diastat anti-ro - Technogenetics

Transcript

GOLDchipTM
Constitutional
199GLD20
199GLD10
Edizione
Agosto 2013
Test
vetrini/
confezione
campioni
/vetrino
Codice
Kit
199GLD20
GOLDCHIP
Constitutional 20P
20
5
4
199GLD10
GOLDCHIP
Constitutional 10P
10
5
2
ISTRUZIONI PER L’USO
For research use only /Non per uso diagnostico
19265 Ed. I/08.13
Pag. 1 - 38 GOLDchip Constitutional 2013
AVVERTENZA
GOLDchipTM Constitutional è un test solo per uso di ricerca. Il
laboratorio è responsabile, sia dell’esecuzione corretta del protocollo
d’analisi che dell’interpretazione dei risultati. Technogenetics non è
responsabile dei risultati ottenuti e qualunque decisione medica va
fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili ed il conforto di test
di conferma che impiegano metodi alternativi.
INTRODUZIONE
La citogenetica clinica si conferma essere uno strumento diagnostico
indispensabile per l’identificazione di alterazioni cromosomiche, in
particolare aneuploidie e anomalie strutturali sbilanciate, nel feto di
donne in età avanzata.
Benché l’accuratezza diagnostica del cariotipo sia del 99.4 - 99.8% su
amniociti coltivati e del 97.5-99.6% sui villi coriali, l’esame
microscopico
dei
cromosomi
potrebbe
non
identificare
riarrangiamenti di segmenti genomici più piccoli di 5-10Mb, come
quelli delle regioni subtelomeriche. Inoltre, il tempo necessario per
avere un risultato è di 10-14 giorni poiché le cellule devono essere
prima coltivate.
Attualmente, i nuovi metodi di citogenetica molecolare hanno
migliorato la risoluzione di rilevamento delle anomalie
cromosomiche e ridotto i tempi necessari per l’analisi. Una delle
tecniche più diffuse e utilizzate è la FISH (Fluorescence In Situ
Hybridization), basata sull’uso di una o più sonde specifiche per una
regione cromosomica, di diversi kb di lunghezza. Tuttavia, questo
tipo di test non rivela anomalie localizzate in zone cromosomiche
diverse dal segmento genomico per il quale la sonda è stata
disegnata ed è limitato dal numero di sonde che possono essere
usate contemporaneamente. In aggiunta, essa richiede il sospetto
clinico che un locus specifico nel genoma abbia subito un
cambiamento nel numero di copie di DNA: questa conoscenza
permette di scegliere la sonda appropriata per l’analisi e la scelta
dell’esecuzione dell’esame su cromosomi metafasici o su nuclei
interfasici. Infine, l’analisi è efficace nell’individuazione delle
microdelezioni ma non è altrettanto affidabile per quanto riguarda
le microduplicazioni.
Per ovviare questi limiti della FISH, è stato sviluppato un nuovo
metodo di analisi: l’array-CGH, che consente di rilevare, effettuando
un unico esperimento, qualsiasi sbilancio di dosaggio (aneuploidie,
duplicazioni e delezioni) in molteplici loci nel genoma. Perciò,
l’array-CGH può essere considerato come un esperimento FISH
coordinato e concomitante di centinaia o migliaia di sonde
specifiche per ogni locus presente nella regione rappresentata
nell’array stesso.
Questa nuova tecnologia è basata sull’uso di campioni di DNA test e
controllo marcati con fluorocromi diversi che vengono ibridati
contemporaneamente a sonde di DNA targets localizzati su un
supporto di vetro. Sono stati creati diversi tipi di microarray, con
substrati di DNA differenti, tra cui oligonucleotidi (25-85bp), cDNAs
o Bacterial Artificial Chromosomes (BACs, 80-200kb).
La risoluzione dell’array-CGH ha la potenzialità di essere più elevata
rispetto a quella delle analisi cromosomiche di routine poichè è
determinata dalla copertura e densità dei cloni utilizzati: è
teoricamente limitata solo dalle dimensioni dei DNA targets e dalla
distanza tra le loro sequenze sul cromosoma.
I microarray di cloni a largo inserto genomico (come BAC e P1)
consentono di individuare cambiamenti in singola copia (rapporto
1:2 e 3:2) in modo accurato e riproducibile. L’uso dei BACs favorisce
la diretta correlazione tra le amplificazioni/delezioni da essi rilevate
e la loro localizzazione cromosomica.
La potenzialità dell’array-CGH di analizzare migliaia o centinaia di
loci simultaneamente in un unico esperimento ha un grosso
vantaggio: in numerosi studi, l’array-CGH identifica anomalie che
non erano state rilevate da analisi di citogenetica convenzionale e
FISH. Tuttavia, recenti prove hanno dimostrato l’esistenza, lungo il
genoma, di numerose (e comuni) delezioni/duplicazioni di origine
familiare. Si ritiene che alcune di queste variazioni nel numero di
copie di DNA (CNVs, Copy Number Variations) non abbiano un
significato clinico essendo state osservate in individui
fenotipicamente sia normali che anormali. Altre di esse, invece,
sembrano avere significato clinico, specialmente quando osservate
come de novo in un soggetto con fenotipo anomalo. Sebbene siano
stati fatti grandi passi per catalogare i diversi CNVs e riportarli nei
principali databases pubblici (UCSC o Ensembl), tuttavia anomalie
cromosomiche patologiche potrebbero comprendere regioni con
CNVs o avvenire in tali regioni. In un’ottica diagnostica, gli array
genomici possono generare dati difficili da interpretare e
necessitando di indagini di conferma sui genitori, risulterebbe
impegnativa e costosa su almeno il 97% dei casi sottoposti a studi di
routine. Perciò, gli array genomici wide-dense, che sono
correntemente disponibili per ricerca, non sembrano essere adatti
per l’uso in diagnosi clinica, dal momento che essi fanno sorgere
numerose problematiche di tipo medico, tecnico e finanziario.
Sembrerebbe essere più appropriato, invece, un vetrino mirato
all’investigazione di anomalie cromosomiche conosciute, da
utilizzare solo su individui con fenotipo sospetto.
A causa della presenza di abbondanti CNVs nel genoma, nella
diagnosi prenatale vengono costruiti array targets solo con cloni
localizzati in regioni con chiaro significato patologico. In questo
senso, finora sono stati svolti numerosi esperimenti e ricerche: uno
studio su 1500 bambini con ritardo mentale e nello sviluppo ha
dimostrato che, sebbene l’uso di un array target potrebbe identificare
un numero inferiore di anomalie cromosomiche, questo approccio
riduce ampiamente il numero di CNVs.
BAC array come GOLDchip Constitutional, costruiti con loci a
significato clinico conosciuto, con ridondanza di cloni su ogni
regione e minimi polimorfismi forniscono i migliori dati utili alla
diagnosi. Il vantaggio di questo tipo di vetrino è che i
riarrangiamenti cromosomici rilevati attraverso l’array-CGH possono
essere confermati tramite FISH con lo stesso BAC che mostra
un’alterazione nel dosaggio.
Il goal dei vetrini target come GOLDchip Constitutional nella
pratica medica è quello di fornire dati clinici utili per la diagnosi, la
consulenza genetica, la prognosi e il trattamento clinico delle
anomalie citogenetiche sbilanciate.
In conclusione, l’array-CGH, con la sua potenzialità di identificare
molti riarrangiamenti sbilanciati microscopici e submicroscopici, gli
ultimi dei quali potrebbero essere persi dalla routine citogenetica,
sembra essere uno dei test da affiancare, nel prossimo futuro, al
bandeggio cromosomico e alla FISH.
REGIONI GENOMICHE COPERTE DAL GOLDCHIP CONSTITUTIONAL
Nella seguente tabella sono riportate le patologie rilevate dal
vetrino, con la regione cromosomica coinvolta.
Genomic Regions covered by
GOLDchip Constitutional
band
frequency
size bp
1p36 monosomy
1p36.33p36.32
1/5000
5.188.853
2q37 monosomy
2q37.1q37.3
1/10000
8.155.096
Wolf-Hirschhorn Syndrome
4p16.3
1/50000
2.095.594
Adenomatous polyposis of the colon
5q22.2
1/8000
4.979.981
Cri du Chat Syndrome
5p15.33p15.2
1/15000-50000
11.675.602
Sotos Syndrome
5q35.2q35.3
1/15000
286.035
Greig cephalopolysyndactyly syndrome
7p14.1
1-9/1000000
223.441
Saethre-Chotzen like phenotype
7p21.1
1/25000-50000
313.357
Williams-Beuren Syndrome
7q11.22q11.23
1/10000-20000
3.079.314
Langer Giedion Syndrome
8q23.3q24.12
unknown
2.919.306
9q34 subtelomeric deletion syndrome
(Kleefstra syndrome)
9q34.3
unknown
617.321
DiGeorge 2 Syndrome (DGS2)
10p14p12.31
1/1000000
12.598.536
Hypoparathyroidism sensorineural deafness and
renal disease (Barakat Syndrome)
10p14
1/1000000
149.558
Potocki-Shaffer Syndrome
11p11.2
1/1000000
2.131.894
Wilms tumor, aniridia, genitourinary anomalies
and mental retardation (WAGR) Syndrome
11p13
1/100000
724.186
Patau syndrome
Trisomy 13
1/8000-15000
aneuploidy
Prader Willi Syndrome/Angelman Syndrome
15q11.2q13.1
1/20000
6.028.214
Alpha-Thalassemia/Mental Retardation
Syndrome, Deletion-Type
16pterp13.3
unknown
712.792
Rubinstein-Taybi/Microduplication syndrome
16p13.3
1/100000-125000
303.435
17p11.2 Duplication Syndrome
(Potocki-Lupski syndrome)
17p11.2
1/20000
3.114.637
17q12 Microdeletion/17q12 Microduplication
17q12
unknown
5.416.695
Charcot-Marie-Tooth syndrome
type 1A
17p12
1/10000
508.001
HNPP, Hereditary Pressure Sensitive Neuropathy,
Tomaculous Neuropathy
17p12
2-5/100000
353.888
Miller-Dieker Lissencephaly Syndrome
17p13.3
1/25000
2.308.753
Neurofibromatosis Type 1
17q11.2
1/4000-5000
602.205
Smith-Magenis Syndrome
17p11.2
1/15000-25000
3.114.637
Edwards syndrome
Trisomy 18
1/6000
aneuploidy
Down Syndrome
21q22.12q22.2
1/650-1000
aneuploidy
Cat eye syndrome
22q11.1
1/74000
1.108.477
DiGeorge Syndrome/Velocardiofacial Syndrome
22q11.21q11.22
1/5000
3.353.636
Alpha-thalassemia mental retardation syndrome,
X-linked
Xq21.1
1/1000000
150.203
Klinefelter syndrome
47,XXY
1/500 male; 69/10000 others
aneuploidy
Leri-Weill Dyschondrosteosis
Xpterp22.33
unknown
458.348
Mental retardation, X-linked,
with isolated growth hormone deficiency,
included
Xq27.1
1/1000000
248.024
Pelizaeus-Merzbacher disease
Xq22.2
1/400000
328.661
Premature ovarian failure, X-linked
Xq26.2-q28
> 1/1000
17.907.001
Lubs X-linked mental retardation syndrome
Xq28
1/1000000
203.640
Turner syndrome
45,X
1/2500 fem; 1/5000
others
aneuploidy
Gonadal dysgenesis, XY, SRY-related - XX male
syndrome, SRY positive
Yp11.31
1-9/100000
216.527
PRINCIO DEL METODO
I vetrini GOLDchip Constitutional sono prodotti realizzati con
sequenze genomiche umane conosciute. Sono prodotti dedicati per
array-CGH e basandosi sulla ibridazione competitiva del DNA
genomico verso un DNA controllo consentono di investigare lo
sbilanciamento nel numero di copie di determinate sequenze
genomiche.
Il protocollo sperimentale si compone di otto fasi:
1. Preparazione del materiale di partenza: viene valutata la
qualità spettrofotometrica del DNA test onde evitare che
residui salinici e altri contaminanti possano introdurre bias
durante il processo di marcatura.
2. Marcatura: i DNA test e controllo vengono marcati
indipendentemente con due diversi fluorocromi, utilizzando la
tecnica di marcatura “Random Priming” dove utilizzando come
stampo il DNA test o controllo viene neosintetizzato il DNA
corrispondente in presenza della Klenow (frammento della
DNA polimerasi I di E. coli) e dei Random Primers come primers
di innesco. Questo permette, durante la scansione del chip, di
acquisire due immagini distinte, una relativa al test e l’altra al
controllo, e di misurare l’intesità di segnale dei due DNA,
ibridati in modo competitivo per ogni singolo spot depositato
sul vetrino.
3. Purificazione: i DNA test e controllo vengono co-purificati su
silica minispin column e si eluiscono in acqua sterile.
4. Precipitazione: i due DNA marcati e purificati si co-precipitano
in presenza di una soluzione di bloccaggio.
5. Ibridazione: il pellet dei due DNA cosí ottenuti viene risospeso
nella soluzione di ibridazione. Dopo una fase di denaturazione
e pre-ibridazione in questa soluzione, il DNA viene depositato
sulla superficie del vetrino per permettere l’ibridazione.
6. Lavaggi: al fine di rimuovere legami aspecifici ed il materiale in
eccesso non ibridato si operano passaggi a stringenza
controllata.
7. Scansione: la scansione del chip viene eseguita con lo
strumento Innoscan 710 e successivi, Innopsys.
8. Analisi dei dati: le immagini ottenute con la scansione vengono
elaborate con il software di analisi BIO-SOFT, GeosLab.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
I vetrini GOLDchip Constitutional contenuti possono essere nel
formato a 4 aree o 2 aree e permettono l’analisi per ciascun formato
di 4 o 2 pazienti contemporaneamente:
REF
199GLD20
DESCRIZIONE
GOLDchip Constitutional 20P
199MIX20
reagents
A. Distilled Water
B. dNTPs mix
C. Blocking buffer
D. Hybridization mix
REF
199GLD10
DESCRIZIONE
199MIX10
reagents
A. Distilled Water
B. dNTPs mix
C. Blocking buffer
D. Hybridization mix
CONTENUTO
5 vetrini
25 Vetrini coprioggetto 12x24
1000 µL
200 µL
1000 µL
180 µL
CONTENUTO
5 vetrini
15 Vetrini coprioggetto 12x24
1000 µL
100 µL
500 µL
90 µL
SCHEMA DI UTILIZZO PER IL FORMATO A 4 AREE
DNA-paziente 400ng
DNA-controllo 400ng
LABELLING
LABELLING
HYBRIDISATION
400ng DNA
paziente 1-Cy3
AREA 1
400ng DNA
controllo 1-Cy5
400ng DNA
paziente 2-Cy3
AREA 2
400ng DNA
controllo 2-Cy5
400ng DNA
paziente 3-Cy3
AREA 3
400ng DNA
controllo 3-Cy5
400ng DNA
paziente 4-Cy3
AREA 4
400ng DNA
controllo 4-Cy5
BARCODE
AVVERTENZE
I vetrini GOLDchip Constitutional devono essere utilizzati solo
ed esclusivamente a scopo di ricerca. Non utilizzare per uso
diagnostico.
I vetrini GOLDchip Constitutional sono stati messi a punto per
essere utilizzati seguendo le istruzioni descritte in metodica. Il
cliente ha la responsabilità di applicare correttamente il protocollo;
procedure
anche
solo
parzialmente
differenti
possono
compromettere la buona riuscita dei risultati.
Tutti i dati ottenuti devono essere confermati tramite FISH o altre
tecniche di conferma in uso presso i centri di citogenetica clinica.
Qualsiasi decisione medica non può essere basata sul risultato di un
unico test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili. I
dati clinici discrepanti vanno approfonditi prima di prendere
qualsiasi decisione analitica, eventualmente con il conforto di test di
conferma.
Alcune patologie considerate nel vetrino sono causate da mutazioni
anche in singoli geni le quali possono non essere rilevate dal
presente test. Tuttavia, anche delezioni/duplicazioni nella regione
cromosomica in cui è localizzato il gene coinvolto possono portare
allo progresso della malattia. Infatti, una volta rilevata
un’abberrazione genotipica legata ad un fenotipo patologico è
opportuno consultare i databases di riferimento (Decipher, Orphanet
e OMIM) per avere un quadro clinico informazionale della patologia
stessa (cause, frequenza, diagnosi, cure). L’insieme di tutte le
informazioni disponibili permettono una scelta ponderata sul tipo di
test di conferma (oltre alla tecnica FISH, obbligatoria) da applicare
per poter avere una diagnosi completa.
A causa della natura stessa della tecnica con cui sono stati progettati
(l’array-CGH), i vetrini GOLDchip Constitutional non permettono di
rilevare traslocazioni bilanciate.
Technogenetics non può essere ritenuta responsabile dei risultati
ottenuti.
PRECAUZIONI
Lasciar equilibrare a temperatura ambiente i DNA prima della
quantificazione:
 eseguire in ghiaccio tutte le fasi contrassegnate dall’icona
apposita sul protocollo.
 eseguire in semioscurità tutte le fasi contrassegnate
dall’icona apposita sul protocollo.
Per evitare contaminazione con particelle autofluorescenti indossare
preferibilmente guanti in nitrile senza polvere e tenere in mano i
vetrini solo dalla parte dell’etichetta. Non toccare direttamente in
alcun modo la superficie del vetrino.
Utilizzare solo provette sterili.
Non abbandonare tubi, coprioggetto, vetrini, etc. sul bancone per
evitare che vi si depositi della polvere.
Preparare le soluzioni di lavaggio in volume strettamente sufficiente
a processare i vetrini ibridati; eventuali eccessi non potranno essere
più utilizzati e dovranno pertanto essere eliminati.
Le soluzioni madri, prodotte in stock, dovranno essere datate e
conservate a temperatura ambiente.
Filtrare le soluzioni dove è richiesto utilizzando un filtro con i pori
da 0.2 µm.
La soluzione di ibridazione (Hybridization mix) contiene
formammide, che è nota avere effetto teratogeno; per ogni ulteriore
informazione consultare il corrispondente MSDS (disponibile su
richiesta presso il Quality Assurance).
Ozono: è riconosciuto che livelli di ozono ≥ 5ppb (0.005ppm)
possono compromettere l’efficienza dei fluorofori e di conseguenza
la qualità dell’analisi. Evitare di lavorare in luoghi troppo ventilati e
con scambio diretto dell’aria con quella esterna.
SOLUZIONI RICHIESTE MA NON FORNITE












EDTA 0.5M, pH=8.0
Etanolo Assoluto filtrato
Etanolo al 70% filtrato
Sodio Acetato 3M pH=5.2
Formammide deionizzata
NaCl 5M
Na2HPO4 0.5M pH=7.4
SDS 10%
20x SSC
Tween20
Isopropanolo
Acqua bidistillata filtrata
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI MA NON FORNITI
 BioPrime® Array CGH Genomic Labelling Sistem (Life
















Technologies, cod. 18095011)
Cyanine 3-dCTP (Perkin-Elmer, cod. NEL576001EA)
Cyanine 5-dCTP (Perkin-Elmer, cod NEL577001EA.)
DNA genomico maschio (Promega, cod. G1471)
DNA genomico femmina (Promega, cod. G1521)
Buste in plastica
Fogli di alluminio
Nanodrop (Celbio) o Spettrofotometro
Termociclatore
Termostato a secco per provette da 1.5ml
Bagnetto termostatato
Camere di incubazione (Corning, cod. 2551)
Stufa
Agitatore basculante
Centrifuga per provette da 50ml
Scanner
Couplin jar






Provette 1.5ml
Provette 0.2 ml per termociclatore
Provette da 50ml
Pipette P10, P100, P200, P1000 e relativi puntali sterili monouso
Pipettatore e pipette sierologiche monouso da 5, 10 e 25ml
Vetreria da laboratorio
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
In caso di estrazione di DNA da tessuti, si raccomanda di partire da
materiale fresco non congelato.
In caso di estrazione di DNA da liquido amniotico, si consiglia di
procedere con l’esperimento solo in presenza della quantità di
materiale richiesta. In alternativa, è possibile eseguire l’esperimento
a partire da DNA estratto da liquido amniotico in coltura.
L’estrazione di DNA da villo coriale non comporta alcuna
problematica specifica.
Si consiglia di estrarre il DNA entro le 24 ore dal prelievo dei
campioni con kit commerciali che assicurino un’adeguata resa e
qualità del DNA e i parametri di assorbanza A260/280 e A260/230
richiesti.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE E DI LAVORO
I vetrini GOLDchip Constitutional sono confezionati in buste
sigillate che li proteggono dalla luce e dall’umidità. Non estrarli
dalla confezione fino al momento dell’utilizzo; riporre nella busta i
vetrini residui e conservarli nella teca contenente sali essiccanti a
temperatura ambiente (15-25°C). I vetrini sono utilizzabili fino alla
data di scadenza. Una volta ibridati, possono essere conservati al
buio ed a temperatura ambiente.
I reagenti accessori devono essere conservati secondo le indicazioni
del fornitore.
I reagenti da conservare a temperatura ≤-15°C devono essere riposti
nella confezione originaria in congelatore. Scongelare solo al
momento dell’utilizzo ed evitare continui cicli di congelamento e
scongelamento che potrebbero danneggiare i prodotti.
I fluorocromi sono sensibili alla luce; evitare l’esposizione alla luce
diretta. Conservare a temperatura ≤-15°C e scongelare solo al
momento
dell’utilizzo.
Evitare
ripetuti
cicli
di
congelamento/scongelamento.
Il kit BioPrime® Array CGH Genomic Labeling System (Life
Technologies) si compone di due parti, quella per la marcatura e
quella per la purificazione. Conservare la prima a temperatura ≤15°C, la seconda a temperatura ambiente. Riporre nella confezione
originaria i reagenti e le colonnine residue. Prestare attenzione
all’enzima exo-Klenow, particolarmente termosensibile: non
necessita di scongelamento e deve essere estratto dal freezer solo
immediatamente prima di aggiungerlo alla mix, trasportandolo
sempre in ghiaccio.
Tutte le operazioni sperimentali, dalla preparazione del campione
alla scansione finale del vetrino, devono essere eseguite in un
ambiente con una temperatura non superiore a 23°C.
PERICOLI
I pericoli identificati nel kit diagnostico sono relativi ai seguenti
componenti:


Hybridization mix
Soluzione di Post-Hybridization
in quanto contengono
Componenti pericolosi secondo il Regolamento (CE) No 1272/2008
Formamide Inclusa nell'elenco delle
sostanze
candidate
estremamente
Componente
preoccupanti
(SVHC)
secondo
il
Regolamento (CE) n. 1907/2006 (REACH)
Classificazione
Concentrazione
Componenti
1999/45/CE
Repr. 1B; H360D
--
pericolosi
Componente
Classificazione
Concentrazione
secondo
il
Regolamento
(CE)
No
Formamide Inclusa nell'elenco delle
sostanze
candidate
estremamente
preoccupanti
(SVHC)
secondo
il
Regolamento (CE) n. 1907/2006 (REACH)
T, Repr.Cat.2, R61
--
ISTRUZIONI DI SICUREZZA
Il prodotto è destinato unicamente ad un uso professionale tramite
operatori adeguatamente formati alla manipolazione ed informati
sui pericoli connessi all’uso dello stesso.
Poiché il prodotto:
 può provocare malformazioni congenite del feto
 è presunto tossico per la riproduzione umana
la manipolazione dello stesso eseguita da lavoratrici in stato di
gravidanza o allattanti deve essere conseguente ad una valutazione
del rischio effettuata in accordo alle disposizioni legislative locali in
materia di protezione dei lavoratori e delle donne in gravidanza.



Non mangiare, bere, fumare durante la manipolazione del
prodotto.
Non conservare alimenti, bevande od altro nel luogo ove si
effettua la manipolazione del prodotto.
Evitare il contatto con la pelle, con gli occhi e con gli
indumenti. Il tipo di attrezzatura di protezione deve essere
selezionato a seguito di una valutazione del rischio tenendo in
debito conto la concentrazione e la quantità di sostanza
pericolosa al posto di lavoro. I mezzi di protezione devono
essere conformi ai requisiti delle adeguate norme tecniche



come NIOSH (USA), EN (EU) o specifiche legislazioni o regole
riconosciute.
Lavarsi le mani prima delle pause e subito dopo aver
maneggiato il prodotto.
Assorbire immediatamente con opportuni assorbenti inerti le
superfici di lavoro eventualmente contaminate da liquido.
Raccogliere il materiale non più utilizzabile e quello da
conferire come rifiuto in appositi contenitori ermetici;
codificare il rifiuto ed effettuare lo smaltimento secondo le
norme locali vigenti.
PROTOCOLLO SPERIMENTALE
FASE 1: PREPARAZIONE DEL MATERIALE
Prima di iniziare il protocollo, impostare alla temperatura indicata i
seguenti strumenti:



Termoblock a 37°C
Bagno termostatato a 72°C
Stufa da ibridazione a 46°C. Impostare la temperatura in
modo che un termometro a mercurio collocato in un
becker pieno d’acqua all’interno del forno misuri 46°C.
Disporre nella stufa una bottiglia con la soluzione PostHyb che sarà utilizzata per la Fase 6.
Materiale di partenza: 400ng di DNA per area per paziente.
Valutare la concentrazione del DNA con uno spettrofotometro,
misurando sempre contemporaneamente paziente e controllo, anche
se la concentrazione di quest’ultimo è già nota.
Il materiale di partenza deve essere DNA genomico non degradato e
non digerito, con una concentrazione non inferiore a 17ng/µl; deve
inoltre avere OD 260/280=1.8-2.0 e OD 260/230=2.0/2.5
Valori non conformi a quelli sopra indicati potrebbero
compromettere la buona riuscita dell’esperimento. Pertanto, qualora
la concentrazione e la qualità del materiale non fossero ottimali, è
necessario precipitare il DNA secondo il protocollo seguente:
a. A ciascun DNA aggiungere 1/10 vol di 3 M sodio acetato pH
5.2 e 2.5 vol di etanolo assoluto. Miscelare le provette per
inversione;
b. Precipitare a -20°C per 2ore o a -80°C per 30min;
c. Centrifugare a 14000 rpm per 30 minuti e scartare il
surnatante;
d. Aggiungere un volume di etanolo 70% pari a quello usato per
l’etanolo al 100% ;
e. Centrifugare a 14000 rpm per 5 minuti e scartare il surnatante
(eliminare eventuali residui con una P10 );
f. Lasciare asciugare il pellet all’aria a TA, assicurarsi che non
rimanga alcun residuo di etanolo nella provetta;
g. Aggiungere un volume di acqua distillata filtrata sterile
adeguato per ottenere una concentrazione del DNA uguale o
superiore a quella richiesta;
h. Risospendere il pellet a TA agitando delicatamente le
provette.
i. Quantificare nuovamente il materiale.
FASE 2: MARCATURA (BioPrime® Array CGH Genomic Labeling
System, Invitrogen)
Lavorare in semioscurità
Lavorare in ghiaccio
2.1 Per ogni DNA test preparare due provette da PCR siglate come
nella seguente figura:
DNA test Cy3
DNA controllo Cy5
lavorare in ghiaccio
Nell’immagine, marcatura di
quattro diversi campioni
2.2 Calcolare il volume di DNA in ul corrispondente a 400 ng. Il
volume finale dovrà essere di 23 µl; lí dove il volume finale di
DNA risulta inferiore a 23 ul dispensare acqua distillata
filtrata sterile (kit BioPrime, Life Technologies).
2.3 Dispensare in ogni pozzetto 20 µl di 2.5x random primers.
2.4 Risospendere manualmente, senza vortexare né spipettare, ed
assicurarsi che non siano presenti bolle sul fondo della provetta.
2.5 Disporre le provette in un termociclatore ed impostare il
seguente programma:
2.6 Avviare il termociclatore ed aspettare che siano trascorsi i 10
minuti a 95°C.
2.7 Appena trascorsi i 10 minuti a 95°C prima che la temperatura
cominci a scendere a 4°C, trasferire velocemente le provette in
ghiaccio (contatto diretto). Mettere in pausa il termociclatore.
2.8 Lasciare le provette immerse in ghiaccio per 5 minuti al termine
dei quali aggiungere in ciascun pozzetto i seguenti reagenti:
Campione siglato con
dNTPs mix (provetta B, tappo blu)
Exo-Klenow
Cyanine 3-dCTP
Cyanine 5-dCTP
totale
5 µl
1 µl
1 µl
--7 µl
5 µl
1 µl
--1 µl
7 µl
NOTA: nel caso di un numero elevato di campioni da analizzare, è
consigliabile preparare una mix dei reagenti considerando un
piccolo eccesso; miscelare delicatamente fino ad ottenere una
soluzione con colorazione omogenea e dispensarne 7 µl in ogni
provetta.
2.9 Agitare delicatamente le provette, senza vortexare né
spipettare, ed assicurarsi che la soluzione sia omogenea (il
colore rosa/azzurro fungerà da indicatore). Spinnare
velocemente per raccogliere tutto il liquido sul fondo della
provetta, verificando l’assenza di bolle.
2.10 Riavviare il termociclatore e posizionare le provette quando la
temperatura dello strumento raggiunge 37°C.
2.1 Al termine del programma, trasferire i campioni in ghiaccio e
bloccare la reazione dispensando in ciascun pozzetto 5 µl di
stop buffer (kit BioPrime, Life Technologies).
NOTA: l’avvenuta marcatura può essere verificata caricando 5 µl di
ciascun campione su gel 0.8% agarosio 1X TBE .Verificare il pattern
elettroforetico come mostrato in figura dove la banda che migra piú
lentamente rappresenta il DNA genomico di partenza mentre uno
smear di frammenti compreso tra 100bp e 600bp di lunghezza
corrisponde al DNA correttamente marcato. Al termine corsa sono
presenti le cianine non incorporate.
FASE 3: PURIFICAZIONE (BioPrime® Array CGH Genomic
Labeling System, PureLink purification columns, Invitrogen)
NOTA: prima di iniziare, assicurarsi che sia stato addizionato
isopropanolo alla soluzione Binding Buffer B2 ed etanolo assoluto
alla soluzione Wash Buffer W1 come descritto a pagina 6 del manuale
di utilizzo Invitrogen.
3.1 A ciascun campione conservato in ghiaccio, aggiungere 200 µl
di Binding Buffer B2.
3.2 Prelevare e trasferire nella stessa colonna di purificazione
ciascun DNA test ed il rispettivo controllo, secondo il seguente
schema:
Paziente Cy3
Controllo Cy5
Paziente Cy3
Controllo Cy5
3.3 Centrifugare per 1 minuto a 10000 rpm. Svuotare il tubo di
raccolta.
3.4 Aggiungere 650 µl di Wash Buffer W1 alla colonna.
Centrifugare per 1 minuto a 10000 rpm. Svuotare il tubo di
raccolta.
3.5 Centrifugare nuovamente alla massima velocità per 2 minuti
per asciugare la colonna da eventuali residui di Wash Buffer.
Scartare il tubo e trasferire la colonna su una provetta da 1.5ml
pulita (non usare le provette ambrate fornite dal kit perché non
sarà più visibile il pellet agli step successivi).
3.6 Depositare 55 µl dell’Elution Buffer E1 al centro della colonna
senza toccare il filtro, chiudere la colonna ed incubare a
temperatura ambiente per 5 minuti. Centrifugare per 2 minuti
alla massima velocità (14000 rpm).
3.7 Chiudere la provetta e buttare la colonna.
3.8 Verificare la qualità dei campioni marcati misurando con lo
spettrofotomentro i valori di concentrazione, di incorporazione
e del rapporto A260/A280.
Valori di riferimento indicativi:
 Concentrazione: 120-200ng/µl
 Incorporazione Cy3: 1.7-3 pmol/µl


Incorporazione Cy5: 1.2-2 pmol/µl
Assorbanza 260/280 = 1.8/2
FASE 4: PRECIPITAZIONE
4.1 Aggiungere a ciascuna provetta i seguenti componenti:
Blocking buffer (provetta C, tappo giallo)
Sodio Acetato 3M pH 5.2
Etanolo assoluto
volume
50 µl
10 µl
250 µl
4.2 Miscelare delicatamente le provette per inversione.
4.3 Incubare 30 minuti a -80°C oppure a -20°C per 2 ore.
E’ possibile interrompere il protocollo precipitando i campioni a
-80°C/-20°C overnight.
4.4 Centrifugare per 30 minuti alla massima velocità a 4°C.
Eliminare il sovranatante.
4.5 Lavare il pellet con 250 µl di etanolo 70%. Centrifugare per 5
minuti alla massima velocità a 4°C. Eliminare il sovranatante.
4.6 Lasciare asciugare il pellet all’aria. Il pellet dovrà avere questo
aspetto:
Il pellet deve risultare
violetto
E’ possibile interrompere il protocollo e conservare il pellet
secco a -20°C.
FASE 5: IBRIDAZIONE
5.1 Risospendere il pellet manualmente, dispensando per ciascuna
provetta il volume indicato in tabella di Hybridization mix
(provetta D, tappo rosso) .
Vetrino a 2 aree
Vetrino a 4 aree
Volume
Hybridization mix
9 µl
9 µl
Volume da dispensare
sul coprioggetto
8.5 µl
8.5 µl
NOTA: per pellet difficili da risospendere lasciare incubare il
preparato nel bagnetto a 72ºC per 5 minuti e procedere
picchiettando il fondo della provetta fino a completa dissoluzione
del pellet.
5.2 Denaturare i campioni incubando in un bagnetto
termostatato/termoblocco a 72ºC per 10 minuti. Agitare
nuovamente il preparato e controllare visivamente che sia
completamente risospeso in una soluzione uniformemente
colorata. Centrifugare brevemente per raccogliere la soluzione
sul fondo della provetta;
5.3 Incubare i campioni a 37ºC per 10 minuti in un termostato a
secco/termoblocco e centrifugare nuovamente per raccogliere
la soluzione sul fondo della provetta;
5.4 Trasferire nuovamente le provette nel termostato a secco ed
effettuare l’ibridazione accanto al termostato in modo da tenere
in temperatura le provette;
5.5 Posizionare correttamente il vetrino sul corrispondente modello
di layout. Prelevare e trasferire sul coprioggetto il volume
opportuno di DNA indicato in tabella, capovolgere il
coprioggetto e posizionarlo sulla corretta area array utilizzando
il modello corrispondente come guida. Evitare la formazione di
bolle.
AREA 1
Ibridare (A):
Paziente1-Cy3/Controllo-Cy5
AREA 2
Ibridare (B):
AREA 3
Ibridare (C):
AREA 4
Ibridare (D):
BARCODE
AREA 1
AREA 2
Ibridare (A):
Ibridare (B):
BARCODE
Nell’immagine un esempio dei 2 layout relativi al formato a 4 ed a 2 aree
del GOLDchip
5.7 Preparare la camera di ibridazione aggiungendo 20 µl di acqua
in entrambi i forellini laterali. Alloggiare il vetrino nella
cameretta,, chiuderla con le barre metalliche in dotazione e
avvolgerla in un foglio di alluminio. Posizionare il pacchetto in
una busta di plastica riempita in precedenza con della carta
bibula imbevuta d’acqua. Chiudere ermeticamente la busta.
5.8 Sistemare la busta cosí confezionata su un vassoio e
accomodarlo nella stufetta di ibridazione preimpostata all’inizio
dell’esperimento alla temperatura di 46°C. Sincerarsi che i
pacchetti siano in posizione completamente orizzontale.
FASE 6: LAVAGGI
Preparare le soluzioni seguendo lo schema riportato in seguito.
Il pH deve essere conforme a quanto indicato, aggiustare
utilizzando un pH-metro assicurandosi della stabilità del pH.
NOTA: soluzioni preparate con acqua erogata al momento dai vari
apparecchi di produzione anche se correttamente preparate possono
presentare variazioni del pH. Pertanto è consigliabile portare a pH le
soluzioni il giorno dopo la loro preparazione.
Non devono essere presenti precipitati salini nelle soluzioni.
Preriscaldare le soluzioni a temperatura in un bagnetto; la
temperatura deve essere controllata singolarmente con un
termometro pulito e tarato prima di procedere. Qualora non sia
possibile utilizzare due bagnetti contemporaneamente, impostare la
temperatura di un bagnetto a 72°C ed immergere sia la Post-Hyb
Solution che la Stringent Wash solution; attendere che la Post-Hyb
raggiunga la temperatura richiesta di 46°C, toglierla dall’acqua e
trasferirla nell’incubatore insieme ai vetrini. Alternativamente è
possibile incubare il giorno prima la Post-Hyb Solution come
suggerito nella Fase 1. Lasciare immersa la Stringent Wash finché
non avrà raggiunto la temperatura indicata.
Soluzione Post-Hybridization , 46°C:
20% Formammide, NaCl 470mM, Na2HPO4 50mM, EDTA
0.2mM, 2% SDS
Soluzione 1, Transition, Temperatura Ambiente:
2xSSC, 0.1% SDS
Soluzione 2, Stringent wash pH 7-7.4, 72°C:
0.5xSSC, 0.3% Tween20
Soluzione 3 pH 7-7.4, Temperatura Ambiente:
0.1xSSC, 0.1% SDS
0.1xSSC
0.01xSSC
Soluzione Post-Hybridization pH 7-7.4 [250ml tot, 46°C]
stock
uso
x250ml
Formammide
100%
20%
50ml
NaCl
5000mM
470mM
23.5ml
Na2HPO4
500mM
50mM
25ml
EDTA
500mM
0.2mM
0.1ml
SDS
10%
2%
50ml
H2O
101.4ml
Soluzione 1_Transition pH 7-7.4 [100ml tot, TA]
stock
uso
x100ml
SSC
20X
2X
10ml
SDS
10%
0.1%
1ml
H2O
89ml
Soluzione 2_Stringent wash pH 7-7.4 [100ml tot, 72°C]
stock
uso
x100ml
SSC
20X
0.5X
2.5ml
Tween 20
100%
0.3%
0.3ml
H2O
97.2ml
Soluzione 3 pH 7-7.4 [100ml tot, TA]
stock
uso
x100ml
SSC
20X
0.1X
0.5ml
SDS
10%
0.1%
1ml
H2O
98.5ml
stock
uso
x100ml
SSC
20X
0.1X
0.5ml
H2O
99.5ml
stock
uso
x100ml
SSC
20X
0.01X
0.05ml
H2O
99.95ml
Isopropanolo [100ml tot, TA]
stock
Isopropanolo
100%
uso
100%
x100ml
100ml
Prima di procedere occorre preparare:
1
couplin jar
1
becher 150 ml
1
1
1
1
1
1
couplin jar
couplin jar
couplin jar
couplin jar
couplin jar
couplin jar
Soluzione Post-Hybridization
Soluzione PostHybridization, rimozione
coprioggetto
Soluzione 1_Transition
Soluzione 2_Stringent wash
Soluzione 3
Soluzione 4
Soluzione 5
Isopropanolo
Utilizzando una pinzetta trasferire i vetrini da una soluzione
all’altra seguendo sempre lo stesso ordine.
6.1 Immergere i vetrini ad uno ad uno nella couplin jar contenete la
Soluzione Post-Hybridization. Attendere 3/5 minuti dopo
l’immersione dell’ultimo vetrino;
6.2 Prelevare un vetrino alla volta, controllare visivamente che i
vetrini coprioggetto scivolino facilmente dalla superficie del
vetro ed agitarlo delicatamente in un becher da 150 ml
contenete la restante Soluzione Post-Hybridization finché i
vetrini coprioggetto non saranno completamente rimossi. Non
asportare manualmente il coprioggetto. Trasferire il vetrino in
un altra couplin jar contenete la soluzione Transition (soluzione
1).
6.3 Prelevare la soluzione Stringent Wash (soluzione 2) dal
bagnetto a 72°C e versarla rapidamente in una couplin jar.
Immergere i vetrini ed incubare a temperatura ambiente per 2
minuti e 30 secondi in agitazione.
6.4 Trasferire ciascun vetrino in una couplin jar con la Soluzione 3
ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente in agitazione.
6.5 Trasferire ciascun vetrino in una couplin jar con la Soluzione 4
ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente in agitazione.
6.6 Trasferire ciascun vetrino in una couplin jar contenente la
Soluzione 5 ed agitarla manualmente per 10 volte. Spostare i
vetrini nella couplin jar contenete isopropanolo, agitare circa 5
volte ed inserire immediatamente il vetrino capovolto con il
barcode rivolto verso il basso in un tubo falcon da 50 ml
(effettuare questa operazione indossando dei guanti puliti).
Chiudere ciascun tubo falcon e ripetere l’operazione con
ciascun vetrino.
inserire il vetrino in una
falcon in modo che
l’etichetta sia rivolta verso
il fondo della provetta
6.7 Centrifugare le falcon contenenti i vetrini per 10 minuti a 1500
rpm a temperatura ambiente.
6.8 Conservare i vetrini chiusi nelle falcon, in posizione verticale e
lontano dalla luce, fino al momento della scansione.
FASE 7: SCANSIONE
Impostare i valori del PMT dei due laser (Cy3 eCy5) a 65 high
resolution ed effettuare la preview a 40 µm come mostrato in figura
1.
Per individuare i parametri corretti occorre calibrare i valori dei due
canali affinchè le curve dell’ istogramma siano sovrapposte.
Selezionare ogni volta una piccola area di ciascun array e procedere
immediatamente con la scansione a 5 µm. Evitare di ripetere
l’operazione un numero eccessivo di volte e selezionare un’area
diversa quando si vogliono investigare parametri diversi.
Verificati i parametri desiderati procedere con la scansione
dell’intera area. I risultati delle scansioni devono essere
corrispondenti ai casi mostrati in figura 2 e figura 3. Il primo caso
mostra la condizione ottimale, quindi istogramma con curve
sovrapposte; nel caso si presenti la condizione mostrata in figura 3,
con curve biforcate nella parte terminale dell’istogramma, prestare
attenzione alla sovrapposizione delle due curve nella parte iniziale
del grafico in corrispondenza del secondo picco (il primo è relativo
al background).
Per informazioni piú dettagliate consultare il manuale dello scanner.
Figura 1: Esempio di impostazione dei parametri di scansione
Figura 2: Esempio di istogramma con curve sovrapposte
Figura 3: Esempio di istogramma analizabile con curve biforcate nella parte
terminale.
FASE 8: ANALISI
Le immagini ottenute dalla scansione sono in formato tiff e vengono
analizzate con il Bio-Soft, un software proprietario sviluppato in
house per l’utilizzo del prodotto GOLDchip.
Per l’utilizzo del software fare riferimento al manuale.
Il design del prodotto GOLDchip Constitutional è basato sul
genome assembly GRCh37 (hg19).
Per condurre un’analisi sono necessari i seguenti file:
• .gal: specifico per ogni lotto;
• .qc: specifico per ogni lotto e per ogni tipologia di matrice di
campione impiegata.
I parametri di controllo qualità per ritenere un’analisi correttamente
interpretabile con il software Bio-Soft sono:
•
•
% di inclusione ≥ 95%;
standard deviation (SD) ≤0.062.
E’ responsabilità dell’utilizzatore la verifica della conformità dei
criteri di accettazione qualitativi dell’analisi; l’interpretazione del
risultato nel caso di analisi i cui parametri di controllo qualità non
rispettino i valori sopra indicati puo’ non essere affidabile.
Technogenetics è in grado di fornirvi, su richiesta, informazioni
ed assistenza per l’utilizzo dei seguenti strumenti e programmi:
Scanner: Innoscan 710 e successivi, Innopsys
Programma di scansione: Mapix, Innopsys
Programma di analisi: BIO-SOFT, GeosLab
Per qualunque altro supporto contattare Technogenetics.
DATI DI VALIDAZIONE
La qualità del prodotto GOLDchip Constitutional è stata valutata
attraverso una validazione analitica, durante la quale sono stati
misurati diversi parametri critici utilizzando campioni di DNA
provenienti sia dalla routine quotidiana sia campioni di DNA
commerciali.
I test di validazione sono stati eseguiti sia internamente sia presso
centri di diagnosi specializzati in Genetica Umana da personale
tecnico aziendale e lí dove richiesto, da personale medico, entrambi
specializzati e opportunamente addestrati per l’utilizzo del
prodotto. Ogni esperimento ed analisi è stati condotti in cieco.
Per la validazione analitica sono stati collezionati 113 campioni (66
positivi e 47 negativi) divisi tra diverse matrici: sangue, amniciti in
coltura, villi coriali, liquido amniotico, linee cellulari linfoblastoidi,
materiale abortivo e midollo osseo. Tutte le patologie rilevabili dal
prodotto sono state testate con almeno un campione positivo.
I risultati della validazione sono raccolti nella seguente tabella:
Requisito
Sensibilità
%inclusione
Standard deviation
Specificità diagnostica
(probabilità di rilevare un risultato non
patologico in un campione non
patologico)
Sensibilità diagnostica
(probabilità di rilevare un risultato
patologico in un campione patologico)
Specificità analitica
(effetto della matrice)
Stabilità (data di scadenza)
Accuratezza
Risultato
Range verificato 50/600ng
Quantità suggerita 400ng
≥ 95%
≤0.062
100%
98.5%
100%
12 mesi
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Per descrizioni approfondite delle patologie:
OMIM/NCBI: www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
DECIPHER: www.decipher.sanger.ac.uk
ORPHANET: www. orpha.net
UCSC: genome.ucsc.edu
ENSEMBL: www.ensembl.org
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