International (40 + 100 combined)

CMV BriteTM Kit
Test per la ricerca dell’antigenemia del CMV
Il nuovo standard nella diagnosi del CMV
(Manuale d’istruzione d’Italiano)
100 tests
[REF] VIR-CMV-100
0344
Dispositivos médicos de diagnóstico in Vitro
IQ Products
Rozenburglaan 13a
9727 DL Groningen
Olanda
Tel: +31 50 5757 000
Fax: +31 50 5757 002
Applicazioni
Il CMV BriteTM Kit consente l’identificazione qualitativa della proteina pp65 situata nella matrice virale,
specifica per il Citomegalovirus (CMV), mediante d’immunofluorescenza indiretta e lettura al
microscopio, a partire da leucociti separati da sangue periferico in EDTA o eparina. Il riconoscimento
della pp65 del CMV nel sangue periferico fornisce un valido aiuto nella diagnosi d’infezione acuta o
riattivazione del CMV.
Introduzione
Il Citomegalovirus umano (CMV) è un virus a DNA di circa 200 nm di diametro, appartenente alla
famiglia degli herpes virus. Presenta un core di DNA a doppia elica, un capside composto da 162
capsomeri e un involucro pericapsidico di rivestimento (1). L’infezione da CMV è frequente e nell’ospite
sano è spesso asintomatica. Tuttavia, l’infezione da CMV nell’ospite immunodepresso e nel feto in
sviluppo può determinare una malattia di tipo locale o diffuso. Le diverse manifestazioni cliniche
includono polmonite, retinite, epatite, enterite e malattie neurologiche. Nonostante le molte possibilità
di trattamento, l’infezione da CMV può risultare in una significativa morbidità e mortalità nei soggetti
sottoposti a trapianto, nei pazienti con AIDS e cancro, in particolare quelli con leucemie o linfomi.
Questi pazienti sono a rischio sia per infezione primaria da CMV sia per riattivazione d’infezioni latenti
(2-4). Una diagnosi precoce e rapida d’infezione da CMV è di grande importanza nell’evitare un
sovratrattamento con farmaci immunosoppressivi e nell’indicare una corretta terapia antivirale.
Tuttavia, la distinzione tra infezione virale asintomatica e malattia significativa tale da richiedere un
trattamento può essere difficile. L’isolamento del CMV da campioni di sangue (CMV viremia) sembra
meglio correlata con l’infezione sintomatica, mentre l’isolamento dalla saliva e dall’urina è
comunemente presente nell’infezione asintomatica. I metodi convenzionali per l’isolamento del CMV
dal sangue sono sensibili, ma possono non fornire risultati significativi per varie settimane. Le colture
cellulari forniscono un risultato entro 1 o 2 giorni, ma non sono sensibili per l’identificazione del CMV
nei campioni di sangue.
Al contrario, la ricerca dell’antigene del CMV (CMV antigenemia) sulle cellule polimorfonucleate (PMN)
del sangue periferico è una tecnica sensibile e rapida (5,6). Questa tecnica utilizza anticorpi
monoclonali per l’identificazione della fosfoproteina della matrice virale (pp65) del CMV, un antigene
precoce nella replicazione virale, che è abbondantemente presente nelle cellule PMN antigene-positive
(6-8). Il test dell’antigenemia per il CMV può essere eseguito entro 5 ore dal prelievo ed è di
significativa importanza nella diagnosi e nel monitoraggio di infezione acuta da CMV in pazienti
sottoposti a trapianto d’organo solido e di midollo osseo (1,2,10-13,19). E’ stato inoltre riportato che
l’antigenemia da CMV è anche correlata con l’infezione da CMV nei pazienti affetti da AIDS (4,18).
Principio della procedura
Il test per la ricerca dell’antigenemia da CMV utilizza un pool di due anticorpi monoclonali (C10/C11)
diretti contro la proteina pp65 della matrice virale del CMV (ref. 6). Il CMV BriteTM Kit utilizza il pool di
C10/C11 per la marcatura in immunofluorescenza indiretta di preparati “cytospin” di leucociti da
sangue periferico. La ricerca dell’antigenemia prevede :
a. La separazione dei leucociti
b. La preparazione dei vetrini “cytospin”
c. La fissazione e la permeabilizzazione
d. La marcatura in immunofluorescenza indiretta con anticorpi monoclonali diretti contro la proteina pp65
del CMV.
e. La lettura e la valutazione dei risultati
Nel primo passaggio, i leucociti sono purificati e gli eritrociti vengono lisati per ottenere una
sospensione cellulare di leucociti. I leucociti sono citocentrifugati e fissati su un vetrino, quindi
permeabilizzati per consentire la successiva identificazione dell’antigene pp65 del CMV. La presenza
dell’antigene pp65 è determinata mediante gli anticorpi monoclonali C10/C11 e visualizzata per mezzo
di un anticorpo specifico secondario FITC-marcato. I leucociti CMV antigene-positivi mostrano una
marcatura nucleare omogenea polilobata giallo-verde se osservati al microscopio a fluorescenza.
L’intera procedura, inclusa la separazione dei leucociti, può essere eseguita in circa 5 ore.
1
Reagenti
MATERIALI E REAGENTI FORNITI NEL CMVBriteTM Kit
CMV BriteTM Reagente A
CMV BriteTM Reagente B
CMV BriteTM Reagente C
CMV BriteTM Reagente D
CMV BriteTM Reagente E
CMV BriteTM Reagente F
CMV BriteTM Reagente G
Vetrini di Controllo*
Soluzione di Destrano in PBS contenente
< 0.1% di Sodio Azide (pronta all’uso).
Soluzione Lisante gli Eritrociti Soluzione di
Cloruro di Ammonio contenente < 0.1% di
Sodio Azide (diluire prima dell’uso)
Soluzione Fissante
Formaldeide in PBS, contenente < 0.1% di
Sodio Azide. (diluire prima dell’uso).
Xn 20-22/36-38-40/43
Soluzione Permeabilizzante Igepal Ca-630 e
Siero Neonatale Bovino in PBS, contenente
< 0.1% di Sodio Azide (diluire prima dell’uso)
Siero Neonatale Bovino in PBS, contenente
< 0.1% di Sodio Azide (diluire prima dell’uso)
Anticorpi Monoclonali C10/C11 (IgG1) diretti
contro la proteina pp65 della matrice virale del
CMV contenenti < 0.1% di Sodio azide (Pronti
all’uso)
Anticorpi di pecora FITC marcati antiimmunoglobuline murine contenenti Blu di
Evans, conservati in Sodio Azide allo < 0.1%
(pronte all’uso)
Vetrini di Controllo per Antigenemia da CMV in
confezioni isolat sigillate contenenti idoneo
disseccante (Pronti all’uso)
100 ml
30 ml
290 ml
290 ml
15 ml
5.9 ml
5.9 ml
20
Ciascun Vetrino di Controllo contiene uno spot per controllo negativo (leucociti fissati CMV antigene
negativi) e uno spot per controllo positivo (cellule fissate CMV antigene positive per la proteina della
matrice virale pp65 miscelate con leucociti antigene negativi).
Prima di aprire, lasciare i vetrini di controllo a temperatura ambiente.
Conservare i reagenti a 2 – 8 °C. Evitare l’esposizione diretta alla luce.
I reagenti conservati secondo le condizioni sopra menzionate sono stabili fino alla data di scadenza
indicata nell’etichetta posta sulla confezione.
Il CMVBriteTM Kit è disponibile in confezioni per 100 tests, contengono 20 vetrini di controllo. La
procedura consigliata è di eseguire la ricerca dell’antigenemia in doppio per ciascun campione.
Precauzioni d’impiego
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
CMV BriteTM Vetrini di controllo per microscopio
Nella preparazione dei CMV BriteTM vetrini di controllo per microscopio, I leucociti sono stati ottenuti da
donatore sano umano. Ciascun donatore è risultato non reattivo per la presenza di anticorpi anti-HIV1, HIV-2, CMV e HbsAg. Sebbene questi metodi siano altamente accurati, non garantiscono che tutte le
unità infette siano state rilevate. Questo prodotto potrebbe anche contenere altre sorgenti umane per
le quali non esiste un test riconosciuto. Poichè non è noto un metodo che possa offrire completa
sicurezza che HIV-1, HIV-2, HCV, virus dell’epatite B, CMV o altri agenti infettivi siano assenti, tutti
questi reagenti dovrebbero essere trattati secondo le norme di sicurezza del laboratorio seguendo
appropriate precauzioni come descritto in “Biosafety in Microbial and Biomedical Laboratories”, 2° ed.,
1988. HHS publication Nà (CDC) 88-8395, centers for Disease Control.
Attenzione
I reagenti contenenti sodio azide possono reagire con materiali di piombo o rame formando metalli di
azide esplosivi. Prima de gettarli lavare con molta acqua per evitare la formazione di azide.
2
Attenzione
Tutti i reagenti dovrebbero essere trattati secondo corrette norme e precauzioni del laboratorio.
Inoltre, è indispensabile trattare tutti i campioni dei pazienti con idonee precauzioni. Non usare la
bocca per pipettare.
Il Reagente C contiene meno del 9,3 % di formaldeide, un allergenico altamente tossico e
potenzialmente cancerogeno che dovrebbe essere trattato secondo adeguate precauzioni da parte del
laboratorio. Evitare il contatto con pelle o occhi.
Il Reagente G contiene Blue di Evans. Evitare il contatto con occhi, pelle, abiti. Chiudere bene il
flacone. Lavare accuratamente dopo l’uso.
Raccolta e Preparazione dei Campioni
Trattamento del campione di sangue
Sono necessari da 5 a 10 ml di sangue venoso in eparina o EDTA, da conservare a temperatura
ambiente (20 – 25 °C) fino alla separazione dei leucociti. Inviare il campione al laboratorio in breve
tempo. La separazione deve essere eseguita entro 6-8 ore dal prelievo, per evitare una riduzione delle
cellule antigene-positive (raccolte in eparina), dopo conservazione del campione (15,16,17). Non è
definita la durata massima di conservazione del campione a temperatura ambiente. Si consiglia
sempre l’immediata preparazione dei vetrini. In pazienti con grave neutropenia (conta assoluta di
neutrofili inferiore a 200/mm3) sono necessari almeno 10ml di sangue.
Materiali e Attrezzature richiesti dal laboratorio
(non inclusi nel CMV BriteTM test Kit)
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Centrifuga da laboratorio
Provette a fondo conico da 15ml per centrifuga; sterili
Micro pipette e puntali
Soluzione salina PBS senza Ca e Mg; pH 7.4.
Acqua demineralizzata (distillata)
Camera di conta emocitometrica o automatica
Vetrini per Citocentrifuga
Citocentrifuga (tipo Shandon Southern Products, Ltd., model Cytospin 3)
Vaschette per lavaggi (Coplin Jars)
Bagnomaria
Incubatore a 37 °C
Microscopio per immunofluorescenza con ingrandimento da 250 a 1000.
Mounting Medium (non fluorescente, tipo CITI FLUOR, soluzione Glicerolo PBS, UKC Chem lab; o
Immunoconcept Mounting Media, Catalogo # 111).
Cappa chimica
Vetrini coprioggetti
3
METODICA
Nota: A meno che non sia indicato diversamente, i reagenti (incluso il PBS) dovrebbero essere tenuti a
temperatura ambiente durante l’esecuzione della metodica (20 – 25 °C).
1) SEPARAZIONE DEI LEUCOCITI (sedimentazione con destrano)
Nota : idonei controlli dovrebbero essere inclusi durante la preparazione dei campioni.
Risospendere da 5 a 7ml di sangue con 1.5ml di reagente A su vortex per 5-10 secondi in una
provetta a fondo conico e incubare 20 minuti a 37 °C (inclinata a 45°). Non chiudere
completamente il tappo. Se si utilizza un maggiore volume di sangue deve essere mantenuto un
rapporto destrano/sangue pari a 1 :4.
Trasferire il surnatante contenente i leucociti (buffy-coat) più lo strato superiore di eritrociti in
un’altra provetta da 15ml usando una pipetta e centrifugare per 10 minuti a 1200rpm (circa 300 g).
Togliere il surnatante.
Diluire il Reagente B (soluzione lisante) 1 :10 in acqua demineralizzata (distillata) e lasciare
raffreddare a 4 °C. Risospendere il pellet di cellule in 5ml di soluzione lisante gli eritrociti diluita.
Risospendere su vortex e incubare per 10 minuti a 4 °C, aggiungere 5ml di PBS e centrifugare come
prima. Togliere il surnatante. Questo passaggio può essere ripetuto se le cellule rosse non sono
state completamente lisate.
Lavare in 5ml di PBS, centrifugare come prima e togliere il surnatante.
2) CONTA DELLE CELLULE E PREPARAZIONE DELLA DILUIZIONE RICHIESTA
Risospendere il pellet in 1ml di PBS (in pazienti con grave neutropenia ; conta assoluta di
neutrofili<200/mm3 ; il volume di risospensione può scendere fino a 0.2 ml)
Contare le cellule utilizzando una camera di conta emocitometrica o automatica.
Portare alla concentrazione di a 1.5 x 106 cellule /ml diluendo con PBS.
3) PREPARAZIONE DI VETRINI PER CITOCENTRIFUGA
Centrifugare 100ul della sospensione cellulare (1.5 x 105 cellule/spot) a 600-800 rpm per 4 minuti
su vetrini.
Preparare almeno tre vetrini per citocentrifuga per ogni campione (due per il test più un vetrino di
backup).
Lasciare asciugare I vetrini per circa 5 minuti.
I vetrini possono essere tenuti a temperatura ambiente per tutta la notte prima della fissazione.
4) FISSAZIONE E PERMEABILIZZAZIONE
Diluire il Reagente C 1 :5 con acqua demineralizzata (distillata) sotto cappa
Diluire il Reagente D 1:5 in acqua demineralizzata (distillata) prima dell’uso. Non riutilizzare.
Immergere 2 vetrini nel reagente C per 10 minuti a temperatura ambiente sotto cappa.
Preparare 100 ml di soluzione di lavaggio diluendo il Reagente E 1:200 in PBS prima dell’uso. Non
riutilizzare.
Immergere I vetrini tre volte nella soluzione di lavaggio diluita e quindi lasciarli nella stessa
soluzione per 5 minuti.
Immergere I vetrini nel Reagente D diluito, per 5 minuti a temperatura ambiente.
Immergere I vetrini due volte in soluzione di lavaggio fresca e lasciarli per 5-10 minuti.
Lavare in acqua demineralizzata (distillata) per 15 secondi.
Lasciare asciugare I vetrini sotto cappa per circa 20 minuti.
Una volta asciutti I vetrini dovrebbero essere marcati immediatamente o conservati a 4 °C per
24 ore o congelati a –80 °C.
5) MARCATURA IN IMMUNOFLUORESCENZA
Marcare l’area con le cellule sul vetrino con un pennarello da laboratorio per evitare la diffusione
della soluzione contenente l’anticorpo e lasciare asciugare per 5 minuti.
Immergere I vetrini per 3-5 minuti in PBS in una apposita vaschetta (Coplin jar); non far seccare il
campione durante l’esecuzione della metodica in tutti I passaggi seccessivi.
Togliere solo un vetrino alla volta dalla vaschetta; asciugare accuratamente l’area intorno al
campione con un pezzetto di carta o cotone.
Aggiungere 35 µl del Reagente F (Anticorpi Monoclonali C10/C11) e incubare per 30 minuti a 37 °C
a bagnomaria. Come controllo positivo incubare un vetrino di un paziente noto CMV antigene
positivo o un controllo incluso nel CMV BriteTM Kit.
Lavare due volte con PBS fresco in una vaschetta per 3 minuti.
Togliere solo un vetrino alla volta dalla vaschetta; asciugare accuratamente l’area intorno al
campione con un pezzetto di carta o cotone.
4
Aggiungere 35 µl di Reagente G (Ig FITC marcate contenenti Blue di Evans), incubare per 30 minuti
a 37 °C a bagnomaria.
Lavare due volte in PBS fresco, sciacquare con acqua di rubinetto (5 volte) aggiungere il Mounting
Medium e un coprivetrino.
6) LETTURA
Leggere I vetrini prima possibile. I vetrini possono essere conservati fino a 8 ore a 4 °C, coperti, per
evitare la perdita di fluorescenza.
Utilizzare un microscopio per immunofluorescenza a 250 ingrandimenti. Un ingrandimento maggiore
(400x o 1000x) può essere utilizzato per aumentare la risoluzione.
Osservare l’intera superficie del campione.
Le cellule positive mostrano una omogenea marcatura giallo-verde polilobata nucleare.
Le cellule negative non mostrano marcatura nucleare giallo-verde.
In meno del 5% dei casi può presentarsi una lettura dubbia dovuta ad artefatti.
-
-
La maggior parte degli artefatti è dovuta ad una marcatura citoplasmatica non specifica, talvolta
con macchie nere; questa marcatura generalmente appare debole e più giallastra; si tratta per lo
più di eosinofili. Nella maggior parte dei casi questi artefatti possono essere facilmente
differenziati dalle cellule vere positive grazie al differente aspetto della marcatura.
se tutte le cellule appaiono verdastre, si tratta di artefatti (situazione peraltro molto rara).
Una tipica marcatura verdastra di cellule situate solo alla periferia dello spot, non è considerata
positiva (situazione rara).
Se I vetrini non sono leggibili per dubbia interpretazione dovuta ad artefatti, marcare il vetrino di
backup o eseguire nuovamente il test.
Un tipico risultato di cellule CMV pp65 antigene-positive ottenute dal campione di un paziente è
mostrata nella figura 1. I risultati della marcatura dei controlli positivi e negativi sono visualizzati
nella figura 2 e nella figura 3 rispettivamente.
Controlo de Qualidade
As lâminas de controlo positivas e negativas fornecidas com o Kit permitem verificar o procedimento
de coloração, e devem apresentar a coloração correcta antes da avaliação das amostras de pacientes.
O controlo positivo deve apresentar uma coloração amarela-esverdeada homogénea das células
positivas com morfologia arredondada (o núcleo não é visível). O controlo negativo não deve
apresentar coloração amarela-esverdeada. Se os controlos não fornecerem estes resultados, a série
de colorações deve ser considerada inválida. Il controllo della preparazione e del trattamento del
campione dovrebbe essere fatto utilizzando appropriati controlli (come segnalato nel paragrafo 1.
Separazione dei Leucociti).
Risultati
Interpretazione
I risultati di valutazione dei vetrini dei campioni sono qualitativi, e devono essere riportati solo come
Positivo o Negativo, secondo le seguenti definizioni :
POSITIVO – una o più cellule antigene-positive presenti sui vetrini marcati in doppio
Il significato dell’incremento/diminuzione del numero delle cellule antigene-positive per singolo
campione nei due test eseguiti in parallelo non è stata determinata.
NEGATIVO – nessuna cellula CMV antigene-positiva presente sui vetrini marcati in doppio.
5
Limiti della Procedura
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
L’identificazione della proteina precoce della matrice virale pp65 del CMV dovrebbe essere eseguita
dai laboratori con esperienza in tecniche immunocitochimiche.
La preparazione dei leucociti dovrebbe essere eseguita dai laboratori con esperienza in tecniche
asettiche.
L’efficacia del CMV BriteTM Kit con campioni differenti da leucociti di sangue umano non è stata
definita.
Le caratteristiche di esecuzione del test sono state determinate con anticoagulanti quali eparina
o EDTA e non sono stati testati anticoagulanti differenti.
Il CMV BriteTM Kit deve essere utilizzato con microscopio per immunofluorescenza e non in
citofluorimetria.
Il tipo e le condizioni degli strumenti utilizzati possono interferire con l’immagine ottenuta. La
reazione può variare secondo il tipo di microscopio utilizzato, la sorgente di luce, l’età della
lampadina, il blocco dei filtri e il loro spessore, la differenza in sensibilità del substrato
dell’antigene, o secondo la procedura impiegata. Ciascun laboratorio dovrebbe stabilire i propri
criteri per la lettura dei campioni dei pazienti utilizzando idonei controlli.
L’identificazione e la conferma della presenza della proteina pp65 della matrice virale del CMV,
proteina strutturale precoce, nei leucociti del sangue periferico, non ha valore diagnostico
d’infezione sintomatica in quanto, poichè il CMV può essere presente per un periodo significativo
dopo l’infezione acuta e pazienti con CMV antigenemia (soprattutto a bassi livelli) possono
mostrare infezione asintomatica. In tutti i dati riportati in letteratura ci sono pazienti che sono
antigenemia-negativi e viremia positivi ; alcuni di questi pazienti possono presentare
manifestazioni cliniche che indicano malattia. Perciò, un test antigenemia negativo non esclude
assolutamente un’infezione da CMV o manifestazioni cliniche che indichino uno stato di malattia
del paziente.
Il CMV BriteTM Kit non è da utilizzare per il monitoraggio di farmaci antivirali.
La caratteristiche di esecuzione del test non sono state definite su campioni neonatali.
Si può notare una diminuzione delle cellule antigene-positive per vetrino (raccolte in eparina)
dopo conservazione del campione (15, 16, 17). Pertanto, i vetrini dovrebbero essere preparati
immediatamente. Non è stato definito il tempo massimo di conservazione dei campioni a
temperatura ambiente.
In pazienti con grave neutropenia (conta assoluta di neutrofili inferiore a 200/mm3) sono
necessari almeno 10ml di sangue.
Poichè gli anticorpi monoclonali sono stati preparati utilizzando un prototipo del CMV, questi
possono non riconoscere tutte le note o nuove varianti antigeniche del CMV.
Gli anticorpi monoclonali potrebbero non identificare varianti del CMV che mostrino cambiamenti
della sequenza di aminoacidi degli epitopi riconosciuti.
Valori attesi
Il CMV BriteTM Test Kit è stato valutato in due differenti laboratori clinici di virologia: presso centri di
trapianto di midollo osseo o organi solidi e in centri di trattamento di pazienti con AIDS (20). Un totale
di 300 campioni di sangue venoso sono stati raccolti da pazienti sottoposti a trapianto (159 trapianti di
midollo allogenici e 47 trapianti di organi solidi), 85 pazienti HIV positivi/AIDS, e 9 pazienti
immunocompetenti. 92 campioni (30.7%) sono risultati positivi per il CMV utilizzando il CMV BriteTM
Kit. La prevalenza in una popolazione asintomatica anti-CMV anticorpo positiva non è stata
determinata.
6
Caratteristiche Specifiche
Il CMV BriteTM Test kit è stato confrontato con la ricerca del virus del CMV in colture “conventional
culture (CC)” e in “shell vial culture (SV)” utilizzando leucociti umani da sangue periferico. 300
campioni clinici sono stati valutati confrontando “conventional culture” (CC) e “shell vial culture” (SV).
Confronto di CMV BriteTM Test Kit con CC e SV (Centro clinico #1)
CMV BriteTM Test kit
CC/SV
+
+
3
0
45
103
Numero totale
48
103
Numero totale
3
148
151
Confronto di CMV BriteTM Test Kit con CC e SV (Centro clinico # 2)
CMV BriteTM Test kit
CC/SV
+
Numero totale
+
28
16
44
3
102
105
Numero totale
31
118
149
Confronto di CMV BriteTM Test Kit con CC e SV (Entrambi I Centri clinici)
CMV BriteTM Test kit
CC/SV
+
Numero totale
+
31
3
34
61
205
266
Numero totale
92
208
300
Sensibilità 31/34 = 91.2% (95% CI = 76.3 – 98.1%)
Specificità 205/266 = 77.1% (95% CI = 70.2 – 81.1%)
La minor precisione dei dati ottenuti con le colture cellulari per il CMV (“conventional culture CC e shell
vial culture SV”e) confrontate con il test per la CMV antigenemia, documentata in letteratura (21). I
differenti risultati ottenuti sembrano essere una conseguenza della terapia antivirale o della variabilità
dei campioni (12). Inoltre, la ricerca dell’antigenemia del CMV indica chiaramente un’ infezione acuta
da CMV ed è un dato aggiuntivo a quelli ottenuti con le “conventional e shell vial culture
(4th International CMV Workshop, Paris, April 19-21, 1993).
Le discrepanze nei risultati sono state eliminate valutando la presenza d’infezione da CMV in altri
materiali ottenuti dal paziente : colture positive di urina e faringe, campioni di lavaggi broncoalveolari
(BAL) e cercando nella storia clinica del paziente ad altri sintomi che confermino un’ infezione da CMV.
Inoltre l’infezione da CMV è stata evidenziata per mezzo di dati istologici e colture di biopsie, e/o
mediante ricerca serologica di CMV IgG o IgM in sierologia (non per pazienti sottoposti a trapianto di
midollo osseo o pazienti con AIDS), e/o grazie ai risultati di test locali di riferimento impiegati dal
laboratorio per l’antigenemia per il CMV (valutati nei singoli laboratori e non disponibili
commercialmente).
7
Confronto di CMV BriteTM Test Kit con altri metodi per l’identificazione d’infezione da CMV
(Centro clinico # 1)
CMV BriteTM Test kit
CC/SV
+
-
+
47
1
6
97
Numero totale
53
98
Numero totale
48
103
151
Confronto di CMV BriteTM Test Kit con altri metodi per l’identificazione d’infezione da CMV
CC/SV
+
+
Numero totale
42
2
44
(Centro clinico # 2)
CMV BriteTM Test kit
3
102
105
Numero totale
45
104
149
Confronto di CMV BriteTM Test Kit con altri metodi per l’identificazione d’infezione da CMV
(Entrambi I Centri clinici)
CMV BriteTM Test kit
CC/SV
+
-
+
89
3
9
199
Numero totale
98
202
Numero totale
92
208
300
19 dei 64 risultati discordanti sono stati risolti sulla base dei dati ottenuti sia utilizzando il test locale
per l’antigenemia del CMV, sia mediante I dati della sierologici per il CMV.
Sensibilità 89/98 = 90.8% (95% CI = 83.3 – 95%)
Specificità 199/202 = 98.5% (95% CI = 95.7 – 99.7%)
Valore Predittivo Positivo 89/92 = 96.7% (95% CI = 90.8 – 99.3%)
Valore Predittivo Negativo 199/208 = 95.7% (95% CI = 91.6 – 97.9%)
8
Cross Reattività
Studi sulla cross-reattività sono stati eseguiti testando I reagenti del CMV BriteTM con differenti virus
correlati con il CMV, responsabili di sintomi clinici simili e/o isolati da sangue periferico. A meno che
indicato diversamente sono stati testati i seguenti virus:
Herpes virus tipo 1
Herpes virus tipo 2
Varicella-zoster virus
Adenovirus 2
Adenovirus 4
Adenovirus 5
Parainfluenza virus 1
Parainfluenza virus 2
Parainfluenza virus 3
Virus Respiratorio sinciziale
Poliovirus 3 (tipo 3)
Echovirus 30
Epstain-Barr virus (variante di laboratorio P3HR1) *
Human herpes virus tipo 6 (variante di laboratorio GS) *
HIV – tipo 1 **
* National Institute of Public Health and Environmental Protection, The Netherlands
** Virion, Switzerland
Non è stata osservata cross reattività ad eccezione di una debole reazione positiva con sei su sette
isolati HSV-1 utilizzando le “shell vial culture SV”. Tuttavia, la debole fluorescenza evidenziata con
HSV-1 era citoplasmatica (visibile soltanto esternamente al nucleo e in un numero limitato di foci),
simile al pattern in IF che si osserva con anticorpi monoclonali per HsV-1. Questa debole marcatura
potrebbe essere dovuta ai recettori Fc che sono espressi nelle cellule infettate con HSV-1 rilevabili con
le “shell vial culture SV”. Una successiva analisi ha portato alla conclusione che non c’è evidenza di
cross reattività tra i test per l’antigenemia da HSV e CMV se si utilizza il pool di anticorpi monoclonali
C10/C11.
Versione 3
9
Bibliography
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