Clementi 2

Università degli Studi - Azienda Ospedaliera Padova
UOC di GENETICA CLINICA ED EPIDEMIOLOGICA
Direttore Prof. Maurizio Clementi
ANALISI
GENETICHE su
DNA FETALE
CIRCOLANTE
Non Invasive Prenatal Diagnosis (NIPD)
1997
Il DNA fetale circolante
Placenta
•
•
Maternal plasma
Maternal blood cells
Nel plasma materno è presente DNA cell-free di
provenienza sia materna che fetale
Entrambe le frazioni sono presenti in quantità molto
limitate , sono costituite da frammenti di DNA molto
corti e rappresentano l’intero genoma
The cell-free fetal DNA
2004
The cell-free fetal DNA
Identificabile dalla 5
Possibile PD dalla 7
Affidabile dalla 9
The cell-free fetal DNA
Il DNA fetale circolante
Il DNA fetale proviene principalmente dalla placenta e
costituisce il 5-25% del DNA cell-free totale (in media
circa il 10%)
E’ individuabile dalla 4° settimana ma utilizzabile dalla 9°10° sg
• Clearance completa poche ore dopo il parto
•
•
“Fetal Nucleic Acids” nella circolazione materna
Year
1997
tappe
“free fetal DNA in maternal blood”
ricercatori
Lo
Applicazioni cliniche. difficoltà
Esistono numerosi problemi generali associati alla detection del cffDNA nella
circolazione materna:
1. la concentrazione è relativamente bassa; frammenti piccolI
2. la quantità del DNA libero totale nel sangue varia enormemente tra gli individui;
3. l’elevato background materno;
primer
4. il feto eredita metà del suo genoma dalla madre.
5. sesso femminile non facilmente identificabile
primer
Applicazioni cliniche. difficoltà
Esistono numerosi problemi generali associati alla detection del cffDNA nella
circolazione materna:
1. la concentrazione è relativamente bassa; frammenti piccolI
2. la quantità del DNA libero totale nel sangue varia enormemente tra gli individui;
3. l’elevato background materno;
4. il feto eredita metà del suo genoma dalla madre.
5. sesso femminile non facilmente identificabile
Applicazioni
• Determinazione sesso fetale
Y facilmente identificabile
Mini-sequencing
rs1534285: A/G; Het 0.53
rs1894579: C/T; Het 0.53
rs1373592: A/G; Het 0.50
rs741935: A/G; Het 0.38
rs925178: A/G; Het 0.51
rs1936313: C/T; Het 0.52
Het
rs1977719: C/T; Het 0.43
rs1372687: A/C; Het 0.36
OmoC
EmiT
rs1930674: C/G; Het 0.56
rs1981452: G/T; Het 0.52
Controlli 1 e 2
Settimana
gestazionale
Concentrazione
DNA libero totale
Concentrazione
cffDNA
(settimane + giorni)
(Genome Equivalents/ml di sangue)
(Genome Equivalents/ml di sangue)
Controllo 1
11 + 2
414.84
/
Controllo 2
11 + 0
297.23
35.8 (Y)
► non è stato possibile confermare la presenza del cffDNA mediante Real-Time qPCR
sul gene SRY nella coppia di controllo 1
► rs741935 (madre CC e padre T), rs1894579 (madre CC e padre T)
rs1894579
Applicazioni
• Determinazione sesso fetale
• Rh
Determinazione del genotipo RhD fetale
Legler et al., 2009
Finning et al., 2008
cfDNA: applicazioni “genetiche”
cfDNA: preparazione del campione
Vs
Estrazione del cfDNA (manuale o
automatizzata) ma NON separazione delle
frazioni materna e fetale
Malattie monogeniche
1138G>A (FGRF3); Chitty et al., 2011
Arg668Cys, Lys710ter, Tyr1092ter (CFTR);
Bustamante-Aragones et al., 2008
(CAG)n (IT-15); Gonzalez-Gonzalez et al., 2003
Casi 1, 2, 3 e 4
Settimana
gestazionale
Concentrazione
DNA libero totale
Concentrazione
cffDNA
(settimane + giorni)
(Genome Equivalents/ml di sangue)
(Genome Equivalents/ml di sangue)
Caso 1
12 + 1
109.36
22.23
Caso 2
16 + 0
986.58
40.91
Caso 3
10 + 5
564.66
11.32
Caso 4
15 + 4
589.24
25.25
Caso 4
Caso 3
Caso 2
Caso 1
wt
dF508
I risultati ottenuti sono stati confermati dall’analisi molecolare su villi coriali.
Applicazioni
• Determinazione sesso fetale
• Rh
• Malattia monogeniche
• Aneuplodie?
Aneupliodia
Tounta et al., 2011
Chiu et al., 2011
de Jong et al., 2011
Futuro previsto nel 2012
ffDNA: metodi di analisi
- WG massively parallel sequencing (W-MPS)
- Targeted massively parallel sequencing (t-MPS)
- Single nucleotide polymorphism (SNP)-based
SANGER
SEQUENCER
1 READ
SAMPLE
atgcgta
cggtctt
atcaggc
ggcttgc
NGS
SEQUENCER
MULTIPLE
READS
cttcttc
ttattag
tctctag
atctgta
BIOINFORMATIC ALIGNMENT
ctgactacgtagcctatcctaggacga
atcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga
tgctcggcgactcgatcgata
cgtagcctatcctaggacga
agactgactacgtagcctatcctag
cgatcgatagactgactacgtag
ctcggcgactcgatcgataga
ctacgtagcctatcctaggacga
tcgatagactgactacgtagc
ctcggcgactcgatcgatagact
cgactcgatcgatagactgactacgt
ctacgtagcctatcctaggacga
attgctcggcgactcga
agcctatcctaggacga
cgatagactgactacgtagcctat
attgctcggcgactcgatcgataga
atcgatagactgactacgtagcctatccta
attgctcggcgactcgatcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga
READS
REF.
Sequence
COVERAGE
5X
ctgactacgtagcctatcctaggacga
atcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga
tgctcggcgactcgatcgata
cgtagcctatcctaggacga
agactgactacgtagcctatcctag
cgatcgatagactgactacgtag
ctcggcgactcgatcgataga
ctacgtagcctatcctaggacga
tcgatagactgactacgtagc
ctcggcgactcgatcgatagact
cgactcgatcgatagactgactacgt
ctacgtagcctatcctaggacga
attgctcggcgactcga
agcctatcctaggacga
cgatagactgactacgtagcctat
attgctcggcgactcgatcgataga
atcgatagactgactacgtagcctatccta
2X
9X
attgctcggcgactcgatcgatagactgactacgtagcctatcctaggacga
READS
REF.
Sequence
NIPT methods: MPS
Milioni di frammenti di DNA libero sia materno che fetale
vengono sequenziati simultaneamente ed, essendo noto l’intero
genoma umano, ogni frammento può essere assegnato al
cromosoma di provenienza.
In presenza di un’aneuploidia ci sarà un eccesso o un difetto
relativo di DNA libero per il cromosoma in questione.
NIPT methods: MPS
Per esempio, per la trisomia 21:
- 20% DNA fetale, di questi il 5% dal cromosoma 21
- I frammenti di DNA che derivano dal cr 21 fetale
sono 33% in più rispetto all’atteso
NIPT methods: MPS
-
-
Il metodo deve individuare questa differenza
considerando che l’80% dei frammenti da cr 21
saranno materni:
L’aumento relativo di DNA da cr 21 sarà solo del
10%
NIPT methods: SNPs-based
13/05/15
NIPT: cause di FP e FN
FALSI POSITIVI
• MOSAICISMO PLACENTARE
• VANISHING TWIN SYNDROME: 15% DI TUTTI I FALSI POSITIVI
• PATOLOGIA MATERNA NON NOTA, COME MOSAICISMO (8-9% DEI FALSI
POSITIVI) o NEOPLASIA
• MODIFICHE DELLA QUANTITÀ DI DNA CIRCOLANTE: OBESITÀ, GEMELLARITÀ
FALSI NEGATIVI
• INSUFFICIENTE QUANTITÀ DI cfDNA FETALE NEL CAMPIONE
• MOSAICISMO FETALE-PLACENTARE
NIPT: cause di FP e FN
Essendo DNA di origine placentare mostra gli stessi limiti del
CVS vs LA, in particolare per quanto riguarda i mosaicismi
placentari.
NIPT: cause di FP e FN
Gravidanze gemellari:
Difficile assegnazione della possibile aneuploidia
La quota eccedente in presenza di trisomia di un
feto può essere mascherata dall’altro gemello
normale
Possibili effetti di un Vanishing twin sui risultati
dello screening (15% dei FP)
NIPT: cause di FP e FN
• Infezione
• Cancro
• Trasfusioni di sangue
• Mosaicismo latente
• Immunoterapia
13/05/15
• Donne trapiantate
NIPT in commercio
NIPT
NIPT: comparazione - 1
Trisomia 21 Trisomia 13 Trisomia 18
Sensibilità
>99%
>97%
>96%
Aneuploidie
Cromosomi
sessuali
± 95%
Specificità
>99%
>99%
>99%
>96%
FP
<0,1%
<0,1%
<0,1%
FN
<0,001%
<0,001%
<0,001%
No call /
resampling
<2%
<2%
<2%
NIPT: comparazione - 2
S.G.
Tempi
referto gg
lavorativi
Dove viene
eseguito
Costo
medio
Consulenza
genetica
pre/post
G-Test
10
8-9
Italia
750
Si
Harmony
10
7
USA
450
Si
Maternity T21
10
10
USA
1000
Si
Panorama
9
5-6
USA
650750
Si
Praenatest
10
10
Germania
650690
Demandata
all’inviante
Prenataltest
10
8-10
Italia
420
Pre
Tranquillity
10
5
Svizzera
600
Demandata
all’inviante
Verifi
10
5
USA
n.a.
Demandata
all’inviante
NIPT: microdel/dup
G-Test
Harmony
1p36, 2p33.1, 5p15.2 (in validazione)
no
Maternity T21 1p36, 5p, 4p, 8q, 11q, 15p11, 22q11 (vers. plus)
Panorama
1p36, 5p15.2, 22q11
Praenatest
No
Prenataltest
No
Tranquillity
5p15, 15p11, 22q22 + tutte > 10 Mb
Verifi
1p36, 4p, 5p, 15p11, 22q11
NIPT: microdel/dup
A causa dei numeri non ancora elevati di
microdel/dup riscontrati in NIPT, la sensibilità e
specificità di questo test è bassa (Valore
predittivo positivo: 5-20%), con una percentuale
elevata di falsi positivi (aumento ingiustificato di
procedure invasive NON necessarie)
Prospettive future NIPT
- Anomalie degli altri autosomi (??)
- Miglioramento performance di
cromosomi
sessuali e micro del/dup
- Mosaicismi
- Traslocazioni
- Triploidie