Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

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Ricerche Microbiologiche Standard del
Regno Unito
Ricerca nei Campioni di specie Mycobacterium
Emesso da Standards Unit, Microbiology Services, PHE
Batteriologia I B 40 I Emissione no: 6.1 I Data emissione: 22.05.14 I Pagina 1 di 44
© Crown copyright 2014
Ringraziamenti
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche (SMI - Standards for
Microbiology Investigations) sono sviluppate sotto l'egida della Public Health England (PHE) in
collaborazione con il Servizio Sanitario Nazionale (NHS - National Health Service), la Sanità
Pubblica del Galles e con le organizzazioni professionali i cui loghi sono di seguito elencati sul
sito web http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnerships. Le SMI sono sviluppate, revisionate e
controllate da diversi gruppi di lavoro che sono supervisionati da un comitato direttivo (consultare
http://www.hpa.org.uk/SMI/WorkingGroups).
Si ringraziano per contributi forniti i numerosi operatori dei laboratori clinici, gli specialisti e i
laboratori di riferimento che hanno fornito informazioni e commenti durante lo sviluppo di questo
documento. Si ringraziano i Revisori Medici per le modifiche apportate ai contenuti clinici.
Si ringrazia inoltre il Dr. Tim Collins per il suo considerevole contributo specialistico.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Microbiology Services
Public Health England
61 Colindale Avenue
London NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
Website: http://www.hpa.org.uk/SMI
Le Procedure Standard del Regno Unito per le Ricerche Microbiologiche sono sviluppate con la
collaborazione di:
Batteriologia | B 40 | Emissione no: 6.1 | Data emissione: 22.05.14 | Pagina : 2 di 44
Contenuti
RINGRAZIAMENTI .....................................................................................................................2
TABELLA MODIFICHE ..............................................................................................................4
SMI DEL RU: SCOPO E OBIETTIVO ........................................................................................6
SCOPO DEL DOCUMENTO ......................................................................................................8
SCOPO .......................................................................................................................................8
INTRODUZIONE .........................................................................................................................8
INFORMAZIONE TECNICA/LIMITAZIONI ...............................................................................16
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA .......................................................................18
2
PRELIEVO DEL CAMPIONE ..........................................................................................19
3
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ..................................................21
4
PROCESSO/PROCEDURA SUL CAMPIONE ................................................................22
5
PROCEDURA DI REFERTAZIONE ..............................................................................34
9
NOTIFICA ALLA PHE O EQUIVALENTE .......................................................................35
APPENDICE: RICERCA SU CAMPIONI DI SPECIE MYCOBACTERIUM .............................37
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................................38
NICE ha accreditato la procedura usata dalla Public Health England per elaborare gli Standards for
Microbiology Investigations. L’accreditamento è valido per 5 anni dal Luglio 2011. Informazioni più
dettagliate sull’accreditamento possono essere consultate: www.nice.org.uk/accreditation.
Per ulteriori informazioni sul nostro accreditamento consultare: : www.nice.org.uk/accreditation
Tabella delle Modifiche
Ciascun metodo SMI possiede una registrazione separata delle correzioni. Quelle attuali sono
specificate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la E-mail:
[email protected]
I documenti nuovi o revisionati devono essere controllati in ciascun laboratorio in accordo con il
sistema locale di gestione della qualità.
Modifica No/Data.
5/22.05.14
Emissione eliminata. no
6
Emissione inserita no.
6.1
Sezione(i) interessate/Pagina no. Modifica.
Il documento è stato inserito in un nuovo formato che
evidenzia il passaggio della Health Protection Agency alla
Public Health England.
Prima pagina ridisegnata.
Documento intero .
Rinominata la pagina di “Stato come Scopo Obiettivo” e
aggiornata in modo appropriato.
I loghi delle organizzazioni professionali sono stati
revisionati ed aggiornati.
La bibliografia degli standard di sicurezza e notifica è
stata revisionata ed aggiornata.
Il contenuto scientifico rimane invariato.
Modifica No/Data.
4/10.08.12
Emissione eliminata. no
5
Emissione inserita/ Pagina no.
6
Sezione(i) interessate.
Modifica.
Documento presentato in nuovo formato.
Documento intero.
Il termine '' contenitore a tenuta ermetica con
marchiatura CE “ sostituisce quello di “ contenitore
impermeabile sterile '' (ove appropriato) e si riferisce al
testo specifico nell’ambito della Direttiva UE per
Dispositivi Medico-Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato
1 B 2.1) e alla direttiva stessa EC1,2.
Il documento è stato in generale ampliato con particolare
riferimento alle sezioni riguardanti:
Batteriemia
Tubercolosi multiresistente ai farmaci
Nuove tecnologie per diagnosi e tipizzazione di M.
tuberculosis.
Campioni fecali.
4.6.3 prove di amplificazione acido necleico
Inserito diagramma di flusso diagnostico
Bibliografia
Bibliografia in parte aggiornata
#
SMI del RU : Scopo e Obiettivo
Utilizzatori delle SMI
Nel Regno Unito le SMI sono principalmente destinate come risorsa generale ai professionisti
che operano nel campo della medicina di laboratorio e delle malattie infettive. Le SMI forniscono
ai clinici informazioni in merito allo standard dei servizi di laboratorio riferibili alle ricerche per la
diagnosi delle infezioni nei loro pazienti e le documentazioni forniscono indicazioni che facilitano
la prenotazione elettronica di test appropriati. I documenti forniscono gli standard per le ricerche
microbiologiche anche ai responsabili della sanità pubblica che devono considerarle come parte
delle procedure da adottare per la salute sia clinica che pubblica per la propria popolazione
Informazioni di Base per le SMI
Le SMI comprendono algoritmi e procedure raccomandate che riguardano tutte le componenti
del processo diagnostico dalla fase pre-analitica (sindrome clinica) alle diverse fasi analitiche
(prove di laboratorio) e post-analitiche (interpretazione e comunicazione dei risultati).Gli
algoritmi delle sindromi sono corredati da informazioni più dettagliate contenenti consigli sulle
indagini per specifiche malattie e infezioni. Note orientative riguardano il contesto clinico, la
diagnosi differenziale e indagini appropriate per particolari condizioni cliniche. Le note
orientative descrivono metodologie di laboratorio essenziali che sono alla base della qualità, ad
esempio la validazione della prova, la garanzia della qualità, la definizione dell'incertezza della
determinazione.
La Standardizzazione del processo diagnostico conseguente all'adozione delle SMI consente di
garantire in tutto il Regno Unito strategie d’indagine equivalenti nei diversi laboratori ed è una
condizione essenziale per interventi nel campo della sanità pubblica, della sorveglianza, e per le
attività di ricerca e di sviluppo. Nel Regno Unito le SMI rappresentano strategie omogenee per
le prove diagnostiche e la programmazione degli interventi di sanità pubblica
Collaborazione Paritaria
La preparazione e stesura delle SMI è effettuata mediante collaborazione paritaria fra PHE,
NHS, Royal College of Pathologists e le organizzazioni professionali.L'elenco delle
organizzazioni partecipanti può essere trovato su sito
http://www.hpa.org.uk/SMI/Partnershipshttp. L'inclusione del logo di una organizzazione in una
SMI implica il sostegno degli obiettivi e del processo di preparazione del documento. I
rappresentanti delle organizzazioni professionali fanno parte del comitato direttivo e dei Gruppi
di Lavoro che sviluppano le SMI. Le opinioni dei rappresentanti possono non essere
rigorosamente conformi a quelle dei membri delle organizzazioni a cui appartengono né a
quelle delle loro organizzazioni. I rappresentanti prescelti rappresentano uno strumento
bidirezionale per la consultazione e dialogo. Le opinioni espresse sono ricercate con un
processo di consultazione.
Assicurazione di Qualità
Il NICE (National Institute for Health and Care Excellence) ha accreditato la procedura utilizzata
dai Gruppi di Lavoro per produrre le SMI L’accreditamento è applicabile a tutte le linee guida
prodotte dall’Ottobre del 2009. La procedura per lo sviluppo delle SMI è certificata dalla ISO
9001:2008.Le SMI rappresentano una procedura standard di buona qualità pratica alla quale si
devono attenere per la propria attività tutti i laboratori di microbiologia clinica e di sanità pubblica
del Regno Unito. Le SMI sono accreditate dal NICE e non rappresentano gli standard minimi di
#
Microbiologia è usato come termine generico per includere le due specialità di Microbiologia Medica riconosciute dal GMC
(General Medical Council), (che comprende Batteriologia, Micologia e Parassitologia) e la Virologia Medica.
attività, e neppure il più alto livello di complesse indagini di laboratorio disponibili nel Regno
Unito. Utilizzando le SMI, i laboratori dovranno tenere conto delle esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali qualora opportune. Le SMI aiutano i laboratori a soddisfare i
requisiti ell’accreditamento con la promozione di procedure d’elevata qualità che possono
essere verificate. Le SMI forniscono inoltre un punto di riferimento per lo sviluppo del metodo.
Queste stesse devono essere utilizzate in associazioni con altre SMI.Le prestazioni della SMI
dipendono dal personale ben addestrato e dalla qualità dei reagenti e delle attrezzature
utilizzate. I laboratori dovrebbero assicurare che tutti i reagenti di tipo commerciale e quelli
messi a punto in laboratorio siano stati validati e risultati idonei allo scopo. I laboratori devono
partecipare a programmi di valutazione di qualità esterni ed eseguire le relative procedure del
controllo di qualità interno.
Coinvolgimento del Paziente e della Comunità
Nello sviluppo delle SMI i rispettivi Gruppi di Lavoro sono impegnati per favorire il
coinvolgimento dei pazienti e dell’opinione pubblica. Grazie al coinvolgendo pubblico, di
operatori sanitari, ricercatori e organizzazioni di volontariato la SMI risultante sarà
strutturalmente valida e atta a soddisfare le esigenze dell'utente. L’opportunità di
partecipazione per contribuire alla consultazione è estesa al pubblico con l’accesso libero al
nostro sito web.
Informazione della Gestione e dei Dati Sensibili
La PHE è un’organizzazione che condivide le direttive Caldicott. Ciò significa prendere ogni
possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui pazienti e
di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza.
Lo sviluppo di metodi SMI è assoggetto agli obiettivi PHE di Uguaglianza
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1317133470313. I Gruppi di Lavoro SMI
sono impegnati a raggiungere gli obiettivi di parità di consultazione efficace con gli
appartenenti al pubblico, i partner, le parti interessate ed i gruppi specialistici coinvolti.
Dichiarazione Legale
Mentre ogni cura è stata intrapresa per la preparazione delle SMI, PHE e ogni altra
organizzazione di sostegno, deve, per quanto possibile in base a qualunque legge vigente,
escludere la responsabilità per tutte le perdite, costi, reclami, danni o spese derivanti da o
connessi all'uso di una SMI o con qualsiasi informazione ivi contenuta. Se si apportano
modifiche a una SMI, si deve porre in evidenza dove e da chi sono state effettuate tali
modifiche.
Le conoscenze di base e la tassonomia microbica per la SMI sono le più complete possibili, al
momento della pubblicazione. Eventuali omissioni e nuove informazioni saranno considerate
nel corso della prossima revisione. Queste procedure standard (SMI) possono essere
sostituite solo da revisioni dello standard, azione legislativa, o in seguito ad indicazioni da
parte dell’ente accreditato NICE.
I diritti d’autore delle SMI sono della “Crown” e questi dovrebbero essere riconosciuti quando
appropriato.
Citazione Suggerita per questo Documento
Public Health England. (2014). Investigation of Specimens for Mycobacterium species. UK
Standards for Microbiology Investigations. B 40 Emissione 6.1. http://www.hpa.org.uk/SMI/pdf
Scopo del Documento
Tipi di campione
Espettorato, lavaggio gastrico, liquidi da sedi corporee sterili, (LCR, Liquido pleurico ecc.) urine,
cute o biopsie tissutali, midollo osseo, lavaggio bronco alveolare, sangue, campioni post mortem,
osso.
Scopo
Questa SMI è stata sviluppata per la ricerca e l’isolamento dei micobatteri da diversi campioni
clinici. Per garantire una maggior possibilità d’isolamento dei micobatteri si raccomanda l’uso di
metodi automatizzati e di terreni solidi. L’applicazione delle tecnologie fenotipiche e di quelle
molecolari consente l’approccio più efficace per la diagnosi di laboratorio delle malattie tubercolari
e non tubercolari.
In questa SMI non sono descritti trattamento, prevenzione e controllo della TB ma questi argomenti
sono riportati nel ‘Clinical diagnosis and management of tuberculosis, mentre le misure di
prevenzione e controllo sono state sviluppate dal National Collaborating Centre for Chronic
Conditions’ con la collaborazione del National Istitute for Health and Clinical Excellence (NICE)3..
Questa SMI integra le raccomandazioni formulate nella guida per la prevenzione e il trattamento
della tubercolosi, rilasciate dal Department of Health4
Questa SMI deve essere usata in congiunzione con le altre SMI.
Introduzione
La tubercolosi umana (TB) è causata prevalentemente dai membri del Mycobacterium tuberculosis
complex (MTBC), nell’uomo è predominante il Mycobacterium tuberculosis, e meno
frequentemente gli altri componenti il complesso, quali Mycobacterium bovis, Mycobacterium
africanum, Mycobacterium canettii o Mycobacterium caprae. I Ceppi di vaccino vivo
Mycobacterium bovis BCG, che sono utilizzati anche per via intra-vescicale nel trattamento del
cancro della vescica, possono talvolta causare malattia nei pazienti immunocompromessi. Le altre
due specie attualmente appartenenti al complesso, Mycobacterium microti e Mycobacterium
pinnipedii sono quasi esclusivamente associate a diversi ospiti mammiferi ma alcuni casi sono stati
riportati in pazienti immunocompromessi5-7. Micobatteri non tubercolari (NTM) sono sempre più
rilevati come causa di malattie negli esseri umani. Non tutte le persone con infezione da bacilli
tubercolari sviluppano la malattia, e non tutti quelli che sono infettati diventano contagiosi per le
altre persone. La malattia conclamata si può sviluppare mesi o anni dopo l'esposizione iniziale. I
pazienti con evidenza di potenziale acquisizione di MTBC, ad esempio con un test positivo alla
tubercolina e / o alla prova dell’interferone gamma sul sangue, ma senza sintomi di malattia attiva
e di campione positivo per MTBC, possono avere un'infezione TB latente (LTBI, latent TB
infection)3. La malattia causata dalla tubercolosi può manifestarsi in qualsiasi organo, ma è più
frequente nei polmoni, dove l'infezione è caratterizzata dalla formazione di granulomi.
Si definisce tubercolosi primaria l’insorgenza di un’infezione causata da microrganismi MTBC.
Nell’infezione primaria la lesione si manifesta nella sede d’ingresso del microrganismo, solitamente
il polmone, sebbene possano essere coinvolte le tonsille, l’intestino e la cute. In questo primo
stadio possono essere infettati anche i linfonodi (complesso primario). La positività del test cutaneo
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alla tubercolina, che compare dopo 3 – 8 settimane dall’infezione, indica la comparsa dell’immunità
cellulare e dell’ipersensibilità cutanea. I foci che si sviluppano nell’endotelio dei vasi
sanguigni.possono rompersi determinando una tubercolosi miliare disseminata. La tubercolosi post
primaria si sviluppa come conseguenza della riattivazione dei microrganismi in una lesione
primaria “guarita” o per una nuova infezione esogena. La tubercolosi post primaria si manifesta di
solito dopo cinque o più anni dall’inizio dell’infezione primaria e può interessare bambini e adulti.
Un fattore predisponente può essere la deficienza di vitamina D, frequentemente osservata negli
immigrati8,9.
La parete cellulare dei micobatteri contiene acidi micolici, che sono acidi grassi a lunga catena.
Questi acidi impediscono il rapido accesso ai coloranti di uso comune e sono richieste particolari
procedure (ad esempio il calore o detergenti) che consentano al colorante di penetrare nelle cellule
micobatteriche. Tuttavia, una volta che le cellule hanno acquisito il colorante, questo non è
rimosso poi dai solventi usuali, quali solventi acido-alcol -- e pertanto i micobatteri sono denominati
bacilli alcool-acido resistenti AAFB, acid-alcohol fast bacilli), o più comunemente ora (AFB) 3,4,10,11.
Questa caratteristica colorazione è molto importante per la diagnosi microbiologica e istologica di
malattie causate dai micobatteri
3,4,10,11
.
In considerazione dell’importanza della TB nelle malattie umane a livello globale, le norme
internazionali in materia di diagnosi e la gestione della tubercolosi sono state prodotte da un
organismo di collaborazione comprendente l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS),
adattate e applicate dall'Unione Europea, nonché da altre linee guida nazionali di standard per la
diagnosi e il trattamento10-13.
Mycobacterium tuberculosis
Tubercolosi polmonare
L’infezione si realizza inizialmente con l’inalazione di goccioline . Una volta in situ, i microrganismi
possono essere catturati dalle cellule fagocitarie dell’ospite entro le quali possono rimanere vitali
ed anche continuare a moltiplicarsi. Da questo focus primario (focus di Ghon), i microrganismi
diffondono per via linfatica nei linfonodi e possono raggiungere il torrente circolatorio, infettando il
polmone e gli altri organi. Nella maggior parte dei soggetti i foci granulomatosi possono guarire. In
ogni modo essi possono continuare a contenere microrganismi vitali. Fattori quali
immunosoppressione, alcolismo, malnutrizione e invecchiamento possono contribuire a una
riduzione della capacità di contenimento dell’infezione.
La diagnosi di TB polmonare si avvale di solito del contemporaneo riscontro di lesioni radiografiche
del torace, reattività alla prova cutanea della tubercolina, con o senza bacilli acido resistenti (AFB)
della ricerca microscopica sull’espettorato (striscio positivo) che possono giustificare l’inizio della
terapia in attesa dei risultati colturali3,10. Si deve fare ogni sforzo per ottenere campioni idonei per
la coltura perché la prova di sensibilità in vitro dell’isolato diviene sempre più importante a seguito
delle emergenti resistenze multiple ai farmaci, e la genotipizzazione per essere utilizzata per
dimostrare correlazioni epidemiologiche3,11,14. Solitamente per la ricerca microscopica e colturale
di AFB si raccolgono tre campioni separati di espettorato, sebbene, sulla base di studi comparativi
degli incrementi diagnostici, (WHO),per la ricerca diretta sullo striscio, abbia ora ridotto la
raccomandazione da tra a due campioni seriali 3,4,6,10,13,15.
Tubercolosi extra-polmonare
Linfoadenite
La linfadenite è la più frequente forma d’infezione extra-polmonare da micobatteri che, quando
causata da bacilli tubercolari, era nota come scrofola. I linfonodi cervicali sono quelli più
frequentemente infettati sebbene ne possano esserne interessati altri16,17,18. Gli ascessi possono
sviluppare formazioni cavitarie. La linfadenite cervicofacciale nei bambini in tenera età può spesso
essere sostenuta da micobatteri non tubercolari, di solito da Mycobacterium avium19,20.
Tubercolosi miliare
Tubercolosi miliare è la definizione che è stata introdotta per descrivere l’aspetto a semi di miglio
(nella radiografia del torace) delle lesioni infette, ma attualmente è utilizzata genericamente per
descrivere tutte le manifestazioni ematogene progressive di tubercolosi disseminata21. Il numero
dei casi è in aumento per l’incremento di pazienti da immunocopromissione correlata a HIV.
Neurotubercolosi – Tubercolosi meningea
La meningite tubercolare (TBM, tuberculous meningitis) è di solito causata dalla rottura di un
tubercolo nello spazio sub-aracnoidale e non da una diffusione ematogena alle meningi. Le
manifestazioni cliniche iniziano in genere con malessere, cefalea intermittente e febbricola, seguite
entro due settimane da cefalea persistente, vomito, confusione, meningismo e sintomi neurologici
di tipo focale21. La mortalità è superiore nei soggetti con < di 5 e > di 50 anni o in quelli in cui la
malattia ha durata superiore a 2 mesi. La diagnosi di meningite tubercolare si avvale di un fondato
sospetto clinico. Sebbene in questi casi il quadro liquorale presenti tipicamente un aumento del
numero dei leucociti (GB) con predominanza dei linfociti, queste cellule possono essere assenti,
mentre in alcuni pazienti, si osserva una prevalenza di granulociti polimorfonucleati. Le proteine
del LCR sono di solito aumentate. E’ stato sviluppato un algoritmo diagnostico per favorire
un’identificazione precoce nei pazienti a maggior rischio di TBM22. In questi casi le possibilità di
ottenere uno striscio e un risultato colturale positivo sono aumentate con il prelievo di un
consistente volume di LCR (> 6mL) o si eseguono accertamenti ripetuti su questo tipo di
campione22.
Tubercolosi gastrointestinale
La tubercolosi gastrointestinale era comunemente riscontrata nell’era pre-antibiotica in pazienti con
forma polmonare diffusa che si manifestava a causa dell’ingestione delle secrezioni polmonari
infette23. Può anche essere causata dal M, tuberculosis o, in alcune aree rurali dal M. bovis (dopo
alimentazione con latte infetto non pastorizzato24). La diagnosi di TB gastrointestinale è spesso
ottenuta con l’endoscopia. La biopsia tissutale prelevata nell’organo coinvolto fornisce il maggior
numero di microrganismi per strisci e colture per ricerca di AFB3.
TB peritoneale
La tubercolosi peritoneale si manifesta in forma di ascite (essudativa) o adesiva (asciutta). La
forma ascitica è caratterizzata dalla presenza di liquido fluttuante, quella adesiva da aderenze
fibrotiche e frequentemente con presenza di rigonfiamento addominale24.
Tubercolosi genitourinaria
La tubercolosi genitourinaria è infrequente prima della pubertà ed è più frequente nei maschi25.
L’intervallo fra esordio dell’infezione e sviluppo di malattia renale attiva è di solito molto lungo (anni
o decenni). Con il progredire dell’infezione, le lesioni del rene possono divenire caseose, con
conseguente eliminazione di AFB vitali nella pelvi renale e nell’uretere, e l’infezione può diffondersi
poi alla vescica26. Il paziente può presentare frequente nicturia associata a disuria ed ematuria, e
l’analisi delle urine può rilevare proteinuria, ematuria (in più del 50% dei casi) L’analisi delle urine
rileva spesso proteinura, ematuria e(in più del 50% dei casi e piuria ‘sterile’ (in più dell’80%)11,27.
Tubercolosi ossea articolare e della colonna vertebrale
La tubercolosi ossea articolare e della colonna vertebrale di solito è espressione di un’infezione
polmonare primaria che si diffonde all’osso per via ematogena28. I fattori predisponesti
comprendono, deficit immunitari e uso di droghe per via endovenosa. La tubercolosi della colonna
vertebrale è la più frequente manifestazione delle ossa e delle articolazioni, seguita dal
coinvolgimento delle articolazioni che sostengono il peso come il ginocchio e l’anca. La diagnosi di
tubercolosi ossea e articolare è di solito posta su base clinica e radiologica associata a
disponibilità di campione bioptico per l’esame istologico e allo striscio e coltura per AFB. La TB
della colonna vertebrale (morbo di Pott) si localizza più frequentemente nella parte toracica
inferiore e nelle aree lombari superiori29. Si manifesta principalmente nella tarda infanzia, nei
giovani adulti e nell’età avanzata, producendo un collasso vertebrale con conseguente
deformazione della colonna. L’ascesso tubercolare dello psoas origina da infezioni toraciche e
della colonna vertebrale lombare e diffonde all’interno della guaina del muscolo psoas, talvolta
estendendosi fino alla coscia.
Batteriemia
Batteriemia a bassa concentrazione batterica si manifesta spesso con i micobatteri e fa parte della
storia naturale di un soggetto infetto contribuendo alla comparsa della TB in altri organi30. Tuttavia,
la micobatteraemia rilevabile è relativamente rara, tranne che nei pazienti che sono spiccatamente
immunocompromessi, come quelli con HIV-AIDS31-34. Nei pazienti affetti da AIDS dei paesi
sviluppati questa è stata il più delle volte sostenuta da Mycobacterium avium complex, in quelli
dell'Africa sub-sahariana può essere causata da MTBC33-35. L'incidenza di queste infezioni
micobatteriemiche diffuse ora è molto meno frequente grazie alla disponibilità di una efficace
terapia antiretrovirale36. Le specie Mycobacterium sono state isolate dal sangue di altri pazienti
immunocompromessi, come quelli con leucemia, e occasionalmente da pazienti che non sono
gravemente immunodepressi31.
Tubercolosi multi-resistente ai farmaci (MDR-TB, multi drug resistant TB)
Negli anni recenti sono stati segnalati in aumento in tutto il mondo i casi di TB resistenti a uno o a
più farmaci37,38. M. tuberculosis diviene resistente ai farmaci per mutazione spontanea
occasionale39. I fattori associati alla resistenza ai farmaci sono conseguenti a trattamento
incompleto e insufficiente, e alla mancata adesione al programma di trattamento prescritto.
Resistenza primaria è definita come la manifestazione che si verifica nei pazienti infettati da un
ceppo già resistente. Resistenza secondaria si presenta quando i mutanti resistenti di un
organismo inizialmente farmaco sensibile emergono nel corso di una infezione, di solito a causa di
chemioterapia inadeguata. Ceppi di TBC multi-resistenti ai farmaci (MDR) sono resistenti in vitro a
isoniazide e rifampicina. Oltre ai metodi convenzionali di sensibilità fenotipica, una parte di
mutazioni genetiche associate a resistenza può essere identificata da vari metodi molecolari. Tali
metodi possono essere applicati a un battere isolato o in modo diretto sul campione; fornendo in
tal modo una precoce identificazione della presenza di resistenza ai farmaci. I regimi del
trattamento per i MDR-TB tendono a essere meno efficace e più prolungati rispetto alla terapia per
la TB farmaco-sensibile. I ceppi di tubercolosi diffusamente resistenti ai farmaci (XDR-TB) stanno
diventando più frequenti. Questi microrganismi, oltre ad essere MDR, sono anche resistenti a
qualsiasi fluorochinolone e ad almeno un composto iniettabile di “seconda linea”, vale a dire
amikacina, kanamicina o capreomycin40. Sono ora stati segnalati casi di tubercolosi totalmente
resistenti ai farmaci 41.
Micobatteri non Tubercolari (NTM - Non Tuberculous Mycobatteria)
Queste specie Mycobacterium sono state variamente definite 'micobatteri non tubercolari',
'micobatteri ambientali', 'micobatteri anonimi', 'micobatteri atipici' .e 'micobatteri opportunisti'. I.
NTM in natura sono ubiquitari, hanno uno spettro variegato di patogenicità per l'uomo, non si
trasmettono da persona a persona e sono spesso resistenti alla classica terapia anti-tubercolare42,
43. Tuttavia, la correlazione della resistenza in vitro e l’efficacia in vivo rimangono molto meno
definite per i NTM a lenta crescita che per i MTBC42. Sono state descritte oltre 100 specie di
micobatteri e molte di loro sono state riconosciute patogene obbligate o opportuniste per l'uomo o
per gli animali42, 44. A differenza di M. tuberculosis, l'isolamento di una specie di NTM da campioni
quali l’espettorato non equivale a malattia --- i risultati microbiologici devono essere interpretati in
collaborazione con i riscontri clinici e radiologici42. L'utilizzo di nuove tecniche come il
sequenziamento comparativo del 16S rDNA consente una continua evoluzione ed espansione
della tassonomia di questo gruppo44. La tradizionale distinzione tra'' rapida crescita” e ''specie
lenta crescita”, in funzione della capacità dei ceppi di sviluppare colonie visibili nella subcoltura su
un mezzo solido in 7 giorni o meno di incubazione, rimane di valore clinico e tassonomico42,44.
Specie a crescita lenta
Mycobacterium avium - intracellulare gruppo (MAI)
Il termine M. avium complex (MAC) è spesso usato per comodità in micobatteriologia clinica per
etichettare temporaneamente ceppi fenotipicamente simili a M. avium42. La separazione di molte
specie in precedenza assegnate a questo complesso (compresa M. intracellulare) è ora facilmente
possibile. Inoltre ora sono note tre sottospecie con il nome di M. avium: M. avium subsp. avium,
M. avium subsp. paratubercolosis, e M. avium subsp. silvaticum42, 44,45. Nei pazienti
immunocompetenti, i microrganismi MAI, di solito M. intracellulare, possono invadere l'albero
bronchiale, pre-esistendo nelle aree bronchiectasiche, o in vecchie cavità42. Nei pazienti
immunodepressi M. avium e i microrganismi correlati possono causare infezione diffusa36,42. Le
infezioni da M. avium possono causare linfoadenite cervicale nei bambini in tenera età19, 20,42.
Questi microrganismi sono spesso presenti nell’acqua e possono contaminare i campioni.
Mycobacterium gordonae
Questa è una specie acquatica comune che raramente ha causato dubbia malattia in pazienti
immunosoppressi 42. È un comune contaminante di campioni clinici.
Mycobacterium kansasii
L’infezione polmonare è la forma più frequente di malattia causata da M. kansasii, di solito in
pazienti con preesistente malattia polmonare cronica o pneumoconiosi, sebbene le infezioni
possono verificarsi in altre parti del corpo42. È un foto cromogeno, cioè è richiesta la luce per
pigmentare le colonie.
Mycobacterium malmoense
M. malmoense di solito causa malattie polmonari e ai linfonodi, ma sono state segnalate altre
malattie disseminate in sede extrapolmonare42. La diagnosi di infezione da M. malmoense è
ottenuta come per gli altri micobatteri, anche se il tempo di incubazione richiesto può essere di 12
settimane prima che le colonie siano visibili sui terreni solidi46.
Mycobacterium marinum
M. marinum è l’agente causale che si trova 'nella vasca dei pesci' o che provoca il granuloma 'da
piscina, lesione cutanea localizzata successiva alla contaminazione di una ferita aperta o
abrasione con acqua di acquari, piscine e acqua dolce o salata di aree naturali. Questa specie ha
una capacità intermedia di crescita con una temperatura ottimale di 28-30° C42.
Mycobacterium ulcerans
Il M. ulcerans causa di lesioni cutanee in diverse parti del mondo, tra cui l'Australia (ulcera
Bairnsdale") e nel Sud-Est asiatico, in Uganda e in altre parti dell'Africa ("ulcera di Buruli"), e nel
Centro / Sud America42,47. L’infezione può portare alla formazione di un’ulcera progressiva cronica
indolore, che occasionalmente si può manifestare in viaggiatori provenienti da aree endemiche
42,47. Il microrganismo può essere difficile da isolare in laboratorio - è più sensibile ai metodi di
decontaminazione standard rispetto ad altri micobatteri, la crescita è lenta (6-12 settimane) e
necessita di incubazione a 30-33° C42, 47. I Metodi molecolari possono essere utili per confermare
la diagnosi clinica.
Mycobacterium xenopi
M. xenopi è un'altra causa relativamente frequente di malattia polmonare NTM in alcune aree
geografiche42,48. È termofilo, con una temperatura di crescita ottimale di 45° C, e, come M.
malmoense, si sviluppa lentamente a 37° C. Può essere isolato da varie fonti ambientali, inclusi i
rubinetti dell’acqua calda, e quindi può anche essere una causa di contaminazione dei campioni42.
Specie Particolarmente esigenti
Alcune altre specie micobatteriche richiedono specifici supplementi o condizioni per essere
coltivate con successo in laboratorio. Questi includono Mycobacterium genevense (ad esempio
mycobactin J) e Mycobacterium haemophilum (emina o ferro altri composti), ed entrambe le specie
hanno dimostrato di essere associate principalmente a pazienti immunocompromessi, compresi
quelli infettati da HIV42. Tuttavia, M. haemophilum, che ha una temperatura ottimale di crescita di
28-30 ° C, può anche causare linfadenite in pazienti pediatrici sani 20,42. M. leprae, agente
eziologico della lebbra, non può attualmente essere coltivato in vitro.
Specie a rapida crescita42, 44, 49
Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum
Queste specie e quelle affini sono ben riconosciute come la causa di infezione del tessuto cutaneo
e dei tessuti molli 42,49. Questi micobatteri possono infettare cateteri vascolari a permanenza e altri
dispositivi medici42. Sono stati trovati in liquidi di lavaggio ottenuti da broncoscopia e possono
essere associati a false diagnosi positive. Sebbene si siano riscontrate variazioni in alcune
sottospecie, la temperatura ottimale di crescita è compresa tra 30-33° C.
Micobatteri e HIV/AIDS
Fra tutte le persone infettate con l'HIV a livello mondiale, si valuta che un terzo è stato infettato
anche da Mycobacterium tuberculosis50. La povertà, il sovraffollamento e la mancanza di casa
sono i fattori socio-economici più frequenti nella co-infezione TB e l'HIV51. I pazienti con infezione
da HIV sono predisposti alla riattivazione dell’infezione latente da TB e pure per una rapida
progressione dell’infezione di recente acquisizione52. Nella diagnosi e nel trattamento di pazienti
con co-infezione è richiesto un approccio coordinato53.
Nei pazienti HIV positivi con infezioni sistemiche sono state isolate numerose specie di micobatteri
non-tubercolari, quella MAI è la più frequente - tuttavia l'incidenza di tali infezioni diffuse si è molto
ridotta con l'uso di terapia anti-retrovirale molto efficace36,42.
Nuove tecnologie per la Diagnosi e Tipizzazione di M. tuberculosis
Saggi commerciali sul sangue per la diagnosi di tubercolosi latente
Il rilievo della tubercolosi latente è essenziale per la ricerca dei contatti e per il controllo
dell'epidemia. Tradizionalmente il test cutaneo alla tubercolina (TST, tubercolin skin test, cioè la
Mantoux o anche in precedenza la prova di Heaf) sono stati comunemente utilizzati per il
rilevamento di infezioni latenti da M. tuberculosis. Tuttavia, questa procedura è problematica, per i
diversi criteri interpretativi dei risultati - falsi positivi e negativi, limitata durata di conservazione
della proteina purificata (PPD), lettura soggettiva dei risultati, e mancanza di volontà di alcuni
contatti di tornare per il controllo e l’interpretazione della prova54. I micobatteri ambientali e il
Mycobacterium bovis-derivato dal Bacillo Calmette-Guérin (BCG) vaccino sono frequentemente
causa di risultati falsi positivi3, 54.
Di conseguenza non vi è la necessità di sviluppare un test più affidabile, sensibile e specifico per la
diagnosi della tubercolosi latente. Per rispondere a questa esigenza, sono state sviluppate prove
che utilizzano sangue intero in grado di rilevare le cellule T attivate da M. tuberculosis- o che
stimano il y-interferone prodotto da queste cellule; questi sono stati definiti saggi di rilascio
dell’interferone gamma (IGRA – interferon gamma release assays) o test dell’interferone gamma
(IGTs – interferon gamma tests)3,55. Sono disponibili in commercio due saggi il QuantiFERON ® Gold In-Tube TB e il T-SPOT ® test TB. Questi sono utilizzati per identificare le persone che sono
a rischio maggiore di sviluppare la tubercolosi e dove il trattamento dell'infezione latente può
essere utile. Esempi includono: operatori sanitari, persone che hanno avuto contatti recenti con un
paziente con tubercolosi attiva e quelli con condizioni mediche soggiacenti, come HIV, leucemia o
linfoma3.
I saggi rilevano la risposta dell'ospite all'infezione usando antigeni micobatterici presenti nel M.
tuberculosis ma non nel BCG; sebbene questi siano trovati in alcuni micobatteri diversi, compresi
Mycobacterium szulgai, M. marinum e M. kansasii. In questo modo non sono influenzati da una
precedente vaccinazione con BCG o l'esposizione a più micobatteri non tubercolari. Tuttavia,
queste analisi non sono in grado di distinguere l'infezione latente della tubercolosi dalla malattia
attiva o da quella precedentemente trattata con successo. Entrambi i test possono fornire un
risultato entro 24 ore e rilevare un'infezione latente di TB con un elevato livello di sensibilità e
specificità. Nessuno di questi test dovrebbe essere utilizzato in modo isolato per diagnosticare o
definire una malattia attiva da TB 55,56. Le raccomandazioni per quanto riguarda il ruolo di queste
prove nella diagnosi di LTBI sono state revisionate e pubblicate dal NICE, e anche dai Centers for
Disease Control and Prevention degli Stati Uniti riguardo al loro uso appropriato per rilevare
l’infezione da M. tuberculosis3,55.
Test di amplificazione dell'acido nucleico
l test di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT, nucleic acid amplification tests) per la rilevazione
di MTBC, quando applicati direttamente a un campione primario possono essere utili in
determinate situazioni, come la rapida conferma della diagnosi di meningite tubercolare22,57.
L'accuratezza della NAAT è si è rilevata maggiore sui campioni respiratori rispetto a quelli di altre
sedi. Per la malattia TB, sia in sede polmonare sia extra-polmonare, il risultato positivo NAAT
potrebbe essere utilizzato per emettere la diagnosi, ma un negativo non può escluderla3,10,22. A
causa della mancata disponibilità di una NAAT convalidata e ottimalizzata per il rilevamento del
complesso M. tuberculosis per uso generale, nel Regno Unito è stato precedentemente
raccomandato che tali prove fossero utilizzate solo in alcune condizioni, ad esempio, nel caso di
uno striscio positivo dell'espettorato di un paziente in cui una rapida conferma di TBC potrebbe
modificare le caratteristiche dell’assistenza alla persona o la gestione di piani per rintracciare le
persone in caso di contatto molto diffuso3. Tuttavia, la tecnologia continua a svilupparsi, e in un
ampio studio multinazionale pubblicato dopo che queste raccomandazioni erano state formulate,
ha dimostrato una sensibilità del 98% (in un programma) quando lo striscio dell’espettorato è
risultato in alcuni positivo, e il 73% negativo; la coltura per MTBC ha confermato i pazienti con un
accertamento NAAT per paziente. In funzione di questo e di altri studi, l'OMS ha formulato
raccomandazioni in merito all'applicazione di questo metodo - in particolare per essere utilizzato
come test diagnostico iniziale per la tubercolosi su almeno un campione di espettorato per chi è
sospettato di avere l'HIV associato a TBC o a MDR-TB. E’ stata riconosciuta la necessità della
microscopia convenzionale e la cultura per AFB.
I Metodi genotipici hanno valore critico nel permettere l'identificazione preliminare rapida a livello di
complesso o specie di un micobatterio isolato e a chiarire la tassonomia del genere4,44. Possono
anche essere usati per diagnosticare infezioni dovute a specie di micobatteri esigenti che sono
difficili da coltivare in laboratorio42,47.
Le prove NAAT sono anche utili per il rilevamento rapido di mutazioni genetiche di M. tuberculosis
associate a resistenza ai farmaci (in particolare rifampicina) 38,58-61. Nel Regno Unito è stato
raccomandato che questa prova per rilevare la resistenza alla rifampicina sia effettuata su
campioni AFB positivi di pazienti giudicati a rischio "significativo" per TB resistenti ai farmaci3.
Fattori che influenzano la valutazione del rischio includono se il paziente ha avuto un precedente
trattamento per la tubercolosi o contatto con un caso noto di TB resistente ai farmaci3.
Analisi genomica di M. tuberculosis isolati da epidemie e focolai di TB
Focolai sporadici di tubercolosi tra le popolazioni umane sono una grave minaccia per la salute
pubblica sia nei paesi industrializzati che nei paesi in via di sviluppo. La diagnosi precoce e
accurata dei ceppi epidemici è fondamentale nella gestione e nel controllo della diffusione
potenziale dei TB. Sono stati descritti vari metodi genomici 62. Il cromosoma di M. tuberculosis
contiene loci, in cui sono serialmente ripetuti elementi genetici, con il numero di ripetizioni variabile
tra i vari ceppi. Il loro numero può essere determinato per ogni isolato generando un profilo che
può poi essere confrontato. Questi loci sono stati denominati ripetizioni in tandem esatti (ETR, exat
tandem repeats), numero variabile di ripetizioni in tandem (VNTR, variablle number tandem
repeats) o unità micobatteri intervallate ripetitive (MIRU, mycobacterial interspersed ripetitive units)
e il metodo è stato chiamato tipizzazione MIRU-VNRT63,64. Nel Regno Unito 24 differenti loci sono
attualmente analizzati per ogni un nuovo isolato di M. tuberculosis per ogni nuovo paziente. La
genotipizzazione ha dimostrato di essere utile in varie situazioni, compresa l'Identificazione (o
esclusione) di eventuali Incidenti di laboratorio per contaminazione crociata; indagini su focolai
percepiti, nonché nell'analisi di condizioni di trasmissione di M. tuberculosis nell’ambito e fra
comunità11,63-66. La PHE ha fornito indicazioni per l'Interpretazione e l’indagine di gruppi generati
dal programma nazionale di tipizzazione dei ceppi, nel Regno Unito, come stanno facendo le linee
guida per l’applicazione delle genotipizzazione con i risultati dei CDC.
Identificazione MALDI-TOF di specie Mycobacterium
La MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption ionisation –time of flight) è un’analisi di
spettroscopia di massa utilizzata per le proteine ribosomiali 16s. Per agevolare l'identificazione
questa tecnica mette a confronto i picchi di massa ottenuti dai ceppi di prova e quelli dei ceppi di
riferimento conosciuti. È possibile che un microrganismo sia identificato entro 20 minuti ed è
sempre più utilizzata nei laboratori per fornire un sicuro sistema d’identificazione. Sono stati
condotti studi sul beneficio di questa tecnica per l'identificazione di specie micobatteriche e si è
accertato che è un mezzo affidabile per distinguere tra specie strettamente correlate all’interno di
un gruppo67,68. Il metodo MALDI-TOF fornisce un mezzo rapido di identificazione per questo
importante gruppo di agenti patogeni, consentendo potenzialmente regimi di trattamento accurati
da iniziarsi immediatamente, tuttavia è richiesta una successiva validazione che non è ancora
ampiamente disponibile.
Informazione Tecnica/Limitazioni
Limitazioni delle SMi del RU
Le raccomandazioni formulate nelle SMI del RU sono basate su prove (ad esempio sensibilità e
specificità), se disponibili, opinioni degli esperti e pragmatismo, tenendo in considerazione anche
le risorse disponibili. I laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e
intraprendere ricerche addizionali, se appropriato. Prima del loro uso, i laboratori devono
assicurare che tutti i saggi commerciali e in-house sono stati validati e sono idonei allo scopo
Terreni Selettivi per Procedure di Screening
I terreni selettivi che non consentono la crescita di tutti i ceppi dei microrganismi circolanti possono
essere raccomandati sulla base delle evidenze disponibili. Un equilibrio deve pertanto essere
ricercato tra evidenze disponibili e risorse necessarie quando si usa più di una piastra di terreno.
Contenitori per campioni1,2
Le SMI usano Il termine '' contenitore a chiusura ermetica con marchiatura CE ” per descrivere
quelli contrassegnati con la marchiatura CE per la raccolta e il trasporto dei campioni clinici. I
requisiti per i contenitori dei campioni sono riportati nella Direttiva UE per i Dispositivi Sanitari
Diagnostici in vitro (98/79/CE allegato 1 B 2.1) in cui si stabilisce:'' La progettazione deve
consentire un'agevole manipolazione e, se necessario, ridurre per quanto possibile la
contaminazione dei, e perdite dal dispositivo durante l'uso e, nel caso di recipienti per campioni, il
rischio di contaminazione degli stessi. Le procedure di fabbricazione devono essere adatte a
questi scopi''.
Coltura dei Campioni
I campioni inviati per l’esame colturale dei micobatteri appartengono a due categorie: quelli
normalmente contaminati con flora residente e quelli provenienti da aree normalmente “sterili”. I
campioni contaminati richiedono, prima della coltura, una fase di decontaminazione per ridurre la
possibilità di crescita eccessiva di microrganismi diversi dai micobatteri. L’eccessiva
decontaminazione dei campioni deve essere evitata poiché può essere responsabile di risultati
falsamente negativi11. Sono stati descritti quattro diversi metodi per la decontaminazione dei
campioni, ma non esistono prove che dimostrino che un metodo sia il migliore e i laboratori
dovranno selezionare quello che preferiscono --- che può variare con il paziente e con la tipologia
del campione. Sono state proposte altre tecniche di lavorazione che hanno espresso un buon
rendimento rispetto a quello più diffuso con NALC-NaOH, procedura che sarà descritta nella
sezione 2.6.2, e che può anche essere adatta, se opportuno, dopo validazione locale, al sistema di
coltura liquida in uso6,69, 70
Per eseguire l’esame colturale per micobatteri i laboratori devono essere accreditati, disporre del
controllo interno di qualità, e assicurare una prestazione soddisfacente nel Controllo di Qualità
Esterno per ogni livello delle prestazioni che è fornita, ad esempio per microscopia, coltura,
identificazione, e per le prove di sensibilità4.
Va notato che sebbene il piruvato di sodio favorisca la crescita di M. bovis può inibire alcune
specie di Mycobacterium non-tubercolari.
Quando si centrifugano i campioni, il tempo appropriato deve essere aggiunto al tempo totale di
rotazione per consentire alla centrifuga di raggiungere la velocità appropriata e per il successivo
tempo necessario al suo arresto.
La concentrazione dei campioni di espettorato, ad esempio mediante centrifugazione, aumenta la
sensibilità iniziale della microscopia71.
Sono state segnalate false colture positive, dovute a contaminazione crociata nei laboratori, e la
mediana della percentuale di falsi positivi è risultata del 3,1% 65.Ove possibile, la contaminazione
crociata deve essere evitata con l'uso di pipette singole e di aliquote singole di decontaminanti e
altri additivi. Ogni additivo al campione, compresa l’acqua, deve essere sterile.
I sistemi automatizzati di coltura liquidi disponibili nel Regno Unito sono stati saggiati per la loro
capacità di rilevare una vasta gamma di micobatteri a rapida e lenta e crescita, tuttavia
l’isolamento di tutte le specie di micobatteri non è affidabile con questi sistemi, in particolare
quando si indagando pazienti immunocompromessi42. I limiti rilevati sono rappresentati da una
temperatura di incubazione unica e dalla difficoltà di fornire gli additivi di crescita necessari per
alcune specie molto esigenti. Si possono chiedere consigli ai laboratori di riferimento o al
produttore del sistema in questione. Basse concentrazioni M. tuberculosis si recuperano solo su
supporti a base di uova, come su becco di clarino di Löwenstein Jensen11.
La temperatura della piastra di calore deve essere controllata perché, se eccessiva, comporterà la
perdita di sensibilità della colorazione e quindi strisci falsi negativi72, 73.
1
Considerazioni sulla Sicurezza1,2,74-88
1.1
Prelievo dei Campioi, trasporto e Conservazione,1,2,74-77
Usare tecnica asettica
Prelevare i campioni in appropriati contenitori impermeabili con marchiatura CE e trasportarli in
sacchetti di plastica sigillati
E’ essenziale la conformità alla regolamentazione postale per trasporto e conservazione
1.2
Procedura sul Campione 1,2,74-88
Livello di contenimento 3,
Le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi devono essere eseguite in cabina
microbiologica di sicurezza con Contenimento di Livello 380.
I disinfettanti fenolici non sono supportati dalla Biocidal Products Directive 2001 e quindi non sono
più disponibile nel Regno Unito89. Si usano alternative che hanno modificato l'efficacia di
inattivazione delle specie Mycobacterium90. La Public Health England ha fatto raccomandazioni
per possibili alternative ai disinfettanti fenolici, tra cui gli ipocloriti e biossido di cloro91. I tempi di
contatto e la concentrazione per vari disinfettanti possono variare e ciò deve essere tenuto in
considerazione. Sono auspicabili disinfettanti con rapidi tempi di contatto.
L'uso di piastre termiche nella cabina microbiologica di sicurezza (CMS) in ambiente di
contenimento di Livello 3 può alterare la velocità di flusso dell'aria nel suo interno. Se queste
devono essere utilizzate, nella CMS si deve controllare il flusso d'aria quando la piastra è attiva e
spenta per ottimizzare e confermare l’efficienza della stessa.
Utilizzare contenitori sigillati per la centrifugazione. Dopo centrifugazione aprirli in una cabina
microbiologica di sicurezza.
Per disinfettare le superfici delle cabine di sicurezza microbiologica e per pulire l'esterno delle
attrezzature utilizzare disinfettanti secondo le istruzioni del produttore.
Trasportare il materiale di scarto direttamente all'autoclave quando è pronta per lo smaltimento e
autoclave immediatamente.
Utilizzare materiali di consumo di plastica invece di quelli in vetro, ove possibile.
Nota: La fissazione al calore degli strisci non uccide le specie Mycobacterium.
Manipolare i vetrini con cautela (consultare la sezione 4.4).
I campioni devono essere posti su appropriati supporti per ridurre al minimo la possibilità di rottura
dei contenitori ed eventuali perdite.
Fare riferimento alla linea guida corrente sulla sicurezza delle manipolazioni di tutti i microrganismi
presentati in questa SMI.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio
2
2.1
Prelievo del Campione
Tipo di Campione
Espettorato, lavaggio gastrico, liquidi da sedi corporee sterili, (LCR, Liquido pleurico ecc.) urine,
cute o biopsie tissutali, lavaggio bronco alveolare, campioni post mortem, lavaggio gastrico midollo
osseo, sangue, osso.
2.2
Tempo Ottimale e Metodo di Prelievo92
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento LLA Sezione1.1
Raccogliere i campioni prima della terapia antimicrobica se possibile92.
Per la diagnosi iniziale di infezione da micobatteri tutti i campioni devono essere prelevati di
recente e possibilmente prima dell’inizio del trattamento anti-tubercolare. Anche '' Altri''
antimicrobici possono avere una notevole attività anti-micobatterica, in particolare i fluorochinoloni
come la ciprofloxacina, levofloxacina o moxifloxacina, e macrolidi come la claritromicina o
azitromicina.
Usare appropriati contrassegni di rischio in base alla politica locale.
Fare riferimento alle specifiche linee guida HSE / COSHH per la raccolta e la manipolazione sicura
dei campioni che possono contenere microrganismi del Gruppo di Rischio 3.
Procedure che generano aerosol, come broncoscopia o espettorato indotto, devono essere
eseguite in un’area opportunamente progettata e ventilata3.
Campioni diversi da sangue
Campioni diversi da sangue e midollo osseo devono essere refrigerati se il trasporto al laboratorio
o l’inizio della procedura e >1 ora.
Lavaggi gastrici
Se la procedura è ritardata di > 4 ore, i lavaggi gastrici devono essere neutralizzati aggiungendo
circa 100 mg di carbonato di sodio a circa 50 ml del campione86.
Colture di sangue e midollo osseo
Il Sangue e la coltura dell’aspirato di midollo osseo devono essere trasportati e inseriti appena
possibile nel sistema di coltura automatizzato.
2.2.1 Corretto tipo di campione e metodo di prelievo
Campioni di espettorato
Per ridurre al minimo la contaminazione i campioni devono essere stati prelevati di recente (da
meno di 1 giorno). I migliori campioni sono quelli purulenti. Di prima mattina, per tre giorni
consecutivi, devono essere raccolti ≥5 mL per ogni campione con intervallo di 8-24
dall’ultimo3,4,10,13.
I campioni prelevati la mattina presto (cioè poco dopo il risveglio del paziente) hanno la massima
resa. Quando la tosse è secca, può essere utile prima della raccolta la fisioterapia, il drenaggio
posturale o l'inalazione di soluzione salina nebulizzata (induzione della produzione di espettorato)
Lavaggio broncoalveolare / lavaggi bronchiali
Questi possono essere inviati se espettorato, spontaneo o indotto, non è disponibile o se i
campioni sullo striscio sono AFB negativi.
Nota: Dovrebbe essere evitata la contaminazione del broncoscopio con acqua di rubinetto, che
può contenere specie ambientali di Mycobacterium. Il volume minimo del campione è
preferibilmente di 5 ml.
Lavaggi gastrici
I lavaggi gastrici sono di solito utilizzati per i bambini quando insorgono problemi per la raccolta
dell’espettorato. I bambini piccoli spesso ingurgitano le loro secrezioni respiratorie invece di
espellerle. L’espettorato indotto è considerato preferibile al lavaggio gastrico, quando possibile3.
Raccogliere un campione al mattino presto (prima di colazione) per 3 giorni consecutivi94.
Preferibilmente, un volume minimo di 5 mL. Gli aspirati devono essere prontamente consegnati e
trattati per evitare il deterioramento dei microrganismi provocato dall’acido (consultare di seguito la
neutralizzazione alla sezione 4.5). I risultati della microscopia diretta sul lavaggio gastrico possono
essere fuorvianti perché altri bacilli acido-resistenti sono normalmente presenti nello stomaco.
Liquidi da sedi corporee sterili
I Liquidi da sedi corporee sterili (LCR, liquido pleurico ecc.) non richiedono la decontaminazione e
possono essere seminati direttamente in terreni neutri. Comunque, se richiesto, possono essere
trattati con acido. Prelevare il maggior volume possibile di LCR in modo asettico in un
contenitore impermeabile con marchiatura CE. Se dopo la prima puntura lombare è disponibile un
volume ridotto e i risultati dei conteggi cellulari e della concentrazione delle proteine fanno
sospettare una meningite TB, deve essere considerata l’opportunità di un secondo prelievo con
l’intento di ottenere un maggiore volume di campione per aumentare le possibilità di colture
positive22.
Ricordare che i liquidi pleurico e pericardico non sono campioni molto sensibili per la ricerca di M.
tuberculosis e che attualmente si ritengono più utili le biopsie prelevate durante la raccolta dei
liquidi da queste sedi.11. Il risultato negativo di questi campioni fluidi non esclude la diagnosi.
Campioni urinari
I campioni urinari devono essere raccolti di primo mattino per 3 giorni consecutivi in un contenitore
impermeabile con marchiatura CE (che non contiene acido borico), posto in un sacchetto di
plastica sigillato. Se non sono disponibili contenitori per un campione completo di urine di primo
mattino (UPM), può essere accettato un campione di UPM da mitto intermedio, anche se questa
alternativa non è la migliore.
Cute/osso, e tessuti inclusi campioni post mortem95
I campioni di questo tipo devono essere omogeneizzati, con eccezione del tessuto osseo. Se si
riceve un pezzo voluminoso può essere necessario selezionare e tagliare una parte appropriata di
tessuto. In modo analogo, alcuni frammenti di tessuto possono richiedere di essere ‘sminuzzati’
con bisturi e forbici sterili prima di essere omogeneizzati in modo adeguato. Prelevare
asetticamente i campioni e inserirli in un contenitore impermeabile con marchiatura CE privo di
conservanti, inserito in sacchetto di plastica sigillato, aggiungendo acqua distillata sterile per
prevenire l’essiccamento. Selezionare, se possibile, una parte caseosa: il maggior numero di
microrganismi è presente alla periferia della lesione caseosa.
Campioni fecali
Mycobacterium tuberculosis e il gruppo dei Mycobacterium avium-intracellulare sono stati isolati
dalle feci, in particolare nei pazienti immunocompromessi, come quelli affetti da HIV-AIDS.
Tuttavia, i batteri NTM possono essere isolati in soggetti sani, solo come colonizzanti96. Se si isola
M. tuberculolosis, questo potrebbe essere dovuto alla ingestione di secrezioni respiratorie infette
piuttosto che a malattia intestinale96. La procedura di isolamento non è affidabile e ha una ridotta
percentuale di successo per la forte contaminazione di altri batteri, pertanto la coltura di campioni
fecali per micobatteri non è raccomandata in questa SMI. M tuberculosis e i NMT, tra cui i MAI,
possono essere isolati da colture di sangue nelle infezioni disseminate.
Pus o pus prelevato con tamponi
Il Pus o pus prelevato con tamponi deve essere raccolto in modo asettico e deve essere inviato il
maggior volume possibile in un contenitore impermeabile con marchiatura CE inserito in un
sacchetto di plastica. Il pus è il campione di scelta. I tamponi sono meno appropriati perché i
micobatteri, se presenti, possono rimanere adesi sul tampone stesso invece di essere trasferiti con
successo nei terreni di coltura97.
Midollo osseo
Prelevare per aspirazione la maggior quantità possibile di midollo osseo e inserirlo
direttamente nel terreno di coltura seguendo le istruzioni del produttore.
Sangue
Per maggiori informazioni sulle emocolture consultare B 37 – Investigation of Blood Cultures (for
Organisms other than Mycobacterium species) ma microscopia, sub-coltura e altri accertamenti
devono essere eseguiti secondo i metodi descritti in questa SMI.
Nota: EDTA, anche in tracce, inibisce la crescita di alcune specie Mycobacterium.
2.3 Quantità Adeguata e Numero Appropriato di Campioni92
Il numero e la frequenza dei campioni prelevati dipendono dalle condizioni cliniche del paziente.
3
Trasporto e Conservazione del Campione1,2
3.1
Condizioni Ottimali di Trasporto e Conservazione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sezione 1.1
I campioni devono essere trasportati e processati il più presto possibile92.
I campioni devono essere trasportati e ricevuti in laboratorio entro un giorno dal prelievo e
processati il più presto possibile4. Devono essere indicati i requisiti richiesti da ciascun laboratorio
Se la procedura è ritardata, la refrigerazione è preferibile alla temperatura ambiente92.
3.1.1 Trasporto
La definizione di Categoria A (per colture positive) e Categoria B (per i campioni) è limitata alla
classificazione di campioni / colture microbiche che devono essere trasportate a un altro
laboratorio (consultare la Tabella successiva).
Descrizione del Campione
I campioni di Categoria A sono noti o sospetti di contenere un
agente microbico con la seguente definizione "materiale infettante
trasportato in una forma che, se si verifica l'esposizione a esso, è
in grado di provocare invalidità permanente, malattia pericolosa
per la vita o la morte per gli esseri umani o animali ". La maggior
parte è del Gruppo di Rischio 3 o 4
Per questioni pratiche, per consentire l’invio dei campioni e
permettere ai centri di compiere le proprie funzioni, i componenti
della categoria individuata come A sono sono stati ridotti. Questi
comprendono Escheichia coli produttrici di Vero-citotossina
(VTEC), Mycobacterium tuberculosis e Shigella dysenteriae 1
I Campioni di Categoria B sono quelli che non sono compresi nella
definizione della Categoria A
Istruzioni imballaggio
Contrassegno UN2814 (Umani)
Istruzioni imballaggio PI620
Documentazione di supporto per ADR
Trasporto come categoria A
ADR corriere autorizzato
Contrassegno UN3373
Istruzioni per confezionamento PI650
Inviare tramite corriere
Royal mail NOT accetta
Contrassegno UN3373
Istruzioni per confezionamento PI650
Posta o corriere
La Royal mail NOT accetta
4
Procedura sul campione1,2
4.1 Selezione della Prova
Se è disponibile un volume sufficiente, i campioni sono normalmente indagati prima con la
microscopia per AFB (striscio) e poi con la coltura, con l'esclusione di quelli già pre-inoculati in un
flacone di coltura micobatterica. La microscopia diretta delle urine ha un valore discutibile, inoltre,
in funzione dellla situazione clinica, per la presenza di micobatteri non tubercolari11, 27.
Se il volume del campione è insufficiente per entrambe le ricerche, la cultura è generalmente
preferibile alla microscopia per la maggiore sensibilità.
Potrebbe essere opportuno processare un campione per AFB, in funzione della sua tipologia e dei
dati clinici disponibili, anche se queste prove non sono state espressamente richieste quando
campioni sono stati inviati3. Questi materiali particolari includono le biopsie pleuriche o materiale
da linfonodi3.
4.2 Aspetto
Liquidi corporei da sedi sterili
Notare la presenza di eventuali coaguli, se presente, utilizzarli nella procedura.
Biopsie dei tessuti
Processare l'intero tessuto se il campione è piccolo.
Per i campioni di grandi dimensioni selezionare per gli strisci e la coltura le parti caseose (se
presenti), così come il tessuto immediatamente circostante le aree caseose
4.3 Preparazione del Campione
Per considerazioni sulla sicurezza fare riferimento alla Sessione 1.2
Consultare di seguito le sezioni importanti per la preparazione degli strisci e della ricerca colturale
4.4
Microscopia
4.4.1 Standard
Eseguire l’esame microscopico e inviare il risultato entro un giorno di lavoro dal ricevimento del
campione4.
Eseguire l’esame microscopico dopo omogeneizzazione e prima della decontaminazione dei
campioni o direttamente dal campione.
1.
Centrifugare i campioni omogeneizzati in contenitori chiusi a 3000 x g per 15 minuti.
2.
Scartare con attenzione il sopranatante in un recipiente contenente un disinfettante
idoneo.
3.
Preparare uno striscio sottile del sedimento su un solo vetrino e fissare al calore su
una piastra riscaldata (65°C–75°C) per almeno 10 minuti e al massimo per 1 ora72,
collocare in seguito su un idoneo portavetrini o altro supporto. Colorare con metodo
auramina-fenolo.
*E’ importante che la centrifugazione sia eseguita con un’appropriata Forza di Centrifugazione
Relativa (FCR ). Questa varia da centrifuga a centrifuga ed è proporzionale alla lunghezza del
braccio del rotore e alla velocità di rotazione. Non deve essere confusa con la velocità di
Rotazione per Minuto (RPM).
Nota: L’esame dello striscio di appropriati campioni deve essere garantito per almeno sei giorni
lavorativi alla settimana4.
4.4.2. Preparazione degli strisci
Strisci di espettorato:
Strisciare il sedimento ottenuto per centrifugazione dal campione trattato e centrifugato con
un’ansa di plastica su un vetrino, mantenendosi lontani dai margini10,11,73. Non preparare strisci
troppo sottili.
Liquidi corporei sterili:
Preparare gli strisci come in precedenza (strisci dell’espettorato) dal sedimento dopo
centrifugazione. Per il LCR può essere opportuno strisciare il materiale in strati successivi, se il
volume è sufficiente.
Tessuto:
Gli strisci dei tessuti garantiscono una sensibilità più elevata se preparati con tecniche istologiche,
cioè colorando sezioni seriali con il metodo di Ziehl-Neelsen modificato. Si possono eseguire strisci
diretti, ma questi sono solitamente poco sensibili. Se il materiale disponibile è scarso, la coltura dei
tessuti prelevati di recente è il metodo diagnostico più sensibile perché fornisce il maggior numero
di informazioni per la gestione del paziente.
Tamponi
Non esaminare con microscopia i tamponi da prelievo unico perché possono essere fonte di
contaminazione. L’esame microscopico è indicato se si ricevono un paio di tamponi, oppure un
tessuto associato a un tampone con pus. Se è stato inviato un solo tampone sospendere il
materiale contenuto in 1 mL di acqua distillata sterile e trattare come l’espettorato.
Sangue / aspirato di midollo osseo
Eseguire l’esame microscopico su ogni flacone che il sistema colturale automatizzato segnala
come positivo o è giudicato positivo visivamente. Con ago di sicurezza apropriata o altro
dispositivo, rimuovere poche gocce di miscela sangue/brodo trasferendole su un vetrino da
microscopio pulito. Strisciare il campione con ansa sterile per ottenere uno strato sottile per la
colorazione specifica dei microrganismi acido resistenti.
4.4.3 Colorazione degli Strisci
La colorazione Auramina-fenolo è più sensibile della Ziehl-Neelsen e pertanto più idonea per la
valutazione di strisci da materiali clinici4,10,11,42,71,73,98. La colorazione Ziehl-Neelsen consente
l’osservazione di dettagli morfologici ed è utile nell’esame delle colture positive per AFB, e può
essere utilizzata per confermare i risultati dei campioni clinici positivi all’auramina–fenolo.
Prima del loro utilizzo nella routine, colorare con i nuovi lotti di auramina-fenolo e Ziehl-Neelsen i
vetrini di controllo, positivo e negativo, fissati in precedenza.
Nota: Durante la colorazione dei vetrini, per ridurre il rischio di contaminazione crociata è
opportuno garantire che non vengano a contatto fra loro. Devono essere allestiti un vetrino di
controllo negativo e positivo correttamente verificati. Inoltre, prima della colorazione, controllare
che non siano presenti schizzi d'acqua di rubinetto -- questi possono produrre risultati falsi positivi
per presenza di NTM nelle condutture idriche. Quando si utilizzano le tecniche di colorazione,
queste devono essere integrate con la COSHH locale e la valutazione del rischio.
Colorazione di strisci fissati al calore con auramina-fenolo per la ricerca con
microscopia a fluorescenza di microrganismi acido-alcool resistenti in campioni
clinici99
1.
Versare sul vetrino il colorante Auramina-fenolo e attendere 10 minuti. Il colorante
deve essere di recente preparazione e filtrato se ottenuto da reagenti primari, cioè non
avendo utilizzato forniture commerciali di colorante concentrato.
2.
Lavare con acqua o con soluzione decolorante e asciugare il vetrino.
3.
Versare il decolonizzante a base di acido-alcol (1% v/v) e lasciare agire per 3 – 5
minuti.
4.
Allontanare il decolorante acido-alcol e aggiungere il colorante di contrasto da lasciare
agire per 15 – 30 secondi
Il colorante di contrasto idoneo include:
Rosso tiazina 0.02% p/v in soluzione acquosa
Permanganato di potassio 0,1% (p/v)
5.
Sciacquare con acqua e porre il vetrino ad asciugare su un supporto inclinato
6.
Esaminare a ingrandimento a 25x o 40x con microscopio a epi-fluorescenza a
ingrandimento 25 x 40 (ingrandimenti con obiettivi a 40x non richiedono coprioggetto).
Nota: Se si utilizzano confezioni commerciali seguire le indicazioni del produttore.
Colorazione con Ziehl Neelsen di strisci fissati al calore per la ricerca di bacilli
alcool acido resistenti nelle colture positive99
1.
Coprire il vetrino con cabol fuxina concentrata.
2.
Scaldare in modo moderato e lasciare per 3 -5 minuti da quando si ha sviluppo di
vapori.
3.
Lavare accuratamente con acqua.
4.
Decolorare per 2 -3 minuti con una soluzione di acido–alcol (al 3% v/v), lavare con
acqua, aggiungere nuovamente acido-alcol per 3-4 minuti fino a quando il vetrino
assume una debole colorazione rosa.
5.
Lavare accuratamente con acqua.
6.
Controcolorare per 30 secondi con di blu di metilene o verde malachite (1% p/v).
7.
Lavare con acqua e lasciare asciugare.
8.
Applicare l’olio di immersione e leggere con microscopio a luce trasmessa
Nota: Se si utilizzano confezioni commerciali seguire le indicazioni del produttore.
Questa tecnica può essere anche utilizzata su campioni clinici per identificare l’aspetto
macroscopico di AFB.
4.5
Coltura e Ricerca
4.5.1 Pretrattamento
Tutti i metodi prevedono una o più fasi descritte di seguito:
Pre-Trattamento (quale centrifugazione)
Questo non è appropriato per tutti i tipi di campione.
Omogeneizzazione
Migliora la sensibilità della coltura ma non è richiesta per tutti i campioni.
Decontaminazione e neutralizzazione:
Rimuove la contaminazione e bilancia il pH. La successione delle diverse fasi deve essere prevista
in funzione delle percentuali di contaminazione di ciascun laboratorio. I laboratori che utilizzano
sistemi di coltura automatizzati devono fare riferimento alle raccomandazioni del produttore per
l’uso di metodi di decontaminazione compatibili. Quattro sono i metodi di decontaminazione /
digestione ora utilizzati nelle procedure dei campioni.
1. Decontaminazione di campioni con NaOH 0,5 N (2% w / v)
2. Decontaminazione dei campioni con NALC-NaOH.
3. Decontaminazione dei campioni con H2SO4 (0.5N).
4. Decontaminazione di campioni utilizzando acido ossalico (3%).
Non sono disponibili dati o prove di valutazione per consigliare un metodo ottimale. La scelta del
metodo più idoneo e il tempo di decontaminazione variano con il livello di contaminanti presenti nei
campioni. I laboratori devono trattare campioni in funzione del livello di contaminazione nel
campione.
Concentrazione (ad esempio la centrifugazione):
Questo non è appropriato per tutti i tipi di campioni.
4.5.2 Campioni provenienti da sedi sterili
Questo metodo è adatto per i seguenti campioni:
•
•
•
Espettorato.
Lavaggio gastrico.
Lavaggio broncoalveolare / lavaggio bronchiale.
•
Tamponi laringei (il materiale deve essere eluito dai tamponi con NaOH e il prodotto trattato
come espettorato. Se è richiesta la microscopia devono essere inviati due tamponi).
Nota: I campioni provenienti da siti sterili non richiedono decontaminazione prima di coltura.
Pre-trattamento:
Centrifugare i campioni di fluidi, se sufficientemente liquidi, ad esempio lavaggi broncoalveolari.
Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti e scartare il surnatante in disinfettante, lasciando 1 mL di
sedimento da risospendere.
Omogeneizzazione
Omogeneizzazione può essere effettuata con uno dei seguenti metodi:
1. Durante il processo di decontaminazione passare ripetutamente su vortex finché il
campione è completamente omogeneizzato.
2. Trattamento con ditiotreitolo: Sciogliere i campioni con un volume in eccesso di ditiotreitolo,
agitare o passare su vortex a intermittenza fino a quando il campione è omogeneizzato.
Centrifugare a 3000 xg per 15 minuti e scartare il surnatante in disinfettante, lasciando 1
mL per risospendere il sedimento.
3. Trattamento con N-acetil-L-cisteina (NALC): Includere NALC in fase di decontaminazione
(consultare decontaminazione di campioni con NALC-NaOH).
Decontaminazione dei campioni con NaOH
1. Aggiungere 7 ml di NaOH (0,5 N) al campione.
2. Lasciare agire l'NaOH (0,5 N) per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25° C), passare su
vortex ad intervalli regolari (per esempio ogni 5 minuti).
3. Neutralizzare il campione con 14 mL di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8).
Oppure
1. Aggiungere 2 mL di NaOH 1N (4% w/v) a 2 mL di campione.
2. Lasciare agire NaOH per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25° C), passare su vortex a
intervalli regolari. (per esempio ogni 5 minuti).
3. Neutralizzare il campione con 3 mL di tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8).
Decontaminazione dei campioni con NALC-NaOH:
1. Aggiungere al campione un uguale volume di lavoro NALC-NaOH (2% NALC e 0,5 N
NaOH, da usare eentro 48 ore dalla preparazione).
2. .Agitare la provetta in un vortex per non più di 20 secondi. Capovolgere la provetta in modo
che la NALC-NaOH venga a contatto con l'intera superficie della provetta. Evitare
agitazione eccessiva.
3...Per decontaminare il campione lasciare la provetta a stazionare per 30 min a temperatura
ambiente (20-25° C).
4 Diluire la miscela in almeno 20 mL con tampone fosfato sterile 0,067 M (pH 6,8) e
capovolgere più volte per mescolare il contenuto.
Concentrazione
Centrifugare a 3000 xg per 15 min usando contenitori chiusi all'interno della centrifuga. Scartare il
sopranatante in disinfettante lasciando 1 mL per risospendere il sedimento o risospendere in 1-2
ml 0,067 M tampone fosfato sterile (pH 6,8). (Quest'ultimo ha l'effetto aggiuntivo di aumentare
l'attività di neutralizzazione).
4.5.3 Campioni grossolanamente contaminati da batteri Gram-negativi
Questo metodo è adatto per i seguenti campioni:
• Urine.
• Cute o biopsie di tessuto da siti non sterili.
• Campioni post mortem.
• Pus, aspirati e fluidi.
Pre-trattamento
•
Centrifugare campioni fluidi, ad esempio, urina o pus se il volume di liquido è adeguato e
sufficiente, in provette sigillate a 3000 xg per 15 minuti.
•
Aprire la centrifuga e scartare con attenzione il surnatante in un contenitore con
disinfettante.
•
Macinare tutti i campioni di tessuto e versare in un contenitore universale sterile.
Sminuzzare il tessuto in piccoli pezzi con un bisturi sterile. Porre una parte del campione
in una piccola provetta sterile e conservare a ≤ -20 ° C per ripetere la coltura se
contaminata.
Decontaminazione
1. Aggiungere un uguale volume di H2SO4 (0.5N) a tutti fluidi / campioni di tessuti e lasciare
agire per 20-30 min. I tempi delle diverse fasi devono essere rivisti in funzione della
percentuale di contaminazione di laboratorio per diversi tipi di campioni.
2. Riempire il contenitore sterile con tampone fosfato 0,067 M (pH 6,8) dopo il trattamento e
la centrifugare a 3000 xg per 15 min. Scartare il sopranatante in un contenitore per rifiuti
lasciando il sedimento in circa 1 ml di liquido o risospendere in 1-2 ml di tampone fosfato
sterile 0,067 M (pH 6,8). (Quest'ultimo ha anche l'effetto di aumentare l'attività di
neutralizzazione).
4.5.4 Campioni contaminati con specie Pseudomonas
Questo metodo è adatto per espettorato o per campioni respiratori di pazienti con fibrosi cistica e
bronchite che sono presumibilmente colonizzati da specie Pseudomonas aeruginosa.
Omogeneizzazione
Consultare la sezione 4.5.2. Campioni da sedi non sterili
Decontaminazione
Aggiungere al campione una quantità sufficiente di acido ossalico al 3% fino a riempire un normale
contenitore di plastica.
1.
Aggiungere al campione nel contenitore universale di plastica una quantità sufficiente
di acido assalico al 3% per facilitarne l’omogeneizzazione e la decontaminazione.
2.
Lasciare agire l’acido per 30 minuti (o più a lungo se necessario) agitando a
intermittenza per facilitare l’omogeneizzazione e la decontaminazione.
3.
Centrifugare il campione per 15 minuti a 3000x g
4.
Decantare il sopranatante in un contenitore con disinfettante
Neutralizzazione
Neutralizzare il campione con NaOH (0.5N) o risospendere in 1-2 mL di tampone fosfato 0,067 M
(pH 6.8).
4.5.5 Procedura sul campione
Il liquido cefalorachidiano (LCR), il sangue e altri campioni da sedi normalmente sterili, o campioni
già dimostratisi privi di batteri vitali dopo esame culturale, non necessitano di decontaminazione
(consultare di seguito se il campione fluido è intensamente colorato di sangue come quelli pleurici).
Oltre alla cultura per micobatteri questi campioni dovrebbero essere saggiati con l’esame colturale
per altri patogeni (consultare B 27 - Investigation of cerebrospinal fluid, B 37 - Investigation of
blood cultures for organisms other than Mycobacterium species o con altre SMI, come appropriato)
per eliminare altre cause di infezione. Ciò indica l'assenza di altri batteri o pone in evidenza la
necessità di procedure di decontaminazione. In questa condizione considerare il ricorso a saggi
molecolari prima della procedura.
Centrifugare il LCR e gli altri campioni fluidi da sedi sterili prima della preparazione dello striscio e
della coltura (3000 xg per 15 minuti, come descritto in precedenza). "Decontaminare" i fluidi
intensamente colorati di sangue diversi dal LCR per ridurre i falsi positivi (come in 4.5.3) in quanto
può essere unna procedura appropriata prima dell'incubazione in un sistema automatizzato di
coltura liquido dotato di rivelazione della fluorescenza. Utilizzare il restante sedimento e il
surnatante (se disponibile) per la cultura. Per i campioni di LCR, dopo la semina di terreni di
coltura appropriati, aggiungere al contenitore originale un terreno liquido di coltura (ad esempio di
Kirchner), se disponibile, e incubare con gli altri terreni. In alternativa si può usare il terreno liquido
di un sistema automatico per recuperare la quantità residua.
Omogeneizzare i tessuti e le biopsie e decontaminare se necessario. Utilizzando procedure
asettiche, inoculare le biopsie dei tessuti e osso sminuzzato in piccoli frammenti, direttamente sulla
superficie di un terreno solido e di terreni di arricchimento.
4.5.6 Sistemi automatici di monitoraggio
I sistemi automatici di coltura sono raccomandati per una più rapida e agevole ricerca della
crescita dei micobatteri4. I sistemi automatici segnalano lo sviluppo dei micobatteri rilevando il
consumo di ossigeno o la produzione di CO2. Questi sistemi riducono notevolmente la media del
tempo richiesta per la crescita dei micobatteri rispetto a quelli solidi a becco di clarino100,101. I
terreni solidi sono utilizzati in associazione ai precedenti4,11,42,102 Rari isolati di M. tuberculosis si
sviluppano solo su terreni contenenti uovo, quali il becco di clarino Lowenstein Jensen (LJ) 11. Si
raccomanda un solo piruvato incorporato nel becco di clarino del LJ (o altro terreno contenente
uovo) per ottimizzare la crescita del M. bovis.11 Alcuni micobatteri non tubercolari possono non
produrre segnali di crescita nei terreni liquidi e si richiede la definizione di una valutazione
adeguata per utilizzare solo la coltura in fase liquida. La coltura su terreno solido è inoltre richiesta
per alcune tipologie di campioni quando si devono utilizzare temperature d’incubazione diverse,
come per le lesioni superficiali.
I sistemi automatici di coltura sono pure utilizzati per le prove di sensibilità, con riduzione del
tempo di risposta dei risultati a 4-12 giorni.
Nota: Se il campione ha un volume insufficiente per tutte le indagini richieste, le prove da eseguire
devono essere selezionate su indicazione clinica (consultare B 27 - Investigation of cerebrospinal
fluid).
Per ridurre il rischio di perdere colture positive, e seguendo le istruzioni del produttore per l'uso, le
colture liquide che sono in ultima analisi negative su un sistema automatico, prima di essere
scartate devono essere ispezionate visivamente per ricercare la crescita di microrganismi.
4.5.7 Cultura
Tutti i campioni sono trattati come segue:
1. Preparare i flaconi secondo le istruzioni del produttore.
2. Inoculare la superficie di un becco di clarino di Löwenstein Jensen (LJ) piruvato a pH
neutro (o altro mezzo idoneo a base d'uovo) con 0,2 mL di campione trattato e un terreno
di coltura liquido (con un volume adeguato, come specificato dal produttore).
3. Inoculare i campioni prelevati da sedi superficiali, quali la cute, in due set di terreni, uno
dei quali è incubato a 28-30° C. Usare due temperature di incubazione per i lavaggi
bronchiali con strisci positivi, perché i micobatteri che più comunemente contaminano
broncoscopi ed endoscopi preferiscono una bassa temperatura per la crescita. Anche
campioni fluidi d’ossa e articolazioni possono richiedere l’incubazione a 2 temperature
per ottimizzare il recupero di tutte le specie NTM 42. Si consideri per esempio, se il
campione è di una estremità dell'arto e/o uno striscio diretto positivo e la diagnosi di
tubercolosi non è attesa.
4. Angolare lievemente il becco di clarino per consentire al campione di inoculare l'intera
superficie. Assicurarsi che i tappi siano ben chiusi.
5. Incubare i becchi di clarino a 35-37° C per 8 settimane estendibili a 12, se necessario;
controllare tutte le settimane per verificare la presenza di eventuale sviluppo di acido
resistenti46.
6. Utilizzare sistemi di incubazione automatizzati con flaconi liquidi e incubare secondo le
istruzioni del produttore. Per piccoli volumi, protrarre il periodo di incubazione. La
percentuale d’isolamento dal LCR può essere aumentata aggiungendo un mezzo liquido
come quello di Kirchner o Middlebook 7H9 al contenitore originale e incubare a 35-37°
C- perché è noto che i micobatteri aderiscono alle pareti dei contenitori di plastica. In
alternativa, si lavare il contenitore originale con il brodo da flacone di coltura
automatizzata.
7.
.Conservare
il sedimento inutilizzato trattato in caso i campioni debbano essere
decontaminati. Se non è necessario per altri saggi, l'intero campione del LCR deve
essere posto in coltura per ottimizzare la percentuale di isolamento.
8. Confermare la presenza di bacilli acido resistenti (AFB) in coltura positiva con colorazione
di Ziehl-Neelsen o auramina-fenolo. La prima può essere preferita per il maggiore
dettaglio morfologico ottenuto. Quando eseguita su flaconi con liquido di coltura positivo
si raccomanda di effettuare la colorazione Gram per consentire il rilevamento di
contaminazione e/o una piastra di agar sangue predisposta per lo stesso scopo.
9. Inviare aliquote delle culture confermate positive (in contenitore impermeabile con
marchiatura CE inserito sacchetto di plastica sigillato) al Laboratorio di Riferimento
competente, in conformità alle regolamentazioni postali e del trasporto75.
10. Controllare la proliferazione batterica nella fase post decontaminazione utilizzando
piastre di purificazione.
Nota: Predisporre entro un giorno lavorativo dal ricevimento la coltura automatica in fase liquida
associata a quella convenzionale solida per almeno un campione per ogni tipologia di campione.
Per soddisfare lo standard diagnostico raccomandato dal Department of Health Guideelines i
laboratori devono prestare servizio per 6 giorni lavorativi4.
4.5.8 Prove amplificazione acidi nucleici
I saggi di amplificazione degli acidi nucleici (NAAT) sono appropriati come metodo primario di
diagnostica in alcune circostanze3. Per una discussione più dettagliata, si veda l'introduzione.
1. Le prove diagnostiche rapide per M. tuberculosis complex su campioni primari devono essere
utilizzate solo se:
•
La conferma rapida di una diagnosi di TB per le persone con striscio dell’espettoratopositivo deve essere in grado di modificare la loro condizione di assistenza,
o
• Prima di procedere a iniziative estese per rintracciare i contatti.
2. I clinici dovrebbero considerare anche una diagnosi di TB non respiratoria se le prove
diagnostiche rapide sono negative, ad esempio nel liquido pleurico, LCR e urina.
3. Sintomi clinici e altri risultati di laboratorio coerenti con meningite TB dovrebbero portare a un
trattamento, anche se il saggio di diagnosi rapida è negativo, perché sono gravi le potenziali
conseguenze per il paziente.
4. Prima di intraprendere una grande iniziativa per rintracciare i contatti (per esempio, in una
scuola o un ospedale), le specie di Mycobacterium dovrebbero essere confermate come
appartenenti al complesso M. tuberculosis con prove su materiali quali strisci positivi al
microscopio o con coltura positiva. Utilizzare Il criterio clinico se le prove sono inconcludenti o
ritardate.
5. Se la valutazione suggerisce un paziente a rischio da ceppo di TB multi-resistente (MDR):
•
La prova di diagnosi rapida dovrebbe essere condotta per la resistenza alla rifampicina.
•
Le misure di controllo delle infezioni e il trattamento per la tubercolosi MDR devono essere
iniziate come indicato dal NICE.
6. Le prove diagnostiche rapide per l'identificazione M. tuberculosis complex dovrebbero essere
effettuate su materiale bioptico solo se:
•
Tutto il campione è stato impropriamente messo in formalina e
•
I bacilli acido-resistenti sono visibili al microscopio.
Tutti gli accertamenti NAAT devono essere effettuati in conformità con le istruzioni del produttore.
Idonei campioni clinici dovrebbero essere in teoria inviati per la microscopia convenzionale AFB e
l’esame colturale, come descritto in precedenza.
4.5.9 Terreni di coltura, condizioni e microrganismi
Aspetti clinici
Condizioni
Terreni
Standard
Sistemi
automatici liquidi
Incubazione
Temp oC
Atmos
Tempo
35 - 37
Aria
Seguire
istruzioni
produttore
Lettura
colture
Microrganismo(i)
bersaglio
Continua*
Specie
Mycobacterium
e
Tutti I campioni
LJ + piruvato
35 - 37
Aria
8 settimane
estendibili a 12
settimane se
richiesto
35 - 37
Aria
Seguire
istruzioni
produttore
NB BCG e
M.xenopi non
crescono bene
sul terreno con
piruvato
preferendo il
glicerolo
Sangue
Tutti gli aspirati
midolari
Sistemi
automatici liquidi
Settimanale
Specie
Mycobacterium
Continua*
Specie
Mycobacterium
Per queste situazioni, aggiungere::
Aspetti clinici
Condizioni
Infezione cute
Terreni
supplementari
LJ + piruvato
Incubazione
Lettura
colture
Temp oC
Atmos
Tempo
28 - 30
Aria
8 settimane
estendibili a
12 settimane
se richiesto
‘granuloma
vasca pesci’
Settimanale
Microrganism
o(i) bersaglio
M. marinum
M. ulcerans
Ulcera cutanea
(o “Buruli” o
ulcera di
“Bairnsdale)
Striscio + ve
BAL/lavaggio
Considerare
fluidi ossei e
articolari come
estremità e/o
strisci diretti
positivi
4-6 settimane
LJ + piruvato
28 – 30
Aria
LJ + piruvato
28 - 30
Aria
Settimanale.
8 settimane
estendibili a
12 settimane
se richiesto
Settimanale
Micobatteri a
rapida crescita
Micobatteri
nontubercolari
Se si usano sistemi automatici, dopo decontaminazione fare riferimento alle raccomandazioni del produttore.
*
Utilizzare una piastra di agar sangue per il flacone con segnale positivo per verificare la contaminazione..
Possono essere richiesti supplementi addizionali per l’isolamento di specie micobatteriche esigenti.
Note: In alcune circostanze è appropriata la prova con NAAT, consultare la sezione 4.5.8.
4.6
Identificazione
Fare riferimento alle single SMI per l’identificazione dei microrganismi.
I microrganismi possono essere successivamente identificati se clinicamente ed
epidemiologicamente appropriato.
4.6.1 Livello minimo di identificazione in laboratorio
Livello genere Mycobacterium (si avvale della colorazione della coltura con Ziehl-Neelsen o
auramina-fenolo dalla coltura).
Identificare almeno un AFB isolato da ogni nuovo paziente a livello di complesso/specie, ed
eseguire prove di sensibilità adeguate se sono stati identificati MTBC4. Queste sono di solito
eseguite in un laboratorio di riferimento per micobatteri (elencati di seguito).
Ripetere gli accertamenti per gli AFB isolati dallo stesso paziente e le prove di sensibilità per
MTCB se l’isolato proviene da un campione raccolto 3 mesi o più dopo un precedente l’isolamento
di microrganismo MTBC4.
4.7 Prove di Sensibilità agli Antimicrobici
Fare riferimento alle linee guida della British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) e/o
EUCAST.
Consultare il National Mycobacterium Reference Laboratory ed i Regional Centers for
Mycrobiology secondo richiesta. E’ raccomandato un uso prudente degli antimicrobici in accordo
con i protocolli locali e nazionali.
Almeno un isolato di AFB di ogni nuovo paziente deve essere identificato come livello di
complesso/specie ed eseguita una prova adeguata di sensibilità se si è identificato un MTBC4.
Ripetere per gli AFB isolati dallo stesso paziente l’identificazione e un nuovo e test di sensibilità
MTBC se isolato da un campione prelevato tre mesi o più dopo una precedente positività per MTBC4
4.8 Invio per Ricerche su Focolaio Epidemico
N/D
4.9 Invio ai Laboratori di Riferimento
Per informazioni sulle prove disponibili, tempi di risposta, procedure per il trasporto e altre richieste
del laboratorio di riferimento, click here for user manuals and request forms.
Microrganismi con resistenze insolite o inattese, o qualora sussista un problema clinico o di
laboratorio, o anomalie che richiedano approfondimenti devono essere inviati agli appropriati
laboratori di riferimento.
Contattare l’appropriato laboratorio nazionale di riferimento per informazioni sulle prove disponibili,
tempi di consegna, procedure di trasporto ed eventuali altri richieste per ‘invio del campione:
Inghilterra e Galles
http://www.hpa.org.uk/webw/HPAweb&Page&HPAwebAutoListName/Page/1158313434370?p=11
58313434370
Scozia
http://www.hps.scot.nhs.uk/reflab/index.aspx
Irlanda del Nord
http://www.publichealth.hscni.net/directorate-public-health/health-protection
Nota: Inviare solo isolati AFB positivi. Se l'invio è di altro materiale, prima prendere accordi con il
laboratorio di riferimento. Conservare una aliquota o la coltura in attesa di referto finale.
Gli isolati per l’identificazione e prove di sensibilità devono essere inviati al Center for
Mycobacteriology (RCM) entro un giorno lavorativo dal rilievo della positività della coltura4. Se è
®
usato il sistema Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT ) la coltura deve essere incubata
per altre 48 ore prima della spedizione per ottenere una biomassa adatta. Gli isolati dovrebbero
pervenire al Regional Centre for Mycobacteriology entro un giorno lavorativo dall’invio4.
Inviare al laboratorio di riferimento, ove sussistano indicazioni epidemiologiche, isolati associati a
epidemie, microrganismi con resistenze inusuali o inattese, ove sussista un problema di laboratorio
o clinico od anomalie che richiedano approfondimenti –se non inviati in precedenza.
Potranno essere richieste indicazioni tecniche per coltura rapido o altri servizi al National
Mycobacterium Reference Laboratory (NMRL) e al RCM:
National Mycobacterium Reference Laboratory
Abernethy Building
Institute of Cell and Molecular Science (ICMS)
2 Newark Street,
Whitechapel
London
E1 2AT
Tel: 020 7377 5895
Regional Centres for Mycobacteriology
Health Protection Agency West Midlands, Birmingham Laboratory
Birmingham Heartlands Hospital
Bordesley Green East
Birmingham
B9 5SS
Tel: 0121 424 3247
Newcastle HPA Regional Mycobacterial Reference Laboratory
Level 2
Freeman Hospital
High Heaton
Newcastle upon Tyne
NE7 7DN
Tel: 0191 282 1150
Public Health Wales, Microbiology Cardiff
Department of Microbiology
Regional Centre for Mycobacteriology
Llandough Hospital
Penlan Road
Penarth
Vale of Glamorgan
CF64 2XX
Tel: 029 2071 6408
Northern Ireland Mycobacterial Reference Laboratory
Microbiology Department
Kelvin Building
Royal Victoria Hospital
Grosvenor Road
Belfast
BT12 6BA
Scottish Mycobacterium Reference Unit
Royal Infirmary of Edinburgh
Little France
Edinburgh
EH16 4SA
Tel: 0131 242 6016
Inviare ai Regional Reference Laboratory per procedure di colorazione e tipizzazione.
5 Procedura di Refertazione
5.1
Microscopia
Refertare presenza o assenza di AFB.
Tempo di refertazione microscopica
Il risultato microscopico deve essere refertati entro un giorno lavorativo dal ricevimento del
campione4,10.
I nuovi risultati positivi devono essere comunicati telefonicamente a un clinico responsabile
dell’assistenza al paziente4.
5.2
Coltura
Positiva
Isolata specie Mycobacterium (associare una osservazione sull’identificazione di potenziali
Micobatteri non tubercolari, se appropriata, secondo i protocolli locali)
Negativa
Non isolate specie Mycobacterium .
Tempo refertazione coltura
Comunicare quando disponibili i risultati delle nuove colture positive e quelli clinicamente urgenti.
Per rispettare I criteri accettati a livello internazionale, i campioni devono essere posti in coltura e i
bacilli isolati identificati entro 21 giorni dal ricevimento in laboratorio del campione per almeno il
90% di loro4.
Emettere i referti negativi dei sistemi automatici liquidi secondo le istruzioni del produttore.
Emettere il referto negativo dopo 8 -12 settimane se si è usata una coltura su terreno solido.
Comunicare quando disponibili i risultati delle nuove colture positive e quelli clinicamente urgenti.
5.3
P rove di Sensibilità agli Antimicrobici
Refertare le sensibilità come clinicamente suggerito.
Per i MTBC, i risultati delle prove di sensibilità dei principali agenti terapeutici (es. isoniazide,
rifampicina, pirazinamide, etambutolo) dovrebbero essere disponibili entro 30 giorni dal
ricevimento del campione nel laboratorio che ha ricevuto il materiale per ≥ 95% dei campioni4.
Questi risultati devono essere disponibili entro 14 giorni se il MTBC isolato è stato ricevuto dal
laboratorio specializzato per prove di sensibilità.
5.4. Referto di tipizzazione ceppo
I 24 loci MIRU-VNTR sono refertati dai Mycobacterial Reference Laboratories via MycoNet con
una Stringa di 24 cifre nello stesso ordine, vale a dire:
•
5 ETRS: A, B, C, D, E, seguita da Dieci Mirus: 2,10,16,20,23,24,26,27,39,40; Seguito da
•
9 VNTR: 424,1955,2163 b, 2347,2401,3171,3690,4052,4156.
Se un locus contiene più di 9 ripetizioni, sono utilizzate le lettere maiuscole per indicare il numero
di copie (A per 10 e cosi via).
Se è presente una delezione parziale in ETR-D, allora tutte le ripetizioni sono contate compresa la
ripetizione parziale, e la presenza della ripetizione parziale è Indicata nel conteggio da un a'.
E’ stato raccomandato che dovrebbe essere disponibile un genotipo MIRU-VNTR per ogni nuovo
isolato di MTBC, inserito nella Banca Dati Nazionale entro 21 giorni dal ricevimento dal laboratorio
di riferimento per ≥ 95% degli isolati4.
6 Notifica al PHE103,104 o Equivalente105-108
Le Norme di Denuncia del 2010 rendono obbligatorio ai laboratori diagnostici di denunciare alla
Public Health England (PHE) tutti i casi nei quali s’identificano gli agenti causali elencati nella
Scheda 2 della Direttiva. Le denunce devono pervenire per scritto, su carta o per via elettronica,
entro sette giorni. I casi urgenti devono essere notificati il più presto possibile verbalmente: si
raccomanda entro le 24 ore. Questi stessi devono essere in seguito denunciati in forma scritta entro
sette giorni.
Secondo la Notification Regulations il laboratorio ricevente la notifica è l’ufficio locale della PHE.
Se il caso è già stato notificato da un professionista medico abilitato, al laboratorio diagnostico è
ancora richiesta la denuncia del caso qualora si riscontrino evidenze d’infezione imputabili ad
agenti causali soggetti a tale disposizione.
La denuncia secondo la Direttiva dell’Health Protection (Notification) Regulations 2010 non
sostituisce l’informazione volontaria alla PHE. La maggior parte dei laboratori del NHS segnala
spontaneamente al PHE gran parte delle diagnosi di laboratorio sostenute da vari agenti eziologici
e molte sezioni della PHE hanno definito accordi con i laboratori locali per segnalazioni urgenti di
alcuni tipi d’infezione. Queste iniziative devono continuare.
Nota: La linea guida dell’Health Protection Legislation Guidance (2010) include la segnalazione
per Human Immunodeficiency Virus HIV & Sexually Transmitted Infections STIs, Healthcare
Associated Infections e HCAIs e Creutzfeldt–Jakob disease CJD da includere nel ‘Notification
Duties of Registered Medical Practitioners’, e non al ‘Notification Duties of Diagnostic
Laboratories’.
http://www.hpa.org.uk/Topics/InfectiousDiseases/InfectionsAZ/HealthProtectionRegulations/
Esistono accordi diversi in Scozia105,106, Galles107 e Irlanda del Nord108 .
Appendice: Ricerca nei Campioni Clinici di specie
Mycobacterium:
Prepare tutti i campioni
Tutti i campioni
Sistemi liquidi
automatizzati
Incubare a 35-37 C
Aerobiosi
Seguire le
indicazioni del
produttore
Monitoraggio
continuo
Sangue
Infezioni della cute “granuloma da
vasca dei pesci”
Ulcera cutanea
(Ulcera di Buruli o di Baimsdale)
Considere osso e liquido articolare,
es. da estreità e/o striscio diretto
LJ + piruvato
Sistemi liquidi
automatizzati
LJ + piruvato
Incubare a 35-37 C
Aerobiosi
8 settimane, fino a
12 settimaane*
Lettura settimanale
Incubare a 35-37 C
Aerobiosi
Seguire le
indicazioni del
produttore
Monitoraggio
continuo
Incubare a 28-30 C
Aerobiosi
8 settimane, fino a 12
settimaane*
Lettura settimanale
Striscio + ve BAL/
lavaggio
LJ + piruvato
Incubare a 28-30 C
Aerobiosi
4-8 settimane,
Lettura settimanale
Specie Mycobacterium
Specie Mycobacterium
M. marinum
M. ulcerans
Micobatteri non
tubercolari
In alcune circostanze la prova NAAT è appropriata, consultare sezione 4.5.8
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Ricerche Microbiologiche Standard del Regno Unito

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