practice

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practice

C
LINICAL
PRACTICE
Consensus Workshop
e Raccomandazioni
sull'impiego delle diverse metodiche
per la determinazione dello stato
di HER2 nel carcinoma mammario
e nel carcinoma gastrico
Con l’Endorsement
del Gruppo di Lavoro sulla Terapia
Molecolare dei Tumori
Consensus Workshop e Raccomandazioni sull'impiego delle diverse metodiche
per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma mammario e nel carcinoma gastrico
A cura del gruppo di lavoro
AIOM-SIAPEC-IAP
Vincenzo Adamo (Messina)
Stefania Gori (Perugia)
Carlo A.M. Barone (Roma)
Stefano Iacobelli (Chieti)
Oscar Bertetto (Torino)
Roberto Labianca (Bergamo)
Generoso Bevilacqua (Pisa)
Vito Lorusso (Lecce)
Roberto Biffi (Milano)
Eugenio Maiorano (Bari)
Roberto Bordonaro (Catania)
Annamaria Molino (Verona)
Antonino Carbone (Aviano-PN)
Filippo Montemurro (Torino)
Emanuele D'Amore (Vicenza)
Marcella Mottolese (Roma)
Marco Danova (Pavia)
Oscar Nappi (Napoli)
Angelo Paolo Dei Tos (Treviso)
Cecilia Nisticò (Roma)
Michele De Laurentiis (Napoli)
Carmine Pinto (Bologna)
Lucia Del Mastro (Genova)
Massimo Rugge (Padova)
Sabino De Placido (Napoli)
Anna Sapino (Torino)
Ferdinando De Vita (Napoli)
Mario Scartozzi (Ancona)
Francesco Di Costanzo (Firenze)
Alberto Sobrero (Genova)
Claudio Doglioni (Milano)
Gianluigi Taddei (Firenze)
Nicola Fazio (Milano)
Mauro Truini (Genova)
Roberto Fiocca (Genova)
Giovanni Tuccari (Messina)
Nicola Gebbia (Palermo)
Marco Venturini (Verona)
Annunziata Gloghini (Milano)
Giuseppe Viale (Milano)
2
Indice
Pagina
5
Introduzione
Pagina
6
HER2 e altri parametri predittivi nel carcinoma mammario
Pagina
8
Requisiti minimi e standard di refertazione
Gli statement
Pagina
12
Raccomandazioni
Pagina
14
Le metodiche di rilevazione
Pagina
14
Immunoistochimica nella determinazione dello stato di HER2
Pagina
15
Le tecniche di ibridazione di situ: FISH/CISH/SISH
Pagina
22
Raccomandazioni
Pagina
25
Trastuzumab nel trattamento del carcinoma gastrico
e della giunzione gastroesofagea HER2-positivo:
le evidenze cliniche
Pagina
27
Criteri di eleggibilità della terapia antiHER2
Pagina
28
Gli statement sul carcinoma gastrico
Pagina
30
Raccomandazioni per la determinazione dello stato di HER2
nel carcinoma gastrico
Pagina
36
Bibliografia
3
4
Introduzione
Gli approfondimenti relativi alla caratteristiche biologiche del carcinoma mammario e gastrico
hanno radicalmente mutato l'approccio terapeutico a queste patologie. In particolare, grazie alla
disponibilità di trastuzumab, è oggi possibile instaurare un trattamento mirato sui tumori HER2
positivi che costituiscono circa il 15-20 % dei tumori mammari e più del 20% dei tumori gastrici
metastatici o localmente avanzati. L'identificazione dei soggetti candidati alla terapia personalizzata con trastuzumab assume pertanto un'importanza decisiva al fine di mutare la prognosi dei
pazienti affetti da tumori HER2 positivi.
E' importante, però, che le acquisizioni metodologiche, a livello laboratoristico e clinico, siano di
volta in volta discusse e concordate dalle figure professionali cui è demandata la valutazione dei
pazienti, in particolare dal patologo e dall'oncologo.
Questo, ancora una volta, lo spirito che ha animato i lavori della Quarta Edizione del Consensus
Workshop, dedicata a "HER2 e altri parametri predittivi", evento che si è celebrato a Catania sotto l'egida di AIOM e SIAPEC. Un'occasione di incontro tra specialisti patologi e oncologi che, oltre alle consuete sessioni plenarie per fare il punto sullo stato dell'arte in materia, ha previsto la
costituzione di 4 gruppi di lavoro dedicati ad argomenti di grande attualità, al centro della ricerca
di settore.
Lo spazio riservato dal Consensus Workshop al carcinoma mammario HER2 positivo si è posto un
duplice obiettivo: da un lato, fare il punto e riaffermare il consenso degli specialisti sulle informazioni raccolte nel corso degli anni e che si sono tradotte di recente nelle "Raccomandazioni sui
requisiti minimi e gli standard di refertazione e sull’utilizzo di metodiche per la determinazione
dello stato di HER2 nel carcinoma mammario”. Dall'altro lato, il Consensus Workshop mette a
punto strategie condivise su problematiche particolari, quali il trattamento dei tumori mammari
HER2 positivi di piccole dimensioni, il significato della polisomia del cromosoma 17 e dei cloni focali HER2 positivi.
Inoltre, per la prima volta nell'ambito dei Consensus Workshop sui tumori HER2 positivi, un gruppo di lavoro specifico è giunto all'elaborazione di statement sulla valutazione dello stato di HER2
nei tumori gastrici e della giunzione gastroesofagea.
Gli statement, basati in gran parte sulle esperienze cliniche raccolte dallo studio ToGA, sono stati successivamente votati da tutti i partecipanti all'evento e costituiscono un primo importante
momento di condivisione tra gli specialisti italiani, confluito successivamente nelle “Raccomandazioni per la determinazione dello stato di HER2 nel carcinoma gastrico”.
I due documenti, a cui abbiamo dato ampio spazio in questa edizione speciale di Clinical Practice,
sono disponibili sui siti web delle due società (www.aiom.it, www.siapec.it) e costituiscono il riferimento attuale per la valutazione dello stato di HER2 in questi pazienti.
5
HER2 e altri parametri predittivi
nel carcinoma mammario
Il percorso intrapreso già da diversi anni dal gruppo di lavoro AIOM-SIAPEC-IAP nel corso dei
vari Consensus Workshop Palermo, Taormina, Paestum e Catania, è culminato nella messa a
punto di raccomandazioni, recentemente pubblicate sul sito AIOM (www,aiom.it). Nella più recente Consensus di Catania (14-15 aprile 2010), si è concretizzato un importante confronto tra anatomopatologi e oncologi su alcune tematiche di attualità in questo campo: il trattamento terapeutico dei tumori mammari HER2-positivi di piccole dimensioni, la polisomia del cromosoma 17, i
cloni focali con amplificazione del gene HER2.
I risultati dei gruppi di lavoro sono stati poi oggetto di discussione in plenaria, con votazione
elettronica finale sugli statement elaborati da ogni gruppo tematico.
La Consensus è parte di un percorso intrapreso già da diversi anni, e il cui primo importante risultato è stato la redazione di linee guida sottoscritte dalla SIAPEC-IAP e dall’AIOM, presentate
per la prima volta al Congresso Nazionale di Firenze nel 2009.
Accanto alle raccomandazioni cliniche per una gestione ottimale del carcinoma mammario, le linee guida integrano l’ iter standard per la determinazione della positività per HER2, osservata in
circa il 15-20% dei carcinomi mammari. Le pazienti con carcinoma mammario HER2-positivo possono, infatti, beneficiare della terapia con trastuzumab, la prima targeted therapy ad avere ottenuto importanti risultati in termini di aumento della sopravvivenza dei tumori HER2-postivi,
rendendola simile a quella, più favorevole, delle forme HER2-negative (Figura 1)
In questa ottica, la definizione di requisiti minimi di refertazione, la standardizzazione della refertazione e l’individuazione di percorsi diagnostico-terapeutici integrati sono cruciali per una
gestione terapeutica ottimale: infatti, come afferma il professor Giuseppe Viale, dell’Istituto Europeo di Oncologia ed Università degli Studi di Milano, chairman della Consensus di Catania: “Ciò
che il patologo scrive nel referto diventa uno dei pilastri fondamentali delle successive scelte
terapeutiche”. Ne consegue che una gestione integrata multispecialistica della paziente è necessaria, in quanto la scelta terapeutica è condizionata dalla caratterizzazione biologica, e pone in
primo piano il ruolo del patologo, quale responsabile della congruità dei criteri diagnostici, prognostici e predittivi. D’altro canto, l’oncologo - applicando una strategia terapeutica basata sulla
attesa risposta ai diversi trattamenti- è sempre di più figura centrale nella personalizzazione
del trattamento.
Trastuzumab ha modificato la prognosi delle
donne con tumore mammario HER2-positivo
Probabilità
di sopravvivenza globale
Figura
1
HER2 –
HER2+/no trastuzumab
HER2+/trastuzumab
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
12
24
36
48
60
Mesi dalla diagnosi
Dawood S et al, J Clin Oncol. 2010 Jan 1;28(1):92-8. Epub 2009 Nov 23
6
Continua il percorso che
ha portato l’AIOM e la SIAPEC-IAP alla realizzazione
delle linee guida nazionali:
centrale il ruolo della determinazione dell’HER2-positività, primo step per
l’impostazione di una terapia personalizzata
Figura
2
Valutazione dello stato di HER2
IIC
Utilizza anticorpi per la determinazione della
iperespressione della proteina HER2
FISH
Utilizza ibridazione in situ con fluorescenza
per determinare l’amplificazione del gene HER2
CISH
Utilizza ibridazione in situ con metodo
cromogenico
Pubblicate a cura di AIOMSIAPEC-IAP le recenti
raccomandazioni per la determinazione dello stato
di HER2 nel carcinoma
mammario
Perché trastuzumab funzioni è necessario
SISH
Utilizza ibridazione in situ con metodo
all’argento
che il carcinoma esprima la molecola HER2,
ed è altresì indispensabile che gli esami
preliminari per l’identificazione di HER2 siano eseguiti il prima possibile e con la massima accuratezza. Si stima tra il 20-40% il
tasso di errore nella diagnosi del carcinoma mammario HER2-positivo; ridurre questo errore ad
appena il 5%, come auspicato dalle linee guida internazionali, significa una speranza di trattamento specifico per un ingente numero di donne: il carcinoma HER2-positivo- ogni anno- in Italia
colpisce dalle 8.000 alle 10.000 donne.
Inoltre, il continuo progredire delle conoscenze biologiche alla base dello sviluppo tumorale, unitamente all’acquisizione, da parte dei patologi, di maggiore esperienza metodologica con i sistemi classici (IIC e FISH/CISH) (Figura 2) e l’avvento di nuove tecniche di rilevazione, impongono
una rivisitazione dello stato dell’arte relativo alla gestione ottimale del carcinoma mammario
HER2-positivo.
Di recente sono state pubblicate a cura di AIOM-SIAPEC-IAP le “Raccomandazioni sui requisiti minimi e gli standard di refertazione e sull’utilizzo di metodiche per la determinazione dello stato di
HER2 nel carcinoma mammario” che rappresentano ad oggi il documento di riferimento in Italia.
7
Requisiti minimi e standard di refertazione
Statement
Dalle sessioni delle Consensus dedicate al carcinoma
mammario, gli statement votati, con un focus su alcuni
degli argomenti più attuali
Stato dei margini
Il ruolo di HER2 nel carcinoma mammario
Per la valutazione dei margini il campione va chinato
■ La valutazione dei margini va eseguita macroscopicamente
con conferma istologica del margine più vicino, indicando
la distanza in mm.
■ Nel caso di infiltrazione visibile solo istologicamente si deve
riportare se la medesima è focale o estesa (≥di 1 campo a 4x)
L ’ e vo l u z i o n e d e l l e te c n i c h e d i a g n o st i c h e st r u -
■
100
m e n ta l i e l e c o n o s c e n ze p i ù a p p r o fo n d i te s u l l a
sto r i a n a t u r a l e e b i o m o l e c o l a r e d e l c a r c i n o m a
m a m m a r i o h a n n o m o d i fi c a to r a d i c a l m e n te l ’ a p p r o c c i o te r a p e u t i c o a l l a n e o p l a s i a m a m m a r i a ,
91%
80
favo r e n d o u n a st r a te g i a p e r s o n a l i z z a ta d e l l e
60
cure.
A riguardo, l’individuazione di alcuni “punti chia-
40
20
8%
0
D’accordo
Parzialmente
d’accordo
ve ” m o l e c o l a r i , n e c e s s a r i a l l a c e l l u l a n e o p l a st i c a
1%
Disaccordo
p e r l ’ a c q u i s i z i o n e d e l l e c a r a t te r i st i c h e d i m a l i g n i tà , h a e v i d e n z i a to i l r u o l o p r i m a r i o svo l to d a l l a s u p e r fa m i g l i a H E R / EG F R , e i n p a r t i c o l a r e d a l
Statement
Focolai multipli
c - e r b B 2 / H E R 2 . S i t r a t ta d i r e c et to r i t i r o s i n - c h i -
Il termine “multicentrico” o “multifocale” dovrebbe essere
sostituito con il termine “multiplo”
■ Tumori multipli nettamente separati da parenchima normale
vanno campionati con le stesse modalità utilizzate
per le neoplasie singole
■ Focolai multipli di invasione insorti su un carcinoma duttale
in situ vanno considerati come lesione
■
100
95%
n a s i c i i n g r a d o d i t r a s fe r i r e g r u p p i fo s fo r i c i d a
d o n a to r i a d a l ta e n e r g i a , c o m e l ’ AT P , a d a l t r e
molecole.
S o n o e n z i m i a st r u t t u r a m o n o m et r i c a : c o st i t u i ta d a u n d om ain t r a n s m e m b r a n a d i p o c h i a m i -
80
n o a c i d i , u n dom ai n e xt r a c e l l u l a r e N - te r m i n a l e ,
60
d e st i n a to a l l e g a m e c o n fa t to r i d i c r e s c i ta e o r -
40
m o n i , e d u n d om ain i n t r a c e l l u l a r e C - te r m i n a l e ,
20
4%
2%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
D’accordo
r e s p o n s a b i l e d e l l ’ a t t i v i tà c h i n a s i c a p r o p r i a m e n te d et ta
Le v i e d e l s e g n a l e i n d ot te d a l r e c et to r e H E R 2
n o n s o n o c o m p l eta m e n te n ote , m a l ’ a t t i va z i o n e
Statement
Refertazione
Il referto deve includere tutti gli 8 parametri prognostico/predittivi
identificati dal Consenso di St. Gallen. L’inclusione nel referto
di parametri aggiuntivi non è attualmente raccomandata
Parametri San Gallen
1. Tipo istologico (sec. WHO 2003)
2. Diametro del tumore
3. Grado
4. Invasione vascolare
100
5. Stato linfonodale
6. Assetto recettoriale
7. HER2
8. Ki67
98%
80
60
40
20
0
D’accordo
8
2%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
d e l m e c c a n i s m o P I 3 K / A k t è c e r ta m e n te c e n -
Diametro, istotipo, grado
istologico, grado nucleare,
neoangiogenesi sono i fattori
morfologici del carcinoma mammario che guidano la valutazione
prognostica
Tipo istologico
Statement
L’iperespressione di HER2
è un fattore prognostico negativo e predittivo di risposta alla
terapia
■
La neoplasia deve essere classificata in accordo al tipo istologico
previsto da OMS
100
100%
80
60
40
20
t r a l e , a s s o c i a to a l s e g n a l e m i to g e n et i c o a t t r a -
0
D’accordo
ve r s o l a v i a M A P K .
0%
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
I l g e n e H E R 2 è u n p r oto - o n c o g e n e s i t u a to s u l
Diametro del tumore
c h e , u n a vo l ta a t t i va to , d a o r i g i n e a d u n a c a s c a -
■
ta d i s e g n a l i i n t r a c e l l u l a r i s e c o n d a r i , c h e c o m p o r ta n o u n a s p i n ta c o m p l e s s i va ve r s o l a p r o l i fe r a z i o n e c e l l u l a r e e l a s o p p r e s s i o n e d i m e c c a n i s m i a p o ptot i c i .
Statement
braccio lungo del cromosoma 17 (17q11.2-q12),
La dimensione del tumore è quella macroscopica, a meno che
non venga indicata nel referto istologico una diversa
dimensione microscopica
■ In tumori con nodi multipli si misura e si stadia (T) il nodo
di diametro maggiore; le dimensioni degli altri noduli vanno
comunque riportate
100
98%
80
D a t i i n l et te r a t u r a i n d i c a n o c h e c i r c a i l 1 5 - 2 0 %
60
d e l l e d o n n e c o l p i te d a c a r c i n o m a d e l l a m a m -
40
m e l l a h a n n o u n c a r c i n o m a c o n a m p l i fi c a z i o n e
20
d e l g e n e c h e c o d i fi c a p e r H E R 2 , c o n c o n s e -
0
2%
D’accordo
g u e n te s ov r a e s p r e s s i o n e d e l r e c et to r e .
Q u e sta s i t u a z i o n e s i a s s o c i a a d u n a m a l a t t i a a g -
s p r e s s i o n e d i H E R 2 è u n fa t to r e p r e d i t t i vo d i r i s p o sta a l l a te r a p i a a n t i - H E R 2 .
Statement
te r i st i c a p e c u l i a r e p i ù i m p o r ta n te è c h e l ’ i p e r e -
0%
Disaccordo
Grado
g r e s s i va a p r o g n o s i i n fa u sta , c o n a u m e n ta to r i s c h i o d i m eta sta t i z z a z i o n e a d i sta n z a . La c a r a t -
Parzialmente
d’accordo
Pe r ta n to i n q u e st ’ a m b i to , u n a p p r o c c i o te r a -
■
■
Il grado istologico deve essere valutato secondo i criteri
di Elston & Ellis, ed applicato a tutti i carcinomi della mammella
Per le agobiopsie, si suggerisce di utilizzare i sistemi di grading
nucleare quando non è possibile valutare in modo adeguato
il grado di Elston & Ellis
100
96%
80
60
p e u t i c o p e r s o n a l i z z a to i m p l i c a d u e m o m e n t i
40
fo n d a m e n ta l i :
20
4%
ƒ l a c o r r et ta i d e n t i fi c a z i o n e d e i b e r s a g l i m o l e -
0
D’accordo
colari;
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
ƒ l ’ u t i l i z zo ot t i m a l e d e l l e o p p o r t u n i tà te r a p e u t i -
Stato linfonodale
Tr a st u z u m a b è u n a n t i c o r p o m o n o c l o n a l e u m a n i z z a to s p e c i fi c o p e r i l r e c et to r e H E R 2 ; i l s u o
l e g a m e a l d o main I V e xt r a c e l l u l a r e d e l r e c et to r e a r r e sta i l c i c l o c e l l u l a r e i n G 1 , ve r o s i m i l m e n te
Statement
che oggi disponibili.
b l o c c a n d o l a c a s c a ta P I 3 K .
■
Lo stato linfonodale comprendente il numero di linfonodi
esaminati e delle eventuali metastasi deve essere sempre
riportato nel referto
100
100%
80
60
40
S i r i c o n o s c o n o a l fa r m a c o l e s e g u e n t i a z i o n i a n -
20
titumorali:
0
D’accordo
ƒ Il blocco dell’HER-2, impedendo processi mo-
0%
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
Malgrado i progressi in campo
diagnostico abbiano permesso
l’identificazione di forme tumorali
non palpabili <1 cm, non è ancora
stata chiarita in modo definitivo
la loro rilevanza prognostica
Statement
l e c o l a r i o r i e n ta t i a l l a p r o l i fe r a z i o n e c e l l u l a r e ;
Scelta del campione per la determinazione
dei fattori prognostici predittivi
■
La valutazione dei parametri biologici (assetto recettoriale, stato
di HER2 e Ki67) deve essere effettuata anche sulle biopsie
pre-operatorie se è prevista terapia neo-adiuvante e sulle biopsie
di recidive e metastasi
100
99.3%
80
60
40
20
0
D’accordo
0.7%
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
9
Statement
Il patologo dovrà garantire la massima accuratezza nell’identificazione e nella misurazione della componente invasiva nei carcinomi
mammari di piccole dimensioni (minori o uguali a cm. 1,0), specificandone anche il diametro massimo istologico
dei fattori prognostico predittivi
■
Nel caso di neoplasie, la determinazione dei parametri biologici
va effettuata su tutte le lesione di diverso istotipo o grado
100
ƒ l a c i to s s i c i tà a n t i c o r p o - m e d i a ta ( A D C C ) , c o n
i n n e s c o d e l l a c a s c a ta d e l l a v i a d e l c o m p l e m e n to o d e l l e c e l l u l e i m m u n o c o m p ete n t i c h e
r i c o n o s c o n o i l f r a m m e n to Fc d e g l i a n t i c o r p i ;
96%
80
ƒ u n a a t t i v i tà a n t i - a n g i o g e n et i c a .
60
I m a g g i o r i st u d i i n te r a p i a a d i u va n te ( c o n o l t r e
40
1 4 . 0 0 0 p a z i e n t i ) h a n n o d o c u m e n ta to u n va n ta g g i o c l i n i c a m e n te s i g n i fi c a t i vo d i t r a st u z u m a b i n
20
3%
1%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
D’accordo
te r m i n i s i a d i s o p r av v i ve n z a l i b e r a d a m a l a t t i a
( D FS ) s i a d i s o p r av v i ve n z a g l o b a l e ( O S ) .
Statement
N e l d et ta g l i o , l e a n a l i s i d e i s ot to g r u p p i d e l l o st u -
Determinazione sui carcinomi in situ fattori
prognostici predittivi
■
La determinazione dell’assetto recettoriale (ER/PR) deve essere
effettuata anche su neoplasie intraduttali
100
96.4%
d i o i n te r n a z i o n a l e , m u l t i c e n t r i c o , r a n d o m i z z a to
H E Rc e pt i n Ad j u va n t ( H E R A ) , d i m o st r a n o c h e l a
te r a p i a a d i u va n te c o n t r a st u z u m a b è sta ta i n
g r a d o d i r i d u r r e i l r i s c h i o d i r e c i d i va d e l c a r c i n o m a , i n d i p e n d e n te m e n te d a l l o sta to l i n fo n o d a -
80
l e o r e c et to r i a l e , e a p r e s c i n d e r e d a l l ’ età d e l l a
60
p a z i e n te o d a l l e d i m e n s i o n i d e l c a r c i n o m a .
40
20
0
D’accordo
2.1%
1.4%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
I tumori infracentimetrici
Pe r c i ò c h e c o n c e r n e l e d i m e n s i o n i t u m o r a l i va
s ot to l i n e a to c h e g r a z i e a c a m p a g n e d i d i a g n o s i
p r e c o c e , c o n g i u n ta m e n te a d i n d a g i n i st r u m e n -
Statement
Determinazione dei recettori ormonali
■
La valutazione dell’assetto dei recettori ormonali deve essere
espressa in valori percentuali indipendentemente dalla intensità
di colorazione
100
ta l i p i ù s e n s i b i l i , s i è i n c r e m e n ta ta l a p o s s i b i l i tà
d i i d e n t i fi c a r e t u m o r i s p e s s o n o n p a l p a b i l i c o n
d i a m et r o i n fe r i o r e a l c e n t i m et r o .
Tu t tav i a , a n c o r a o g g i n o n s i c o n o s c e l a rea le r i -
97%
80
l e va n z a c h e l e d i m e n s i o n i d e l c a r c i n o m a h a n n o
60
a i fi n i p r o g n o st i c i e , a n c o r d i p i ù , a l l a te r a p i a .
40
E ’ d o c u m e n ta to c h e l o sta to H E R 2 p o s i t i vo r a p -
20
D’accordo
p r e s e n ta a n c h e p e r i t u m o r i d i p i c c o l e d i m e n -
3%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
s i o n i ( 1 c m o m e n o ) u n fa t to r e p r o g n o st i c o i n d i p e n d e n te n e g a t i vo d i r i s c h i o d i r i c a d u ta o d i
Statement
m o r ta l i tà bre as t-can c er re lated : l o st u d i o r e -
Determinazione dell’indice di proliferazione
con Ki67
Ki67 va determinato in ogni carcinoma primitivo invasivo
della mammella
■ La valutazione della frazione di cellule proliferanti va espressa
come percentuale di cellule positive per Ki67, indipendentemente
dalla intensità di colorazione e deve essere effettuata alla
periferia della neoplasia su più campi non selezionati
■
100
99%
80
60
40
20
1%
0
D’accordo
10
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
t r o s p et t i vo d i c o o r te d e l g r u p p o d e l M D A n d e r s o n C e n te r c o n d ot to s u 9 6 5 p a z i e n t i c o n c a r c i n o m a m a m m a r i o H E R 2 p o s i t i vo , d i d i m e n s i o n i
i n fe r i o r i a 1 c m , h a r i p o r ta to u n a p e r c e n t u a l e d i
Lo stato di HER-positività anche
nei tumori <1 cm è un fattore
prognostico indipendente negativo di rischio di ricaduta o di
mortalità carcinoma-correlata
Dagli statement emerge la necessità di valutare lo status di HER2
(oltre che degli altri parametri prognostico-predittivi) nei carcinomi
mammari di piccole dimensioni limitatamente alla componente infiltrante, anche nei tumori microinvasivi
Determinazione di HER2
ri HER2 negativi.
■
I n o l t r e , i t u m o r i H E R 2 p o s i t i v i m o st r ava n o u n r i s c h i o s i g n i fi c a t i va m e n te s u p e r i o r e , d i o l t r e 5
vo l te , d i a n d a r e i n c o n t r o a r e c i d i ve a 5 a n n i , r i s p et to a i t u m o r i o r m o n o s e n s i b i l i .
Statement
r e c i d i va a 5 a n n i d e l 2 3 % , c o n t r o i l 7 % d e i t u m o -
L’iperespressione/amplificazione di HER2 deve essere
valutata in ogni carcinoma invasivo mammario primitivo all’atto
della prima diagnosi o della recidiva
100
100%
80
60
40
S u l l a b a s e d i q u e st i r i s u l ta t i , g l i a u to r i c o n c l u d o -
20
no che è necessario prendere in considerazio-
0%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
n e i l t r a t ta m e n to i n p a z i e n t i c o n t u m o r i p i c c o l i
D’accordo
s e n z a i n te r e s s a m e n to l i n fo n o d a l e , n é m eta sta s i
anti-HER2.
S u u n ’ a l t r a c o o r te d i o l t r e 2 0 0 0 p a z i e n t i a ffe r e n t i a l l ’ I st i t u to E u r o p e o d i O n c o l o g i a , C u r i g l i a n o
et a l r i p o r ta n o u n a p r o g n o s i p e g g i o r e p e r i t u mori pT1aN0, HER2-positivi e ormonosensibili.
Statement
a d i sta n z a - T 1 a b N 0 M 0 - c o n te r a p i a a d i u va n te e
Tumori HER2+ di piccole dimensioni
prognosi e terapie
■
La presenza di iperespressione/amplificazione di HER2 è
associata a prognosi peggiore anche nei tumori T1 di piccole
dimensioni (pT1a-b) pNO
■
Il trattamento adiuvante con Trastuzumab potrebbe essere
efficace anche in pazienti con tumore mammario HER2-positivo
di dimensioni pari od inferiori ad 1 cm
100
Infine, un’ulteriore conferma viene dalla revisione dei dati in letteratura svolta da Swain e pre-
75
sentata all’ASCO 2009: tumori HER2 positivi di
50
qualunque dimensione- incluso l’infracentimetri-
25
co- possono trarre vantaggio in termini di disea-
0
D’accordo
Statement
se free suvival (DFS) dal trattamento con trastuzumab.
D I c o n s e g u e n z a , è i n d i c a ta l a va l u ta z i o n e d e l l e
c a r a t te r i st i c h e b i o l o g i c h e a n c h e n e i t u m o r i d i
p i c c o l e d i m e n s i o n i , e d è i m p o r ta n te r i c o r d a r e i l
c o n t r i b u to d e l p a to l o g o , c h e d ov r à :
ƒ garantire la massima accuratezza nella identificazione e nella misurazione della componente invasiva nei carcinomi mammari di piccole dimensioni (minori o uguali a cm. 1,0), specificandone anche il diametro massimo istologico,
ƒ va l u ta r e l o sta t u s d i H E R 2 ( oltre c he d eg li al -
2.08%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
Identificazione e misurazione
componente infiltrante
■
Il patologo deve garantire la massima accuratezza nella
identificazione e nella misurazione della componente invasiva
nei carcinomi mammari di piccole dimensioni (minori o uguali
a cm. 1,0), specificandone anche il diametro massimo istologico
■
La valutazione dello status di HER2 (oltre che degli altri
parametri prognostico-predittivi) nei carcinomi di piccole
dimensioni deve essere limitata alla componente infiltrante,
anche nei tumori microinvasivi
100
99.32%
75
50
25
tri p aram etri p ro gno stic o -p red ittiv i ) n e i c a r c i n o m i d i p i c c o l e d i m e n s i o n i l i m i ta ta m e n te
a l l a c o m p o n e n te i n fi l t r a n te , a n c h e n e i t u m o r i m i c r o i n va s i v i .
0
D’accordo
0.68%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
Amplificazione genica
Statement
Tutte le pazienti con tumori
HER2-positivi di qualsiasi dimensione trattate con trastuzumab
mostrano un aumento della sopravvivenza libera da malattia
97.92%
■
Nei casi con dubbia iperespressione di HER2, la valutazione
dell’amplificazione del gene nei carcinomi di piccole dimensioni
è facilitata dall’impiego di reazioni di ibridazione in situ in
campo chiaro (CISH/SISH)
100
98.62%
75
50
25
0
D’accordo
0%
1.38%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
11
Dalle “Raccomandazioni AIOM-SIAPEC-IAP sui re
e sull’utilizzo di metodiche per la determinazione
Requisiti minimi e standard
di refertazione
Diametro del carcinoma
La dimensione del carcinoma è quella macroscopica, a meno che non venga indicata nel referto
istologico una diversa dimensione microscopica.
Campionamento della neoplasia
I n t u m o r i c o n n o d i m u l t i p l i s i m i s u r a e s i sta d i a
Da ogni neoplasia della mammella si devono ot-
( T ) i l n o d o d i d i a m et r o m a g g i o r e ; l e d i m e n s i o n i
tenere non meno di 3 inclusioni in paraffina se le
d e g l i a l t r i n o d i va n n o c o m u n q u e r i p o r ta te .
dimensioni del carcinoma lo consentono.
I l p a to l o g o d e ve g a r a n t i r e l a m a s s i m a a c c u r a te z z a n e l l a i d e n t i fi c a z i o n e e n e l l a m i s u r a z i o n e
Stato dei margini
d e l l a c o m p o n e n te i n va s i va n e i c a r c i n o m i m a m -
Per la valutazione dei margini il campione va chi-
mari di piccole dimensioni (minori o uguali a cm.
nato.
1 , 0 ) , s p e c i fi c a n d o n e a n c h e i l d i a m et r o m a s s i m o
La valutazione dei margini va eseguita macro-
i sto l o g i c o .
scopicamente con conferma istologica del mar-
La p r e s e n z a d i i p e r e s p r e s s i o n e / a m p l i fi c a z i o n e
gine più vicino, indicando la distanza in mm.
d i H E R 2 è a s s o c i a ta a p r o g n o s i p e g g i o r e a n c h e
Nel caso di infiltrazione visibile solo istologica-
nei tumori T1 di piccole dimensioni (pT1a-b) pN0;
mente si deve riportare se la medesima è foca-
i l t r a t ta m e n to a d i u va n te c o n ta r g et t h e r a py p o -
le o estesa (>1 di campo a 4x).
t r e b b e e s s e r e e ffi c a c e a n c h e i n p a z i e n t i c o n
c a r c i n o m a m a m m a r i o H E R 2 - p o s i t i vo d i d i m e n -
Focolai multipli
s i o n i p a r i o d i n fe r i o r i a d 1 c m .
Il termine “multicentrico” o “multifocale” deve es-
La va l u ta z i o n e d e l l o sta to d i H E R 2 ( o l t r e c h e d e -
sere sostituito con il termine “multiplo”.
g l i a l t r i p a r a m et r i p r o g n o s t i c o - p r e d i t t i v i ) n e i
Tumori multipli nettamente separati da parenchi-
carcinomi di piccole dimensioni, anche microin-
ma normale vanno campionati con le stesse mo-
va s i v i , d e ve e s s e r e l i m i ta ta a l l a c o m p o n e n te i n -
dalità utilizzate per le neoplasie singole. Focolai
fi l t r a n te .
multipli di invasione insorti su un carcinoma dut-
La va l u ta z i o n e d e l l ’ a m p l i fi c a z i o n e d e l g e n e n e i
tale in situ vanno considerati come lesione sin-
c a r c i n o m i d i p i c c o l e d i m e n s i o n i è fa c i l i ta ta d a l -
gola.
l’impiego di reazioni di ibridazione in situ in
campo chiaro (CISH/SISH).
Refertazione
Il referto deve includere tutti gli 8 parametri
Grado
prognostico/predittivi identificati dal Consenso
I l g r a d o i sto l o g i c o d e ve e s s e r e va l u ta to s e c o n -
di St. Gallen. L’inclusione nel referto di parametri
d o i c r i te r i d i E l sto n & E l l i s , e d a p p l i c a to a t u t t i i
aggiuntivi non è attualmente raccomandata.
c a r c i n o m i d e l l a m a m m e l l a . Pe r l e a g o b i o p s i e , s i
Parametri San Gallen
s u g g e r i s c e d i u t i l i z z a r e i s i ste m i d i g r a d i n g n u -
ƒ Tipo istologico (sec. WHO 2003)
c l e a r e q u a n d o n o n è p o s s i b i l e va l u ta r e i n m o d o
ƒ Diametro del carcinoma
a d e g u a to i l g r a d o d i E l sto n & E l l i s .
ƒ Grado
ƒ Invasione vascolare
I n va s i o n e va s c o l a r e
ƒ Stato linfonodale
La p r e s e n z a o m e n o d i i n va s i o n e va s c o l a r e p e -
ƒ Assetto recettori ormonali
r i t u m o r a l e d e ve e s s e r e i n d i c a t a , e d e f i n i t a
ƒ HER2
“ e ste s a ” , s e i d e n t i fi c a ta i n 2 o p i ù i n c l u s i o n i d e l -
ƒ Ki67.
l a ste s s a n e o p l a s i a .
Tipo istologico
D i a g n o s i s u l i n fo n o d o s e n t i n e l l a
La neoplasia deve essere classificata in accordo
E ’ o p p o r t u n o i n d i c a r e i l p r oto c o l l o u t i l i z z a to p e r
al tipo istologico previsto da OMS.
l a va l u ta z i o n e d e l l i n fo n o d o s e n t i n e l l a .
12
quisiti minimi e gli standard di refertazione
dello stato di HER2 nel carcinoma mammario”
www.aiom.it
www.siapec.it
La d i a g n o s i m o r fo l o g i c a s u l i n fo n o d o s e n t i n e l l a
dipendentemente dalla intensità di colorazione.
d e ve e s s e r e r i p o r ta ta s e c o n d o l a d e fi n i z i o n e
La valutazione dell’assetto recettoriale deve cor-
TNM.
rispondere alla espressione media di recettori
dell’intera sezione esaminata.
Stato linfonodale
Il controllo positivo interno deve mostrare una
Lo stato linfonodale, comprendente il numero di
colorazione eterogenea delle cellule luminali nor-
linfonodi esaminati e delle eventuali metastasi,
mali, con cellule non colorate accanto a cellule
deve essere sempre riportato nel referto.
debolmente colorate e a cellule intensamente
colorate.
Stadiazione TNM
Una colorazione limitata a poche cellule e di ugua-
La stadiazione TNM deve essere sempre ripor-
le intensità può essere dovuta ad una scarsa sen-
tata.
sibilità della reazione. Le cellule mioepiteliali e le
cellule stromali rappresentano un utile controllo
Referto del carcinoma in situ
negativo interno: una loro colorazione, per quanto
Nelle neoplasia in situ va indicato il tipo istologi-
debole, è segno di aspecificità della reazione.
co, il grado nucleare, la presenza di necrosi comedonica e la relativa classificazione DIN/LIN
Determinazione dell’indice di proliferazione
Per la definizione dell’estensione e dei margini il
(Ki67)
campione chirurgico va incluso in toto a meno di
Ki67 va determinato in ogni carcinoma primitivo
non disporre di studio radiologico del pezzo.
invasivo della mammella.
La valutazione della frazione di cellule prolife-
ranti dovrebbe essere espressa come percen-
dei fattori prognostico predittivi
tuale di cellule positive per Ki67 indipendente-
E’ necessario che l’inclusione scelta per la deter-
mente dalla intensità di colorazione e deve esse-
minazione dei parametri biologici includa anche
re effettuata alla periferia della neoplasia su più
parenchima mammario non neoplastico in tutti i
campi non selezionati.
casi in cui ciò sia possibile.
La valutazione dei parametri biologici (assetto
Determinazione di HER2
recettoriale, stato di HER2 e Ki67) deve essere
L’iperespressione/amplificazione di HER2 deve
effettuata anche sulle biopsie pre-operatorie se
essere valutata in ogni carcinoma invasivo mam-
è prevista terapia neo-adiuvante e sulle biopsie
mario primitivo all’atto della prima diagnosi o del-
di recidive e metastasi.
la recidiva (per le metodiche vedi sotto).
Nel caso di neoplasie multiple, la determinazione
dei parametri biologici va effettuata su tutte le
I n te g r a z i o n e d e i p a r a m et r i m o r fo l o g i c i e
lesioni solo se di diverso istotipo o grado.
biologici
Il patologo è responsabile della congruità dei pa-
Determinazione sulle neoplasie in situ fattori
rametri diagnostici, prognostici e predittivi.
prognostico predittivi
La
d ete r m i n a z i o n e
d e l l ’ a s s et to
r e c et to r i a l e
Controlli di qualità
(ER/PR) deve essere effettuata anche sulle neo-
E’ fortemente raccomandata la partecipazione a
plasie intraduttali.
programmi di controllo esterno della qualità (VEQ)
per la determinazione di ER, PR, HER2 e Ki67.
Determinazione dei recettori ormonali
Il referto deve riportare il clone utilizzato per la
Integrazione nei nomenclatori/tariffari
determinazione immunocitochimica dei recettori.
E’ necessario il riconoscimento della determina-
La valutazione dell’assetto dei recettori ormona-
zione dei parametri biologici nel nomenclatore/ta-
li deve essere espressa in valori percentuali in-
riffario.
13
Le metodiche di rilevazione
Immunoistochimica nella determinazione dello stato di HER2
Statement
Quando e su quali campioni effettuare il test
La determinazione dello stato di HER2 deve essere effettuata
sempre al momento della diagnosi sul tumore primario infiltrante
100
100%
Lo sta to d i H E R 2 r a p p r e s e n ta u n i m p o r ta n te
fattore prognostico e predittivo del carcinoma
mammario. E’ ampiamente accettato che l’immunoistochimica (IIC) sia la metodica di scree-
80
ning di primo livello di tutti i nuovi tumori mam-
60
mari: il grado di affidabilità della tecnica dipen-
40
de però da numerosi fattori legati alle modalità
20
0
D’accordo
0%
0%
di preparazione ed analisi dei campioni, all’inter-
In disaccordo
Non so
pretazione dei risultati, nonché alle procedure di
refertazione e ai controlli di qualità sui test eseguiti.
Statement
In presenza di progressione di malattia la determinazione
va effettuata sulla lesione metastatica, se disponibile,
o sul tumore primario se non precedentemente effettuata
secondo gli attuali standard
Inoltre, in presenza di malattia metastatica, è
preferibile valutare lo stato di HER2 nella sede
di recidiva, a causa della possibile discordanza,
stimata intorno al 10-20%, fra carcinoma prima-
100
100%
rio e metastasi. Per contro, su campioni citologi-
80
ci non inclusi la tecnica non permette una ade-
60
guata valutazione, e pertanto viene raccoman-
40
data la tecnica di ibridazione in situ.
20
0
D’accordo
0%
0%
In disaccordo
Non so
Di seguito, sono riportati alcuni punti fermi relativi alla metodica IIC:
ƒ L’IIC è stata validata su campioni tessutali fis-
Statement
Qualora siano disponibili solo preparati citologici non inclusi,
si raccomanda l’utilizzo di ibridazione in situ come
metodo di determinazione
100
sati in formalina neutra tamponata al 10%;
ƒ Fissativi diversi (in particolare su base alcolica) vanno validati;
ƒ E’ obbligo di ogni laboratorio organizzare mo-
96%
80
dalità di trasporto e consegna del campione
60
per consentire un’adeguata e rapida fissazione/conservazione;
40
ƒ Il campione va fissato per almeno 6 ore e per
20
2%
2%
In disaccordo
Non so
0
D’accordo
un massimo di 48 ore;
ƒ E’ preferibile utilizzare kit standardizzati di
Statement
anticorpi anti-HER2 poli o monoclonali referenziati per aumentare la riproducibilità tra
Modalità e tempi di fissazione
dei campioni tessutali
laboratori;
I campioni tessutali da sottoporre a valutazione dello stato
di HER2 devono essere fissati in formalina neutra
tamponata al 10%, a meno che l’uso di fissativi alternativi
sia stato validato presso l’istituzione stessa.
100
97%
80
60
40
20
2%
1%
In disaccordo
Non so
0
D'accordo
14
Punteggi IIC 3+ indicano pazienti
con alta probabilità di risposta
a trastuzumab, mentre score
di 0 e 1+ sono considerati
negativi
L’immunoistochimica è la metodica più comunemente utilizzata come valutazione di primo livello. Le metodiche ISH vengono prevalentemente utilizzate per l’accertamento dell’eleggibilità alla terapia
con trastuzumab nei casi con immunoreattività 2+, e/o quando richiesto dal curante nell’appropriato contesto clinico
zando controlli interni, quali ghiandole mammarie normali; la rilevazione, in queste ultime,
di reattività più che minimale, deve fare considerare la possibilità di falsi positivi e indurre
a rivedere la tecnica;
Statement
ƒ I risultati della tecnica IIC vanno validati utiliz-
Modalità e tempi di fissazione
dei campioni tessutali
Il tempo di fissazione ottimale in formalina neutra
tamponata è compreso fra le 6 h e le 48 h, in relazione
alla tipologia del campione
100
100%
80
ƒ Per ovviare alle variazione di immunoreattivi-
60
tà in distinte aree neoplastiche, va esaminata
40
20
l’intera neoplasia presente sulla sezione isto-
0
D'accordo
logica, escludendo aree più periferiche o con
0%
0%
In disaccordo
Non so
artefatti morfologici;
ƒ La refertazione deve essere il più possibile
Scoring System
m u n e m e n te u t i l i z z a to u n o s c o r i n g s y s t e m
(0,1+,2+,3+), che tiene conto della percentuale di
cellule positive e della completezza e intensità della colorazione di membrana;
ƒ Il controllo di qualità inter e intra- laboratorio
Statement
chiara, concisa e priva di ambiguità: viene co-
Si raccomanda di esprimere lo stato di HER2 mediante uno scoring
system (0, 1+, 2+, 3+ secondo FDA e/o linee guida ASCO/CAP)
e con la valutazione descrittiva che tenga conto della percentuale
di cellule positive e della completezza
100
91%
80
60
è un dovere del servizio di istocitopatologia;
40
ƒ L’omogeneità e la riproducibilità della metodi-
20
ca va validata ri-testando una parte dei casi
9%
0
D’accordo
con tecniche di ibridazione molecolare.
Parzialmente
d’accordo
0%
Non so
L’importanza di HER2 come marcatore predittivo
di riposta al trastuzumab è ormai un dato consoli-
Correlazioni dei test IIC vs FISH
bilità di risposta all’anticorpo monoclonale, mentre
score di 0 e 1+ vengono considerati negativi.
Le tecniche di ibridazione
in situ: FISH/CISH/SISH
Statement
dato: punteggi 3+ indicano pazienti con alta proba-
E’ opportuno che ciascun laboratorio provveda a validare una
quota parte della casistica valutata in IIC con ibridazione in situ,
ottenendo una concordanza non inferiore al 90% nei casi 3+
100
95%
80
60
40
20
5%
0%
In disaccordo
Non so
0
Le tecniche di ibridazione in sit u sono analisi di
D’accordo
c i to g e n et i c a m o l e c o l a r e p e r l a r i l e va z i o n e d i
specifiche anomalie cromosomiche. Versatilità,
a p p l i c a b i l i tà e r i p r o d u c i b i l i tà d e l l e m eto d i c h e
hanno favorito un aumento della loro diffusione
in questi ultimi anni, soprattutto in ambito oncologico.
Al momento, la FISH è la tecnica di elezione per
la ricerca di un numero crescente di aberrazioni cromosomiche e/o alterazioni geniche, con
L’espressione di HER2 ≤1 nel
carcinoma primitivo è stata correlata ad una riduzione significativa della PFS, della DFS e della OS, soprattutto nelle pazienti
ormono-responsive
15
1
FISH/CISH/SISH: quando utilizzarle
Statement
La FISH viene considerata principalmente come metodica di valutazione di II° livello, in accordo con le linee guida internazionali e nazionali, da utilizzare dopo l’immunoistochimica, per dirimere quei casi in
cui la determinazione IIC abbia fornito risultati equivoci (IIC 2+) o per
contribuire a risolvere quesiti clinici specifici
■
Lo studio dell’amplificazione genica di HER2 nel carcinoma della
mammella mediante tecniche di ibridazione in situ fluorescente
o in campo chiaro è utilizzato come indagine di secondo livello
successivo alla valutazione con immunoistochimica
numerose applicazioni diagnostiche.
La standardizzazione delle procedure con questa te c n i c a n o n è c o m p i u ta m e n te d e fi n i ta , a
causa di limiti propriamente strumentali/tecnici
100
91%
e per possibili difficoltà nell’interpretazione dei
80
risultati: Dowsett et al hanno riscontrato in un
60
40
20
9%
0%
0
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
2
FISH/CISH/SISH: quando utilizzarle
Statement
D’accordo
■
La FISH/CISH/SISH va eseguita su tutti i casi 2+
(o “equivoci” secondo le linee guida ASCO/CAP) all’analisi
immunoistochimica o su richiesta del medico curante
100
97%
80
60
40
20
0
1%
2%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
4
FISH/CISH/SISH: su quali campioni eseguirle
Statement
D’accordo
■
FISH/CISH/SISH possono essere efficacemente impiegati
su preparati istologici fissati in formalina neutra tamponata
■ FISH/CISH rappresentano la metodica di elezione per preparati
citologici (convenzionali o in monostrato) di lesioni metastatiche
■ Non vi sono ancora procedure standardizzate per la SISH
su preparati citologici
100
proficiency program svolto in 5 laboratori di riferimento una discordanza di lettura dello status di HER2 alla FISH dell’ordine del 20%.
I n o c c a s i o n e d e l l e p a s s a te c o n s e n s u s fu r o n o
poste le basi per una maggiore accuratezza e
riproducibilità della rilevazione di HER2 utilizzando metodiche di ibridazione in situ cromogeniche, come CISH e SISH.
La FISH viene considerata principalmente come
metodica di valutazione di II° livello, in accordo
con le linee guida internazionali e nazionali, da
utilizzare dopo l’immunoistochimica, per dirimere quei casi in cui la determinazione IIC abbia
fornito risultati equivoci (IIC 2+) o per contribuire
a risolvere quesiti clinici specifici.
L'impiego di tecniche di ibridazione in situ è, comunque, possibile anche per la valutazione di
primo livello dello stato di HER 2 nel carcinoma
della mammella.
L’adozione di tecniche dual color , che utilizzano
due fluoro cromi o due cromogeni diversi per
visualizzare sullo stesso preparato istologico o
93%
citologico la regione centromerica del cromoso-
80
60
ma 17 (sonda CEP 17) ed il numero di copie del
40
gene HER2 (sonda locus-specifica), deve essere
privilegiata.
20
0
D’accordo
2%
5%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
La valutazione, deve essere fatta su almeno 20
cellule neoplastiche e in almeno due campi di-
6
FISH/CISH/SISH: il cromosoma 17
Statement
ve r s i d e l l a c o m p o n e n te i n va s i va , p e r r e n d e r e
■
ragione dell’eterogeneità tumorale;
Per la FISH è raccomandabile l’uso di kit che includano una sonda
centromerica (dual color).
Per CISH/SISH, è raccomandabile la valutazione del cromosoma 17
con sonda centromerica su sezioni consecutive
100
97%
gene HER2/segnali centromerici del cromosoma 17, è definito come amplificato un rapporto >2/nucleo;
80
ƒ nel caso di un rapporto tra 1,8 e 2,2, conside-
60
rato equivoco dalle linee guida CAP/ASCO, va
40
ripetuta la reazione su altri campioni o la let-
20
0
D’accordo
16
ƒ deve comprendere il rapporto tra segnali del
1%
2%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
tura, che può essere fatta dallo stesso o affidata a un secondo osservatore;
stiche in cui il gene HER2 risulta amplificato,
nonché il valore di cut-off applicato per lo
score finale.
La FISH, pur restando la tecnica di riferimento
per la predittività di risposta al trattamento con
trastuzumab, presenta alcune criticità: necessità
di attrezzature costose, specifiche e dedicate;
perizia del lettore; impossibilità di conservazione
a lungo termine dei preparati per decadimento
del fluorocromo; mancanza di dettaglio morfologico che non consente un confronto con IIC.
Per ovviare ad alcune di queste problematiche,
sono state introdotte la CISH e la SISH, metodiche di ibridazione in situ in campo chiaro, che
prevedono, quindi, l’utilizzo del comune microscopio ottico, garantendo una migliore correlazione
tra aspetti morfologici e risultato della reazione.
8
FISH: l’interpretazione dei risultati
■
Si raccomanda di valutare non meno di 20 cellule/campo
in almeno 2 campi della componente invasiva identificata
sulla sezione in E/E
■ I preparati citologici vanno esaminati interamente
100
98%
80
60
40
20
0
D’accordo
1%
1%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
9
FISH: l’eterogeneità tumorale
Statement
ƒ va segnalata la percentuale di cellule neopla-
Statement
L’introduzione di CISH e SISH ha permesso di ovviare ad alcune
problemtiche tecniche della FISH, garantendo una migliore
correlazione tra aspetti morfologici e risultato della reazione
■
■
E’ opportuno esaminare il preparato allestito con la FISH
sulla base della reattività dell’IIC
In caso di popolazione neoplastica eterogenea è opportuno
riportare la percentuale di cellule in cui il gene risulta
amplificato
100
99%
80
60
L ’ i b r i d a z i o n e in si tu c r o m o g e n i c a ( C I S H ) è la
40
metodica di elezione per preparati citologici o in
20
monostrato di lesioni metastatiche. Rappresen-
1%
0
D’accordo
ta una valida alternativa alla FISH, con livelli di
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
concordanza riportati in letteratura superiori al
95%. La valutazione dello stato di HER2 va effetneoplasia mammaria. Il segnale è sotto forma di
precipati puntiformi o aggregati di cromogeno;
la sezione va esaminata dapprima ad ingrandimento relativamente basso per valutare la omogeneità o meno della distribuzione dei segnali.
Quando si utilizzino tecniche con una sola sonda
10
Statement
t u a ta s o l o s u l l a c o m p o n e n te i n fi l t r a n te d e l l a
Lo stato del gene si valuta tramite il rapporto tra le copie
di geni HER2 e i segnali centromerici del cromosoma 17
■ Un rapporto >2,2 dimostra amplificazione del gene
■ E’ necessario anche riportare la media dei segnali CEP17
per fornire indicazioni sulla polisomia
■
100
99%
80
60
specifica per il gene HER2, è accertata l’amplificazione del gene quando si contano >6 segnali/nucleo o grandi cluster , mentre è considerata
negativa quando i segnali sono <4/nucleo.
40
20
1%
0
D’accordo
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
Nei casi dubbi, 4-6 segnali/nucleo, si raccomanda
di verificare anche il numero dei centromeri del
cromosoma 17, per escludere casi di polisomia. Se
si utilizzano tecniche di dual-color , con una sonda
specifica per il gene HER2 ed una per il centromero del cromosoma 17, la valutazione della eventuale amplificazione genica viene effettuata applicando gli stessi criteri della FISH (rapporto tra
gene e centromero maggiore o uguale a 2).
La CISH, metodica di elezione
per preparati citologici
di lesioni metastatiche, è una
valida alternativa alla FISH, con
una concordanza superiore
al 95%
17
Se si utilizzano le tecniche di dual-color, la valutazione dell’eventuale amplificazione genica si effettua applicando gli stessi criteri che
vengono utilizzati con la FISH
Statement
11
Tecniche metallografiche, distinte in autometal-
FISH: il referto finale
■
Nel referto finale si deve indicare se il tumore è amplificato
o non amplificato. Non è necessario riportare la ratio
100
94%
lografia a base di oro (Nanogold with gold enhancement in situ hybridization: GOLDFISH) o metallografia enzimatica a base di argento (SISH). In que-
80
sta ultima metodica, il precipitato puntiforme d’ar60
gento - a bordo uniforme e arrotondato – identifi-
40
ca ogni copia del gene o del centromero del cro-
20
4%
2%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
D’accordo
mosoma 17; il precipitato nero contrasta nettamente con la colorazione standard con ematossilina.
Copie multiple vengono evidenziate come punti
Statement
12
multipli o cluster (gruppi di segnali di forma irre-
Nei casi con rapporto gene/cromosoma 17 compreso tra 1,8-2,2,
la conta dovrebbe essere ripetuta dallo stesso
o da un secondo osservatore.
■ In alternativa la reazione dovrebbe essere effettuata su
altre sezioni o, se disponibile, su una diversa inclusione della
neoplasia
■
100
golare). La concordanza totale con la FISH dual
color è riportata dell’ordine del 96 %, con discrepanze legate essenzialmente all’eterogeneità delle aree tumorali.
Analogamente alla CISH, la SISH permette il cal-
93%
80
colo del rapporto tra copie del gene e del cromo-
60
soma 17 sullo stesso preparato solo se vengono
40
utilizzate tecniche dual-color .
20
4%
3%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
La concordanza delle due metodiche con la FISH
0
D’accordo
è superiore al 95%, utilizzando lo scoring system
CAP/ASCO.
Statement
14
CISH/SISH: l’interpretazione dei risultati
Si deve esaminare tutta la sezione a 20X
■ Nel caso in cui si rilevi omogeneità di segnale, selezionare almeno
2 campi della neoplasia infiltrante e valutarli ad alto
ingrandimento evitando le aree periferiche della sezione
■ I preparati citologici vanno esaminati interamente
■
100
93%
La polisomia del cromosoma 17. Sulla base delle linee guida FDA e, più recentemente, delle racc o m a n d a z i o n i CA P / AS C O , l ’ a m p l i fi c a z i o n e d e l
gene HER2, quando si utilizzino tecniche dual co-
lor, viene indicata dal rapporto ≥2 o >2.2 tra nu-
80
mero di copie del gene HER2 e i segnali del cen-
60
tromero del cromosoma 17 (CEP 17); i tumori con
40
un aumento del numero di segnali sia per il gene
20
0
D’accordo
2%
5%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
HER2 sia per il CEP 17, ma con ratio <2 (<1.8 per
ASCO/CAP) sono considerati polisomici.
La polisomia 17, definita come presenza di 3 o più
copie del centromero 17, in assenza di amplifica-
Statement
15
CISH/SISH: l’interpretazione dei risultati
zione genica può essere associata ad una inten-
In caso di sicura amplificazione (>10 segnali o clusters) o non
amplificazione (1-4 segnali), l’analisi può essere effettuata a 40x
■ In presenza di un numero di segnali compreso tra 5 e 10
è opportuno proseguire l’analisi a maggior ingrandimento
(63x o 100x) contando almeno 40 cellule
sità di colorazione all’IIC di 2+, e più raramente a
■
100
92%
80
60
40
20
8%
0
D’accordo
18
3+: solo i casi polisomici con iperespressione del-
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
Secondo lo scoring system
CAP/ASCO, la concordanza
tra le due metodiche CISH/SISH
con la FISH è superiore al 95%
Poichè solo i casi polisomici IIC 3+ sono eleggibili alla targeted therapy, bisogna verificare l’incidenza di polisomia 17 in assenza di amplificazione genica e il meccanismo dell’aumento dei segnali CEP17
la proteina (IIC 3+) sono eleggibili per il trattamen-
FISH/CISH/SISH: la polisomia
del cromosoma 17
Diventa, quindi, prioritario verificare:
ƒ la reale incidenza di polisomia 17 in assenza di
amplificazione genica,
ƒ il meccanismo biologico responsabile dell’aumento dei segnali CEP 17,
Statement
to con targeted therapy .
Il tumore è considerato polisomico quando la media
delle copie del centromero 17 è 3
■ L’eventuale presenza di polisomia va segnalata in assenza
di amplificazione genica
■
100
90%
80
60
ƒ il valore biologico e clinico da attribuire alla
40
polisomia 17.
20
La reale incidenza di casi polisomici è dibattuta: i
D’accordo
dati in letteratura oscillano tra il 4 ed il 30%, in fun-
8%
2%
0
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
zione dei criteri utilizzati per la diagnosi. Le linee
guida ASCO/CAP definiscono la polisomia come la
copie CEP 17 per cellula in ≥30% dei nuclei contati.
Recentemente Marchiò C. et al, utilizzando la tecnica microarray- based comparative genomic hy-
bridization (aCGH) hanno suggerito che la polisomia vera potrebbe essere un evento molto raro:
nello studio solo il 5.5% delle polisomie individuate
con la FISH è stato confermato alla aCGH.
Infatti, quanto inizialmente definito polisomico
con la FISH dual color ha corrisposto piuttosto
ad un aumento ( gain ) o ad un’amplificazione della sola zona del centromero, e non ad un vero
aumento del numero dei cromosomi 17.
Il 20% delle pazienti di questo studio con carcinoma considerato “polisomico” alla FISH, con ratio
HER2:CEP17<2, mostravano in realtà amplificazione del gene HER2 alla aCGH, ed erano quindi
eleggibili ad un trattamento con trastuzumab.
Questo dato, confermato poi da altri studi analoghi, potrebbe in parte spiegare alcuni report apparentemente sorprendenti di pazienti con neoplasie HER2 negative/equivoche, che hanno comunque risposto al trattamento con trastuzumab.
In conclusione, è verosimile che i casi di carcinoma della mammella con vera polisomia del cromosoma 17 siano estremamente rari, e sia pertanto opportuno considerare amplificati i casi
con >6 segnali di HER2 per cellula, indipendentemente dal numero dei segnali del centromero 17,
anche in virtù del potenziale beneficio clinico ottenibile con trastuzumab in queste pazienti.
Statement
l’NCCTG definisce polisomici i casi con almeno 3
La polisomia del cromosoma 17
■
Il rapporto > 2 dimostra amplificazione del gene
per i casi disomici
100
91.6%
80
60
40
20
6.11%
2.29%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
D’accordo
La polisomia del cromosoma 17
Statement
presenza di 3 segnali CEP 17 per cellula, mentre
■
La vera polisomia del cromosoma 17 è un evento
molto raro
■
La presenza di un numero di segnali >2 del centromero
del 17 è quasi sempre causata da gain o da amplificazione
di tale regione e non da polisomia
■
In questi casi è necessario evitare sottostime della
amplificazione di HER2 dimostrata dalla presenza di >6 copie
o clusters
■
Il referto deve includere la dizione “non amplificato” o
“amplificato” e la sua spiegazione (ratio>2 per i casi disomici
o >6 copie o cluster di HER2)
100
99.33%
80
60
40
20
0.67%
0
D’accordo
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
Di recente, è emerso che la
vera polisomia può essere un
evento molto raro: vanno
considerati amplificati tutti
i casi con >6 segnali per cellula
19
Alcuni tumori mammari appaiono eterogenei per caratteristiche
morfologiche e genetiche e possono causare discrepanze di risultato tra metodiche di IIC e FISH: in questi casi vanno ancora definite prognosi ed eleggibilità della terapia con trastuzumab
Statement
Cloni focali con amplificazione del gene HER2
■
Non è raro il riscontro di eterogeneità nella iperespressione/
amplificazione di HER2 nei tumori mammari
■
Se la frazione di cellule positive infiltranti è pari o inferiore al 10%,
la paziente non è candidata al trattamento con trastuzumab
(risultato negativo per FDA/EMEA/AIFA; equivoco
per ASCO/CAP)
■
Prima di escludere la paziente dal possibile beneficio del
trattamento è necessario che lo stato di HER2 venga
accuratamente rivalutato con ulteriori colorazioni
immunoistochimiche e/o con tecniche di ibridazione in situ
100
del gene HER2
Malgrado i tentativi di uniformare ed aumentare
l ’ a c c u r a te z z a d e l l a r i l e va z i o n e d e l l o sta t u s d i
HER2, alcuni tumori mammari appaiono eterogenei, sia per quanto riguarda la morfologia che le
caratteristiche genetiche, e possono causare discrepanze di risultato tra metodiche di IIC e FISH.
99.21%
80
L’eterogeneità genetica, rilevata all’immunoisto-
60
chimica, viene distinta in focale, quando localizza-
40
ta in cloni definiti di cellule HER2 positive, o diffusa, quando vi sono area 3+ positive frammiste
20
0.79%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
5
Cloni focali: il campione
Statement
D’accordo
■
Quando si sia evidenziata iperespressione/amplificazione in
<10% cellule in una inclusione è raccomandato di testare ulteriori
inclusioni della neoplasia primaria e/o delle eventuali metastasi
linfonodali
100
93.28%
80
60
40
20
5.22%
1.49%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
5
Cloni focali amplificati: la rivalutazione
Statement
D’accordo
■
Tutti i tumori con quota di cellule neoplastiche HER2 3+IIC
pari o inferiore al 10% devono essere ritestati con tecniche
di ibridazione in situ
■
Tutti i tumori valutati in prima istanza con ISH e con quota di
cellule neoplastiche amplificate pari o inferiore al 10%
devono essere ritestati con tecniche di IIC
100
90.37%
80
60
40
20
8.15%
0
D’accordo
Parzialmente
d’accordo
1.48%
Disaccordo
Di recente è emerso il beneficio
della terapia con trastuzumab
anche nei casi eterogenei con
amplificazione focale
20
Cloni focali con amplificazione
ad aree 2+ o negative.
Le raccomandazioni ASCO/CAP definiscono eterogeneo , utilizzando tecniche di ibridazione in situ ,
un carcinoma che presenti amplificazione del gene in più del 5%, ma in meno del 50% delle cellule
neoplastiche infiltranti, con una ratio >2.2. Sulla
base di questa definizione l’incidenza di eterogeneità intratumorale varia dal 5 al 30%, evidenziando una ampia soggettività di interpretazione.
Questa eterogeneità intratumorale può essere
r e s p o n s a b i l e d e l l a d i ve r s i tà n e l l ’ a m p l i fi c a z i o n e
del gene o iperespressione del recettore HER2
tra carcinoma primario e metastasi, che si evidenzia in circa il 14% dei casi.
Oggi, è sconosciuto l’impatto che l’eterogeneità
genetica può avere sulla storia naturale della
neoplasia mammaria e sulle scelte terapeutiche,
generando, quindi, diversi quesiti:
ƒ La prognosi è diversa rispetto ai tumori con
omogeneità genetica?
ƒ I tumori eterogenei traggono comunque beneficio da trattamenti con agenti anti-HER2?
ƒ In presenza di recettori ormonali negativi, vanno considerati tumori triple-negative?
A queste domande non esistono ancora risposte
definitive, tuttavia va tenuto presente che le pazienti con tumori che non hanno >10% di cellule
HER2 positive (3+) all’IIC o un rapporto uguale o
superiore a 2 alle tecniche di ibridazione in situ
non sono candidata al trattamento con trastuzumab. Il risultato è infatti ritenuto negativo per
FDA/EMEA/AIFA, e considerato equivoco per le
raccomandazioni ASCO/CAP.
Malgrado ciò, un’analisi aggiuntiva dello studio
N9831 ha indicato il beneficio con trastuzumab
anche in quei casi eterogenei, con amplificazione
focale, che teoricamente non sarebbero stati
candidati al trattamento.
Pertanto, prima di escludere le pazienti con tu-
5
Cloni focali amplificati: il referto
Statement
Per valutare adeguatamente lo stato di HER2 in tumori eterogenei,
è opportuno effettuare una rivalutazione accurata su ulteriori inclusioni della neoplasia primaria e/o delle metastasi con ulteriori
colorazioni IIC e/o ISH
■
E’ opportuno aggiungere nel referto la percentuale di cellule
con iperespressione della proteina o amplificazione del gene
(ratio >2 o numero di copie HER2 >6 o cluster), anche se
inferiore al 10%
100
99.23%
80
60
mori eterogenei dal possibile beneficio del trat-
40
tamento, si raccomanda che lo stato di HER2
20
venga accuratamente rivalutato con ulteriori co-
0
D’accordo
lorazioni immunoistochimiche e/o con tecniche
0%
0.77%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
di ibridazione in situ da eseguirsi su ulteriori intuali metastasi linfonodali.
Inoltre, per meglio caratterizzare e quantificare il
fenomeno, è stata proposta l’istituzione di un data
base nazionale, con l’obiettivo di valutare l’incidenza, la caratterizzazione biologica ed il significato
prognostico dell’eterogeneità, prevedendo anche
5
L’istituzione di un database nazionale
Statement
clusioni della neoplasia primaria e/o delle even■
E’ auspicabile la istituzione di un database nazionale
Registrazione di tutti i casi con iperespressione/amplificazione
focale riscontrati dal 1-6-2010 all’1-6-2011 per valutare:
■ Incidenza
■ Caratterizzazione biologica
■ Prognosi
■ Programmazione studi clinici
100
98.41%
la possibilità di programmare studi clinici specifici.
80
In conclusione, appare evidente che la diagnosi
della presenza o meno di eterogeneità intratu-
60
40
morale ha una grande rilevanza, soprattutto per
20
le pazienti al momento non eleggibili ad un tratta-
0
mento con farmaci anti-HER2.
D’accordo
0.79%
0.79%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
E’ importante che il patologo segnali all’oncologo
la presenza di eterogeneità intratumorale, in modo che siano identificate le pazienti per le quali
sarà necessario, in caso di comparsa di recidive
locali o a distanza, ritestare la neoplasia per verificare l’eventuale opportunità di iniziare un trattamento con farmaci anti-HER2.
Il patologo ha un ruolo importante nel segnalare all’oncologo la
presenza di eterogeneità intratumorale
21
Dalle “Raccomandazioni AIOM-SIAPEC-IAP sui re
e sull’utilizzo di metodiche per la determinazione
Valutazione di HER2
Lettura del preparato IIC
E’ opportuno valutare l’intera neoplasia infiltran-
Quando e su quali campioni effettuare il test?
te, evitando campi periferici o con artefatti mor-
La determinazione dello stato di HER2 deve esse-
fologici. In presenza di frequente immunoreatti-
re effettuata sempre al momento della diagnosi
vità (2+) in strutture duttulo-lobulari normali, la
sul carcinoma primario. In presenza di progres-
procedura va nuovamente standardizzata (con
sione di malattia la determinazione va effettuata
particolare riferimento a tempi e modalità di fis-
sulla lesione metastatica, se disponibile, o sul car-
sazione). Non è raro il riscontro di eterogeneità
cinoma primario (se non precedentemente effet-
nella iperespressione/amplificazione di HER2 nei
tuata secondo gli attuali standard). Qualora siano
tumori mammari. In questi casi se la frazione di
disponibili solo preparati citologici non inclusi, si
cellule positive infiltranti è pari o inferiore al 10%,
raccomanda l’utilizzo di FISH/CISH come metodo
la paziente non è candidata al trattamento con
di determinazione.
ta r g ete d
t h e r a py
( r i s u l ta to
n e g a t i vo
per
FDA/EMEA/AIFA; equivoco per ASCO/CAP).
Modalità e tempi di fissazione dei campioni
Prima di escludere la paziente dal possibile bene-
tessutali
ficio del trattamento è necessario che lo stato di
I campioni tessutali da sottoporre a valutazione
HER2 venga accuratamente rivalutato con ulterio-
dello stato di HER2 devono essere fissati in for-
ri colorazioni immunoistochimiche e/o con tecni-
m a l i n a n e u t r a ta m p o n a ta a l 1 0 % , a m e n o c h e
che di ibridazione in situ.
l ’ u s o d i fi s s a t i v i a l te r n a t i v i s i a sta to va l i d a to
Quando si sia evidenziata iperespressione/ampli-
presso l’istituzione stessa. E’ necessario mette-
ficazione in <10% cellule in una inclusione, è racco-
re in opera tutte le procedure atte a garantire
mandato di testare ulteriori inclusioni della neo-
l’immediata, adeguata e completa fissazione, an-
plasia primaria e/o delle eventuali metastasi. Tut-
che attraverso la rivisitazione delle procedure
ti i tumori con quota di cellule neoplastiche HER2
che possono coinvolgere altri operatori. Il tem-
3+ IIC pari o inferiore al 10% devono essere ritesta-
po di fissazione ottimale in formalina è compre-
ti con tecniche di ibridazione in situ.
so fra le 8 h e le 48 h, in relazione alla tipologia
del campione.
Refertazione
Lo stato di HER2 deve essere espresso mediante
Con quale metodica effettuare il test
lo scoring system (0, 1+, 2+, 3+) e, possibilmente, an-
L’immunoistochimica è la metodica più comune-
che con la valutazione descrittiva che tenga con-
mente utilizzata come valutazione di primo livello.
to della percentuale di cellule positive e della
Le metodiche ISH vengono prevalentemente uti-
c o m p l ete z z a e d i n te n s i tà d e l l a c o l o r a z i o n e d i
lizzate per l’accertamento dell’eleggibilità alla te-
membrana.
rapia con trastuzumab nei casi con immunoreat-
Nel referto vanno riportati i dati salienti della pro-
tività 2+, e/o quando richiesto dal curante nell’ap-
cedura analitica impiegata.
propriato contesto clinico.
Correlazioni dei test IIC vs FISH
E’ opportuno che ciascun laboratorio provveda a
validare una quota parte della casistica valutata in
IIC
IIC con FISH/CISH, ottenendo una concordanza
Come effettuare il test IIC
non inferiore al 90% nei casi 3+.
Kit standardizzati o anticorpi policlonali e monoclonali referenziati (nel contesto di una proce-
d u r a te cni c a va l id a ta ) p o s so no e ss e re a ttu a l -
E’ necessario che ogni laboratorio includa sezioni
mente utilizzati per la determinazione dello sta-
o linee cellulari di controllo positivo (3+) e negativo
to di HER2.
(0, 1+) in ogni sessione di colorazione. La valutazio-
22
quisiti minimi e gli standard di refertazione
dello stato di HER2 nel carcinoma mammario”
www.aiom.it
www.siapec.it
ne dell’immunoreattività dei controlli deve prece-
dere quella dei campioni in esame.
FISH/CISH/SISH possono essere efficacemente
E ’ nec essario pianificare la verifica periodi c a
impiegati su preparati istologici fissati in formalina
(annuale/semestrale) del tasso di positività IIC
neutra tamponata. FISH/CISH rappresentano la
per HER2 nei casi testati localmente (percentua-
metodica di elezione per preparati citologici (con-
le attesa di casi con iperespressione di HER2
venzionali o in monostrato) di lesioni metastatiche.
2+/3+ = 15-20% dei casi di carcinoma mammario
Non vi sono ancora procedure standardizzate
primitivo).
per la SISH su preparati citologici.
L’uso sporadico delle procedure e/o la valutazione
L’impiego di fissativi diversi dalla formalina neu-
di un limitato numero di casi/ anno deve indurre a
tra tamponata richiede sempre adeguata valida-
considerare la centralizzazione dei test presso un
zione dei risultati. I tessuti fissati in Bouin o de-
laboratorio di riferimento.
calcificati non sono adeguati per la valutazione
E’ opportuna l’adesione a programmi di VEQ per
dell’amplificazione di HER2.
IIC su base regionale, nazionale o sovra-nazionale.
Come si effettua la metodica
Nomenclatore tariffario
E’ necessario acquisire competenze che consen-
E’ necessario provvedere con urgenza all’inclusio-
tano di adattare alle variabili pre-analitiche i reat-
ne della valutazione IIC di HER2 nel nomenclatore
tivi
tariffario.
FISH/CISH/SISH. Eventuali modifiche delle meto-
e
i
p r oto c o l l i
dei
kit
commerciali
per
diche devono essere accuratamente validate su
Chi valuta il risultato IIC
casi con stato di HER2 noto.
L’interpretazione dei risultati relativi allo stato di
HER2 deve essere effettuata da personale con
FISH - L’interpretazione dei risultati
consolidata esperienza in patologia mammaria e
Si raccomanda di valutare non meno di 20 cellu-
nelle procedure utilizzate. I dati devono essere in-
le/campo in almeno 2 campi della componente
tegrati nel referto istopatologico e la loro congrui-
invasiva identificata sulla sezione in E/E.
tà garantita dal Patologo responsabile.
I preparati citologici vanno esaminati interamente.
E’ opportuno esaminare il preparato allestito con
la FISH sulla base della reattività dell’IIC.
Non è raro il riscontro di eterogeneità nella ipe-
ISH
respressione/amplificazione di HER2 nei tumori
Le metodiche di ibridazione in Situ (ISH) sono, co-
mammari. In caso di popolazione neoplastica ete-
me precedentemente specificato, utilizzate per
rogenea è opportuno riportare la percentuale di
confermare i casi equivoci in IIC, ma possono es-
cellule in cui il gene risulta amplificato.
sere ugualmente impiegate come valutazione di
Tutti i tumori valutati in prima istanza con ISH e
primo livello per determinare lo stato di HER 2.
con quota di cellule neoplastiche amplificate pari
Le metodiche ISH vanno comunque eseguite su
o inferiore al 10% devono essere ritestati con tec-
tutti i casi 2+ (o “equivoci” secondo le linee guida)
niche di IIC.
all’analisi immunoistochimica o su richiesta del
E’ opportuno aggiungere nel referto la percen-
medico curante.
tuale di cellule con amplificazione del gene (ratio
La CISH è una metodica ampiamente validata
>2 o numero di copie HER2 >6 o cluster), anche
c h e p r e s e n ta u n ’ e l e va ta c o n c o r d a n z a c o n l a
se inferiore al 10%.
FISH.
Nei casi con rapporto gene/cromosoma 17 com-
La metodica SISH, sviluppata più recentemente,
preso tra 1,8-2,2, la conta dovrebbe essere ripetu-
ha ottenuto risultati sovrapponibili a quelli della
ta dallo stesso o da un secondo osservatore.
CISH. La SISH può essere quindi utilizzata nella
In alternativa la reazione dovrebbe essere effet-
determinazione dell’amplificazione di HER2.
tuata su altre sezioni o, se disponibile, su una di-
23
versa inclusione della neoplasia.
La vera polisomia del cromosoma 17 è un evento
E’ auspicabile documentare il risultato delle inda-
molto raro.
gini con una immagine fotografica digitale. È au-
La presenza di un numero di segnali >2 del centro-
spicabile l’istituzione di un database nazionale,
mero del 17 è quasi sempre causata da gain o da
per la registrazione di tutti i casi con iperespres-
amplificazione di tale regione e non da polisomia
sione/amplificazione focale riscontrati dall’1-6-
In questi casi, onde evitare sottostime della ampli-
2010 all’1-6-2011 per valutare incidenza, caratteriz-
ficazione di HER2, si deve considerare amplifica-
zazione biologica, prognosi, programmazione stu-
to il carcinoma che mostri un valore medio >6 co-
di clinici.
pie del gene per cellula, o clusters. Il referto deve
includere la dizione "non amplificato" o "amplifica-
CISH/SISH - L’interpretazione dei risultati
to" e la giustificazione (ratio ≥2 per i casi disomici,
Si deve esaminare tutta la sezione a 20x.
o >6 copie del gene o clusters di HER2 nei casi
Nel caso in cui si rilevi omogeneità di segnale, se-
apparentemente polisomici).
lezionare almeno 2 campi della neoplasia infiltrante e valutarli ad alto ingrandimento, evitando le
Chi valuta il risultato
aree periferiche della sezione.
L’interpretazione dei risultati relativi allo stato di
I preparati citologici vanno esaminati interamente.
HER2 deve essere effettuata da personale con
In caso di sicura amplificazione (>10 segnali o clu-
consolidata esperienza in patologia mammaria e
sters) o non amplificazione (1-4 segnali), l’analisi
nelle procedure utilizzate. I dati devono essere in-
può essere effettuata a 40x.
tegrati nel referto istopatologico e la loro con-
In presenza di un numero di segnali compreso tra
gruità garantita dal Patologo.
5 e 10 è opportuno proseguire l’analisi a maggior
ingrandimento (63x o 100x) contando almeno 40
Controllo di qualità
cellule.
E’ opportuno utilizzare controlli positivi esterni di
È opportuno determinare la media dei segnali
r e a z i o n e p e r i o d i c a m e n te e , c o m u n q u e , a o g n i
CEP17 e la media dei segnali HER2 osservati nelle
cambio di lotto del kit.
due sezioni consecutive.
E’ opportuna l’implementazione di programmi di
E’ opportuno esaminare il preparato allestito con
VEQ per FISH/CISH/SISH su base regionale, na-
la CISH sulla base della reattività dell’IIC. Nei casi
zionale o sovra-nazionale.
eterogenei si può esprimere il risultato anche come percentuale di cellule amplificate.
Centri di riferimento
La limitata esperienza nelle procedure e/o la va-
Polisomia
lutazione di un esiguo numero di casi/anno deve
Il carcinoma è considerato polisomico quando la
indurre a considerare la centralizzazione dei test
media delle copie del centromero 17 è ≥3.
24
presso un laboratorio di riferimento.
Trastuzumab nel trattamento del carcinoma
gastrico e della giunzione gastroesofagea
HER2-positivo metastatico: le evidenze cliniche
stato dimostrato un beneficio in termini di so-
1
pravvivenza nel carcinoma gastrico e della giun-
Figura
Trastuzumab è il primo agente biologico di cui sia
zione gastroesofagea HER2-positivo metastatico.
Indipendentemente dallo stato di HER2, la tera-
L’iperespressione di HER2 come fattore
prognostico nel carcinoma gastrico
100
90
80
% sopravvivenza
pia del carcinoma gastrico e della giunzione GE
metastatico si fonda sull'impiego di regimi chemioterapici a base di fluoropirimidine e platino
con eventuale aggiunta di epirubicina o doceta-
0
70
1
60
50
40
2
30
xel. Il tasso di risposta non è superiore al 30-50%
20
con una sopravvivenza libera da malattia di 3-6
10
mesi ed una sopravvivenza globale mediana di
0
3
0
6-11 mesi. In caso di carcinoma HER2 positivo la
5
10
15
20 25 30 35 40 45 50 55 60
65
Mesi
sopravvivanza globale può risultare ulteriormen-
Sopravvivenza cumulativa di 139 pazienti con carcinoma gastrico
operati secondo i punteggi di espressione di HER2
te ridotta (Figura 1).
In uno studio condotto su 139 pazienti con carci-
Allgayer H et al, JCO 2000;18(11):2201-2209
noma gastrico sottoposti a intervento chirurgico
la sopravvivenza a 3 anni è risultata del 42,9% (IIC
2+) versus 74% (IIC 0). Anche in questi tipi di car-
della giunzione GE HER2-positivo, inoperabile, lo-
cinoma la presenza di una sovraespressione di
calmente avanzato o ricorrente e/o metastatico.
HER2 consente di utilizzare terapie mirate anti-
I pazienti, con un'aspettativa di vita di almeno 3
HER2.
mesi e non precedentemente trattati per malat-
In particolare l’efficacia e la tollerabilità di tra-
tia avanzata o metastatica, sono stati randomiz-
stuzumab sono stati valutati nello studio ToGA
zati a ricevere 5-FU o capecitabina più cisplatino
(Trastuzumab for Gastric Cancer), studio con-
oppure trastuzumab associato allo stesso regi-
dotto su 584 soggetti con carcinoma gastrico e
me chemioterapico (Figura 2).
L’iperespressione di
HER2 è l’aspetto più
interessante recentemente emerso sotto il
profilo della caratterizzazione biologica
dei tumori gastrici e
della giunzione gastroesofagea anche ai
fini della possibilità di
utilizzare trastuzumab
Figura
2
Disegno dello studio ToGA
Studio di fase III, randomizzato, in aperto, internazionale, multicentrico
3807 pazienti
screenati
810 HER2-positivi
(22.1%)
Carcinoma gastrico
HER2-positivo
in fase avanzata
(N=584)
5-FU
o capecitabinaa
+ cisplatino
(n=290)
R
Fattori di stratificazione
-
Tumore in stadio avanzato o metastatico
Tumore gastrico o della giunzione gastro-esofagea
Misurabile o non misurabile
ECOG PS 0-1 vs 2
capecitabina vs 5-FU
5-FU
o capecitabinaa
+ cisplatino
+trastuzumab
(n=294)
Endpoint primario: OS
Endpoint secondari: PFS, RR, QoL
a
Secondo scelta del ricercatore
25
Dallo studio ToGA, emerge un beneficio consistente con l’utilizzo di
trastuzumab nel carcinoma gastrico che si concretizza in una riduzione del 26% del rischio di morte quando trastuzumab viene somministrato in combinazione con la chemioterapia (HR = 0.74)
Figura
3
I pazienti arruolati facevano parte di un più am-
Studio ToGA: end point primario:
sopravvivenza globale
Mediana (mesi)
Eventi OS
HR
95%
167 13.8 0.74 0.60
182 11.1
Event
FC + T
FC
1.0
0.9
pio gruppo di soggetti sottoposti a screening
per valutare la positività di HER2 (n = 3807), posiCI
0.91
tività che è accertata nel 22.1% dei casi valutati.
p value
0.0046
Inoltre l’iperespressine di HER2 è stata riscontra-
0.8
ta in una percentuale più alta di pazienti con neo-
0.7
plasia della giunzione gastroesofagea (33.2%) ri-
0.6
0.5
spetto ai pazienti con carcinoma gastrico (20.9%).
0.4
Valutando, invece, il tasso di positività utilizzando
0.3
la classificazione di Lauren, emerge che i tumo-
0.2
11.1
0.1
13.8
ri intestinali o misti sono più frequentemente
0
0 2
4
6
8
HER2-positivi rispetto ai tumori diffusi (32.2%,
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
20.4% e 6,1%).
Mesi
N°
277 246 209 173 147 113
266 223 185 143 117 90
a
rischio
90 71 56 43 30
64 47 32 24 16
21
14
13 12
7 6
6
5
4
0
1
0
Per quanto riguarda l'endopoint primario dello
0
0
studio, ovvero la sopravvivenza globale, emerge
un beneficio consistente che si concretizza in
Bang YJ et al, Lancet 2010
una riduzione del 26% del rischio di morte quando trastuzumab viene somministrato in combinazione con la chemioterapia (HR = 0.74): ciò cor-
End point secondario: risposta tumorale
risponde in mediana a un aumento di sopravvi-
Figura
4
60
venza di quasi 3 mesi (Figura 3).
FC + trastuzumab
FC
p=0.0145
50
p=0.0017
Anche per quanto riguarda gli endpoint secon-
47.3%
dari è stata osservata una differenza statistica-
41.8%
Pazienti (%)
40
mente significativa tra i 2 gruppi. La sopravvi-
34.5%
32.1%
venza libera da progressione risulta essere a fa-
30
vore del gruppo trastuzumab (hazard ratio 0,71)
p=0.0599
20
così come i tassi globali di risposta (47,3% vs
10
34,5%), di risposta parziale (41,8% vs 32,1%) e com-
5.4%
2.4%
pleta (5,4% vs 2,4%) (Figura 4).
0
CR
PR
ORR
Un’analisi post hoc ha evidenziato maggiori be-
ORR= CR + PR; CR, risposta completa; PR, risposta parziale
nefici clinici nei pazienti trattati con trastuzumab che presentavano un’elevata iperespres-
van Cutsem E et al, J Clin Oncol 2009; 27: Abstract 4509
sione di HER2, (definita come IIC2+/FISH+ o IIC3+) (Fi-
Figura
5
Sopravvivenza globale secondo lo stato di HER2
Sottogruppo
Tutti
gura 5).
N
Mediana OS
(mesi)
HR
95% CI
584
11.1 vs 13.8
0.74
0.60, 0.91
61
70
159
256
15
7.2 vs 10.6
10.2 vs 8.7
17.7 vs 17.5
0.92
1.24
0.75
0.58
0.83
0.48, 1.76
0.70, 2.20
0.51, 1.11
0.41, 0.81
0.20, 3.38
131
446
8.7 vs 10.0
11.8 vs 16.0
1.07
0.65
0.70, 1.62
0.51, 0.83
filo di tollerabilità, l'aggiunta
Analisi pre-pianificata
IIC0/FISH+
IIC1+/FISH+
IIC2+/FISH+
IIC3+/FISH+
IIC3+/FISH-
10.8 vs 12.3
12.3 vs 17.9
0.2
0.4
In favore
di trastuzumab
0.6
1
Risk ratio
2
3
d i t r a st u z u m a b a l l a c h e mioterapia è risultata ben
to l l e r a ta :
l’incidenza
4 5
Non in favore
di trastuzumab
due bracci di trattamento.
Non si evidenziano, inoltre,
d i ffe r e n ze s o sta n z i a l i p e r
quanto riguarda gli eventi
avversi cardiaci.
van Cutsem E et al, J Clin Oncol 2009; 27: Abstract 4509
26
di
eventi avversi ematologici
e non è risultata simile nei
Analisi esploratoria
IIC0 o 1+/FISH+
IIC2+/FISH+ o IIC3+
Per quanto riguarda il pro-
Criteri di eleggibilità alla terapia antiHER2
L’accurata identificazione dei pazienti candidati al
I pazienti con neoplasie IIC2+ risultate positive a
trattamento con una terapia mirata su HER2 è or-
SISH (Silver in situ hybridization) o FISH (Fluore-
mai riconosciuta come un passo obbligato per l’ot-
scent in situ hybridization) sono da ritenere eleg-
timizzazione delle strategie terapeutiche non solo
gibili alla terapia con trastuzumab (Figura 9).
nel carcinoma mammario ma anche nel carcinoma
gastrico e della giunzione gastroesofagea. I risultati dello studio ToGA; hanno dimostrato un beneficio
curare a tutti i pazienti con tumore metastatico
HER2-positivi. In questo studio, il 22,1% dei pazienti
screenati per HER2, adottando i criteri validati del-
7
Cellule tumorali con reattività di membrana
incompleta (basolaterale)
Figura
in termini di sopravvivenza che è necessario assi-
lo Scoring System per l’interpretazione mediante
immunoistochimica nel carcinoma gastrico, sono
risultati eleggibili al trattamento con trastuzumab.
Il nuovo Scoring system per la valutazione di
HER2, tiene in considerazione alcune importanti
differenze istologiche tra carcinoma dello stomaco e carcinoma mammario, quali la maggiore eterogeneità tumorale (Figura 6) e l’incompleta immunoreattività di membrana legata alla polarizzazio-
8
HER2 è raccomandato in tutti i pazienti con carci-
Figura
ne funzionale delle cellule gastriche (Figura 7).
L’esame immunoistochimico (IIC) dello stato di
noma dello stomaco e della giunzione gastroesofagea in stadio avanzato/metastatico. Mediante que-
Scoring system per il carcinoma gastrico
IIC negativo (0)
Nessuna marcatura o marcatura di membrana osservata
in <10% delle cellule tumorali
IIC negativo (1+)
sto test è possibile definire l’espressione di HER2
a livello di membrana, definita come 0 (negativa), 1+
Debole/appena percettibile marcatura della membrana
individuata in >10% delle cellule tumorali. Le cellule sono
marcate soltanto in una parte della membrana
(negativa), 2+ (equivoca) o 3+ (positiva). (Figura 8).
IIC (risultato equivoco) (2+)
I tumori con positività IIC3+ sono eleggibili al trat-
Da lieve moderata marcatura completa della membrana
individuata in >10% delle cellule tumorali
tamento con trastuzumab mentre i casi equivoci
IIC positivo (3+)
devono essere testati con tecniche di ibridazione in
Forte marcatura completa della membrana
individuata in >10% delle cellule tumorali
situ (ISH), per valutare lo stato di amplificazione di
HER2 (Figura 9).
L’eterogeneità tumorale è più comune
9
Algoritmo per il test di HER2
nel carcinoma
Figura
Figura
6
Campione tumorale
IIC
QuickTime™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest immagine
0
Tipo anello
con sigillo
+1
+2
+3
Tipo intestinale
(formazione di ghiandole)
ISH
Nessuna
amplificazione
Alta amplificazione
+
Eleggibile
a
trastuzumab
Hofmann M et al, 2008
27
Gli statement sul carcinoma gastrico
Il gruppo di lavoro focalizzato sul carcinoma ga-
e condivisi con i partecipanti al workshop, sulla
strico HER2-positivo ha messo a punto una serie
valutazione dello stato di HER2. Queste racco-
di statement riassuntivi, successivamente votati
mandazioni possono essere d’ausilio ad un impie-
5
La valutazione dello stato di HER2
Statement
go razionale delle nuove strategie terapeutiche
■
mirate ad HER2 nei pazienti con carcinoma dello
Il trial clinico TOGA -Trastuzumab for Gastric Cancer- ha
dimostrato l’efficacia terapeutica di Trastuzumab nel carcinoma
dello stomaco e della giunzione gastro-esofagea localmente
avanzato o metastatico HER2-positivo
■ L’EMA ha approvato l’utilizzo del farmaco in prima linea
per il trattamento dei carcinomi metastatici dello stomaco
e della giunzione gastro-esofagea HER2-positivi
■ E’ pertanto necessario valutare lo stato di HER2 in tutti i pazienti
con carcinoma metastatico dello stomaco e della giunzione
gastro-esofagea
100
stomaco o della giunzione gastroesofagea (GE)
HER2-positivo metastatico.
In seguito ai risultati dello studio ToGA, l'EMA ha
approvato l'impiego di trastuzumab in prima linea
nel trattamento del carcinoma metastatico dello
stomaco o della giunzione gastroesofagea HER2positivo. La valutazione dello stato di HER2 è dun-
93.66%
que raccomandabile in tutti i pazienti che pre-
75
sentano questa neoplasia.
50
La valutazione si effettua su campioni bioptici o
25
5.63%
0.7%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
5
I tessuti e la preparazione
Statement
D’accordo
■
metastatiche: il materiale istologico deve essere
fissato in formalina neutra al 10% in un lasso di
tempo compreso tra 6 e 48 ore.
Un'ulteriore indicazione per ottimizzare l'affida-
Lo stato di HER2 deve essere valutato su campioni bioptici
o chirurgici della lesione primitiva o sulle lesioni metastatiche
Il materiale istologico deve essere fissato in formalina neutra
tamponata al 10%
■ I tempi di fissazione dei campioni bioptici e chirurgici devono
essere contenuti tra 6 e 48 ore
■
100
chirurgici della lesione primitiva o sulle lesioni
bilità del test, consiste nell'esecuzione di almeno
5 biopsie endoscopiche in aree diverse della neoplasia: i tumori gastrici, infatti, presentano una
notevole eterogeneità dell'espressione di HER2.
96.35%
In presenza di una diagnosi istologica di carcino-
75
ma misto, viene raccomandato di selezionare una
50
inclusione che sia rappresentativa della componente ghiandolare della neoplasia.
25
3.65%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
5
Eterogeneità tumorale e scelta del campione
5
Il gold standard
■
In considerazione della possibile eterogeneità di espressione
di HER2 è consigliabile l’esecuzione di almeno 5 biopsie
endoscopiche in aree diverse della neoplasia
■ Nel caso di campioni operatori con diagnosi istologica di carcinoma
misto, si raccomanda di selezionare una inclusione che sia
rappresentativa della componente ghiandolare della neoplasia
Statement
L’esame di primo livello da eseguire per la deter-
Statement
D’accordo
■
100
96.32%
La tecnica di screening per l’analisi dello stato di HER2 nel
carcinoma dello stomaco o della giunzione gastroesofagea è
l’immunoistochimica, corredata da ISH nei casi con score 2+.
■ L’uso di reagenti diversi da quelli già clinicamente validati
deve essere preventivamente validato in sede locale o
in un centro di riferimento
100
75
75
50
50
88.11%
25
25
0
D’accordo
1.47%
2.21%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
9.79%
2.1%
0
D’accordo
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
Le raccomandazioni possono essere d’ausilio ad un impiego razionale delle nuove strategie terapeutiche mirate ad HER2 nei pazienti con carcinoma dello stomaco o della giunzione gastroesofagea HER2-positivo metastatico
28
5
L’interpretazione dei risultati
5
Lo scoring system
Statement
■
I criteri per la interpretazione dei risultati di immunoistochimica
e per l’assegnazione degli score sono in parte differenti da quelli
utilizzati per la valutazione di HER2 nel carcinoma mammario
■ Le neoplasie dello stomaco e della giunzione gastroesofagea
mostrano caratteristiche diverse nella immunoreattività
di membrana ed una maggior eterogeneità intratumorale nella
espressione/amplificazione di HER2
Statement
■
100
99.28%
75
50
Lo score 3+ viene attribuito a carcinomi dello stomaco o della
giunzione gastroesofagea che presentano ≥10% di cellule con
intensa colorazione di membrana, completa, basolaterale o laterale
■ Lo score 2+ viene attribuito a carcinomi dello stomaco o della
giunzione gastroesofagea che presentano ≥10% di cellule
con moderata/debole colorazione di membrana, completa,
basolaterale o laterale.
Nel caso di biopsia gastrica endoscopica, è sufficiente che
sia presente un cluster di almeno 5 cellule contigue con
le caratteristiche di immunoreattività sopra descritte
■ Lo score 1+ viene attribuito alle neoplasie che presentano cellule
con lieve e frammentata colorazione di membrana almeno nel 10%
delle cellule neoplastiche
■
100
25
0
D’accordo
0.72%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
93.18%
75
50
25
minazione dello stato di HER2 è l’immunoistochi-
6.82%
0
D’accordo
mica, corredata dall’ibridazione in situ (ISH) nei ca-
Parzialmente
d’accordo
0%
Disaccordo
si con score 2+. L'impiego di reagenti diversi da
zione in sede locale o in un centro di riferimento.
Le differenze istologiche tra tumori gastrici e
m a m m a r i , i n p a r t i c o l a r e l ' i m m u n o r e a t t i v i tà d i
membran a e l'eterog eneità intratu morale, non
c o n s e nto n o d i a p p l i ca r e a l l e d ue n eo p l a s ie l e
stesse modalità di interpretazione dei risultati e
5
Amplificazione genica: i criteri
Statement
quelli già clinicamente validati, richiede una valida■
di assegnazione dello score.
I criteri per la definizione dello stato di amplificazione del gene
HER2 sono analoghi a quelli utilizzati per il carcinoma mammario
100
98.54%
75
50
25
Per questo motivo è stato messo a punto un ap-
1.46%
0%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
D’accordo
posito Scoring System per l'attribuzione dei gradi di positività ad HER2 ai carcinomi gastrici o
della giunzione gastroesofagea.
ne del gene HER2 sono invece analoghi a quelli uti-
5
Statement
I criteri per la definzione dello stato di amplificazio-
HER2-positività: eleggibilità alla terapia
con trastuzumab
con score 2+, associato ad amplificazione genica
Sono considerati HER2-positivi i tumori con score
immunoistochimico 3+, o con score 2+ associato ad amplificazione
del gene, dimostrata con tecnica FISH o cromogenica
■ I pazienti con tumori amplificati ma con score immunoistochimico
0 o 1+ non sono considerati eleggibili per la terapia comprendente
Trastuzumab
■ Se la neoplasia gastrica è risultata negativa per HER2
(score IIC 0 o 1+) su prelievi bioptici, si raccomanda di ripetere
la determinazione sul campione operatorio o sulla lesione
metastatica, quando disponibili
valutata mediante tecnica SISH o FISH. I tumori
100
gastrici possono presentare, inoltre, uno score
75
lizzati per il carcinoma mammario HER2-positivo e
fanno riferimento alle tecniche di ibridazione in situ.
Lo stato di positività per HER2 viene definito in
presenza di uno score immunoistochimico 3+ o
immunoistochimico 0 o 1+ in presenza di amplifi-
■
97.12%
50
cazione genica: in questi casi dubbi, i partecipan25
ti al gruppo di lavoro hanno trovato un consenso
2.16%
0.72%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
0
per la non eleggibilità alla terapia anti-HER2. Inol-
D’accordo
tre, sempre nell'ottica di identificare tutti i paconsiglia di ripetere la determinazione dello stato
5
HER2-positività: la conferma
di HER2 sul campione bioptico o sulla lesione me-
Statement
zienti che possono beneficiare di trastuzumab, si
■
tastatica anche quando la biopsia ha dato un esito negativo.
Infine, viene raccomandato che il report diagnostico sullo stato di HER2 venga formulato utiliz-
Il report diagnostico sullo stato di HER2 viene formulato utilizzando
gli score IIC (0, 1+, 2+, 3+) e indicando la % di immunoreattività
■ Il giudizio conclusivo deve essere completato con la valutazione
della amplificazione del gene nei casi con score IIC 2+
100
75
zando gli score immunoistochimici con indicazio-
50
ne della percentuale di positività: il giudizio con-
25
clusivo si completa con la valutazione dell’amplifi-
0
cazione genica nei casi con score IIC2+.
95.62%
D’accordo
3.65%
0.73%
Parzialmente
d’accordo
Disaccordo
29
Raccomandazioni AIOM-SIAPEC-IAP per la determ
Epidemiologia
e classificazione
trata una variabilità geografica nella distribuzione
delle localizzazioni tumorali tra i vari paesi che hanno partecipato allo studio.
Il carcinoma gastrico globalmente è la seconda causa di morte correlata al carcinoma, con una maggiore incidenza nei paesi asiatici rispetto all'Occidente.
Nei paesi europei la malattia è al quarto posto per
incidenza e al terzo per mortalità, con 171.000 nuovi
Le differenze tra carcinoma
mammario e gastrico
casi e 137.900 decessi registrati nel 2004.
Un metodo validato per la valutazione dello stato di
A fronte di una riduzione dei casi di carcinoma
HER2, basato su un apposito scoring system, è di-
squamoso dell'esofago e di carcinoma gastrico di-
sponibile da tempo per i tumori della mammella. Le
stale, è da registrare l'aumento dei casi di carcinoma
differenze riscontrate tra i tumori gastrici e mam-
del cardias e dell'esofago distale. La classificazione
mari hanno reso però necessario apportare modifi-
anatomica distingue i tumori gastrici in base al sito
che allo scoring system già utilizzato nella valutazio-
d'origine: si parla quindi di tumori prossimali (cardias
ne di HER2 nel carcinoma della mammella.
o giunzione esofago-gastrica, fondo) e distali (corpo,
Nel valutare l’espressione di HER2 nel carcinoma ga-
antro).
strico occorre tenere in conto alcune differenze ri-
La classificazione di Siewert individua 3 tipi di carci-
spetto al carcinoma mammario:
noma della giunzione esofago-gastrica a seconda
ƒ maggiore eterogeneità tumorale dei carcinomi
della posizione rispetto alla sede anatomica del car-
gastrici rispetto a quelli mammari;
dias, mentre quella di Lauren distingue -sulla base
ƒ incompleta immunoreattività di membrana legata
dell’aspetto citomorfologico e della modalità di cre-
alla polarizzazione funzionale delle cellule di car-
scità- tra forme intestinali, diffuse e miste.
cinoma gastrico;
ƒ maggiore frequenza di casi FISH+/IIC 0-1 rispetto
al carcinoma mammario.
L’iperespressione
di HER2
Uno scoring system modificato per la valutazione di
HER2 nel carcinoma gastrico è stato messo a punto per identificare i pazienti candidabili all'arruola-
L’iperespressione di HER2 è l’aspetto più interessan-
mento nello studio ToGA.
te recentemente emerso sotto il profilo della carat-
Le evidenze cliniche sul ruolo prognostico dell’ipe-
terizzazione biologica dei tumori gastroesofagei e
respressione di HER2 nel carcinoma gastrico han-
dello stomaco. Le forme intestinali secondo la classi-
no condotto così alla validazione dell'Herceptest
ficazione di Lauren presentano un’iperespressione
Scoring System per l’interpretazione dei risultati di
significativamente maggiore (32.3% vs 6%) di HER2
HER2 nel carcinoma gastrico, che ha tenuto conto
rispetto a quelle diffuse.
della maggiore eterogeneità tumorale dei carcino-
Oggi il principale “database” relativo alla frequenza
mi gastrici rispetto a quelli mammari e dell’incom-
di espressione dell’HER2 nei tumori gastrici e ga-
pleta immunoreattività di membrana legata alla po-
stroesofagei, è rappresentato dallo studio ToGA,
larizzazione funzionale delle cellule di carcinoma
trial randomizzato di fase III nel quale pazienti con
gastrico.
carcinoma dello stomaco o della giunzione esofago-
Nella popolazione dello studio ToGA il 22,1% dei pa-
gastrica in fase avanzata HER2+ sono stati rando-
zienti è risultato eleggibile al trattamento con tra-
mizzati a ricevere il solo trattamento chemioterapi-
stuzumab in seguito al riscontro di una positività
co con cisplatino e 5-FU o capecitabina o la stessa
IIC3+ e/o FISH+, determinata rispettivamente me-
chemioterapia in associazione a trastuzumab.
diante Herceptest e dualcolor FISH Dako.
Dai dati dello studio ToGA è emersa una diversa per-
Più nel dettaglio, un'analisi esplorativa ha chiarito
centuale di HER2-positività in base alla localizzazione
che il 16,6% dei soggetti esaminati mostravano una
del carcinoma. Nello stesso tempo, è stata riscon-
positività IIC3+ oppure IIC2+/FISH+ mentre il 5,5% dei
30
inazione dello stato di HER2
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pazienti, caratterizzati da IIC 0 o 1+, sono risultati
raffina liquida
positivi alla FISH.
sono degradare l'epitopo
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perchè le alte temperature pos-
ƒ I campioni inclusi in paraffina possono essere
conservati per un tempo indefinito prima del se-
Preparazione dei tessuti
e problemi metodologici
zionamento.
Il sezionamento e la sparaffinatura
Nell’esecuzione del test per HER2 è fondamentale in
Sezionamento
primo luogo la standardizzazione dei processi di
ƒ Idealmente, le sezioni tissutali andrebbero otte-
raccolta, fissazione, inclusione in paraffina, seziona-
nute immediatamente prima dell'esecuzione del
mento e sparaffinatura delle sezioni.
test HER2
ƒ Le sezioni devono essere ricavate da un'area
La raccolta dei tessuti
Carcinoma gastrico o della giunzione esofago-gastrica operato o non resecabile
ƒ Sia i campioni chirurgici che quelli bioptici sono
idonei per la valutazione dello stato di HER2.
rappresentativa del carcinoma
ƒ Lo spessore delle sezioni tessutali può influenzare l'interpretazione dei risultati: è opportuno assicurarsi che lo spessore sia inferiore a 5mm
ƒ Le sezioni vengono disposte su vetrini ed essiccate per 12-24 ore a temperatura ambiente o
Preparazione iniziale dei tessuti
ƒ Dopo il prelievo il trasporto al laboratorio deve
avvenire in tempi rapidi (entro 20-30 minuti).
ƒ Il campione viene chinato, sezionato e fissato in
laboratorio.
un'ora alla temperatura di 60 °C.
Sparaffinatura
Si raccomanda di praticare una completa rimozione
della paraffina: la paraffina residua determina risultati falsi-negativi e aumenta il rischio di colorazione
non-specifica.
La fissazione
ƒ Una inadeguata fissazione dei tessuti è la più comune causa di errore del test di rilevazione dello
I problemi metodologici
stato di HER2.
L'Immunoistochimica (IIC) è il test di primo livello di
ƒ Disporre il tessuto nel fissativo il più rapidamente possibile (entro 20 minuti).
ƒ Durata della fissazione
-
-
nel carcinoma gastrico. L'IIC deve essere standardizzata ed associata all'utilizzo di idonei campioni di
Campioni prelevati chirugicamente: 6-48 ore
controllo. I casi con reattività IIC2+ devono essere
(ma almeno 1 ora/mm di spessore del tessuto).
ritestati con altre procedure (ISH); altri casi posso-
Biopsie endoscopiche: non più di 24 ore.
no essere ritestati su richiesta del curante nell'ap-
ƒ Tipo di fissativo
-
riferimento per la valutazione dello stato di HER2
propriato contesto clinico.
Formalina neutra tamponata 10%, preparata di
recente (da sostituire regolarmente)
Modalità e tempi di fissazione dei campioni tes-
Per ottenere risultati affidabili l'impiego di al-
sutali
tri fissativi deve essere validato
Formalina neutra tamponata al 10%.
L'esecuzione dei test IIC e ISH può essere
Altri composti, alternativi alla formalina (tranne Bo-
ostacolata dall'impiego di fissativi non a base
uin, non utilizzabile per FISH) previa validazione della
di formalina.
procedura.
La procedura di fissazione deve essere immediata,
L'inclusione in paraffina
adeguata e completa.
ƒ I campioni tessutali vengono disidratati in etano-
E’ necessario mettere in opera tutte le procedure at-
lo/xilene e inclusi in paraffina
ƒ Si deve evitare una prolungata incubazione in pa-
te a garantire le suddette condizioni, anche attraverso adeguata sensibilizzazione degli altri operatori.
31
Tempo di fissazione ottimale: fra le 6 e le 48 ore, in
Problemi frequenti in IIC
relazione alla tipologia di campione. La determinazio-
Sottostima
ne dello status di HER2 su frammenti precedente-
ƒ Sovrafissazione in formalina
mente congelati è sconsigliata.
ƒ Insufficiente ri-esposizione antigenica
ƒ Scelta dell’anticorpo.
Come effettuare il test IIC
Anticorpi poli- e monoclonali sono ugualmente affi-
Sovrastima
dabili nel contesto di una procedura tecnica validata.
ƒ Post-fissazione alcoolica (confrontare con cellule
L’utilizzo di reattivi singoli deve avvenire seguendo
normali!)
una procedura standardizzata e validata, costante-
ƒ Colorazione citoplasmatica
mente affiancata da idonei controlli e sottoposta a
ƒ Valutazione di componenti non neoplastiche.
verifica periodica.
Refertazione
Procedimento tecnico
Lo stato di HER2 deve essere espresso mediante lo
Sezioni tagliate di recente (< 3 mesi)
scoring system dello studio ToGA (da 0 a 3+) con la
Recupero antigenico (H.I.E.R.)
possibile aggiunta della percentuale di cellule positi-
ƒ 0.01M Tampone citrato, pH 6.0 o 0.01M EDTA, pH
ve, della completezza e dell’intensità della colorazio-
8.0
ne di membrana.
ƒ 40 min. a 95° in bagno termostatico o 14 min. a
750W in forno a microonde.
Correlazione dei test IIC vs FISH
Anticorpi
E’ opportuno che ciascun laboratorio provveda a va-
Lo studio ToGA ha utilizzato HercepTest® per la va-
lidare una quota parte della casistica valutata in IIC
lutazione dell’espressione di HER2. Sono disponibili
con ibridazione in situ, ottenendo una concordanza
tuttavia almeno 25 differenti anticorpi anti-HER2
non inferiore al 90% nei casi 3+.
(4B5, CB11, A0485 ecc.): per questa ragione sono rac-
La correlazione globale tra IIC/FISH deve essere >
comandate per ciascun laboratorio la validazione
80%. Valutazioni discordanti riguardano casi giudica-
della procedura immunoistochimica utilizzata e la
ti 2+ (immunoreattività di membrana, di debole-mo-
partecipazione a programmi di controllo di qualità.
derata intensità in >10% di cellule della componente
invasiva): fino al 50% di tali casi dimostra amplifica-
Interpretazione dei risultati
zione di HER2 con FISH.
I campioni da analizzare dovrebbero comprendere
E’ opportuno che ciascun laboratorio provveda a va-
strutture normali residue da usare come riferimen-
lidare una quota parte della casistica valutata in IIC
to interno. In tali strutture l’espressione di membra-
con FISH/CISH. In caso di concordanza inferiore al
na di HER2 deve essere assente o solo minimamen-
80%, procedere ad una verifica della procedura IIC
te apprezzabile.
utilizzata.
Nel caso di biopsia gastrica endoscopica, per definire la neoplasia HER2 positiva è sufficiente che sia
presente un cluster di almeno 5 cellule contigue po-
All'interno del singolo laboratorio si deve procedere
sitive.
ad un controllo di qualità dell'attività svolta, che
Se la neoplasia gastrica è risultata negativa per
comprenda l’uso di sezioni di controllo positive (3+) e
HER2 (score IIC 0 o 1+) su prelievi bioptici, si racco-
negative (0, 1+) e/o linee cellulari con e senza ipere-
manda di ripetere la determinazione sul campione
spressione di HER2, fissate in formalina ed incluse
operatorio o sulla lesione metastatica, quando di-
in paraffina. Verifica periodica (annuale/semestrale)
sponibili.
della percentuale di positività IIC per HER2 nei casi
Valutare a piccolo ingrandimento tutta l’area neopla-
testati localmente (la percentuale attesa di casi con
stica infiltrante e non meno di 10 campi a forte in-
iperespressione di HER2 2+/3+ è di circa il 20% dei
grandimento (x40).
casi di carcinoma primitivo gastrico o della giunzio-
Tenere conto di possibili variazioni di espressione al-
ne esofago-gastrica).
l’interno del campione.
L’uso sporadico delle procedure e/o la valutazione
Evitare campi periferici (possibili artefatti da essic-
di un limitato numero di casi/anno deve consigliare
camento, insufficiente dispensazione del reattivo,
la centralizzazione dei test presso un laboratorio di
effetti da schiacciamento, etc.).
riferimento.
32
La riproducibilità
delle procedure IIC
quello ricavato dall'analisi delle percentuali di positività 3+ del carcinoma gastrico al test immunoistochimico (17,6%).
Il trasferimento dello Scoring System messo a pun-
Per quanto riguarda invece lo studio ToGA, la prin-
to per il carcinoma mammario alla valutazione IIC
c i p a l e fo n te d i i n fo r m a z i o n e s u l l e f r e q u e n ze d i
per il carcinoma gastrico ha comportato una note-
espressione di HER2, la percentuale di positività è
vole variabilità dei risultati tra i singoli operatori al-
risultata superiore a quanto indicato in letteratura.
l'interno del laboratorio e tra diversi laboratori.
Lo screening è stato condotto con successo su
E' essenziale quindi un corretto addestramento dei
3667 pazienti utilizzando IIC o FISH: su questa po-
patologi per migliorare l'interobserver agreement
polazione, il 22%, pari a 810 pazienti, sono risultati
e la riproducibilità dei test per il carcinoma gastri-
HER2 positivi (IIC 3+ e/o FISH+).
co. In quest'ambito il French-German ring study ha
fornito istruzioni pratiche di facile applicazione.
HER2 nel carcinoma
gastrico: impatto prognostico
e predittivo
HER2 e istotipo/sede
del carcinoma primitivo
Nei paesi Occidentali si è prodotto negli ultimi anni
uno “shift” epidemiologico relativo alle caratteristiche del carcinoma gastrico: è stato registrato in-
Lavori sperimentali su linee cellulari gastriche e su
fatti un significativo aumento dei tumori dello sto-
topi xenograft hanno dimostrato che l’iperespres-
maco prossimale e della giunzione gastroesofagea
sione di HER2 è legata all’amplificazione del gene,
e un netto decremento delle localizzazioni distali.
correla con l’andamento clinico e condiziona nega-
Il dato non è privo di conseguenze sullo stato di
tivamente la prognosi e la risposta alla chemiote-
HER2: infatti la iperespressione/amplificazione di
rapia. Il silenziamento dell’espressione di HER2 ri-
HER2 è più comune nell’adenocarcinoma esofageo
duce la proliferazione cellulare e la crescita del
e della giunzione gastroesofagea rispetto agli ade-
carcinoma.
nocarcinomi dello stomaco distale, anche in conse-
Numerosi studi hanno valutato l'impatto prognosti-
guenza della maggiore prevalenza delle forme di ti-
co e predittivo dell’espressione e dell’amplificazio-
po diffuso (sec. Lauren) in questi ultimi.
ne di HER2 nel carcinoma gastrico mediante le tec-
Nello specifico la prevalenza di iperespressione di
niche IIC e FISH.
HER2 riportata in letteratura, in base ai test IIC e
I dati disponibili in letteratura nel periodo 1991-2009
ISH, varia dal 13% al 41% e dipende dall'istotipo (tipo
e v i d e n z i a n o c h e n e l c a r c i n o m a g a st r i c o l ' i p e r e -
intestinale 16-34%, tipo diffuso 6-7%, non noto/mi-
spressione di HER2, stabilita attraverso IIC, varia
sto 14-20%) e dalla sede del carcinoma primitivo
dal 7% al 34%.
(24-32% a livello della giunzione gastroesofagea vs
Tra questi, lo studio di Park, dopo aver rilevato una
9.5-18% gastrico).
percentuale di positività all'esame IIC pari al 15,9%
La d i st r i b u z i o n e r e l a t i va a l l ' i p e r e s p r e s s i o n e d i
ha mostrato come l'amplificazione di HER2/neu
HER2 nei tipi classificati secondo Lauren trova
mediante FISH/CISH si associ a una riduzione dei
conferma anche nello studio ToGA dove la percen-
tassi di sopravvivenza rispetto ai pazienti con car-
tuale di positività di HER2 si è attestata sul 32,3%
cinoma non amplificato (21,4% vs 63%).
nel tipo intestinale contro il 6,1% nel tipo diffuso e il
Inoltre, è stata dimostrata una correlaz ione tra
20,4% nelle forme miste.
l'espressione di HER2 e alcuni aspetti prognostici
sfavorevoli del carcinoma (dimensioni del carcinoma, invasione della sierosa e interessamento linfonodale).
Le percentuali di positività rilevate mediante IIC son o p r o s s i m e a q u e l l e r e g i st r a te m e d i a n te F I S H
(Fluorescence in situ hybridisation). L'amplificazione genica di HER2, riportata in letteratura, varia infatti tra il 7% e il 42%.
Il valore medio di positività alla FISH è identico a
33
Raccomandazioni AIOM-SIAPEC-IAP per la determ
Raccomandazioni
ƒ In considerazione della possibile eterogeneità
di espressione di HER2 è consigliabile l’esecu-
ƒ Il trial clinico TOGA -Trastuzumab for Gastric
Cancer- ha dimostrato l’efficacia terapeutica
zione di almeno 6 biopsie endoscopiche in
aree diverse della neoplasia.
di trastuzumab nel carcinoma dello stomaco
e della giunzione esofago-gastrica localmente
avanzato o metastatico HER2-positivo.
ƒ Nel caso di campioni operatori con diagnosi
istologica di carcinoma misto, si raccomanda
di selezionare una inclusione che sia rappre-
ƒ L’EMA ha approvato l’utilizzo del farmaco in
prima linea per il trattamento dei carcinomi
sentativa della componente ghiandolare della
neoplasia.
metastatici dello stomaco e della giunzione
g a st r o e s o fa g e a H E R 2 - p o s i t i v i ( I I C 3 + o p p u r e
IIC2+ con FISH+).
ƒ La tecnica di screening per l’analisi dello stato
di HER2 nel carcinoma dello stomaco o della
giunzione gastroesofagea è l’immunoistochi-
ƒ E ’ p ertan to neces sario valutare lo stato d i
mica, corredata da ISH nei casi con score 2+.
HER2 in tutti i pazienti con carcinoma metastatico dello stomaco e della giunzione gastroesofagea.
ƒ L’uso di reagenti diversi da quelli già clinicamente validati deve essere preventivamente
validato in sede locale o in un centro di riferi-
ƒ La valutazione dello stato di HER2 è indicata in
mento.
tutti i pazienti con carcinoma dello stomaco e
della giunzione esofago-gastrica metastatici
ƒ I criteri per la interpretazione dei risultati di
suscettibili di un trattamento con cisplatino e
immunoistochimica e per l’assegnazione degli
5FU/capecitabina in combinazione con tra-
score sono in parte differenti da quelli utiliz-
stuzumab
zati per la valutazione di HER2 nel carcinoma
mammario.
ƒ Il materiale istologico deve essere fissato in
formalina neutra tamponata al 10%.
ƒ Le neoplasie dello stomaco e della giunzione
gastroesofagea mostrano caratteristiche di-
ƒ I tempi di fissazione dei campioni bioptici e
verse nella immunoreattività di membrana e
chirurgici devono essere contenuti tra 6 e 48
una maggior eterogeneità intratumorale nella
ore.
espressione/amplificazione di HER2.
34
inazione dello stato di HER2
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Scoring system
ƒ L’indagine IIC costituisce il test di primo livello: essa richiede una conferma ISH solo nei
casi con score 2+. L’indagine ISH nei casi con
score IIC 1+ può essere presa in considerazione, data la difficoltà di definire i tumori IIC 1+:
in questi casi la definizione dello stato di HER2 in funzione della terapia con Trastuzumab
d e ve e s s e r e d i s c u s s a i n d i v i d u a l m e n te c o n
l’oncologo.
Su campioni operatori:
ƒ Lo score 3+ viene attribuito a carcinomi dello
stomaco o della giunzione esofago-gastrica
che presentano ≥10% di cellule con intensa colorazione di membrana, completa, basolaterale o laterale.
ƒ Lo score 2+ viene attribuito a carcinomi dello
stomaco o della giunzione esofago-gastrica
che presentano 10% di cellule con moderata/debole colorazione di membrana, completa, basolaterale o laterale.
ƒ Lo score 1+ viene attribuito alle neoplasie che
presentano lieve e frammentata colorazione
di membrana in almeno il 10% delle cellule neoplastiche.
Su biopsie endoscopiche:
ƒ I criteri di score sono uguali a quelli sopra descritti per quanto riguarda l’intensità dell’immunocolorazione. E’ richiesta la presenza di
un cluster di almeno 5 cellule contigue con le
caratteristiche di immunoreattività sopra descritte. Il cut off del 10% di cellule positive
non si applica alle biopsie endoscopiche.
ƒ L’indagine IIC costituisce il test di primo livello: essa richiede una conferma ISH solo nei
casi con score 2+. L’indagine ISH nei casi con
score IIC 1+ può essere presa in considerazione, data la difficoltà di definire i tumori IIC 1+:
in questi casi la definizione dello stato di HER2 in funzione della terapia con Trastuzumab
d e ve e s s e r e d i s c u s s a i n d i v i d u a l m e n te c o n
l’oncologo.
ƒ I criteri per la definizione dello stato di amplificazione del gene HER-2 (ISH) sono analoghi a
quelli utilizzati per il carcinoma mammario.
Ai fini della prescrizione di trastuzumab la determinazione di HER-2 è ritenuta positiva se:
ƒ IIC score 3+
ƒ IIC score 2+ confermata da ISH positiva.
35
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