigidi
Brinster
Broccolo
Brodin
Brosch
Brouwer
Bruno
Bucci
Buommino
Buonavoglia
93
88
63
17
115
99
129
60
55
71
33
120
47
104
105
119
95
52
42
87
48
40
126
115
62
63
94
57
115
42
121
57
69
117
87
109
129
113
53
90
93
15
60
35
57
57
52
11
126
80
75
Caccamo
Cacopardo
Cafiso
Caggia
Caggiano
Cagnacci
Caiazza
Cainarca
Calà
Calderaro
Calò
Calugi
Calvez
Cambieri
Camera
Camero
Camilli
Camilloni
Cammarota
Campa
Campa
Campanile
119
44
115
28
48
128
77
121
94
6
113
45
62
88
74
75
92
101
113
20
117
115
89
72
98
76
105
78
107 120
74
121
118
122
49
127
95
103
110
69
124
81
97
102
C
47
64
84
85
87
88
89
C.
B.
V.
C.
G.
S.
M.
M.
C.
A.
L.
G.
V.
I.
A.
M.
R.
B.
G.
M.
D.
F.
64
95
38
39
52
57
119
L.
L.
F.
G.
A.
S.
N.
M.
C.
R.
A.P.
V.
S.
A.
D.
F.
A.M.
E.
N.A.
J.M.
I.
S.
G.
F.
A.
A.
E.
E.
A.
C.
M.
A.
G.
M.R.
S.
P.
R.
R.
M.
A.
A.L.
L.
F.
G.
F.
L.
M.
L.
H.
P.
C.
E.
C.
Campion
Campitelli
Canganella
Cangiano
Canitano
Cannas
Canozo
Cantarella
Capasso
Capicotto
Caputi
Caraccio
Caracciolo
Carbini
Carcò
Cardona
Careddu
Cariani
Carlone
Carlton
Caronte
Caroppo
Carosi
Carta
Caruso
Cascioferro
Caselli
Cassai
Cassone
Castagnoli
Castellazzi
Castro
Catamo
Catania
Catone
Cattani
Cauda
Cavallo
Cavallo
Cavallo
Cavalot
Ceccherini-Nelli
Ceccherini-Silberstein
Ceci
Celandroni
Cellini
Ceragioli
Ceresa
Ceri
Cerini
Cermelli
Cervi
Chezzi
U.
L.
F.
A.
S.
E.
M.
L.
A.
V.
F.
M.
C.
M.
S.T.
A.
L.
C.
B.
M.
B.
R.
S.
M.
M.
V.
P.
C.
Chiacchio
Chisu
Chiuppesi
Ciabattini
Cicetti
Ciotoli
Ciotti
Civitelli
Civra
Clausi
Clementi
Coci
Cocuzza
Colafigli
Cole
Coletti
Colla
Colomba
Colombari
Colone
Colonna
Coppola
Coppola
Cornaglia
Corrente
Cosco
Cosimo
Costa
99
59
12
107
44
38
82
54
76
46
12
70
11
34
54
18
35
126
83
21
96
73
128
100
11
125
52
52
29
88
55
120
80
74
44
109
15
14
102
89
84
96
62
48
50
69
107
107
58
61
95
40
6
62
64
100
43
53
45
125
17
56
51
59
34
116
35
109
57
45
87
106
118
125
105
6
104
51
75
46
46
51
C.M.
S.
S.
A.
R.
G.
A.
M.C.
M.
A.M.
A.M.
124
85
99
43
124
116
79
110
108
51
112
87
88
89
63
105
112
118
23
86
38
97
39 49
101 119
45
129
110
87
44
127
49
53
18
114
118
114
38
83
53
M.
E.
M.
A.
F.
P.
M.
D.
D.
A.
R.
M.
R.
E.
G.
F.
E.
P.
A.
M.A.
O.
S.
V.
E.
A.
C.
A.
R.
F.
M.
E.A.
G.
T.
M.
M.
M.
D.
G.
C.
V.
S.
A.
A.
D.
G.
D’Abramo
D’Addetta
D’Agostino
D’Agostino
D’Ambrosio
D’Ancona
D’Angelo
D’Antonio
D’Archivio
d’Arminio Monforte
D’Arrigo
D’Arrigo
Daturi
De Benedictis
De Chiara
De Conto
De Crignis
De Filippis
De Filippis
De Francesco
De Giglio
De Grazia
De Gregorio
de Heer
De Logu
De Luca
De Luca
De Philippis
De Robertis
De Rosa
Debbia
Deinite
Del Gaudio
Del Grosso
Del Pezzo
del Piano
Delfino
Delogu
Demangel
Demelio
D’Ercole
Deriu
Desogus
Dessì
Dettori
G.L.
S.
G.
E.
D.
A.
S.
M.
D.
V.
R.
P.
M.
E.
D.
G.
G.
R.
A.
A.
N.
N.
Devoto
Di Bartolomeo
Di Bonaventura
Di Campli
Di Cave
Di Franco
Di Giambenedetto
Di Giulio
Di luca
Di Marco
Di Marco
Di Marco
Di Martino
Di Molfetta
Di Paolo
Di Perri
Di Salvo
Di Stefano
Di Stefano
Di Taranto
Di Vincenzo
Diaz
75
105
79
82
92
92
80
104
80
62
62
98
96
58
56
49
42
63
81
127
48
106
82
52
100
79
109
13
51
82
70
54
48
92
68
93
78
62
57
115
80
68
100
21
6
86
87
69
93
69
63
109
109
69
52
53
125
45
76
69
17
63
72
53
125
48
41
21
123
128
86
124
101
102
84
85
D
129
84
Costanzo
Costarelli
Covan
Craxì
Creti
Crisafi
Crisanti
Crocetta
Cubeddu
Cuffini
Cuppone
88
89
63
86
101
96
110
99
85
86
78
79
108
87
128
109
111
125
38
97
39
101
49
119
62
104
105
112
110
105
54
54
G.
S.
T.
M.
S.
P.
A.
L.
M.
I.
G.
G.
M.
M.
C.
V.
E.
A.
Dicuonzo
Dimonte
D’Inzeo
D’Isanto
Distefano
Doldo
Dolei
Dolzani
Donalisio
Donatelli
Donia
Donnarumma
Donnarumma
Dono
D’Orazi
Drouillon
D’Ugo
Dusi
92
62
61
42
95
46
55
93
51
59
98
10
82
87
63
62
44
87
63
112
72
103
80
77
81
82
E
D.
S.
Ercolini
Esin
104
57
L.
F.
G.
Fabeni
Facchetti
Fadda
K.
G.
E.
M.
D.
V.
C.B.
C.
D.
F.
F.
C.
S.
D.
M.
C.
E.
S.
P.L.
B.
A.
A.
F.
G.
M.C.
S.
S.
L.
G.
R.E.H.
L.
L.
P.M.
V.
A.
C.
112
Fægri
Failla
Fainardi
Falduto
Falzone
Farinella
Faulds
Fazio
Fazio
Felici
Ferraglia
Ferranti
Ferrari
Ferraro
Fidelbo
Filippone
Finamore
Fiorentini
Fiori
Fiori
Florio
Focà
Formica
Fortina
Fossati
Fracchiolla
Frateschi
Frattini
Freer
Friesen
Fumarola
Furlanis
Furneri
Fusco
Fusco
Fusco
62
43
23
106
113
50
92
55
76
107
103
98
39
119
71
49
56
59
53
30
57
42
11
21
61
111
46
35
73
70
48
96
70
43
52
69
93
27
104
80
76
F
59
108
116
60
109
125
121
122
64
60
54
66
72
43
124
108
112
61
110
62
111
121
G.
M.
P.
E.
F.
M.
A.
E.
C.
R.
R.
M.
F.
V.
G.
E.
C.
E.
G.
A.
G.M.
A.
S.
J.C.
D.
G.
R.
G.
E.
R.
M.
G.
L.
M.
S.M.
V.
R.
R.
F.
C.
R.
C.
F.
R.
R.
E.
P.
R.F.
E.
A.M.
G.
S.
J.
C.
F.
E.
V.
R.
G.
L.
Gallucci
Gambuzza
Gangemi
Garaci
Gargiulo
Garibaldi
Garozzo
Garrafa
Garzelli
Gatti
Gaziano
Gelmi
Gemignani
Gentili
Gentilomi
Gerace
Geraci
Ghelardi
Gherardi
Giammanco
Giammanco
Giancotti
Giannecchini
Giard
Gibellini
Giltri
Gindro
Ginestra
Giovanetti
Gisi
Giuffrè-Cuculletto
Giuffrida
Giuliani
Giuliano
Giulini
Giummarra
Giuseppetti
Gluck
Gona
Gori
Gorini
Gorrini
Gotta
Graffeo
Grande
Granieri
Grassi
Grassi
Grasso
Greco
Greco
Grelli
Grigolato
Grimaldi
Grimaldi
Grimaldi
Grisolia
Grossi
Guardo
Guida
118
71
40
41
127
71
120
40
48
49
99
127
117
52
57
71
90
50
92
94
106
46
59
111
42
129
102
98
9
125
24
65
45
76
40
56
44
44
116
62
42
6
70
61
69
55
65
80
65
113
75
24
52
121
74
76
68
45
90
80
Hartke
Herrmann
Huygen
111
62
49
Iannitto
Iatta
Iezzi
Illiberi
Immordino
Imperi
Imperiali
Ingianni
Iorio
Ioudinkova
Isgrò
Iuliano
Izzo
54
48
105
87
103
18
113
100
101
86
53
96
128
72
76
50
130
56
49
101
76
91
107
102
95
64
66
98
A.
J-L.
K.
64
66
121
38
39
119
90
91
92
90
114
91
120
92
110
106
81
91
I
Gabriele
Gaeta
Gagliano
Gaido
Galbo
Galdiero
Galdiero
Galeotta Lanza
Galimberti
Gallè
Galli
Gallinella
109
78
65
85
71
11
42
76
129
74
113
57
72
72
77
E.
R.
M.
O.
R.
M.
M.
A.
A.M.
E.
G.
R.
I.
103
106
G
L.
S.
M.
E.
R.
M.
M.
A.
V.
F.
J.
G.
92
55
H
56
99
102
92
F.
A.
F.
S.
V.
M.
M.G.
R.
M.
R.
A.
P.
L.
G.
B.
C.
C.
M.
C.
M.G.
M.C.
T.
P
F.
G.
M.
D.
R.
M.C.
M.A.
A.
A.
P.
C.
D.
P.
M.
A.
F.
R.
I.
M.E.
G.
A.
V.
C.S.
P.
C.
M.
C.
R.
M.T.
M.P.
I.
G.
S.
E.
R.
P.
L.R.
F.
A.
M.
R.
J
S.
Jacobson
64
Kampanaraki
Kellici
Kolstø
77
99
50
K
A.
S.
A.B.
L
S.
M.
M.
H.J.
M.
C.
P.
A.G.
A.
S.
S.
N.
G.
N.
T.
T.
G.
D.
I.
F.
E.
A.
N.
M.
M.C.
D.
M.
M.
S.
C.
T.
N.
E.
G.
G.
C.
A.
La Carbona
La Francesca
La Sorda
Laanbroek
Labonia
Lagatolla
Lagrange
Lamberti
Lambiase
Landi
Landolfo
Lanzieri
Lapadula
Lari
Lazzarotto
Leanderson
Leigheb
Lembo
Lenci
Leone
Lepri
Levis
Li Vigni
Liberatore
Liberto
Libertucci
Libra
Lichtner
Lo Caputo
Lo Passo
Lo Russo
Lopatriello
Lorusso
Lovero
Lubini
Lucenti
Lupetti
111
121
59
116
48
93
62
46
68
117
51
81
128
48
4
72
38
51
17
61
101
70
83
105
46
89
40
126
63
71
46
48
75
48
93
123
52
60
108
79
49
76
M
B.
A.
F.
M.
A.
P.
C.M.
S.
E.
S.
G.
I.
G.
M.
E.
N.
G.
G.
N.
R.
A.
R.
S.
M.
A.
A.G.
A.
M.
S.
M.E.
Macchi
Madeddu
Maggi
Magnani
Mai
Maida
Maida
Maimone
Maioli
Makhzami
Malaponte
Malet
Mameli
Manai
Manaresi
Manca
Mancuso
Mandalari
Mandras
Manganelli
Mangiafico
Manservigi
Manzara
Manzoni
Manzoni
Marcelin
Marchese
Marchetti
Marchetti
Marcocci
24
100
96
50
41
126
103
53
87
60
40
62
55
100
57
126
71
33
83
92
64
19
112
4
118
62
87
73
109
56
47
64
Marcuccilli
Marino
Marino-Merlo
Marsico
Martella
Martinelli
Martinotti
Martucci
Marzullo
Maselli
Mastino
Mastrantonio
Masucci
Matera
Matteoli
Matteucci
Matti
Maugeri
Mauro
Mazzarello
Mazzarino
Mazzei
Mazzella
Mazzotta
Mazzucco
Meacci
Medaglini
Mededdu
Medici
Medici
Mei
Melito
Merito
Merlino
Merlo
Mesiano
Mezzatesta
Midiri
Midulla
Migliavacca
Milazzo
Milici
Minei
Minutolo
Miraglia
Mogavero
Molicotti
Mollinari
Monaco
Monari
Monno
Montagna
Montanari
Monte
Morace
Morassutto
Morelli
Morganti
Mosci
Motta
Motta
Mura
Musiani
Musumeci
17
105
24
11
97
97
58
61
78
46
24
14
61
46
96
24
96
75
61
87
40
20
61
63
51
118
53
100
23
24
55
82
40
87
56
87
116
71
45
96
119
103
68
24
90
117
38
56
92
47
63
48
9
124
121
93
48
96
74
120
49
21
57
35
Narbad
Narciso
Nardi
Neglia
Negrini
Negro Ponzi
Nencioni
Neri
Neri
Neri
Ngakeu
Nibbering
Nicol
Nicoletti
92
33
63
80
118
127
88
50
55
101
39
52
52
116
33
116
107
106
43
114
117
47
39
110
55
64
106
47
64
97
55
106
88
89
72
76
65
90
102
99
122
47
64
69
74
86
129
N
127
72
98
84
108
121
43
128
76
110
112
85
125
56
130
A.
P.
G.
R.
R.
A.
L.
W.
M.
A.
A.
P.H.
G.
G.
91
98
34
120
54
129
F.
M.
R.
D.
V.
A.
M.
E.
Nicoletti
Nicoletti
Nicoletti
Nicolosi
Nicolosi
Nostro
Novelli
Nucleo
40
105
81
33
116
105
88
96
56
F.
G.
M.
M.A.
L.
C.P.
T.
M.
R.
A.
R.
R.
B.
E.
G.
E.
A.
R.
M.G.
C.
R.
R.
S.
G.
M.C.
M.
S.
124
Q
34
66
114
89
99
117
116
O
S.
G.
P.
G.
C.
L.
S.
D.
Oliveri
120
Orefici
Oreste
Orlandini
Orsi
Ortega De Luna
Ortu
Otranto
24
129
18
51
49
118
74
38
18
Pace
Paganelli
Pagani
Palamara
Palermo
Palermo
Pallenzona
Palmeri
Palù
Pantanella
Pantosti
Paolantonio
Paoletti
Paolillo
Paolini
Paolucci
Papasergi
Pappalardo
Pappalardo
Parati
Parenti
Passariello
Patamia
Pataracchia
Pea
Pecorini
Peggy Marconi
Pelaia
Pepe
Peppoloni
Peralta
Perandin
Perfetto
Perinetti
Perno
Peroni
Peruzzi
Pessina
Petrazzuolo
Petti
Pettini
Peumans
Picardi
Picciani
Picciano
Piccolo
Piccolomini
Pierangeli
Piizzi
Pilloni
Pinardi
Pinsi
Piperno
Pisano
Pisciotta
Pistello
Pitarresi
Pizzillo
Pizzimenti
54
47
96
41
125
44
87
95
17
93
25
80
80
77
35
128
71
40
41
35
96
41
32
18
7
111
43
46
16
95
95
126
81
80
17
48
6
73
81
78
53
58
74
104
125
6
80
45
46
116
86
127
117
119
42
43
103
54
117
28
103
74
102
113
114
101
P
T.
F.
L.
A.T.
R.
C.I.
A.
A.
G.
F.
A
M.
I.
R.
G.
S.
S.
G.
S.
G.
S.
C.
I.
M.
F.
G.
C.
G.
O.
S.
S.
F.
B.
G.
C.F.
I.
S.
A.
M.
A.
E.
W.J.
M.
C.
P.
G.
R.
A.
C.
G.N.
F.
G.
A.
M.
M.G.
M.
G.L.
P.
A.
99
50
123
128
P.
A.
E.
125
Pizzimenti
Pizzo
Pizzolante
Platia
Poddighe
Pollara
Pollicino
Pollicita
Pompei
Pompilio
Ponti
Porta
Posteraro
Pota
Pozzi
Pradel
Prandini
Previti
Privitera
Pruzzo
Psaila
Puccio
Puglisi
Pulcrano
Pulicari
Puliti
Purrello
117
80
48
103
55
126
53
58
100
104
88
61
59
76
53
60
40
114
54
13
99
46
119
78
46
74
115
Quaglino
Quirino
Quiros-Roldan
89
46
128
Raieta
Raimondi
Raimondo
Rametti
Ramirez
Randazzo
Rao
Rapicetta
Rapisarda
Rappazzo
Rappelli
Rasi
Ravizzola
Razin
Re
Reali
Recchia
Reina
Restuccia
Riboldi
Ricca
Rigoli
Rinaldi
Rindi
Riu
Rivardo
Rizza
Rizzo
Roana
Robbiano
Roccasalva
Rodella
Rodighiero
Roizman
Rollini
Romani
Romano
Romano Carratelli
Romeo
Romeo
Roscetto
Rossana
Rossano
Rossetti
Rossi
Ruggeri
42
73
8
46
106
28
72
44
113
56
21
22
127
49
5
87
18
94
28
43
107
99
89
48
21
58
107
76
83
85
56
126
49
55
4
2
49
76
64
129
78
88
68
10
124
71
114
127
105
89
108
60
130
111
85
86
121
79
122
112
92
R
82
122
90
102
91
104
118
127
82
130
45
58
62
38
39
119
105
38
104
39
105
130
121
103
122
119
63
K.
A.
G.
L.A.
S.
C.
M.
M.
M.F.
G.C.
P.
G.
G.
S.V.
M.C.
S.
S.
A.
C.
E.
E.
R.
M.
L.
F.
F.
S.
A.
J.
F.
L.S.
A.
I.
B.
M.
L.
M.
C.
G.
M.G.
E.
C.
F.
B.
D.
A.
77
53
64
114
86
42
95
100
102
49
77
84
85
64
127
66
128
130
78
79
77
74
S.
M.
G.
A.
R.
A.
Rugolo
Rusnati
Russo
Russo
Russo
Rynditch
64
51
22
22
44
86
90
126
123
124
S
M.C.
M.
M.
S.
S.
G.
D.
M.
Sacchi
Saddi
Sali
125
Salvetti
Samperi
Sangiorgio
Sanglard
Sanguinetti
A.
R.
I.
L.
F.
O.
N.
F.
D.
C.
D.
G.
S.
C.
A.M.
G.C.
M.
D.
A.
M.T.
G.
V.
O.
M.
L.A.
G.P.
L.
C.
S.
A.
C.
D.
P.
R.
R.
A.
F.
G.
G.
P.
P.
G
A.
S.
M.
T.
A.M.
D.
G.
A.
S.
P.
S.
F.
A.
A.
M.
F.
K.
V.
Sanna
Santangelo
Santino
Santoriello
Santoro
Sarpi
Sauvageot
Savino
Savoia
Scagnolari
Scalas
Scalia
Scalise
Schiraldi
Schito
Schito
Schmid
Schols
Sciacca
Sciortino
Scolari
Scriffignano
Scudiero
Scutella
Sechi
Segoloni
Selan
Selvaggi
Senesi
Serafino
Serra
Serra
Serror
Sessa
Sgarbanti
Siddu
Sidoti
Silvestri
Simonetti
Sinibaldi Vallebona
Solidoro
Sorge
Sorge
Sozzani
Spalla
Spanu
Speciale
Spina
Squadrito
Stano
Starnino
Stefanelli
Stefani
Stivala
Stivala
Stringaro
Succi
Superti
Susanna
Svicher
70
100
61
50
121
107
59
21
111
100
109
93
87
118
79
111
84
83
45
83
32
46
82
85
85
116
58
65
24
7
65
79
125
2
51
5
45
50
99
55
87
60
8
50
112
51
34
41
99
89
123
123
43
96
61
29
115
53
126
39
39
25
40
120
125
6
73
50
45
T
B.
Taddeo
55
108
109
111
112
60
59
112
60
61
108
110
112
84
44
123
86
86
116
90
55
91
106
90
91
38
87
68
107
117
124
E.
V.
S.
D.
E.
L.
A.
G.
M.
L.
M.E.
G.
R.
R.
L.
E.A.
R.
C.
C.
P.
C.
G.
E.M.
G.
S.
M.
L.
G.
L.
M.A.
V.
M.
R.J.
O.
Tagliafico
Tancrè
Taormina
Taramelli
Tarsitano
Tauro
Tavanti
Tempera
Tempesta
Terlenghi
Terlizzi
Teti
Ticozzi
Timpanaro
Tissi
Tonin
Torelli
Torrisi
Torti
Toscani
Totaro
Trapanotto
Trecarichi
Tripodi
Trombetti
Trovato
Trovato
Tsague
Tudisco
Tufano
Tullio
Tumbarello
Turner
Turriziani
95
46
95
16
75
48
117
56
75
126
87
3
73
120
74
93
59
90
127
99
48
90
108
78
45
116
113
126
80
10
83
108
58
126
Urone
Usai
Usiglio
54
68
87
Vaccaro
Van Damme
van Dissel
Vannucci
Varaldo
Vatteroni
Vecchiarelli
Vella
Venitucci
Venuti
Veroux
Veroux
Vescovo
Vinci
Visco-Comandini
Vitali
Vitiello
Vizzari
Vizzini
Volpi
Vullo
Vultaggio
90
58
52
43
9
96
47
95
48
24
65
65
7
46
63
19
42
115
44
43
126
54
Waldron
Welling
Wickham
98
52
33
Zaccaria
Zacconi
Zanetti
Zannoni
Zappacosta
Zappalà
Zerbini
Zumbo
24
7
3
112
105
44
57
61
118
64
66
127
88
71
128
89
72
130
60
62
113
114
120
129
80
84
81
85
82
76
128
91
U
92
N.
D.
D.
V
87
99
108
122
88
118
89
112
L.
E.J.M.
J.T.
L.
P.E.
M.L.
A.
A.
C.
A.
M.
P.F.
M.
M.
U.
L.A.
M.
G.
L.
I.
V.
A.
103
106
72
77
W
26
115
116
K.
M.M.
M.
Z
62
63
D.
C.
S.
G.F.
R.
D.
M.
A.
106
38
68
123
124
108
109
111
112
78
Società italiana di Microbiologia
Anno 9 - N. 1
Ottobre 2007
RIASSUNTI

Scarica i riassunti - Società Italiana di Microbiologia

Transcript

Documenti analoghi

HIV L`HIV provoca l`AIDS, malattia che si manifesta quando il virus

Infezioni da HIV e AIDS

Epatite B Il virus dell`epatite B (HBV) è un virus a DNA appartenente

Il rischio di patologie infettive per chi opera in ambito ospedaliero

congresso 2005.qxd

Micronews 7 7 - Policlinico S.Orsola

La Casa More diventa WOW! e Trilobite.

Green algae as biodiesel source - Università degli Studi di Roma

Informativa per Urea Breath Test

diapo le malattie a trasmissione sessuale