Review - Blood Transfusion
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Review - Blood Transfusion
Review Universal red blood cells Federico Morelli Servizio di Immunoematologia e Trasfusionale, Azienda Ospedaliera Ospedale San Martino di Genova e Cliniche Universitarie Convenzionate (Responsabile: Dott. Mauro Valbonesi) Introduction Introduzione The aim of Transfusion Medicine is to make the transfusion of blood between individuals of the same species both possible and safe. Incompatibility reactions caused by different antigens on the red blood cells were a clinically unexplainable and irresolvable problem until Landsteiner discovered the blood group antigens of the ABO system: the classification of donors and recipients finally allowed transfusion therapy to used with reasonable success1. In our times, just over a century later, ABO typing remains the cornerstone to blood transfusion: the whole system, in its various stages of collection, distribution and transfusion, is based on this typing. Nevertheless, transfusion of ABO incompatible units is still the main cause of transfusion accidents with a fatal outcome2,3. Eliminating the need to type for the ABO group would be a scientific revolution of the same grandeur as that triggered by Landsteiner's discoveries. Italian transfusion legislation does already accept the use of universal red blood cells (RBC) in situations in which transfusion is needed so urgently that ABO and RhD that typing cannot be carried out: these RBC are group O RhD negative4,5. Unfortunately, O RhD negative blood is rare. Moreover, there are some clinical situations in which this approach is not adequate. In patients transfused occasionally but who have a rare phenotype and/or are immunised against public antigens, in autoimmune haemolytic anaemias, in patients receiving multiple transfusions, and in the chronic anaemias even the non-ABO/RhD minor blood group Scopo della Medicina Trasfusionale è rendere possibile e sicura la trasfusione di sangue tra individui della stessa specie. Le reazioni da incompatibilità dovute alle differenze antigeniche sui globuli rossi (RBC) hanno costituito un problema clinico inspiegabile e insolubile fino a quando Landsteiner scoprì i caratteri gruppoematici del sistema ABO: la classificazione di donatori e pazienti permise finalmente di effettuare con buon successo la terapia trasfusionale1. Ai nostri giorni, un secolo dopo, la tipizzazione ABO rimane ancora il cardine della trasfusione del sangue: l'intero sistema, nelle sue fasi di raccolta, distribuzione e trasfusione, non può farne a meno. Tuttavia l'infusione di unità ABO incompatibili è ancora la principale causa di incidenti trasfusionali ad esito fatale2,3. Eliminarne la necessità innescherebbe una rivoluzione scientifica pari a quella innescata da Landsteiner. La normativa trasfusionale italiana già prevede l'utilizzo di emazie universali nei casi che necessitano di trasfusione talmente urgente da non consentire di effettuare la tipizzazione ABO e RhD: esse sono di gruppo O RhD negativo4,5. Le emazie O RhD negativo però sono rare; inoltre, ci sono alcune situazioni cliniche in cui questo approccio non è sufficiente. Nei pazienti trasfusi occasionalmente ma di fenotipo raro e/o immunizzati verso antigeni ad alta diffusione, nelle anemie emolitiche autoimmuni, nei politrasfusi e nelle anemie croniche anche i sistemi gruppoematici minori non ABO/RhD acquistano rilievo: circa il 30% di falcemici e thalassemici sviluppano alloanticorpi immuni clinicamente significativi6,7. Questi soggetti, che oggi vengono ipertrasfusi e vivono molto Correspondence: Dott. Federico Morelli Via dei Vassalli 2/1 16167 Genova 224 Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs antigen systems become relevant: about 30% of patients with sickle cell anaemia or thalassaemia develop clinically significant alloantibodies6,7. Such patients, who are nowadays transfused with many units of blood and live for much longer, often belong to particular ethnic groups and marked antigenic differences between the donor and recipient stimulate the production of antibodies against ubiquitous or high frequency antigens: in this way these patients can become practically untransfusable8,9. It is then necessary to turn to an international registry of donors with rare phenotypes (e.g. the International Donor Panel of the World Health Organisation, WHO IDP), whose development requires considerable organisational and financial resources10,11. An alternative could be to use red blood cell substitutes with the following features: a total block of antigenic sites, normal survival in the circulation, and negative compatibility tests. Such a therapeutic alternative does not yet exist. The perfluorocarbonates and haemoglobin solutions, although acellular and without problems of compatibility, have a very short half-life (in the order of hours) and are appropriate only for urgent or emergency oxygen delivery12,13. Two different strategies have been conceived and developed to obtain the so-called "universal" red blood cells: one involves enzymatic removal of the antigenic determinants on the membrane of the red blood cell, the other is based on chemically masking these antigenic sites with polymers. The development of efficient methods to obtain universal RBC would prevent ABO-incompatibility transfusion errors, prevent large scale immunisation of patients and allow trouble-free transfusion of those already immunised. Group O red blood cells obtained by enzymatic removal of A and B antigens It has been known since the 1930s that some bacterial lysates can destroy A, B and H reactivity14: in detail, bacterial enzymes of Clostridium tertium, Bacillus cereus and Trichomonas foetus destroy, respectively, the A, B and H antigens15-17. When the A and B specificities disappear, H reactivity increases and two sugars, N-acetylgalactosamine (NacGal) and galactose (Gal), respectively, are produced. When reactivity to the H antigen is also lost, the only reactivity to remain is that against anti-pneumococcus type XIV antiserum and fucose (Fuc) is obtained. On the basis of this knowledge a biochemical and genetic scheme was first hypothesised18 (in the 1940s and Blood Transf 2003; 3: 224-43 più a lungo, spesso appartengono a gruppi etnici particolari, e la spiccata differenza antigenica tra donatore e ricevente stimola la produzione di anticorpi verso antigeni ubiquitari o ad alta incidenza: così essi possono diventare praticamente intrasfondibili8,9. Diventa allora obbligatorio il ricorso ai registri internazionali di donatori con fenotipi rari (International Donor Panel dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, WHO IDP), il cui sviluppo richiede sforzi organizzativi ed economici non indifferenti10,11. Una possibile alternativa potrebbe essere il ricorso a sostituti eritrocitari che presentino i seguenti requisiti: un blocco totale dei siti antigenici, una normale sopravvivenza in circolo ed esami di compatibilità negativi. Un simile presidio terapeutico ancora non esiste. I perfluorocarbonati e le soluzioni di emoglobina, pur essendo acellulari e non presentando problemi di compatibilità, hanno emivita in circolo assai breve (nell'ordine di ore) e sono adatti soltanto al supporto ossiforetico nell'urgenza-emergenza12,13. Per ottenere emazie cosiddette "universali" sono state concepite e sviluppate due differenti strategie: la rimozione per via enzimatica dei determinanti antigenici di membrana o il mascheramento chimico con polimeri dei siti antigenici. Lo sviluppo di metodiche efficaci consentirebbe di evitare l'errore trasfusionale ABO, di prevenire su larga scala l'immunizzazione dei pazienti e di trasfondere senza problemi clinici quelli già immunizzati. Emazie di gruppo O ottenute mediante rimozione enzimatica degli antigeni A e B Fin dagli anni '30 è noto che alcuni lisati batterici hanno la capacità di distruggere le reattività A, B e H14: in particolare, gli enzimi batterici di Clostridium tertium, Bacillus cereus e Trichomonas foetus distruggono rispettivamente gli antigeni A, B e H15-17. Quando le specificità A e B scompaiono, aumenta la reattività H e si ottengono come prodotti due zuccheri, rispettivamente Nacetilgalattosamina (NacGal) e galattosio (Gal); quando anche questa reattività viene perduta rimane solamente quella con l'antisiero anti-pneumococco tipo XIV e si ottiene fucosio (Fuc). Su queste basi è stato prima ipotizzato18 (negli anni '40 e '50) e poi elaborato (negli anni '70) uno schema biochimico e genetico idoneo a spiegare la formazione degli antigeni ABO e Lewis sulle emazie e nelle secrezioni19,20. Gli antigeni ABO sono il risultato dell'interazione dei geni ABO, Hh, Lewis (Lele) e secretore (Sese): i prodotti dei geni A, B, H e Lele sono glicosiltrasferasi che trasferiscono gli zuccheri 225 F Morelli Figura 1 - Schematic representation of A, B and H oligosaccharide structures on erythocyte membrane. Group A1 specificity present a repetitive structure. Black arrows indicate sites of glucoside activity for the enzymatic conversion (A→O e B→O) R = glycoprotein or glycolipid radical, Nacgal = N-acetyl-D-galactosamine, Nacglu = N-acetyl-glucosamine, gal = Dgalactose, fuc = L-fucose 1950s) and then refined (in the 1970s). This scheme was intended to explain the formation of the ABO and Lewis antigens on red blood cells and in secretions19,20. The ABO antigens are the result of interactions between the ABO, Hh, Lewis (Lele) and secretor (Sese) genes: the products of the A, B, H and Lele genes are glycosyltransferases which transfer the immunodominant sugars for A (NacGal), B (Gal), H (Fuc) and Lewis (Fuc) onto the terminal β1galactose-Nβ1acetylglucosamine (Galβ1-Nβ1acGlc) disaccharide unit of the glycoprotein or glycolipid structures of the membrane. Originally two types of oligosaccharide precursors were described: type 1 chains, in which the Galβ1-Nβ1acGlc bond is of a 1→3 type, are found in secretions but can be absorbed onto blood cells, while the type 2 chains have a 1→4 Galβ1Nβ1acGlc bond and belong to the red blood cells21. Subsequently, a new type of oligosaccharide precursor was identified, expressed exclusively on glycolipids and red blood cells carrying the A antigen: this so-called type 3 chain is formed of β1galactose-Nα1acetylgalactosamine (Galβ1-Nα1acGal) with a 1→3 bond and is a repetitive structure in the A1 phenotype22 (Figure 1). Finally, again in A subjects, a fourth precursor with a globular structure 226 immunodominanti per A (NacGal), B (Gal), H (Fuc) e Lewis (Fuc) sull'unità terminale disaccaridica β1galattosoNβ1acetilglucosamina (Galβ1-Nβ1acGlc) di strutture glicoproteiche o glicolipidiche della membrana. Sono stati descritti originariamente due tipi di precursori oligosaccaridici: le catene di tipo 1, in cui il legame Galβ1Nβ1acGlc è di tipo 1→3, si trovano nelle secrezioni ma possono venire adsorbite sulle emazie, mentre le catene di tipo 2, in cui il legame Galβ1-Nβ1acGlc è di tipo 1→4, sono proprie dei globuli rossi21. Successivamente, è stato evidenziato un nuovo tipo di precursore oligosaccaridico, espresso esclusivamente su glicolipidi e su eritrociti recanti l'antigene A, denominato catena di tipo 3, formato da β1galattoso-Nα1acetilgalattosamina (Galβ1-Nα1acGal) con legame di tipo 1→3 e di struttura ripetitiva nel fenotipo A122 (Figura 1). Infine, sempre in soggetti A, è stato identificato un quarto precursore, di struttura globosidica, chiamato globo-A o catena di tipo 4, presente in minima quantità sulle emazie22. L'esposizione sequenziale di nuove strutture antigeniche, causata dalla rimozione di zuccheri mediante trattamento enzimatico con eso-glicosidasi, non ha suggerito soltanto il percorso biosintetico dei determinanti Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs was identified: this A globoside or type 4 chain is present in very small quantities on blood cells22. The sequential exposure of new antigenic structures, caused by the removal of sugars by enzymatic treatment with exoglycosidases, not only suggested the biosynthetic pathway of the ABO determinants, but also revealed how antigenic structures can appear and disappear during normal cell differentiation and how epitopes, which are normally deeply hidden, re-appear on the surface when, during neoplasia, there is a defect of gene expression and/ or enzyme activity22. This gave rise to the attempt to convert A and B red cells into O erythrocytes (Erythrocyte Conversion in O, ECO) by removing the respective immunodominant sugars (NacGal and Gal) using appropriate exoglycosidases of nonbacterial origin: αN-acetylgalactosaminidase for group A and α-galactosidase for group B (Figure 1). This latter enzyme, extracted from coffee beans23, was used clinically for the first time over 20 years ago at the New York Blood Center when it successfully produced small quantities of B→O converted blood cells24 which, following labelling with 51Cr, were transfused without consequences25: the physical and functional characteristics of these cells remained unchanged and their survival was normal even after repeated administrations26. The studies continued with transfusion of whole units of converted B→O units into normal A and O volunteers27,28 without any clinical or laboratory signs of reaction developing, except for an occasional increase in anti-B titre, which did not compromise erythrocyte survival or expected increases in haemoglobin even after transfusion of further converted units29. Finally, in 2000, a randomised, phase II, clinical study was carried out in non-immunised, transfusion-dependent, adult, group A or O patients who were transfused randomly with B→O converted units or control units of group O red blood cells30. Forty-one units of B red cells were manipulated with a recombinant version of the α-galactosidase enzyme derived from coffee beans; the antigenic conversion was checked by diagnostic monoclonal antisera of murine origin. The mean haemoglobin concentration of the B→O blood, identical prior to treatment to that of the group O control units, dropped by 11% during the enzymatic conversion procedure, probably as a result of washing. The mean increase in Hb in the patients per unit of converted B→O red cells transfused was 5% lower than that produced by the O control units. The in vivo safety and efficacy of the transfusion of the B→O converted blood was confirmed, but some in vitro serological abnormalities similar to those observed in the phase I clinical studies were found25-29. Blood Transf 2003; 3: 224-43 ABO, ma ha anche rivelato come le strutture antigeniche possano apparire e scomparire durante la normale differenziazione cellulare e come epitopi, che sono di norma profondamente indovati, riappaiano in superficie qualora, in corso di neoplasie, vi sia un difetto di espressione genica e/o di attività enzimatica22. Da ciò deriva il tentativo di convertire emazie A e B in emazie O (Erythrocyte Conversion in O, ECO) rimuovendo i rispettivi zuccheri immunodominanti (NacGal e Gal) mediante appropriate esoglicosidasi di origine non batterica: αN-acetilgalattosaminidasi per il gruppo A e α-galattosidasi per il gruppo B (Figura 1). Quest'ultimo enzima, ricavato da semi verdi di caffè23, venne utilizzato a scopo clinico per la prima volta oltre vent'anni fa al New York Blood Center per ottenere con successo piccole quantità di emazie B→O convertite24 che poi, previa marcatura con 51Cr, furono trasfuse senza conseguenze25: esse mantenevano intatte le loro caratteristiche fisiche e funzionali e la loro sopravvivenza rimaneva normale anche dopo ripetute somministrazioni26. Gli studi proseguirono con la trasfusione di intere unità di emazie B→O convertite in volontari normali A e O27,28 senza che si verificasse alcun segno clinico o laboratoristico di reazione, fatta eccezione per occasionali aumenti del titolo anti-B, che, comunque, non compromettevano la sopravvivenza eritrocitaria e gli incrementi emoglobinici attesi anche in caso di trasfusione di ulteriori unità convertite29. Nel 2000 è stato finalmente realizzato uno studio clinico random di fase II su pazienti adulti trasfusione-dipendenti non immunizzati di gruppo A o O, cui sono state somministrate casualmente unità di emazie B→O convertite e unità di controllo di gruppo O30. Quarantuno unità di emazie B sono state trattate con una versione ricombinante, ricavata da semi di caffè, dell'enzima α-galattosidasi; l'avvenuta conversione è stata controllata con antisieri diagnostici monoclonali di origine murina. La concentrazione emoglobinica media delle emazie B→O, sovrapponibile prima del trattamento a quella delle unità di controllo di gruppo O, si è abbassata dell'11% dopo il processo di conversione enzimatica, probabilmente a causa del lavaggio. L'incremento medio di Hb nei pazienti per unità B→O trasfusa è risultato del 5% inferiore rispetto alle unità di controllo O. La sicurezza e l'efficacia in vivo della trasfusione di emazie B→O convertite sono state confermate, ma sono state parimenti riscontrate in vitro alcune anormalità sierologiche simili a quelle osservate negli studi clinici di I fase25-29. Cinque dei diciannove pazienti che hanno ricevuto emazie B→O convertite hanno sviluppato un significativo incremento del titolo anti-B, e due di essi hanno dimostrato crossmatch incompatibili 227 F Morelli Five of the nineteen patients who received B→O converted red cells developed a significant increase in anti-B titre, and two of these showed incompatible antiglobulin crossmatching with the same B→O blood cells. The first finding probably reflects an immune response to a modest residue of B epitopes (0.8 x 106 present on the red cell membrane before enzyme treatment), whose weak antigenic expression does not, however, cause appreciable haemolysis. More complicated, and potentially more worrying, are the causes of the second problem: residual B epitopes or neoantigens? Although the enzyme removes the terminal galactose of the P1 and Pk globular antigens, no cryptic antigen as ever been revealed so far25. On the other hand, if the exogalactosidase cannot remove the galactose from the less accessible oligosaccharide chains, the same conformation which protects from enzymatic attack could provide antigenic configurations less readily recognisable by the immune system. Alternatively, antibodies that recognise characteristics in common between A and B antigens ("A, B" epitopes) could play a role31. It is clear that B→O red cell conversion alone would not constitute a significant advantage in either financial terms of increasing blood resources or in terms of improving transfusion safety. Although a small percentage of B units reaching expiry could be recuperated by enzymatic B→O conversion, thus increasing available resources, the minimal saving obtained would not cover the cost of the enzyme treatment. Furthermore, the production of B→O and AB→A converted blood would not prevent the sometimes fatal complications of ABO transfusion errors. The beneficial effect of enzyme treatment will only be fully appreciated if large scale total conversion of red cell collections to group O can be achieved, and for this to happen group A units must also be amenable to enzyme treatment. Unfortunately, the biochemical complexity of the A antigen has created unexpected problems. The first attempts to transplant ABO-incompatible solid organs go back to the 1960s. These attempts were unsuccessful. However, since the waiting list of group O patients was very long, both because of the general lack of organs and because of the use of group O organs for non-O recipients, at the beginning of the 1970s the first clinical attempts to overcome the ABO barrier were made, using organs with low expression of incompatible antigens: A2→O, A2B→B. It was precisely then that it was demonstrated that the expression of A antigens on the red cells of A2 individuals was much weaker than that of A1 individuals32. Furthermore, experiments on skin transplants showed that O recipients immediately rejected skin transplants from 228 all'antiglobulina con le stesse emazie B→O. Il primo dato probabilmente riflette una risposta immune a un modesto residuo di epitopi B (presenti in numero di 0,8 x 106 sulla superficie eritrocitaria prima del trattamento enzimatico), la cui debole espressione antigenica non sembra comunque determinare emolisi apprezzabile. Più oscure, e potenzialmente preoccupanti, le cause del secondo problema: residui B o neoantigeni? Sebbene l'enzima utilizzato rimuova anche il galattosio terminale degli antigeni globosidici P1 e Pk, non è mai stato rivelato finora alcun antigene criptico 25 . D'altra parte, se la esogalattosidasi non riesce a rimuovere il galattosio dalle catene oligosaccaridiche meno accessibili, la stessa conformazione che protegge dall'attacco enzimatico potrebbe fornire configurazioni antigeniche meno direttamente riconoscibili dall'apparato immunitario. Oppure potrebbero avere un ruolo anticorpi che riconoscono caratteristiche comuni ad A e B (epitopi "A, B")31. È evidente che la conversione eritrocitaria B→O da sola non costituirebbe un significativo vantaggio né in termini economici di aumento della risorsa sangue né in termini di miglioramento della sicurezza trasfusionale. Sebbene una piccola percentuale di unità B che giungono a scadenza potrebbe, mediante la conversione enzimatica B→O, essere recuperata, incrementando così le risorse disponibili, l'esiguo risparmio ottenuto non coprirebbe il costo del trattamento enzimatico. Inoltre, la produzione di emazie convertite B→O e AB→A non consentirebbe di prevenire le talvolta fatali complicanze dell'errore trasfusionale ABO. L'effetto benefico del trattamento enzimatico si apprezzerebbe pienamente soltanto con la totale conversione su larga scala della raccolta eritrocitaria al gruppo O, e per ottenere ciò è necessario avviare anche le unità A al trattamento enzimatico. Malauguratamente, la complessità biochimica dell'antigene A ha creato imprevedibili problemi. Fin dagli anni '60 erano stati tentati i primi trapianti ABO-incompatibili di organi solidi con esito negativo. Tuttavia, poiché la lista di attesa per i pazienti di gruppo O era molto lunga a causa sia della carenza generale di organi sia dell'uso di organi di gruppo O per riceventi non-O, all'inizio degli anni '70 vennero effettuati i primi tentativi clinici di superare la barriera ABO, usando organi con antigeni incompatibili di bassa espressività: A2→O, A2B→B. Proprio allora era stato dimostrato che l'espressività degli antigeni A sulle emazie di individui A2 era molto più debole rispetto agli A132. Inoltre, gli esperimenti di trapianto cutaneo avevano dimostrato che riceventi O rigettavano immediatamente la pelle trapiantata da individui A1 e B, mentre il rigetto iperacuto non si verificava se il lembo cutaneo proveniva Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs A1 and B donors, while hyperacute rejection did not occur with skin flaps from A2 subjects. Ceppellini et al. predicted, as would be later confirmed, that it would be possible to carry out solid organ transplants successfully from A2 subjects to O recipients33. We now know that A1 subjects not only express quantitatively more A epitopes in tissues than do the A2 subjects, but there are also qualitative differences between the two subgroups. The gylcosyltransferase of A1 individuals uses all four types of chains as precursors when adding the immunodominant sugar to the H substance, whereas the A2 gylcosyltransferase can only use type 1 and 2 chains34. It can be seen from the biosynthetic pathway of the A and B antigens that expression of A antigens will be strongest in A1 secretors, while expression in A2 nonsecretors is minimal because it is based mainly on type 2 chains. Since the action of the B glycosyltransferase is probably limited to type 1 and 2 chains, it is probable that B subjects, like A2 ones, also express less antigen35. The α-N-acetylgalactosaminidase enzyme is not as readily available as the α-galactosidase. The New York Blood Center purified it from chicken liver and was then able to convert A2 blood cells into O cells, while the A1 specificity was only partially weakened36. Subsequent studies led to the hypothesis that the A epitopes on red cells differed not only by their sensitivity to enzyme treatment, but also by the nature of the immune response they cause. When A erythrocytes were incubated for two hours with enzyme at a concentration of 0.1 UI/mL, complement-mediated immune haemolysis and reactivity with the lectin of Dolichos biflorus were abolished, while, in parallel, agglutination with the anti-H lection of Ulex europaeus increased; however, the agglutinating capacity of monoclonal and polyclonal anti-A antisera was only partially attenuated, despite incubation with enzyme concentrations up to 10 UI/mL37! Since this antigenantibody bond triggers the complex series of cell and biochemical events which characterise the ABO incompatibility tranfusion reactions38, it was necessary not only to determine the optimal conditions (concentration, incubation, etc.) of the enzyme treatment, but also to examine its efficacy on the single stages of the immune response with appropriate tests. To this end, a purified exo-α-Nacetylgalactosaminidase, obtained from the IX-70 strain of the commensal intestinal bacterium Ruminococcus torques, was used39; group A red blood cells treated with different concentrations of the enzyme and untreated control A red cells were first put into contact with monoclonal anti-A antibodies and then examined to evaluate their capacity to Blood Transf 2003; 3: 224-43 da soggetti A2. Ceppellini et al.predissero, come in effetti si sarebbe constatato, che sarebbe stato possibile eseguire con successo trapianti di organi solidi da soggetti A2 a riceventi O33. Oggi sappiamo che gli individui A1 non solo esprimono un maggior numero di epitopi A nei tessuti rispetto ai soggetti A2, ma che tra i due sottogruppi vi è anche una differenza qualitativa. La glicosiltrasferasi degli individui A1, nell'aggiungere lo zucchero immunodominante alla sostanza H, usa tutti e quattro i tipi di catene come precursore, mentre la glicosiltrasferasi A2 può utilizzare solamente i tipi 1 e 234. Lo schema biosintetico degli antigeni A e B consente di stabilire che la più forte espressività degli antigeni A si estrinsecherà negli individui A1 secretori , mentre in quelli A2 non secretori essa sarà minima, perché basata principalmente sulle catene di tipo 2. Poiché anche l'azione della glicosiltrasferasi B è probabilmente limitata alle catene di tipo 1 e 2, è verosimile che anche i soggetti B, come gli A2, esprimano una minor quantità di antigene35. Lo stesso enzima α-N-acetilgalattosaminidasi non è così facilmente disponibile come l'α-galattosidasi. Il New York Blood Center lo ha purificato dal fegato di pollo e con esso è stato possibile trasformare emazie A2 in emazie O, mentre la specificità A1 veniva solo parzialmente indebolita36. Da studi successivi è stato ipotizzato che gli epitopi A sui globuli rossi differissero tra loro non solo nella sensibilità al trattamento enzimatico, ma anche nella natura della risposta immune da essi evocata. Incubando emazie A per due ore con una concentrazione enzimatica di 0,1 UI/mL era possibile abolire l'emolisi immune complemento-mediata e la reattività con la lectina di Dolichos biflorus, mentre, parallelamente, si incrementava l'agglutinazione con lectina anti-H di Ulex europaeus; tuttavia, la capacità agglutinante di antisieri monoclonali e policlonali anti-A veniva solo parzialmente attenuata, nonostante l'incubazione con concentrazioni enzimatiche fino a 10 UI/mL37! Poiché questo legame antigene-anticorpo innesca la complessa serie di eventi cellulari e umorali che caratterizzano le reazioni trasfusionali da incompatibilità ABO38, era dunque necessario non soltanto determinare le modalità ottimali (concentrazione, incubazione ecc.) del trattamento enzimatico, ma anche esaminarne l'efficacia sulle singole fasi della risposta immunitaria con test appropriati. A tale scopo, è stata utilizzata un'eso-α-N-acetilgalattosaminidasi purificata, ottenuta dal ceppo IX-70 del batterio enterico commensale Ruminococcus torques39, ed emazie A trattate con diverse concentrazioni di enzima, contestualmente ad emazie di controllo A non trattate, sono state, prima, messe a contatto con anticorpi anti-A monoclonali e, poi, 229 F Morelli stimulate immunoadherence (rosetting) and erythrophagocytosis, in monocytic and polymorphonuclear cell cultures. The same two populations of blood cells were also incubated with serum and whole group B and group A blood (to evaluate, respectively, complement-mediated haemolysis and the capacity to stimulate the production of TNFα) and with polyclonal diagnostic antisera of human origin (to check the A typing and titre the agglutination)40. The results confirmed that enzymes concentrations similar to those reported previously37, and appropriate for abolishing complementmediated immune haemolysis and reactivity with Dolichos biflorus lectin, could eliminate even the A determinants of the membrane responsible for the interaction with monocytes and macrophages, as shown by the loss of rosetting and immune activation of these latter cells. The loss of immune activation was demonstrated by the lack of TNFα release and the disappearance of erythrophagocytosis. In contrast, the antigenic A determinants involved in the reaction with polyclonal antibodies were more resistant to the enzyme treatment40. This information can be interpreted by considering the topography of the ABH antigens on the surface of the red blood cell. The antigens are situated at the end of oligosaccharide chains of different lengths, and extend for various distances outside the membrane, from the 18 Å of the double layer glycolipids, to the 100-150 Å of the polyN-acetyl-lactosamine of the most extended glycoproteins; the epitopes on the O-glycans and N-glycans of the glycophorins and band 3 and 4.5 glycoproteins are at intermediate distances. The result is that the ABH antigens are organised in rows or layers, most of which are thought to be arranged on the most external branched part of the glycocalyx. Furthermore, the epitopes extending furthest outwards are uniformly distributed on the red cell membrane at an average distance of about 80 Å from each other, while the more internal epitopes are closer to each other (30 Å)41. The more external layer, formed of the A epitopes on the peak of the long polylactosamine chains, is very probably the one more involved in antibody binding with anti-A IgG and IgM: the antigen-antibody complexes, in their turn, trigger rosetting and immune activation of the monocytes, activation of the complement cascade and haemagglutination. The destruction, even only partial, of this layer can make the binding with anti-A IgG more difficult (the Fc part of the IgG binds to monocyte receptors) and the bond with anti-A IgM more unstable (this is the complex that activates complement); nevertheless, a sufficient number of sites may remain to enable these latter 230 esaminate per verificare la loro capacità di stimolare immunoaderenza (rosetting) ed eritrofagocitosi, in colture cellulari di monociti e polimorfonucleati. Le stesse due popolazioni di emazie sono state, inoltre, incubate con siero e con sangue in toto di gruppo B e O (per valutarne rispettivamente l'emolisi complemento-mediata e la capacità stimolante la produzione di TNFα) e con antisieri diagnostici policlonali di origine umana (per controllarne la tipizzazione A e titolarne l'agglutinazione)40. I risultati confermano che concentrazioni di enzima simili a quelle riferite in precedenza37, e idonee ad abolire l'emolisi immune complemento-mediata e la reattività con la lectina di Dolichos biflorus, sono in grado di eliminare pure i determinanti A di membrana responsabili dell'interazione con le cellule monocito- macrofagiche, come si evince dalla perdita di immunoaderenza e di attivazione immune da parte di queste ultime, rivelata dal mancato rilascio di TNFα e dalla scomparsa dell'eritrofagocitosi. Al contrario, i determinanti antigenici A coinvolti nella reazione con gli anticorpi policlonali si rivelano alquanto più resistenti al trattamento enzimatico40. Questi dati possono essere interpretati facendo riferimento alla topografia degli antigeni ABH sulla superficie del globulo rosso. Essi si trovano al termine di catene oligosaccaridiche di differente lunghezza, e si estendono a diverse distanze all'esterno della membrana, dai 18 Å dei glicolipidi del doppio strato fino ai 100-150 Å delle poli-N-acetil-lattosamine delle glicoproteine più estese; a distanze intermedie stanno gli epitopi sugli Oglicani e sugli N-glicani delle glicoforine e delle glicoproteine di banda 3 e 4.5. Ne risulta una distribuzione a file o a strati degli antigeni ABH, la cui maggior parte si ritiene sia dislocata sulla parte più esterna e ramificata del glicocalice. Inoltre, gli epitopi che si spingono più all'esterno sono uniformemente distribuiti sulla membrana eritrocitaria a una distanza media gli uni dagli altri di circa 80 Å, mentre gli epitopi più interni sono più ravvicinati tra loro (30 Å)41. Lo strato più esterno, costituito dagli epitopi A collocati sulla cima delle lunghe catene polilattosaminiche, è molto probabilmente quello più coinvolto nel legame anticorpale con IgG e IgM anti-A: i complessi antigene-anticorpo, a loro volta, innescano l'immunoaderenza e l'immunoattivazione dei monociti, l'attivazione della cascata complementare e l'emoagglutinazione. La sua distruzione, anche parziale, può rendere difficile il legame con le IgG anti-A, la cui porzione Fc si lega ai recettori monocitari, e instabile quello con le IgM anti-A, che attivano il complemento, ma può residuare un numero di siti sufficiente a far sì che quest'ultime grandi molecole pentavalenti si Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs large pentavalent molecules to bind to adjacent red blood cells thus allowing agglutination40. Furthermore, the A epitopes on the type 3 chains anchored to glycolipids are arranged "repetitively"22,42: although the one in a more external position may be removed by the exo-α-Nacetylgalactosaminidase, the more internal determinant probably remains intact, despite the use of a co-adjuvant endoglycosidase27 (Figure 1). However, studies on the conformation of the A antigen indicate that the external determinant might itself not be completely accessible to enzymatic action because it can be found tucked under the head group - in its turn folded towards the membrane - of the type 3 A chain43. The research on enzymatic removal of A determinants is still underway: it is not possible to hypothesise a future for the production of universal O blood by enzymatic conversion until a biochemical solution is found to this problem. leghino a emazie adiacenti consentendo così l'agglutinazione40. Inoltre, sulle catene di tipo 3 ancorate ai glicolipidi, gli epitopi A sono posizionati in maniera "ripetitiva"22,42: se quello in posizione più esterna può essere rimosso dall'eso-α-N-acetilgalattosaminidasi, il determinante più interno rimane verosimilmente intatto, nonostante l'utilizzo di un'endoglicosidasi coadiuvante27 (Figura 1). Comunque, studi sulla conformazione antigenica A indicano che anche lo stesso determinante esterno potrebbe essere non del tutto accessibile all'azione enzimatica, in quanto si troverebbe infilato sotto il gruppo di testa - a sua volta ripiegato verso la membrana - delle catene A di tipo 343. Le ricerche sulla rimozione enzimatica dei determinanti A proseguono: non è possibile ipotizzare un futuro per la produzione di emazie universali O mediante conversione enzimatica, finché non si riuscirà a trovare una soluzione biochimica al problema. Camouflaged or "stealth" red blood cells Emazie mascherate o invisibili The enzymatic removal of antigenic epitopes or potential binding sites on the surfaces of red blood cells is desirable in order to prevent alloimmunisation and to make red cells resistant to microbial or parasitic attack44,45. Nevertheless, this type of approach is severely limited by the availability of the enzymes with the required specificities. So far it has only been possible to remove B antigen specifically and efficiently. Although there are other proteases and glycosidases able to remove other antigens, their action compromises the structural and functional integrity of the red blood cells: for example, although neuraminidase-mediated destruction of the sialic acid terminals of glycoproteins interferes with malarial infection, blood treated in this way would be immediately eliminated from the circulation46,47. The studies to achieve group O blood by enzymatic removal of A and B antigens have spanned over about twenty-five years, but in the second half of the 1990s various groups of researchers struck out in a different direction. They tried to make red blood cells invisible to the immune system by masking the antigenic membrane sites with a neutral polymer, polyethylene glycol (PEG). The aims were to prevent transfusion reactions in already immunised subjects and any new alloimmunisation events48-52. The advantage of camouflaging antigens with PEG rather than removing them would be that a single treatment could mask most or even all of the surface La rimozione enzimatica di epitopi antigenici o di potenziali siti di legame sulla superficie dei globuli rossi può essere auspicabile per prevenire l'alloimmunizzazione o per rendere le emazie resistenti ad attacchi microbici o parassitari44,45. Tuttavia, questo tipo di approccio viene ad essere fortemente limitato dalla disponibilità di enzimi per le specificità richieste. Abbiamo visto come finora sia stato possibile rimuovere specificamente ed efficacemente il solo antigene B. Sebbene esistano altre proteasi e glicosidasi in grado di rimuovere altri antigeni, la loro azione compromette l'integrità strutturale e funzionale degli eritrociti: ad esempio, la distruzione dei terminali di acido sialico delle glicoproteine mediante neuraminidasi interferisce con l'infezione malarica, ma le emazie così trattate sarebbero immediatamente eliminate dal circolo46,47. Se gli studi per ottenere emazie di gruppo O mediante rimozione enzimatica degli antigeni A e B sono in corso da circa venticinque anni, nella seconda metà degli anni '90 diversi gruppi di ricercatori hanno tentato di ottenere dei globuli rossi invisibili per il sistema immunitario, mascherando i loro siti antigenici di membrana con un polimero neutro, il polietilenglicole (PEG), nell'intento di prevenire sia reazioni trasfusionali in soggetti già immunizzati sia eventuali nuove alloimmunizzazioni48-52. Il vantaggio del camuffamento con PEG rispetto alla rimozione enzimatica risiederebbe nel fatto che con un singolo Blood Transf 2003; 3: 224-43 231 F Morelli molecules with a role in the blood group systems and in attachment sites. Previous studies had clearly demonstrated the lack of toxicity of long PEG polymers, exceeding 400 Dalton (D) (unlike the short chain molecules, used in refrigerator circuitry, which are extremely toxic!) and since the 1940s it has been known that PEG (1 and 6 kD) administered intravenously is rapidly eliminated in the urine without producing any demonstrable harmful effects53-55. In 1977 it was shown that bovine albumin could be made non-immunogenic if PEG were bound covalently to its surface56; furthermore, the protein treated in this way retained a normal in vivo survival and was not toxic57,58. Since then many other purified proteins have been conjugated with PEG to reduce their immunogenicity and have been studied clinically: PEG-superoxide dismutase and PEG-catalase to reduce reperfusion lesions in areas of ischaemia59, PEG-asparaginase for the treatment of acute leukaemias60, PEG-adenosine deaminase in the cure of SCID61, PEG-bilirubin oxidase for jaundice62, and PEGhaemoglobin as a replacement for red blood cells63,64. Furthermore, PEG has been bound to many other types of molecules and surfaces, such as arterial grafts65, tissue transplants matrices including Langerhans cells 66, liposomes67 and drugs68. PEG is a non-ionic polyether, whose fundamental chemical structure is HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH. It can be defined chemically as a polyoxide of ethylene69. It exists in an extraordinary variety of molecular weights (from 100 to 8 million g/mole) and spatial configurations (linear, branched, stellate). The linear forms can terminate at one extremity with a methyl group (monomethoxypolyethylene glycol: mPEG); the branched ones (bPEG) have 3 to 10 branches attached to a central linear axis; the stellate PEG (sPEG) have a divinylbenzene ring carrying up to 100 arms. PEG is a neutral compound. It is soluble in most organic solvents and, above all, in water, with which it forms hydrogen bonds in the ratio of three molecules of water for each unit of ethylene oxide, while the hydroxyl group, which does not become methylated, is available for covalent reactions with proteins, through the action of binding reagents. Thus in aqueous solution every molecule of PEG becomes surrounded by a large hydration sphere70. It should not, however, appear contradictory that PEG was used in the past in Transfusion Medicine for an apparently opposite aim, that is as an additive potentiating antigen-antibody reactions in pre-transfusion compatibility tests71,72. Added in appropriate concentrations to serum and diluted red blood cells, its characteristic action of 232 trattamento verrebbero mascherate la maggior parte, o addirittura tutte, le molecole di superficie che hanno un ruolo nei sistemi gruppoematici e nei siti di attacco. Studi precedenti avevano chiaramente dimostrato l'assenza di tossicità del PEG di lunghezza polimerica superiore ai 400 Dalton (D) (al contrario le molecole a catena corta, usate nei circuiti refrigeranti, sono molto tossiche!) e fin dagli anni '40 era noto che PEG (1 e 6 kD) somministrato in vena veniva rapidamente eliminato per via urinaria, senza manifestare alcun effetto dannoso53-55. Dal 1977 era stato evidenziato che l'albumina bovina poteva essere resa non immunogena, se alla sua superficie veniva legato PEG in maniera covalente56; inoltre, la proteina così trattata conservava una normale sopravvivenza in vivo e si dimostrava non essere tossica57,58. Da allora, molte altre proteine purificate sono state coniugate con PEG per ridurne l'immunogenicità e sono state studiate clinicamente: PEG-superossidodismutasi e PEG-catalasi per ridurre le lesioni da riperfusione in aree ischemiche59, PEG-asparaginasi nel trattamento delle leucemie acute60, PEG-adenosindeaminasi nella cura della SCID61, PEGbilirubinaossidasi per gli itteri62, PEG-emoglobina come sostituto eritrocitario63,64. Inoltre, il PEG è stato legato a molti altri tipi di molecole e superfici, quali innesti arteriosi65, matrici per trapianti di tessuti come le cellule di Langerhans66, liposomi67 e farmaci68. Il PEG è un polietere non ionico, la cui struttura chimica di base è la seguente: HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH; esso può essere definito, in termini chimici, un poliossido di etilene69. Esiste in una straordinaria varietà di pesi molecolari (pm) (da 100 a 8 milioni g/mole) e di configurazioni spaziali (lineari, ramificate, stellari). Le forme lineari possono terminare a un'estremità con un gruppo metilico (monometossipolietilenglicole: mPEG); quelle ramificate (branched) hanno da 3 a 10 braccia innestate su un asse centrale lineare (bPEG); le stellari consistono di un anello divinilbenzenico dal quale si dipartono fino a 100 braccia (sPEG). Il PEG ha carica neutra ed è solubile in gran parte dei solventi organici e, soprattutto, in acqua, con cui forma legami idrogeno nella misura di tre molecole d'acqua per unità di ossido di etilene, mentre il gruppo idrossilico, che non viene metilato, è disponibile per le reazioni covalenti di coniugazione con le proteine, mediante l'azione di reagenti leganti. Pertanto, in soluzione acquosa ogni molecola di PEG si circonda di una larga sfera di idratazione70. Non deve, tuttavia, apparire contraddittorio che il PEG sia già stato utilizzato in passato in Medicina Trasfusionale per uno scopo apparentemente opposto, ossia come additivo potenziante le reazioni antigene-anticorpo Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs Figura 2 - The PEG density gradient (horizontal grey lines) acts as a sort a sieve: the smaller molecules (O 2, CO2, glucose, ions, polypeptides pass the membrane, while the large protein molecules are blocked. The antigen camouflage and the antigen-antibody interaction blocking depend on the polymer dimension, on the antigen topography and on the class of immunoglobulin. On the left, are represented the protective "shell" acted by PEG of various molecular weight (2, 5, 20 kD) on some antigen determinants (ABH, Rh, Kidd, Ss). Rh antigens are located near the membrane surface and are, therefore, easily covered by 5 kD-PEG. Only 20 kD-PEG can effectively camouflage external antigens, as ABH, Kidd e Ss removing water, due to its strong hydrophilicity, manages to create space around the red blood cells and thus efficiently concentrates the antibody molecules, helping them to approach the cells and attach to them, and, in many cases, increasing the strength of the reaction 73,74. Excessively high concentrations of PEG can even cause precipitation of plasma proteins giving rise to false positive results75. However, bond covalently - by two types of binding reagents, cyanide chloride (CN) (also known as dichlorotriazine) and the N-hydroxysuccinimidylester of methoxypolyethylene glycol propionic acid (SPA) (also known as bispropionyl-N-hydroxysuccinimide) - to proteins (for example, those of the red cell membrane), it covers them with a protective "shell" of PEG+water molecules70. This steric barrier has a density gradient and acts as a sort of molecular sieve, excluding large protein molecules, such as antibodies, but allowing the passage of smaller molecules such as glucose, amino acids and oxygen, essential for cell metabolism76 (Figure 2). This notably reduces both the reactions between antibodies and red cells and those between cells (red cells-red cells and red cells-phagocytes)51,77. Blood Transf 2003; 3: 224-43 nell'esecuzione delle prove di compatibilità pretrasfusionale71,72. Aggiunto in opportuna concentrazione al siero e alle emazie diluite, a causa della sua caratteristica azione di rimuovere acqua perché fortemente idrofilo, riesce a creare più spazio intorno al globulo rosso e, quindi, a concentrare efficacemente le molecole anticorpali, facilitandone l'avvicinamento e l'attacco alle cellule, aumentando anche, in molti casi, la forza della reazione73,74. Concentrazioni troppo alte di PEG possono addirittura determinare una precipitazione delle proteine plasmatiche con conseguenti risultati falsamente positivi75. Unito invece in maniera covalente - mediante due tipi di reagenti leganti, il cloruro di cianuro (CN) (noto anche come diclorotriazina) e l'N-idrossisuccinimidilestere dell'acido metossipolietilenglicolpropionico (SPA) (noto anche come bispropionil-N-idrossisuccinimide) - alle proteine (per esempio a quelle della membrana eritrocitaria), le copre sotto un "guscio" protettivo formato da PEG+molecole d'acqua70. Questa barriera sterica ha un gradiente di densità e agisce come una sorta di setaccio molecolare, che esclude grandi molecole proteiche, come gli anticorpi, e lascia passare molecole più piccole, come glucosio, aminoacidi e ossigeno, essenziali al metabolismo cellulare76 (Figura 2). 233 F Morelli The efficacy of this immunological camouflage depends on various factors: these include, on the one hand, the density and topography of the antigenic determinants on the cell membrane as well as the availability of sites for covalent bonds and, on the other hand, the size and shape of the PEG molecules used. Furthermore, any benefit of this technology is subject not only to its efficacy but also, and more importantly, to its in vivo safety and biocompatibility. Between the spring of 1996 and the first few months of 1997 no fewer than 4 groups of researchers, one in Korea and three in the United States, published scientific articles on PEG-RBC48-52. The Korean group have not continued research in this field, while the three American groups (from the University of Alabama, Albany Medical College of New York and the University of South California of Los Angeles in collaboration with the local Red Cross) provided new contributions and details on their attempts78-82. The results were concordant and fairly encouraging. The covalent bond with the PEG, mediated by CN or SPA, did not have any harmful effects on cell structure or biological functions of the red blood cells at concentrations of PEG able to block the antigenic sites efficiently. The RBC morphology and deformability were not affected, the oxidation status of Hb and its P50 were not modified, and cation and anion homeostasis (Na+, K+ and SO4- flows) were maintained at concentrations of PEG 5kD from 0.6 mM (0.3%) to 2.4 mM (1.2%). Unfortunately, using these concentrations, the PEGRBC were rapidly eliminated from the circulation, while good in vivo survival of the camouflaged murine red cells only occurred when concentrations of PEG 5kD no exceeding 0.4 mM (0.2%) were used. Unfortunately, using CN-PEG 5kD, concentrations of at least 1-5 mM (0.5-2.5%) were necessary to obtain an effective block of the antigens (including the ABO ones) on human red cells, which could be demonstrated in vitro. However, the Albany group demonstrated that sheep PEG-RBC injected into mice produced a greatly attenuated immune response: about 90% less antibody was produced in these mice than in control mice injected with untreated sheep RBC79. It had to be accepted that the immediate aim of research on PEG-RBC cannot yet be to produce "universal red blood cells", but only antigenically and immunologically attenuated erythrocytes with an almost normal half-life that could be exploited in chronically transfused patients and/or those with rare phenotypes in order to prevent reactions against non-ABO antigens80. The Los Angeles group demonstrated that camouflaging cells with PEG drastically reduced 234 Vengono così notevolmente ridotte sia le interazioni tra anticorpi ed emazie sia le interazioni tra cellule (emaziaemazia ed emazia-fagocita)51,77. L'efficacia di questo mascheramento immunologico dipende da alcuni fattori: essi comprendono, da un lato, la densità e la topografia dei determinanti antigenici sulla membrana nonché la disponibilità di siti per il legame covalente e, dall'altro, la taglia e la forma delle molecole di PEG utilizzate. Ogni benefico effetto di questa tecnologia è condizionato, inoltre, non solamente dalla sua efficacia, ma anche (anzi, in primo luogo) dalla sua sicurezza e biocompatibilità in vivo. Tra la primavera del 1996 e i primi mesi del 1997 ben 4 gruppi di ricercatori, uno in Corea e tre negli Stati Uniti, hanno pubblicato i primi lavori scientifici sui PEG-RBC48-52. Il gruppo coreano non ha continuato i suoi studi in quest'area, mentre i tre gruppi americani, rispettivamente dell'Università dell'Alabama, dell'Albany Medical College di New York e dell'Università della South California di Los Angeles in collaborazione con la locale Croce Rossa, hanno fornito ulteriori nuovi contributi e dettagli sui loro tentativi78-82. I risultati sono stati concordi e abbastanza confortanti. Il legame covalente mediato da CN o da SPA con il PEG non aveva alcun effetto dannoso sulla struttura cellulare e sulle funzioni biologiche dei globuli rossi a concentrazioni di PEG in grado di assicurare un efficace blocco dei siti antigenici. La morfologia e la deformabilità eritrocitarie non venivano influenzate, lo stato di ossidazione dell'Hb e la sua P50 non venivano modificati, l'omeostasi di cationi e anioni (flussi di Na+, K+ e SO4-) era conservata a concentrazioni di PEG 5kD da 0,6 (0,3%) a 2,4 mM (1,2%). Purtroppo, usando queste concentrazioni, i PEG-RBC venivano rapidamente eliminati dal circolo, mentre si otteneva una buona sopravvivenza in vivo delle emazie murine camuffate solamente quando venivano usate concentrazioni di PEG 5kD non superiori a 0,4 mM (0,2%). Sfortunatamente, usando CN-PEG 5kD, erano necessarie concentrazioni di almeno 1-5 mM (0,5-2,5%) per ottenere un effettivo blocco degli antigeni sulle emazie umane (compresi quelli ABO), dimostrabile in vitro. Tuttavia, il gruppo di Albany ha dimostrato che PEG-RBC di pecora iniettati in topi provocano una risposta immunitaria fortemente attenuata: viene prodotto circa il 90% di anticorpi in meno rispetto ai topi di controllo che ricevevano emazie di pecora non trattate79 Si è dovuto, dunque, prendere atto che l'obiettivo immediato della ricerca sui PEG-RBC non poteva ancora essere quello di produrre delle "emazie universali", ma soltanto degli eritrociti antigenicamente e immunologicamente attenuati e di emivita Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs aggregation and, consequently, the viscosity of red cells resuspended in plasma, and extended the potential indications for PEG-RBC to pathological conditions characterised by vaso-occlusive events or flow disorders, such as myocardial infarction or sickle cell crises51. The laboratory of the Southern California Region branch of the American Red Cross was the first to use classical routine methods now employed in blood banks (including the indirect antiglobulin test and flow cytometry) and has studied PEG of various molecular weights (5, 15 and 18.5 kD), reaching the conclusion that best antigen masking is obtained with mixtures of PEG of different molecular weights (18.5 + 3.35 kD at a concentration of 1.3 mM)52,81. However, various problems arose with all the first generation PEG when the RBC were subject to normal pre-transfusion tests: after incubation for 30'-60' with compatible plasma, PEGRBC non-specifically adsorbed proteins (IgG and IgM), which were detected by the indirect Coombs' test and flow cytometry82 and would have shortened the cells' survival in vivo83. Furthermore, some normal sera contained antiPEG antibodies which agglutinated with the treated cells84 and, in ABO incompatibility tests, complement-lysing capacity was not reduced, but indeed increased85. Many of the above-mentioned problems have been overcome by using second generation PEG. The Alabama group first used a bifunctional compound of PEG (SPAPEG-SPA), incubated and crosslinked with albumin, called X-PEG78 and then a branched PEG (4-branched PEG-SPA) combined with albumin86. The Los Angeles group, using a mixture of branched PEG (4-branched PEG 20 kD at a concentration of 1mM + 4-branched PEG-amine 10 kD at 2mM), obtained PEG-RBC that maintained a discoid shape and which did not agglutinate with anti-A, anti-B and antiD antisera even in the anti-globulin test87,88. It was, therefore, clear that antigenic determinants close to the cell surface (for example, Rh antigens), even when present in large amounts, can be effectively masked by short chain polymers, while more external antigens (for example, MNSsU on glycophorins) require longer chains (Figure 2). Furthermore, very branched polymers may be more efficient because they create a denser exclusion zone, thus better preventing existing antibodies from approaching and binding to the cell. It is, therefore, understandable that a combination of the above molecules could act synergistically to provide better overall protection89. From the point of view of safety, the lack of toxicity of PEG-RBC was further confirmed by murine hypertransfusion in which the PEG-RBC formed up to 80% of the red cell mass of the mice, which thus received a dose Blood Transf 2003; 3: 224-43 quasi normale che avrebbero potuto essere vantaggiosamente utilizzati in pazienti cronicamente trasfusi e/o di fenotipo raro per prevenire reazioni verso antigeni non-ABO80. Gli studi del gruppo di Los Angeles hanno dimostrato che il mascheramento con PEG riduce drammaticamente l'aggregazione e, di conseguenza, la viscosità delle emazie risospese in plasma, e hanno esteso le potenziali indicazioni dei PEG-RBC a condizioni patologiche caratterizzate da eventi vaso-occlusivi o da difficoltà di flusso, quali l'infarto miocardico e le crisi falcemiche51. Il laboratorio della Croce Rossa Americana della Southern California Region per primo ha utilizzato i metodi classici di routine in uso nelle banche del sangue (tra cui il test indiretto all'antiglobulina e la citometria a flusso) e ha studiato PEG a diverso peso molecolare (5, 15 e 18,5 kD), arrivando a stabilire che si ottenevano i migliori risultati di mascheramento antigenico con miscele di PEG di differente pm (18,5 + 3,35 kD a concentrazione 1,3 mM)52,81. Applicando i normali test pre-trasfusionali emergevano, però, svariati problemi con tutti i PEG di prima generazione: emazie trattate con PEG, dopo incubazione per 30'-60' con plasma compatibile, adsorbivano aspecificamente proteine (IgG e IgM), che venivano rivelate col test di Coombs indiretto e in citofluorimetria82 e che avrebbero potuto ridurne la sopravvivenza in vivo83. Alcuni sieri normali contenevano, poi, anticorpi anti-PEG che agglutinavano le emazie trattate84 e, nell'incompatibilità ABO, la capacità lisante del complemento non veniva ridotta, ma anzi risultava aumentata85. Molti dei suddetti problemi sono stati superati usando PEG di seconda generazione. Il gruppo dell'Alabama ha dapprima usato un composto bifunzionale di PEG (SPAPEG-SPA), incubato e crosslinked con albumina, chiamato X-PEG78 e poi un PEG ramificato (4-branched PEG-SPA) combinato con albumina86. Il gruppo di Los Angeles, usando una miscela di PEG ramificati (4-branched PEG 20 kD a concentrazione 1mM + 4-branched PEG-amine 10 kD a 2mM), è riuscito a ottenere dei PEG-RBC con morfologia discocitica mantenuta, non agglutinabili da antisieri antiA, anti-B e anti-D, anche in test all'anti-globulina87,88. Risulta, pertanto, evidente da tutte queste esperienze che determinanti antigenici vicini alla superficie cellulare (ad esempio, antigeni Rh), anche se presenti in gran numero, possono essere efficacemente mascherati da polimeri a corta catena, mentre altri antigeni più esterni (per esempio MNSsU sulle glicoforine) richiedono catene più lunghe (Figura 2). Inoltre, polimeri altamente ramificati possono risultare più efficaci perché forniscono una zona di 235 F Morelli of CN-mPEG of 6.7g/kg of body weight, without developing behavioural disturbances or post-mortem changes79,89. Since a hypothetical unit of PEG-RBC should contain from about 13 to 25 g of PEG, the dose infused into a patient would correspond to that administered without any problems to healthy volunteers during clinical trials with PEG-Hb89,90. Recently, the Albany Medical College group, in an attempt to characterise, quantify and control the biophysical and immunological effects of this new technology in the light of its subsequent clinical application in Transfusion Medicine, reported having improved its PEG-RBC, using a mPEG with a higher molecular weight (20 kD) and using benzotriazobylcarbonate (BTC), rather than CN, as the binding molecule91. All the chemical bonds used to allow mPEG to fix covalently to the cells interact with the ε-amine groups of lysine radicals of the membrane proteins. Although sharing the same site of action, CN-PEG, SPA-PEG and BTC-PEG have different reaction times: however, if the incubation period of the RBC is extended from 30 minutes to one hour, they are all equally efficient91. This was proven by testing the three preparations of PEG with two different techniques, already used in the past to study the properties of the red cell surface92 and treating proteins and liposomes with PEG93: particellar electrophoresis and polymer separation in an aqueous two-phase (PEG/dextran) system. Using the same methods it was possible to demonstrate that the efficacy of the camouflage depends on both the polymer density (mM) and its molecular mass (kD). The first method revealed that PEG treatment notably weakened electrical charges on the red cell surface, thus slowing electrophoretic mobility; the second method demonstrated the PEG-RBC's particular affinity for the upper part (PEG phase) of the system, while the untreated or not completely linked cells remained at the interface (the two polymers do not mix) or precipitated into the dextran layer. Using longer PEG chains (20 kD), electrophoretic immobility was achieved and the gradient of separation was higher (due to the greater affinity for the upper phase) at molar concentrations (2 mM) which, surprisingly, corresponded to excellent in vivo survival of the treated cells and better masking capacity91. So, at Albany, it really can be said that "size does matter"91! Furthermore, the data from these relatively simple investigations suggest that the production and purification of PEG-RBC is biotechnology that could be applied efficiently and cost-effectively in all transfusion centres. In fact, one critical aspect of the potential use of PEG-RBC is how to separate the correctly modified cells (i.e. not 236 esclusione più densa che meglio impedisce l'avvicinamento e il legame di anticorpi pre-esistenti. Di conseguenza, è comprensibile che una combinazione delle suddette molecole possa agire sinergicamente così da fornire una migliore protezione globale89. Sul versante della sicurezza, l'ipertrasfusione murina ha ulteriormente ribadito l'assenza di tossicità dei PEG-RBC, che sono arrivati a costituire fino all'80% della massa eritrocitaria dei topi, i quali sono giunti dunque a ricevere una dose di CN-mPEG pari a 6,7g/kg di peso senza disturbi comportamentali né alterazioni autoptiche79,89. Poiché un'ipotetica unità di PEG-RBC dovrebbe contenere da 13 a 25 g circa di PEG, la dose così infusa a un paziente sarebbe corrispondente a quella somministrata senza alcun inconveniente a volontari sani nel corso di trials clinici con PEG-Hb89, 90. Recentemente, il gruppo dell'Albany Medical College, nell'intento di caratterizzare, quantificare e controllare l'effetto biofisico e immunologico di questa nuova tecnologia in vista di una sua successiva applicazione clinica in Medicina Trasfusionale, ha riferito di aver migliorato i suoi PEG-RBC, usando un mPEG a più alto peso molecolare (20 kD) e impiegando, come molecola legante, benzotriazobilcarbonato (BTC) invece di CN91. Tutti i leganti chimici utilizzati per consentire al mPEG di fissarsi covalentemente alle cellule interagiscono con i gruppi ε-aminici dei radicali lisinici delle proteine di membrana. Pur condividendo il medesimo sito d'azione, CNPEG, SPA-PEG e BTC-PEG manifestano differenti tempi di reazione: tuttavia, portando il tempo di incubazione con gli eritrociti da 30 minuti a un'ora, si dimostrano ugualmente efficienti91. Ciò è stato provato testando le tre preparazioni di PEG con due diverse tecniche, già utilizzate in passato per studiare le proprietà della superficie eritrocitaria92 e il trattamento con PEG di proteine e liposomi93: l'elettroforesi parcellare e un sistema di separazione polimerico (PEG/ destrano) in doppia fase acquosa. Con le medesime metodiche è stato anche possibile dimostrare che l'efficacia del mascheramento dipende sia dalla densità del polimero (mM) sia dalla sua massa molecolare (kD). Con il primo metodo, il trattamento con PEG rivela un notevole effetto attenuante sulle cariche elettriche di superficie dei globuli rossi, rallentandone, di conseguenza, la mobilità elettroforetica; con la seconda tecnica, i PEG-RBC evidenziano una particolare affinità per la parte superiore (fase PEG) del sistema, mentre le emazie non trattate, o non completamente linked, rimangono all'interfaccia (i due polimeri non si mescolano) o precipitano nello strato di destrano. Usando PEG di lunghezza maggiore (20 kD), si Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs immunogenic) from those not completely modified (and, thus, still immunogenic). The abovementioned study shows how it would be possible to exploit the biophysical changes induced in PEG-treated red cells to recover, easily, rapidly and selectively, only those cells truly masked: the completely PEG-linked cells would be first separated in the two phase system, because they partition into the upper layer, and would then be recovered by saline dilution (to decrease the viscosity) and brief centrifugation91. This simple method could easily be developed and automated for large scale production, as has already been done for the purification of enzymes produced by microorganisms94. The reduced immunogenicity of the PEG-RBC, found in vivo by the Albany group, does not seem to be exclusively due to the antigen-masking, but could derive in part from the low concentrations of m-PEG preventing monocytes from phagocytosing the foreign cells, thus altering the process of antigen presentation79. In fact, PEG treatment of white blood cells with PEG (PEG-WBC), and in particular antigen-presenting cells (APC) and T lymphocytes, surprisingly prevented the recognition of HLA class II foreign molecules and lymphocyte proliferation in response to foreign HLA antigens. This was demonstrated in mixed lymphocyte cultures: mononuclear cells (obtained from the peripheral blood of subjects with incompatible class II HLA antigens) treated with mPEG inhibited T-lymphocyte proliferation (measured by tritiated-thymidine incorporation) in a dose-dependent manner77. The phenomenon was not due to a possible toxic effect of the PEG, since cells stimulated with phytohaemagglutinin proliferated normally, while the addition of interleukin-2 did not have any effect, suggesting that the PEG-lymphocytes were not antigen-primed. On the other hand, the PEG-RBC also showed some cell interaction abnormalities: rouleaux formation, and consequently the erythrocyte sedimentation rate, decreased considerably91. In conclusion, masking adhesion, recognition and co-stimulatory molecules of allogeneic cells (APC and T lymphocytes) with PEG weakens the stimulation of alloreactive T lymphocytes, leading them to apoptosis, and would contribute, through a mechanism of clonal deletion, to establishing a state of immunological tolerance95. Experimental studies on rat pancreatic island cells treated with mPEG and then transplanted, showed that engraftment and cell and/or tissue function were not altered95. The potential impact of these studies on transfusion and transplant practices is clear. Besides the scenario Blood Transf 2003; 3: 224-43 raggiungono uno stato di immobilità elettroforetica e un incremento del gradiente di separazione (dovuto all'aumento dell'affinità per la fase superiore) a concentrazioni molari (2 mM) cui, sorprendentemente, corrisponde un'ottimale sopravvivenza cellulare in vivo e una migliore capacità mascherante91. Ad Albany, dunque, possono ben dire che "la taglia conta davvero" (size does matter)91! Inoltre, i dati ottenuti mediante queste relativamente semplici metodiche suggeriscono come la produzione e la purificazione dei PEG-RBC sia una biotecnologia che potrebbe essere applicata in maniera efficiente e remunerativa in ogni struttura trasfusionale. Infatti, un punto critico della potenziale utilizzazione clinica dei PEGRBC è la separazione delle cellule correttamente modificate (e, quindi, non immunogene) da quelle non completamente modificate (e, perciò, ancora immunogene). Nel suddetto studio si dimostrerebbe come sia possibile sfruttare i cambiamenti biofisici indotti sulle emazie dal trattamento con PEG per recuperare in maniera semplice, rapida e selettiva solo emazie realmente mascherate: le cellule completamente PEG-linked verrebbero prima separate, nel sistema in doppia fase, perché si raccolgono nello strato superiore, e, poi, recuperate mediante diluizione in salina (per diminuire la viscosità) e centrifugazione a basso numero di giri91. Questa semplice metodica potrebbe facilmente essere sviluppata e automatizzata a livello produttivo su larga scala, come è stato fatto in precedenza per la purificazione di enzimi prodotti da microrganismi94. La ridotta immunogenicità dei PEG-RBC, riscontrata in vivo dal gruppo di Albany, non sembra essere dovuta esclusivamente al camuffamento degli antigeni, ma deriverebbe in parte dall'incapacità, indotta da basse concentrazioni di m-PEG, di fagocitare le cellule estranee da parte dei monociti, alterando così il processo di presentazione dell'antigene79. Infatti, il trattamento con PEG dei globuli bianchi (PEG-WBC), in particolare delle cellule presentanti l'antigene (APC) e dei linfociti T, sorprendentemente previene il riconoscimento di molecole estranee HLA di classe II e la proliferazione linfocitaria in risposta ad antigeni HLA estranei. Ciò è stato dimostrato in coltura linfocitaria mista: cellule mononucleate (ottenute da sangue periferico di soggetti incompatibili per antigeni HLA di classe II) trattate con mPEG inibivano la proliferazione T-linfocitaria (misurata mediante incorporazione di timidina-tritiata) in maniera dosedipendente77. Il fenomeno non era dovuto ad eventuale effetto tossico da parte del PEG, in quanto le cellule, stimolate con fitoemagglutinina, proliferavano normalmente, mentre l'aggiunta di interleuchina-2 non 237 F Morelli outlined in the introduction, it would perhaps become possible to prevent tissue or organ rejection without being reliant life-long on immunosuppressive drugs which, although effective, have considerable side effects. PEG treatment of the donor's "passenger" lymphocytes, contaminating blood components and bone marrow, would prevent GvHD and immune recognition, while "pegylation" of the vascular endothelium of a donated organ or tissue would at least attenuate, if not completely abolish, acute and chronic rejection79. The recipient's immune system would remain fully competent, thus avoiding the risk of developing infections and second tumours95, and it would not be necessary to inactivate (irradiate) or remove (filtrate) the leucocytes from blood components77. Finally, unlike other methods, such as blocking antibodies or soluble ligands, camouflaging the RBC with PEG would provide simultaneous and global inhibition of sites and cell metabolic pathways, thus being more efficient and costeffective. As already mentioned, PEG treatment of the red cell membrane could represent a new method for treating and/or preventing malaria: blood removal and then transfusion with PEG-RBC in patients with cerebral malaria would not only dramatically reduce blood viscosity in the microcirculation51, but would also prevent further red cell invasion by the plasmodium, rapidly diminishing the dangerous parasitaemia and, above all, maintaining it at a low level because glycophorin A, carrying the Duffy antigens and the receptors for the plasmodium, would be covered by the PEG shell96. Conclusions The field of research is exciting, the dedication of the researchers considerable, the progress continuous and the prospects thrilling. The research on PEG-RBC started more recently and is, therefore, less advanced than that on ECO: there are not yet controlled experimental in vivo data from animal and human studies to confirm the initial exciting results. On the other hand, the problem of A→O conversion must be resolved in order to obtain ECO. If all this achieved, "stealth" blood cells and "converted" ones will become rivals, at least as far as concerns the large scale prevention of ABO incompatibility errors. The PEG-RBC would perhaps be a better product because of their complete immunological "inertia", and would be of great benefit in particular situations in which no other compatible blood components were available. However, at present, it seems far-sighted to 238 sortiva alcun effetto, suggerendo che i PEG-linfociti non fossero antigen-primed. D'altra parte, anche i PEG-RBC rivelano anomalie nelle interazioni tra cellule: la capacità di formare rouleaux e, di conseguenza, la velocità di eritrosedimentazione (VES) diminuiscono considerevolmente91. In conclusione, il mascheramento con PEG delle molecole di adesione, riconoscimento e co-stimolazione delle cellule allogeniche (APC e linfociti T) indebolirebbe la stimolazione di linfociti T alloreattivi, inducendoli così all'apoptosi, e contribuirebbe, mediante un meccanismo di delezione clonale, ad instaurare uno stato di tolleranza immunologica95. Studi sperimentali su cellule insulari pancreatiche di ratto trattate con mPEG e trapiantate dimostrerebbero, peraltro, che l'attecchimento e la funzione di masse cellulari e/o tessutali non vengono alterati95. È evidente il potenziale impatto di questi studi sulla pratica trasfusionale e trapiantologica. Oltre a quanto prospettato nell'introduzione, diventerebbe forse possibile prevenire il rigetto di tessuti od organi trapiantati senza dover utilizzare per tutta la vita farmaci immunosoppressori, efficaci ma gravati da importanti effetti collaterali. Il trattamento con PEG dei linfociti "passeggeri" del donatore, contaminanti emocomponenti e midollo osseo, consentirebbe di prevenire la GvHD e il riconoscimento immune, mentre la "pegilazione" dell'endotelio vascolare dell'organo o del tessuto donato potrebbe, quanto meno, attenuare, se non abolire, il rigetto acuto e cronico79. Il sistema immunitario del ricevente rimarrebbe pienamente competente, evitandogli il rischio di sviluppare infezioni e tumori secondari95, e non sarebbe più necessario inattivare (irradiazione) o rimuovere (filtrazione) i leucociti dagli emocomponenti77.Infine,ilcamuffamentoconPEG,adifferenza di altri metodi (anticorpi bloccanti o ligandi solubili), conferirebbe una inibizione simultanea e globale di siti e percorsi metabolici cellulari, risultando più efficace e cost-effective. Come è stato accennato in precedenza, la modificazione con PEG della membrana eritrocitaria potrebbe rappresentare un nuovo metodo per il trattamento e/o la prevenzione della malaria: l'exanguino-trasfusione con PEGRBC nella malaria cerebrale consentirebbe non solo di ridurre drammaticamente la viscosità ematica nel microcircolo51, ma anche di prevenire ulteriori invasioni eritrocitarie da parte dei plasmodi, diminuendo acutamente parassitemie pericolose e, soprattutto, mantenendole a bassi livelli, in quanto la glicoforina A, vettore degli antigeni Duffy e dei recettori per i plasmodi, verrebbe ricoperta dal guscio di PEG96. Blood Transf 2003; 3: 224-43 Universal RBCs talk of synergy rather than competition. The combined application of both methods would produce truly universal red blood cells, which would be minimally or not at all immunogenic and reactive with ABO antigens ABO (enzymatic conversion) and non-ABO ones (PEG), and which would have excellent flow properties (PEG). It would then become possible to foresee that our transfusion activities would include a production line for supplying high quality red blood cell components, in which, besides stages of leucoreduction and viral inactivation, there would also be stages of enzymatic conversion and PEG treatment. Leucoreduction by pre-storage filtration is already a widespread practice, although its global use remains controversial97; inactivation of pathogens is undergoing clinical trials98; enzymatic conversion and "pegylation" could produce O-converted and "stealth" blood appropriate for the transfusion of universal, safe, high quality red cells. There would no longer be the problems of optimising collection procedures, storage, red cell typing and incompatibility testing. The main work of our transfusion units would cease to be retesting ABO phenotypes on units of blood, but would become the development and maintenance of strict controls of quality and rigorous good manufacturing practices to avoid episodes of acute haemolysis, no longer due to exchanges of test-tubes or clerical errors, but to incomplete enzymatic removal of the ABO antigens or imperfect masking of other polymorphisms99. Blood Transf 2003; 3: 224-43 Conclusioni Il campo di ricerca è appassionante e l'impegno degli studiosi notevole, i progressi sono continui e le prospettive entusiasmanti. Gli studi sui PEG-RBC sono più recenti e, quindi, meno avanzati di quelli sulle ECO: mancano ancora dati sperimentali controllati in vivo su animali e nell'uomo che permettano di confermare le promesse iniziali. D'altra parte, per ottenere ECO è necessario risolvere il problema della conversione A→O. Se tutto ciò si realizzerà, emazie "invisibili" ed emazie "convertite" diventeranno rivali, almeno per quanto riguarda la prevenzione su larga scala degli incidenti da incompatibilità ABO. I PEG-RBC costituirebbero forse un prodotto migliore per la loro totale "inerzia" immunologica, e sarebbero di grande beneficio in situazioni particolari, in cui nessun altro emocomponente compatibile fosse disponibile. Tuttavia, allo stato attuale delle conoscenze, appare lungimirante parlare di sinergia piuttosto che di competizione. L'applicazione combinata di entrambe le metodiche potrebbe consentire di ottenere emazie veramente universali, scarsamente o per niente immunogene, non reattive con anticorpi diretti verso antigeni ABO (conversione enzimatica) e non-ABO (PEG), e oltretutto dotate di proprietà di flusso ottimali (PEG). Diventerebbe, allora, possibile prevedere, nel prossimo futuro dell'attività delle nostre strutture trasfusionali, una linea di produzione di emocomponenti eritrocitari di qualità, nella quale, oltre alle fasi di leucoriduzione e di inattivazione virale, subentrino le fasi di conversione enzimatica e di trattamento con PEG. La leucoriduzione mediante filtrazione pre-storage è ormai diffusa, anche se la sua estensione totale è controversa97; l'inattivazione dei patogeni sta affrontando la fase dei clinical trials98; la conversione enzimatica e la "pegilazione" potrebbero produrre emazie O-convertite e invisibili adatte ad una trasfusione eritrocitaria universale, sicura e di qualità. Non vi sarebbero più problemi di ottimizzazione della raccolta e di conservazione delle scorte, di tipizzazione eritrocitaria e di incompatibilità. Il lavoro principale delle nostre strutture trasfusionali non sarebbe più quello di ricontrollare il fenotipo ABO sulle unità di sangue, ma diventerebbe lo sviluppo e il mantenimento di severi controlli di qualità e di rigorose good manifacturing practices, per evitare episodi emolitici acuti dovuti non più a scambi di provette o a clerical errors, ma a incompleta rimozione enzimatica degli antigeni ABO o a imperfetto mascheramento degli altri polimorfismi99. 239 F Morelli References 1) Landsteiner K. Über Agglutinationserscheinungen normalen menslichen Blutes. Wien Klin Wochenschr 1901; 14: 1132-4. 2) Linden JV, Wagber K, Voytovich AE, Sheehan J. Transfusion errors in New York State: an analysis of 10 years’ experience. Transfusion 2000; 40: 1207-13. 3) Williamson L, Cohen H, Love E, et al. The serious hazard of transfusion (SHOT) initiative: the UK approach haemovigilance. 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