Le tecniche molecolari nella diagnosi delle epatiti

Le tecniche molecolari nella
diagnosi delle epatiti
dott. Danila Bassetti
Microbiologia e Virologia
Struttura Semplice Sierologia Autoimmunità
Ospedale S.Chiara di Trento
Biologia Molecolare ed Epatiti
Integrazione nella loro gestione clinica con
finalità di:
Diagnosi delle forme acute e croniche
Prognosi e predittività dell’efficacia
terapeutica
Monitoraggio clinico e terapeutico
Epatiti virali - Vie di trasmissione
“Fec-orale”
Epatiti virali
“Parenterali”
A
E
Trasmissione
enterica
C
Trasmissione
parenterale
NANB
B
D
F, ? altre
F
Clinica epatiti B e C: variabili influenti
Virus:
•
•
•
•
Attività replicativa
“Viral load”
Genotipo
Mutazioni da ceppo
“wild type”
• Resistenza a farmaci
anti-virali
Paziente:
• Età (sesso)
• Immunodepressione
• Gravidanza
• Trasmissione
verticale
• Comorbidità
• Genetica (IL28R, IFN λ)
• Insulinoresistenza
Biologia Molecolare ed epatiti B / C
QUANDO
?
COME
?
Forme ACUTE
Forme CRONICHE
PERCHE’
?
HBV e Biologia Molecolare
(HBV-DNA qualitativo)
HBV-DNA quantitativo (“viral load”)
Ricerca mutanti o varianti “escape”
Genotipizzazione
Ricerca resistenze ad antivirali
Ittero
Sintomi
HBeAg
⇑ ALT
Anti-HBe
Epatite acuta B:
marcatori sierologici
Titolo
HBV-DNA
Anti-HBc
HBsAg
Anti-HBs
IgM anti-HBc
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40
52
Settimane dopo l’esposizione
Biologia Molecolare ed Epatite B acuta
Generalmente non necessaria
Utile nella identificazione di:
varianti HBV “escape”
forme c.d. Occulte
Cronicizzazione: decorso sierologico tipico
Acuta
(6 mesi)
HBV DNA
Cronica
(anni)
HBeAg
anti-HBe
HBsAg
Titolo
Total anti-HBc
IgM anti-HBc
0
4
8
12 16 20 24 28 32 36
52
Settimane dopo l’esposizione
anni
HBV-DNA: indicatore prognostico
REVEAL Studio:
Livelli HBV DNA ed evoluzione
Viral Load at Baseline
20
Incidenza Cumulativa di HCC
(%) (n=3653)
14.89%
Multivariatarischio relativo di cirrosi (n=3482)
12
10.6
9.7
10
15
12.17%
8
6
10
3.6
4
5
3.57%
2.0
2
1.30% 1.37%
0
<300 (Undetectable)
1.0
0
300-9999
Chen CJ et al. JAMA. 2006;295:65-73.
Iloeje UH et al. Gastroenterology. 2006;130:678-686.
10,000-99,999
100,000-999,999
≥1 million
Distribuzione genotipi HBV
F
D
A
D
A,B,C,D
C
D
H
F
H
Cronicizza A>D
Pre core mutazione B,C,D>A
HBeAg sieroconv B versus C
C
D
E
G
A
D
Bj
Ba
F
A,B,C,D
Rischio fibrosi C>B
Rischio mortalità F>A o D
Risposta a IFN A>D, B>C
Genotipizzazione HBV
Genotipo C
Più spesso associato con malattia epatica
severa e HCC rispetto al genotipo B
Genotipo B
Associato con sieroconversione da HBeAg
ad anti-HBe in età più giovane rispetto al
genotipo C
Genotipi A e B
Più alto tasso di risposta antivirale e
perdita HBeAg in seguito a terapia con
pegIFN alfa rispetto al genotipo D e C
Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2006;4:936-962.
HBV Genotyping
Line Probe Assay
Marker line
Conj. control
Amp. control
Genotype A
Genotype B
Genotype C
Genotype D
Genotype E
Genotype F
Genotype G
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Infezione cronica da HBV: evoluzione
Epatite
cronica
25-30%
Cirrosi
60-65%
5%
Infezione
cronica
HCC
7-10%
35-40%
Portatore
asintomatico
OLT/
decesso
Terapie per Epatite B Cronica
Interferone
α
Antigen
Presenting
Cell
Immunomodulazione
T helper cell
B cell
Cytotoxic T cell
Azione Antivirale
Natural killer cell
Azione Antivirale
Nucleoside/
nucleotide
analoghi
Terapia epatite B: due approcci diversi
Interferone (PEG-IFN)
Meccanismo immunostimolante-antivirale
Terapia “finita” (48 settimane)
Analoghi nucleosid(t)ici (NUCs)
Meccanismo antivirale puro
Terapia “long term”
Scopo monitoraggio terapia
Epatiti B e C
Misura efficacia antivirale:HBV,HCV
Predizione dell’outcome: HBV,HCV
Modifica precoce della terapia
• sospensione per inefficacia: HCV
• adattamento: HBV
Diagnosi di resistenza: HBV
Risposta virologica HBV
Risposta ad IFN
HBV-DNA <2000 UI/mL
alla 24 sett. terapia
Risposta a NUCs
HBV-DNA <15 UI/mL
entro 48 sett. terapia
Terapia Epatite B cronica
Farmaci anti-HBV
Nucleosidi analoghi
Nucleotidi analoghi
ETV
TDF
Potenza
LdT
LAM
FTC
ADV
IFN
Barriera genetica
ATTIVITA’ ANTIVIRALE : potenza e barriera genetica
Resistenza ad analoghi nucleos(t)idici
80
Year 1
Year 2
Year 3
Year 4
Year 5
70
60
50
40
30
Year 5
20
Year 3
10
Year 1
0
F
TD
T
LD
T
LD
V
ET
DV
V
ET
A
M
LA
in
in
-R
M
EU
LA
Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36:687-96; Lok et al Gastroenterology 2003; 125 : 1714-1722; Zoulim et al J Viral Hepatitis 2006;13:278-288; Hadzyiannis
et al NEJM 2005; 352 : 2673-2681; Chang et al. NEJM 2006; 351: 1001-1010; Lai et al NEJM 2006; 354: 1011-1020;
Lai et al Abstract # 91, AASLD 2006. Colonno R et al. Abstract #110, AASLD 2006. Globe study. Data on file. Keefee et al. Clin Gastroenterol Hepatol
2008; 6:268-274.
Mutazioni nel genoma HBV causa di
resistenza ad antivirali
Terminal protein
Spacer
Reverse transcriptase
rI
o
3L 0M DD 4V I
7
V1 L18 YM M20 204
M
1
F G
A
Lamivudine-resistant mutations
Adefovir-resistant mutations
Entecavir-resistant mutations
(requires pre-existing M204I/V mutation)
Telbivudine-resistant mutations
K. Kowdley.
RNase H
B
C
I169
A181V
or T
D
344
E
S202
T184
N236T K241E
K318Q
M250
Resistenza HBV ad antivirali:
ibridazione inversa
Profili di Resistenza indotti da mutazioni virali
HBV e gravidanza
Kits HBV-DNA
Kits HBV-DNA: sensibilità e ranges dinamici
Virus Epatite C
Prevalenza HCV nel mondo
Europe
8.9 million
(1.03%)
1, 2, 3
The Americas
13.1 million
(1.7%)
1, 2, 3
4
4
1
Africa
31.9 million
(5.3%)
4
4,5
3
3
Western Pacific
1, 362.2 million
(3.9%)
Asia: 6
1,3
Southeast Asia
Eastern
Mediterranean
21.3 million
(4.6%)
32.3 million
(2.15%)
Stimati 170-180 milioni di portatori (3,1%) globale
World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence: update. 2003. Farci P, et al.
Semin Liver Dis. 2000;20:103-126. Wasley A, et al. Semin Liver Dis. 2000;20:1-16.
HCV e Biologia Molecolare
(HCV-RNA qualitativo)
HCV-RNA quantitativo (“viral load”)
Genotipizzazione
Marcatori di Infezione da HCV
Epatite acuta che cronicizza
Epatite acuta che guarisce
Anti-HCV
Sintomi +/-
Sintomi+/
Sintomi+/+/-
HCV RNA
HCV RNA
Ag
T it o lo
T it o lo
anti-HCV
Ag
ALT
ALT
Normale
0 1
2
3 4
mesi
5
Normale
6
1
2 3
anni
Tempo dopo esposizione
4
0
1
2
3 4
mesi
5
6
1
2 3
anni
Tempo dopo esposizione
4
Kit HCV-RNA: sensibilità e ranges dinamici
Biologia Molecolare ed Epatite C acuta
Generalmente non necessaria
Utile nella identificazione di:
fasi pre-sierologiche
trasmissione verticale (monitoraggio
neonato 0,3,12 mesi)
HCV genotipi
Prevalenza genotipi HCV nel mondo
Genotipo e risposta alla terapia
I genotipi 1 (a,b) e 4 presentano una minore
risposta alla terapia
“Viral load baseline” e genotipo sono i due
principali predittori indipendenti di risposta
sostenuta alla terapia (SVR)
Sono previsti schemi posologici differenziati tra
genotipi (dose e durata terapia)
Tuttavia pazienti con lo stesso genotipo e con gli
stessi livelli di viremia basale hanno differenti
risposte alla terapia → anche altri fattori
condizionano la risposta alla terapia (insulinoresistenza,
mutazione IL28R per IFN λ)
Timing del monitoraggio virologico
Risposta virologica alla terapia:
HCV-RNA
RVR: negativo a 4 settimane di terapia
EVR: completa
negativo a 12 sett.
parziale
calo > 2 log a 12 sett.
10
NR: < 2 log da valori base a 12 sett.
non-vRVR: calo <0.8 log a 48 ore
10
10
predittività negativa per SVR
SVR: negatività a 6 mesi da fine terapia
Definizione della risposta virologica
alla 4 e 12 settimana di terapia
Monitoraggio terapia epatite C genotipo 1
Monitoraggio terapia epatite C genotipo 2/3
HBV DNA – HCV RNA
So
nd
e
sp
ec
ific
he
pe
r
il t
ar
ge
t
Il rilevamento
del genoma virale è il parametro
più attendibile
per la diagnosi e per il
monitoraggio dell’infezione
Tecniche di biologia molecolare
Take-home Messages
Nella gestione delle epatiti B e C la
Biologia Molecolare è in grado di:
Confermare la diagnosi (f. acute e croniche)
Definire indici prognostici
Orientare la scelta di opzioni terapeutiche
(farmaco, posologia, durata, sospensione)
Monitorare outcome clinico e terapeutico
Confermare trasmissione materno-fetale
GRAZIE dell’Attenzione!
ERROR: undefined
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