C. difficile Assay

Transcript

C. difficile Assay

C. difficile Assay
For the qualitative detection and identification of toxigenic Clostridium difficile
bacterial DNA from stool samples
Quidel Molecular Direct C. difficile Assay
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Contents
Intended Use .............................................................................................................................................. 3
Summary and Explanation ......................................................................................................................... 3
Principle of the Procedure ......................................................................................................................... 3
Materials Provided ..................................................................................................................................... 4
Optional Material ....................................................................................................................................... 4
Materials Required But Not Provided ........................................................................................................ 4
Warnings and Precautions ......................................................................................................................... 4
Storage and Handling of Kit Reagents ....................................................................................................... 5
Specimen Collection, Storage, and Handling ............................................................................................. 5
Initial Thermocycler Programming ............................................................................................................ 5
7500 Fast DX Programming Instructions................................................................................................ 5
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx Programming Instructions ........................................... 9
SmartCycler II Programming Instructions .............................................................................................. 9
Assay Procedure....................................................................................................................................... 11
Sample Process Procedure....................................................................................................................... 11
Amplification Protocol on the 7500 Fast Dx Thermocycler ................................................................. 12
Amplification Protocol on the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ........................................ 12
Amplification Protocol on the SmartCycler II....................................................................................... 13
Interpretation of Results .......................................................................................................................... 14
Interpretation of Results using the 7500 Fast Dx Thermocycler ......................................................... 14
Interpretation of Results using the Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ... 14
Interpretation of Results using the Cepheid SmartCycler II Dx Thermocycler .................................... 15
Quality Control ......................................................................................................................................... 15
Limitations ............................................................................................................................................... 15
Clinical Performance ................................................................................................................................ 15
Analytical Performance ............................................................................................................................ 19
Level of Detection ................................................................................................................................ 19
Analytical Reactivity (Inclusivity).......................................................................................................... 20
Analytical Specificity (Cross-reactivity and Microbial Interference) .................................................... 20
Analytical Specificity – Interfering Substances .................................................................................... 22
Reproducibility Study ........................................................................................................................... 23
Carryover and Cross-contamination Studies ....................................................................................... 23
Customer and Technical Support ............................................................................................................. 23
Intellectual Property ................................................................................................................................ 24
Trademarks .......................................................................................................................................... 24
Patents ................................................................................................................................................. 24
Glossary .................................................................................................................................................... 25
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Intended Use
The Quidel® Molecular Direct C. difficile Assay is a qualitative, multiplexed in vitro diagnostic test for the direct
detection of toxin A gene (tcdA) or toxin B gene (tcdB) sequences of toxigenic strains of Clostridium difficile
from unformed (liquid or soft) stool specimens collected from patients suspected of having Clostridium
difficile-Associated Disease (CDAD).
The Quidel Molecular Direct C. difficile Assay is a real-time PCR test and utilizes proprietary sample preparation
with fluorescently labeled primers and probes. The assay can be performed using either the Life Technologies
QuantStudio® Dx; the Applied Biosystems 7500 Fast Dx, or the Cepheid SmartCycler II, to detect the toxin gene
sequences associated with toxin-producing C. difficile strains.
The assay is intended to be performed directly on CDAD-suspected stool specimens, and is indicated for use as
an aid in the diagnosis of CDAD.
Summary and Explanation
1
C. difficile is a major cause of antibiotic-associated diarrhea and colitis, accounting for up to 25% of all cases.
It is thought that the exposure to antibiotics disrupts the flora of the intestine, allowing an opportunistic
colonization by C. difficile, which is present in the gut flora of up to 3% of healthy adults. The virulence of C.
difficile is believed to be mediated by the production of two toxins (Toxin A and Toxin B). Both toxin genes
(tcdA and tcdB respectively) are located within a 19.6 Kb pathogenicity locus (PaLoc), along with 3 other gene.
The presence of both Toxin A and Toxin B proteins is not required for pathogenicity. Recently, the incidence
2
and severity of C. difficile-associated disease corresponding to short-term hospital stays has been on the rise.
Principle of the Procedure
The Quidel Molecular Direct C. difficile Assay detects nucleic acids that have been prepared from a patient
sample using proprietary sample preparation. A multiplex real-time PCR reaction is performed under
optimized conditions in a single well generating amplicons for each of the targets present in the sample.
Identification occurs by the use of oligonucleotide primers and probes that are complementary to conserved
regions in the tcdA and tcdB genes of the pathogenicity locus.
Quidel Molecular Probe Labels
Target
Toxin A
Toxin B
Process Control (PRC)
Dye
CAL Fluor Orange® 560
Quasar® 670
The following is a summary of the procedure:
1. Sample Collection: Dip a neonatal flocked swab into the liquid or soft stool specimen using standard
techniques from pediatric and adult patients suspected of having Clostridium difficile-associated
disease (CDAD).
Note: Remove mucus from the specimen prior to sampling the fecal material. Failure to sample the
fecal material due to excess mucus may lead to false negative results. Samples containing an excess
amount of mucus should not be tested.
2. Sample Preparation: Twirl the neonatal flocked swab in the first process buffer then add 30 µL of the
diluted sample into the second process buffer tube which contains the process control (PRC).
3. Rehydration of Master Mix: Rehydrate the lyophilized Master Mix using the Rehydration Solution.
The Master Mix contains oligonucleotide primers, fluorophore- and quencher-labeled probes
targeting conserved regions of the tcdA and tcdB, as well as the PRC sequence.
4. Nucleic Acid Amplification and Detection: Add 15 µL of the rehydrated Master Mix to each reaction
tube or plate well. Then add 5 µL of prepared specimen (i.e., specimen with PRC) to the plate well or
appropriately labeled reaction tube. Place the plate or tube into the Applied Biosystems® 7500 Fast
Dx® instrument, the Life Technologies QuantStudio™ Dx Real-Time PCR Instrument, or the Cepheid®
SmartCycler® II instrument.
Once the reaction tube or plate is placed in the appropriate instrument, the Quidel Molecular Direct
C. difficile Assay protocol is initiated. This assay is based on Taqman® chemistry and uses an enzyme
with DNA polymerase and 5’-3’ exonuclease activities. During DNA amplification, this enzyme cleaves
the probe bound to the complementary DNA sequence, separating the quencher dye from the
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reporter dye. This step generates an increase in fluorescent signal upon excitation by a light source of
the appropriate wavelength. With each cycle additional dye molecules are separated from their
quenchers resulting in an increase in the fluorescent signal. If sufficient fluorescence is achieved the
sample is reported as positive for the detected nucleic acid.
Materials Provided
SKU # M105
Assay Kit (96 Reactions) – Store at 2° to 8°C
#


Component
Quantity
Rehydration Solution Part M5003
1 vial/kit 1.9 mL
Quidel Molecular C. difficile Master Mix Part M5043
12 vials/kit
8 reactions/vial
SKU # M207
Rapid DNA Stool Sample Prep Kit (96 Specimens) – Store at 2° to 25°C
#


Component
Quantity
Process Buffer 1 Part M5032
96 tubes/kit 500 µL
Process Buffer 2 Part M5033
Contains Process Control
96 tubes/kit 570 µL
Neonatal flocked Swabs Part M5034
96 swabs
Optional Material
External controls for toxigenic C. difficile (e.g., Quidel Molecular C. difficile Control Set #M108; these
controls may serve as external processing and amplification controls and are independent of the PRC).
Materials Required But Not Provided
Micropipettors (range between 1 to 10 μL or 2 to 20 μL and 100 to 1000 μL)
Non-aerosol pipette tips
Applied Biosystems 7500 Fast Dx or Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument System
96 well PCR plate
Applied Biosystems optical plate films
Plate centrifuge for 7500 series 96 well plate
Or
Micropipettors (range between 1 to 10 μL and 100 to 1000 μL)
Non-aerosol pipette tips
SmartCycler II instrument
SmartCycler disposables
SmartCycler centrifuge
Warnings and Precautions
For In Vitro Diagnostic Use
Performance characteristics of this test have been established with the specimen types listed in the
Intended Use Section only. The performance of this assay with other specimen types or samples has not
been evaluated.
Using cycling conditions other than those indicated in the Thermocycler Programming Instructions section
may give erroneous results.
Use of this product should be limited to personnel with sufficient training in PCR techniques.
Treat all specimen/samples as potentially infectious. Follow universal precautions when handling
samples, this kit, and its contents.
Proper sample collection, storage, and transport are essential for correct results.
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Store assay reagents as indicated on their individual labels.
Wear suitable protective clothing, gloves, eye and face protection when using this kit.
For accurate results, pipette carefully using only calibrated equipment.
Thoroughly clean and disinfect all surfaces with a 10% bleach solution followed by molecular grade water.
Use micropipettes with an aerosol barrier or positive displacement tips for all procedures.
Avoid microbial and cross contamination of the kit reagents. Follow Good Laboratory Procedures.
Do not mix reagents from kits with different lot numbers.
Do not use/substitute reagents from other manufacturers with this kit.
Do not use this product after its expiration date.
Proper workflow planning is essential to minimize contamination risk. Always plan laboratory workflow in
a uni-directional manner, beginning with pre-amplification and moving through amplification and
detection.
Use dedicated supplies and equipment in pre-amplification and amplification areas.
Do not allow cross movement of personnel or equipment between areas.
Keep amplification supplies separate from pre-amplification supplies at all times.
Do not open sample tubes or unseal plates post amplification.
Dispose of amplified material carefully and in accordance with local laws and regulations in order to
minimize the risk of amplicon contamination.
Do not use supplies, materials or pipettors dedicated for reagent or sample preparation for processing
amplified products.
MSDS is available upon request or can be accessed on the product website.
Do not vortex Process Buffer 1 as this will cause excessive foaming, which may increase the likelihood of
sample cross contamination.
Storage and Handling of Kit Reagents
Store the unopened Assay Kit at 2° to 8°C and the Rapid DNA Stool Sample Prep Kit at 2° to 25°C until the
expiration date listed on the outer kit box.
The rehydrated Master Mix must be used within 60 minutes. For longer storage the rehydrated Master
Mix should be recapped, sealed with parafilm and stored in an upright position at ≤–20°C for up to 3 days.
Protect the Master Mix from light during storage.
Indications of Instability or Deterioration of Reagents:
Rehydration Solution: Cloudiness of the Rehydration Solution may indicate deterioration of this reagent.
Contact Quidel Technical Support for a replacement.
Process Buffer 1: Upon refrigerated storage, Process Buffer 1 may have white precipitate in the vial. This is
not an indication of instability or deterioration. Please equilibrate the Process Buffer 1 at room
temperature if removing from cold storage. Do not use Process Buffer until precipitate has been dissolved.
Storage at 20° to 25°C may be more convenient.
Specimen Collection, Storage, and Handling
Single or multiple freshly passed fecal specimens are collected into a clean container. Swab specimens are
inadequate as the sample is too small and susceptible to variation in storage temperature. Specimens
collected after a barium enema or other treatment should be avoided. Specimens should be transported in
tightly sealed, leak proof plastic containers. If specimens can be processed within 3 to 4 hours after collection,
transport at room temperature is adequate. Specimens delayed to the laboratory should be promptly cooled
and kept at either 2° to 8°C or -20°C for up to 7 days. Ship samples on ice if transported over long distances.
Specific requirements for shipping specimens should follow recommendations found in section 42 and 49 of
the Code of Federal Regulation, CFR.
Processed Specimen Storage
Specimens diluted in Process Buffer 1 and Process Buffer 2 may be stored at room temperature (20° to 25 C)
for up to 7 days in total. Specimens in Process Buffer 2 should not be refrigerated or frozen!
Initial Thermocycler Programming
7500 Fast DX Programming Instructions
1.
Launch the Applied Biosystems 7500 Fast Dx software package. If SDS unit is not powered, a warning
window will open. Select the Cancel button.
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2.
The Quick Startup document dialog window will open. Select the Create New Document button to
start the New Document Wizard. Follow each step to initiate the Quidel Molecular Direct C. difficile
protocol.
a. Define Document: Most of the following should be the default setting. If not, change
accordingly.
i. Confirm or enter the following information
Assay: Standard Curve (Absolute Quantitation)
Container: 96-Well Clear
Template: Blank Document
Run Mode: Fast 7500
Operator: Your operator name
Comments: SDS v1.4
Plate Name: Quidel Molecular Direct C difficile
b.
c.
d.
ii. Select the Next button
Select Detectors: New detectors for C. difficile and the process control (PRC) must be
added. For each target, select the New Detector button to open the New Detector pop-up
window. Alternatively, use the Create Another button from within the New Detector popup window for the last detector.
i. Enter the following information for each detector.
Name
Reporter Dye
Quencher Dye
Color
C. difficile
JOE
(none)
(Select)
PRC
CY5
(none)
(Select)
ii. Select a unique color to represent each detector
iii. Highlight the new detectors and add to the Detectors in Document column using
the Add button.
iv. Select (none) from the Passive Reference drop-down menu.
v. Select the Next button.
vi. Select the Finish button without setting any wells.
The wizard will close and the software will open, starting with the Setup tab. This will show
the sample plate that was set up during the quick start. For the initial set up, nothing
needs to be changed here.
Defining the Theromocycler Protocol: Select the Instrument tab to set up the Quidel
Molecular Direct C. difficile PCR cycling times and temperatures. Under Thermal Profile
there should be a default 2-stage protocol. Each stage will have 3 user-editable text boxes.
The top box value represents the number of reps or cycles for that stage. The middle box
value represents the temperature (˚C) and the lowest box value represents the time
(minutes: seconds).
i. Make the following changes to the default Thermal Cycler Protocol:
1. Stage 1
a. Reps: 1
b. Temp: 92
c. Time: 2:00
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2.
3.
4.
Stage 2 (3-Step Amplification Stage)
a. Reps: 15
b. Step 1
i. Temp: 92
ii. Time: 0:05
c. Step 2
i. Temp: 57
ii. Time: 0:05
Note: Select bar to right of Stage, Step 2. Select the Add Step button to
add another step.
d. Step 3
i. Temp: 68
ii. Time: 0:25
Select the bar to the right of Stage 2. Select the Add Cycle button to add
another stage.
Stage 3 (3-Step Amplification Stage)
a. Reps: 35
b. Step 1
i. Temp: 92
ii. Time: 0:05
c. Step 2
i. Temp: 57
ii. Time: 0:05
d. Step 3
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i. Temp:
ii. Time:
5.
68
0:25
If a wrong stage is added the stage can be removed by pressing the Delete
button after highlighting the stage between the vertical lines.
ii. Under Settings enter the following:
Sample Volume (μL): 20 (default)
Run Mode:
Data Collection:
7500 Fast (default)
Stage 3, Step 3(68.0 @ 0:25)
NOTE: Do not check the check box next to ‘Expert Mode’.
iii. Final protocol
e.
Set threshold for each analyte
i. Select the Results tab
ii. Select the Amplification Plot tab
iii. Select C. difficile from the Detector tab in the top right corner
iv. In the Analysis Settings block, set the Threshold to 4.0e4
v. Select the Auto Baseline radio button
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vi. Repeat iii-v for PRC, setting the Threshold to 3.0e4
f.
g.
Save the new protocol as a template for future uses.
i. At the top of the screen select File and then Save As
ii. Save In: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. File name: ‘Quidel Molecular C difficile’
iv. Save as type: ‘SDS Templates (*.sdt)’
Exit the software
QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx Programming Instructions
Quidel Molecular provides a pre-defined template for the assay on a CD that must be uploaded to the
QuantStudio™ Dx instrument. Please contact a Quidel Representative at (800) 874-1517 (toll-free in the U.S.A.)
or (858) 552-1100, Monday through Friday, between 8:00 a.m. and 5:00 p.m., Eastern Time to obtain this CD.
These templates contain the run parameters such that no instrument programming is needed to get started.
To install a test definition document:
1. From the QuantStudio™ Dx Software Home tab, click Manage Test in the Tools panel.
2. From the Test Menu, click Install.
3. Navigate to your test definition document (.tdd) file, select the file, and click Open. The QuantStudio™
Dx Software automatically adds the selected test to the Test Menu.
4. Click Close to close the Test Menu and save your changes.
SmartCycler II Programming Instructions
1.
2.
Launch the SmartCycler II Dx 3.0b software package.
Create the Quidel Molecular C. difficile assay.
a. Select the Define Assays button from the top of the screen.
b. Name the assay:
i. Select the New button at the bottom left corner of the screen
ii. Type in ‘Quidel Molecular C. difficile’ and select OK
iii. ‘Quidel Molecular C. difficile’ will be added to the top of the Assay Name list located on
the upper left-hand of the screen
c. Set the analysis values: Under the Assay Type: Research section select the Analysis Settings tab,
and make sure the following specifications are set.
i. Select FATA25 from the Dye Set drop-down menu
ii. The Analysis Type drop-down menu should be set to Qualitative (Default setting)
iii. In the Channel Name column, enter ‘C. difficile’ for channel 2, and ‘PRC’ for channel 4
iv. In the Usage column, select Unused from the drop-down menu for Channels 1 and 3,
Target for C. difficile and Internal Control for PRC. When selecting the Internal Control,
the window below will pop up. Select the Yes button.
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v. In the Curve Analysis column, enter Primary Curve for each channel (C. difficile, PRC)
(Default setting).
vi. In the Thresh Setting column, enter Manual Threshold for each channel (C. difficile, PRC)
(Default setting).
vii. In the Manual Thresh Flour Units column, enter the following thresholds:
a. C. difficile: 10.0
b. PRC: 10.0
viii. In the Valid Min Cycle column (scroll to the right if not immediately visible), enter 5 for
each channel (C. difficile, PRC).
ix. In the Valid Max Cycle column (scroll to the right if not immediately visible), enter 35 for
each channel (C. difficile, PRC).
x. In the Bkgnd Sub column, use “ON” for each channel (C. difficile, PRC) (Default setting).
xi. In the Bkgnd Min Cycle column, enter 5 for each channel (C. difficile, PRC).
xii. In the Bkgnd Max Cycle column, enter 20 each channel (C. difficile, PRC).
xiii. In the Boxcar Avg Cycles column, keep 0 for each channel (C. difficile, PRC) (Default
setting).
xiv. In the End Pt Threshold column, enter 20 for the C. difficile channel and 10 for the PRC
channel.
xv. In the NC IC% column, keep “NA” for channel (PRC) (Default setting).
xvi. In the IC Delta column, keep “NA” for each channel (C. difficile, PRC) (Default setting).
xvii. In the Customize Result Text section (below the table), select Organism Based Result Text
from the drop-down menu. The warning window below will pop up. Select Yes.
d.
xviii. Select the Customize button to open the Organism-Based Result Text dialog window.
Select the Add button, enter ‘C. difficile’ in the Organism Name column and check the C.
difficile box. Click OK at the bottom of the pop up window.
Set the RT-PCR cycling times and temperatures as follows:
i. Stage 1
1. Hold
2. Temp:
92.0
3. Secs:
120
4. Optics:
OFF
ii. Stage 2
1. 3-Temperature Cycle
2. Times to Repeat:
15
3. First Temperature Row
a. Temp:
92.0
b. Secs:
5
c. Optics:
OFF
4. Second Temperature Row
a. Temp:
57.0
b. Secs:
5
c. Optics:
OFF
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5.
Third Temperature Row
a. Temp:
66
b. Secs:
25
c. Optics:
OFF
iii. Stage 3
1.
2.
3.
3.
3-Temperature Cycle
Times to Repeat:
35
First Temperature Row
a. Temp:
92
b. Secs:
5
c. Optics:
OFF
4. Second Temperature Row
a. Temp:
57
b. Secs:
5
c. Optics:
OFF
5. Third Temperature Row
a. Temp:
66
b. Secs:
25
c. Optics:
ON
Save the protocol by selecting the Save button at the bottom of the screen.
Assay Procedure
Run the following procedures at controlled room temperature of 20° to 25°C.
Sample Process Procedure
Prior to sampling specimen, remove and discard mucus using a swab or transfer pipette. Only fecal material
should be used in the assay. Note: Remove mucus from the specimen prior to sampling the fecal material.
Failure to sample the fecal material due to excess mucus may lead to false negative results. Samples containing
an excess amount of mucus should not be tested.
1. To collect sample from a liquid specimen, insert head of swab completely into the stool specimen.
Touch swab to inner side of tube to remove excess liquid. To collect sample from a semi-solid
specimen, insert head of swab completely into stool specimen in a minimum of four locations. Rotate
swab against inside of specimen tube to remove excess stool so that shape of swab head is clearly
visible. For optional liquid positive control, treat as a liquid specimen and collect control sample using
supplied swab.
2. Dip the neonatal swab into Process Buffer 1 and twirl 4-5 seconds to remove stool from swab and to
mix.
3. Pipette 30 µL from Process Buffer 1 into Process Buffer 2. Pipette up and down 4-5 times with a
calibrated pipette set at 570 µL.
Note: Specimens diluted in Process Buffer 1 and Process Buffer 2 may be stored at room temperature
(20° to 25 C) for up to 7 days in total.
CAUTION: Specimens in Process Buffer 1 and Process Buffer 2 should not be refrigerated or frozen!
Master Mix Rehydration Procedure
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Determine the number of specimens to be tested, and obtain the correct number of eight-test
lyophilized Master Mix vials for testing.
Return unused reagents to the appropriate storage conditions.
Open Master Mix carefully to avoid disruption of the pellet.
Add 135 µL of Rehydration Solution to the Master Mix.
Place vial at room temperature for 1 to 2 minutes to allow rehydration of pellet.
Gently pipette up and down 2 to 3 times (avoiding bubble formation) prior to dispensing into the first
plate well.
Note: The rehydrated Master Mix is sufficient for eight reactions.
Note: The rehydrated Master Mix must be used within 60 minutes. For longer storage the rehydrated
Master Mix should be recapped, sealed with parafilm and stored in an upright position at ≤–20°C for
up to 3 days. Protect the Master Mix from light during storage.
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PCR Set-up Procedure:
1.
2.
3.
4.
5.
Add 15 µL of the rehydrated Master Mix to each reaction tube or plate well.
Add 5 µL of specimen in Process Buffer 2 into the reaction tubes or plate wells. Mixing of reagents is
not required.
Note: Use a micropipettor with a new non-aerosol tip with each extracted specimen.
Close the reaction tubes or seal the plate.
Note: Quidel suggests each thermocycler run should include a well with External Controls (e.g., Quidel
Molecular C. difficile Control Set #M108). Run controls in keeping with your lab practices and policies.
Centrifuge the reaction tubes or plate for a minimum of 15 seconds. Ensure that all liquid is at the
bottom of the plate well or tube.
Insert tubes or plate into the thermocycler.
Amplification Protocol on the 7500 Fast Dx Thermocycler
1.
2.
3.
4.
5.
Switch on 7500 Fast Dx.
Launch the 7500 Fast Dx software package.
The Quick Startup document dialog window will open.
Click on Create a new document.
Most of the following should be the default setting. If not, change accordingly.
Assay:
Container:
96-Well Clear
Template:
Quidel Molecular C. difficile
Run Mode:
Operator:
Comments:
Plate Name:
6.
7.
8.
Standard Curve (Absolute Quantitation)
Fast 7500
Your operator name
SDS v1.4 (add more if needed)
YYMMDD-Quidel Molecular C difficile
Set Up Sample Plate
a. Under the Setup and Plate tabs the plate setup will appear.
b. Select all wells that will contain sample, right-click and select the Well Inspector from the dropdown menu. When the Well Inspector pop-up window opens, select the detectors for C. difficile
and PRC.
c. Use the Well Inspector to enter the sample names. Patient IDs may be entered in the Well
Inspector window; however it is recommended that this is done prior to resuspending the
lyophilized master mix, post run, or using the import function to minimize the time the PCR
reactions will sit at room temperature prior to starting the run.
d. Save the run with a unique identifier as an “.sds” file (e.g., YYMMDD-runID#-Quidel Molecular C
difficile.sds).
e. A window will open asking for the “Reason for change of entry.” Enter “Setup” and any other
comments relevant to the run.
Starting the PCR
a. Select the Instrument tab.
b. Insert the 96 well PCR plate into the machine.
c. Under Instrument Control, select the Start button to initiate the run.
Post PCR
a. IMPORTANT: When the run is finished, press OK. Analyze the data by pressing the “Analyze”
button in the top menu, and save the file.
b. Save the file by pressing Save Document in the task bar. A window will open asking for the
“Reason for change of entry.” Enter “Data analysis post run” and any other comments relevant
to the run.
Amplification Protocol on the QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Switch on QuantStudio Dx.
Choose IVD mode on the instrument.
Launch the QuantStudio Dx IVD software package.
Enter the system Username and Password when prompted.
The Home screen window will open.
In the Setup box, highlight the previously loaded test name “Quidel Molecular Direct C. difficile.”
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7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Click the Setup button to begin a run.
The Setup, Test Properties screen will be displayed. Enter run information accordingly.
a. Enter the Experiment Name (default setting launches the run with a date and time stamp).
b. Enter the Plate Barcode information.
c. Record material lot numbers under Reagent Information.
d. Save the run with a unique identifier as an “.sds” file (e.g., YYMMDD-runID#-Quidel Molecular C
difficile.sds)
e. A window will open asking for the “Reason for change of entry.” Enter “Setup” and any other
comments relevant to the run.
In the left menu bar, select Define.
Edit sample information.
a. Enter specific sample information for each well by deleting the default identifier (Patient 1,
Patient 2, etc.) and entering new information, OR
b. Select Import from File across the top of the display to upload a predefined plate map from a
Text (tab delimited) file.
In the left menu bar, select Assign to verify proper plate setup.
Loading the sample plate.
a. Eject the instrument tray.
b. Insert the 96-well PCR plate into the machine with the A1 well positioned in the top, left corner.
c. Retract the instrument tray.
Starting the run.
a. In the left menu bar, select Run.
b. Click the green Start Run button at the top of the screen.
i. If prompted, select the serial number specific to the instrument being used.
When the run is complete, select Analysis in the left menu bar.
a. Save the file by pressing Save in the task bar. A window will open asking for the “Reason for
change of entry.” Enter “Data analysis post run” and any other comments relevant to the run.
b. The Amplification Plot will show by default. To view other plot types, select them from the left
menu bar.
c. To view run information with Ct values, select the Well Table tab in the right side of the screen.
Printing a report.
a. In the top menu bar, select Print Report. Customize the report contents by selecting or
deselecting boxes from the report window.
b. Select the “Print Report” button at the bottom of the dialogue box.
Exporting data files.
a. In the left menu bar, select Export.
b. Enter the Export File Location OR click Browse to locate the desired path.
c. The Export File Name will default to that of the saved run.
d. Select Excel as the file type.
e. Customize the exported data report by toggling across the provided tabs and selecting or
deselecting options.
f. Select Start Export along the bottom of the screen.
Amplification Protocol on the SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Switch on SmartCycler Block(s).
Launch the SmartCycler Dx Version 3.0b software package.
Select the Create Run button from the top of the screen to set up the run.
Under Run Name, enter a unique identifier for the current run (e.g., YYMMDD-run ID#_Quidel
Molecular C. difficile).
Under Notes, enter any notes about the run for future reference.
Under Assay, select the ‘Quidel Molecular C. difficile’ assay from the drop-down menu.
Under Assay Information, enter lot number and expiration date of the kit.
To select the wells that will be used, do one of the following:
a. To automatically assign wells do the following:
i. Under Number of specimens, enter the number of samples in the provided text box.
ii. Select the Apply button. The entered number of rows will appear in the Site Table.
b. To manually choose wells on the SmartCycler blocks, do the following:
i. Select the Add/Remove Sites button towards the bottom of the screen.
Page 13 of 26
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
ii. This will open the Select Sites pop-up window with two columns. The column on the left
(Sites) lists all available sites, and the column on the right (Selections) holds all selected
sites.
iii. To select all sites, click the Select All Sites button.
iv. To select specific sites, highlight one or more sites, and select the right arrow to add the
site(s) to the Selections column.
v. Select the OK button to close the window. The selected sites will appear in the Site Table.
Enter the sample identifiers under the Sample ID column within the Site Table (this can also be done
after the run is started).
Enter any notes under the Notes column, and leave the Sample Type column entries as ‘SPEC’.
Select the Start Run button at the bottom of the screen.
Select View Results tab after the run is finished.
Save the run after it is finished and prior to exiting the software.
Select Sample Results tab.
The SmartCycler software will automatically report whether C. difficile has been detected in the
samples or whether the run was invalid (unresolved).
Interpretation of Results
Interpretation of Results using the 7500 Fast Dx Thermocycler
Assay
Result
Negative
C. difficile
Positive
Interpretation of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay Results on the
Applied Biosystems 7500 Fast DX Thermocycler
Detector:
Detector:
C. difficile
Process Control
No Ct-value
Ct-value reported No toxigenic C. difficile DNA detected
Reported
Ct-value reported
NA*
Toxigenic C. difficile DNA detected
No toxigenic C. difficile DNA and No PRC detected;
for invalid test results, retest the same processed
No Ct-value
No Ct-value
sample first. If the test is invalid upon retesting
Invalid
Reported
Reported
with the processed sample, re-process another
aliquot of the same sample or obtain a new sample
and re-test.
*No Ct value is required for the Process control to make a positive call.
Interpretation of Results using the Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Assay
Result
Negative
C. difficile
Positive
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Detector:
Detector:
C. difficile
Process Control
No Ct-value
Ct-value reported No toxigenic C. difficile DNA detected
Reported
Ct-value reported
NA*
No toxigenic C. difficile DNA and No PRC detected;
for invalid test results, retest the same processed
No Ct-value
No Ct-value
sample first. If the test is invalid upon retesting
Invalid
Reported
Reported
with the processed sample, re-process another
aliquot of the same sample or obtain a new sample
and re-test.
*No Ct value is required for the Process control to make a positive call.
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Interpretation of Results using the Cepheid SmartCycler II Dx Thermocycler
Assay
Result
Cepheid SmartCycler II Dx Thermocycler
Detector:
Detector:
C. difficile
Process Control
C. difficile
Negative
NEG
Pass
No toxigenic C. difficile DNA detected
C. difficile
Positive
POS
NA*
No toxigenic C. difficile DNA and No PRC detected; for
invalid test results, retest the same processed sample
C. difficile
NEG
Fail
first. If the test is invalid upon retesting with the
Unresolved
processed sample, re-process another aliquot of the
same sample or obtain a new sample and re-test
*No result is required for the Process Control to make a positive call.
Quality Control
The Quidel Molecular Direct C. difficile Assay incorporates several controls to monitor assay performance.
1. The Process control is to be used during sample processing and amplification in the assay. This control is
pre-filled in Process Buffer 2
2. Commercially available external positive C. difficile controls may be treated as a patient specimen and
should be used in accordance with your lab standards. Previously characterized positive C. difficile
specimens may be used lieu of commercial C. difficile controls.
3. A previously characterized negative specimen may be used as an external negative control. This must be
treated as a patient specimen and should be performed in accordance with your lab standards.
Limitations
Negative results do not preclude infection with toxigenic C. difficile and should not be the sole basis of a
treatment decision.
As with other assays of this type, there is a risk of false negative results due to the presence of sequence
variants in the amplification targets.
Improper collection, storage, or transport may lead to false negative results.
Inhibitors present in the sample and/or errors in following the assay procedure may lead to false negative
results.
Improper sampling of the specimen (e.g. mucus) may lead to false negative results.
Clinical Performance
The performance of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was evaluated with specimens collected at
four geographically diverse locations within the United States between August 2012 and November 2012. In
two studies (one study for the ABI 7500 Fast Dx and Cepheid SmartCycler II (665 specimens) and a second
study for the QuantStudio Dx (792 specimens)), the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was compared to
direct and enriched toxigenic C. difficile culture. The tables below present the data from these studies.
Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Performance characteristics of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay were established during a
prospective study conducted August to November 2012. Six hundred sixty-five (665) specimens used for
this study were collected from patients suspected of having Clostridium difficile-associated disease (CDAD)
at four distinct geographical sites across the United States. These specimens were tested with the Quidel
Assay on the 7500 Fast Dx at one of three (3) facilities.
Nine (9) specimens (1.35%) were invalid in the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay when initially
tested. We calculated the age and gender distribution based on the initial test result obtained for each
specimen. Therefore, the patient age and gender data below is for the remaining six hundred fifty-six
(656) specimens.
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Combined Sites – Age and Gender Distribution
Gender
Age
Total
Male
Female
Unknown Gender
Infant
(<2 years)
Child
(≥2 to <12 years)
Adolescent
(≥12 to <18 years)
Transitional Adolescent
(≥18 to ≤21 years)
Adult
(>21 to 59 years)
Sr. Adult
(> 60 years)
Total
3
Prevalence by age of C. difficile positives with
the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay
on the Applied Biosystems 7500 Fast Dx
33.3% (1/3)
12.5% (1/8)
4
4
8
21
18
39
25.6% (10/39)
8
11
19
21.1% (4/19)
5
8
13
15.4% (2/13)
132
146
278
19.1% (53/278)
127
169
296
15.9% (47/296)
297
356
656
18.0% (118/656)
Direct Culture Cytotoxicity Assay Comparison
Six hundred sixty-five (665) specimens were tested by both the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay
and the tissue culture cytotoxin assay. Three specimens (0.5%) were indeterminate in the cytotoxin assay
due to toxicity in the antitoxin well. Nine specimens (1.35%) were invalid in the Quidel Molecular Direct C.
difficile Assay when initially tested. Eight specimens yielded a valid result when retested according to the
Quidel Molecular Direct C. difficile Assay draft package insert (7 were negative, 1 was positive). One
specimen remained invalid upon repeat testing. We calculated clinical performance based on the initial
test result obtained for each specimen. Therefore, the data below is for the remaining six hundred fiftythree (653) specimens.
Combined Sites – Combined Ages
Direct Culture
95% CI
POS
NEG
Total
Sensitivity
94.3% 87.4%
97.5%
Quidel Molecular RealPOS
83
33*
116
Specificity
94.2% 91.9%
95.8%
Time PCR Direct C.
difficile Assay on ABI
NEG
5**
532
537
7500
Total
88
565
653
*
Of the thirty-three (33) discordant specimens (Quidel Molecular Positive/Direct Culture Negative) reported, thirty-two (32)
were tested with a FDA-cleared molecular device. All thirty-two of these specimens were positive for C. difficile. The remaining
specimen was unavailable for testing.
** Five (5) discordant specimens (Quidel Negative/Tissue Culture Cytotoxin Positive) reported were tested with the FDA-cleared
molecular device. All five (5) of these specimens were found to be negative for C. difficile.
Enriched Toxigenic Culture Comparison
and enriched toxigenic culture. Nine specimens (1.35%) were invalid in the Quidel Molecular Direct C.
difficile Assay when initially tested. Eight specimens yielded a valid result (7 were negative, 1 was positive)
when retested according to the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay draft package insert. One
specimen remained invalid upon repeat testing. We calculated clinical performance based on the initial
test result obtained for each specimen. Therefore, the data below is for the remaining six hundred fifty-six
(656) specimens.
Enhanced Toxigenic Culture
POS
NEG
Quidel Molecular Direct
POS
112
6*
C. difficile Assay on
NEG
14**
524
ABI 7500
Total
126
530
Total
118
538
656
Sensitivity
Specificity
88.9%
98.9%
95% CI
82.2%
93.3%
97.6%
99.5%
*
Six (6) discordant specimens (Quidel Molecular Positive/Enriched Toxigenic Culture Negative) reported were tested with a FDAcleared molecular device. All of these specimens were positive for C. difficile.
** Twelve (12) discordant specimens (Quidel Negative/ Enriched Toxigenic Culture Positive) reported, were tested with a FDAcleared molecular device. Two (2) specimens were unavailable for testing. Nine (9) of these specimens were found negative for
C. difficile, and three (3) were positive.
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Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument System
prospective study conducted August to November 2012. Seven hundred ninety-two (792) samples used
for this study were collected from patients suspected of having Clostridium difficile-associated disease
(CDAD) at four (4) distinct geographical sites across the United States. These specimens were tested with
the Quidel Assay on the QuantStudio Dx Instrument at one of three (3) facilities. One (1) specimen (0.1%)
was invalid in the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay when initially tested. We calculated age and
gender distribution based on the initial test result obtained for each specimen. Therefore, the patient age
and gender data below is for the remaining seven hundred ninety-one (791) specimens.
Age
Unknown Gender
Infant
(<2 years)
Child
(≥2 to <12 years)
Adolescent
(≥12 to <18 years)
(≥18 to ≤21 years)
Adult
(>21 to 59 years)
Senior Adult
(> 60 years)
Total
Gender
Male
Female
Total
2
Prevalence by age of C. difficile positives
with the Quidel Molecular Direct C.
difficile Assay on the QuantStudio
50.0% (1/2)
5
5
10
10.0% (1/10)
28
21
49
24.5% (12/49)
10
14
24
20.8% (5/24)
6
7
13
7.7% (1/13)
158
170
328
18.3% (60/328)
163
202
365
17.8% (65/365)
370
419
791
18.3% (145/791)
Direct Culture Assay Comparison
Seven hundred and ninety-two samples were tested by both the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay
and the direct culture assay. Three (3) specimens (0.4%) were indeterminate in the cytotoxin assay due to
toxicity in the antitoxin well. One (1) specimen (0.1%) was invalid in the Quidel Molecular Direct C. difficile
Assay when initially tested. The specimen yielded a valid result when retested according to the Quidel
Molecular Direct C. difficile Assay draft package insert (it was negative). We calculated clinical
performance based on the initial test result obtained for each specimen. Therefore, the data below is for
the remaining seven hundred eighty-eight (788) specimens.
Tissue Culture Cytotoxin
POS
NEG
POS
98
45*
C. difficile Assayon
NEG
7**
638
LTI QuantStudio
Total
105
683
Total
143
645
788
Sensitivity
Specificity
93.3%
93.4%
95% CI
86.9%
96.7%
91.3%
95.0%
*
Of the forty-five (45) discordant specimens (Quidel Molecular Positive/Direct Culture Negative) reported, forty-four (44) were
tested with a FDA-cleared molecular device. Thirty-five (35) of these specimens were positive for C. difficile, and nine (9) were
negative. The remaining specimen was unavailable for testing.
** Seven (7) discordant specimens (Quidel Negative/Direct Culture Positive) reported were tested with a FDA-cleared molecular
device. Two (2) of these specimens were found positive for C. difficile, and five (5) were negative.
Seven hundred ninety-two (792) samples were tested by both the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay
and enhanced toxigenic culture. One (1) specimen (0.1%) was invalid in the Quidel Molecular Direct C.
difficile Assay when initially tested. The specimen yielded a valid result (it was negative) when retested
according to the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay draft package insert. We elected to calculate
clinical performance based on the initial test result obtained for each specimen. Therefore, the data below
is for the remaining seven hundred ninety-one (791) specimens.
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Enriched Toxigenic Culture
POS
NEG
POS
137
8*
NEG
20**
626
LTI QuantStudio
Total
157
634
Total
145
646
791
Sensitivity
Specificity
87.3%
98.7%
95% CI
81.1%
91.6%
97.5%
99.4%
*
Eight (8) discordant specimens (Quidel Molecular Positive/Enriched Toxigenic Culture Negative) reported were tested with a
FDA-cleared molecular device. Two (2) of these specimens were positive for C. difficile, and six (6) were negative.
** Seventeen (17) out of twenty (20) discordant specimens (Quidel Negative/ Enriched Toxigenic Culture Positive) reported, were
tested with a FDA-cleared molecular device. Three (3) specimens were unavailable for testing. Eleven (11) of these specimens
were found negative for C. difficile, and six (6) were positive.
Cepheid SmartCycler II
prospective study conducted August to November 2012. Six hundred sixty-five (665) specimens used for
this study were collected from patients suspected of having Clostridium difficile-associated disease (CDAD)
at four distinct geographical sites across the United States. These specimens were tested with the Quidel
Assay on the SmartCycler II at one of three (3) facilities.
Five (5) specimens (0.75%) were invalid in the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay when initially
tested. We calculated the age and gender distribution based on the initial test result obtained for each
specimen. Therefore, the patient age and gender data below is for the remaining six hundred sixty (660)
specimens.
Age
Unknown Gender
Infant
(<2 years)
Child
(≥2 to <12 years)
Adolescent
(≥12 to <18 years)
(≥18 to ≤21 years)
Adult
(>21 to 59 years)
Senior Adult
(> 60 years)
Total
Gender
Male
Female
3
Prevalence by age of C. difficile positives with
the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay
on the Cepheid SmartCycler II
33.3% (1/3)
Total
4
4
8
12.5% (1/8)
21
18
39
23.1% (9/39)
8
11
19
15.8% (3/19)
5
8
13
7.7% (1/13)
133
147
280
18.6% (52/280)
129
169
298
17.1% (51/298)
300
357
660
17.9% (118/660)
Direct Culture Assay Comparison
and the direct culture assay. Three (3) specimens (0.5%) were indeterminate in the cytotoxin assay due to
toxicity in the antitoxin well. Five (5) specimens (0.75%) were invalid in the Quidel Molecular Direct C.
difficile Assay when initially tested. All five (5) specimens yielded a valid when retested according to the
Quidel Molecular Direct C. difficile Assay draft package insert result (3 were negative, 2 were positive).
We calculated clinical performance based on the initial test result obtained for each specimen. Therefore,
the data below is for the remaining six hundred fifty-seven (657) specimens.
Page 18 of 26
Tissue Culture Cytotoxin
POS
NEG
POS
78
38*
NEG
9**
532
Total
87
570
Total
116
541
657
Sensitivity
Specificity
89.7%
93.3%
95% CI
81.5%
94.5%
91.0%
95.1%
* The thirty-three (38) discordant specimens (Quidel Molecular Positive/Direct Culture Negative) reported were tested with a FDAcleared molecular device. Nine (9) of these specimens were negative for C. difficile, and twenty-nine (29) were positive for C.
difficile.
** Eight (8) of the nine (9) discordant specimens (Quidel Negative/Direct Culture Positive) reported were tested with a FDA-cleared
molecular device. One (1) specimen was unavailable for testing. Five (5) of these specimens were found to be negative for C.
difficile, and three (3) were found to be positive.
and enriched toxigenic culture. Five (5) specimens (0.75%) were invalid in the Quidel Molecular Direct C.
difficile Assay when initially tested. All five (5) specimens yielded a valid result when retested according to
the Quidel Molecular Direct C. difficile (3 were negative, 2 were positive). We elected to calculate clinical
performance based on the initial test result obtained for each specimen. Therefore, the data below is for
the remaining six hundred sixty (660) specimens.
Enhanced Toxigenic Culture
POS
NEG
POS
103
15*
Cepheid
NEG
22**
520
SmartCycler II
Total
125
535
Total
118
542
660
Sensitivity
Specificity
82.4%
97.9%
95% CI
74.8%
88.1%
95.4%
98.3%
* Fifteen (15) discordant specimens (Quidel Molecular Positive/Enriched Toxigenic Culture Negative) reported were tested with a
FDA-cleared molecular device. Six (6) of these specimens were positive for, nine (9) of these specimens were negative.
** Nineteen (19) of the twenty-two (22) discordant specimens (Quidel Negative/ Enriched Toxigenic Culture Positive) reported were
tested with a FDA-cleared molecular device. Three (3) specimens were unavailable for testing. Ten (10) of these specimens were
found to be positive for C. difficile, and nine (9) were found to be negative.
Analytical Performance
Level of Detection
The analytical sensitivity (limit of detection or LoD) of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was
determined using quantified (CFU/mL) cultures of two C. difficile strains (ATCC BAA-1870 and ATCC BAA-1872)
serially diluted in a negative fecal matrix. Analytical sensitivity (LoD) is defined as the lowest concentration at
which 95% of all replicates tested positive.
Strain Designation
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Strain Designation
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Calculated CFU/mL CFU per Assay at
Toxinotype
at LoD
LoD
IIIb
8.4E+04
4.2E-01
0
2.4E+04
1.2E-01
LoD Confirmation
Results
60/60
59/60
Life Technologies QuantStudio
Calculated CFU/mL CFU per Assay at
Toxinotype
at LoD
LoD
IIIb
8.4E+04
4.2E-01
0
8.0E+03
4.0E-02
LoD Confirmation
Results
20/20
20/20
Strain Designation
Toxinotype
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
IIIb
0
Calculated CFU/mL
at LoD
8.4E+04
2.4E+04
CFU per Assay at
LoD
4.2E-01
1.2E-01
LoD Confirmation
Results
58/60
60/60
Page 19 of 26
Analytical Reactivity (Inclusivity)
The analytical reactivity of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was determined using quantified
(CFU/assay) C. difficile strains of various toxinotypes, including hypervirulent strains; quantified strains were
diluted in a negative fecal matrix at 2-3X LoD.
C. difficile Strain
Toxinotype
Concentration
(CFU/assay)
Result
ATCC 43255
0
5.0E-2
Positive
CCUG 8864
X
1.2E-01
Positive
CCUG 37770
IV
6.6E-01
Positive
ATCC BAA-1875
V
9.8E-01
Positive
ATCC 43598
VIII
1.14E+00
Positive
CCUG 37774
XXIII
1.0E-01
Positive
CCUG 9004
n/a
9.5E-01
Positive
ATCC BAA-1874
0
2.0 E-01
Positive
ATCC 43600
0
7.4 E-01
Positive
ATCC BAA-1871
0
3.0 E-02
Positive
ATCC BAA-1803
IIIc
1.2 E-01
Positive
ATCC 700792
0
1.11 E+00
Positive
ATCC 43599
0
1.3 E-01
Positive
CCUG 60276
n/a
1.01 E-01
Positive
CCUG 60275
n/a
6.8 E-01
Positive
CCUG 37778
n/a
3.4 E-01
Positive
CCUG 37777
n/a
7.3 E-01
Positive
CCUG 37776
n/a
1.6 E-01
Positive
CCUG 37773
n/a
9.0 E-02
Positive
ATCC 17857
0
5.6 E-01
Positive
ATCC 43594
0
8.0 E-02
Positive
ATCC 43596
0
7.3 E-01
Positive
ATCC BAA-1872
0
4.2E-01
Positive
ATCC BAA-1870
IIIb
1.2E-01
Positive
Analytical Specificity (Cross-reactivity and Microbial Interference)
The analytical specificity of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was evaluated by testing a panel
consisting of sixty-six (66) bacterial, viral and yeast microorganisms representing common enteric pathogens,
flora or nucleic acid commonly present in the intestine, as well as human DNA. Microorganisms or nucleic acids
were mixed with pooled negative matrix and tested directly, and in the presence of 2 to 3x LoD level of C.
difficile for cross-reactivity and microbial interference, respectively. These studies were conducted on the ABI
7500 only.
Page 20 of 26
The table below summarizes the data from these studies. There was no evidence of cross reactivity or
interference with any of the panel members and the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay.
Organisms ID
Identification
Concentration
tested
(CFU/mL or
PFU/mL)
Acinetobacter baumannii
Aeromonas hydrophila
Alcaligenes faecalis subspecies
faecalis
Bacillus cereus
Bacteroides fragilis
Campylobacter coli*
Campylobacter jejuni sub sp
.jejuni
Candida albicans
Citrobacter freundii
Clostridium bifermentans
Clostridium botulinum
Clostridium butyricum
Clostridium difficile (nontoxigenic)
Clostridium difficile (nontoxigenic)
Clostridium haemolyticum*
Clostridium novyi
Clostridium orbiscindens
Clostridium perfringens (Strain:
Type A)
Clostridium scindens
Clostridium septicum
Clostridium sordellii
Clostridium sporogenes
Edwardsiella tarda
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Enterococcus faecalis vanB
Escherichia coli
Escherichia coli O157:H7
Helicobacter pylori
Klebsielia oxytoca
Lactobacillus acidophilus
Listeria
monocytogenes(Serotype 1/2b)
Peptostreptococcus anaerobius
Plesiomonas shigelloides
ZM 081597
ATCC 7966
5.27E+08
2.09E+10
Negative
Negative
Results
Microbial
Interference
C. difficile
Result
ATCC BAA1870
Positive
Positive
ATCC 15554
4.65E+09
Negative
Positive
Positive
ATCC 13472
CCUG 4856
CCUG 36995
1.00E+07
1.77E+08
5.30E+08
Negative
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
ATCC 33292
1.72E+07
Negative
Positive
Positive
Crossreactivity
C. difficile
Result
Microbial
Interference
C. difficile
Result
ATCC BAA1872
Positive
Positive
ATCC 10231
3.00E+07
ATCC 8090
2.38E+09
ATCC 638
2.05E+07
In silico analysis
CCUG 47601
1.75E+07
Negative
Positive
Positive
Negative
Positive
Positive
Negative
Positive
Positive
No in silico cross reactivity observed
Negative
Positive
Positive
ATCC 43601
4.58E+06
Negative
Positive
Positive
ATCC 43593
1.13E+06
Negative
Positive
Positive
ATCC 9650
CCUG 57219
ATCC 49531
3.43E+09
6.50E+06
5.30E+06
Negative
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
ZM 0801585
3.37E+07
Negative
Positive
Positive
ATCC 35704
ATCC 12464
ATCC 9714
Z077
CCUG 6329
CCUG 9284
CCUG 33098
CCUG 36938
CCUG 43123
CCUG 47545
CCUG 59819
ATCC 11437
ATCC 15947
ATCC 13048
ATCC 13047
ATCC 51299
ATCC 23511
ZM 0801622
ZM 0801486
ATCC 33496
ATCC 4356
1.62E+07
6.60E+09
1.94E+06
2.07E+08
9.85+E07
6.50E+07
2.00E+07
5.55E+07
2.50E+07
1.36E+07
7.00E+06
3.55E+07
2.03E+09
1.31E+10
5.95E+08
3.45E+09
1.92E+09
2.20E+09
3.57E+06
1.63E+09
6.82E+07
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
ZM 0801534
1.18E+10
Negative
Positive
Positive
ATCC 27337
ATCC 14029
5.80E+08
1.40E+08
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Page 21 of 26
Organisms ID
Porphyromonas
asaccharolytica
Prevotella melaninogenica
Proteus mirabilis
Providencia alcalifaciens
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella cholerasuis
(typhimurium)
Salmonella enterica subspecies
Arizonae (formerly
Choleraesuis arizonae)
Salmonella enteric subspecies
enterica (formally Salmonella
choleraesuis)
Serratia liquefaciens
Serratia marcescens
Shigella boydii
Shigella dysenteriae
Shigella sonnei
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus agalactiae
(Group B Streptococcus)
Vibrio parahaemolyticus
Adenovirus 1 VR-1*
Rotavirus (Strain: WA)*
Norovirus GII
Enterovirus 71
Echovirus 6
Coxsackievirus B4
Cytomegalovirus Towne VR977
Results
Microbial
Interference
C. difficile
Result
ATCC BAA1870
Microbial
Interference
C. difficile
Result
ATCC BAA1872
Identification
Concentration
tested
(CFU/mL or
PFU/mL)
CCUG 7834
1.30E+07
Negative
Positive
Positive
ATCC 25845
ATCC 25933
ATCC 9886
ATCC 35554
5.10E+08
1.06E+09
9.60E+08
2.60E+10
Negative
Negative
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
ATCC 14028
3.55E+10
Negative
Positive
Positive
ATCC 13314
4.22E+09
Negative
Positive
Positive
ATCC 7001
6.80E+09
Negative
Positive
Positive
ATCC 27592
ZM 0801723
ATCC 9207
ATCC 49557
ATCC 29930
ATCC 43300
ATCC 14990
3.79E+10
6.10E+08
8.16E+08
1.26E+10
3.36E+08
6.00E+07
4.00E+08
Negative
Positive
Negative
Negative
Negative
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
ATCC 12386
2.75E+08
Negative
Positive
Positive
ATCC 17802
DHI 62207
ZM
NATROTA-ST
ZM
NATNOVII-ST
DHI 80406
DHI 121506
DHI 92206
9.50E+06
5.67E+05
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
2.32E+08
Negative
Positive
Positive
3.92E+08
Negative
Positive
Positive
4.82E+05
1.05E+09
2.43E+07
Negative
Negative
Negative
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
Positive
DHI 201006
1.48E+06
Negative
Positive
Positive
Crossreactivity
C. difficile
Result
Promega
184 µg/ml
Negative
Positive
Positive
G3041
*Purified nucleic acid was used in the testing of these organisms. Cell counts were approximated based on
nucleic acid concentration and genome size.
Human Genomic DNA
Analytical Specificity – Interfering Substances
The performance of Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was evaluated with potentially interfering
substances that may be present in stool specimens. The potentially interfering substances were evaluated at
relevant levels using the C. difficile strains BAA-1870 and BAA-1872 at a concentration of 2 to 3x LoD. There
was no evidence of interference caused by the following 35 substances tested: Palmitic Acid, Triclosan,
Methicillin, Phenylephrine HCl, Stearic Acid, Mineral Oil, Naproxen Sodium, Aluminum Hydroxide, Magnesium
Hydroxide, Mucin, Barium Sulfate, Cimetidine, Esomeprazole , Magnesium Hydrate, Nystatin, Human Serum
Albumin, Bismuth Subsalicylate, Ethanol, Calcium Carbonate, Glucose, Loperamide HCl, Human Hemoglobin,
Benzalkonium Cl, 5-Aminosalicylic acid, Petroleum Jelly, Cortisol, Zinc Oxide, Sennosides, Whole Blood,
Nonoxynol-9, Miconazole Nitrate Salt, Aluminum Hydroxide/Magnesium Carbonate, Witch Hazel, Vancomycin
HCl, and Human IgA.
Page 22 of 26
Reproducibility Study
The reproducibility of the Quidel Molecular Direct C. difficile Assay was evaluated at 3 laboratory sites.
Reproducibility was assessed using a panel of 4 simulated samples that included medium (5x LoD), low (2x
LoD), high negative (0.3x LoD) C. difficile specimens, and negative samples. Panels and controls were tested at
each site by 2 operators for 5 days (triplicate testing x 2 operators x 5 days x 3 sites = 90 results per level). The
LoD values are based on the values obtained in the LoD study. The panels and controls were extracted and
tested on the Applied Biosystems 7500 Fast DX instrument, the Life Technologies QuantStudio Dx Instrument,
and the Cepheid SmartCycler II instrument.
Reproducibility Results – Applied Biosystems 7500 Fast DX
Site 1
Site 2
Panel Member ID
Results AVE Ct %CV
Results AVE Ct
High Negative
5/29
28.8
15.0
11/30
27.1
0.3x LoD
Low Positive
29/30
23.2
8.4
30/30
22.7
2x LoD
Med Positive 5x
30/30
20.5
5.7
30/30
20.2
LoD
Negative
0/29
N/A
N/A
0/30
N/A
Specimen
Negative Control 0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
Positive Control
30/30
15.8
2.9
30/30
16.2
Reproducibility Results – Life Technologies QuantStudio Dx
Site 1
Site 2
Panel Member ID
Results AVE Ct %CV
Results AVE Ct
High Negative
8/30
22.9
5.0
15/30
22.5
0.3x LoD
Low Positive
30/30
20.4
5.9
30/30
19.0
2x LoD
Med Positive 5x
30/30
18.4
4.2
30/30
17.5
LoD
Negative
0/30
N/A
N/A
0/30
N/A
Specimen
N/A
N/A
0/30
N/A
Positive Control
30/30
15.7
0.6
30/30
15.7
Reproducibility Results – Cepheid SmartCycler II
Site 1
Panel Member ID
Results AVE Ct %CV
High Negative
17/30
23.4
6.6
0.3x LoD
Low Positive
29/30
20.1
4.6
2x LoD
Med Positive 5x
30/30
18.4
9.5
LoD
Negative
0/30
N/A
N/A
Specimen
N/A
N/A
Positive Control
30/30
15.1
3.8
%CV
Site 3
Results AVE Ct %CV
Total
Results
9.0
16/30
27.6
2.8
32/89
7.5
29/30
23.1
6.5
88/90
5.0
30/30
20.4
5.0
90/90
N/A
0/30
N/A
N/A
0/89
N/A
2.6
0/30
30/30
N/A
15.7
N/A
2.9
0/90
90/90
%CV
Results
5.7
15/30
22.5
1.5
38/90
5.1
30/30
19.2
0.8
90/90
2.2
30/30
17.9
0.7
90/90
N/A
0/30
N/A
N/A
0/90
N/A
0.1
0/30
30/30
N/A
15.5
N/A
0.1
0/90
90/90
Site 3
AVE Ct %CV
Site 3
AVE Ct %CV
Total
Results
Results
Site 2
AVE Ct
%CV
Results
22/30
25.3
13.4
26/30
23.4
9.3
65/90
29/29
20.1
5.1
30/30
19.9
6.4
88/89
30/30
18.5
3.1
30/30
18.3
6.4
90/90
0/30
N/A
N/A
0/29
N/A
N/A
0/89
0/30
30/30
N/A
14.8
N/A
2.2
0/29
30/30
N/A
14.5
N/A
3.4
0/89
90/90
Total
Results
Carryover and Cross-contamination Studies
In internal studies, on all three platforms there was no evidence of carry-over/cross contamination with the
Quidel Molecular Direct C. difficile Assay.
Customer and Technical Support
To place an order or for technical support, please contact a Quidel Representative at (800) 874-1517 (toll-free
in the U.S.A.) or (858) 552-1100 (outside the U.S.A.), Monday through Friday, between 8:00 a.m. and 5:00
Page 23 of 26
p.m., Eastern Time. Orders may also be placed by fax at (740) 592-9820. For e-mail support contact
[email protected] or [email protected]. For services outside the U.S.A., please contact your
local distributor. Additional information about Quidel, our products, and our distributors can be found on our
website quidel.com.
\
Intellectual Property
Trademarks
SmartCycler® is a registered trademark of Cepheid Corporation. Applied Biosystems® is a registered trademark
of Life Technologies. QuantStudio™ is a trademark of Life Technologies. TaqMan® is a registered trademark of
Roche. CAL Flour® Orange 560 and Quasar® 670 are registered trademarks of BioSearch Technologies, Inc.
Patents
Dye compounds in this product are sold under license from BioSearch Technologies, Inc. and protected by U.S.
and world-wide patents either issued or under application.
The purchase of this product grants the purchaser rights under certain Roche patents to use it solely for
providing human in vitro diagnostic services. No general patent or other license of any kind other than this
specific right of use from purchase is granted hereby.
Page 24 of 26
Glossary
Contents / Contains
Control
Consult instructions for use
Intended Use
96
Contains sufficient for 96 determinations
Biological risks
Page 25 of 26
References
1
2
Sloan, L. M., B. J. Duresko, D. R. Gustafson, and J. E. Rosenblatt. 2008. Comparison of Real-Time PCR for
Detection of the tcdC Gene with Four Toxin Immunoassays and Culture in Diagnosis of Clostridium difficile
Infection. J. Clin. Micro. 46(6):1996–2001
Archibald, L. K., S. N. Banerjee, and W. R. Jarvis. 2004. Secular trends in hospital-acquired Clostridium difficile
disease in the United States. J. Infect. Dis. 189:1585–1588.
M105 – Quidel Molecular Direct C. difficile Assay Kit
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Germany
Quidel Corporation
Worldwide Headquarters
10165 McKellar Court
San Diego, CA 92121 USA
quidel.com
M105en v2013MAR13
Page 26 of 26
Test C. difficile
Pour la détection qualitative et l'identification de l'ADN bactérien du Clostridium difficile
toxigène à partir d'échantillons de selles
Test moléculaire direct C. difficile Quidel
Page 1 sur 28
Sommaire
Utilisation prévue.................................................................................................................................... 4
Résumé et explication ............................................................................................................................. 4
Principe de la procédure ......................................................................................................................... 4
Matériel fourni ........................................................................................................................................ 5
Matériel facultatif ................................................................................................................................... 5
Matériel requis non fourni ...................................................................................................................... 5
Mises en garde ........................................................................................................................................ 5
Stockage et manipulation des kits de réactifs ........................................................................................ 6
Prélèvement, stockage et manipulation ................................................................................................. 6
Programmation initiale du thermocycleur ............................................................................................. 7
Instructions de programmation 7500 Fast DX .................................................................................... 7
Instructions de programmation de l'appareil d'ACP en temps réel QuantStudio Dx .......................10
Instructions de programmation du SmartCycler II............................................................................10
Procédure de test..................................................................................................................................12
Procédure de prélèvement des échantillons ........................................................................................12
Protocole d'amplification sur le thermocycleur 7500 Fast Dx ..........................................................13
Protocole d'amplification sur l'appareil d'ACP en temps réel QuantStudio Dx ................................14
Protocole d'amplification sur l’instrument SmartCycler II ................................................................15
Interprétation des résultats ..................................................................................................................15
Interprétation des résultats en utilisant le thermocycleur 7500 Fast Dx .........................................15
Interprétation des résultats à l'aide de l'appareil d'ACP en temps réel Life Technologies
QuantStudio Dx .................................................................................................................................16
Interprétation des résultats à l'aide du thermocycleur Cepheid SmartCycler II Dx .........................16
Contrôle qualité ....................................................................................................................................16
Limitations ............................................................................................................................................16
Performance clinique ............................................................................................................................17
Performances analytiques ....................................................................................................................21
Niveau de détection ..........................................................................................................................21
Réactivité analytique (inclusivité) .....................................................................................................21
Spécificité analytique (réactivité croisée et interférence microbienne) ..........................................22
Spécificité analytique – Substances interférentes ............................................................................24
Étude de reproductibilité ..................................................................................................................24
Études de rémanence et de contamination croisée .........................................................................26
Assistance clientèle et technique .........................................................................................................26
Propriété intellectuelle .........................................................................................................................26
Marques déposées ............................................................................................................................26
Page 2 sur 28
Brevets ..............................................................................................................................................26
Glossaire................................................................................................................................................27
Page 3 sur 28
Utilisation prévue
Le test moléculaire direct C. difficile Quidel® est un test de diagnostic qualitatif, multiplexé in vitro conçu pour
la détection directe des séquences de gènes codant de la toxine A (tcdA) ou la toxine B (tcdB) depuis des
souches toxigènes de Clostridium difficile issues d'échantillons de selles non moulées (liquides ou molles)
prélevés sur des patients qui semblent souffrir d'une maladie associée au Clostridium difficile (MACD).
Le test moléculaire direct C. difficile Quidel est une ACP en temps réel qui utilise une préparation brevetée
d'échantillons et des amorces et des sondes fluorescentes. Ce test est réalisable à l'aide du matériel Life
Technologies QuantStudio® Dx, Applied Biosystems 7500 Fast Dx ou Cepheid SmartCycler II afin de procéder à
la détection des séquences géniques associées aux souches de C. difficile toxigènes.
Le test doit être réalisé directement sur les échantillons de selles dont on suspecte qu'ils provoquent une
MACD, ou est simplement indiqué dans le diagnostic d'une MACD.
Résumé et explication
La bactérie C. difficile est une cause majeure de diarrhée et de colite associées aux antibiotiques, qui
1
représente jusqu'à 25 % des cas. On pense que l'exposition aux antibiotiques perturbe la flore intestinale, ce
qui favorise une colonisation opportuniste de la bactérie C. difficile (présente naturellement dans la flore
intestinale chez 3 % des adultes sains). La virulence de cette bactérie C. difficile est censée être médiée par la
production de deux toxines (A et B). Les deux toxigènes (respectivement tcdA et tcdB) se situent dans un locus
de pathogénicité (PaLoc) de 19.6 Kb avec 3 autres gènes. La présence des protéines des deux toxines A et B
n'est pas nécessaire pour établir le pouvoir pathogène. L'incidence et la gravité de la maladie associée à la
2
bactérie C. difficile ayant entraîné de brefs séjours à l'hôpital ont augmenté récemment.
Principe de la procédure
Le test moléculaire direct C. difficile Quidel détecte les acides nucléiques qui ont été préparés à partir d'un
échantillon de patient en utilisant une préparation brevetée d'échantillons. Une ACP en temps réel multiplexée
est effectué en conditions optimisées dans un seul puits générant des amplicons pour chacune des cibles
présentes dans l'échantillon. L'identification est réalisée en utilisant des amorces oligonucléotidiques et des
sondes qui sont complémentaires aux régions conservées dans les gènes tcdA et tcdB du locus de
pathogénicité.
Étiquettes de sonde moléculaire Quidel
Cible
Toxine A
Toxine B
Témoin (PRC)
Colorant
Quasar® 670
Voici un résumé de la procédure :
1. Prélèvement : En utilisant les pratiques de laboratoire standard, plonger un écouvillon floqué de
dépistage néonatal dans des échantillons de selles liquides ou molles de patients pédiatriques et
adultes dont on soupçonne une maladie associée au clostridium difficile (MACD).
Remarque : Retirer le mucus du spécimen avant l'échantillonnage de la matière fécale.
L'échantillonnage de matières fécales en présence de mucus en excès peut faire échouer le test et
donner des résultats erronés. Les échantillons contenant des quantités excessives de mucus ne
doivent pas être testés.
2. Préparation d'échantillon : Agiter l'écouvillon floqué de dépistage néonatal dans le premier tampon,
puis ajouter 30 µl de l'échantillon dans le second tube tampon qui contient le témoin.
3. Réhydratation du mélange étalon : Réhydrater le mélange étalon lyophilisé en utilisant la solution de
réhydratation. Le mélange étalon contient des amorces oligonucléotidiques, des sondes libérant un
fluorophore et d’extinction ciblant les régions conservées des tcdA et tcdB, ainsi que la séquence de
témoin contrôle.
4. Amplification et détection de l'acide nucléique Ajouter 15 µL de mélange étalon réhydraté dans
chaque tube de réaction ou puits de plaque. Puis ajouter 5 µL de spécimen préparé (échantillon avec
témoin) sur la plaque ou dans le tube à réaction correctement étiqueté. Placer la plaque ou le tube
dans l'appareil d'ACP en temps réel Applied Biosystems® 7500 Fast Dx, Life Technologies
QuantStudio™ Dx ou Cepheid® SmartCycler® II.
Page 4 sur 28
Une fois que le tube à réaction ou la plaque est insérée dans l'instrument, le protocole de test
moléculaire direct C. difficile Quidel se lance. Le test se base sur le principe chimique TaqMan® et
utilise une enzyme ADN polymérase et des activités exonucléases 5'-3'. Pendant l'amplification de
l'ADN, cette enzyme clive la sonde liée à la séquence ADN complémentaire, séparant alors l'inhibiteur
de signal fluorescent du rapporteur fluorescent. Cette étape génère une augmentation du signal de
fluorescence lors de l'inhibition par une source de lumière de longueur d'onde appropriée. À chaque
cycle, d’autres molécules sont séparées de leurs inhibiteurs de signal fluorescent provoquant une
augmentation du signal de fluorescence. Si une fluorescence suffisante est obtenue, l'échantillon est
considéré comme positif pour l'acide nucléique détecté.
Matériel fourni
SKU # M105
Kit de détection (96 réactions) – Entreposé entre 2 et 8 °C
#


Composant
Quantité
Solution de réhydratation Réf. M5003
1 fiole / kit de 1,9 mL
Mélange étalon du test moléculaire C. difficile Quidel
Réf. M5043
12 flacons / kit
8 réactions / fiole
SKU # M207
Kit de préparation d'échantillons de selles ADN rapide (96 échantillons) – À conserver entre 2 et 25 °C
#


Composant
Quantité
Tampon 1 Réf. M5032
96 tubes / kit de 500 µL
Tampon 2 Réf. M5033
Contient un témoin contrôle
96 tubes / kit de 570 µL
Écouvillons floqués de dépistage néonatal Réf. M5034
96 écouvillons
Matériel facultatif
Témoins externes de C. difficile toxigène (par ex., ensemble de témoins moléculaires C. difficile Quidel
n°M108 ; ces témoins peuvent également servir de témoin de traitement externe ou d'amplification et
n'ont rien à voir avec le témoin).
Matériel requis non fourni
Micropipeteurs (plage comprise entre 1 et 10 μL ou 2 et 20 μL et 100 à 1 000 μL)
Embouts de pipette sans aérosol
Appareil d'ACP en temps réel Applied Biosystems 7500 Fast Dx ou Life Technologies QuantStudio Dx
Plaque ACP 96 puits
Films pour plaque de réaction optique Applied Biosystems
Plateau centrifuge pour plaque de réaction optique 96 puits série 7500
Ou
Micropipeteurs (plage comprise entre 1 et 10 μL et 100 et 1 000 μL)
Embouts de pipette sans aérosol
Appareil SmartCycler II
Éléments jetables SmartCycler
Centrifuge SmartCycler
Mises en garde
Usage en diagnostic in vitro
Les caractéristiques de performance de ce test ont été établies avec les types d'échantillons indiqués dans
la section Utilisation prévue uniquement. La mise en œuvre de ce test avec d'autres types d'échantillons
ou de spécimens n'a pas été évaluée.
Page 5 sur 28
L’utilisation de conditions de cyclage différentes de celles indiquées dans la section Instructions de
programmation du thermocycleur peut donner des résultats erronés.
L’utilisation de ce produit doit être limitée aux personnes parfaitement formées aux techniques de l'ACP.
Traiter tous les spécimens/échantillons comme étant potentiellement infectés. Suivre les précautions
universelles lors de la manipulation des échantillons, de ce kit et de son contenu.
Le prélèvement, l’entreposage et le transport adéquats des échantillons sont indispensables pour obtenir
des résultats corrects.
Stocker les réactifs du test comme indiqué sur leurs étiquettes individuelles.
Porter des vêtements de protection, des gants, des protections oculaire et faciale lors de l'utilisation de ce
kit.
Pour des résultats précis, pipeter soigneusement en utilisant uniquement un équipement calibré.
Nettoyer et désinfecter toutes les surfaces avec une solution à 10 % de javel puis avec de l'eau de qualité
moléculaire.
Utiliser des micropipettes avec une barrière aérosol ou des embouts volumétriques pour toutes les
procédures.
Éviter toute contamination croisée et microbienne des réactifs du kit. Suivre les procédures de bonnes
pratiques de laboratoire.
Ne pas mélanger les réactifs provenant de kits avec des numéros de lot différents.
Ne pas utiliser ou substituer des réactifs issus d'autres fabricants avec ce kit.
Ne pas utiliser le produit après sa date de péremption.
Une planification appropriée du déroulement est essentielle pour minimiser le risque de contamination.
Toujours planifier le déroulement des tâches de laboratoire d'une manière unidirectionnelle, à
commencer par la pré-amplification puis seulement l'amplification et la détection.
Utiliser des fournitures et un équipement dédiés dans les zones de pré-amplification et d'amplification.
Ne pas autoriser le déplacement du personnel et des équipements entre les zones.
Toujours tenir à l'écart les fournitures pour pré-amplification et celles employées dans le cadre de
l’amplification.
Ne pas ouvrir les tubes d'échantillons ou les plaques non-scellées après l’amplification.
Jeter les matériaux amplifiés avec précaution et conformément aux lois et règlements locaux afin de
minimiser le risque de contamination induit par les amplicons.
Ne pas utiliser de fournitures, de matériel ou de pipeteurs conçus pour un réactif ou une préparation
d'échantillon dédiés au traitement de produits amplifiés.
Une fiche de données de sécurité est disponible sur simple demande ou peut être consultée sur le site
Web du fabricant.
Ne pas agiter le tampon 1 car cela risque de provoquer un moussage excessif, qui pourrait augmenter la
probabilité d’une contamination croisée.
Stockage et manipulation des kits de réactifs
Conserver le kit de test non-ouvert entre 2 et 8 °C et le kit de préparation rapide d'ADN à partir
d'échantillon de selles entre 2 et 25 °C jusqu'à la date de péremption indiquée à l'extérieur du
conditionnement du kit.
Le mélange étalon réhydraté doit être utilisé dans les 60 minutes. Pour une plus longue durée de
conservation (jusqu'à 3 jours), le mélange étalon réhydraté doit être rebouché, scellé avec du parafilm et
conservé en position verticale à une température ≤ -20 °C. Protéger le mélange étalon de la lumière
pendant le stockage.
Indications d'instabilité ou de détérioration des réactifs :
Solution de réhydratation : Une nébulosité dans la solution de réhydratation peut indiquer une
détérioration de ce réactif. Contacter l’assistance technique Quidel pour un remplacement.
Tampon 1 : En cas de stockage réfrigéré, le flacon contenant le tampon 1 peut présenter un précipité
blanc. Il ne s’agit pas d’une indication d'instabilité ou de détérioration. Conserver le tampon 1 à
température ambiante après l’avoir retiré du réfrigérateur. Ne pas utiliser le tampon avant la dissolution
complète du précipité blanc. Une conservation entre 20 et 25 °C peut être plus pratique.
Prélèvement, stockage et manipulation
Un ou plusieurs échantillons de selles fraiches sont collectés dans un récipient propre. Les écouvillons de
prélèvement sont inadéquats lorsque l’échantillon est trop petit ou vulnérable aux variations de température
de stockage. Il faut éviter les échantillons prélevés après un lavement baryté ou tout autre traitement. Les
Page 6 sur 28
échantillons doivent être transportés dans des conteneurs en matière plastique fermés hermétiquement et
étanches. Si les échantillons peuvent être traités dans un délai de 3 à 4 heures après le prélèvement, un
transport à température ambiante est adéquat. Les échantillons qui arrivent en retard au laboratoire doivent
être rapidement refroidis puis maintenus à une température comprise entre 2 et 8 °C ou à -20 °C pendant
7 jours maximum. Expédier les échantillons sur de la glace en cas de transport sur de longues distances. Les
exigences spécifiques au regard de l’expédition des échantillons doivent respecter les recommandations
précisées dans les articles 42 et 49 du Code des Règlements Fédéraux (CFR).
Conservation des échantillons traités
Les échantillons dilués dans le tampon et le tampon 2 peuvent être conservés à température ambiante
(entre 20 et 25 C) pendant un maximum de 7 jours. Les échantillons du tampon 2 ne doivent pas être
réfrigérés ou congelés !
Programmation initiale du thermocycleur
Instructions de programmation 7500 Fast DX
1.
2.
Lancer le progiciel Applied Biosystems 7500 Fast Dx. Si l’instrument SDS n’est pas sous tension, une
fenêtre d'avertissement s'ouvre. Cliquer sur le bouton Annuler.
La fenêtre de dialogue Document de démarrage rapide s'ouvre. Cliquer sur le bouton Créer un
nouveau document pour démarrer l'Assistant nouveau document. Suivre chaque étape pour initier le
protocole de test moléculaire direct C. difficile Quidel.
a. Définir un document: Ce qui suit concerne le paramétrage par défaut. Sinon, modifier en
conséquence.
i. Confirmer ou entrer les informations suivantes
Test : Courbe standard (quantification absolue)
Conteneur : transparent avec 96 puits
Modèle : document vide
Mode
Fast 7500
d'exécution :
Opérateur : nom de l'opérateur
Commentaires : SDS v1.4
Désignation de
Moléculaire direct C. difficile
la plaque :
b.
c.
d.
ii. Cliquer sur le bouton Suivant
Sélectionner les détecteurs : De nouveaux détecteurs doivent être ajoutés pour C. difficile
et le témoin. Pour chaque cible, cliquer sur le bouton Nouveau détecteur pour ouvrir la
fenêtre Nouveau détecteur. Sinon, utiliser le bouton Créer un nouveau détecteur de la
fenêtre Nouveau détecteur pour le dernier détecteur.
i. Entrer les informations suivantes pour chaque détecteur :
Produit
Colorant de
Colorant
Couleur
chimique
notification
d'extinction
C. difficile
JOE
(aucun)
(sélectionner)
Témoin
CY5
(aucun)
(sélectionner)
ii. Sélectionner une couleur unique pour représenter chaque détecteur.
iii. Mettre en surbrillance les nouveaux détecteurs et les ajouter dans la colonne
Détecteurs dans un document en utilisant le bouton Ajouter.
iv. Sélectionner aucun dans le menu déroulant Référence passive.
v. Cliquer sur le bouton Suivant.
vi. Cliquer sur le bouton Terminer sans définir le moindre puits.
L'assistant se ferme et le logiciel s'ouvre, puis démarre avec l'onglet Installation. Cela va
faire apparaître la plaque d'échantillon qui a été installée pendant le démarrage rapide.
Rien ne doit être changé ici pour l'installation initiale.
Définir le protocole du thermocycleur : Cliquer sur l'onglet Instrument pour configurer les
temps de cyclage de l'ACP du test moléculaire direct C. difficile Quidel ainsi que les
températures. Sous l'option Profil thermique se trouve un protocole par défaut à
2 niveaux. Chaque niveau comporte 3 zones de texte modifiables par l'utilisateur. La valeur
de la zone supérieure représente le nombre de répétitions ou de cycles pour ce niveau. La
Page 7 sur 28
valeur de la zone intermédiaire représente la température (˚C), et la valeur de zone
inférieure représente le temps (minutes:secondes).
i. Apporter les changements suivants au protocole du thermocycleur par défaut :
1. Niveau 1
a. Répétition :
1
b. Temp. :
92
c. Durée :
2:00
2.
3.
4.
Niveau (niveau d'amplification en 3 étapes)
a. Répétition : 15
b. Étape 1
i. Temp. : 92
ii. Durée : 0:05
c. Étape 2
i. Temp. : 57
ii. Durée : 0:05
Remarque: Sélectionner la barre sur la droite du Niveau 2. Cliquer sur
le bouton Ajouter une étape pour en ajouter une.
d. Étape 3
i. Temp. : 68
ii. Durée : 0:25
Sélectionner la barre sur la droite du Niveau 2. Cliquer sur le bouton
Ajouter un cycle pour en ajouter un.
Niveau 3 (niveau d'amplification en 3 étapes)
a. Répétition : 35
Page 8 sur 28
b.
c.
d.
5.
Étape 1
i.
ii.
Étape 2
i.
ii.
Étape 3
i.
ii.
Temp. : 92
Durée : 0:05
Temp. : 57
Durée : 0:05
Temp. : 68
Durée : 0:25
Si un stade erroné est ajouté, le stade peut être supprimé en appuyant sur
le bouton Supprimer après avoir mis en surbrillance le stade entre les
lignes verticales.
ii. Entrer les informations suivantes sous Paramètres :
Volume d'échantillon (μL) : 20 (par défaut)
Mode d'exécution :
Collecte des données :
7500 Fast (par défaut)
Niveau 3, étape 3 (68,0 à 0:25)
REMARQUE : Ne pas cocher la case à côté de « Mode expert ».
iii. Protocole final
Page 9 sur 28
e.
Définir un seuil pour chaque analyse.
i. Sélectionner l'onglet Résultats
ii. Sélectionner l'onglet Tracé d'amplification
iii. Sélectionner C. difficile dans l'onglet Détecteur situé en haut à droite
iv. Dans le bloc Paramètres d'analyse, régler le Seuil sur 4.0e4.
v. Sélectionner le bouton radio Ligne de base auto
vi. Répéter les étapes iii à v pour régler le témoin à un seuil de 3.0e4
f.
Enregistrer le nouveau protocole comme modèle pour de futures utilisations.
i. En haut de l'écran, cliquer sur Fichier puis sur Enregistrer sous
ii. Enregistrer sous : D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nom de fichier : « Moléculaire C. Difficile Quidel »
iv. Type d'enregistrement : « Modèles SDS (*.sdt) ».
Quitter le logiciel.
g.
Instructions de programmation de l'appareil d'ACP en temps réel QuantStudio Dx
Le test moléculaire Quidel fournit un modèle prédéfini d'un test sur un CD qui doit être téléchargé sur
l'appareil QuantStudio™ Dx. Veuillez contacter un représentant Quidel au +1 800 874 1517 (appel gratuit
depuis les États-Unis) ou le +1 858 552 1100 du lundi au vendredi de 8h à 17h (heure de l'est) pour recevoir
votre CD. Ces modèles contiennent les paramètres d'exécution. Aucune programmation de l'appareil n'est
requise pour démarrer. Procédure d'installation d'un document de définition de test :
1. À partir de l'onglet d'accueil du logiciel QuantStudio™ Dx, cliquer sur Gérer les tests dans la fenêtre
Outils.
2. À partir du menu Test, cliquer sur Installer.
3. Accéder au fichier (.tdd) correspondant au document de définition de test, sélectionner le fichier et
cliquer sur Ouvrir. Le logiciel QuantStudio™ Dx ajoute automatiquement le test choisi dans le menu
Test.
4. Cliquer sur Fermer pour fermer le menu Test et enregistrer les modifications.
Instructions de programmation du SmartCycler II
1.
2.
Lancer le progiciel SmartCycler II Dx Version 3.0b.
Créer le test moléculaire C. difficile Quidel.
a. Sélectionner le bouton Définir des tests au-dessus de l'écran.
b. Renommer le test :
i. Sélectionner le bouton Nouveau en bas à gauche de l'écran.
ii. Saisir « Moléculaire C. difficile Quidel » et cliquer sur OK
iii. « Moléculaire C. difficile Quidel » sera ajouté au début de la liste Nom du test en haut à
gauche de l'écran.
c. Définir les valeurs d'analyse : Dans la section Type de test : recherche, sélectionner l'onglet
Paramètres d'analyse et vérifier les réglages de spécifications suivantes :
i. Sélectionner FATA25 dans le menu déroulant Kit colorant
Page 10 sur 28
ii. Le menu déroulant Type d'analyse doit être réglé sur Qualitatif (paramètre par défaut).
iii. Dans la colonne Nom du canal, saisir « C. difficile » pour le canal 2 et « Témoin » pour le
canal 4
iv. Dans la colonne Utilisation, choisir Inutilisé dans le menu déroulant pour les canaux 1 et 3,
Cible pour C. difficile et Témoin interne pour le témoin. La fenêtre illustrée ci-dessous
s'affiche lors de la sélection du Témoin interne. Cliquer sur le bouton Oui.
v. Dans la colonne Courbe d'analyse, entrer une Courbe primaire pour chaque canal (C.
difficile, témoin) (paramètre par défaut).
vi. Dans la colonne Réglage du seuil, entrer Seuil manuel pour chaque canal (C. difficile,
témoin) (paramètre par défaut).
vii. Dans la colonne Seuil manuel des unités fluor, entrer les valeurs seuils suivantes :
a. C. difficile: 10.0
b. Témoin: 10.0
viii. Dans la colonne Cycle min. valide (faire défiler vers la droite si la colonne n'est pas
immédiatement visible), entrer 5pour chaque canal (C. difficile, témoin).
ix. Dans la colonne Cycle max. valide (faire défiler vers la droite si la colonne n'est pas
immédiatement visible), entrer 35pour chaque canal (C. difficile, témoin).
x. Dans la colonne Bkgnd Sub, utiliser « ON » pour chaque canal (C. difficile, témoin)
(paramètre par défaut).
xi. Dans la colonne Bkgnd Min Cycle, saisir 5 pour chaque canal (C. difficile, témoin).
xii. Dans la colonne Bkgnd Max Cycle, saisir 20 pour chaque canal (C. difficile, témoin).
xiii. Dans la colonne Boxcar Avg cycles, garder 0 pour chaque canal (C. difficile, témoin)
(paramètre par défaut).
xiv. Dans la colonne End Pt Threshold, saisir 20 pour le canal C. difficile et 10 pour le canal
témoin.
xv. Dans la colonne NC IC%, garder «S/O» pour le canal (témoin) (paramètre par défaut).
xvi. Dans la colonne IC Delta, garder «S/O» pour chaque canal (C. difficile, témoin) (paramètre
par défaut).
xvii. Dans la section Personnaliser le libellé du résultat (sous le tableau), sélectionner Libellé
du résultat basé sur l'organisme dans le menu déroulant. La fenêtre de mise en garde
représentée ci-dessous s'affiche. Cliquer sur Oui.
d.
xviii. Cliquer sur le bouton Personnaliser pour ouvrir la fenêtre de dialogue Libellé du résultat
basé sur l'organisme. Cliquer sur le bouton Ajouter, saisir « C. difficile » dans la colonne
Nom de l'organisme et cocher la case C. difficile. Cliquer sur OK en bas de la fenêtre
contextuelle.
Régler les temps de cyclage de l'ACP en temps réel et les températures comme suit :
i. Niveau 1
1. T° de
2. Temp. :
92.0
3. Secondes : 120
4. Optiques : OFF
ii. Niveau 2
1. Cycle de température 3
2. Nombre de répétitions :
15
3. Première ligne de température
Page 11 sur 28
4.
5.
a. Temp. :
92.0
b. Secondes :
5
c. Optiques :
OFF
Deuxième ligne de température
a. Temp. :
57.0
b. Secondes :
5
c. Optiques :
OFF
Troisième ligne de température
a. Temp. :
66
b. Secondes :
25
c. Optiques :
OFF
iii. Niveau 3
1.
2.
3.
3.
Cycle de température 3
Nombre de répétitions :
35
Première ligne de température
a. Temp. :
92
b. Secondes :
5
c. Optiques :
OFF
4. Deuxième ligne de température
a. Temp. :
57
b. Secondes :
5
c. Optiques :
OFF
5. Troisième ligne de température
a. Temp. :
66
b. Secondes :
25
c. Optiques :
ON
Enregistrer le protocole en cliquant sur le bouton Enregistrer en bas de l'écran.
Procédure de test
Exécuter les procédures suivantes, à une température ambiante régulée entre 20 et 25 °C.
Procédure de prélèvement des échantillons
Avant tout prélèvement d’échantillon, éliminer et se débarrasser du mucus à l'aide d'un écouvillon ou d'une
pipette de transfert. Seule de la matière fécale doit être utilisée au cours du test. Remarque : Retirer le mucus
du spécimen avant l'échantillonnage de la matière fécale. L'échantillonnage de matières fécales en présence
de mucus en excès peut faire échouer le test et donner des résultats erronés. Les échantillons contenant des
quantités excessives de mucus ne doivent pas être testés.
1. Pour prélever un échantillon à partir de selles liquides, plonger complètement la tête d’un écouvillon
dans l'échantillon de selles. Avec l’écouvillon, appuyer sur l’intérieur du tube pour éliminer l'excès de
liquide. Pour prélever un échantillon à partir d'un spécimen semi-solide, plonger complètement la
tête de l'écouvillon dans le spécimen de selles au minimum à quatre emplacements. Appuyer et
tourner l’écouvillon contre la paroi intérieur du tube d’échantillon pour éliminer l’excès de selles de
sorte que la forme de la tête de l'écouvillon soit clairement visible. Pour un témoin liquide facultatif,
procéder comme pour un échantillon liquide en prélevant l'échantillon témoin en utilisant l’écouvillon
fourni.
2. Plonger l'écouvillon néonatal dans le tampon 1 et agiter pendant quelques secondes pour éliminer les
selles de l'écouvillon puis mélanger.
3. Pipeter 30 µL du tampon 1 dans le tampon 2. Pipeter jusqu'à 4 ou 5 reprises avec une pipette calibrée
réglée sur 570 µL.
Remarque : Les échantillons dilués dans le tampon et le tampon 2 peuvent être conservés à
température ambiante (entre 20 ° et 25 C) pendant un maximum de 7 jours.
ATTENTION : Les échantillons du tampon 1 et du tampon 2 ne doivent pas être réfrigérés ou
congelés !
Procédure de réhydratation du mélange étalon
1.
2.
3.
Déterminer le nombre de spécimens destinés à être testés et obtenir le nombre correct de huit fioles
de mélange étalon lyophilisé pour les tests.
Retourner les réactifs non utilisés dans les conditions de stockage appropriées.
Ouvrir soigneusement le mélange étalon pour éviter toute perturbation des pastilles.
Page 12 sur 28
4.
5.
6.
Ajouter 135 µL de solution de réhydratation au mélange étalon.
Placer le flacon à température ambiante pendant 1 à 2 minutes afin de permettre la réhydratation
des pastilles.
Pipeter doucement de haut et en bas à 2 ou 3 reprises (en évitant la formation de bulles) avant toute
distribution dans le premier puits à fond plat.
Remarque : Le mélange étalon réhydraté est suffisant pour huit réactions.
Remarque : Le mélange étalon réhydraté doit être utilisé dans l'heure qui suit. Pour une plus longue
durée de conservation (jusqu'à 3 jours), le mélange étalon réhydraté doit être rebouché, scellé avec
du parafilm et conservé en position verticale à une température ≤ -20 °C. Protéger le mélange étalon
de la lumière pendant le stockage.
Procédure de l'ACP :
1.
2.
3.
4.
5.
Ajouter 15 µL de mélange étalon réhydraté dans chaque tube de réaction ou puits de plaque.
Ajouter 5 µL du tampon 2 dans les tubes réactionnels ou les puits à fond plat. Le mélange des réactifs
n'est pas nécessaire.
Remarque : Utiliser une micropipette pourvue d’un nouvel embout sans aérosol avec chaque
échantillon extrait.
Fermer les tubes réactionnels ou sceller la plaque.
Remarque : Quidel suggère que chaque cycle du thermocycleur doit comporter un puits avec témoins
externes (par ex., l'ensemble de témoins moléculaires C. difficile Quidel n°M108). Mesurer les
témoins en appliquant les pratiques et politiques en vigueur dans le laboratoire.
Centrifuger les tubes réactionnels ou la plaque pendant 15 secondes minimum. Faire en sorte que
tout le liquide se retrouve au fond de la plaque de puits ou du tube.
Insérer les tubes ou la plaque dans le thermocycleur.
Protocole d'amplification sur le thermocycleur 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
Mettre le thermocycleur 7500 Fast Dx sous tension.
Lancer le progiciel 7500 Fast Dx.
La fenêtre de dialogue Document de démarrage rapide s'ouvre.
Cliquer sur Créer un nouveau document.
Ce qui suit concerne le paramétrage par défaut. Sinon, modifier en conséquence.
Test :
Conteneur :
Modèle :
Mode d'exécution :
Opérateur :
Commentaires :
Désignation de la plaque :
6.
7.
Courbe standard (quantification absolue)
transparent avec 96 puits
Moléculaire C. difficile Quidel
Fast 7500
nom de l'opérateur
SDS v1.4 (ajouter davantage le cas échéant)
AAMMJJ-Moléculaire C difficile Quidel
Installation d'une plaque d'échantillon
a. La procédure d'installation d'une plaque apparaît sous les onglets Installation et Plaque.
b. Sélectionner tous les puits qui contiennent un échantillon, cliquer droit et sélectionner
Inspecteur de puits dans le menu déroulant. Lorsque la fenêtre contextuelle Inspecteur de puits
s'ouvre, sélectionner les détecteurs de C. difficile et du témoin.
c. Utiliser l'Inspecteur de puits pour entrer les noms d'échantillons. Les identifiants de patients
peuvent être entrés dans la fenêtre Inspecteur de puits ; il est toutefois recommandé que cela
soit fait avant la remise en suspension du mélange étalon lyophilisé, après amplification. Sinon
l'utilisation de la fonction d'importation pour minimiser la durée de l'ACP va nécessiter une
stabilisation à température ambiante avant toute exécution.
d. Enregistrer le cycle sous un identifiant unique en tant que fichier « .sds » (par ex., AAMMJJ-cycle
n°X-Moéculaire C difficile Quidel.sds).
e. Une fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer
la «Configuration» et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Démarrage de l'ACP
a. Cliquer sur l'onglet Instrument.
b. Insérer la plaque ACP à 96 puits dans l'instrument.
c. Sous Contrôle d'instrument, cliquer sur le bouton Démarrer pour lancer l'amplification.
Page 13 sur 28
8.
Après l'ACP
a. IMPORTANT : Cliquer sur OK lorsque le test est terminé. Analyser les données en cliquant sur le
bouton « Analyser » dans le menu supérieur puis enregistrer le fichier.
b. Enregistrer le fichier en cliquant sur Enregistrer le document dans la barre des tâches. Une
fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer
« l'analyse des données après amplification » et d'autres commentaires pertinents au sujet de
l'amplification.
Protocole d'amplification sur l'appareil d'ACP en temps réel QuantStudio Dx
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Mettre l'appareil QuantStudio Dx sous tension.
Choisir le mode IVD de l'appareil.
Lancer le progiciel QuantStudio Dx IVD.
Saisir le nom d'utilisateur et le mot de passe du système au moment de la requête.
La fenêtre Écran d'accueil va s'ouvrir.
Dans la boîte Configurer, mettre en surbrillance le nom du test précédemment chargé « Moléculaire
direct C. difficile Quidel ».
Cliquer sur le bouton Configurer pour lancer un cycle.
L'écran Configurer, Propriétés du test s'affiche. Saisir les informations du cycle en conséquence.
a. Saisir le Nom de l'expérience (le paramétrage par défaut lance le cycle avec un horodatage).
b. Saisir les informations du code à barres de la plaque.
c. Consigner les numéros de lot des matériaux sous Informations sur les réactifs.
d. Enregistrer le cycle sous un identifiant unique en tant que fichier « .sds » (par ex., AAMMJJ-cycle
n°X-Moléculaire C difficile Quidel.sds)
e. Une fenêtre va s'ouvrir pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer
la « Configuration » et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
Dans la barre de menu gauche, sélectionner Définir.
Modifier les informations de l'échantillon.
a. Entrer des informations d’échantillon spécifiques pour chaque puits en écrasant l’identifiant par
défaut (Patient 1, Patient 2, etc.) et saisir de nouvelles informations, OU
b. Sélectionner Importer à partir du fichier dans la partie supérieure de l'écran pour télécharger
une configuration de plaque prédéfinie depuis un fichier texte (délimité par des tabulations).
Dans la barre de menu gauche, cliquer sur Attribuer pour vérifier la configuration correcte de la
plaque.
Chargement de la plaque d'échantillon.
a. Éjecter le plateau de l'instrument.
b. Insérer la plaque APC à 96 puits dans l’appareil avec le puits A1 bien positionné en haut à gauche.
c. Retirer le plateau de l'instrument.
Démarrage du cycle.
a. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Cycle.
b. Cliquer sur le bouton vert Lancer le cycle situé dans la partie supérieure de l'écran.
i. En cas d’invite, sélectionner le numéro de série spécifique de l'instrument utilisé.
Lorsque le cycle est terminé, sélectionner Analyse dans la barre de menu à gauche.
a. Enregistrer le fichier en cliquant sur Enregistrer dans la barre des tâches. Une fenêtre va s'ouvrir
pour demander à l'utilisateur le « motif du changement d'entrée ». Entrer « l'analyse des
données après amplification » et d'autres commentaires pertinents au sujet de l'amplification.
b. Le tracé d'amplification sera affiché par défaut. Pour afficher d'autres types de tracés,
sélectionner ces derniers dans la barre de menu à gauche.
c. Pour afficher des informations de cycle avec les valeurs Ct, cliquer sur l'onglet Tableau des puits
sur le côté droit de l'écran.
Impression d'un rapport.
a. Dans la barre de menu supérieure, sélectionner Imprimer un rapport. Personnaliser le contenu
du rapport en cochant ou décochant des cases dans la fenêtre des rapports.
b. Cliquer sur le bouton « Imprimer un rapport » en bas de la boîte de dialogue.
Exportation des fichiers de données.
a. Dans la barre de menu gauche, sélectionner Exporter.
b. Spécifier l'emplacement du fichier d'exportation OU cliquer sur Parcourir pour localiser le
chemin souhaité.
c. Le nom du fichier d'exportation sera par défaut celui du cycle enregistré.
d. Sélectionner Excel comme type de fichier.
Page 14 sur 28
e.
f.
Personnaliser le rapport de données exporté en basculant entre les onglets et en sélectionnant
ou désélectionnant les options.
Sélectionner « Démarrer l’exportation » en bas de l'écran.
Protocole d'amplification sur l’instrument SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
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8.
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14.
15.
Mettre le(s) bloc(s) SmartCycler sous tension.
Lancer le progiciel SmartCycler Dx Version 3.0b.
Cliquer sur le bouton Créer un cycle en haut de l'écran pour configurer le cycle.
Sous Nom du cycle, saisir un identifiant unique pour le cycle en cours (ex. : AAMMJJ-Cycle
n°X_Moléculaire C. difficile Quidel).
Sous Notes, entrer des notes concernant le cycle pour référence ultérieure.
Sous Test, sélectionner « Moléculaire C. difficile Quidel » dans le menu déroulant.
Sous Informations de test, entrer un numéro de lot et la date d'expiration du kit.
Pour sélectionner les puits qui seront utilisés, procéder avec l'une des options suivantes :
a. Pour attribuer automatiquement des puits, procéder comme suit :
i. Sous Nombre d'échantillons, entrer le nombre d'échantillons dans la zone de texte prévue.
ii. Cliquer sur le bouton Appliquer. Le nombre de lignes entrées apparaît dans le tableau des
sites.
b. Pour choisir manuellement les puits sur les blocs du SmartCycler, procéder comme suit :
i. Cliquer sur le bouton Ajouter / supprimer des sites en bas de l'écran.
ii. Cela va ouvrir la fenêtre contextuelle Sélectionner des sites avec deux colonnes. La colonne
de gauche (Sites) récapitule tous les sites disponibles et la colonne de droite (Sélections)
contient tous les sites sélectionnés.
iii. Pour sélectionner tous les sites, cliquer sur le bouton Sélectionner tous les sites.
iv. Pour sélectionner des sites spécifiques, mettre en évidence un ou plusieurs sites puis cliquer
sur la flèche droite pour ajouter le(s) site(s) dans la colonne Sélections.
v. Cliquer sur le bouton OK pour fermer la fenêtre. Les sites sélectionnés vont apparaitre dans
le Tableau des sites.
Entrer les identifiants d'échantillons dans la colonne ID échantillon du Tableau des sites (cette
opération peut être réalisée après le démarrage du cycle).
Entrer des notes dans la colonne Notes et laisser les entrées de la colonne Type d'échantillon avec la
note « SPEC ».
Cliquer sur le bouton Lancer cycle en bas de l'écran.
Sélectionner l'onglet Afficher les résultats dès la fin du cycle de mesure.
Enregistrer le cycle après son achèvement et avant de quitter le logiciel.
Cliquer sur l'onglet Résultats de l'échantillon.
Le logiciel SmartCycler va automatiquement indiquer si de l’ARN viral C. difficile a été détecté dans les
échantillons ou si le cycle n'était pas valide (non résolu).
Interprétation des résultats
Interprétation des résultats en utilisant le thermocycleur 7500 Fast Dx
Résultat du
test
Négatif
C. difficile
positif
Interprétation des résultats du test moléculaire direct C. difficile Quidel sur le
thermocycleur Applied Biosystems 7500 Fast DX
Détecteur :
Détecteur :
C. difficile
témoin
Aucune valeur-ct
Valeur-ct signalée ADN C. difficile non toxigène détecté
signalée
Valeur-ct signalée
S/O*
ADN C. difficile toxigène détecté
Aucun ADN C. difficile toxigène et aucun témoin
détectés ; pour des résultats de test non valides,
recommencer le test avec le même échantillon
Aucune valeur-ct
Aucune valeur-ct
Non valide
purifié. Si le test n'est pas valable après un
signalée
signalée
nouveau test sur l'échantillon traité, re-tester une
autre aliquote du même échantillon ou obtenir un
nouvel échantillon et recommencer le test.
*Aucune valeur Ct n'est requise en cas de faux positif du témoin.
Page 15 sur 28
Interprétation des résultats à l'aide de l'appareil d'ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx
Résultat du
test
Négatif
C. difficile
positif
Interprétation des résultats du test moléculaire direct C. difficile Quidel sur l'
appareil d'ACP en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx
Détecteur :
Détecteur :
C. difficile
témoin
Aucune valeur-ct
Valeur-ct signalée ADN C. difficile non toxigène détecté
signalée
Valeur-ct signalée
S/O*
recommencer le test avec le même échantillon
Aucune valeur-ct
Aucune valeur-ct
Non valide
purifié. Si le test n'est pas valable après un
signalée
signalée
nouveau test sur l'échantillon traité, re-tester une
autre aliquote du même échantillon ou obtenir un
nouvel échantillon et recommencer le test.
*Aucune valeur Ct n'est requise en cas de faux positif du témoin.
Interprétation des résultats à l'aide du thermocycleur Cepheid SmartCycler II Dx
Résultat du
test
Interprétation des résultats du test moléculaire direct C. difficile Quidel sur le
thermocycleur Cepheid SmartCycler II Dx
Détecteur :
Détecteur :
C. difficile
témoin
C. difficile
négatif
NÉG
Accepté
C. difficile
positif
POS
S/O*
ADN C. difficile non toxigène détecté
recommencer le test avec le même échantillon purifié. Si
C. difficile
NÉG
Échec
le test n'est pas valable après un nouveau test sur
non résolu
l'échantillon traité, re-tester une autre aliquote du
même échantillon ou obtenir un nouvel échantillon et
recommencer le test
*Aucune résultat n'est requis en cas de faux positif du témoin.
Contrôle qualité
Le test moléculaire direct C. difficile Quidel incorpore plusieurs témoins visant à surveiller les performances du
test.
1. Le témoin doit être utilisé pendant le traitement et l'amplification de l'échantillon au cours du test. Ce
témoin est pré-rempli dans le tampon 2
2. Disponible dans le commerce, des témoins C. difficile positifs externes peuvent être traités comme un
échantillon de patient et doivent être utilisés en accord avec vos normes de pratiques de laboratoire. Les
échantillons caractérisés C. difficile positifs auparavant peuvent être utilisés à la place des témoins C.
difficile du commerce.
3. Un échantillon précédemment caractérisé négatif peut être utilisé comme témoin négatif externe. Ce
dernier doit être traité comme un échantillon de patient et doit être mis en œuvre conformément aux
normes de pratiques de laboratoire en vigueur.
Limitations
Des résultats négatifs n’excluent pas une infection par C. difficile et ne doivent pas constituer l'unique
base d'une décision de traitement.
Comme avec d'autres tests de ce type, il existe un risque de faux négatifs dû à la présence de variantes de
séquences dans les cibles d'amplification.
Un prélèvement, un stockage voire un transport inapproprié peut induire des faux négatifs.
Page 16 sur 28
Les inhibiteurs présents dans l'échantillon et / ou les erreurs dans la procédure de test suivante peuvent
induire des faux négatifs.
Un échantillonnage incorrect de l'échantillon (par exemple du mucus) peut conduire à des faux négatifs.
Performance clinique
La performance du test moléculaire direct C. difficile Quidel a été évaluée avec des échantillons prélevés à
quatre endroits géographiquement distincts aux États-Unis entre août et novembre 2012. Dans deux études
(l'une pour l'ABI 7500 Fast Dx et Cepheid SmartCycler II (665 échantillons) et l'autre pour le QuantStudio Dx
(792 échantillons)), le test moléculaire direct C. difficile Quidel a été comparé à une culture directe et enrichie
de C. difficile toxigène. Les tableaux ci-dessous récapitulent les données de ces études.
Instrument Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Les caractéristiques de performance du test moléculaire direct C. difficile Quidel ont été établies dans le
cadre d'une étude prospective menée entre août et novembre 2012. Les six cent soixante-cinq (665)
échantillons utilisés au cours de cette étude ont été recueillis auprès de patients qui vraisemblablement
souffraient d'une MACD (maladie associée au Clostridium difficile) sur quatre sites distincts aux États-Unis.
Ces échantillons ont été examinés à l'aide du test Quidel sur un appareil 7500 Fast Dx sur l'un des trois (3)
sites.
Neuf (9) échantillons (1,35 %) ont été déclarés non valables au test moléculaire direct C. difficile Quidel au
moment du test initial. Nous avons analysé la répartition par âge et par sexe en fonction des résultats au
test initial pour chaque échantillon. Par conséquent, l'âge et le sexe des patients indiqués ci-dessous
concernent les six cent cinquante-six (656) échantillons restants.
Tous sites confondus : répartition par âge et par sexe
Prévalence par âge des positifs au C. difficile
Sexe
après le test moléculaire direct C. difficile
Âge :
Total
Quidel sur un appareil Applied Biosystems
Masculin Féminin
7500 Fast Dx
Sexe inconnu
3 33,3 % (1/3)
Jeune enfant
4
4
8 12,5 % (1/8)
(âge < 2 ans)
Enfant
21
18
39 25,6 % (10/39)
(≥ 2 à < 12 ans)
Adolescent
8
11
19 21,1 % (4/19)
(≥ 12 à < 18 ans)
Adolescent en
transition (≥ 18 à ≤
5
8
13 15,4 % (2/13)
21 ans)
Adulte
132
146
278 19,1 % (53/278)
(> 21 à 59 ans)
Sénior
127
169
296 15,9 % (47/296)
(> 60 ans)
Total
297
356
656 18,0 % (118/656)
Comparaison avec le test de cytotoxicité en culture directe
Six cent soixante-cinq (665) échantillons ont été testés à la fois par le test moléculaire direct C. difficile
Quidel et le test de cytotoxine en culture de tissus. Trois échantillon (0,5 %) ont été indéterminés dans le
test de cytotoxicité en raison de la présence d’une toxine dans un puits antitoxine. Neuf échantillons
(1,35 %) ont été déclarés non valables au test moléculaire direct C. difficile Quidel au moment du test
initial. Huit échantillons ont donné un résultat valable lors d'un nouveau test selon la notice du test
moléculaire direct C. difficile Quidel (7 ont été négatifs et un seul positif). Un échantillon est resté non
valide lors des tests répétés. Nous avons calculé la performance clinique sur la base du résultat au test
initial obtenu pour chaque échantillon. Par conséquent, les données ci-dessous concernent les six cent
cinquante-trois (653) échantillons restants.
Page 17 sur 28
Tous sites confondus : tous âges confondus
Culture directe
POS
Test moléculaire direct
83
C. difficile Quidel d'ACP POS
en temps réel sur ABI
NÉG
5**
7500
Total
88
NÉG
33*
532
565
Total
116
537
653
Sensibilité
Spécificité
94,3 %
94,2 %
95 % IC
87,4 % 97,5 %
91,9 % 95,8 %
*
Sur les trente-trois (33) échantillons discordants signalés (positif au moléculaire Quidel / négatif à la culture directe) , trentedeux (32) ont été testés à l'aide d'un dispositif moléculaire agréé par la FDA. Les trente-deux échantillons étaient positifs à la C.
difficile. Le reste des échantillons n'était pas disponible pour être testé.
** Cinq (5) échantillons discordants signalés (négatif au Quidel / positif à la cytotoxine en culture de tissus) ont été testés à l'aide
du dispositif moléculaire agréé par la FDA. Ces cinq (5) échantillons ont été négatifs à la C. difficile.
Comparaison avec la culture toxigène enrichie
Quidel et à la culture toxigène enrichie. Neuf échantillons (1,35 %) ont été déclarés non valables au test
moléculaire direct C. difficile Quidel au moment du test initial. Huit échantillons ont donné un résultat
valable (7 ont été négatifs et un seul positif) lors d'un nouveau test selon la notice du test moléculaire
direct C. difficile Quidel. Un échantillon est resté non-valide lors des tests répétés. Nous avons calculé la
performance clinique sur la base du résultat au test initial obtenu pour chaque échantillon. Par
conséquent, les données ci-dessous concernent les six cent cinquante-six (656) échantillons restants.
Culture toxigène enrichie
POS
NÉG
POS
112
6*
C. difficile Quidel sur
NÉG
14**
524
ABI 7500
Total
126
530
Total
118
538
656
Sensibilité
Spécificité
88,9 %
98,9 %
95 % IC
82,2 % 93,3 %
97,6 % 99,5 %
** Six (6) échantillons discordants signalés (positif au moléculaire Quidel / négatif à la culture toxigène enrichie) ont été testés à
l'aide du dispositif moléculaire agréé par la FDA. Tous les échantillons étaient positifs à la C. difficile.
** Douze (12) échantillons discordants signalés (négatif au Quidel / positif à la culture toxigène enrichie) ont été testés à l'aide du
dispositif moléculaire agréé par la FDA. Deux (2) échantillons n'étaient pas disponibles pour un test. Neuf (9) de ces
échantillons ont été testés négatifs à la C. difficile et trois (3) positifs.
Appareil d'APC en temps réel Life Technologies QuantStudio Dx
cadre d'une étude prospective menée entre août et novembre 2012. Les sept cent quatre-vingt-douze
(792) échantillons utilisés au cours de cette étude ont été recueillis auprès de patients qui
vraisemblablement souffraient d'une MACD (maladie associée au Clostridium difficile) sur quatre (4) sites
distincts aux États-Unis. Ces échantillons ont été testés à l'aide du test Quidel sur un appareil QuantStudio
Dx sur l'un de ces trois (3) sites. Un (1) échantillon (0,1 %) a été déclaré non valable au test moléculaire
direct C. difficile Quidel au moment du test initial. Nous avons calculé la répartition par âge et par sexe en
fonction du résultat au test initial obtenu pour chaque échantillon. Par conséquent, l'âge et le sexe des
patients indiqués ci-dessous concernent les sept cent quatre-vingt-onze (791) échantillons restants.
Âge :
Sexe inconnu
Jeune enfant
(âge < 2 ans)
Enfant
(≥ 2 à < 12 ans)
Adolescent
(≥ 12 à < 18 ans)
Adolescent en
transition
(≥ 18 à ≤ 21 ans)
Adulte
(> 21 à 59 ans)
Sexe
Masculin
Féminin
Total
2
Prévalence par âge des positifs au C.
difficile après le test moléculaire direct
C. difficile Quidel sur un QuantStudio
50,0 % (1/2)
5
5
10
10,0 % (1/10)
28
21
49
24,5 % (12/49)
10
14
24
20,8 % (5/24)
6
7
13
7,7 % (1/13)
158
170
328
18,3 % (60/328)
Page 18 sur 28
Âge :
Sexe
Total
Prévalence par âge des positifs au C.
difficile après le test moléculaire direct
C. difficile
Quidel sur un QuantStudio
17,8
% (65/365)
Sénior
163
202
365
(> 60 ans)
Total
370
419
791 18,3 % (145/791)
Comparaison avec le test en culture directe
Sept cent quatre-vingt-douze échantillons ont été testés à l'aide du test moléculaire direct C. difficile
Quidel et du test en culture directe. Trois (3) échantillon (0,4 %) ont été indéterminés dans le test de
cytotoxicité en raison de la présence d’une toxine dans un puits antitoxine. Un (1) échantillon (0,1 %) a été
déclaré non valable au test moléculaire direct C. difficile Quidel au moment du test initial. L'échantillon a
donné un résultat valable (il était négatif) lors d'un nouveau test selon la notice du test moléculaire direct
C. difficile Quidel. Nous avons calculé la performance clinique sur la base du résultat au test initial obtenu
pour chaque échantillon. Par conséquent, les données ci-dessous concernent les sept cent quatre-vingthuit (788) échantillons restants.
Cytotoxine de culture de tissus
POS
NÉG
Total
POS
98
45*
143
NÉG
7**
638
645
LTI QuantStudio
Total
105
683
788
Sensibilité
Spécificité
93,3 %
93,4 %
95 % IC
86,9 % 96,7 %
91,3 % 95,0 %
*
Sur les quarante-cinq (45) échantillons discordants signalés (positif au moléculaire Quidel / négatif à la culture directe) ,
quarante-quatre (44) ont été testés à l'aide d'un dispositif moléculaire agréé par la FDA. Trente-cinq (35) de ces échantillons ont
été positifs à la C. difficile et neuf (9) ont été négatifs. Le reste des échantillons n'était pas disponible pour être testé.
** Sept (7) échantillons discordants signalés (négatif au Quidel / positif à la culture directe) ont été testés à l'aide du dispositif
moléculaire agréé par la FDA. Deux (2) de ces échantillons ont été déclarés positifs à la C. difficile et cinq (5) ont été déclarés
négatifs.
Sept cent quatre-vingt-douze (792) échantillons ont été testés à l'aide du test moléculaire direct C. difficile
Quidel et à la culture toxigène enrichie. Un (1) échantillon (0,1 %) a été déclaré non valable au test
moléculaire direct C. difficile Quidel au moment du test initial. L'échantillon a donné un résultat valable (il
était négatif) lors d'un nouveau test selon la notice du test moléculaire direct C. difficile Quidel. Nous avons
choisi de calculer la performance clinique sur la base du résultat au test initial obtenu pour chaque
échantillon. Par conséquent, les données ci-dessous concernent les sept cent quatre-vingt-onze (791)
échantillons restants.
POS
NÉG
POS
137
8*
NÉG
20**
626
LTI QuantStudio
Total
157
634
Total
145
646
791
Sensibilité
Spécificité
87,3 %
98,7%
95 % IC
81,1 % 91,6 %
97,5 % 99,4 %
*
Huit (8) échantillons discordants signalés (positif au moléculaire Quidel / négatif à la culture toxigène enrichie) ont été testés à
l'aide du dispositif moléculaire agréé par la FDA. Deux (2) de ces échantillons ont été déclarés positifs à la C. difficile et six (6) ont
été déclarés négatifs.
** Dix-sept (17) échantillons sur vingt (20) échantillons discordants signalés (négatif au Quidel / positif à la culture toxigène
enrichie) ont été testés à l'aide du dispositif moléculaire agréé par la FDA. Trois (3) échantillons n'étaient pas disponibles pour
un test. Onze (11) de ces échantillons ont été déclarés négatifs à la C. difficile et six (6) ont été déclarés positifs.
cadre d'une étude prospective menée entre août et novembre 2012. Les six cent soixante-cinq (665)
échantillons utilisés au cours de cette étude ont été recueillis auprès de patients qui vraisemblablement
souffraient d'une MACD (maladie associée au Clostridium difficile) sur quatre sites distincts aux États-Unis.
Ces échantillons ont été testés à l'aide du test Quidel sur un appareil SmartCycler II sur l'un des trois (3)
sites.
Cinq (5) échantillons (0,75 %) ont été déclarés non valables au test moléculaire direct C. difficile Quidel au
moment du test initial. Nous avons analysé la répartition par âge et par sexe en fonction des résultats au
Page 19 sur 28
test initial pour chaque échantillon. Par conséquent, l'âge et le sexe des patients indiqués ci-dessous
concernent les six cent soixante (660) échantillons restants.
Âge :
Sexe inconnu
Jeune enfant
(âge < 2 ans)
Enfant
(≥ 2 à < 12 ans)
Adolescent
(≥ 12 à < 18 ans)
Adolescent en transition
(≥ 18 à ≤ 21 ans)
Adulte
(> 21 à 59 ans)
Sénior
(> 60 ans)
Total
Sexe
Masculin Féminin
3
Prévalence par âge des positifs au C. difficile
après le test moléculaire direct C. difficile
Quidel sur un Cepheid SmartCycler II
33,3 % (1/3)
Total
4
4
8
12,5 % (1/8)
21
18
39
23,1 % (9/39)
8
11
19
15,8 % (3/19)
5
8
13
7,7 % (1/13)
133
147
280
18,6 % (52/280)
129
169
298
17,1 % (51/298)
300
357
660
17,9 % (118/660)
Comparaison avec le test en culture directe
Quidel et le test de culture directe. Trois (3) échantillons (0,5 %) ont été indéterminés dans le test de
cytotoxicité en raison de la présence d’une toxine dans un puits antitoxine. Cinq (5) échantillons (0,75 %)
ont été déclarés non valables au test moléculaire direct C. difficile Quidel au moment du test initial. Ces
cinq (5) échantillons ont donné un résultat valable (3 ont été négatifs et deux positifs) lors d'un nouveau
test selon la notice du test moléculaire direct C. difficile Quidel. Nous avons calculé la performance
clinique sur la base du résultat au test initial obtenu pour chaque échantillon. Par conséquent, les
données ci-dessous concernent les six cent cinquante-sept (657) échantillons restants.
Cytotoxine de culture de tissus
POS
NÉG
Total
POS
78
38*
116
NÉG
9**
532
541
Total
87
570
657
Sensibilité
Spécificité
89,7 %
93,3 %
95 % IC
81,5 % 94,5 %
91,0 % 95,1 %
* Les trente-huit (38) échantillons discordants signalés (positif au moléculaire Quidel / négatif à la culture directe) ont été testés à
l'aide d'un dispositif moléculaire agréé par la FDA. Neuf (9) de ces échantillons ont été testés négatifs à la C. difficileet vingt-neuf
(29) positifs.
**Huit (8) des neuf (9) échantillons discordants signalés (négatif au Quidel / positif à la culture directe) ont été testés à l'aide du
dispositif moléculaire agréé par la FDA. Un (1) échantillon n'était pas disponible pour être testé. Cinq (5) de ces échantillons ont
été testés négatifs à la C. difficile et trois (3) positifs.
Quidel et à la culture toxigène enrichie. Cinq (5) échantillons (0,75 %) ont été déclarés non valables au
test moléculaire direct C. difficile Quidel au moment du test initial. Ces cinq (5) échantillons ont donné un
résultat valable (trois ont été négatifs et deux positifs) lors d'un nouveau test selon la notice du test
moléculaire direct C. difficile Quidel. Nous avons choisi de calculer la performance clinique sur la base du
résultat au test initial obtenu pour chaque échantillon. Par conséquent, les données ci-dessous concernent
les six cent soixante (660) échantillons restants.
Page 20 sur 28
POS
NÉG
POS
103
15*
Cepheid
NÉG
22**
520
SmartCycler II
Total
125
535
Total
118
542
660
Sensibilité
Spécificité
82,4 %
97,9 %
95 % IC
74,8 % 88,1 %
95,4 % 98,3 %
* Quinze (15) échantillons discordants signalés (positif au moléculaire Quidel / négatif à la culture toxigène enrichie) ont été testés
à l'aide du dispositif moléculaire agréé par la FDA. Six (6) de ces échantillons étaient positifs à la C. difficile, et neuf (9) étaient
négatifs.
** Dix-neuf (19) échantillons sur vingt-deux (22) échantillons discordants signalés (négatif au Quidel / positif à la culture toxigène
enrichie) ont été testés à l'aide du dispositif moléculaire agréé par la FDA. Trois (3) échantillons n'étaient pas disponibles pour un
test. Dix (10) de ces échantillons ont été testés positifs à la C. difficile et neuf (9) négatifs.
Performances analytiques
Niveau de détection
La sensibilité analytique (limite de détection ou LoD) du test moléculaire direct C. difficile Quidel a été
déterminée en utilisant des cultures quantifiées (CFU / mL) de deux souches de C. difficile (ATCC BAA-1870 et
ATCC BAA-1872) diluées en série dans une matrice fécale négative. La sensibilité analytique (limite de
détection ou LoD) est définie comme étant la concentration la plus faible à laquelle 95 % de toutes les
répétitions ont été testées positives.
Instrument Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Désignation des
souches
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Toxinotype
CFU / mL calculé à
la LoD
CFU par test à la
LoD
IIIb
0
8,4E+04
2,4E+04
4,2E-01
1,2E-01
Résultats de
confirmation de la
LoD
60/60
59/60
Désignation des
souches
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Toxinotype
la LoD
CFU par test à la
LoD
IIIb
0
8,4E+04
8,0E+03
4,2E-01
4,0E-02
Résultats de
confirmation de la
LoD
20/20
20/20
Désignation des
souches
Toxinotype
la LoD
CFU par test à la
LoD
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
IIIb
0
8,4E+04
2,4E+04
4,2E-01
1,2E-01
Résultats de
confirmation de la
LoD
58/60
60/60
Réactivité analytique (inclusivité)
La réactivité analytique du test moléculaire direct C. difficile Quidel a été déterminée en utilisant des cultures
quantifiées (CFU / test) de souches C. difficile de différents toxinotypes, y compris des souches
hypervirulentes, diluées dans une matrice fécale négative à deux ou trois fois la LoD.
Souche C. difficile
Toxinotype
Concentration
(CFU / test)
Résultat
ATCC 43255
0
5,0E-2
Positif
CCUG 8864
X
1,2E-01
Positif
CCUG 37770
IV
6,6E-01
Positif
ATCC BAA-1875
V
9,8E-01
Positif
Page 21 sur 28
Souche C. difficile
Toxinotype
Concentration
(CFU / test)
Résultat
ATCC 43598
VIII
1,14E+00
Positif
CCUG 37774
XXIII
1,0E-01
Positif
CCUG 9004
s/o
9,5E-01
Positif
ATCC BAA-1874
0
2,0 E-01
Positif
ATCC 43600
0
7,4 E-01
Positif
ATCC BAA-1871
0
3,0 E-02
Positif
ATCC BAA-1803
IIIc
1,2 E-01
Positif
ATCC 700792
0
1,11 E+00
Positif
ATCC 43599
0
1,3 E-01
Positif
CCUG 60276
s/o
1,01 E-01
Positif
CCUG 60275
s/o
6,8 E-01
Positif
CCUG 37778
s/o
3,4 E-01
Positif
CCUG 37777
s/o
7,3 E-01
Positif
CCUG 37776
s/o
1,6 E-01
Positif
CCUG 37773
s/o
9,0 E-02
Positif
ATCC 17857
0
5,6 E-01
Positif
ATCC 43594
0
8,0 E-02
Positif
ATCC 43596
0
7,3 E-01
Positif
ATCC BAA-1872
0
4,2E-01
Positif
ATCC BAA-1870
IIIb
1,2E-01
Positif
Spécificité analytique (réactivité croisée et interférence microbienne)
La spécificité analytique du test moléculaire direct C. difficile Quidel a été évaluée en testant un panel
composé de soixante-six (66) micro-organismes bactériens, viraux ainsi que d’une souche de levure
représentant des pathogènes entériques communs, la flore ou l'acide nucléique habituellement présent dans
l'intestin, ainsi que de l'ADN humain . Des micro-organismes ou des acides nucléiques ont été mélangés avec
une matrice négative groupée et testés directement et en présence de C. difficile à 2 ou 3 fois la limite de
détection pour respectivement la réactivité croisée et l'interférence microbienne. Ces études ont été menées
uniquement sur un appareil ABI 7500.
Le tableau ci-dessous récapitule les données de ces études. Il n'y avait aucune preuve de réactivité croisée ou
d’interférence avec l'un des membres du panel et le test moléculaire direct C. difficile Quidel.
Identifiant des organismes
Identification
Concentration
testée
(UFC / mL ou
PFU / mL)
Alcaligenes faecalis
subspecies faecalis
Bacillus cereus
Campylobacter coli*
.jejuni
ZM 081597
ATCC 7966
5,27E+08
2,09E+10
Négatif
Négatif
Résultats
Résultat
d'interférence
croisée C.
difficile
ATCC BAA1870
Positif
Positif
ATCC 15554
4,65E+09
Négatif
Positif
Positif
ATCC 13472
CCUG 4856
CCUG 36995
1,00E+07
1,77E+08
5,30E+08
Négatif
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
ATCC 33292
1,72E+07
Négatif
Positif
Positif
Résultat
de
réactivité
croisée C.
difficile
Résultat
d'interférence
croisée C.
difficile
ATCC BAA1872
Positif
Positif
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Concentration
testée
(UFC / mL ou
PFU / mL)
Identification
Candida albicans
Clostridium difficile (nontoxygène)
Clostridium difficile (nontoxygène)
Clostridium novyi
Clostridium perfringens
(souche : type A)
Edwardsiella tarda
Escherichia coli
Helicobacter pylori
Klebsielia oxytoca
Listeria monocytogenes
(sérotype 1/2b)
Peptostreptococcus
anaerobius
Porphyromonas
asaccharolytica
Proteus mirabilis
(typhimurium)
Salmonella enterica
subspecies Arizonae
(anciennement Choleraesuis
ATCC 10231
3,00E+07
ATCC 8090
2,38E+09
ATCC 638
2,05E+07
Analyse in-silico
CCUG 47601
1,75E+07
Résultats
Résultat
Résultat
Résultat
d'interférence d'interférence
de
croisée C.
croisée C.
réactivité
difficile
difficile
croisée C.
ATCC BAAATCC BAAdifficile
1870
1872
Négatif
Positif
Positif
Négatif
Positif
Positif
Négatif
Positif
Positif
Pas de réactivité croisée in silico observée
Négatif
Positif
Positif
ATCC 43601
4,58E+06
Négatif
Positif
Positif
ATCC 43593
1,13E+06
Négatif
Positif
Positif
ATCC 9650
CCUG 57219
ATCC 49531
3,43E+09
6,50E+06
5,30E+06
Négatif
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
ZM 0801585
3,37E+07
Négatif
Positif
Positif
ATCC 35704
ATCC 12464
ATCC 9714
Z077
CCUG 6329
CCUG 9284
CCUG 33098
CCUG 36938
CCUG 43123
CCUG 47545
CCUG 59819
ATCC 11437
ATCC 15947
ATCC 13048
ATCC 13047
ATCC 51299
ATCC 23511
ZM 0801622
ZM 0801486
ATCC 33496
ATCC 4356
1,62E+07
6,60E+09
1,94E+06
2,07E+08
9,85+E07
6,50E+07
2,00E+07
5,55E+07
2,50E+07
1,36E+07
7,00E+06
3,55E+07
2,03E+09
1,31E+10
5,95E+08
3,45E+09
1,92E+09
2,20E+09
3,57E+06
1,63E+09
6,82E+07
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
ZM 0801534
1,18E+10
Négatif
Positif
Positif
ATCC 27337
5,80E+08
Négatif
Positif
Positif
ATCC 14029
1,40E+08
Négatif
Positif
Positif
CCUG 7834
1,30E+07
Négatif
Positif
Positif
ATCC 25845
ATCC 25933
ATCC 9886
ATCC 35554
5,10E+08
1,06E+09
9,60E+08
2,60E+10
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
ATCC 14028
3,55E+10
Négatif
Positif
Positif
ATCC 13314
4,22E+09
Négatif
Positif
Positif
Page 23 sur 28
arizonae)
Salmonella enteric
subspecies enterica
(anciennement Salmonella
choleraesuis)
Serratia marcescens
Shigella boydii
Shigella sonnei
(streptocoque du groupe B)
Adénovirus 1 VR-1*
Rotavirus (souche : WA)*
Norovirus GII
Entérovirus 71
Échovirus 6
Coxsackie virus B4
Cytomégalovirus Towne VR977
Résultats
Résultat
d'interférence
croisée C.
difficile
ATCC BAA1870
Résultat
d'interférence
croisée C.
difficile
ATCC BAA1872
Identification
Concentration
testée
(UFC / mL ou
PFU / mL)
Résultat
de
réactivité
croisée C.
difficile
ATCC 7001
6,80E+09
Négatif
Positif
Positif
ATCC 27592
ZM 0801723
ATCC 9207
ATCC 49557
ATCC 29930
ATCC 43300
ATCC 14990
3,79E+10
6,10E+08
8,16E+08
1,26E+10
3,36E+08
6,00E+07
4,00E+08
Négatif
Positif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
ATCC 12386
2,75E+08
Négatif
Positif
Positif
ATCC 17802
DHI 62207
ZM
NATROTA-ST
ZM
NATNOVII-ST
DHI 80406
DHI 121506
DHI 92206
9,50E+06
5,67E+05
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
2,32E+08
Négatif
Positif
Positif
3,92E+08
Négatif
Positif
Positif
4,82E+05
1,05E+09
2,43E+07
Négatif
Négatif
Négatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
DHI 201006
1,48E+06
Négatif
Positif
Positif
Proméga
184 µg / mL
Négatif
Positif
Positif
G3041
* De l’acide nucléique purifié a été utilisé dans le cadre du test de ces organismes. Les numérations cellulaires
étaient estimées en fonction de la concentration en acide nucléique et de la taille du génome.
ADN du génome humain
Spécificité analytique – Substances interférentes
La performance du test moléculaire direct C. difficile Quidel a été évaluée avec des substances potentiellement
interférentes qui peuvent être présentes dans les échantillons de selles. Les substances interférentes
potentielles ont été évaluées à des niveaux pertinents à l'aide des souches de C. difficile BAA-1870 et BAA1872 à une concentration de 2 à 3 fois la LoD. Il n'y a eu aucune preuve d'interférence causée par les
35 substances testées que voici : acide palmitique, triclosan, méthicilline, chlorhydrate de phényléphrine, acide
stéarique, huile minérale, naproxen sodique, hydroxyde d'aluminium, hydroxyde de magnésium, mucine,
sulfate de baryum, cimétidine, ésoméprazole , hydrate de magnésium, nystatin, séruma albumine humaine,
subsalicylate de bismuth, éthanol, carbonate de calcium, glucose, chlorhydrate de lopéramide, hémoglobine
humaine, chlorure de benzalkonium, acide 5-aminosalicylique, gelée de pétrole, cortisol, oxyde de zinc,
sennosides, sang total, nonoxynol-9, sel de nitrate de miconazole, hydroxyde d'aluminium ou carbonate de
magnésium, hamamélis, chlorhydrate de vancomycine et IgA humaine.
Étude de reproductibilité
La reproductibilité du test moléculaire direct C. difficile Quidel a été évaluée sur trois sites de laboratoire. Elle
a été évaluée à l'aide d'un groupe de 4 échantillons « en aveugle » qui incluent des concentrations moyennes
(5 fois la LoD), faibles (2 fois la LoD), très faibles (0,3 fois la LoD) de souche C. difficile et des échantillons
négatifs. Les groupes et les témoins ont été testés sur chaque site par 2 opérateurs pendant 5 jours (test
tripliqué x 2 opérateurs x 5 jours x 3 sites = 90 résultats par concentration d'échantillon). Les valeurs de limite
de détection (LoD) sont fondées sur les valeurs obtenues au cours de l'étude LoD. Les groupes et les témoins
ont été extraits puis testés sur les appareils Applied Biosystems 7500 Fast DX, Life Technologies QuantStudio
Dx et Cepheid SmartCycler II.
Page 24 sur 28
Résultats de reproductibilité : Applied Biosystems 7500 Fast DX
Identifiant
Site n°1
Site n°2
du
Résultats AVE Ct
%CV
Résultats AVE Ct
membre
du panel
Haut
négatif
5/29
28.8
15.0
11/30
27.1
0,3 x LoD
Bas positif
29/30
23.2
8.4
30/30
22.7
2 x LoD
Positif
moyen 5 x 30/30
20.5
5.7
30/30
20.2
LoD
Échantillo
Non
Non
Non
n négatif
0/29
disponi
disponi
0/30
disponi
ble
ble
ble
Témoin
Non
Non
Non
négatif
0/30
disponi
disponi
0/30
disponi
ble
ble
ble
Témoin
30/30
15.8
2.9
30/30
16.2
positif
Résultats de reproductibilité : Life Technologies QuantStudio Dx
Identifiant
Site n°1
Site n°2
du
Résultats AVE Ct
%CV
Résultats AVE Ct
membre
du panel
Haut
négatif
8/30
22.9
5.0
15/30
22.5
0,3 x LoD
Bas positif
30/30
20.4
5.9
30/30
19.0
2 x LoD
Positif
moyen 5 x
30/30
18.4
4.2
30/30
17.5
LoD
Échantillon
Non
Non
Non
négatif
0/30
disponi disponi
0/30
disponi
ble
ble
ble
Témoin
Non
Non
Non
négatif
0/30
disponi disponi
0/30
disponi
ble
ble
ble
Témoin
30/30
15.7
0.6
30/30
15.7
positif
Résultats de reproductibilité : Cepheid SmartCycler II
Identifiant
Site n°1
du
Résultats AVE Ct
%CV
Résultats
membre
du panel
Haut
négatif
17/30
23.4
6.6
22/30
0,3 x LoD
Bas positif
29/30
20.1
4.6
29/29
2 x LoD
Positif
moyen 5 x
30/30
18.4
9.5
30/30
LoD
Échantillon
Non
Non
négatif
0/30
disponi disponi
0/30
ble
ble
Témoin
Non
Non
négatif
0/30
disponi disponi
0/30
ble
ble
Témoin
30/30
15.1
3.8
30/30
%CV
Résultats
Site n°3
AVE Ct
%CV
Résultats
totaux
9.0
16/30
27.6
2.8
32/89
7.5
29/30
23.1
6.5
88/90
5.0
30/30
20.4
5.0
90/90
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
0/30
0/30
0/89
0/90
2.6
30/30
15.7
2.9
90/90
%CV
Résultats
Site n°3
AVE Ct
%CV
Résultats
totaux
5.7
15/30
22.5
1.5
38/90
5.1
30/30
19.2
0.8
90/90
2.2
30/30
17.9
0.7
90/90
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
0/30
0/30
0/90
0/90
0.1
30/30
15.5
0.1
90/90
Site n°2
AVE Ct
%CV
Résultats
Site n°3
AVE Ct
%CV
Résultats
totaux
25.3
13.4
26/30
23.4
9.3
65/90
20.1
5.1
30/30
19.9
6.4
88/89
18.5
3.1
30/30
18.3
6.4
90/90
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
14.8
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
2.2
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
14.5
Non
disponi
ble
Non
disponi
ble
3.4
0/29
0/29
30/30
0/89
0/89
90/90
Page 25 sur 28
Résultats de reproductibilité : Cepheid SmartCycler II
Identifiant
Site n°1
du
Résultats AVE Ct
%CV
Résultats
membre
du panel
positif
Site n°2
AVE Ct
%CV
Résultats
Site n°3
AVE Ct
%CV
Résultats
totaux
Études de rémanence et de contamination croisée
Dans des études internes, sur les trois plateformes, il n'y a eu aucune preuve de rémanence ou de
contamination croisée avec le test moléculaire direct C. difficile Quidel.
Assistance clientèle et technique
Pour passer une commande ou pour obtenir une assistance technique, veuillez contacter un représentant
Quidel au +1 800 874 1517 (appel gratuit aux États-Unis) ou +1 858 552 1100 (en dehors des États-Unis), du
lundi au vendredi entre 8h00 et 17h00 (heure de l'Est). Les commandes peuvent être passées par fax au
+1 740 592 9820. Pour toute assistance par courriel, veuillez contacter [email protected] ou
[email protected]. Pour tout service à l'extérieur des États-Unis, veuillez contacter votre
distributeur local. Des informations supplémentaires sur Quidel, nos produits et nos distributeurs sont
consultables sur notre site Web à l’adresse quidel.com.
Propriété intellectuelle
Marques déposées
Smartcycler® est une marque déposée de Cepheid Corporation. Applied Biosystems® est une marque déposée
de Life Technologies. QuantStudio™ est une marque déposée de Life Technologies. TaqMan® est une marque
déposée de Roche. CAL Flour® Orange 560 et Quasar® 670 sont des marques déposées de BioSearch
Technologies, Inc.
Brevets
Les composés colorants de ce produit sont commercialisés sous licence de Biosearch Technologies, Inc. et
protégés par des brevets américains et du monde entier soit émis soit en application.
L'achat de ce produit accorde à l'acheteur des droits conférés par certains brevets de Roche visant à autoriser
son utilisation uniquement dans le cadre de la fourniture de services de diagnostic in vitro pour l'homme.
Aucun brevet général ni aucune autre licence de toute autre nature que ce droit d'usage spécifique à l'achat
n’est accordée par les présentes.
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Glossaire
Contenu / Contient
Témoin
Consultez les instructions d’utilisation
Utilisation prévue
96
Contenu suffisant pour 96 déterminations
Risques biologiques
Page 27 sur 28
Références
1
2
Sloan, L. M., B. J. Duresko, D. R. Gustafson, and J. E. Rosenblatt. 2008. Comparaison de l'ACP en temps réel
pour la détection du gène tcdC avec quatre immunoessais et culture de toxines dans le diagnostic de
l'infection au Clostridium difficile. J. Clin. Micro. 46(6):1996–2001
M105 – Kit de test moléculaire direct C. difficile Quidel
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hanovre,
Allemagne
Quidel Corporation
Siège mondial
San Diego, CA 92121 États-Unis
quidel.com
M105en v2013MAR13
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C. difficile-Assay
Für den qualitativen Nachweis und die Identifizierung von toxigenem Clostridium difficile
in bakterieller DNA aus Stuhlproben
Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay
Seite 1 von 29
Inhalt
Einsatzbereich ......................................................................................................................................... 4
Zusammenfassung und Erläuterung ....................................................................................................... 4
Funktionsprinzip...................................................................................................................................... 4
Mitgelieferte Materialien........................................................................................................................ 5
Optionales Material ................................................................................................................................ 5
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien ............................................................................ 5
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen.............................................................................................. 6
Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien ............................................................................ 6
Entnahme, Aufbewahrung und Handhabung der Proben ...................................................................... 7
Anfangsprogrammierung des Thermocyclers ......................................................................................... 7
Anleitung zum Programmieren des 7500 Fast DX .............................................................................. 7
Anleitung zum Programmieren des QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx .......................10
Anleitung zum Programmieren des SmartCycler II ...........................................................................11
Assayverfahren .....................................................................................................................................12
Probenprozessverfahren.......................................................................................................................12
Amplifikationsprotokoll auf dem 7500 Fast Dx Thermocycler..........................................................13
Amplifikationsprotokoll auf dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument ................................14
Amplifikationsprotokoll auf dem SmartCycler II ...............................................................................15
Auswertung der Ergebnisse ..................................................................................................................16
Auswertung der Ergebnisse mit dem 7500 Fast Dx Thermocycler ...................................................16
Auswertung der Ergebnisse mit dem
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument .........................................................16
Auswertung der Ergebnisse mit dem Cepheid SmartCycler II Dx Thermocycler ..............................17
Qualitätskontrolle .................................................................................................................................17
Einschränkungen ...................................................................................................................................17
Klinische Leistung ..................................................................................................................................17
Analytische Leistung .............................................................................................................................22
Nachweisempfindlichkeit ..................................................................................................................22
Analytische Reaktivität (Inklusivität).................................................................................................22
Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität und mikrobielle Störung) ...................................................23
Analytische Spezifität – Störsubstanzen ...........................................................................................25
Reproduzierbarkeitsstudie ................................................................................................................25
Carryover- und Kreuzkontaminationsstudien ...................................................................................26
Kundendienst und technischer Support ...............................................................................................27
Geistiges Eigentum ...............................................................................................................................27
Handelsmarken .................................................................................................................................27
Seite 2 von 29
Patente ..............................................................................................................................................27
Glossar ..................................................................................................................................................28
Seite 3 von 29
Einsatzbereich
Der Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ist ein qualitativer, Multiplex-, in vitro-Diagnostik-Test für den
direkten Nachweis der Toxin A Gen- (tcdA) oder Toxin B Gen- (tcdB) Sequenzen toxigener Stämme von
Clostridium difficile in wässrigen (flüssigen oder weichen) Stuhlproben, die von Patienten, bei denen Verdacht
auf Clostridium-difficile-assoziierte Erkrankung (CDAD) besteht, entnommen wurden.
Der Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ist ein Echtzeit-PCR-Test und nutzt proprietäre
Probenvorbereitung mit fluoreszent markierten Primern und Sonden. Der Assay kann entweder mit Life
Technologies QuantStudio® Dx, dem Applied Biosystems 7500 Fast Dx oder dem Cepheid ® SmartCycler® II
durchgeführt werden, um die Toxingen-Sequenz, die mit Toxin-produzierenden C. difficile-Stämmen
verbunden ist, nachzuweisen.
Der Assay ist für die Verwendung direkt mit CDAD-verdächtigen Stuhlproben vorgesehen und für die
Unterstützung bei der Diagnose von CDAD konzipiert.
Zusammenfassung und Erläuterung
1
C. difficile ist eine der Hauptursachen (25 % aller Fälle) für antibiotika-assoziierte Diarrhö und Colitis. Es wird
vermutet, dass die Verwendung von Antibiotika die Flora des Darms stört und eine opportunistische
Kolonisierung durch C. difficile, das in der Darmflora von bis zu 3 % gesunder Erwachsener vorhanden ist,
ermöglicht. Es wird angenommen, dass die Virulenz von C. difficile durch die Produktion von zwei Toxinen
(Toxin A und Toxin B) gesteuert wird. Beide Toxingene (tcdA bzw. tcdB) befinden sich zusammen mit drei
weiteren Genen innerhalb eines 19,6 kb großen Pathogenitätslokus (PaLoc). Das Vorhandensein der Proteine
Toxin A und Toxin B ist für die Pathogenität nicht erforderlich. Die Häufigkeit und die Schwere von C. difficile2
assoziierten Erkrankungen mit entsprechenden Kurzaufenthalten im Krankenhaus steigen an.
Funktionsprinzip
Der Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay weist Nukleinsäuren nach, die anhand einer Patientenprobe
mithilfe proprietärer Probenvorbereitung vorbereitet wurden. Eine Multiplex-Echtzeit-PCR-Reaktion wird
unter optimierten Bedingungen in einer einzigen Kavität durchgeführt, wobei Amplifikate für jedes der in der
Probe vorhandenen Ziele generiert werden. Die Identifizierung erfolgt durch die Verwendung von
Oligonukleotidprimern und Sonden, die die konservierten Regionen in den Genen tcdA und tcdB des
Pathogenitätslokus ergänzen.
Quidel Molecular Sonden-Etiketten
Ziel
Toxin A
Toxin B
Prozesskontrolle (PRC)
Farbstoff
Quasar® 670
Zusammenfassung des Verfahrens:
1. Probennahme: Einen beflockten Neugeborenentupfer mit Standardverfahren in die flüssige oder
weiche Stuhlprobe von pädiatrischen und erwachsenen Patienten eintauchen, bei denen der
Verdacht auf Clostridium difficile-assoziierte Erkrankung (CDAD) besteht.
Hinweis: Vor dem Testen den Schleim (Mucin) von dem fäkalen Material entfernen. Ein Fehlschlag der
Probeentnahme des fäkalen Materials aufgrund von übermäßigem Schleim kann zu falschnegativen
Ergebnissen führen. Proben mit übermäßigem Schleimgehalt sollten nicht getestet werden.
2. Probenvorbereitung: Den beflockten Neugeborenentupfer im ersten Prozesspuffer herumwirbeln;
anschließend 30 µl der verdünnten Probe zum zweiten Prozesspufferröhrchen hinzufügen, der die
Prozesskontrolle (PRC) enthält.
3. Rehydrierung des Mastermix: Den lyophilisierten Mastermix mithilfe der Rehydrierungslösung
rehydrieren. Der Mastermix enthält Oligonukleotid-Primer, Fluorophor und mit Quencher markierte
Sonden, die konservierte tcdA- und tcdB-Regionen erfassen, sowie die PRC-Sequenz.
4. Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäure In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede
Testplattenvertiefung 15 µl des rehydrierten Mastermix geben. Anschließend 5 µl der vorbereiteten
Probe (d. h. der Probe mit PRC) in die Testplattenvertiefung oder das entsprechend beschriftete
Reagenzröhrchen geben. Die Testplatte oder das Reagenzröhrchen in das Applied Biosystems® 7500
Fast Dx® Instrument, das Life Technologies QuantStudio™ Dx Real-Time PCR Instrument bzw. das
Cepheid® SmartCycler® II Instrument stellen.
Seite 4 von 29
Nachdem das Reagenzröhrchen oder die Testplatte in das entsprechende Gerät gestellt wurde, wird
das Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay-Protokoll gestartet. Dieser Assay basiert auf der
Taqman®-Chemie und nutzt ein Enzym mit DNA-Polymerase und 5’-3’-Exonuklease-Aktivitäten.
Während der DNA-Amplifikation spaltet dieses Enzym die an der komplementären DNA-Sequenz
gebundene Sonde und löst den Quencher-Farbstoff vom Reporter-Farbstoff. Dieser Schritt generiert
bei Anregung durch eine Lichtquelle von entsprechender Wellenlänge einen Anstieg des
Fluoreszenzsignals. Mit jedem Zyklus werden weitere Farbstoffmoleküle von ihren Quenchern
getrennt, was einen weiteren Anstieg des Fluoreszenzsignals verursacht. Wenn ausreichend
Fluoreszenz erzielt wird, wird die Probe für die nachgewiesene Nukleinsäure als positiv gemeldet.
Mitgelieferte Materialien
SKU-Nr. M105
Assay-Kit (96 Reaktionen) – Bei 2 bis 8 °C aufbewahren
#


Komponente
Menge/Anzahl
Rehydrierungslösung Artikel-Nr. M5003
1 Fläschchen/Kit 1,9 ml
Quidel Molecular C. difficile Mastermix Artikel-Nr. M5043
12 Fläschchen/Kit
8 Reaktionen/Fläschchen
SKU-Nr. M207
Rapid DNA Stool Sample Prep Kit (96 Proben) – Bei 2 bis 25 °C aufbewahren
#


Komponente
Menge/Anzahl
Prozesspuffer 1 Artikel-Nr. M5032
96 Röhrchen/Kit 500 µl
Prozesspuffer 2 Artikel-Nr. M5033
Enthält Prozesskontrolle
96 Röhrchen/Kit 570 µl
Beflockte Neugeborenentupfer Artikel-Nr. M5034
96 Tupfer
Optionales Material
Externe Kontrollen für toxigenes C. difficile (z. B. Quidel Molecular C. difficile Kontrollset, Artikel-Nr. M108;
diese Kontrollen können als externe Prozess- und Extraktionskontrollen dienen und sind von der PRC
unabhängig).
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien
Mikro-Pipettierer (zwischen 1 und 10 μl oder 2 bis 20 μl und 100 bis 1000 μl)
Aerosolfreie Pipettenspitzen
Applied Biosystems 7500 Fast Dx oder Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR
Instrumentensystem
PCR-Platte mit 96 Vertiefungen
Applied Biosystems Verschlussfolie
Plattenzentrifuge für Testplatte der Serie 7500 mit 96 Vertiefungen
Oder
Mikro-Pipettierer (zwischen 1 und 10 μl sowie 100 und 1000 μl)
Aerosolfreie Pipettenspitzen
SmartCycler II-Instrument
SmartCycler II-Verbrauchsmaterial
SmartCycler II-Zentrifuge
Seite 5 von 29
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Zur In-vitro-Diagnose
Die Leistungsmerkmale dieses Tests wurden nur anhand der im Abschnitt Bestimmungsgemäßer
Gebrauch aufgeführten Präparattypen bestimmt. Die Leistung dieses Assays mit anderen Präparattypen
oder Proben wurde nicht untersucht.
Die Verwendung anderer Zyklusbedingungen als der im Abschnitt Anleitung zum Programmieren des
Thermocyclers beschriebenen kann zu falschen Ergebnissen führen.
Die Verwendung dieses Produkts sollte Personen mit ausreichender Übung bei PCR-Methoden
vorbehalten sein.
Alle Präparate/Proben sind als potenziell infektiös zu behandeln. Bei der Arbeit mit Proben, diesem Kit
und dessen Inhalt sind universelle Vorsichtsmaßnahmen zu befolgen.
Korrekte Ergebnisse setzen eine ordnungsgemäße Gewinnung und Lagerung und einen sachgemäßen
Transport der Proben voraus.
Die Assay-Reagenzien sind entsprechend den Angaben auf ihren jeweiligen Etiketten aufzubewahren.
Bei der Verwendung dieses Kits geeignete Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille und Mundschutz
tragen.
Um genaue Ergebnisse beim Pipettieren zu erhalten, sorgfältig vorgehen und nur kalibrierte Geräte
verwenden.
Alle Oberflächen mit einer 10%igen Bleichelösung und anschließend mit molekularbiologisch gereinigtem
Wasser reinigen und desinfizieren.
Bei allen Arbeitsschritten Mikro-Pipettierer mit einer Aerosolbarriere oder Spitzen mit positiver
Verdrängung verwenden.
Mikrobielle Kontamination bzw. Kreuzkontamination der Kitreagenzien vermeiden. Nach den Prinzipien
der Guten Laborpraxis arbeiten.
Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen Chargennummern dürfen nicht gemischt werden.
Keine Reagenzien anderer Hersteller mit diesem Kit verwenden/ersetzen.
Dieses Produkt nicht nach Ablauf seines Verfallsdatums verwenden.
Die richtige Planung des Arbeitsablaufs ist eine Grundvoraussetzung zur Minimierung des
Kontaminationsrisikos. Den Arbeitsablauf im Labor stets in eine Richtung, beginnend bei der
Präamplifikation und weiter in Richtung Amplifikation und Detektion ablaufend, planen.
Im Präamplifikations- und Amplifikationsbereich jeweils eigenes Zubehör und eigene Gerätschaften
verwenden.
Zwischen den Bereichen darf weder Personenverkehr noch Austausch von Gerätschaften stattfinden.
Das Zubehör für die Amplifikation und das Zubehör für die Präamplifikation jederzeit voneinander
getrennt halten.
Probenröhrchen oder Platten nach der Amplifikation nicht mehr öffnen bzw. entsiegeln.
Amplifiziertes Material sorgfältig und nach vor Ort geltenden Gesetzen und Bestimmungen entsorgen, um
das Risiko einer Amplifikatkontamination zu minimieren.
Zubehör oder Materialien, die nur für die Reagenzien- oder Probenvorbereitung bestimmt sind, nicht für
die Verarbeitung amplifizierter Produkte verwenden.
Sicherheitsdatenblätter sind auf Anfrage erhältlich und stehen auf der Produkt-Website zur Verfügung.
Den Prozesspuffer 1 nicht vortexen, das dies zu übermäßiger Schaumbildung führt und die
Wahrscheinlichkeit von Kreuzkontamination der Proben erhöhen kann.
Aufbewahrung und Handhabung der Kit-Reagenzien
Das ungeöffnete Assay-Kit bei 2 bis 8 °C und das Rapid DNA Stool Sample Prep Kit bei 2 bis 25 °C bis zu
dem auf der äußeren Kitschachtel aufgedruckten Verfallsdatum aufbewahren.
Der rehydrierte Mastermix muss innerhalb von 60 Minuten verwendet werden. Bei längerer Lagerung
muss der Mastermix wieder mit einem Deckel verschlossen und mit Parafilm versiegelt werden und kann
bis zu 3 Tage in aufrechter Position bei ≤–20 °C gelagert werden. Den Mastermix lichtgeschützt
aufbewahren.
Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsbeeinträchtigung der Reagenzien:
Rehydrierungslösung: Eine Trübung der Rehydrierungslösung kann ein Anzeichen für eine
Qualitätsbeeinträchtigung dieses Reagenzes sein. In diesem Fall kann beim Technischen Kundendienst von
Quidel ein Ersatzreagenz angefordert werden.
Prozesspuffer 1: Bei gekühlter Aufbewahrung kann der Prozesspuffer 1 eine weiße Ablagerung im
Fläschchen aufweisen. Dies ist kein Anzeichen für Instabilität oder Qualitätsbeeinträchtigung. Den
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Prozesspuffer 1 nach der gekühlten Aufbewahrung auf Raumtemperatur bringen. Den Prozesspuffer erst
verwenden, wenn die gesamte Ablagerung gelöst ist. Eine Aufbewahrung bei 20 °C bis 25 °C ist
möglicherweise praktikabler.
Entnahme, Aufbewahrung und Handhabung der Proben
Eine oder mehrere frisch ausgeschiedene Fäkalproben werden in einen sauberen Behälter entnommen.
Tupferproben sind unzureichend, weil die Proben zu klein und zu anfällig für Schwankungen der
Lagertemperatur sind. Nach einem Bariumeinlauf oder einer anderen Behandlung entnommene Proben sollten
nicht verwendet werden. Die Proben sollten in dicht verschlossenen, auslaufsicheren Kunststoffbehältern
transportiert werden. Wenn die Proben innerhalb von 3 bis 4 Stunden nach der Entnahme verarbeitet werden
können, reicht der Transport bei Raumtemperatur aus. Proben, deren Transport zum Labor verzögert ist, sind
sofort bei entweder 2 °C bis 8 °C oder bei -20 °C zu kühlen und können bis zu 7 Tage lang aufbewahrt werden.
Bei langen Transportwegen sind die Proben auf Eis gelagert zu transportieren. Die spezifischen Anforderungen
für den Probentransport sollten den Empfehlungen in Abschnitt 42 und 49 der CFR (Code of Federal
Regulation) entsprechen.
Aufbewahrung bearbeiteter Proben
In Prozesspuffer 1 und Prozesspuffer 2 verdünnte Proben können bis zu 7 Tage lang bei Raumtemperatur
(20 bis 25 C) aufbewahrt werden. Proben in Prozesspuffer 2 dürfen nicht gekühlt oder eingefroren werden!
Anfangsprogrammierung des Thermocyclers
Anleitung zum Programmieren des 7500 Fast DX
1.
2.
Das Applied Biosystems 7500 Fast Dx Softwarepaket starten. Wenn das SDS-Gerät nicht eingeschaltet
ist, wird ein Warnfenster geöffnet. Die Schaltfläche Abbrechen auswählen.
Das Dialogfenster Kurzanleitung zur Inbetriebnahme wird geöffnet. Die Schaltfläche Neues
Dokument erstellen auswählen, um den Assistenten für neue Dokumente aufzurufen. Führen Sie
jeden Schritt durch, um das Quidel Molecular Direct C. difficile-Protokoll zu starten.
a. Dokument definieren: Bei den meisten der folgenden Eingaben handelt es sich um
Standardeinstellungen. Andernfalls die entsprechenden Änderungen vornehmen.
i. Die folgenden Daten bestätigen bzw. eingeben
Assay: Standardkurve (Absolute Quantifizierung)
Behältnis: 96 Vertiefungen, transparent
Vorlage: Leeres Dokument
Laufmodus: Fast 7500
Bediener: Ihr Bedienername
Anmerkungen: SDS v1.4
Bezeichnung
Quidel Molecular Direct C. difficile
der Platte:
b.
c.
ii. Die Schaltfläche Weiter auswählen.
Detektoren auswählen: Es müssen neue Detektoren für C. difficile und die Prozesskontrolle
(PRC) hinzugefügt werden. Für jedes Ziel die Schaltfläche Neuer Detektor auswählen, um
das Popup-Fenster Neuer Detektor aufzurufen. Alternativ die Schaltfläche Weiteren
erstellen aus dem Popup-Fenster Neuer Detektor für den letzten Detektor verwenden.
i. Für jeden Detektor die folgenden Informationen eingeben:
ReporterQuencherFarbe
Bezeichnung
Farbstoff
Farbstoff
C. difficile
JOE
(keiner)
(Auswahl)
PRC
CY5
(keiner)
(Auswahl)
ii. Für jeden Detektor eine eigene Farbe auswählen.
iii. Die neuen Detektoren markieren und der Spalte Detektoren in Dokument mit der
Schaltfläche Hinzufügen hinzufügen.
iv. Aus dem Dropdown-Menü Passive Referenz (Keine) auswählen.
v. Die Schaltfläche Weiter auswählen.
vi. Die Schaltfläche „Fertigstellen“ auswählen, ohne vorher Vertiefungen festzulegen.
Der Assistent wird geschlossen, und die Software wird aufgerufen, wobei zunächst die
Registerkarte Vorbereitung angezeigt wird. Hier wird die Probenplatte angezeigt, die
Seite 7 von 29
d.
während des Schnellstarts erstellt worden ist. Bei der ersten Einrichtung muss auf dieser
Registerkarte nichts geändert werden.
Definition des Thermocycler-Protokolls: Die Registerkarte Gerät auswählen, um Dauer und
Temperaturen der RT-PCR-Zyklen für den Quidel Molecular Direct C. difficile PCR-Test
einzustellen. Unter Thermoprofil sollte ein aus 2 Phasen bestehendes Standardprotokoll
vorhanden sein. Jede Phase hat 3 vom Benutzer bearbeitbare Textfelder. Der Wert im
obersten Feld gibt die Anzahl der Wiederholungen oder Zyklen für die betreffende Phase
an. Der Wert im mittleren Feld gibt die Temperatur (˚C) und das unterste Feld gibt die Zeit
(in Minuten: Sekunden) an.
i. Das Thermalcycler-Standardprotokoll wie folgt ändern:
1. Phase 1
a. Wiederholungen:
1
b. Temperatur:
92
c. Dauer:
2:00
2.
Phase 2 (Aus 3 Schritten bestehende Amplifikationsphase)
a. Wiederholungen: 15
b. Schritt 1
i. Temperatur:
92
ii. Dauer:
0:05
c. Schritt 2
i. Temperatur:
57
ii. Dauer:
0:05
Hinweis: Den Balken rechts von Phase, Schritt 2 wählen. Die
Schaltfläche Schritt hinzufügen auswählen, um einen weiteren Schritt
hinzuzufügen.
d. Schritt 3
i. Temperatur:
68
ii. Dauer:
0:25
Seite 8 von 29
3.
Den Balken rechts von Phase 2 wählen. Die Schaltfläche Zyklus hinzufügen
auswählen, um eine weitere Phase hinzuzufügen.
4.
Phase 3 (Aus 3 Schritten bestehende Amplifikationsphase)
a. Wiederholungen: 35
b. Schritt 1
i. Temperatur:
92
ii. Dauer:
0:05
c. Schritt 2
i. Temperatur:
57
ii. Dauer:
0:05
d. Schritt 3
i. Temperatur:
68
ii. Dauer:
0:25
5.
Wurde eine falsche Phase hinzugefügt, kann diese entfernt werden, indem
nach Markieren der Phase zwischen den senkrechten Linien die
Schaltfläche Löschen gedrückt wird.
ii. Unter Einstellungen Folgendes eingeben:
Probenvolumen (μl): 20 (Standard)
Laufmodus:
Datenerfassung:
7500 Fast (Standard)
Phase 3, Schritt 3 (68,0 bei 0:25)
HINWEIS: Das Kontrollkästchen neben „Expertenmodus“
nicht markieren.
Seite 9 von 29
iii. Endgültiges Protokoll
e.
Den Schwellenwert für jeden Analyten eingeben.
i. Die Registerkarte Ergebnisse öffnen.
ii. Die Registerkarte Amplifikationsplot öffnen.
iii. Aus der Registerkarte „Detektor“ oben rechts C. difficile wählen.
iv. Im Block Analyseeinstellungen den Schwellenwert auf 4,0e4 setzen.
v. Das Optionsfeld Automatische Basislinie auswählen.
vi. Schritt iii-v für PRC wiederholen und den Schwellenwert auf 3,0e4 setzen.
f.
Das neue Protokoll für spätere Verwendungen als Matrize speichern.
i. Oben im Bildschirm Datei und anschließend Speichern als auswählen.
ii. Speichern unter: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Dateiname: „Quidel Molecular C difficile“
iv. Dateityp: „SDS Templates (*.sdt)“
Die Software beenden.
g.
Anleitung zum Programmieren des QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument Dx
Quidel Molecular bietet eine vordefinierte Vorlage für den Assay auf einer CD, die auf das QuantStudio™ Dx
Instrument hochgeladen werden muss. Wenden Sie sich bitte an einen Quidel-Repräsentanten unter der
Seite 10 von 29
Nummer (800) 874-1517 (gebührenfrei in den USA) oder unter (858) 552-1100, Montag bis Freitag zwischen 8
und 17 Uhr (Ostküstenzeit), um diese CD zu erhalten. Diese Vorlagen enthalten die Durchlaufparameter, so
dass keine Instrumentenprogrammierung erforderlich ist, um zu beginnen. Installieren des
Testdefinitionsdokuments:
1. Auf der Registerkarte „QuantStudio™ Dx Software Home“ im Fenster „Instrumente“ auf „Test
verwalten“ klicken.
2. Im Testmenü auf „Installieren“ klicken.
3. Zur .tdd-Datei (Test Definition Document) navigieren, die Datei auswählen und auf „Öffnen“ klicken.
Die QuantStudio™ Dx Software fügt automatisch den ausgewählten Test zum Testmenü hinzu.
4. Auf „Schließen“ klicken, um das Testmenü zu schließen und die Änderungen zu speichern.
Anleitung zum Programmieren des SmartCycler II
1.
2.
Das Softwarepaket des SmartCycler II Dx Version 3.0b starten.
Den Quidel Molecular C difficile-Assay erstellen.
a. Oben im Bildschirm die Schaltfläche Assays definieren auswählen.
b. Eine Bezeichnung für den Assay eingeben:
i. Unten links im Bildschirm die Schaltfläche Neu auswählen.
ii. „Quidel Molecular C. difficile“ eingeben und OK wählen.
iii. Nun wird „Quidel Molecular C. difficile“ der Liste Assayname oben links im Bildschirm
hinzugefügt.
c. Die Analysewerte festlegen:
Im Abschnitt Assaytyp: Forschung die Registerkarte
Analyseeinstellungen auswählen und folgende Spezifikationen verwenden:
i. Aus dem Dropdown-Menü Farbstoffe FATA25 wählen.
ii. Das Dropdown-Menü Analysetyp sollte auf Qualitativ (Standardeinstellung) eingestellt
werden.
iii. In der Spalte „Kanal-Name“ „C. difficile“ für Kanal 2 und „PRC“ für Kanal 4 eingeben.
iv. In der Spalte Gebrauch aus dem Dropdown-Menü nicht gebraucht für die Kanäle 1 und 3,
Ziel für C. difficile und interne Kontrolle für PRC auswählen. Beim Auswählen von interne
Kontrolle erscheint das unten gezeigte Fenster. Die Schaltfläche Ja auswählen.
v. In der Spalte „Kurvenanalyse“ die Option Primäre Kurve für jeden Kanal (C. difficile, PRC)
wählen (Standardeinstellung).
vi. In der Spalte Einstellung des Schwellenwerts für jeden Kanal (C. difficile, PRC) Manueller
Schwellenwert eingeben (Standardeinstellung).
vii. In der Spalte Manueller Schwellenwert für Fluoreszenzeinheiten folgende
Schwellenwerte eingeben:
a. C. difficile: 10,0
b. PRC: 10,0
viii. In der Spalte Gültiger mind. Zyklus (falls nicht direkt sichtbar, nach rechts scrollen) für
jeden Kanal (C. difficile, PRC) 5 eingeben.
ix. In der Spalte Gültiger max. Zyklus (falls nicht direkt sichtbar, nach rechts scrollen) für
jeden Kanal (C. difficile, PRC) 35 eingeben.
x. In der Spalte Leerwertsubtraktion für jeden Kanal (C. difficile, PRC) „EIN“ wählen
(Standardeinstellung).
xi. In der Spalte Mindestanzahl Zyklen, Leerwert für jeden Kanal (C. difficile, PRC) 5 eingeben.
xii. In der Spalte Höchstzahl Zyklen, Leerwert für jeden Kanal (C. difficile, PRC) 20 eingeben.
xiii. In der Spalte Durchschnittl. Anzahl Zyklen Boxcar für jeden Kanal (C. difficile, PRC) 0
beibehalten (Standardeinstellung).
xiv. In der Spalte Endpunkt Schwellenwert 20 für den C. difficile-Kanal und 10 für den PCRKanal eingeben.
xv. In der Spalte NC IC% für den PRC-Kanal „NA“ belassen (Standardeinstellung).
xvi. In der Spalte IC Delta für jeden Kanal (C. difficile, PRC) „NA“ belassen
(Standardeinstellung).
Seite 11 von 29
xvii. Im Abschnitt Ergebnistext anpassen (unterhalb der Tabelle) aus dem Dropdown-Menü
Organismusbasierter Ergebnistext wählen. Daraufhin wird das nachstehende Warnfenster
geöffnet. Ja wählen.
3.
xviii. Mit der Schaltfläche Anpassen das Dialogfenster Organismusbasierter Ergebnistext
öffnen. Die Schaltfläche Hinzufügen auswählen, in der Spalte Bezeichnung des
Organismus „C. difficile“ eingeben und das Kästchen C. difficile markieren. Unten im
Popup-Fenster auf OK klicken.
d. Die Dauer und die Temperaturen der RT-PCR-Zyklen wie folgt einstellen:
i. Phase 1
1. Halten
2. Temperatur:
92,0
3. Sekunden:
120
4. Optik:
AUS
ii. Phase 2
1. Zyklus mit 3 Temperaturen
2. Anzahl der Wiederholungen: 15
3. Erste Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
92,0
b. Sekunden:
5
c. Optik:
AUS
4. Zweite Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
57,0
b. Sekunden:
5
c. Optik:
AUS
5. Dritte Temperatur Reihe
a. Temperatur:
66
b. Sekunden:
25
c. Optik:
AUS
iii. Phase 3
1. Zyklus mit 3 Temperaturen
2. Anzahl der Wiederholungen: 35
3. Erste Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
92
b. Sekunden:
5
c. Optik:
AUS
4. Zweite Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
57
b. Sekunden:
5
c. Optik:
AUS
5. Dritte Temperatur Reihe:
a. Temperatur:
66
b. Sekunden:
25
c. Optik:
EIN
Das Protokoll durch Auswahl der Schaltfläche Speichern unten im Bildschirm speichern.
Assayverfahren
Die folgenden Arbeitsschritte werden bei einer geregelten Raumtemperatur von 20 bis 25 °C durchgeführt.
Probenprozessverfahren
Vor dem Testen der Probe Schleim (Mucin) mit einem Tupfer oder einer Pipette entfernen. Nur fäkales
Material darf für den Test verwendet werden. Hinweis: Vor dem Testen den Schleim (Mucin) von dem fäkalen
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Material entfernen. Ein Fehlschlag der Probeentnahme des fäkalen Materials aufgrund von übermäßigem
Schleim kann zu falsch negativen Ergebnissen führen. Proben mit übermäßigem Schleimgehalt sollten nicht
getestet werden.
1. Um eine Probe aus flüssiger Stuhlprobe zu entnehmen, die Tupferspitze vollständig in die Stuhlprobe
einführen. Mit dem Tupfer die Innenseite des Röhrchens berühren, um übermäßige Flüssigkeit zu
entfernen. Um eine Probe aus halbfester Stuhlprobe zu entnehmen, die Tupferspitze an mindestens
vier Stellen vollständig in die Stuhlprobe einführen. Den Tupfer gegen die Innenseite des
Probenröhrchens drehen, um übermäßigen Stuhl zu entfernen; die Form der Tupferspitze muss
deutlich zu erkennen sein. Bei optionaler positiver Flüssigkontrolle diese wie eine flüssige Probe
handhaben und die Kontrollprobe mit dem mitgelieferten Tupfer entnehmen.
2. Den Neugeborenen-Tupfer in Prozesspuffer 1 eintauchen und 4 bis 5 Sekunden drehen, um den Stuhl
vom Tupfer zu lösen und zu mischen.
3. 30 µl von Prozesspuffer 1 in Prozesspuffer 2 pipettieren. 4 bis 5 Mal mit einer auf 570 µl kalibrierten
Pipette auf- und abpipettieren.
Hinweis: In Prozesspuffer 1 und Prozesspuffer 2 verdünnte Proben können bis zu 7 Tage lang bei
Raumtemperatur (20 bis 25 C) aufbewahrt werden.
ACHTUNG: Proben in Prozesspuffer 1 und Prozesspuffer 2 dürfen nicht gekühlt oder eingefroren
werden!
Vorgehensweise zum Rehydrieren des Mastermix:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Die Anzahl der zu testenden Präparate bestimmen und die entsprechende Anzahl an lyophilisierten
Mastermix-Fläschchen (für jeweils acht Reaktionen) für den Assay bereitstellen.
Unbenutzte Reagenzien wieder unter ihren jeweiligen Aufbewahrungsbedingungen aufbewahren.
Den Mastermix vorsichtig öffnen, um eine Beschädigung des Pellets zu vermeiden.
Dem Mastermix 135 µl der Rehydrierungslösung zugeben.
Das Fläschchen 1 bis 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, damit das Pellet rehydriert.
Vor dem Verteilen in die erste Testplattenvertiefung vorsichtig und unter Vermeidung der Bildung von
Luftbläschen 2 bis 3 Mal auf- und abpipettieren.
Hinweis: Der rehydrierte Mastermix ist ausreichend für acht Reaktionen.
Hinweis: Der rehydrierte Mastermix muss innerhalb von 60 Minuten verwendet werden. Bei längerer
Lagerung muss der Mastermix wieder mit einem Deckel verschlossen und mit Parafilm versiegelt
werden und kann bis zu 3 Tage in aufrechter Position bei ≤ -20 °C gelagert werden. Den Mastermix
lichtgeschützt aufbewahren.
Vorgehensweise zum Vorbereiten der PCR:
1.
2.
3.
4.
5.
In jedes Reagenzröhrchen bzw. in jede Testplattenvertiefung 15 µl des rehydrierten Mastermix geben.
5 µl der Probe in Prozesspuffer 2 in das Reagenzröhrchen oder die Testplattenvertiefungen geben. Ein
Mischen der Reagenzien ist nicht erforderlich.
Hinweis: Für jeden Probenextrakt eine neue Mikro-Pipettierer mit einer neuen aerosolfreien Spitze
verwenden.
Die Reagenzröhrchen schließen bzw. die Platte versiegeln.
Hinweis: Quidel empfiehlt, dass jeder Thermocycler-Lauf eine Vertiefung mit externen Kontrollen (z.
B. Quidel Molecular C. difficile Kontrollset, Artikel-Nr. M108) enthält. Die Kontrollen nach den jeweils
im Labor üblichen Vorgehensweisen und Protokollen testen.
Die Reagenzröhrchen bzw. die Platte mindestens 15 Sekunden zentrifugieren. Darauf achten, dass
sich die gesamte Flüssigkeit am Boden der Platte oder des Reagenzröhrchens befindet.
Die Röhrchen bzw. die Platte in den Thermocycler setzen.
Amplifikationsprotokoll auf dem 7500 Fast Dx Thermocycler
1.
2.
3.
4.
5.
Den 7500 Fast Dx einschalten.
Das 7500 Fast Dx Softwarepaket starten.
Das Dialogfenster Kurzanleitung zur Inbetriebnahme wird geöffnet.
Auf Neues Dokument erstellen klicken.
Bei den meisten der folgenden Eingaben handelt es sich um Standardeinstellungen. Andernfalls die
entsprechenden Änderungen vornehmen.
Seite 13 von 29
Assay:
Behältnis:
Vorlage:
Laufmodus:
Bediener:
Anmerkungen:
Bezeichnung
der Platte:
6.
7.
8.
Standardkurve (Absolute Quantifizierung)
96 Vertiefungen, transparent
Fast 7500
Ihr Bedienername
SDS v1.4 (ggf. weitere hinzufügen)
JJMMTT-Quidel Molecular C difficile
Vorbereitung einer Platte mit Proben
a. Auf den Registerkarten Vorbereitung und Platte wird das Platten-Layout angezeigt.
b. Alle Vertiefungen auswählen, die Proben enthalten werden, die rechte Maustaste drücken und
aus dem Dropdown-Menü die Option Kavitätenprüfung wählen. Im Popup-Fenster Well
Inspector die Detektoren für C. difficile und PRC wählen.
c. Zur Eingabe der Probenbezeichnungen die Option Well Inspector verwenden. Im Fenster „Well
Inspector“ können auch die Patienten-IDs eingegeben werden. Es wird empfohlen, dies vor dem
Resuspendieren des lyophilisierten Mastermix, nach dem Lauf oder mithilfe der Import-Funktion
durchzuführen, damit die PCR-Reaktionen vor Beginn des Laufs möglichst kurze Zeit der
Raumtemperatur ausgesetzt sind.
d. Den Lauf mit einer eindeutigen Bezeichung als „.sds“-Datei (z. B. JJMMTT-Lauf-ID-Nr.-Quidel
Molecular C difficile.sds) speichern.
e. Ein Fenster wird geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist.
„Vorbereitung“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
Starten der PCR
a. Die Registerkarte Gerät aufrufen.
b. Die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen in das Gerät setzen.
c. Unter Gerätesteuerung die Schaltfläche Start wählen, um den Lauf zu starten.
Nach der PCR
a. WICHTIG: Nach Beendigung des Laufs auf OK drücken. Die Daten durch Drücken der Schaltfläche
„Analysieren“ im Menü oben analysieren. Anschließend die Datei speichern.
b. Zum Speichern der Datei Dokument speichern in der Taskleiste drücken. Ein Fenster wird
geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist. „Datenanalyse nach
dem Lauf“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
Amplifikationsprotokoll auf dem QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Den QuantStudio Dx einschalten.
Den IVD-Modus auf dem Instrument auswählen.
Das QuantStudio Dx IVD Softwarepaket starten.
Wenn eine entsprechende Aufforderung angezeigt wird, Benutzername und Passwort eingeben.
Der Startbildschirm wird geöffnet.
Im Kästchen Vorbereitung den Namen des zuvor geladenen Tests „Quidel Molecular Direct C.
difficile“ eingeben.
7. Auf die Schaltfläche Vorbereitung klicken, um einen Lauf zu starten.
8. Der Bildschirm Vorbereitung, Testeigenschaften erscheint. Entsprechende Lauf-Informationen
eingeben.
a. Experimentname eingeben (Standardeinstellung startet den Lauf mit einem Datum und
Zeitstempel).
b. Die Information Platten-Barcode eingeben.
c. Unter Reagenzinformationen die Material-Chargennummern notieren.
d. Den Lauf mit einer eindeutigen Bezeichung als „.sds“-Datei (z. B. JJMMTT-Lauf-ID-Nr.-Quidel
Molecular C difficile.sds) speichern.
e. Ein Fenster wird geöffnet, in dem der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist.
„Vorbereitung“ bzw. andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
9. In der linken Menüleiste Definieren auswählen.
10. Die Probeninformationen bearbeiten.
a. Spezifische Probeninformationen für jede Vertiefung eingeben, indem die Standard-ID (Patient 1,
Patient 2 usw.) gelöscht wird und neue Informationen eingegeben werden, ODER
Seite 14 von 29
b.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Oben auf der Anzeige Aus Datei importieren auswählen, um eine vordefinierte Plattenkarte aus
einer Text-Datei (tabulator-getrennt) auszuwählen.
In der linken Menüleiste Zuweisen auswählen, um die richtige Plattenvorbereitung sicherzustellen.
Laden der Probenplatte.
a. Den Instrumententräger auswerfen.
b. Die PCR-Platte mit 96 Vertiefungen in die Maschine einführen, wobei die Vertiefung A1 in der
linken oberen Ecke positioniert wird.
c. Den Instrumententräger einziehen.
Den Lauf starten.
a. In der linken Menüleiste Lauf auswählen.
b. Oben im Bildschirm auf die Schaltfläche Lauf starten klicken.
i. Bei entsprechender Aufforderung die Seriennummer für das verwendete Instrument
auswählen.
Wenn der Lauf abgeschlossen ist, in der linken Menüleiste Lauf auswählen.
a. Zum Speichern der Datei Speichern in der Taskleiste drücken. Ein Fenster wird geöffnet, in dem
der Grund für die Änderung der Eingabe einzutragen ist. „Datenanalyse nach dem Lauf“ bzw.
andere Anmerkungen eingeben, die für den Lauf relevant sind.
b. Standardmäßig erscheint Amplifikationsplot. Um andere Plotarten anzuzeigen, können diese aus
der linken Menüleiste ausgewählt werden.
c. Um Laufinformationen mit Ct-Werten anzuzeigen, die Registerkarte Vertiefungstabelle rechts im
Bildschirm auswählen.
Drucken eines Berichts.
a. In der oberen Menüleiste Bericht drucken auswählen. Den Inhalt des Berichts anpassen, indem
Kontrollkästchen im Berichtsfenster ausgewählt werden oder ihre Auswahl aufgehoben wird.
b. Unten im Dialogfeld die Schaltfläche Bericht drucken auswählen.
Exportieren von Datendateien.
a. In der linken Menüleiste Exportieren auswählen.
b. Den Pfad der Exportdatei auswählen ODER auf Durchsuchen klicken, um den gewünschten Pfad
zu suchen.
c. Der Name der Exportdatei ist standardmäßig der des gespeicherten Laufs.
d. Excel als Dateityp auswählen.
e. Den exportierten Datenbericht anpassen, indem zwischen den Registerkarten hin- und
hergewechselt wird und Optionen ausgewählt werden oder ihre Auswahl aufgehoben wird.
f. Unten im Bildschirm die Schaltfläche „Export starten“ auswählen.
Amplifikationsprotokoll auf dem SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Den Block / die Blöcke des SmartCyclers einschalten.
Das Softwarepaket des SmartCycler Dx Version 3.0b starten.
Die Schaltfläche Lauf erstellen oben im Bildschirm auswählen, um den Lauf einzustellen.
Unter Name des Laufs eine eindeutige Bezeichnung für den aktuellen Lauf eingeben (z. B.
JJMMTT_Quidel Molecular C. difficile).
Unter Anmerkungen etwaige Anmerkungen zu dem Lauf zur künftigen Bezugnahme eingeben.
Unter Assay den Assay „Quidel Molecular C. difficile“ aus dem Dropdown-Menü auswählen.
Unter Assay-Informationen die Chargennummer und das Verfallsdatum des Kits eingeben.
Zur Auswahl der zu verwendenden Vertiefungen wie folgt vorgehen:
a. Zur automatischen Zuordnung von Vertiefungen wie folgt vorgehen:
i. Unter Anzahl der Proben die Anzahl der Proben in das dazu vorgesehene Textfeld eingeben.
ii. Die Schaltfläche Anwenden auswählen. Die eingegebene Anzahl an Reihen wird in der
Positionstabelle angezeigt.
b. Manuelles Schließen der Vertiefungen der SmartCycler-Blöcke:
i. Die Schaltfläche Positionen hinzufügen/entfernen weiter unten auf dem Bildschirm wählen.
ii. Dadurch wird das Popup-Fenster Positionen auswählen mit zwei Spalten aufgerufen. Die
Spalte links (Positionen) führt alle verfügbaren Positionen auf, die Spalte rechts
(Auswahlen) enthält alle ausgewählten Positionen.
iii. Zur Auswahl aller Positionen auf die Schaltfläche Alle Positionen wählen klicken.
iv. Zur Auswahl spezifischer Positionen mindestens eine Position markieren und die Position(en)
mithilfe des Nach-rechts-Pfeils der Spalte Auswahlen hinzufügen.
v. Zum Schließen des Fensters die Schaltfläche OK drücken. Die ausgewählten Positionen
werden in der Positionstabelle angezeigt.
Seite 15 von 29
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Die Probenkennungen in die Spalte Proben-ID in der Positionstabelle eingeben (dies kann auch erst
nach Beginn des Laufs durchgeführt werden).
In die Spalte Anmerkungen etwaige Anmerkungen eintragen und die Einträge in der Spalte Probentyp
bei „SPEC“ belassen.
Unten im Bildschirm die Schaltfläche Lauf starten auswählen.
Nach Beendigung des Laufs die Registerkarte Ergebnisse anzeigen aufrufen.
Den Lauf nach seinem Abschluss und vor dem Schließen der Software speichern.
Die Registerkarte Probenergebnisse öffnen.
Die SmartCycler-Software gibt automatisch an, ob in den Proben C. difficile nachgewiesen wurde oder
ob der Lauf ungültig war (nicht erkannt).
Auswertung der Ergebnisse
Auswertung der Ergebnisse mit dem 7500 Fast Dx Thermocycler
Auswertung der Ergebnisse des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays auf dem
Applied Biosystems 7500 Fast DX Thermocycler
AssayDetektor
Detektor
Ergebnis
C. difficile
Prozesskontrolle
Kein Ct-Wert
Negativ
Ct-Wert gemeldet Keine toxigene C. difficile DNA nachgewiesen
gemeldet
C. difficile
Ct-Wert gemeldet
N. z.*
Toxigene C. difficile DNA nachgewiesen
positiv
Keine C. difficile DNA und keine PRC nachgewiesen;
bei ungültigen Testergebnissen den Test zunächst
mit derselben verarbeiteten Probe wiederholen. Ist
Kein Ct-Wert
Kein Ct-Wert
Ungültig
ein erneuter Test mit der verarbeiteten Probe
gemeldet
gemeldet
ebenfalls ungültig, ein anderes Aliquot derselben
Probe erneut verarbeiten oder eine neue Probe
entnehmen und einen neuen Test durchführen.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ct-Wert erforderlich.
Auswertung der Ergebnisse mit dem Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
Programmierungsanweisungen für das Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
AssayDetektor
Detektor
Ergebnis
C. difficile
Prozesskontrolle
Kein Ct-Wert
Negativ
Ct-Wert gemeldet Keine toxigene C. difficile DNA nachgewiesen
gemeldet
C. difficile
Ct-Wert gemeldet
N. z.*
positiv
Keine C. difficile DNA und keine PRC nachgewiesen;
bei ungültigen Testergebnissen den Test zunächst
mit derselben verarbeiteten Probe wiederholen. Ist
Kein Ct-Wert
Kein Ct-Wert
Ungültig
ein erneuter Test mit der verarbeiteten Probe
gemeldet
gemeldet
ebenfalls ungültig, ein anderes Aliquot derselben
Probe erneut verarbeiten oder eine neue Probe
entnehmen und einen neuen Test durchführen.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ct-Wert erforderlich.
Seite 16 von 29
Auswertung der Ergebnisse mit dem Cepheid SmartCycler II Dx Thermocycler
Cepheid SmartCycler II Dx Thermocycler
AssayDetektor:
Detektor:
Ergebnis
C. difficile
Prozesskontrolle
C. difficile
negativ
NEG.
Bestanden
C. difficile
positiv
POS.
N. z.*
Keine toxigene C. difficile DNA nachgewiesen
Keine C. difficile DNA und keine PRC nachgewiesen; bei
ungültigen Testergebnissen den Test zunächst mit
C. difficile
derselben verarbeiteten Probe wiederholen. Ist ein
nicht
NEG.
Fehlgeschlagen
erneuter Test mit der verarbeiteten Probe ebenfalls
erkannt
ungültig, ein anderes Aliquot derselben Probe erneut
verarbeiten oder eine neue Probe entnehmen und einen
neuen Test durchführen.
*Für die Prozesskontrolle ist zur Einstufung als positives Ergebnis kein Ergebnis erforderlich.
Qualitätskontrolle
Der Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay enthält mehrere Kontrollen zur Überwachung der Leistung des
Assays.
1. Die Prozesskontrolle ist während der Probenverarbeitung und Amplifikation im Assay zu verwenden. Diese
Kontrolle ist in Prozesspuffer 2 vorgefüllt.
2. Handelsübliche externe positive C. difficile-Kontrollen können wie ein Patientenpräparat behandelt
werden. Ihre Handhabung sollte nach den im Labor üblichen Standardvorgehensweisen erfolgen. Anstelle
einer handelsüblichen C. difficile -Kontrolle können auch bereits charakterisierte positive C. difficilePräparate verwendet werden.
3. Als externe Negativkontrolle eignet sich ein bereits charakterisiertes negatives Präparat. Diese sind wie ein
Patientenpräparat und nach Ihren Standardvorgehensweisen im Labor zu behandeln.
Einschränkungen
Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit toxigenem C. difficile nicht aus und dürfen nicht als
alleinige Basis für eine Behandlungsentscheidung herangezogen werden.
Wie bei anderen Assays dieser Art besteht ein Risiko für falsch negative Ergebnisse aufgrund des
Vorhandenseins von Variationen in den Amplifikationszielen.
Unsachgemäße Entnahme und Lagerung oder unsachgemäßer Transport können zu falsch negativen
Ergebnissen führen.
Auch Inhibitoren in der Probe und/oder Fehler bei der Durchführung des Assays können zu
falschnegativen Ergebnissen führen.
Unsachgemäßes Testen der Probe (z. B. Schleim) kann zu falsch negativen Ergebnissen führen.
Klinische Leistung
Die Leistung des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays wurde mit Proben beurteilt, die zwischen August
2012 und November 2012 an vier verschiedenen geografischen Orten in den USA entnommen wurden. Der
Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay wurde im Rahmen zweier Studien (einer Studie für den ABI 7500 Dx
und den Cepheid SmartCycler II (665 Proben) und einer zweiten Studie für den QuantStudio Dx (792 Proben))
mit einer direkten und einer angereicherten toxigenen C. difficile-Kultur verglichen. Die Tabellen unten
enthalten Daten dieser Studien.
Die Leistungsmerkmale des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays wurden anhand einer von August
bis Novemeber 2012 durchgeführten prospektiven Studie bestimmt. Die in dieser Studie verwendeten
Sechshundertundfünfundsechzig (665) Proben wurden Patienten, bei denen Verdacht auf Clostridiumdifficile-assoziierte Erkrankung (CDAD) besteht, an vier verschiedenen geografischen Orten in den USA
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entnommen. Diese Proben wurden mit dem Quidel Assay auf dem 7500 Fast Dx an einem von drei (3)
Standorten getestet.
Neun (9) Proben (1,35 %) waren bei den ersten Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig.
Wir haben die Alters- und Geschlechterverteilung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für jede Probe
erhalten wurde, berechnet. Aus diesem Grund gelten die unten stehenden Daten zum Alter und
Geschlecht der Patienten für die verbleibenden sechshundertsechsundfünfzig (656) Proben.
Kombinierte Standorte – Alters- und Geschlechterverteilung
Prävalenz nach Alter der C. difficileGeschlecht
Positivfälle mit dem Quidel Molecular
Alter
Gesamt
Direct C. difficile-Assay auf dem Applied
männlich weiblich
Biosystems 7500 Fast Dx
Geschlecht unbekannt
3 33,3 % (1/3)
Säugling
4
4
8 12,5 % (1/8)
(<2 Jahre)
Kind
21
18
39 25,6 % (10/39)
(≥2 bis <12 Jahre)
Jugendlicher
8
11
19 21,1 % (4/19)
Heranwachsender (≥18
5
8
13 15,4 % (2/13)
bis ≤21 Jahre)
Erwachsener
132
146
278 19,1 % (53/278)
(>21 bis 59 Jahre)
älterer Erwachsener
127
169
296 15,9 % (47/296)
(>60 Jahre)
Gesamt
297
356
656 18,0 % (118/656)
Direktkultur-Zytotoxizitätsassay-Vergleich
Sechshundertfünfundsechzig (665) Proben wurden sowohl mit dem Quidel Molecular Direct C. difficileAssay als auch dem Gewebekultur-Zytotoxin-Assay getestet. Drei Proben (0,5 %) waren im Zytotoxin-Assay
aufgrund von Toxizität in der Antitoxin-Vertiefung unklar. Neun Proben (1,35 %) waren bei den ersten
Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig. Acht Proben ergaben bei Wiederholungstests
gemäß dem Entwurf der Packungsbeilage des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay gültige Ergebnisse
(7 waren negativ, 1 war positiv). Eine Probe war auch bei dem Wiederholungstest ungültig. Wir haben die
klinische Leistung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für jede Probe erhalten wurde, berechnet. Aus
diesem Grund basieren die unten stehenden Daten auf den verbleibenden sechshundertdreiundfünfzig
(653) Proben.
Kombinierte Standorte – kombinierte Altersgruppen
Direktkultur
95 % KI
POS.
NEG.
Gesamt
Empfindlichkeit
94,3
%
87,4
% 97,5 %
Quidel-MolekularPOS.
83
33*
116
Spezifität
94,2 % 91,9 % 95,8 %
Echtzeit-PCR Direct C.
difficile-Assay auf ABI
NEG.
5**
532
537
7500
Gesamt 88
565
653
*
Von den dreiunddreißig (33) gemeldeten diskordanten Proben (Quidel Molecular positiv/Direktkultur negativ) wurden
zweiunddreißig (32) mit einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Alle zweiunddreißig Proben
wurden positiv auf C. difficile getestet. Die verbleibende Probe war nicht zum Testen verfügbar.
** Fünf (5) gemeldete diskordante Proben (Quidel negativ / Gewebekultur-Zytotoxin positiv) wurden mit einem FDA-zugelassenen
molekularbiologischen Messinstrument getestet. Alle fünf (5) dieser Proben wurden negativ auf C. difficile getestet.
Vergleich mit angereicherter toxigener Kultur
Sechshundertfünfundsechzig (665) Proben wurden sowohl mit dem Quidel Molecular Direct C. difficileAssay als auch mit einer angereicherten toxigenen Kultur getestet. Neun Proben (1,35 %) waren bei den
ersten Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig. Acht Proben ergaben bei
Wiederholungstests gemäß dem Entwurf der Packungsbeilage des Quidel Molecular Direct C. difficileAssay gültige Ergebnisse (7 waren negativ, 1 war positiv). Eine Probe war auch bei dem
Wiederholungstest ungültig. Wir haben die klinische Leistung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für
jede Probe erhalten wurde, berechnet. Aus diesem Grund gelten die unten stehenden Daten für die
verbleibenden sechshundertsechsundfünfzig (656) Proben.
Seite 18 von 29
Angereicherte toxigene Kultur
POS.
NEG. Gesamt
POS.
112
6*
118
C. difficile-Assay auf
NEG.
14**
524
538
ABI 7500
Gesamt
126
530
656
Empfindlichkeit
Spezifität
88,9 %
98,9 %
95 % KI
82,2 % 93,3 %
97,6 % 99,5 %
** Sechs (6) gemeldete diskordante Proben (Quidel Molecular positiv / angereicherte toxigene Kultur negativ) wurden mit einem
FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Alle sechs Proben wurden positiv auf C. difficile getestet.
** Zwölf (12) gemeldete diskordante Proben (Quidel negativ / angereicherte toxigene Kultur positiv) wurden mit einem FDAzugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Zwei (2) Proben waren nicht zum Testen verfügbar. Neun (9)
Proben darunter wurden negativ auf C. difficile und drei (3) positiv getestet.
Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrumentensystem
Siebenhundertzweiundneunzig (792) Proben wurden Patienten, bei denen Verdacht auf Clostridiumdifficile-assoziierte Erkrankung (CDAD) besteht, an vier (4) verschiedenen geografischen Orten in den USA
entnommen. Diese Proben wurden mit dem Quidel Assay auf dem QuantStudio Dx Instrument an einem
von drei (3) Standorten getestet. Eine (1) Probe (0,1 %) war bei den ersten Tests im Quidel Molecular
Direct C. difficile-Assay ungültig. Wir haben die Alters- und Geschlechterverteilung auf Basis des ersten
Testergebnisses, das für jede Probe erhalten wurden, berechnet. Aus diesem Grund gelten die unten
stehenden Daten zum Alter und Geschlecht der Patienten für die verbleibenden
siebenhunderteinundneunzig (791) Proben.
Geschlecht
Alter
männlich
weiblich
Gesamt
Prävalenz nach Alter der C. difficilePositivfälle mit dem Quidel
Molecular Direct C. difficile-Assay
auf dem QuantStudio
50,0 % (1/2)
2
Säugling
5
5
10 10,0 % (1/10)
(<2 Jahre)
Kind
28
21
49 24,5 % (12/49)
Jugendlicher
10
14
24 20,8 % (5/24)
Heranwachsender
6
7
13 7,7 % (1/13)
(≥18 bis ≤21 Jahre)
Erwachsener
158
170
328 18,3 % (60/328)
(>21 bis 59 Jahre)
163
202
365 17,8 % (65/365)
(>60 Jahre)
Gesamt
370
419
791 18,3 % (145/791)
Direktkultur-Assay-Vergleich
Siebenhundertzweiundneunzig Proben wurden sowohl mit dem Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay
als auch mit dem Direktkultur-Assay getestet. Drei (3) Proben (0,4 %) waren im Zytotoxin-Assay aufgrund
von Toxizität in der Antitoxin-Vertiefung unklar. Eine (1) Probe (0,1 %) war bei den ersten Tests im Quidel
Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig. Die Probe ergab bei Wiederholungstests gemäß dem Entwurf
der Packungsbeilage des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ein gültiges Ergebnis (sie war negativ).
Wir haben die klinische Leistung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für jede Probe erhalten wurde,
berechnet. Aus diesem Grund basieren die unten stehenden Daten auf den verbleibenden
siebenhundertachtundachzig (788) Proben.
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Gewebekultur-Zytotoxin
POS.
NEG. Gesamt
POS.
98
45*
143
NEG.
7**
638
645
LTI QuantStudio
Gesamt
105
683
788
Empfindlichkeit
Spezifität
93,3 %
93,4 %
95 % KI
86,9 % 96,7 %
91,3 % 95,0 %
*
Von den fünfundvierzig (45) gemeldeten diskordanten Proben (Quidel Molecular positiv / Direktkultur negativ) wurden
vierundvierzig (44) mit einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Fünfunddreißig (35) dieser
Proben wurden positiv und neun (9) negativ auf C. difficile getestet. Die verbleibende Probe war nicht zum Testen verfügbar.
** Sieben (7) gemeldete diskordante Proben (Quidel negativ / Direktkultur positiv) wurden mit einem FDA-zugelassenen
molekularbiologischen Messinstrument getestet. Zwei (2) dieser Proben wurden positiv auf C. difficile getestet und fünf (5)
waren negativ.
Siebenhundertzweiundneunzig (792) Proben wurden sowohl mit dem Quidel Molecular Direct C. difficileAssay als auch mit einer angereicherten toxigenen Kultur getestet. Eine (1) Probe (0,1 %) war bei den
ersten Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig. Die Probe ergab bei Wiederholungstests
gemäß dem Entwurf der Packungsbeilage des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ein gültiges Ergebnis
(sie war negativ). Wir entschieden uns, die klinische Leistung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für
jede Probe erhalten wurden, zu berechnen. Aus diesem Grund basieren die unten stehenden Daten auf den
verbleibenden siebenhunderteinundneunzig (791) Proben.
POS.
NEG. Gesamt
Quidel Molecular
POS.
137
8*
145
Direct C. difficile-Assay
NEG.
20**
626
646
auf LTI QuantStudio
Gesamt
157
634
791
Empfindlichkeit
Spezifität
87,3 %
98,7 %
95 % KI
81,1 % 91,6 %
97,5 %
99,4%
** Acht (8) gemeldete diskordante Proben (Quidel Molecular positiv / angereicherte toxigene Kultur negativ) wurden mit einem
FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Zwei (2) dieser Proben wurden positiv auf C. difficile
getestet und sechs (6) waren negativ.
** Siebzehn (17) der zwanzig (20) gemeldeten diskordanten Proben (Quidel negativ / angereicherte toxigene Kultur positiv) wurden
mit einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Drei (3) Proben waren nicht zum Testen
verfügbar. Elf (11) dieser Proben wurden negativ auf C. difficile getestet und sechs (6) waren positiv.
Sechshundertundfünfundsechzig (665) Proben wurden Patienten, bei denen Verdacht auf Clostridiumdifficile-assoziierte Erkrankung (CDAD) besteht, an vier verschiedenen geografischen Orten in den USA
entnommen. Diese Proben wurden mit dem Quidel Assay auf dem SmartCycler II an einem von drei (3)
Standorten getestet.
Fünf (5) Proben (0,75 %) waren bei den ersten Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig.
Wir haben die Alters- und Geschlechterverteilung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für jede Probe
erhalten wurde, berechnet. Aus diesem Grund gelten die unten stehenden Daten zum Alter und
Geschlecht der Patienten für die verbleibenden sechshundertsechzig (660) Proben.
Alter
Gesamt
Direct C. difficile-Assay auf dem
männlich weiblich
3 33,3 % (1/3)
Säugling
4
4
8 12,5 % (1/8)
(<2 Jahre)
Kind
21
18
39 23,1 % (9/39)
Jugendlicher
8
11
19 15,8 % (3/19)
Heranwachsender
5
8
13 7,7 % (1/13)
Seite 20 von 29
Alter
Gesamt
Direct C. difficile-Assay auf dem
männlich weiblich
(≥18 bis ≤21 Jahre)
Erwachsener
133
147
280 18,6 % (52/280)
(>21 bis 59 Jahre)
129
169
298 17,1 % (51/298)
(>60 Jahre)
Gesamt
300
357
660 17,9 % (118/660)
Direktkultur-Assay-Vergleich
Sechshundertfünfundsechzig (665) Proben wurden sowohl mit dem Quidel Molecular Direct C. difficileAssay als auch dem Direktkultur-Assay getestet. Drei (3) Proben (0,5 %) waren im Zytotoxin-Assay
aufgrund von Toxizität in der Antitoxin-Vertiefung unklar. Fünf (5) Proben (0,75 %) waren bei den ersten
Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig. Alle fünf (5) Proben ergaben bei
Wiederholungstests gemäß dem Entwurf der Packungsbeilage des Quidel Molecular Direct C. difficileAssay gültige Ergebnisse (3 waren negativ, 2 waren positiv). Wir haben die klinische Leistung auf Basis des
ersten Testergebnisses, das für jede Probe erhalten wurde, berechnet. Aus diesem Grund gelten die
unten stehenden Daten für die verbleibenden sechshundertsiebenundfünfzig (657) Proben.
Gewebekultur-Zytotoxin
POS.
NEG. Gesamt
POS.
78
38*
116
NEG.
9**
532
541
Gesamt
87
570
657
Empfindlichkeit
Spezifität
89,7 %
93,3 %
95 % KI
81,5 % 94,5 %
91,0 % 95,1%
* Die achtunddreißig (38) gemeldeten diskordanten Proben (Quidel Molecular positiv / Direktkultur negativ) wurden mit einem
FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Neun (9) Proben darunter wurden negativ auf C. difficile
und neunundzwanzig (29) positiv auf C. difficile getestet.
** Acht (8) der neun (9) gemeldeten diskordanten Proben (Quidel negativ / Direktkultur positiv) wurden mit einem FDAzugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Eine (1) Probe war nicht zum Testen verfügbar. Fünf (5) Proben
darunter wurden negativ auf C. difficile und drei (3) positiv getestet.
Sechshundertfünfundsechzig (665) Proben wurden sowohl mit dem Quidel Molecular Direct C. difficileAssay als auch mit einer angereicherten toxigenen Kultur getestet. Fünf (5) Proben (0,75 %) waren bei den
ersten Tests im Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay ungültig. Alle fünf (5) Proben ergaben bei
Wiederholungstests gemäß dem Quidel Molecular Direct C. difficile gültige Ergebnisse (3 waren negativ, 2
waren positiv). Wir entschieden uns, die klinische Leistung auf Basis des ersten Testergebnisses, das für
jede Probe erhalten wurden, zu berechnen. Aus diesem Grund gelten die unten stehenden Daten für die
verbleibenden sechshundertsechzig (660) Proben.
POS.
NEG. Gesamt
POS.
103
15*
118
Cepheid
NEG.
22**
520
542
SmartCycler II
Gesamt
125
535
660
Empfindlichkeit
Spezifität
82,4 %
97,9 %
95 % KI
74,8 % 88,1 %
95,4 % 98,3 %
* Fünfzehn (15) gemeldete diskordante Proben (Quidel Molecular positiv/ angereicherte toxigene Kultur negativ) wurden mit
einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Sechs (6) Proben darunter wurden positiv und neun
(9) davon negativ auf C. difficile getestet.
** Neunzehn (19) der zweiundzwanzig (22) gemeldeten diskordanten Proben (Quidel negativ / angereicherte toxigene Kultur
positiv) wurden mit einem FDA-zugelassenen molekularbiologischen Messinstrument getestet. Drei (3) Proben waren nicht zum
Testen verfügbar. Zehn (10) Proben darunter wurden positiv auf C. difficile und neun (9) negativ getestet.
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Analytische Leistung
Nachweisempfindlichkeit
Die analytische Empfindlichkeit (Nachweisgrenze bzw. LoD) des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays
wurde anhand von quantifizierten (CFU/ml) Kulturen von zwei C. difficile-Stämmen (ATCC BAA-1870 und ATCC
BAA-1872) ermittelt, die in einer negativen Fäkalmatrix seriell verdünnt wurden. Analytische Empfindlichkeit
(LoD) wird als die niedrigste Konzentration definiert, bei der 95 % aller Replikate positiv testeten.
StammKennzeichnung
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Berechnete
CFU pro Assay
Toxinotyp
CFU/ml bei LoD
bei LoD
IIIb
8,4E+04
4,2E-01
0
2,4E+04
1,2E-01
LoD
Bestätigungsergebnisse
60/60
59/60
StammKennzeichnung
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Berechnete
CFU pro Assay
Toxinotyp
CFU/ml bei LoD
bei LoD
IIIb
8,4E+04
4,2E-01
0
8,0E+03
4,0E-02
LoD
20/20
20/20
StammKennzeichnung
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Berechnete
CFU pro Assay
CFU/ml bei LoD
bei LoD
8,4E+04
4,2E-01
2,4E+04
1,2E-01
LoD
58/60
60/60
Toxinotyp
IIIb
0
Analytische Reaktivität (Inklusivität)
Die analytische Reaktivität des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays wurde anhand von quantifizierten
(CFU/Assay) Kulturen von C. difficile-Stämmen verschiedener Toxinotypen ermittelt, einschließlich
hypervirulenter Stämme, die in einer negativen Fäkalmatrix bei 2-3X LoD verdünnt wurden.
C. difficile Stamm
Toxinotyp
Konzentration
(CFU/Assay)
Ergebnis
ATCC 43255
0
5,0E-2
Positiv
CCUG 8864
X
1,2E-01
Positiv
CCUG 37770
IV
6,6E-01
Positiv
ATCC BAA-1875
V
9,8E-01
Positiv
ATCC 43598
VIII
1,14E+00
Positiv
CCUG 37774
XXIII
1,0E-01
Positiv
CCUG 9004
N. z.
9,5E-01
Positiv
ATCC BAA-1874
0
2,0 E-01
Positiv
ATCC 43600
0
7,4 E-01
Positiv
ATCC BAA-1871
0
3,0 E-02
Positiv
ATCC BAA-1803
IIIc
1,2 E-01
Positiv
ATCC 700792
0
1,11 E+00
Positiv
ATCC 43599
0
1,3 E-01
Positiv
CCUG 60276
N. z.
1,01 E-01
Positiv
CCUG 60275
N. z.
6,8 E-01
Positiv
CCUG 37778
N. z.
3,4 E-01
Positiv
CCUG 37777
N. z.
7,3 E-01
Positiv
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C. difficile Stamm
Toxinotyp
Konzentration
(CFU/Assay)
Ergebnis
CCUG 37776
N. z.
1,6 E-01
Positiv
CCUG 37773
N. z.
9,0 E-02
Positiv
ATCC 17857
0
5,6 E-01
Positiv
ATCC 43594
0
8,0 E-02
Positiv
ATCC 43596
0
7,3 E-01
Positiv
ATCC BAA-1872
0
4,2E-01
Positiv
ATCC BAA-1870
IIIb
1,2E-01
Positiv
Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität und mikrobielle Störung)
Die analytische Spezifität des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays wurde durch Testen eines Panels
beurteilt, das aus sechsundsechzig (66) bakteriellen, viralen und Hefe-Mikroorganismen bestand, die häufig im
Darm anzutreffende enterische Pathogene, Flora oder Nukleinsäure repräsentieren, sowie aus menschlicher
DNA. Die Mikroorganismen oder Nukleinsäuren wurde mit gepoolter negativer Matrix gemischt und direkt
oder in Gegenwart von 2 bis 3x LoD C. difficile auf Kreuzreaktivität bzw. mikrobielle Störung getestet. Diese
Studien wurden nur auf dem ABI 7500 durchgeführt.
Die Tabelle unten fasst die Daten dieser Studien zusammen. Es gab keine Anzeichen von Kreuzreaktivität bei
Panel-Elementen oder dem Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay.
Ergebnisse
Mikrobielle
Störung
Kreuzreaktivität
C. difficile
C. difficile
Ergebnis
Ergebnis
ATCC BAA1870
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Mikrobielle
Störung
C. difficile
Ergebnis
ATCC BAA1872
Positiv
Positiv
Organismus-ID
Identifizierung
Getestete
Konzentration
(CFU/ml oder
PFU/ml)
Subspecies faecalis
Bacillus cereus
Campylobacter coli*
Campylobacter jejuni
Subspecies jejuni
Candida albicans
Clostridium difficile (nicht
toxigen)
Clostridium difficile (nicht
toxigen)
Clostridium
haemolyticum*
Clostridium novyi
(Stamm: Typ A)
ZM 081597
ATCC 7966
5,27E+08
2,09E+10
ATCC 15554
4,65E+09
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 13472
CCUG 4856
CCUG 36995
1,00E+07
1,77E+08
5,30E+08
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
ATCC 33292
1,72E+07
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 10231
3,00E+07
ATCC 8090
2,38E+09
ATCC 638
2,05E+07
In-silico-Analyse
CCUG 47601
1,75E+07
Negativ
Positiv
Positiv
Negativ
Positiv
Positiv
Negativ
Positiv
Positiv
Keine In-silico-Kreuzreaktivität beobachtet
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 43601
4,58E+06
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 43593
1,13E+06
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 9650
3,43E+09
Negativ
Positiv
Positiv
CCUG 57219
ATCC 49531
6,50E+06
5,30E+06
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
ZM 0801585
3,37E+07
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 35704
ATCC 12464
ATCC 9714
1,62E+07
6,60E+09
1,94E+06
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
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Ergebnisse
Mikrobielle
Störung
Kreuzreaktivität
C. difficile
C. difficile
Ergebnis
Ergebnis
ATCC BAA1870
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Mikrobielle
Störung
C. difficile
Ergebnis
ATCC BAA1872
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Organismus-ID
Identifizierung
Getestete
Konzentration
(CFU/ml oder
PFU/ml)
Edwardsiella tarda
Enterococcus faecalis
vanB
Escherichia coli
Helicobacter pylori
Klebsiellia oxytoca
(Serotyp 1/2b)
Peptostreptococcus
anaerobius
Porphyromonas
asaccharolytica
Prevotella
melaninogenica
Proteus mirabilis
Salmonella choleraesuis
(Typhimurium)
Salmonella enterica
Subspecies Arizonae
(zuvor Choleraesuis
arizonae)
Salmonella enterica
Subspecies enterica
(zuvor Salmonella
choleraesuis)
Serratia marcescens
Shigella boydii
Shigella sonnei
Staphylococcus
epidermidis
(Gruppe B
Z077
CCUG 6329
CCUG 9284
CCUG 33098
CCUG 36938
CCUG 43123
CCUG 47545
CCUG 59819
ATCC 11437
ATCC 15947
ATCC 13048
ATCC 13047
2,07E+08
9,85+E07
6,50E+07
2,00E+07
5,55E+07
2,50E+07
1,36E+07
7,00E+06
3,55E+07
2,03E+09
1,31E+10
5,95E+08
ATCC 51299
3,45E+09
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 23511
ZM 0801622
ZM 0801486
ATCC 33496
ATCC 4356
1,92E+09
2,20E+09
3,57E+06
1,63E+09
6,82E+07
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
ZM 0801534
1,18E+10
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 27337
5,80E+08
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 14029
1,40E+08
Negativ
Positiv
Positiv
CCUG 7834
1,30E+07
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 25845
5,10E+08
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 25933
ATCC 9886
ATCC 35554
1,06E+09
9,60E+08
2,60E+10
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
ATCC 14028
3,55E+10
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 13314
4,22E+09
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 7001
6,80E+09
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 27592
ZM 0801723
ATCC 9207
ATCC 49557
ATCC 29930
ATCC 43300
3,79E+10
6,10E+08
8,16E+08
1,26E+10
3,36E+08
6,00E+07
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
ATCC 14990
4,00E+08
Negativ
Positiv
Positiv
ATCC 12386
2,75E+08
Negativ
Positiv
Positiv
Seite 24 von 29
Organismus-ID
Streptokokken)
Adenovirus 1 VR-1*
Rotavirus (Stamm: WA)*
Norovirus GII
Enterovirus 71
Echovirus 6
Coxsackievirus B4
Cytomegalovirus Towne
VR-977
Identifizierung
Getestete
Konzentration
(CFU/ml oder
PFU/ml)
Ergebnisse
Mikrobielle
Störung
Kreuzreaktivität
C. difficile
C. difficile
Ergebnis
Ergebnis
ATCC BAA1870
Mikrobielle
Störung
C. difficile
Ergebnis
ATCC BAA1872
ATCC 17802
DHI 62207
ZM NATROTAST
ZM NATNOVIIST
DHI 80406
DHI 121506
DHI 92206
9,50E+06
5,67E+05
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
2,32E+08
Negativ
Positiv
Positiv
3,92E+08
Negativ
Positiv
Positiv
4,82E+05
1,05E+09
2,43E+07
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
Positiv
DHI 201006
1,48E+06
Negativ
Positiv
Positiv
Promega
184 µg/ml
Negativ
Positiv
Positiv
G3041
*Zum Testen dieser Organismen wurde gereinigte Nukleinsäure verwendet. Die Zellzahl wurde auf Grundlage
der Nuklearsäurenkonzentration und der Genomgröße geschätzt.
Humangenomische DNA
Analytische Spezifität – Störsubstanzen
Die Leistung des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays wurde mit potenziellen Störsubstanzen, die in
Stuhlproben vorhanden sein können, beurteilt. Die potenziellen Störsubstanzen wurden bei relevanten Levels
mithilfe der C. difficile-Stämme BAA-1870 und BAA-1872 bei einer Konzentration von 2 bis 3x LoD beurteilt. Es
gab keine Hinweise darauf, dass die folgenden 35 Substanzen, die getestet wurden, Störungen verursachten.
Palmitinsäure, Triclosan, Methicillin, Phenylephrin-HCl, Stearinsäure, Mineralöl, Naproxen-Natrium,
Aluminiumhydroxid, Magnesiumhydroxid, Mucin, Bariumsulfat, Cimetidin, Esomeprazole, Magnesiumhydrat,
Nystatin, Humanes Serumalbumin, Bismuth-Subsalicylat, Ethanol, Calciumcarbonat, Glukose,
Loperamidhydrochlorid, Humanes Hämoglobin, Benzalkoniumchlorid, 5-Aminosalicylsäure, Petrolat, Cortisol,
Zinkoxid, Sennoside, Vollblut, Nonoxynol-9, Miconazolnitratsalz, Aluminiumhydroxid/Magnesiumcarbonat,
Zaubernuss, Vancomycinhydrochlorid und Human-IgA.
Reproduzierbarkeitsstudie
Die Reproduzierbarkeit des Quidel Molecular Direct C. difficile-Assays wurde an 3 Laborstandorten beurteilt.
Die Reproduzierbarkeit wurde mit einer Platte mit 4 simulierten Proben bewertet, die mittelstarke (5x LoD),
niedrige (2x LoD), hoch negative (0,3x LoD) Konzentrationen von C. difficile-Proben und negative Proben
enthielten. Die Panels und Kontrollen wurden 5 Tage lang an jedem Standort von zwei Bedienern getestet
(Triplikat-Tests x 2 Bediener x 5 Tage x 3 Standorte = 90 Ergebnisse je Level). Die LoD-Werte basieren auf den
in der LoD-Studie erhobenen Daten. Die Panels und Kontrollen wurden extrahiert und auf dem Applied
Biosystems 7500 Fast DX-Instrument, dem Life Technologies QuantStudio Dx Instrument und dem Cepheid
SmartCycler II-Instrument getestet.
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Applied Biosystems 7500 Fast DX
Standort 1
Standort 2
PanelErgeb
AVE %
Ergebnisse AVE %
Elementnisse
Ct
Vertraue
Ct
Vertraue
ID
nswert
nswert
hoch
negativ
5/29
28,8 15,0
11/30
27,1 9,0
0,3x LoD
niedrig
positiv
29/30 23,2 8,4
30/30
22,7 7,5
2x LoD
mittel
30/30 20,5 5,7
30/30
20,2 5,0
positiv
Standort 3
Ergebn AVE Ct %
isse
Vertraue
nswert
Gesamte
rgebnisse
16/30
27,6
2,8
32/89
29/30
23,1
6,5
88/90
30/30
20,4
5,0
90/90
Seite 25 von 29
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Applied Biosystems 7500 Fast DX
Standort 1
Standort 2
PanelErgeb
AVE %
Ergebnisse AVE %
Elementnisse
Ct
Vertraue
Ct
Vertraue
ID
nswert
nswert
5x LoD
negative
0/29
N. z. N. z.
0/30
N. z. N. z.
Proben
Negative
0/30
N. z. N. z.
0/30
N. z. N. z.
Kontrolle
Positive
30/30 15,8 2,9
30/30
16,2 2,6
Kontrolle
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Life Technologies QuantStudio Dx
Standort 1
Standort 2
PanelErgeb
AVE %
Ergebnisse AVE %
Elementnisse
Ct
Vertraue
Ct
Vertraue
ID
nswert
nswert
hoch
negativ
8/30
22,9 5,0
15/30
22,5 5,7
0,3x LoD
niedrig
positiv
30/30 20,4 5,9
30/30
19,0 5,1
2x LoD
mittel
positiv
30/30 18,4 4,2
30/30
17,5 2,2
5x LoD
negative
0/30
N. z. N. z.
0/30
N. z. N. z.
Proben
Negative
0/30
N. z. N. z.
0/30
N. z. N. z.
Kontrolle
Positive
30/30 15,7 0,6
30/30
15,7 0,1
Kontrolle
Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit – Cepheid SmartCycler II
Standort 1
Standort 2
PanelErgeb
AVE %
Ergebnisse AVE %
Elementnisse
Ct
Vertraue
Ct
Vertraue
ID
nswert
nswert
hoch
negativ
17/30 23,4 6,6
22/30
25,3 13,4
0,3x LoD
niedrig
positiv
29/30 20,1 4,6
29/29
20,1 5,1
2x LoD
mittel
positiv
30/30 18,4 9,5
30/30
18,5 3,1
5x LoD
negative
0/30
N. z. N. z.
0/30
N. z. N. z.
Proben
Negative
0/30
N. z. N. z.
0/30
N. z. N. z.
Kontrolle
Positive
30/30 15,1 3,8
30/30
14,8 2,2
Kontrolle
Standort 3
Ergebn AVE Ct %
isse
Vertraue
nswert
Gesamte
rgebnisse
0/30
N. z.
N. z.
0/89
0/30
N. z.
N. z.
0/90
30/30
15,7
2,9
90/90
Standort 3
Ergebn AVE Ct %
isse
Vertraue
nswert
Gesamte
rgebniss
e
15/30
22,5
1,5
38/90
30/30
19,2
0,8
90/90
30/30
17,9
0,7
90/90
0/30
N. z.
N. z.
0/90
0/30
N. z.
N. z.
0/90
30/30
15,5
0,1
90/90
Standort 3
Ergebn AVE Ct %
isse
Vertraue
nswert
Gesamte
rgebniss
e
26/30
23,4
9.3
65/90
30/30
19,9
6,4
88/89
30/30
18,3
6,4
90/90
0/29
N. z.
N. z.
0/89
0/29
N. z.
N. z.
0/89
30/30
14,5
3,4
90/90
Carryover- und Kreuzkontaminationsstudien
Interne Studien lieferten keine Hinweise auf Carryover-/Kreuzkontamination mit dem Quidel Molecular Direct
C. difficile-Assay.
Seite 26 von 29
Kundendienst und technischer Support
Um eine Bestellung aufzugeben oder technischen Support anzufordern, wenden Sie sich bitte an einen QuidelRepräsentanten unter der Nummer (800) 874-1517 (gebührenfrei in den USA) oder (858) 552-1100 (außerhalb
der USA), Montag bis Freitag zwischen 8 und 17 Uhr (Ostküstenzeit). Bestellungen können auch per Fax
aufgegeben werden: (740) 592-9820. Für E-Mail-Support wenden Sie sich bitte an [email protected] oder
[email protected]. Für Dienstleistungen außerhalb der USA wenden Sie sich bitte an Ihren
Distributor vor Ort. Weitere Informationen über Quidel, unsere Produkte und unsere Distributoren sind auf
unserer Website quidel.com zu finden.
Geistiges Eigentum
Handelsmarken
Smartcycler® ist eine eingetragene Marke der Cepheid Corporation. Applied Biosystems® ist eine eingetragene
Marke von Life Technologies. QuantStudio™ ist eine eingetragene Marke von Life Technologies. TaqMan® ist
eine eingetragene Marke von Roche. CAL Flour® Orange 560 und Quasar® 670 sind eingetragene Marken von
BioSearch Technologies, Inc.
Patente
Die Farbstoffe in diesem Produkt werden unter Lizenz von BioSearch Technologies, Inc. verkauft und sind
durch ausgestellte oder angemeldete US- und weltweite Patente geschützt.
Der Käufer dieses Produkts gewährt dem Käufer Rechte unter bestimmten Roche-Patenten zur Verwendung
ausschließlich als In-Vitro-Diagnostikservice für den Menschen. Keine allgemeinen Patente oder anderen
Lizenzen jeglicher Art, außer diesem Recht zur Nutzung aufgrund von Erwerb, werden hiermit gewährt.
Seite 27 von 29
Glossar
Inhalt/Enthält
Kontrolle
Gebrauchsanweisung lesen
Einsatzbereich
96
Inhalt ist ausreichend für 96 Bestimmungen
Biologische Risiken
Seite 28 von 29
Literaturverweise
1
2
Sloan, L. M., B. J. Duresko, D. R. Gustafson und J. E. Rosenblatt. 2008. Comparison of Real-Time PCR for
Archibald, L. K., S. N. Banerjee und W. R. Jarvis. 2004. Secular trends in hospital-acquired Clostridium difficile
M105 – Quidel Molecular Direct C. difficile-Assay-Kit
MDSS GmbH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Deutschland
Quidel Corporation
Weltweite Unternehmenszentrale
San Diego, CA 92121 USA
quidel.com
M105en v2013MRZ13
Seite 29 von 29
Dosaggio C. difficile
Per il rilevamento qualitativo e l’identificazione del DNA batterico del Clostridium difficile
tossigenico a partire da campioni fecali
Dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile
Pagina 1 di 28
Contenuto
Uso previsto ............................................................................................................................................ 4
Riassunto e spiegazione .......................................................................................................................... 4
Principio della procedura ........................................................................................................................ 4
Materiali forniti ....................................................................................................................................... 5
Materiale facoltativo............................................................................................................................... 5
Materiali necessari ma non forniti .......................................................................................................... 5
Avvertenze e precauzioni........................................................................................................................ 5
Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit .............................................................................. 6
Prelievo, conservazione e manipolazione dei campioni ......................................................................... 6
Programmazione iniziale del termociclatore .......................................................................................... 7
Istruzioni per la programmazione di 7500 Fast DX ............................................................................. 7
Istruzioni per la programmazione dello strumento QuantStudio DX per
la reazione PCR in tempo reale .........................................................................................................10
Istruzioni per la programmazione di SmartCycler II..........................................................................10
Procedura del dosaggio.........................................................................................................................12
Procedura di elaborazione dei campioni ..............................................................................................12
Protocollo di amplificazione sul termociclatore 7500 Fast Dx ..........................................................13
Protocollo di amplificazione sullo strumento QuantStudio Dx per la reazione
PCR in tempo reale............................................................................................................................14
Protocollo di amplificazione su SmartCycler II ..................................................................................15
Interpretazione dei risultati ..................................................................................................................15
Interpretazione dei risultati con il termociclatore 7500 Fast Dx ......................................................15
Interpretazione dei risultati con lo strumento Life Technologies QuantStudio Dx per
la reazione PCR in tempo reale .........................................................................................................16
Interpretazione dei risultati con il termociclatore Cepheid SmartCycler II Dx .................................16
Controllo di qualità ...............................................................................................................................16
Limitazioni .............................................................................................................................................17
Prestazioni cliniche ...............................................................................................................................17
Prestazioni analitiche ............................................................................................................................21
Livello di rilevamento ........................................................................................................................21
Reattività analitica (Inclusività) .........................................................................................................21
Specificità analitica (Reattività crociata e interferenza microbica) ..................................................22
Specificità analitica – Sostanze interferenti ......................................................................................24
Studio sulla riproducibilità ................................................................................................................24
Carry-over e contaminazione crociata ..............................................................................................25
Servizio clienti e assistenza tecnica ......................................................................................................25
Pagina 2 di 28
Proprietà intellettuale...........................................................................................................................26
Marchi di fabbrica .............................................................................................................................26
Brevetti..............................................................................................................................................26
Glossario ...............................................................................................................................................27
Pagina 3 di 28
Uso previsto
Il Dosaggio Quidel® Molecular Direct C. difficile è un test diagnostico qualitativo, multiplessato in vitro per il
rilevamento diretto delle sequenze genetiche della tossina A (tcdA) o della tossina B (tcdB) di ceppi tossigenici
di Clostridium difficile da campioni fecali non ancora formati (liquidi o molli) prelevati da pazienti nei quali si
sospetta una diarrea associata a Clostridium difficile (CDAD).
Il Dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile è un test PCR in tempo reale e utilizza una preparazione
proprietaria dei campioni con primer e sonde etichettati in modo fluorescente. Il dosaggio può essere eseguito
utilizzando lo strumento Life Technologies QuantStudio® Dx; lo strumento Applied Biosystems 7500 Fast Dx
oppure lo strumento Cepheid SmartCycler II, per il rilevamento delle sequenze genetiche della tossina
associate a ceppi di C. difficile che producono tossine.
Il dosaggio è previsto per essere eseguito direttamente su campioni fecali in cui si sospetta una CDAD ed è
indicato per essere utilizzato come ausilio nella diagnosi di CDAD.
Riassunto e spiegazione
Il C. difficile è un’importante causa di diarrea e colite associate ad antibiotici: fino al 25% di tutti i casi può
1
essere ricondotto a tale batterio. Si ritiene che l’esposizione ad antibiotici alteri la flora intestinale,
permettendo una colonizzazione opportunistica da parte del C. difficile, presente fino al 3% degli adulti sani
nella flora dell’apparato digerente. Si ritiene che la virulenza del C. difficile sia mediata dalla produzione di due
tossine: la tossina A e la tossina B. I geni di entrambe le tossine (rispettivamente tcdA e tcdB) si trovano
all'interno di un locus di patogenicità (PaLoc) di 19,6 Kb insieme ad altri 3 geni. La patogenicità non richiede
che siano presenti sia le proteine della tossina A che quelle della tossina B. Recentemente, l’incidenza e la
2
gravità delle patologie associate al C. difficile e causa di brevi ricoveri ospedalieri sono aumentate.
Principio della procedura
Il dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile tossine rileva gli acidi nucleici che sono stati preparati da un
campione del paziente usando una preparazione proprietaria dei campioni. Viene eseguita una reazione PCR in
tempo reale multipla in condizioni ottimizzate in un pozzetto singolo, generando ampliconi per ciascuno dei
target presenti nel campione. L’identificazione avviene usando primer oligonucleotidici e sonde
complementari rispetto alle regioni conservate dei geni tcdA e tcdB del locus di patogenicità.
Etichette per sonde Quidel Molecular
Target
Tossina A
Tossina B
Controllo di processo (PRC)
Colorante
Quasar® 670
Di seguito viene riepilogata la procedura.
1. Raccolta dei campioni: immergere un tampone floccato neonatale nel campione fecale liquido o
molle usando tecniche standard; il campione proviene da pazienti pediatrici e adulti nei quali si
sospetta una diarrea associata a Clostridium difficile (CDAD).
Nota: rimuovere il muco dal campione di materiale fecale prima dell’analisi. Un errato
campionamento del materiale fecale per muco in eccesso può causare risultati falsi negativi. I
campioni che contengono un'eccessiva quantità di muco non devono essere sottoposti a test.
2. Preparazione dei campioni: fare girare il tampone floccato neonatale nel primo process buffer, quindi
aggiungere 30 µL del campione diluito alla provetta del secondo process buffer, che contiene il
controllo di processo (PRC).
3. Reidratazione del master mix: reidratare il master mix liofilizzato usando la soluzione reidratante. Il
master mix contiene primer oligonucleotidici, sonde etichettate con fluorocromo e quencher che
hanno come target le regioni conservate di tcdA e tcdB, nonché la sequenza PCR.
4. Amplificazione e rilevamento degli acidi nucleici: aggiungere 15 µL di master mix reidratato a
ciascuna provetta di reazione o pozzetto della piastra. Aggiungere poi 5 µL di campione preparato (ad
es., campione con PRC) al pozzetto della piastra o alla provetta di reazione adeguatamente
etichettata. Posizionare la piastra o la provetta nello strumento Applied Biosystems® 7500 Fast Dx ®,
nello strumento Life Technologies QuantStudio™ DX per la reazione PCR in tempo reale o nello
strumento Cepheid® SmartCycler® II.
Pagina 4 di 28
Una volta che la provetta di reazione o la piastra è stata aggiunta allo strumento adeguato, viene
avviato il protocollo del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Questo dosaggio si basa sui
sistemi di analisi chimica Taqman® e utilizza un enzima con DNA polimerasi e attività esonucleasiche
5’-3’. Durante l’amplificazione del DNA, questo enzima divide la sonda legata alla sequenza di DNA
complementare, separando il colorante quencher dal colorante reporter. Questa fase genera un
aumento del segnale fluorescente in risposta all’eccitazione da parte di una fonte luminosa con
opportuna lunghezza d’onda. Con ogni ciclo, altre molecole di colorante vengono separate dai loro
quencher, portando a un aumento del segnale fluorescente. Se si ottiene una fluorescenza sufficiente,
il campione viene refertato come positivo all’acido nucleico rilevato.
Materiali forniti
Codice di inventario M105
Kit per dosaggio (96 reazioni) – Conservare a una temperatura compresa fra 2 °C e 8 °C
#


Componente
Quantità
Soluzione reidratante Parte M5003
1 flacone/kit da 1,9 mL
Master mix Quidel Molecular C. difficile Parte M5043
12 flaconi/kit,
8 reazioni/flacone
Codice di inventario M207
Kit rapido di preparazione dei campioni fecali per DNA (96 campioni) – Conservare a una temperatura
compresa fra 2 °C e 25 °C
#


Componente
Quantità
Process buffer 1 Parte M5032
96 provette/kit; 500 mL
Process buffer 2 Parte M5033
Contiene controllo di processo
96 provette/kit; 570 µL
Tamponi floccati neonatali, parte M5034
96 tamponi
Materiale facoltativo
Controlli esterni per il C. difficile tossigenico (ad es. set di controllo Quidel Molecular C. difficile codice
M108; questi controlli possono servire come controlli esterni per l'elaborazione e l'amplificazione del
PRC).
Materiali necessari ma non forniti
Micropipettatori (intervallo da 1 a 10 μL oppure da 2 a 20 μL e da 100 a 1.000 μL)
Punte non aerosol per pipette
Strumento PCR in tempo reale Applied Biosystems 7500 Fast Dx o Life Technologies QuantStudio Dx.
Piastra PCR a 96 pozzetti
Pellicole ottiche per piastra Applied Biosystems
Centrifuga per piastra a 96 pozzetti serie 7500
Oppure
Micropipettatori (da 1 a 10 μL e da 100 a 1.000 μL)
Punte non aerosol per pipette
Strumento SmartCycler II
Materiali di consumo SmartCycler
Centrifuga SmartCycler
Avvertenze e precauzioni
Per uso diagnostico in vitro
Le caratteristiche di rendimento di questo test sono state stabilite solo con i tipi di campioni elencati nella
sezione Uso previsto. Il rendimento di questo dosaggio con altri tipi di campioni non è stato valutato.
Pagina 5 di 28
L’utilizzo di condizioni di ciclaggio diverse da quelle indicate nella sezione Istruzioni per la
programmazione del termociclatore può produrre risultati erronei.
L’utilizzo di questo prodotto deve essere limitato a personale competente nelle tecniche di PCR.
Considerare tutti i campioni come potenzialmente infettivi. Rispettare le precauzioni universali nel
maneggiare i campioni, questo kit e il suo contenuto.
Raccolta, conservazione e trasporto adeguati dei campioni sono elementi essenziali per ottenere risultati
corretti.
Conservare i reagenti del dosaggio come indicato sulle rispettive etichette.
Indossare indumenti protettivi, guanti e dispositivi di protezione degli occhi e del viso adeguati quando si
usa questo kit.
Per ottenere risultati accurati, pipettare con cura utilizzando solo apparecchiature calibrate.
Pulire a fondo e disinfettare tutte le superfici con una soluzione di candeggina al 10% seguita da acqua
ultrapura per applicazioni in biologia molecolare.
Utilizzare micropipette con barriera aerosol o punte a erogazione positiva in tutte le procedure.
Evitare la contaminazione microbica e crociata dei reagenti del kit. Seguire le buone pratiche di
laboratorio.
Non mescolare reagenti provenienti da kit con numeri di lotto diversi.
Non utilizzare/sostituire reagenti di altri produttori con questo kit.
Non utilizzare questo prodotto oltre la data di scadenza.
Una pianificazione accurata del flusso di lavoro è essenziale per ridurre al minimo il rischio di
contaminazione. Pianificare sempre il flusso di lavoro in maniera unidirezionale, partendo dalla preamplificazione e procedendo con l’amplificazione e il rilevamento.
Utilizzare forniture e apparecchiature specifiche per le aree di pre-amplificazione e amplificazione.
Impedire il movimento incrociato di personale o apparecchiature fra aree diverse.
Mantenere sempre separati gli articoli per l’amplificazione da quelli per la pre-amplificazione.
Non aprire le provette dei campioni né dissigillare le piastre dopo l’amplificazione.
Smaltire il materiale amplificato con cura e nel rispetto delle norme locali vigenti in proposito, al fine di
ridurre al minimo il rischio di contaminazione degli ampliconi.
Non utilizzare articoli, materiali o pipettatori dedicati per la preparazione dei reagenti o dei campioni per
l'elaborazione di prodotti amplificati.
Le schede tecniche MSDS sono disponibili su richiesta, oppure sul sito web del prodotto.
Non vorticare il process buffer 1 poiché ciò potrebbe causare un’eccessiva produzione di schiuma, che a
sua volta potrebbe far aumentare la probabilità di contaminazione crociata del campione.
Conservazione e manipolazione dei reagenti del kit
Conservare il kit per dosaggio non aperto a 2–8 °C e il kit rapido di preparazione dei campioni fecali per
DNA a 2–25 °C fino alla data di scadenza riportata sulla scatola esterna.
Il master mix reidratato deve essere utilizzato entro 60 minuti. In caso di conservazione per un periodo
maggiore, richiudere il master mix reidratato, sigillare con parafilm e conservare in posizione verticale a
≤–20 °C per non oltre 3 giorni. Proteggere il master mix dalla luce durante la conservazione.
Indicazioni di instabilità o deterioramento dei reagenti
Soluzione reidratante: la torbidezza della soluzione reidratante può indicare il deterioramento del
reagente. Contattare l’assistenza tecnica Quidel per richiederne la sostituzione.
Process Buffer 1: dopo essere stato conservato in frigorifero, il process buffer 1 potrebbe avere del
precipitato bianco sul fondo del flacone. Ciò non è indice di instabilità o di deterioramento. Lasciare
equilibrare il process buffer 1 a temperatura ambiente dopo averlo prelevato dal luogo di conservazione
freddo. Non usare il process buffer finché il precipitato non si è dissolto. Si suggerisce una conservazione
da 20 °C a 25 °C.
Prelievo, conservazione e manipolazione dei campioni
I campioni fecali freschi, singoli o multipli, vengono raccolti in un contenitore pulito. I campioni su tampone
non sono adeguati poiché sono troppo piccoli e suscettibili alle variazioni della temperatura di conservazione.
Non usare campioni raccolti dopo un clistere al bario o un altro trattamento. I campioni devono essere
trasportati in contenitori di plastica perfettamente sigillati e privi di perdite. Se i campioni verranno elaborati
entro 3 o 4 ore, è ammissibile il trasporto a temperatura ambiente. I campioni che vengono inviati più tardi al
laboratorio devono essere prontamente raffreddati e conservati a una temperatura di 2–8 °C o a -20 °C per un
massimo di 7 giorni. Se il trasporto avviene su lunghe distanze, spedire i campioni in ghiaccio. Gli specifici
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requisiti per la spedizione dei campioni devono rispettare le indicazioni contenute nelle sezioni 42 e 49 del
Code of Federal Regulation, CFR.
Conservazione dei campioni elaborati
I campioni diluiti nel process buffer 1 e nel process buffer 2 possono essere conservati a temperatura
ambiente (20 –25 C) al massimo per 7 giorni. I campioni nel process buffer 2 non devono essere refrigerati
né congelati.
Programmazione iniziale del termociclatore
Istruzioni per la programmazione di 7500 Fast DX
1.
2.
Lanciare il pacchetto software 7500 Fast Dx. Se l’unità SDS non è alimentata, si apre una finestra di
avvertenza. Selezionare il tasto Annulla.
Si aprirà la finestra di dialogo Avvio rapido documento. Selezionare il tasto Crea nuovo documento
per avviare Creazione automatica nuovo documento. Seguire tutte le fasi per avviare il protocollo
Quidel Molecular Direct C. difficile.
a. Definizione del documento: la maggior parte di quanto segue dovrebbe essere
l’impostazione predefinita. Se non è così, cambiare di conseguenza.
i. Confermare o immettere le seguenti informazioni.
Dosaggio: Curva standard (Quantificazione assoluta)
Contenitore: Trasparente, a 96 pozzetti
Modello: Documento vuoto
Run Mode
Fast 7500
(Modalità ciclo):
Operatore: Nome dell’operatore
Commenti: SDS v1.4
Nome della
Quidel Molecular Direct C difficile
piastra:
b.
c.
d.
ii. Selezionare il tasto Avanti.
Selezione dei rilevatori: occorre aggiungere nuovi rilevatori per il C. difficile e il controllo di
processo (PRC). Per ciascun target, selezionare il tasto Nuovo rilevatore per aprire la
finestra Nuovo rilevatore. In alternativa si può usare il pulsante Crea un altro dalla finestra
Nuovo rilevatore per l’ultimo rilevatore.
i. Immettere le seguenti informazioni per ciascun rilevatore.
Colorante
Colorante
Colore
Nome
reporter
quencher
C. difficile
JOE
(nessuno)
(selezionare)
PRC
CY5
(nessuno)
(selezionare)
ii. Selezionare un colore univoco per rappresentare ciascun rilevatore.
iii. Evidenziare i nuovi rilevatori e aggiungere alla colonna Rilevatori nel documento
usando il tasto Aggiungi.
iv. Selezionare (nessuno) dal menu a discesa Riferimento passivo.
v. Selezionare il tasto Avanti.
vi. Selezionare il tasto Fine senza impostare alcun pozzetto.
La creazione automatica si chiuderà e il software si avvierà con la scheda Impostazione,
che mostra la piastra dei campioni impostata durante l’avviamento rapido. Per
l’impostazione iniziale, non occorre fare cambiamenti in questo momento.
Definizione del protocollo del termociclatore: selezionare la scheda Strumento per
impostare i tempi e le temperature della PCR per Quidel Molecular C. difficile. Sotto Profilo
termico dovrebbe essere presente un protocollo predefinito in 2 fasi. Ciascuna fase ha 3
caselle di testo modificabili dall’utente. Il valore della prima casella in alto rappresenta il
numero di ripetizioni o cicli per quella fase. Il valore della seconda casella rappresenta la
temperatura (˚C) e il valore dell’ultima casella rappresenta il tempo (minuti: secondi).
i. Apportare le seguenti modifiche al Protocollo termociclatore predefinito.
1. Fase 1
a. Ripetizioni:
1
b. Temp:
92
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c.
2.
3.
4.
Tempo:
2:00
Fase 2 (fase di amplificazione in 3 passaggi)
a. Ripetizioni: 15
b. Passaggio 1
i. Temp: 92
ii. Tempo: 0:05
c. Passaggio 2
i. Temp: 57
ii. Tempo: 0:05
Nota: selezionare la barra alla destra della Fase 2. Selezionare il tasto
Aggiungi passaggio per aggiungere un altro passaggio.
d. Passaggio 3
i. Temp: 68
ii. Tempo: 0:25
Selezionare la barra alla destra della Fase 2. Selezionare il tasto Aggiungi
ciclo per aggiungere un’altra fase.
Fase 3 (fase di amplificazione in 3 passaggi)
a. Ripetizioni: 35
b. Passaggio 1
i. Temp: 92
ii. Tempo: 0:05
c. Passaggio 2
i. Temp: 57
ii. Tempo: 0:05
Pagina 8 di 28
d.
5.
Passaggio 3
i. Temp: 68
ii. Tempo: 0:25
Se si aggiunge una fase errata, la si può rimuovere premendo il tasto
Elimina dopo averla evidenziata fra le righe verticali.
ii. Sotto Impostazioni, immettere quanto segue:
Volume campione (μL): 20 (predefinito)
Run Mode (Modalità ciclo):
Raccolta dati:
7500 Fast (predefinita)
Fase 3, Passaggio 3 (68,0 @ 0:25)
NOTA: non spuntare la casella accanto a "Modalità esperta".
iii. Protocollo finale
e.
Impostare la soglia per ciascun analita
i. Selezionare la scheda Risultati.
ii. Selezionare la scheda Tracciato amplificazione.
iii. Selezionare C. difficile dalla scheda Rilevatore nell’angolo in alto a destra
iv. Nel blocco Impostazioni analisi, impostare Soglia su 4.0e4
Pagina 9 di 28
v. Selezionare Linea base automatica
vi. Ripetere i passaggi iii-v per PRC, impostando il valore di Soglia su 3.0e4
f.
g.
Salvare il nuovo protocollo come modello per uso futuro.
i. Nella parte superiore della schermata, selezionare File e poi Salva con nome.
ii. Salvare in: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nome file: "Quidel Molecular C. difficile"
iv. Salvare come: "SDS Templates (*.sdt)"
Uscire dal software.
Istruzioni per la programmazione dello strumento QuantStudio DX per la reazione PCR in
tempo reale
Quidel Molecular fornisce un modello predefinito per il dosaggio su un CD che deve essere caricato nello
strumento QuantStudio™ Dx. Per richiedere il CD, contattare un rappresentante Quidel al numero (800) 8741517 (gratuito negli Stati Uniti), oppure al numero +1 (858) 552-1100, dal lunedì al venerdì, dalle 8:00 alle
17:00, ora della costa orientale. Questi modelli contengono i parametri del ciclo, in modo che non sia
necessario programmare lo strumento per iniziare le operazioni. Per installare un documento di definizione del
test, procedere come segue.
1. Dalla scheda Home del software QuantStudio™ Dx, fare clic su Gestisci test nel pannello Strumenti.
2. Nel menu Test, fare clic su Installa.
3. Cercare il file del documento di definizione del test (.tdd), selezionare il file e fare clic su Apri. Il
software QuantStudio™ Dx aggiunge automaticamente il test selezionato al menu Test.
4. Fare clic su Chiudi per chiudere il menu Test e salvare le modifiche.
Istruzioni per la programmazione di SmartCycler II
1.
2.
Lanciare il pacchetto software SmartCycler II Dx versione 3.0b.
Creare il dosaggio Quidel Molecular C. difficile.
a. Selezionare il tasto Definisci dosaggi nella parte superiore dello schermo.
b. Assegnare un nome al dosaggio:
i. selezionare il tasto Nuovo in basso a sinistra dello schermo;
ii. digitare ’Quidel Molecular C. difficile’ e selezionare OK;
iii. ‘Quidel Molecular C. difficile’ sarà aggiunto nella parte superiore dell’elenco Nome
dosaggio, nell’angolo in alto a sinistra dello schermo.
c. Impostare i valori dell’analisi: nella sezione Tipo dosaggio: Ricerca, selezionare la scheda
Impostazioni analisi e verificare che sia effettuato quanto segue.
i. Selezionare FATA25 dal menu a discesa Imposta colorante.
ii. Il menu a discesa Tipo analisi deve essere impostato su Qualitativo (impostazione
predefinita).
iii. Nella colonna Nome canale, immettere ‘C. difficile’ per Canale 2 e ‘PRC’ per Canale 4.
iv. Nella colonna Uso, selezionare Non utilizzato dal menu a discesa per i Canali 1 e 3, Target
per C. difficile e Controllo interno per PRC. Se si seleziona Controllo interno appare la
finestra mostrata qui sotto. Selezionare Sì.
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v. Nella colonna Analisi della curva, immettere Curva principale per ciascun canale (C.
difficile, PRC) (impostazione predefinita).
vi. Nella colonna Impostazione soglia, immettere Soglia manuale per ciascun canale (C.
difficile, PRC) (impostazione predefinita).
vii. Nella colonna Unità soglia flour manuale, immettere le seguenti soglie:
b. PRC: 10,0
viii. Nella colonna Ciclo min valido (scorrere verso destra se non è immediatamente visibile),
immettere 5 per ciascun canale (C. difficile, PRC).
ix. Nella colonna Ciclo max valido (scorrere verso destra se non è immediatamente visibile),
immettere 35 per ciascun canale (C. difficile, PRC).
x. Nella colonna Sub sfondo, usare "ON" per ciascun canale (C. difficile, PRC) (impostazione
predefinita).
xi. Nella colonna Ciclo min sfondo, immettere 5 per ciascun canale (C. difficile, PRC).
xii. Nella colonna Ciclo max sfondo, immettere 20 per ciascun canale (C. difficile, PRC).
xiii. Nella colonna Cicli medi boxcar, mantenere 0 per ciascun canale (C. difficile, PRC)
(impostazione predefinita).
xiv. Nella colonna Soglia PT finale, immettere 20 per il canale C. difficile e 10 per il canale PRC.
xv. Nella colonna NC IC%, mantenere "NA" per il canale (PRC) (impostazione predefinita).
xvi. Nella colonna Delta IC, mantenere "NA" per ciascun canale (C. difficile, PRC) (impostazione
predefinita).
xvii. Nella sezione Personalizza testo risultati, sotto la tabella, selezionare Testo risultati
basato sugli organismi dal menu a discesa. Apparirà la finestra di avvertenza mostrata qui
sotto. Selezionare Sì.
d.
xviii. Selezionare il tasto Personalizza per aprire la finestra di dialogo Testo risultati basato sugli
organismi. Selezionare il pulsante Aggiungi, immettere ’C. difficile’ nella colonna Nome
organismo e spuntare la casella C. difficile. Fare clic su OK; in fondo alla finestra.
Impostare i tempi di ciclo RT-PCR e le temperature nel seguente modo.
i. Fase 1
1. Mantenimento
2. Temp:
92,0
3. Sec:
120
4. Elementi ottici:
OFF
ii. Fase 2
1. Ciclo a 3 temperature
2. Ripetizioni:
15
3. Fila prima temperatura:
a. Temp:
92,0
b. Sec:
5
c. Elementi ottici:
OFF
4. Fila seconda temperatura:
a. Temp:
57,0
b. Sec:
5
c. Elementi ottici:
OFF
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5.
Fila terza temperatura:
a. Temp:
b. Sec:
c. Elementi ottici:
66
25
OFF
iii. Fase 3
1.
2.
3.
3.
Ciclo a 3 temperature
Ripetizioni: 35
Fila prima temperatura:
a. Temp:
92
b. Sec:
5
c. Elementi ottici:
OFF
4. Fila seconda temperatura:
a. Temp:
57
b. Sec:
5
c. Elementi ottici:
OFF
5. Fila terza temperatura:
a. Temp:
66
b. Sec:
25
c. Elementi ottici:
ON
Salvare il protocollo selezionando il tasto Salva in fondo alla schermata.
Procedura del dosaggio
Eseguire le seguenti procedure alla temperatura ambiente controllata di 20–25 °C.
Procedura di elaborazione dei campioni
Prima di analizzare il campione, rimuovere e gettare il muco usando un tampone o una pipetta di
trasferimento. Nel dosaggio si deve usare solo materiale fecale. Nota: rimuovere il muco dal campione di
materiale fecale prima dell’analisi. Un errato campionamento del materiale fecale per muco in eccesso può
causare risultati falsi negativi. I campioni che contengono un'eccessiva quantità di muco non devono essere
sottoposti a test.
1. Per raccogliere il campione da un campione liquido, inserire completamente la testa del tampone nel
campione fecale. Toccare con il tampone il lato interno della provetta per rimuovere il liquido in
eccesso. Per raccogliere il campione da un campione semi-solido, inserire completamente la testa del
tampone nel campione fecale in almeno quattro punti. Ruotare il tampone all’interno della provetta
del campione per rimuovere le feci in eccesso, in modo che la forma della testa del tampone sia
chiaramente visibile. Per quanto riguarda il controllo positivo liquido opzionale, trattarlo come un
campione liquido e raccoglierlo usando il tampone fornito.
2. Immergere il tampone neonatale nel process buffer 1 e farlo girare per 4 o 5 secondi per rimuovere le
feci dal tampone e mescolare.
3. Pipettare 30 µL dal process buffer 1 nel process buffer 2. Pipettare su e giù 4 o 5 volte con una pipetta
calibrata impostata a 570 µL.
Nota: i campioni diluiti nel process buffer 1 e nel process buffer 2 possono essere conservati a
temperatura ambiente (20 –25 C) al massimo per 7 giorni.
ATTENZIONE: i campioni nei process buffer 1 e 2 non devono essere refrigerati né congelati.
Procedura di reidratazione del master mix
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Stabilire il numero di campioni da testare e ottenere il numero corretto di flaconi di master mix
liofilizzato per otto test.
Riportare gli agenti inutilizzati alle condizioni di conservazione appropriate.
Aprire con cura il master mix, evitando di rovinare i pellet.
Aggiungere 135 µL di soluzione reidratante al master mix.
Lasciare il flacone a temperatura ambiente per 1 o 2 minuti per consentire la reidratazione dei pellet.
Pipettare delicatamente su e giù per 2 o 3 volte, evitando la formazione di bolle, prima di dispensare
nel primo pozzetto della piastra.
Nota: il Master Mix reidratato è sufficiente per otto reazioni.
Nota: il Master Mix reidratato deve essere utilizzato entro 60 minuti. In caso di conservazione per un
periodo maggiore, richiudere il master mix reidratato, sigillare con parafilm e conservare in posizione
verticale a ≤–20 °C per non oltre 3 giorni. Proteggere il master mix dalla luce durante la
conservazione.
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Procedura di approntamento PCR
1.
2.
3.
4.
5.
Aggiungere 15 µL di master mix reidratato a ciascuna provetta di reazione o pozzetto della piastra.
Aggiungere 5 µL di campione al process buffer 2 nelle provette di reazione o nei pozzetti della piastra.
Non è necessario mescolare i reagenti.
Nota: per ciascun campione estratto, usare un micropipettatore con una punta non aerosol nuova.
Chiudere le provette di reazione o sigillare la piastra.
Nota: Quidel suggerisce che ogni ciclo del termociclatore includa un pozzetto con Controlli esterni (ad
es., il set di controllo Quidel Molecular C. difficile M108). Eseguire i controlli secondo le prassi e le
procedure del proprio laboratorio.
Centrifugare le provette di reazione o la piastra per un minimo di 15 secondi. Assicurarsi che tutto il
liquido si trovi sul fondo del pozzetto della piastra o della provetta.
Inserire le provette o la piastra nel termociclatore.
Protocollo di amplificazione sul termociclatore 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
5.
Accendere il 7500 Fast Dx.
Lanciare il pacchetto software 7500 Fast Dx.
Si aprirà la finestra di dialogo Avvio rapido documento.
Fare clic su Crea un nuovo documento.
La maggior parte di quanto segue dovrebbe essere l’impostazione predefinita. Se non è così, cambiare
di conseguenza.
Dosaggio:
Contenitore:
Modello:
Run Mode (Modalità ciclo):
7.
8.
Trasparente, a 96 pozzetti
Fast 7500
Operatore:
Nome dell’operatore
Commenti:
SDS v1.4 (aggiungerne altri se necessario)
Nome della piastra:
6.
Curva standard (Quantificazione assoluta)
AAMMGG-Quidel Molecular C. difficile
Impostazione della piastra dei campioni
a. Sotto le schede Impostazione e Piastra apparirà l’impostazione della piastra.
b. Selezionare tutti i pozzetti che conterranno il campione, fare clic con il tasto destro del mouse e
selezionare Ispettore pozzetto dal menu a discesa. Quando si apre la finestra popup Ispettore
pozzetto, selezionare i rilevatori di C. difficile e PRC.
c. Usare Ispettore pozzetto per inserire i nomi dei campioni. Gli ID paziente possono essere inseriti
nella finestra Ispettore pozzetto; si consiglia però di farlo prima di procedere con la risospensione del master mix liofilizzato, dopo il ciclo o utilizzando la funzione di importazione per
ridurre al minimo il tempo durante il quale le reazioni PCR vengono tenute a temperatura
ambiente prima di iniziare il ciclo.
d. Salvare il ciclo con un identificatore univoco come file “.sds” (ad es., GGMMAA-IDciclo-Quidel
Molecular C difficile.sds).
e. Si aprirà una finestra che chiede "Motivo della modifica della voce". Inserire "Impostazione" e
altri eventuali commenti attinenti al ciclo.
Avvio della PCR
a. Selezionare la scheda Strumento.
b. Inserire la piastra PCR a 96 pozzetti nella macchina.
c. Sotto Controllo strumento, selezionare il tasto Avvio per avviare il ciclo.
Dopo la PCR
a. IMPORTANTE: al termine del ciclo, premere OK. Analizzare i dati premendo il tasto "Analizza" nel
menu superiore, poi salvare il file.
b. Salvare il file premendo Salva documento nella barra degli strumenti. Si aprirà una finestra che
chiede "Motivo della modifica della voce". Inserire "Analisi dati post ciclo" e altri eventuali
commenti attinenti al ciclo.
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Protocollo di amplificazione sullo strumento QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo
reale
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Accendere il QuantStudio Dx.
Scegliere la modalità IVD sullo strumento.
Lanciare il pacchetto software QuantStudio Dx IVD.
Quando viene richiesto, inserire nome utente e password del sistema.
Si aprirà la finestra Schermata principale.
Nella casella Impostazioni, evidenziare il nome del test "Quidel Molecular Direct C. difficile" caricato
precedentemente.
Fare clic sul tasto Impostazioni per avviare un ciclo.
Verrà visualizzata la schermata Impostazioni, Proprietà del test. Inserire i dati relativi al ciclo.
a. Inserire Nome esperimento (per impostazione predefinita, il ciclo viene avviato con un indicatore
data e ora).
b. Immettere i dati del codice a barre piastra.
c. Registrare i numeri di lotto del materiale sotto Dati del reagente.
d. Salvare il ciclo con un identificatore univoco come file “.sds” file (ad es., GGMMAA-IDciclo-Quidel
Molecular C difficile.sds)
e. Si aprirà una finestra che chiede "Motivo della modifica della voce". Inserire "Impostazione" e
altri eventuali commenti attinenti al ciclo.
Nella barra del menu di sinistra, selezionare Definisci.
Modificare i dati dei campioni.
a. Immettere i dati dei campioni specifici di ciascun pozzetto, cancellando l’elemento identificativo
predefinito (Paziente 1, Paziente 2, ecc.) e inserendo i nuovi dati, OPPURE
b. selezionare Importa da file nella parte superiore dello schermo per caricare una mappa
predefinita della piastra da un file di testo (delimitato da tabulazioni).
Nella barra del menu di sinistra, selezionare Assegna per verificare le corrette impostazioni della
piastra.
Caricamento della piastra dei campioni.
a. Espellere il vassoio strumenti.
b. Inserire la piastra PCR a 96 pozzetti nella macchina con il pozzetto A1 posizionato nell’angolo in
alto a sinistra.
c. Retrarre il vassoio strumenti.
Avviare il ciclo.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Ciclo.
b. Fare clic sul tasto verde Esegui ciclo nella parte superiore dello schermo.
i. Se richiesto, selezionare il numero di serie specifico dello strumento in uso.
Una volta completato il ciclo, nella barra del menu di sinistra, selezionare Analisi.
a. Salvare il file premendo Salva nella barra degli strumenti. Si aprirà una finestra che chiede
"Motivo della modifica della voce". Inserire "Analisi dati post ciclo" e altri eventuali commenti
attinenti al ciclo.
b. Per impostazione predefinita, viene visualizzata la finestra Tracciato amplificazione. Per
visualizzare altri tipi di tracciato, selezionarli dalla barra del menu a sinistra.
c. Per visualizzare i dati sul ciclo con i valori Ct, selezionare la scheda Tabella pozzetti sulla destra
dello schermo.
Stampa di un rapporto.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Stampa rapporto. Personalizzare i contenuti del
rapporto selezionando o deselezionando i riquadri nella finestra.
b. Selezionare il tasto Stampa rapporto in fondo allo schermo.
Esportazione dei file di dati.
a. Nella barra del menu di sinistra, selezionare Esporta.
b. Inserire la Posizione del file di esportazione OPPURE fare clic su Sfoglia per individuare il
percorso desiderato.
c. Per impostazione predefinita, il campo Nome file di esportazione sarà compilato con il nome del
ciclo salvato.
d. Come tipo di file, selezionare Excel.
e. Personalizzare il rapporto dei dati esportati scorrendo le schede e selezionando o deselezionando
le opzioni.
f. Selezionare il tasto Avvia esportazione nella parte inferiore dello schermo.
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Protocollo di amplificazione su SmartCycler II
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Attivare il blocco (o i blocchi) SmartCycler.
Lanciare il pacchetto software SmartCycler Dx versione 3.0b.
Selezionare il tasto Crea ciclo in alto nella schermata per impostare il ciclo.
Sotto Nome del ciclo, immettere un identificatore univoco per il ciclo corrente (es., GGMMAA-ID
ciclo_Quidel Molecular C. difficile).
Sotto Note, inserire eventuali note sul ciclo per riferimento futuro.
Sotto Dosaggio, selezionare il dosaggio ’Quidel Molecular C. difficile’ dal menu a discesa.
Sotto Dati del dosaggio, digitare il numero di lotto e la data di scadenza del kit.
Per selezionare i pozzetti da usare, procedere in uno dei modi seguenti.
a. Per assegnare automaticamente i pozzetti, procedere nel modo seguente.
i. Sotto Numero di campioni, digitare il numero di campioni nella casella di testo fornita.
ii. Selezionare il tasto Applica. Il numero di file immesse compare nella Tabella del sito.
b. Per scegliere manualmente i pozzetti sui blocchi SmartCycler, procedere nel modo seguente.
i. Selezionare il tasto Aggiungi/Rimuovi siti, verso la parte bassa dello schermo.
ii. Si aprirà la finestra popup Seleziona siti, con due colonne. La colonna a sinistra (Siti) elenca
tutti i siti disponibili, mentre quella di destra (Selezioni) mostra tutti i siti selezionati.
iii. Per selezionare tutti i siti, fare clic sul tasto Seleziona tutti i siti.
iv. Per selezionare siti specifici, evidenziarne uno o più e selezionare la freccia destra per
aggiungerli alla colonna Selezioni.
v. Selezionare il tasto OK per chiudere la finestra. I siti selezionati appariranno nella Tabella del
sito.
Digitare gli identificatori dei campioni sotto la colonna ID campione della Tabella dei siti: questa
operazione può essere eseguita anche dopo l’inizio del ciclo.
Inserire eventuali note nella colonna Note e lasciare invariate le voci "SPEC" della colonna Tipo di
campione.
Selezionare il tasto Esegui ciclo in fondo allo schermo.
Selezionare la scheda Visualizza risultati al termine del ciclo.
Salvare il ciclo quando è terminato e prima di uscire dal software.
Selezionare la scheda Campione risultati.
Il software SmartCycler indicherà automaticamente se è stato rilevato C. difficile nei campioni, oppure
se il ciclo non è valido (non risolto).
Interpretazione dei risultati
Interpretazione dei risultati con il termociclatore 7500 Fast Dx
Interpretazione dei risultati del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile sul
termociclatore Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Rilevatore:
Risultato
Rilevatore:
controllo di
dosaggio
C. difficile
processo
Nessun valore Ct
Valore Ct
Negativo
Nessun DNA di C. difficile tossigenico rilevato
refertato
refertato
Positivo al
Valore Ct
N.A.*
Rilevato DNA di C. difficile tossigenico
C. difficile
refertato
Nessun rilevamento di DNA tossigenico del C.
difficile e di PRC; per risultati di test non validi,
ripetere prima il test dello stesso campione
Nessun valore Ct
Nessun valore Ct
Non valido
elaborato. Se il test non è valido ripetendo il test
refertato
refertato
con il campione elaborato, rielaborare un’altra
aliquota dello stesso campione, oppure prelevare e
testare un altro campione.
*Il controllo di processo non richiede alcun valore Ct per riferire un’indicazione positiva.
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Interpretazione dei risultati con lo strumento Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in
tempo reale
Strumento Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
Rilevatore:
Risultato
Rilevatore:
controllo di
dosaggio
C. difficile
processo
Nessun valore Ct
Valore Ct
Negativo
refertato
refertato
Positivo al
Valore Ct
N.A.*
C. difficile
refertato
Nessun rilevamento di DNA tossigenico del C.
difficile e di PRC; per risultati di test non validi,
ripetere prima il test dello stesso campione
Nessun valore Ct
Nessun valore Ct
Non valido
elaborato. Se il test non è valido ripetendo il test
refertato
refertato
con il campione elaborato, rielaborare un’altra
aliquota dello stesso campione, oppure prelevare e
testare un altro campione.
*Il controllo di processo non richiede alcun valore Ct per riferire un’indicazione positiva.
Interpretazione dei risultati con il termociclatore Cepheid SmartCycler II Dx
Risultato
dosaggio
Termociclatore Cepheid SmartCycler II Dx
Rilevatore:
Rilevatore:
controllo di
C. difficile
processo
Negativo al
C. difficile
NEG.
Superato
Positivo al
C. difficile
POS.
N.A.*
Nessun rilevamento di DNA tossigenico del C. difficile e
di PRC; per risultati di test non validi, ripetere prima il
C. difficile
test dello stesso campione elaborato. Se il test non è
NEG.
Non superato
irrisolto
valido ripetendo il test con il campione elaborato,
rielaborare un’altra aliquota dello stesso campione
oppure prelevare e testare un altro campione
*Il controllo di processo non richiede alcun risultato per riferire un'indicazione positiva.
Controllo di qualità
Il dosaggio Quidel Molecular C. difficile incorpora numerosi controlli per monitorare le prestazioni del
dosaggio.
1. Il controllo di processo deve essere usato durante l’elaborazione e l’amplificazione dei campioni nel
dosaggio. Tale controllo è pre-riempito nel process buffer 2.
2. I controlli positivi esterni per C. difficile disponibili in commercio possono essere trattati come campioni
del paziente e utilizzati conformemente agli standard del laboratorio. Al posto di controlli C. difficile
disponibili in commercio è possibile usare campioni precedentemente caratterizzati come positivi al C.
difficile .
3. Come controllo negativo esterno si può utilizzare un campione precedentemente caratterizzato come
negativo. Esso va trattato come un campione del paziente e conformemente agli attuali standard di
laboratorio.
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Limitazioni
Risultati negativi non escludono l'infezione da C. difficile tossigenico e non devono essere utilizzati come
sola base per una decisione di trattamento.
Come accade per altri dosaggi di questo tipo, esiste un rischio di risultati falsi negativi a causa della
presenza di varianti di sequenza nei target dell’amplificazione.
Il prelievo, la conservazione o il trasporto impropri possono causare risultati falsi negativi.
Gli inibitori presenti nel campione e/o gli errori nel seguire la procedura del dosaggio possono portare a
risultati falsi negativi.
Una raccolta impropria del campione (ad esempio, muco) può causare risultati falsi negativi.
Prestazioni cliniche
Le caratteristiche di rendimento del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile sono state valutate tramite
campioni raccolti in quattro diverse località geografiche negli Stati Uniti tra agosto e novembre 2012. In due
studi (uno per lo strumento ABI 7500 Fast Dx e Cepheid SmartCycler II (665 campioni) e un secondo studio per
lo strumento QuantStudio Dx (792 campioni)), il dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile è stato
confrontato con una coltura tossigenica di C. difficile diretta e arricchita. Le tabelle seguenti presentano i dati
estratti da questi studi.
Applied Biosystems 7500Fast Dx
Le caratteristiche di rendimento del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile sono state stabilite
attraverso uno studio prospettico svoltosi da agosto a novembre 2012. Seicentosessantacinque (665)
campioni utilizzati per questo studio sono stati raccolti da pazienti nei quali si sospetta una patologia
associata al Clostridium difficile (CDAD) in quattro aree geografiche distinte negli Stati Uniti. Questi
campioni sono stati testati con il dosaggio Quidel sullo strumento 7500 Fast Dx in una delle tre (3)
strutture.
Il test iniziale ha evidenziato nove (9) campioni (1,35%) non validi nel dosaggio Quidel Molecular Direct C.
difficile. Abbiamo tenuto conto dell'età e del sesso sulla base del risultato di test iniziale ottenuto per
ciascun campione. Pertanto, l'età dei pazienti e le informazioni sul sesso indicate di seguito si riferiscono ai
seicentocinquantasei (656) campioni restanti.
Siti combinati – Distribuzione per età e sesso
Sesso
Età
Sesso sconosciuto
Neonati
(<2 anni)
Bambini
(da ≥2 a <12 anni)
Adolescenti
(da ≥12 a <18 anni)
Tarda adolescenza (da
≥18 a ≤21 anni)
Adulti
(da >21 a 59 anni)
Adulti anziani
(> 60 anni)
Totale
Maschi
Femmine
3
Prevalenza per età di positivi al C. difficile
con il dosaggio Quidel Molecular Direct C.
difficile sullo strumento Applied
33,3% (1/3)
12,5% (1/8)
Totale
4
4
8
21
18
39
25,6% (10/39)
8
11
19
21,1% (4/19)
5
8
13
15,4% (2/13)
132
146
278
19,1% (53/278)
127
169
296
15,9% (47/296)
297
356
656
18,0% (118/656)
Confronto del dosaggio di citotossicità su coltura diretta
Seicentosessantacinque (665) campioni sono stati testati sia con il dosaggio Quidel Molecular Direct C.
difficile che con il dosaggio in coltura tissutale citotossica. Tre campioni (0,5%) sono risultati indeterminati
nel dosaggio per la citotossicità, a causa di una tossicità nel pozzetto antitossina. Il test iniziale ha
evidenziato nove campioni (1,35%) non validi nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Otto
campioni hanno generato un risultato valido dopo essere stati nuovamente testati conformemente alla
bozza del foglietto illustrativo del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile (7 sono risultati negativi, 1
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positivo). Un campione è rimasto non valido dopo aver ripetuto il test. Abbiamo tenuto conto delle
prestazioni cliniche sulla base del risultato di test iniziale ottenuto per ciascun campione. Pertanto, i dati
riportati di seguito si riferiscono ai seicentocinquantatré (653) campioni restanti.
Siti combinati – Età combinate
Coltura diretta
Dosaggio Quidel
POS.
Molecular Direct C.
POS.
83
difficile per la reazione NEG.
5**
PCR in tempo reale
Totale 88
sullo strumento ABI
7500
NEG.
33*
532
565
Totale
116
537
653
Sensibilità
Specificità
94,3%
94,2%
95% CI
87,4%
97,5%
91,9%
95,8%
*
Fra i trentatré (33) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con la coltura diretta) riportati, trentadue (32)
sono stati testati con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Tutti i trentadue campioni sono risultati positivi per il C.
difficile. I campioni restanti non erano disponibili per il test.
** Cinque (5) campioni discordanti (negativi con Quidel/positivi con la coltura tissutale citotossica) riportati sono stati testati con il
dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Tutti i cinque (5) campioni sono risultati negativi per il C. difficile.
Confronto su coltura tossigenica arricchita
difficile che con la coltura tossigenica arricchita. Il test iniziale ha evidenziato nove campioni (1,35%) non
validi nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Otto campioni hanno generato un risultato valido (7
negativi, 1 positivo) dopo essere stati nuovamente testati conformemente alla bozza del foglietto
illustrativo del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Un campione è rimasto non valido dopo aver
ripetuto il test. Abbiamo tenuto conto delle prestazioni cliniche sulla base del risultato di test iniziale
ottenuto per ciascun campione. Pertanto, i dati riportati di seguito si riferiscono ai seicentocinquantasei
(656) campioni restanti.
Coltura tossigenica migliorata
POS.
NEG.
Totale
Dosaggio Quidel
POS.
112
6*
118
Molecular Direct C.
difficile su
NEG.
14**
524
538
ABI 7500
Totale
126
530
656
Sensibilità
Specificità
88,9%
98,9%
95% CI
82,2%
93,3%
97,6%
99,5%
*
Sei (6) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con coltura diretta) riportati sono stati testati con un
dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Tutti questi campioni sono risultati positivi per il C. difficile.
** Dodici (12) campioni discordanti (negativi con Quidel Molecular/positivi con coltura tossigenica arricchita) riportati sono stati
testati con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Due (2) campioni sono risultati non disponibili per il test. Nove (9) di
questi campioni sono risultati negativi per il C. difficile e tre (3) sono risultati positivi.
Sistema di strumenti Life Technologies QuantStudio Dx per la reazione PCR in tempo reale
attraverso uno studio prospettico svoltosi da agosto a novembre 2012. Settecentonovantadue (792)
associata al Clostridium difficile (CDAD) in quattro (4) aree geografiche distinte negli Stati Uniti. Questi
campioni sono stati testati con il dosaggio Quidel sullo strumento QuantStudio Dx in una delle tre (3)
strutture. Il test iniziale ha evidenziato un campione (0,1%) non valido nel dosaggio Quidel Molecular
Direct C. difficile. Abbiamo tenuto conto dell'età e del sesso sulla base del risultato di test iniziale ottenuto
per ciascun campione. Pertanto, l'età dei pazienti e le informazioni sul sesso indicate di seguito si
riferiscono ai settecentonovantuno (791) campioni restanti.
Sesso
Età
Sesso sconosciuto
Neonati
(<2 anni)
Bambini
Maschi
Femmine
Totale
2
Prevalenza per età di positivi al C.
difficile con il dosaggio Quidel
Molecular Direct C. difficile sullo
strumento QuantStudio
50,0% (1/2)
5
5
10
10,0% (1/10)
28
21
49
24,5% (12/49)
Pagina 18 di 28
Età
Sesso
Totale
Prevalenza per età di positivi al C.
difficile con il dosaggio Quidel
Molecular Direct C. difficile sullo
strumento
QuantStudio
20,8%
(5/24)
(da ≥2 a <12 anni)
Adolescenti
10
14
24
(da ≥12 a <18 anni)
Tarda adolescenza
6
7
13 7,7% (1/13)
(da ≥18 a ≤21 anni)
Adulti
158
170
328 18,3% (60/328)
(da >21 a 59 anni)
Adulti anziani
163
202
365 17,8% (65/365)
(> 60 anni)
Totale
370
419
791 18,3% (145/791)
Confronto del dosaggio su coltura diretta
Settecentonovantadue campioni sono stati testati sia con il dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile
che con il dosaggio su coltura diretta. Tre (3) campioni (0,4%) sono risultati indeterminati nel dosaggio per
la citotossicità, a causa di una tossicità nel pozzetto antitossina. Il test iniziale ha evidenziato un campione
(0,1%) non valido nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. I campioni hanno generato un risultato
valido dopo essere stati nuovamente testati conformemente alla bozza del foglietto illustrativo del
dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile (risultato negativo). Abbiamo tenuto conto delle prestazioni
cliniche sulla base del risultato di test iniziale ottenuto per ciascun campione. Pertanto, i dati riportati di
seguito si riferiscono ai settecentottantotto (788) campioni restanti.
Coltura tissutale citotossica
POS.
NEG.
Dosaggio Quidel
POS.
98
45*
Molecular Direct C.
difficile su
NEG.
7**
638
LTI QuantStudio
Totale
105
683
Totale
143
645
788
Sensibilità
Specificità
93,3%
93,4%
95% CI
86,9%
96,7%
91,3%
95,0%
*
Fra i quarantacinque (45) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con la coltura diretta) riportati,
quarantaquattro (44) sono stati testati con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Trentacinque (35) di questi campioni
sono risultati positivi per il C. difficile e nove (9) sono risultati negativi. I campioni restanti non erano disponibili per il test.
** Sette (7) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con la coltura diretta) riportati sono stati testati con un
dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Due (2) di questi campioni sono risultati positivi per il C. difficile e cinque (5) sono
risultati negativi.
Settecentonovantadue (792) campioni sono stati testati sia con il dosaggio Quidel Molecular Direct C.
difficile che con la coltura tossigenica migliorata. Il test iniziale ha evidenziato un campione (0,1%) non
valido nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. I campioni hanno generato un risultato valido (era
negativo) dopo essere stati nuovamente testati conformemente alla bozza del foglietto illustrativo del
dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Abbiamo deciso di tenere conto delle prestazioni cliniche sulla
base del risultato di test iniziale ottenuto per ciascun campione. Pertanto, i dati riportati di seguito si
riferiscono ai settecentonovantuno (791) campioni restanti.
Coltura tossigenica arricchita
POS.
NEG.
Totale
Dosaggio Quidel
POS.
137
8*
145
Molecular Direct C.
difficile su
NEG.
20**
626
646
LTI QuantStudio
Totale
157
634
791
Sensibilità
Specificità
87,3%
98,7%
95% CI
81,1%
91,6%
97,5%
99,4%
*
Otto (8) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con la coltura tossigenica arricchita) riportati sono stati
testati con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Due (2) di questi campioni sono risultati positivi per il C. difficile e sei
(6) sono risultati negativi.
** Diciassette (17) campioni discordanti su venti (20) (negativi con Quidel/positivi con coltura tossigenica arricchita) riportati sono
stati testati con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Tre (3) campioni sono risultati non disponibili per il test. Undici
(11) di questi campioni sono risultati negativi per il C. difficile e sei (6) sono risultati positivi.
attraverso uno studio prospettico svoltosi da agosto a novembre 2012. Seicentosessantacinque (665)
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associata al Clostridium difficile (CDAD) in quattro aree geografiche distinte negli Stati Uniti. Questi
campioni sono stati testati con il dosaggio Quidel sullo strumento SmartCycler II in una delle tre (3)
strutture.
Il test iniziale ha evidenziato cinque (5) campioni (0,75%) non validi nel dosaggio Quidel Molecular Direct
C. difficile. Abbiamo tenuto conto dell'età e del sesso sulla base del risultato di test iniziale ottenuto per
ciascun campione. Pertanto, l'età dei pazienti e le informazioni sul sesso indicate di seguito si riferiscono ai
seicentosessanta (660) campioni restanti.
Età
Sesso sconosciuto
Neonati
(<2 anni)
Bambini
(da ≥2 a <12 anni)
Adolescenti
(da ≥12 a <18 anni)
Tarda adolescenza
(da ≥18 a ≤21 anni)
Adulti
(da >21 a 59 anni)
Adulti anziani
(> 60 anni)
Totale
Sesso
Maschi Femmine
3
Prevalenza per età di positivi al C. difficile con
il dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile
sullo strumento Cepheid SmartCycler II
33,3% (1/3)
Totale
4
4
8
12,5% (1/8)
21
18
39
23,1% (9/39)
8
11
19
15,8% (3/19)
5
8
13
7,7% (1/13)
133
147
280
18,6% (52/280)
129
169
298
17,1% (51/298)
300
357
660
17,9% (118/660)
Confronto del dosaggio su coltura diretta
difficile che con il dosaggio in coltura diretta. Tre (3) campioni (0,5%) sono risultati indeterminati nel
dosaggio per la citotossicità, a causa di una tossicità nel pozzetto antitossina. Il test iniziale ha evidenziato
cinque (5) campioni (0,75%) non validi nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Tutti i cinque (5)
campioni hanno generato un risultato valido dopo essere stati nuovamente testati conformemente alla
bozza del foglietto illustrativo del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile (3 negativi, 2 positivi) .
Abbiamo tenuto conto delle prestazioni cliniche sulla base del risultato di test iniziale ottenuto per ciascun
campione. Pertanto, i dati riportati di seguito si riferiscono ai seicentocinquantasette (657) campioni
restanti.
Coltura tissutale citotossica
POS.
NEG.
Dosaggio Quidel
POS.
78
38*
Molecular Direct C.
difficile su Cepheid
NEG.
9**
532
SmartCycler II
Totale
87
570
Totale
116
541
657
Sensibilità
Specificità
89,7%
93,3%
95% CI
81,5%
94,5%
91,0%
95,1%
* I trentotto (38) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con coltura diretta) riportati sono stati testati con un
dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Nove (9) di questi campioni sono risultati negativi per il C. difficile e ventinove (29)
sono risultati positivi per il C. difficile.
**Otto (8) dei nove (9) campioni discordanti (negativi con Quidel/positivi con la coltura diretta) riportati sono stati testati con un
dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Un (1) campione restante non era disponibile per il test. Cinque (5) di questi
campioni sono risultati negativi per il C. difficile e tre (3) sono risultati positivi.
difficile che con la coltura tossigenica arricchita. Il test iniziale ha evidenziato cinque (5) campioni (0,75%)
non validi nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile. Tutti i cinque (5) campioni hanno generato un
risultato valido dopo essere stati nuovamente testati conformemente al Quidel Molecular Direct C.
difficile (3 negativi, 2 positivi). Abbiamo deciso di tenere conto delle prestazioni cliniche sulla base del
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risultato di test iniziale ottenuto per ciascun campione. Pertanto, i dati riportati di seguito si riferiscono ai
seicentosessanta (660) campioni restanti.
Coltura tossigenica migliorata
POS.
NEG.
Totale
Dosaggio Quidel
POS.
103
15*
118
Molecular Direct C.
difficile su Cepheid
NEG.
22**
520
542
SmartCycler II
Totale
125
535
660
Sensibilità
Specificità
82,4%
97,9%
95% CI
74,8%
88,1%
95,4%
98,3%
* Quindici (15) campioni discordanti (positivi con Quidel Molecular/negativi con tossigenica arricchita) riportati sono stati testati
con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Sei (6) di questi campioni sono risultati positivi per il C. Difficile, nove (9) di
questi campioni sono risultati negativi.
** Diciannove (19) su ventidue (22) campioni discordanti (negativi con Quidel/positivi con coltura tossigenica arricchita) riportati
sono stati testati con un dispositivo molecolare approvato dalla FDA. Tre (3) campioni sono risultati non disponibili per il test.
Dieci (10) di questi campioni sono risultati positivi per il C. difficile e nove (9) sono risultati negativi.
Prestazioni analitiche
Livello di rilevamento
La sensibilità analitica (limite di rilevamento o LoD) del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile è stata
stabilita usando colture quantificate (CFU/mL) di due ceppi di C. difficile (ATCC BAA-1870 e ATCC BAA-1872),
diluiti serialmente in una matrice fecale negativa. La sensibilità analitica (LoD) è definita come la
concentrazione più bassa in corrispondenza della quale il 95% di tutti i duplicati risulta positivo al test.
Denominazione del
ceppo
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Applied Biosystems 7500Fast Dx
CFU/mL calcolato
CFU per
Tossinotipo
nel LoD
dosaggio nel LoD
IIIb
8.4E+04
4.2E-01
0
2.4E+04
1.2E-01
Risultati di
conferma LoD
60/60
59/60
Denominazione del
ceppo
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
CFU/mL calcolato
CFU per
Tossinotipo
nel LoD
dosaggio nel LoD
IIIb
8.4E+04
4.2E-01
0
8.0E+03
4.0E-02
Risultati di
conferma LoD
20/20
20/20
Denominazione del
ceppo
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Tossinotipo
IIIb
0
CFU/mL calcolato
nel LoD
8.4E+04
2.4E+04
CFU per
dosaggio nel LoD
4.2E-01
1.2E-01
Risultati di
conferma LoD
58/60
60/60
Reattività analitica (Inclusività)
La reattività analitica del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile è stata determinata usando ceppi
quantificati (CFU/dosaggio) di C. difficile appartenenti a vari tossinotipi, inclusi ceppi ipervirulenti; i ceppi
quantificati sono stati diluiti in una matrice fecale negativa a 2-3X LoD.
Ceppo di C. difficile
Tossinotipo
Concentrazione
(CFU/dosaggio)
RSV
ATCC 43255
0
5.0E-2
Positivo
CCUG 8864
X
1.2E-01
Positivo
CCUG 37770
IV
6.6E-01
Positivo
ATCC BAA-1875
V
9.8E-01
Positivo
ATCC 43598
VIII
1.14E+00
Positivo
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Ceppo di C. difficile
Tossinotipo
Concentrazione
(CFU/dosaggio)
RSV
CCUG 37774
XXIII
1.0E-01
Positivo
CCUG 9004
n/d
9.5E-01
Positivo
ATCC BAA-1874
0
2.0 E-01
Positivo
ATCC 43600
0
7.4 E-01
Positivo
ATCC BAA-1871
0
3.0 E-02
Positivo
ATCC BAA-1803
IIIc
1.2 E-01
Positivo
ATCC 700792
0
1.11 E+00
Positivo
ATCC 43599
0
1.3 E-01
Positivo
CCUG 60276
n/d
1.01 E-01
Positivo
CCUG 60275
n/d
6.8 E-01
Positivo
CCUG 37778
n/d
3.4 E-01
Positivo
CCUG 37777
n/d
7.3 E-01
Positivo
CCUG 37776
n/d
1.6 E-01
Positivo
CCUG 37773
n/d
9.0 E-02
Positivo
ATCC 17857
0
5.6 E-01
Positivo
ATCC 43594
0
8.0 E-02
Positivo
ATCC 43596
0
7.3 E-01
Positivo
ATCC BAA-1872
0
4.2E-01
Positivo
ATCC BAA-1870
IIIb
1.2E-01
Positivo
Specificità analitica (Reattività crociata e interferenza microbica)
La specificità analitica del dosaggio Quidel Molecura Direct C. difficile è stata valutata testando un panel
composto da sessantasei (66) batteri, virus e lieviti che rappresentavano patogeni enterici comuni, flora o acidi
nucleici comunemente presenti nell'intestino e nel DNA umano. I microorganismi o gli acidi nucleici sono stati
mescolati con una matrice negativa mista e testati direttamente o in presenza di un livello LoD da 2 a 3x di C.
difficile, rispettivamente per valutare la reattività crociata e l'interferenza microbica. Questi studi sono stati
condotti solo sull'ABI 7500.
La tabella qui sotto riepiloga i dati estratti da questi studi. Non è stato rilevato alcun segno di reattività o
interferenza in alcun componente del panel e nel dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile.
ID organismo
Identificazione
Concentrazione
testata
(CFU/mL o
PFU/mL)
Alcaligenes faecalis,
sottospecie faecalis
Bacillus cereus
Campylobacter coli*
.jejuni
Candida albicans
ZM 081597
ATCC 7966
5.27E+08
2.09E+10
Negativo
Negativo
Risultati
Interferenza
microbica:
risultato del
C. difficile
ATCC BAA1870
Positivo
Positivo
ATCC 15554
4.65E+09
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 13472
CCUG 4856
CCUG 36995
1.00E+07
1.77E+08
5.30E+08
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 33292
1.72E+07
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 10231
ATCC 8090
3.00E+07
2.38E+09
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Reattività
crociata:
risultato
del C.
difficile
Interferenza
microbica:
risultato del
C. difficile
ATCC BAA1872
Positivo
Positivo
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ID organismo
Clostridium difficile (non
tossicogenico)
Clostridium difficile (non
tossicogenico)
Clostridium novyi
(ceppo: tipo A)
Edwardsiella tarda
Escherichia coli
Helicobacter pylori
Klebsielia oxytoca
(sierotipo 1/2b)
Peptostreptococcus
anaerobius
Porphyromonas
asaccharolytica
Proteus mirabilis
(typhimurium)
Salmonella enterica,
sottospecie Arizonae
(precedentemente
CCUG 47601
1.75E+07
Risultati
Interferenza Interferenza
Reattività
microbica:
microbica:
crociata:
risultato del risultato del
risultato
C. difficile
C. difficile
del C.
ATCC BAAATCC BAAdifficile
1870
1872
Negativo
Positivo
Positivo
Nessuna reattività crociata in silico
rilevata
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 43601
4.58E+06
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 43593
1.13E+06
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 9650
CCUG 57219
ATCC 49531
3.43E+09
6.50E+06
5.30E+06
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ZM 0801585
3.37E+07
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 35704
ATCC 12464
ATCC 9714
Z077
CCUG 6329
CCUG 9284
CCUG 33098
CCUG 36938
CCUG 43123
CCUG 47545
CCUG 59819
ATCC 11437
ATCC 15947
ATCC 13048
ATCC 13047
ATCC 51299
ATCC 23511
ZM 0801622
ZM 0801486
ATCC 33496
ATCC 4356
1.62E+07
6.60E+09
1.94E+06
2.07E+08
9.85+E07
6.50E+07
2.00E+07
5.55E+07
2.50E+07
1.36E+07
7.00E+06
3.55E+07
2.03E+09
1.31E+10
5.95E+08
3.45E+09
1.92E+09
2.20E+09
3.57E+06
1.63E+09
6.82E+07
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ZM 0801534
1.18E+10
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 27337
5.80E+08
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 14029
1.40E+08
Negativo
Positivo
Positivo
CCUG 7834
1.30E+07
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 25845
ATCC 25933
ATCC 9886
ATCC 35554
5.10E+08
1.06E+09
9.60E+08
2.60E+10
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 14028
3.55E+10
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 13314
4.22E+09
Negativo
Positivo
Positivo
Identificazione
Concentrazione
testata
(CFU/mL o
PFU/mL)
ATCC 638
2.05E+07
Analisi in silico
Pagina 23 di 28
ID organismo
Salmonella enterica,
sottospecie enterica
(precedentemente
Salmonella choleraesuis)
Serratia marcescens
Shigella boydii
Shigella sonnei
(streptococco del Gruppo B)
Adenovirus 1 VR-1*
Rotavirus (ceppo: WA)*
Norovirus GII
Enterovirus 71
Ecovirus 6
Coxsackievirus B4
Citomegalovirus Towne VR977
Risultati
Interferenza
microbica:
risultato del
C. difficile
ATCC BAA1870
Interferenza
microbica:
risultato del
C. difficile
ATCC BAA1872
Identificazione
Concentrazione
testata
(CFU/mL o
PFU/mL)
Reattività
crociata:
risultato
del C.
difficile
ATCC 7001
6.80E+09
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 7001
ZM 0801723
ATCC 9207
ATCC 49557
ATCC 29930
ATCC 43300
ATCC 14990
3.79E+10
6.10E+08
8.16E+08
1.26E+10
3.36E+08
6.00E+07
4.00E+08
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 12386
2.75E+08
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 17802
DHI 62207
ZM NATROTAST
ZM NATNOVIIST
DHI 80406
DHI 121506
DHI 92206
9.50E+06
5.67E+05
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
2.32E+08
Negativo
Positivo
Positivo
3.92E+08
Negativo
Positivo
Positivo
4.82E+05
1.05E+09
2.43E+07
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
DHI 201006
1.48E+06
Negativo
Positivo
Positivo
Promega
184 µg/ml
Negativo
Positivo
Positivo
G3041
*Per testare tali organismi è stato usato acido nucleico purificato. Il numero delle cellule è stato approssimato
in base alla concentrazione dell'acido nucleico e delle dimensioni del genoma.
DNA genomico umano
Specificità analitica – Sostanze interferenti
Le prestazioni del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile sono state valutate con sostanze
potenzialmente interferenti che potrebbero essere presenti nei campioni fecali. Le sostanze potenzialmente
interferenti sono state valutate in corrispondenza dei livelli rilevanti usando i ceppi di C. difficile BAA-1870 e
BAA-1872, a una concentrazione da 2 a 3x LoD. Non è stato rilevato alcun segno di interferenza da parte delle
seguenti 35 sostanze testate: acido palmitico, triclosan, meticillina, cloridrato di fenilefrina, acido stearico, olio
minerale, naprossene sodico, idrossido di alluminio, idrossido di magnesio, mucina, solfato di bario, cimetidina,
esomeprazolo, magnesio idrato, nistatina, albumina sierica umana, subsalicilato di bismuto, etanolo,
carbonato di calcio, glucosio, cloridrato di loperamide, emoglobina umana, cloruro di benzalconio, acido 5aminio-salicilico, vaselina, cortisolo, ossido di zinco, senossidi, sangue intero, nonoxynol-9, sale nitrato di
miconazolo, idrossido di alluminio/carbonato di magnesio, Hamamelis, cloridrato di vancomicina e IgA umana.
Studio sulla riproducibilità
La riproducibilità del dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile è stata valutata presso tre laboratori. La
riproducibilità è stata analizzata usando un panel di 4 campioni simulati, comprendente concentrazioni medie
(5x LoD), basse (2x LoD) e alte negative (0,3x LoD) di campioni di C. difficile, oltre a campioni negativi. I panel e
i controlli sono stati testati in ciascun sito da 2 operatori per 5 giorni (test triplice x 2 operatori x 5 giorni x 3 siti
= 90 risultati per livello). I valori LoD si basano sui valori ottenuti nello studio LoD. I panel e i controlli sono stati
estratti e testati sullo strumento Applied Biosystems 7500 Fast DX, sullo strumento Life Technologies
QuantStudio Dx e sullo strumento Cepheid SmartCycler II.
Pagina 24 di 28
Risultati di riproducibilità – Applied Biosystems 7500 Fast DX
Sito 1
Sito 2
ID del
componente del Risultati Ct
%CV
Risultati Ct
panel
MED
MED
Alta negativa
5/29
28,8
15,0
11/30
27,1
0,3x LoD
Bassa positiva
29/30
23,2
8,4
30/30
22,7
2x LoD
Medio positiva
30/30
20,5
5,7
30/30
20,2
5x LoD
Campione
0/29
N/D
N/D
0/30
N/D
negativo
Controllo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
negativo
Controllo
30/30
15,8
2,9
30/30
16,2
positivo
Risultati di riproducibilità – Life Technologies QuantStudio Dx
Sito 1
Sito 2
ID del
%CV
Risultati Ct
panel
MED
MED
Alta negativa
8/30
22,9
5,0
15/30
22,5
0,3x LoD
Bassa positiva
30/30
20,4
5,9
30/30
19,0
2x LoD
Medio positiva
30/30
18,4
4,2
30/30
17,5
5x LoD
Campione
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
negativo
Controllo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
negativo
Controllo
30/30
15,7
0,6
30/30
15,7
positivo
Risultati di riproducibilità – Cepheid SmartCycler II
Sito 1
Sito 2
ID del
%CV
Risultati Ct
panel
MED
MED
Alta negativa
17/30
23,4
6,6
22/30
25,3
0,3x LoD
Bassa positiva
29/30
20,1
4,6
29/29
20,1
2x LoD
Medio positiva
30/30
18,4
9,5
30/30
18,5
5x LoD
Campione
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
negativo
Controllo
0/30
N/D
N/D
0/30
N/D
negativo
Controllo
30/30
15,1
3,8
30/30
14,8
positivo
%CV
Sito 3
Risultati Ct MED %CV
9,0
16/30
27,6
2,8
32/89
7,5
29/30
23,1
6,5
88/90
5,0
30/30
20,4
5,0
90/90
N/D
0/30
N/D
N/D
0/89
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
2,6
30/30
15,7
2,9
90/90
%CV
Sito 3
5,7
15/30
22,5
1,5
38/90
5,1
30/30
19,2
0,8
90/90
2,2
30/30
17,9
0,7
90/90
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
N/D
0/30
N/D
N/D
0/90
0,1
30/30
15,5
0,1
90/90
%CV
Sito 3
13,4
26/30
23,4
9,3
65/90
5,1
30/30
19,9
6,4
88/89
3,1
30/30
18,3
6,4
90/90
N/D
0/29
N/D
N/D
0/89
N/D
0/29
N/D
N/D
0/89
2,2
30/30
14,5
3,4
90/90
Risultati
totali
Risultati
totali
Risultati
totali
Carry-over e contaminazione crociata
Negli studi interni, su tutte le tre piattaforme non è stato rilevato alcun segno di carry-over/contaminazione
incrociata con il dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile.
Servizio clienti e assistenza tecnica
Per ordini o assistenza tecnica, contattare un rappresentante Quidel al numero (800) 874-1517 (gratuito negli
Stati Uniti), oppure al numero +1 (858) 552-1100 (al di fuori degli Stati Uniti), dal lunedì al venerdì, dalle 8:00
Pagina 25 di 28
alle 17:00, ora della costa orientale. Gli ordini possono essere effettuati anche via fax al numero +1 (740) 5929820. Per avere assistenza via e-mail, scrivere a [email protected] oppure a [email protected].
Per servizi al di fuori degli Stati Uniti, contattare il distributore di zona. Maggiori informazioni su Quidel, i nostri
prodotti e i nostri distributori sono disponibili sul sito web quidel.com.
Proprietà intellettuale
Marchi di fabbrica
Smartcycler® è un marchio depositato di Cepheid Corporation. Applied Biosystems® è un marchio depositato
di Life Technologies. QuantStudio™ è un marchio di Life Technologies. TaqMan® è un marchio depositato di
Roche. CAL Flour® Orange 560 e Quasar® 670 sono marchi depositati di BioSearch Technologies, Inc.
Brevetti
I composti coloranti in questo prodotto sono venduti su licenza di BioSearch Technologies, Inc. e sono tutelati
da brevetti statunitensi e internazionali, già rilasciati o in attesa di rilascio.
L’acquisto di questo prodotto concede all’acquirente i diritti previsti da determinati brevetti di Roche, per l’uso
esclusivamente nell’ambito di servizi diagnostici in vitro per esseri umani. Al di là di questo specifico diritto
all’uso, con l’acquisto non vengono concessi brevetti generali o altre licenze di alcun tipo.
Pagina 26 di 28
Glossario
Contenuto / Contiene
Leggere le istruzioni per l'uso
Controllo
Uso previsto
96
Contenuto sufficiente per 96 determinazioni
Rischi biologici
Pagina 27 di 28
Bibliografia
1
2
Sloan, L. M., B. J. Duresko, D. R. Gustafson, and J. E. Rosenblatt. 2008. Comparison of Real-Time PCR for
M105 – Kit per dosaggio Quidel Molecular Direct C. difficile
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Germania
Quidel Corporation
Sede internazionale
San Diego, CA 92121, Stati Uniti
quidel.com
M105it v2013MAR13
Pagina 28 di 28
Ensayo Clostridium difficile
Para la identificación y detección cualitativa del ADN bacteriano de Clostridium difficile
toxigénico en muestras de materia fecal
Ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile
Página 1 de 29
Contenido
Indicaciones ............................................................................................................................................ 4
Resumen y explicación ............................................................................................................................ 4
Principios del procedimiento .................................................................................................................. 4
Materiales proporcionados..................................................................................................................... 5
Materiales opcionales ............................................................................................................................. 5
Materiales necesarios pero no proporcionados ..................................................................................... 5
Advertencias y precauciones .................................................................................................................. 6
Conservación y manipulación de los reactivos del kit ............................................................................ 6
Recogida, conservación y manipulación de muestras ............................................................................ 7
Programación inicial del termociclador .................................................................................................. 7
Instrucciones de programación del 7500 Fast DX ............................................................................... 7
Instrucciones de programación del QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument DX .......................11
Instrucciones de programación del SmartCycler II ...........................................................................11
Procedimiento del ensayo ....................................................................................................................13
Procedimiento para procesar las muestras ..........................................................................................13
Protocolo de amplificación en el termociclador 7500 Fast Dx .........................................................13
Protocolo de amplificación en el QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument .................................14
Protocolo de amplificación en el SmartCycler II ...............................................................................15
Interpretación de los resultados ...........................................................................................................16
Interpretación de los resultados obtenidos con el termociclador 7500 Fast Dx ..............................16
Interpretación de los resultados obtenidos con el instrumento Life Technologies QuantStudio Dx
Real-Time PCR ...................................................................................................................................16
Interpretación de resultados con el termociclador Cepheid SmartCycler II Dx................................17
Control de calidad .................................................................................................................................17
Limitaciones ..........................................................................................................................................17
Rendimiento clínico ..............................................................................................................................17
Rendimiento analítico ...........................................................................................................................21
Nivel de detección.............................................................................................................................21
Reactividad analítica (inclusividad) ...................................................................................................22
Especificidad analítica (Reactividad cruzada e interferencia microbiológica) ..................................23
Especificidad analítica – sustancias interferentes ............................................................................25
Estudio de reproducibilidad ..............................................................................................................25
Análisis de contaminación cruzada y de arrastre .............................................................................26
Atención al cliente y servicio técnico ....................................................................................................27
Propiedad intelectual ............................................................................................................................27
Marcas comerciales ..........................................................................................................................27
Página 2 de 29
Patentes ............................................................................................................................................27
Glosario .................................................................................................................................................28
Página 3 de 29
Indicaciones
El ensayo Quidel® Molecular Direct C. difficile es una prueba de diagnóstico in vitro multiplexada cualitativa,
para la detección directa de secuencias del gen de la toxina A (tcdA) o del gen de la toxina B (tcdB) de cepas
toxigénicas de Clostridium difficile a partir de muestras de materia fecal (liquida o blanda) no formadas de
pacientes en los que se sospecha la presencia de enfermedad asociada con Clostridium difficile (CDAD).
El ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile es una prueba de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de
tiempo real y utiliza la elaboración de muestras de propiedad exclusiva con cebadores y sondas marcadas con
fluorescencia. El ensayo puede realizarse utilizando los instrumentos Life Technologies QuantStudio® Dx,
Applied Biosystems 7500 Fast Dx o Cepheid SmartCycler II, para detectar las secuencias del gen de la toxina
asociadas con cepas de C. difficile que producen toxinas.
El ensayo tiene por objetivo realizarse directamente en muestras de materia fecal sospechadas de tener CDAD
y se indica su uso como una ayuda en el diagnóstico de la CDAD.
Resumen y explicación
C. difficile es uno de los principales causantes de colitis y diarrea relacionadas con antibióticos; representa
1
hasta el 25% de todos los casos. Se cree que la exposición a los antibióticos altera la flora del intestino y esto
da lugar a la colonización oportunista del C. difficile que está presente en la flora intestinal de hasta el 3% de
los adultos sanos. Se cree que la producción de dos toxinas (Toxina A y Toxina B) interviene en la virulencia de
C. difficile. Ambos genes tóxicos (tcdA y tcdB, respectivamente) se ubican dentro de un locus de patogenicidad
(PaLoc) de 19,6 Kb, junto con otros 3 genes. No se requiere la presencia de proteínas de ninguna de las dos
toxinas para la patogenicidad. Recientemente, la incidencia y gravedad de la enfermedad asociada con
2
C. difficile correspondiente a las estadías en hospital a corto plazo se han incrementado.
Principios del procedimiento
El ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile detecta ácidos nucleicos que han sido preparados a partir de
muestras de pacientes utilizando una preparación de muestras de propiedad exclusiva. Se realiza una reacción
de PCR múltiple en tiempo real en condiciones optimizadas en un único pocillo. Esto genera amplicones para
cada una de las dianas presentes en la muestra. La identificación tiene lugar gracias a la utilización de sondas y
cebadores con oligonucleótidos que son complementarios de las regiones conservadas en los genes tcdA y
tcdB del locus de patogenicidad.
Marcado de las sondas Quidel Molecular
Diana
Toxina A
Toxina B
Control del proceso (PRC)
Colorante
Quasar® 670
A continuación, se presenta un resumen del procedimiento:
1. Recogida de muestras: Utilizando técnicas habituales, sumerja un hisopo floqueado neonatal en un
espécimen de materia fecal líquida o blanda de pacientes adultos o pediátricos donde se sospeche la
presencia de enfermedad asociada con Clostridium difficile (CDAD).
Nota: Quite el moco de la muestra antes de tomar la muestra de la materia fecal. Si no puede tomar
una muestra de materia fecal a causa de la excesiva cantidad de moco, esto puede provocar
resultados falsos negativos. Las muestras con excesiva cantidad de moco no deben analizarse.
2. Preparación de muestras: Gire el hisopo floqueado neonatal en el primer tampón de proceso. Luego,
agregue 30 µl de la muestra al segundo tubo que contiene el control del proceso (PRC).
3. Rehidratación de la mezcla maestra: Rehidrate la mezcla maestra liofilizada con la solución de
rehidratación. La mezcla maestra contiene cebadores con oligonucleótidos, fluorocromo y sondas
marcadas con colorante de extinción cuyas dianas son regiones conservadas de tcdA y tcdB, así como
la secuencia de PRC.
4. Amplificación y detección de los ácidos nucleicos: Añada 15 µl de la mezcla maestra rehidratada a
cada tubo de reacción o pocillo de la placa. Luego, agregue 5 µl de la muestra preparada (es decir,
muestra con PRC) al pocillo de la placa o a los tubos de reacción etiquetados apropiadamente.
Coloque la placa o el tubo en los instrumentos Applied Biosystems®7500 Fast Dx®, Life Technologies
QuantStudio™ Dx Real-Time PCR, o en el Cepheid® SmartCycler® II.
Página 4 de 29
Una vez que se añade el tubo de reacción o la placa al instrumento adecuado, se inicia el protocolo
del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile. El ensayo está basado en el procedimiento químico
TaqMan® y utiliza una enzima que tiene actividades de ADN polimerasa y exonucleasa 5’-3’. Durante
la amplificación de ADN, esta enzima corta la sonda unida a la secuencia de ADN complementario,
separando el colorante de extinción del colorante de notificación. Este paso genera un aumento en la
señal de fluorescencia a partir de la excitación mediante una fuente de luz de longitud de onda
apropiada. En cada ciclo, más moléculas de colorante se separan de sus colorantes y generan un
incremento en la señal de fluorescencia. Si se logran señales de fluorescencia suficientes, la muestra
se informa como positiva para la detección de ácidos nucleicos.
Materiales proporcionados
SKU N.º M105
Kit de ensayo (96 reacciones) – Conservar a temperaturas entre 2 °C y 8 °C
#


Componente
Cantidad
Solución de rehidratación Parte M5003
1 vial/kit 1,9 ml
Mezcla maestra para Quidel Molecular C. difficile Parte M5043
12 viales/kit
8 reacciones/vial
SKU N.º M207
Kit de preparación rápida de ADN de muestras de materia fecal (96 muestras) – Conservar a temperaturas
entre 2 °C y 25 °C
#


Componente
Cantidad
Tampón de proceso 1 Parte M5032
96 tubos/kit 500 µl
Tampón de proceso 2 Parte M5033
Contiene control del proceso
96 tubos/kit 570 µl
Hisopos floqueados neonatales Parte M5034
96 hisopos
Materiales opcionales
Controles externos para C. difficile toxigénico (por ejemplo, Conjunto de Control Quidel Molecular
C. difficile N.º M108; estos controles pueden servir como controles de amplificación y procesamiento
externo y son independientes del PRC).
Materiales necesarios pero no proporcionados
Micropipetas (rango entre 1 a 10 μl o 2 a 20 μl y 100 a 1000 μl)
Puntas de pipetas anti-aerosol
Sistemas de los instrumentos Applied Biosystems 7500 Fast Dx o Life Technologies QuantStudio Dx
Real-Time PCR
Placa de PCR de 96 pocillos
Film óptico para placas de Applied Biosystems
Centrífuga para placas de la serie 7500 de 96 pocillos
O
Micropipetas (rango entre 1 a 10 μl y 100 a 1000 μl)
Puntas de pipetas anti-aerosol
Instrumento SmartCycler II
Materiales desechables del SmartCycler
Centrífuga SmartCycler
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Advertencias y precauciones
Para uso diagnóstico in vitro
Las características de rendimiento de esta prueba solo se han establecido con los tipos de muestras
indicados en el apartado Indicaciones. El rendimiento de este ensayo con otros tipos de muestras o
especímenes no ha sido evaluado.
El uso de otras condiciones de ciclo distintas a las indicadas en el apartado Instrucciones de programación
del termociclador puede dar lugar a resultados erróneos.
El uso de este producto debe limitarse a personal con una formación suficiente en las técnicas de PCR.
Trate todas las muestras como si fueran potencialmente infecciosas. Siga las precauciones universales al
manipular las muestras, este kit y su contenido.
La recogida, la conservación y el transporte correctos de las muestras son indispensables para obtener
resultados correctos.
Conserve los reactivos del ensayo tal como se indica en las etiquetas individuales.
Utilice ropa de protección adecuada, guantes y protección facial y ocular cuando utilice este kit.
Para obtener resultados exactos, pipetee con cuidado utilizando únicamente equipo calibrado.
Limpie a fondo y desinfecte todas las superficies con una solución de lejía al 10%, seguida de agua de
calidad para biología molecular.
Utilice micropipetas con barrera anti-aerosol o puntas de desplazamiento positivo para todos los
procedimientos.
Evite la contaminación y la contaminación microbiológica de los reactivos del kit. Siga las buenas prácticas
de laboratorio.
No mezcle reactivos de kits con números de lote distintos.
No utilice ni reemplace reactivos de otros fabricantes con este kit.
No utilice este producto después de la fecha de caducidad.
La planificación correcta del flujo de trabajo es fundamental para reducir al mínimo el riesgo de
contaminación. Planifique siempre el flujo de trabajo del laboratorio de forma unidireccional,
comenzando con la preamplificación y avanzando por los pasos de amplificación y detección.
Utilice suministros y equipos dedicados exclusivamente a las áreas de preamplificación y amplificación.
No permita el movimiento cruzado de personal o equipo entre una zona y otra.
Mantenga siempre los suministros de la zona de amplificación separados de los de la zona de
preamplificación.
No abra los tubos de muestra ni destape las placas después de la amplificación.
Deseche cuidadosamente el material amplificado, de acuerdo con la legislación y las normativas locales
para minimizar el riesgo de contaminación con los amplicones.
No utilice suministros, materiales ni pipetas exclusivos para la preparación de reactivos o muestras de
productos amplificados de procesamiento.
La ficha de datos sobre seguridad de materiales se puede solicitar o consultar en la página web del
producto.
No agite el tampón de proceso 1 en el mezclador vórtex. Esto causará espuma excesiva y puede
incrementar la probabilidad de que se produzca contaminación de las muestras.
Conservación y manipulación de los reactivos del kit
Conserve el kit de ensayo sin abrir a una temperatura de 2 °C a 8 °C y el kit de preparación rápida de ADN
de muestras de materia fecal a 2 °C a 25 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la caja exterior del kit.
La mezcla maestra rehidratada debe utilizarse dentro de los 60 minutos. Para conservar la mezcla maestra
rehidratada durante más tiempo, es necesario volver a taparla, sellarla con Parafilm y conservarla en
posición vertical a ≤ –20 °C durante un máximo de 3 días. Durante su conservación, proteja la mezcla
maestra de la luz.
Indicaciones de inestabilidad o deterioro de los reactivos:
Solución de rehidratación: La turbidez en la solución de rehidratación puede indicar el deterioro de este
reactivo. Llame al servicio técnico de Quidel para cambiarla.
Tampón de proceso 1: Con la conservación en frío, es posible que el tampón de proceso 1 tenga
sedimento blanco en el vial. Esto no es una señal de inestabilidad o deterioro. Si se retira de la
conservación en frío, el tampón de proceso 1 debe equilibrarse a temperatura ambiente. No debe
utilizarse el tampón de proceso hasta que el sedimento se haya disuelto. La conservación de 20 °C a 25 °C
puede ser más conveniente.
Página 6 de 29
Recogida, conservación y manipulación de muestras
Las muestras fecales únicas o múltiples evacuadas recientemente se recogen en un envase limpio. Las
muestras de exudado no son adecuadas ya que la muestra es demasiado pequeña y tiende a variar a
temperatura de conservación. Se deben evitar las muestras recogidas después de un enema de bario u otro
tratamiento. Las muestras deben transportarse en envases plásticos sellados herméticamente a prueba de
fugas. Si se pueden procesar las muestras dentro de las 3 a 4 horas posteriores a la recolección, el transporte a
temperatura ambiente es aceptable. Las muestras demoradas en el laboratorio se deben refrigerar de
inmediato y conservar a 2 °C a 8 °C o a -20 °C por hasta 7 días. Si se deben transportar las muestras a través de
distancias largas, se debe utilizar hielo. Los requerimientos específicos para transportar muestras deben ser
coherentes con las recomendaciones de las secciones 42 y 49 del Código de Regulación Federal (CFR, Code of
Federal Regulation).
Conservación de muestras procesadas
Las muestras diluidas en el tampón de proceso 1 y en el tampón de proceso 2 pueden conservarse a
temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) hasta por 7 días en total. Las muestras en el tampón de proceso 2 ¡no
se deben refrigerar ni congelar!
Programación inicial del termociclador
Instrucciones de programación del 7500 Fast DX
1.
2.
Inicie el paquete de software de Applied Biosystems 7500 Fast Dx. Si la unidad SDS no está encendida,
se abrirá una ventana de advertencia. Seleccione el botón Cancelar.
Se abrirá el cuadro de diálogo Documento de inicio rápido. Seleccione el botón Crear documento
nuevo para iniciar el Asistente para documentos nuevos. Siga cada paso para iniciar el protocolo de
a. Defina el documento: La mayoría de los siguientes parámetros deberían mostrar el valor
predeterminado. Si no es así, cámbielos según corresponda.
i. Confirme o introduzca la siguiente información.
Ensayo Curva estándar (cuantificación absoluta)
Recipiente: Placa transparente de 96 pocillos
Plantilla: Documento en blanco
Modo de
Fast 7500
análisis:
Usuario: Nombre del usuario
Comentarios: SDS v1.4
Nombre de
Quidel Molecular Direct C. difficile
la placa:
b.
c.
ii. Seleccione el botón Siguiente.
Seleccione Detectores: Deben añadirse nuevos detectores para C. difficile y el control del
proceso (PRC). Seleccione el botón Detector nuevo para cada diana, para abrir la ventana
emergente Detector nuevo. También puede utilizar el botón Crear otro desde la ventana
emergente Detector nuevo para el último detector.
i. Introduzca la siguiente información para cada detector:
Colorante de
Colorante de
Color
Nombre
notificación
extinción
C. difficile
JOE
(ninguno)
(Seleccionar)
PRC
CY5
(ninguno)
(Seleccionar)
ii. Seleccione un color único que represente a cada detector.
iii. Resalte los nuevos detectores y añádalos a la columna Detectores en el documento
con el botón Añadir.
iv. Seleccione (ninguno) en el menú desplegable Referencia pasiva.
v. Seleccione el botón Siguiente.
vi. Seleccione el botón Finalizar sin definir ningún pocillo.
El asistente se cerrará y se abrirá el software en la ficha Configuración. Aparecerá la placa
de muestras configurada durante el inicio rápido. Para la configuración inicial, no es
necesario realizar ningún cambio en esta ficha.
Página 7 de 29
d.
Definición del protocolo del termociclador: Seleccione la ficha Instrumento para configurar
las temperaturas y los tiempos de los ciclos de PCR del ensayo Quidel Molecular Direct C.
difficile. En Perfil térmico, debe aparecer un protocolo de 2 etapas predeterminado. Cada
etapa tiene 3 cuadros de texto que el usuario puede modificar. El valor del cuadro superior
representa el número de repeticiones o ciclos en esa etapa. El valor del cuadro central
representa la temperatura (˚C) y el valor del cuadro inferior representa el tiempo (minutos:
segundos).
i. Realice los cambios siguientes en el Protocolo del termociclador predeterminado:
1. Etapa 1
a. Repeticiones:
1
b. Temp.:
92
c. Tiempo:
2:00
2.
Etapa 2, (etapa de amplificación en 3 pasos)
a. Repeticiones: 15
b. Paso 1
i. Temp.: 92
ii. Tiempo: 0:05
c. Paso 2
i. Temp.: 57
ii. Tiempo: 0:05
Nota: Seleccione la barra que aparece a la derecha de Etapa, Paso 2.
Seleccione el botón Añadir paso para añadir otro paso.
d. Paso 3
i. Temp.: 68
ii. Tiempo: 0:25
Página 8 de 29
3.
Seleccione la barra que aparece a la derecha de Etapa 2. Seleccione el
botón Añadir ciclo para añadir otra etapa.
4.
Etapa 3, (etapa de amplificación en tres pasos)
a. Repeticiones: 35
b. Paso 1
i. Temp.: 92
ii. Tiempo: 0:05
c. Paso 2
i. Temp.: 57
ii. Tiempo: 0:05
d. Paso 3
i. Temp.: 68
ii. Tiempo: 0:25
5.
Si se añade una etapa incorrecta, puede eliminarla pulsando el botón
Eliminar después de resaltar la etapa entre las líneas verticales.
ii. En Configuración, introduzca lo siguiente:
Volumen de muestra (µl): 20 (predeterminado)
Modo de análisis:
7500 Fast (predeterminado)
Recogida de datos:
Etapa 3, Paso 3 (68,0 a 0:25)
NOTA: No seleccione la casilla situada junto a "Modo
experto".
Página 9 de 29
iii. Protocolo final
e.
Defina el umbral para cada analito
i. Seleccione la ficha Resultados.
ii. Seleccione la ficha Gráfico de amplificación.
iii. Seleccione C. difficile en la esquina superior derecha de la ficha Detector.
iv. En el bloque Configuración del análisis, establezca Umbral en 4.0e4
v. Seleccione el botón de radio Auto Baseline
vi. Repita los pasos iii a v para establecer el valor Umbral de PRC en 3.0e4.
f.
Guarde el protocolo nuevo como una plantilla para usos futuros.
i. En la parte superior de la pantalla, seleccione Archivo y, a continuación, Guardar
como.
ii. Guardar en: D:\Applied Biosystems\7500 Fast System\Templates\
iii. Nombre del archivo: ‘Quidel Molecular C. difficile’
iv. Guardar como tipo: ‘SDS Templates (*.sdt)’
Salga del software.
g.
Página 10 de 29
Instrucciones de programación del QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument DX
Quidel Molecular suministra plantillas predefinidas para el ensayo en un CD que se deben cargar al
instrumento QuantStudio™ Dx. Comuníquese con un representante de Quidel al (800) 874-1517 (teléfono
gratuito en los Estados Unidos) o al (858) 552-1100, de lunes a viernes, de 8:00 a. m. a 5:00 p. m., hora de la
costa este de EE. UU., para obtener este CD. Estas plantillas contienen los parámetros de análisis necesarios; es
decir, no se necesita programar el instrumento para comenzar. Para instalar un documento de definición de
prueba:
1. Desde la ficha Inicio del software del QuantStudio™ Dx, haga clic en Administrar prueba en el panel
Herramientas.
2. Desde el Menú de la prueba, haga clic en Instalar.
3. Navegue hasta encontrar su documento de definición de prueba (.tdd), selecciónelo y haga clic en
Abrir. El software del QuantStudio™ añade automáticamente la prueba seleccionada al menú de la
prueba.
4. Haga clic en Cerrar para cerrar el menú de la prueba y guardar sus cambios.
Instrucciones de programación del SmartCycler II
1.
2.
Inicie el paquete del software SmartCycler II Dx versión 3.0b.
Cree el ensayo Quidel Molecular C. difficile.
a. Seleccione el botón Definir ensayos de la parte superior de la pantalla.
b. Asigne un nombre al ensayo:
i. Seleccione el botón Nuevo en la esquina inferior izquierda de la pantalla.
ii. Escriba “Quidel Molecular C. difficile” y seleccione OK.
iii. Se añadirá “Quidel Molecular C. difficile” a la parte superior de la lista Nombre del ensayo,
situada en la parte superior izquierda de la pantalla.
c. Defina los valores del análisis: En el apartado Tipo de ensayo: investigación, seleccione la ficha
Configuración del análisis y asegúrese de que estén establecidas las especificaciones siguientes.
i. Seleccione FATA25 en el menú desplegable Conjunto de colorantes.
ii. El menú desplegable Tipo de análisis debe estar configurado en el valor predeterminado
Cualitativo.
iii. En la columna Nombre del canal, introduzca “C. difficile” para el canal 2 y “PRC” para el
canal 4.
iv. En la columna Uso, seleccione Sin usar del menú desplegable para los Canales 1 y 3, Diana
para C. difficile y Control interno para PRC. Al seleccionar Control interno, aparecerá la
ventana emergente que se muestra abajo. Seleccione el botón Sí.
v. En la columna Análisis de la curva, introduzca el valor predeterminado Curva principal para
cada canal (C. difficile, PRC) (Configuración predeterminada).
vi. En la columna Valor umbral, introduzca el valor predeterminado Umbral manual para
vii. En la columna Unidades fluoroscópicas del umbral manual, introduzca los siguientes
valores:
b. PRC: 10,0
viii. En la columna Ciclo mínimo válido (desplácese hacia la derecha si no se hace visible
inmediatamente), introduzca 5 para cada canal (C. difficile, PRC).
ix. En la columna Ciclo máximo válido (desplácese hacia la derecha si no se hace visible
inmediatamente), introduzca 35 para cada canal (C. difficile, PRC).
x. En la columna Substracción del fondo, utilice el valor predeterminado “Activado” para
xi. En la columna Mín. de ciclos para fondo, introduzca 5 para cada canal (C. difficile, PRC).
xii. En la columna Máx. de ciclos para fondo, introduzca 20 para cada canal (C. difficile, PRC).
xiii. En la columna Media de ciclos para suavizado, mantenga el valor predeterminado 0 para
Página 11 de 29
xiv. En la columna Umbral del punto final, introduzca 20 para el canal de C. difficile y 10 para
el canal de PRC.
xv. En la columna % IC NC, mantenga “NA” para el canal (PRC) (Configuración
predeterminada).
xvi. En la columna IC Delta, mantenga el valor predeterminado “NA” para cada canal (C.
difficile, PRC) (Configuración predeterminada).
xvii. En el apartado Personalizar el texto de los resultados (a continuación de la tabla),
seleccione Texto de resultados basado en los microorganismos en el menú desplegable.
Se abrirá la ventana emergente de advertencias que se muestra abajo. Seleccione Sí.
3.
xviii. Seleccione el botón Personalizar para abrir el cuadro de diálogo Texto de resultados
basado en los microorganismos. Seleccione el botón Agregar, introduzca ‘C. difficile’ en la
columna Nombre del Organismo y marque el cuadro C. difficile. Haga clic en OK en la
parte inferior de la ventana emergente.
d. Configure los tiempos y las temperaturas de los ciclos de RT-PCR de la siguiente forma:
i. Etapa 1
1. Retener
2. Temp.:
92,0
3. Segundos: 120
4. Óptica:
Desactivada
ii. Etapa 2
1. Ciclo con 3 temperaturas
2. Repetir_veces:
15
3. Fila de la primera temperatura
a. Temp.:
92,0
b. Segundos: 5
c. Óptica:
Desactivada
4. Fila de la segunda temperatura
a. Temp:.
57,0
b. Segundos: 5
c. Óptica:
Desactivada
5. Fila de la tercera temperatura
a. Temp.:
66
b. Segundos: 25
c. Óptica:
Desactivada
iii. Etapa 3
1. Ciclo con 3 temperaturas
2. Repetir_veces:
35
3. Fila de la primera temperatura
a. Temp.:
92
b. Segundos: 5
c. Óptica:
Desactivada
4. Fila de la segunda temperatura
a. Temp.:
57
b. Segundos: 5
c. Óptica:
Desactivada
5. Fila de la tercera temperatura
a. Temp.:
66
b. Segundos: 25
c. Óptica:
Activada
Guarde el protocolo seleccionando el botón Guardar en la parte inferior de la pantalla.
Página 12 de 29
Procedimiento del ensayo
Lleve a cabo los procedimientos siguientes a temperatura ambiente controlada de 20 °C a 25 °C.
Procedimiento para procesar las muestras
Antes de tomar la muestra, quite y descarte el moco con un hisopo o una pipeta de transferencia. Solo se debe
usar materia fecal en el ensayo. Nota: Quite el moco de la muestra antes de tomar la muestra de la materia
fecal. Si no puede tomar una muestra de materia fecal a causa de la excesiva cantidad de moco, esto puede
provocar resultados falsos negativos. Las muestras con excesiva cantidad de moco no deben analizarse.
1. Para recoger muestras de un espécimen líquido, introduzca la cabeza del hisopo por completo en el
espécimen de materia fecal. Toque la parte interior del tubo con el hisopo para quitar el líquido
excedente. Para recoger muestras de un espécimen semisólido, introduzca la cabeza del hisopo por
completo en cuatro lugares del espécimen de materia fecal, como mínimo. Gire el hisopo dentro del
tubo de muestra para eliminar el exceso de materia fecal, de modo que la forma de la punta del
hisopo sea claramente visible. Para obtener control positivo líquido opcional, se debe tratar igual que
un espécimen líquido y recoger la muestra de control con el hisopo suministrado.
2. Sumerja el hisopo neonatal en el tampón de proceso 1 y hágalo girar de 4 a 5 segundos para quitar la
materia fecal del hisopo y para mezclar.
3. Pipetee 30 µl del tampón de proceso 1 en el tampón de proceso 2. Pipetee aspirando y dispensando
de 4 a 5 veces con una pipeta calibrada regulada en 570 µl.
Nota: Las muestras diluidas en el tampón de proceso 1 y en el tampón de proceso 2 pueden
conservarse a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) hasta por 7 días en total.
PRECAUCIÓN: Las muestras en el tampón de proceso 1 y el tampón de proceso 2 ¡no se deben
refrigerar ni congelar!
Procedimiento de rehidratación de la mezcla maestra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Determine el número de muestras que va a analizar y obtenga el número correcto de viales de mezcla
maestra liofilizada para ocho pruebas para realizar el análisis.
Vuelva a poner los reactivos no utilizados en las condiciones de conservación adecuadas.
Abra con cuidado la mezcla maestra para no alterar el precipitado.
Añada 135 µl de solución de rehidratación a la mezcla maestra.
Deje el vial a temperatura ambiente durante 1 a 2 minutos para que se rehidrate el precipitado.
Pipetee suavemente aspirando y dispensando 2 a 3 veces, evitando la formación de burbujas, antes
de dispensar la solución en el primer pocillo de la placa.
Nota: La mezcla maestra rehidratada es suficiente para ocho reacciones.
Nota: La mezcla maestra rehidratada debe utilizarse dentro de los 60 minutos. Para conservar la
mezcla maestra rehidratada durante más tiempo, es necesario volver a taparla, sellarla con Parafilm y
conservarla en posición vertical a ≤ –20 °C durante un máximo de 3 días. Durante su conservación,
proteja la mezcla maestra de la luz.
Procedimiento de preparación de PCR:
1.
2.
3.
4.
5.
Añada 15 µl de la mezcla maestra rehidratada a cada tubo de reacción o pocillo de la placa.
Añada 5 µl de muestra en el tampón de proceso 2 en los tubos de reacción o pocillos de la placa. No
es necesario mezclar los reactivos.
Nota: Utilice una micropipeta nueva y una punta anti-aerosol nueva para cada muestra extraída.
Cierre los tubos de reacción o selle la placa.
Nota: Quidel recomienda incluir un pocillo con controles externos en cada serie del termociclador
(por ejemplo, conjunto de control Quidel Molecular C. difficile N.º M108). Analice los controles de
acuerdo con las prácticas y las políticas del laboratorio.
Centrifugue los tubos de reacción o la placa durante 15 segundos como mínimo. Asegúrese de que
todo el líquido esté en el fondo del pocillo de la placa o el tubo.
Introduzca los tubos o la placa en el termociclador.
Protocolo de amplificación en el termociclador 7500 Fast Dx
1.
2.
3.
4.
Encienda el 7500 Fast Dx.
Inicie el paquete de software del 7500 Fast Dx.
Se abrirá el cuadro de diálogo Documento de inicio rápido.
Haga clic en Crear un documento nuevo.
Página 13 de 29
5.
La mayoría de los siguientes parámetros deberían mostrar el valor predeterminado. Si no es así,
cámbielos según corresponda.
Ensayo
Recipiente:
Modo de
análisis:
Fast 7500
Usuario:
Nombre del usuario
Nombre de
la placa:
7.
8.
Placa transparente de 96 pocillos
Plantilla:
Comentarios:
6.
Curva estándar (cuantificación absoluta)
SDS v1.4 (añadir más si es necesario)
AAMMDD-Quidel Molecular C difficile
Configure la placa de muestras
a. La configuración de la placa aparecerá en las fichas Configuración y Placa.
b. Seleccione todos los pocillos que van a contener muestra, haga clic con el botón derecho y
seleccione Inspector de pocillo en el menú desplegable. Cuando se abra la ventana emergente
Inspector de pocillo, seleccione los detectores para C. difficile y PRC.
c. Utilice el Inspector de pocillo para introducir los nombres de las muestras. Las ID de paciente se
pueden introducir en la ventana Inspector de pocillo; sin embargo, se recomienda hacerlo antes
de resuspender la mezcla maestra liofilizada, posterior al análisis o mediante la función de
importación para reducir al mínimo el tiempo que las reacciones de PCR permanecerán a
temperatura ambiente antes de iniciar el análisis.
d. Guarde el análisis con un identificador único como un archivo “.sds” (por ejemplo, AAMMDDrunID#-Quidel Molecular C difficile.sds).
e. Se abrirá una ventana para que se indique el motivo de la modificación. Escriba “Configuración” y
cualquier otro comentario relevante para el análisis.
Inicie la PCR
a. Seleccione la ficha Instrumento.
b. Introduzca la placa de PCR de 96 pocillos en el instrumento.
c. En Control del instrumento, seleccione el botón Iniciar para iniciar el análisis.
Después de la PCR
a. IMPORTANTE: Cuando finalice el análisis, pulse OK. Para analizar los datos, pulse el botón
“Analizar” en el menú superior y guarde el archivo.
b. Para guardar el archivo, pulse Guardar Documento en la barra de tareas. Se abrirá una ventana
para que se indique el motivo de la modificación. Escriba “Análisis de datos posterior al análisis”
y cualquier otro comentario relevante para el análisis.
Protocolo de amplificación en el QuantStudio Dx Real-Time PCR Instrument
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Encienda el QuantStudio Dx.
Elija el modo IVD en el instrumento.
Inicie el paquete de software del QuantStudio Dx IVD.
Cuando se le solicite, introduzca el nombre de usuario y la contraseña del sistema.
Se abrirá la ventana Pantalla de inicio.
En la casilla Configuración, resalte el nombre de la prueba cargada anteriormente “Quidel Molecular
Direct C. difficile”.
Haga clic en el botón Configuración para iniciar el análisis.
Se mostrará la pantalla Configuración, Propiedades de la prueba. Ingrese la información del análisis
según corresponda.
a. Escriba el Nombre del experimento (la configuración predeterminada inicia el análisis con un
sello con la fecha y la hora).
b. Introduzca la información del código de barras de la placa.
c. Registre los números de lote del material en Información de los reactivos.
d. Guarde el análisis con un identificador único como un archivo “.sds” (por ejemplo, AAMMDDrunID#-Quidel Molecular C difficile.sds)
e. Se abrirá una ventana para que se indique el motivo de la modificación. Escriba “Configuración” y
cualquier otro comentario relevante para el análisis.
En la barra de menú izquierda, seleccione Definir.
Página 14 de 29
10. Edite la información de la muestra.
a. Introduzca información específica de la muestra para cada pocillo; para ello, borre el identificador
predeterminado (Paciente 1, Paciente 2, etc.) e ingrese información nueva.
b. O BIEN, puede seleccionar Importar desde archivo de la parte superior de la pantalla para cargar
un mapa de placa predefinido desde un archivo de texto (separado por medio de tabulaciones).
11. En la barra de menú izquierda, seleccione Asignar para verificar que la configuración de la placa sea
correcta.
12. Cargue la placa de muestras.
a. Eyecte la bandeja de instrumento.
b. Introduzca la placa de PCR de 96 pocillos en la máquina con el pocillo A1 ubicado en la esquina
superior izquierda.
c. Retraiga la bandeja de instrumento.
13. Inicie el análisis.
a. En la barra de menú izquierda, seleccione Analizar.
b. Haga clic en el botón verde Iniciar análisis que se encuentra en la parte superior de la pantalla.
i. Si el equipo se lo solicita, seleccione el número de serie específico del instrumento que se está
utilizando.
14. Cuando se haya completado el análisis, seleccione Análisis en la barra de menú izquierda.
a. Para guardar el archivo, pulse Guardar en la barra de tareas. Se abrirá una ventana para que se
indique el motivo de la modificación. Escriba “Análisis de datos posterior al análisis” y cualquier
otro comentario relevante para el análisis.
b. Se mostrará la ficha Gráfico de amplificación en forma predeterminada. Para ver otro tipo de
gráficos, selecciónelos de la barra de menú izquierda.
c. Para ver información del análisis con valores de Ct, seleccione la ficha Tabla de pocillos en el
margen derecho de la pantalla.
15. Imprima un informe.
a. En la barra de menú superior, seleccione Imprimir informe. Personalice el contenido del informe
marcando o desmarcando casillas de la ventana de informes.
b. Seleccione el botón “Imprimir informe” en la parte inferior del recuadro de diálogo.
16. Exporte los archivos de datos.
a. En la barra de menú izquierda, seleccione Exportar.
b. Introduzca la Ubicación del archivo para exportar O haga clic en Examinar para ubicar la ruta
deseada.
c. El Nombre del archivo para exportar será el nombre predeterminado del análisis guardado.
d. Seleccione Excel como el tipo de archivo.
e. Personalice el informe de datos exportado activando o desactivando las fichas mostradas y
marcando o desmarcando opciones.
f. Seleccione Iniciar exportación en la parte inferior de la pantalla.
Protocolo de amplificación en el SmartCycler II
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Encienda el/los bloque(s) del SmartCycler.
Inicie el paquete de software del SmartCycler Dx versión 3.0b.
Seleccione el botón de Crear análisis de la parte superior de la pantalla para configurar el análisis.
En Nombre de análisis, escriba el nombre del análisis en curso (p. ej., AAMMDD-run ID#_Quidel
Molecular C. difficile).
En Notas, escriba cualquier comentario que desee sobre el análisis para utilizarlo como referencia en
el futuro.
En Ensayo, seleccione el ensayo "Quidel Molecular C. difficile" en el menú desplegable.
En Información del ensayo, introduzca el número de lote y la fecha de caducidad del kit.
Para seleccionar los pocillos que utilizarán, siga uno de estos métodos:
a. Para asignar automáticamente los pocillos:
i. En Número de muestras, introduzca el número de muestras en el cuadro de texto
suministrado.
ii. Seleccione el botón Aplicar. El número de filas introducido aparecerá en la Tabla de sitios.
b. Para elegir manualmente los pocillos de los bloques del SmartCycler, siga estos pasos:
i. Seleccione el botón Añadir/quitar sitios situado hacia la parte inferior de la pantalla.
ii. Se abrirá la ventana emergente Seleccionar sitios con dos columnas. La columna de la
izquierda (Sitios) indica todos los sitios disponibles y la de la derecha (Selecciones), todos
los sitios seleccionados.
iii. Para seleccionar todos los sitios, haga clic en el botón Seleccionar todos los sitios.
Página 15 de 29
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
iv. Para seleccionar sitios específicos, resalte uno o más sitios y seleccione la flecha derecha
para añadir los sitios a la columna Selecciones.
v. Seleccione el botón OK para cerrar la ventana. Los sitios seleccionados aparecerán en la
Tabla de sitios.
Introduzca la identificación de las muestras en la columna ID de muestra de la Tabla de sitios; esto
también puede hacerse una vez que se ha iniciado el análisis.
Introduzca comentarios en la columna Notas y deje las entradas de la columna Tipo de muestra como
“SPEC”.
Seleccione el botón Iniciar análisis en la parte inferior de la pantalla.
Cuando finalice el análisis, seleccione la ficha Ver Resultados.
Cuando finalice el análisis, guárdelo antes de salir del software.
Seleccione la ficha de Resultados de la muestra.
El software del SmartCycler indicará automáticamente si se ha detectado C. difficile en las muestras o
si el análisis no fue válido (sin resolver).
Interpretación de los resultados
Interpretación de los resultados obtenidos con el termociclador 7500 Fast Dx
Interpretación de los resultados del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile en el
Termociclador Applied Biosystems 7500 Fast Dx
Detector:
Resultado
Detector:
Control del
del ensayo
C. difficile
proceso
No se informó un
Se informó un
Negativo
No se ha detectado ADN de C. difficile toxigénico
valor de Ct
valor de Ct
Positivo
Se informó un
para C.
NA*
ADN de C. difficile toxigénico detectado
valor de Ct
difficile
No se ha detectado ADN de C. difficile y no se ha
detectado PRC; para resultados de análisis no
válido, repita la prueba con la misma muestra
No se informó un
No se informó un
No válido
procesada. Si el análisis es no válido al volver a
valor de Ct
valor de Ct
analizar con la muestra procesada, vuelva a
procesar otra alícuota de la misma muestra u
obtenga una nueva muestra para volver a analizar.
* No se necesita ningún valor de Ct para que el resultado del control del proceso sea positivo.
Interpretación de los resultados obtenidos con el instrumento Life Technologies QuantStudio Dx
Real-Time PCR
Instrumento Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR
Detector:
Resultado
Detector:
Control del
del ensayo
C. difficile
proceso
No se informó un
Se informó un
Negativo
valor de Ct
valor de Ct
Positivo
Se informó un
para C.
NA*
valor de Ct
difficile
detectado PRC; para resultados de análisis no
válido, repita la prueba con la misma muestra
No se informó un
No se informó un
No válido
procesada. Si el análisis es no válido al volver a
valor de Ct
valor de Ct
analizar con la muestra procesada, vuelva a
procesar otra alícuota de la misma muestra u
obtenga una nueva muestra para volver a analizar.
* No se necesita ningún valor de Ct para que el resultado del control del proceso sea positivo.
Página 16 de 29
Interpretación de resultados con el termociclador Cepheid SmartCycler II Dx
Termociclador Cepheid SmartCycler II Dx
Detector:
Resultado
Detector:
Control del
del ensayo
C. difficile
proceso
Negativo
para C.
NEG
Pasa
difficile
Positivo
para C.
POS
NA*
difficile
detectado PRC; para resultados de análisis no válido,
Sin resolver
repita la prueba con la misma muestra procesada. Si el
para C.
NEG
No pasa
análisis es inválido al volver a analizar con la muestra
difficile
procesada, vuelva a procesar otra alícuota de la misma
muestra u obtenga una nueva muestra para volver a
analizar.
*No se necesita ningún resultado para que el control del proceso sea positivo.
Control de calidad
El ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile incluye varios controles para controlar el funcionamiento del
ensayo.
1. El control del proceso se utiliza durante el procesamiento de la muestra y la amplificación en el ensayo.
Este control se llena previamente en el tampón de proceso 2.
2. Los controles externos positivos para C. difficile disponibles en el mercado se pueden tratar igual que una
muestra de paciente y se deben utilizar según las normas de su laboratorio. Pueden utilizarse muestras
positivas para C. difficile previamente caracterizadas en lugar de los controles comerciales para C. difficile.
3. Como control externo negativo, puede utilizarse una muestra negativa previamente caracterizada. Este
control debe tratarse igual que una muestra de paciente y utilizarse según las normas de su laboratorio.
Limitaciones
Los resultados negativos no descartan la infección con C. difficile y no deben utilizarse como única base
para tomar decisiones terapéuticas.
Al igual que con otros ensayos de este tipo, existe el riesgo de obtener resultados falsos negativos debido
a la presencia de variantes de secuencia en las dianas de amplificación.
Si la muestra se recoge, se conserva o se transporta incorrectamente, se pueden obtener resultados falsos
negativos.
Los inhibidores presentes en la muestra o los errores cometidos durante el procedimiento del ensayo
también pueden dar lugar a resultados falsos negativos.
Si las muestras no se recogen correctamente (por ejemplo, moco), se pueden obtener resultados falsos
negativos.
Rendimiento clínico
El rendimiento del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se evaluó con muestras recogidas en cuatro
ubicaciones geográficas distintas dentro de los Estados Unidos entre los meses de agosto y noviembre de
2012. En dos estudios [un estudio con el ABI 7500 Fast Dx y el Cepheid SmartCycler II (665 muestras) y un
segundo estudio con el QuantStudio Dx (792 muestras)], el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se
comparó con cultivo toxigénico enriquecido y directo de C. difficile. Las tablas que se muestran a continuación
presentan los datos obtenidos a partir de estos estudios.
Las características de rendimiento del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se establecieron durante
un estudio prospectivo realizado entre agosto y noviembre de 2012. Seiscientos sesenta y cinco (665)
muestras utilizadas para este estudio se tomaron de pacientes con posible enfermedad asociada con
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Clostridium difficile (CDAD) en cuatro ubicaciones geográficas distintas en los Estados Unidos. Estas
muestras se evaluaron con el Ensayo Quidel en el 7500 Fast Dx en una de las tres (3) instalaciones.
Nueve (9) muestras (1,35%) fueron no válidas en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al
analizarlas inicialmente. Calculamos la distribución de edad y sexo en función del resultado de prueba
inicial obtenido para cada muestra. Por lo tanto, los siguientes datos de edad y sexo de pacientes son para
las seiscientos cincuenta y seis (656) muestras restantes.
Sitios combinados: distribución de edad y sexo
Sexo
Edad
Sexo desconocido
Bebé
(<2 años)
Niño
(≥2 a <12 años)
Adolescente
(≥12 a <18 años)
Adolescente en
transición (≥18 a ≤21
años)
Adulto
(>21 a 59 años)
Adulto mayor
(> 60 años)
Total
Masculino
Femenino
3
Prevalencia por edad de C. difficile
positivos con el ensayo Quidel Molecular
Direct C. difficile en el Applied
33,3% (1/3)
12,5% (1/8)
Total
4
4
8
21
18
39
25,6% (10/39)
8
11
19
21,1% (4/19)
5
8
13
15,4% (2/13)
132
146
278
19,1% (53/278)
127
169
296
15,9% (47/296)
297
356
656
18,0% (118/656)
Comparación del ensayo de citotoxicidad de cultivo directo
Seiscientos sesenta y cinco (665) muestras fueron evaluadas tanto por el ensayo Quidel Molecular Direct
C. difficile como por el ensayo de citotoxicidad de cultivo tisular. Tres muestras (0,5%) resultaron
indeterminadas en el ensayo de citotoxina debido a la toxicidad en el pocillo de antitoxina. Nueve
muestras (1,35%) fueron no válidas en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarlas
inicialmente. Ocho muestras arrojaron un resultado válido al volver a analizarlas de acuerdo con el
prospecto borrador del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile (7 fueron negativas, 1 fue positiva). Una
muestra mantuvo un resultado no válido al repetir la prueba. Decidimos calcular el rendimiento clínico en
función del resultado de la prueba inicial obtenido para cada muestra. Por lo tanto, los siguientes datos
son para las seiscientos cincuenta y tres (653) muestras restantes.
Sitios combinados: edades combinadas
Cultivo directo
CI 95%
POS
NEG
Total
Sensibilidad
94,3%
87,4%
97,5%
Ensayo Quidel
POS
83
33*
116
Especificidad
94,2% 91,9%
95,8%
Molecular Real-Time
PCR Direct C. difficile
NEG
5**
532
537
en ABI 7500
Total
88
565
653
*
De las treinta y tres (33) muestras discordantes (Positivos con Quidel Molecular/Negativos con cultivo directo) informadas,
treinta y dos (32) fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Todas estas treinta y dos muestras
dieron positivas de C. difficile. La muestra restante no estaba disponible para analizar.
** Cinco (5) muestras discordantes (Negativos con Quidel/Positivos con citotoxina por cultivo tisular) informadas fueron evaluadas
con el dispositivo molecular aprobado por la FDA. Todas estas cinco (5) muestras dieron negativas de C. difficile.
Comparación de cultivos toxigénicos enriquecidos
C. difficile como por el cultivo de citotoxicidad enriquecido. Nueve muestras (1,35%) fueron no válidas en
el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarlas inicialmente. Ocho muestras arrojaron un
resultado válido (7 fueron negativas, 1 fue positiva) al volver a analizarlas de acuerdo con el prospecto
borrador del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile. Una muestra mantuvo un resultado no válido al
repetir la prueba. Decidimos calcular el rendimiento clínico en función del resultado de la prueba inicial
obtenido para cada muestra. Por lo tanto, los siguientes datos son para las seiscientos cincuenta y seis
(656) muestras restantes.
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Cultivos toxigénicos enriquecidos
POS
NEG
Total
Ensayo Quidel
POS
112
6*
118
Molecular Direct C.
difficile en el
NEG
14**
524
538
ABI 7500
Total
126
530
656
Sensibilidad
Especificidad
88,9%
98,9%
CI 95%
82,2%
93,3%
97,6%
99,5%
*
Seis (6) muestras discordantes (Positivos con Quidel Molecular/Negativos con cultivo toxigénico enriquecido) informadas
fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Todas estas muestras dieron positivas respecto a C.
difficile.
** Doce (12) muestras discordantes (Negativos con Quidel/Positivos con cultivo toxigénico enriquecido) informadas fueron
evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Dos (2) muestras no estaban disponibles para analizar. Nueve (9)
de estas muestras dieron negativas respecto a C. difficile, y tres (3) positivas.
Sistema del instrumento Life Technologies QuantStudio Dx Real-Time PCR
un estudio prospectivo realizado entre agosto y noviembre de 2012. Setecientos noventa y dos (792)
Clostridium difficile (CDAD) en cuatro (4) ubicaciones geográficas distintas en los Estados Unidos. Estas
muestras se evaluaron con el Ensayo Quidel en el QuantStudio Dx en una de las tres (3) instalaciones. Una
(1) muestra (0,1%) fue no válida en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarla inicialmente.
Calculamos la distribución de edad y sexo en función del resultado de prueba inicial obtenido para cada
muestra. Por lo tanto, los siguientes datos de edad y sexo de pacientes son para las setecientos noventa y
una (791) muestras restantes.
Sexo
Edad
Sexo desconocido
Bebé
(<2 años)
Niño
(≥2 a <12 años)
Adolescente
(≥12 a <18 años)
Adolescente en
transición
(≥18 a ≤21 años)
Adulto
(>21 a 59 años)
Adulto mayor
(> 60 años)
Total
Masculino
Femenino
Total
2
positivos con el ensayo Quidel
Molecular Direct C. difficile en el
QuantStudio
50,0% (1/2)
5
5
10
10,0% (1/10)
28
21
49
24,5% (12/49)
10
14
24
20,8% (5/24)
6
7
13
7,7% (1/13)
158
170
328
18,3% (60/328)
163
202
365
17,8% (65/365)
370
419
791
18,3% (145/791)
Comparación de ensayos de cultivo directo
Setecientos noventa y dos muestras fueron evaluadas tanto por el ensayo Quidel Molecular Direct C.
difficile como por el ensayo de cultivo directo. Tres (3) muestras (0,4%) resultaron indeterminadas en el
ensayo de citotoxina debido a la toxicidad en el pocillo de antitoxina. Una (1) muestra (0,1%) fue no válida
en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarla inicialmente. La muestra arrojó un resultado
válido al volver a analizarla de acuerdo con el prospecto borrador del ensayo Quidel Molecular Direct C.
difficile (fue negativa). Calculamos el rendimiento clínico en función del resultado de la prueba inicial
obtenido para cada muestra. Por lo tanto, los siguientes datos son para las setecientos ochenta y ocho
(788) muestras restantes.
Página 19 de 29
Citotoxina por cultivo tisular
POS
NEG
Ensayo Quidel
POS
98
45*
Molecular Direct C.
difficile en
NEG
7**
638
LTI QuantStudio
Total
105
683
Total
143
645
788
Sensibilidad
Especificidad
93,3%
93,4%
CI 95%
86,9%
96,7%
91,3%
95,0%
*
De las cuarenta y cinco (45) muestras discordantes (Positivos con Quidel Molecular/Negativos con cultivo directo) informadas,
cuarenta y cuatro (44) fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Treinta y cinco (35) de estas
muestras eran positivas para C. difficile, y nueve (9) negativas. La muestra restante no estaba disponible para analizar.
** Siete (7) muestras discordantes (Negativos con Quidel/Positivos con cultivo directo) informadas fueron evaluadas con un
dispositivo molecular aprobado por la FDA. Dos (2) de estas muestras dieron positivas para C. difficile, y cinco (5) negativas.
Setecientos noventa y dos (792) muestras fueron evaluadas tanto por el ensayo Quidel Molecular Direct C.
difficile como por el cultivo toxigénico enriquecido. Una (1) muestra (0,1%) fue no válida en el ensayo
Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarla inicialmente. La muestra arrojó un resultado válido (fue
negativa) al volver a analizarla de acuerdo con el prospecto borrador del ensayo Quidel Molecular Direct C.
difficile. Calculamos el rendimiento clínico en función del resultado de la prueba inicial obtenido para cada
muestra. Por lo tanto, los siguientes datos son para las setecientas noventa y una (791) muestras restantes.
POS
NEG
Total
Ensayo Quidel
POS
137
8*
145
Molecular Direct C.
difficile en el
NEG
20**
626
646
LTI QuantStudio
Total
157
634
791
Sensibilidad
Especificidad
87,3%
98,7%
CI 95%
81,1%
91,6%
97,5%
99,4%
*
Ocho (8) muestras discordantes (Positivos con Quidel Molecular/Negativos con cultivo toxigénico enriquecido) informadas
fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Dos (2) de estas muestras dieron positivas para C. difficile, y
seis (6) negativas.
** Diecisiete (17) de las veinte (20) muestras discordantes (Negativos con Quidel/Positivos con cultivo toxigénico enriquecido)
informadas fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Tres (3) muestras no estaban disponibles para
analizar. Once (11) de estas muestras dieron negativas de C. difficile, y seis (6) positivas.
un estudio prospectivo realizado entre agosto y noviembre de 2012. Seiscientos sesenta y cinco (665)
Clostridium difficile (CDAD) en cuatro ubicaciones geográficas distintas en los Estados Unidos. Estas
muestras se evaluaron con el ensayo Quidel en el SmartCycler II en una de las tres (3) instalaciones.
Cinco (5) muestras (0,75%) fueron no válidas en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarlas
inicialmente. Calculamos la distribución de edad y sexo en función del resultado de prueba inicial obtenido
para cada muestra. Por lo tanto, los siguientes datos de edad y sexo de pacientes son para las seiscientos
sesenta (660) muestras restantes.
3
Direct C. difficile en el Cepheid
SmartCycler II
33,3% (1/3)
Sexo
Edad
Sexo desconocido
Bebé
(<2 años)
Niño
(≥2 a <12 años)
Adolescente
(≥12 a <18 años)
Adolescente en
transición
(≥18 a ≤21 años)
Adulto
Masculino Femenino
Total
4
4
8
12,5% (1/8)
21
18
39
23,1% (9/39)
8
11
19
15,8% (3/19)
5
8
13
7,7% (1/13)
133
147
280
18,6% (52/280)
Página 20 de 29
Sexo
Edad
Masculino Femenino
(>21 a 59 años)
Adulto mayor
(> 60 años)
Total
Total
Direct C. difficile en el Cepheid
SmartCycler II
129
169
298
17,1% (51/298)
300
357
660
17,9% (118/660)
Comparación de ensayos de cultivo directo
C. difficile como por el ensayo de cultivo directo. Tres (3) muestras (0,5%) resultaron indeterminadas en el
ensayo de citotoxina debido a la toxicidad en el pocillo de antitoxina. Cinco (5) muestras (0,75%) fueron
no válidas en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarlas inicialmente. Todas las cinco (5)
muestras arrojaron un resultado válido al volver a analizarlas de acuerdo con el prospecto borrador del
ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile (3 fueron negativas, 2 fueron positivas). Calculamos el
rendimiento clínico en función del resultado de la prueba inicial obtenido para cada muestra. Por lo tanto,
los siguientes datos son para las seiscientos cincuenta y siete (657) muestras restantes.
Citotoxina por cultivo tisular
POS
NEG
Ensayo Quidel
POS
78
38*
Molecular Direct C.
difficile en el Cepheid
NEG
9**
532
SmartCycler II
Total
87
570
Total
116
541
657
Sensibilidad
Especificidad
89,7%
93,3%
CI 95%
81,5%
94,5%
91,0%
95,1%
* Las treinta y ocho (38) muestras discordantes (Positivos con Quidel Molecular/Negativos con cultivo directo) informadas fueron
evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Nueve (9) de estas muestras dieron negativas para C. difficile, y
veintinueve (29) dieron positivas de C. difficile.
** Ocho (8) de las nueve (9) muestras discordantes (Negativos con Quidel/Positivos con cultivo directo) informadas fueron
evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Una (1) muestra no estaba disponible para analizar. Cinco (5) de
estas muestras dieron negativas para C. difficile, y tres (3) positivas.
C. difficile como por el cultivo de citotoxicidad enriquecido. Cinco (5) muestras (0,75%) fueron no válidas
en el ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile al analizarlas inicialmente. Todas las cinco (5) muestras
arrojaron un resultado válido al volver a analizarlas de acuerdo con el Quidel Molecular Direct C. difficile
(3 fueron negativas, 2 fueron positivas). Calculamos el rendimiento clínico en función del resultado de la
prueba inicial obtenido para cada muestra. Por lo tanto, los siguientes datos son para las seiscientos
sesenta (660) muestras restantes.
POS
NEG
Total
Ensayo Quidel
POS
103
15*
118
Molecular Direct C.
difficile en el Cepheid
NEG
22**
520
542
SmartCycler II
Total
125
535
660
Sensibilidad
Especificidad
82,4%
97,9%
CI 95%
74,8%
88,1%
95,4%
98,3%
* Quince (15) muestras discordantes (Positivos con Quidel Molecular/Negativos con cultivo toxigénico enriquecido) informadas
fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Seis (6) de estas muestras dieron positivas para C. difficile,
y nueve (9) de estas muestras dieron negativas.
** Diecinueve (19) de las veintidós (22) muestras discordantes (Negativos con Quidel/Positivos con cultivo toxigénico enriquecido)
informadas fueron evaluadas con un dispositivo molecular aprobado por la FDA. Tres (3) muestras no estaban disponibles para
analizar. Diez (10) de estas muestras dieron positivas para C. difficile, y nueve (9) negativas.
Rendimiento analítico
Nivel de detección
La sensibilidad analítica (límite de detección o LoD) del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se determinó
mediante cultivos cuantificados (ufc/ml) de dos cepas de C. difficile (ATCC BAA-1870 y ATCC BAA-1872) de las
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que se hicieron diluciones seriadas con matriz fecal negativa. La sensibilidad analítica (LoD) se define como la
concentración más baja en la cual el 95% de todos los duplicados dieron positivo.
Designación de
cepas
Toxinotipo
Ufc/ml calculado al
LoD
Ufc por ensayo
al LoD
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
IIIb
0
8,4E+04
2,4E+04
4,2E-01
1,2E-01
Resultados de
confirmación del
LoD
60/60
59/60
Designación de
cepas
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Toxinotipo
Ufc/ml calculado al
LoD
Ufc por ensayo
al LoD
IIIb
0
8,4E+04
8,0E+03
4,2E-01
4,0E-02
Resultados de
confirmación del
LoD
20/20
20/20
Designación de
cepas
ATCC BAA-1870
ATCC BAA-1872
Toxinotipo
Ufc/ml calculado al
LoD
Ufc por ensayo
al LoD
IIIb
0
8,4E+04
2,4E+04
4,2E-01
1,2E-01
Resultados de
confirmación del
LoD
58/60
60/60
Reactividad analítica (inclusividad)
La reactividad analítica del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se determinó mediante cultivos
cuantificados (ufc/ensayo) de cepas de C. difficile de distintos toxinotipos, que incluyen cepas hipervirulentas;
las cepas cuantificadas se diluyeron en una matriz fecal negativa de 2 a 3X LoD.
Cepa de C. difficile
Toxinotipo
Concentración
(ufc/ensayo)
Resultado
ATCC 43255
0
5,0E-2
Positivo
CCUG 8864
X
1,2E-01
Positivo
CCUG 37770
IV
6,6E-01
Positivo
ATCC BAA-1875
V
9,8E-01
Positivo
ATCC 43598
VIII
1,14E+00
Positivo
CCUG 37774
XXIII
1,0E-01
Positivo
CCUG 9004
N/A
9,5E-01
Positivo
ATCC BAA-1874
0
2,0 E-01
Positivo
ATCC 43600
0
7,4 E-01
Positivo
ATCC BAA-1871
0
3,0 E-02
Positivo
ATCC BAA-1803
IIIc
1,2 E-01
Positivo
ATCC 700792
0
1,11 E+00
Positivo
ATCC 43599
0
1,3 E-01
Positivo
CCUG 60276
N/A
1,01 E-01
Positivo
CCUG 60275
N/A
6,8 E-01
Positivo
CCUG 37778
N/A
3,4 E-01
Positivo
CCUG 37777
N/A
7,3 E-01
Positivo
CCUG 37776
N/A
1,6 E-01
Positivo
Página 22 de 29
Cepa de C. difficile
Toxinotipo
Concentración
(ufc/ensayo)
Resultado
CCUG 37773
N/A
9,0 E-02
Positivo
ATCC 17857
0
5,6 E-01
Positivo
ATCC 43594
0
8,0 E-02
Positivo
ATCC 43596
0
7,3 E-01
Positivo
ATCC BAA-1872
0
4,2E-01
Positivo
ATCC BAA-1870
IIIb
1,2E-01
Positivo
Especificidad analítica (Reactividad cruzada e interferencia microbiológica)
La especificidad analítica del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se evaluó por medio de pruebas en un
panel de sesenta y seis (66) microorganismos bacterianos, virales y levaduras, para representar patógenos
entéricos frecuentes, flora o ácido nucleico que se encuentran comúnmente en el intestino, así como en el
ADN humano. Los microorganismos o el ácido nucleico se mezclaron con una matriz negativa combinada y se
evaluaron directamente o en presencia de un nivel de 2 a 3 veces el LoD de C. difficile para determinar la
reactividad cruzada y la interferencia microbiológica, respectivamente. Estos estudios se realizaron solo en el
ABI 7500.
Las tablas que se muestran a continuación resumen los datos obtenidos a partir de estos estudios. No se
observó interferencia ni evidencia de reactividad cruzada entre ninguno de los miembros del panel y el ensayo
ID de los
microorganismos
subespecie faecalis
Bacillus cereus
Campylobacter coli*
Campylobacter jejuni
subespecie jejuni
Candida albicans
Clostridium difficile (no
toxigénico)
Clostridium difficile (no
toxigénico)
Clostridium
haemolyticum*
Clostridium novyi
(Cepa: Tipo A)
Identificación
Concentración
analizada
(ufc/ml o
ufp/ml)
Reactividad
cruzada
Resultado
de C.
difficile
ZM 081597
ATCC 7966
5,27E+08
2,09E+10
Negativo
Negativo
Resultados
Interferencia
microbiológica
Resultado de
C. difficile
ATCC BAA1870
Positivo
Positivo
ATCC 15554
4,65E+09
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 13472
CCUG 4856
CCUG 36995
1,00E+07
1,77E+08
5,30E+08
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 33292
1,72E+07
Negativo
Positivo
Positivo
Interferencia
microbiológica
Resultado de
C. difficile
ATCC BAA1872
Positivo
Positivo
ATCC 10231
3,00E+07
ATCC 8090
2,38E+09
ATCC 638
2,05E+07
Análisis in silico
CCUG 47601
1,75E+07
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
No se observó reactividad cruzada in silico
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 43601
4,58E+06
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 43593
1,13E+06
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 9650
3,43E+09
Negativo
Positivo
Positivo
CCUG 57219
ATCC 49531
6,50E+06
5,30E+06
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ZM 0801585
3,37E+07
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 35704
ATCC 12464
1,62E+07
6,60E+09
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Página 23 de 29
ID de los
microorganismos
Edwardsiella tarda
Enterococcus faecalis
vanB
Escherichia coli
Helicobacter pylori
Klebsielia oxytoca
(Serotipo 1/2b)
Peptostreptococcus
anaerobius
Porphyromonas
asaccharolytica
Prevotella
melaninogénica
Proteus mirabilis
(typhimurium)
Salmonella enterica
subespecie Arizonae
(antes denominada
Salmonella enterica
subespecie enterica
(antes denominada
Salmonella choleraesuis)
Serratia marcescens
Shigella boydii
Shigella sonnei
Staphylococcus
epidermidis
Identificación
Concentración
analizada
(ufc/ml o
ufp/ml)
Reactividad
cruzada
Resultado
de C.
difficile
ATCC 9714
Z077
CCUG 6329
CCUG 9284
CCUG 33098
CCUG 36938
CCUG 43123
CCUG 47545
CCUG 59819
ATCC 11437
ATCC 15947
ATCC 13048
ATCC 13047
1,94E+06
2,07E+08
9,85+E07
6,50E+07
2,00E+07
5,55E+07
2,50E+07
1,36E+07
7,00E+06
3,55E+07
2,03E+09
1,31E+10
5,95E+08
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Resultados
Interferencia
microbiológica
Resultado de
C. difficile
ATCC BAA1870
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 51299
3,45E+09
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 23511
ZM 0801622
ZM 0801486
ATCC 33496
ATCC 4356
1,92E+09
2,20E+09
3,57E+06
1,63E+09
6,82E+07
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ZM 0801534
1,18E+10
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 27337
5,80E+08
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 14029
1,40E+08
Negativo
Positivo
Positivo
CCUG 7834
1,30E+07
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 25845
5,10E+08
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 25933
ATCC 9886
ATCC 35554
1,06E+09
9,60E+08
2,60E+10
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 14028
3,55E+10
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 13314
4,22E+09
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 7001
6,80E+09
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 27592
ZM 0801723
ATCC 9207
ATCC 49557
ATCC 29930
ATCC 43300
3,79E+10
6,10E+08
8,16E+08
1,26E+10
3,36E+08
6,00E+07
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
ATCC 14990
4,00E+08
Negativo
Positivo
Positivo
ATCC 12386
2,75E+08
Negativo
Positivo
Positivo
Interferencia
microbiológica
Resultado de
C. difficile
ATCC BAA1872
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Página 24 de 29
ID de los
microorganismos
(streptococcus del grupo
B)
Adenovirus 1 VR-1*
Rotavirus (Cepa: WA)*
Norovirus GII
Enterovirus 71
Echovirus 6
Virus Coxsakie B4
Citomegalovirus Towne
VR-977
Resultados
Interferencia
microbiológica
Resultado de
C. difficile
ATCC BAA1870
Interferencia
microbiológica
Resultado de
C. difficile
ATCC BAA1872
Concentración
analizada
(ufc/ml o
ufp/ml)
Reactividad
cruzada
Resultado
de C.
difficile
ATCC 17802
DHI 62207
ZM
NATROTA-ST
ZM
NATNOVII-ST
DHI 80406
DHI 121506
DHI 92206
9,50E+06
5,67E+05
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
2,32E+08
Negativo
Positivo
Positivo
3,92E+08
Negativo
Positivo
Positivo
4,82E+05
1,05E+09
2,43E+07
Negativo
Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
DHI 201006
1,48E+06
Negativo
Positivo
Positivo
Identificación
Promega
184 µg/ml
Negativo
Positivo
Positivo
G3041
*Para la evaluación de estos organismos se utilizó ácido nucleico purificado. Los recuentos celulares fueron
aproximados y se hicieron en base a la concentración de ácido nucleico y el tamaño del genoma.
ADN genómico humano
Especificidad analítica – sustancias interferentes
El rendimiento del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile se evaluó con sustancias potencialmente
interferentes que pueden estar presentes en las muestras de materia fecal. Las sustancias potencialmente
interferentes se evaluaron a niveles relevantes, utilizando las cepas BAA-1870 y BAA-1872 de C. difficile a una
concentración de 2 a 3x LoD. No se encontró evidencia de interferencia causada por las siguientes 35
sustancias analizadas: Ácido palmítico, triclosán, meticilina, HCl de fenilefrina, ácido esteárico, aceite mineral,
naproxeno sódico, hidróxido de aluminio, hidróxido de magnesio, mucina, sulfato de bario, cimetidina,
esomeprazol, hidrato de magnesio, nistatina, albúmina sérica humana, subsalicilato de bismuto, etanol,
carbonato de calcio, glucosa, HCl de loperamida, hemoglobina humana, cloruro de benzalconio, ácido
5-aminosalicílico, gelatina de petróleo, cortisol, óxido de cinc, senósidos, sangre completa, nonoxinol-9, sal de
nitrato de miconazol, hidróxido de aluminio o carbonato de magnesio, hamamelis, HCl de vancomicina y IgA
humana.
Estudio de reproducibilidad
La reproducibilidad del ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile fue evaluada en 3 sitios de laboratorio. La
reproducibilidad fue evaluada mediante un panel de 4 muestras simuladas que incluían concentraciones
medias (5x LoD), bajas (2x LoD) y negativas altas (0,3x LoD) de especímenes de C. difficile y muestras negativas.
Los paneles y los controles fueron analizados en cada sitio por 2 operadores durante 5 días (triplicando el
análisis x 2 operadores durante 5 días x 3 sitios = 90 resultados por nivel). Los valores de LoD se tomaron a
partir de los valores obtenidos en el estudio de LoD. Los paneles y los controles se extrajeron y se analizaron
en los instrumentos Applied Biosystems 7500 Fast DX, Life Technologies QuantStudio Dx y Cepheid
SmartCycler II.
Resultados de reproducibilidad: Applied Biosystems 7500 Fast DX
Sitio 1
Sitio 2
ID del
integrante
Resultados AVE %CV Resultados AVE %CV
del panel
Ct
Ct
Negativas
altas
5/29
28,8 15,0 11/30
27,1 9,0
0,3x LoD
Positivas
bajas
29/30
23,2 8,4
30/30
22,7 7,5
2x LoD
Positivas
30/30
20,5 5,7
30/30
20,2 5,0
Sitio 3
Resultados AVE Ct %CV
Resultados
totales
16/30
27,6
2,8
32/89
29/30
23,1
6,5
88/90
30/30
20,4
5,0
90/90
Página 25 de 29
Resultados de reproducibilidad: Applied Biosystems 7500 Fast DX
Sitio 1
Sitio 2
ID del
integrante
del panel
Ct
Ct
medias 5x
LoD
Espécimen
0/29
N/A N/A 0/30
N/A N/A
negativo
Control
0/30
N/A N/A 0/30
N/A N/A
negativo
Control
30/30
15,8 2,9
30/30
16,2 2,6
positivo
Resultados de reproducibilidad: Life Technologies QuantStudio Dx
Sitio 1
Sitio 2
ID del
integrante
del panel
Ct
Ct
Negativas
altas
8/30
22,9 5,0
15/30
22,5 5,7
0,3x LoD
Positivas
bajas
30/30
20,4 5,9
30/30
19,0 5,1
2x LoD
Positivas
medias 5x
30/30
18,4 4,2
30/30
17,5 2,2
LoD
Espécimen
0/30
N/A N/A 0/30
N/A N/A
negativo
Control
0/30
N/A N/A 0/30
N/A N/A
negativo
Control
30/30
15,7 0,6
30/30
15,7 0,1
positivo
Resultados de reproducibilidad: Cepheid SmartCycler II
Sitio 1
Sitio 2
ID del
integrante
Resultados AVE %CV Resultados AVE
del panel
Ct
Ct
Negativas
altas
17/30
23,4 6,6
22/30
25,3
0,3x LoD
Positivas
bajas
29/30
20,1 4,6
29/29
20,1
2x LoD
Positivas
medias 5x
30/30
18,4 9,5
30/30
18,5
LoD
Espécimen
0/30
N/A N/A 0/30
N/A
negativo
Control
0/30
N/A N/A 0/30
N/A
negativo
Control
30/30
15,1 3,8
30/30
14,8
positivo
Sitio 3
Resultados
totales
0/30
N/A
N/A
0/89
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
15,7
2,9
90/90
Sitio 3
Resultados
totales
15/30
22,5
1,5
38/90
30/30
19,2
0,8
90/90
30/30
17,9
0,7
90/90
0/30
N/A
N/A
0/90
0/30
N/A
N/A
0/90
30/30
15,5
0,1
90/90
%CV
Sitio 3
13,4
26/30
23,4
9,3
65/90
5,1
30/30
19,9
6,4
88/89
3,1
30/30
18,3
6,4
90/90
N/A
0/29
N/A
N/A
0/89
N/A
0/29
N/A
N/A
0/89
2,2
30/30
14,5
3,4
90/90
Resultados
totales
Análisis de contaminación cruzada y de arrastre
En estudios internos, en todas las tres plataformas, no hubo evidencia de contaminación cruzada con el ensayo
Página 26 de 29
Atención al cliente y servicio técnico
Para hacer un pedido o solicitar servicio técnico, póngase en contacto con un representante de Quidel
llamando al (800) 874-1517 (teléfono gratuito en los EE. UU.) o al (858) 552-1100 (fuera de los EE. UU.), de
lunes a viernes, de 8:00 a. m. a 5:00 p. m. hora de la costa este de EE. UU. También pueden realizarse pedidos
por fax al (740) 592-9820. Para solicitar asistencia por correo electrónico, envíe mensaje a
[email protected] o a [email protected]. Para obtener asistencia fuera de los EE. UU., póngase
en contacto con su distribuidor local. Puede obtener información adicional sobre Quidel, nuestros productos y
nuestros distribuidores en el sitio web: quidel.com.
Propiedad intelectual
Marcas comerciales
SmartCycler® es una marca registrada de Cepheid Corporation. Applied Biosystems® es una marca registrada
de Life Technologies. QuantStudio™ es una marca registrada de Life Technologies. TaqMan® es una marca
registrada de Roche. CAL Flour® Orange 560 y Quasar® 670 son marcas registradas de BioSearch Technologies,
Inc.
Patentes
Los colorantes utilizados en este producto se venden con licencia de BioSearch Technologies, Inc., y están
protegidos por patentes estadounidenses y mundiales vigentes o en trámite.
La compra de este producto concede al comprador derechos, bajo determinadas patentes de Roche, para su
uso exclusivo en servicios de diagnóstico in vitro en humanos. La compra no da derecho a ninguna patente
general ni a ningún otro tipo de licencia aparte del derecho específico de uso especificado aquí.
Página 27 de 29
Glosario
Contenido/Contiene
Control
Consulte las instrucciones de uso
Indicaciones
96
Contiene una cantidad suficiente para 96
determinaciones
Riesgos biológicos
Página 28 de 29
Referencias
1
2
Sloan, L. M., B. J. Duresko, D. R. Gustafson y J. E. Rosenblatt. 2008. Comparison of Real-Time PCR for
Archibald, L. K., S. N. Banerjee y W. R. Jarvis. 2004. Secular trends in hospital-acquired Clostridium difficile
M105 – Kit de ensayo Quidel Molecular Direct C. difficile
MDSS GmBH
Schiffgraben 41
30175 Hannover,
Alemania
Quidel Corporation
Oficina Central Mundial
San Diego, CA 92121 EE. UU.
quidel.com
M105en v2013MAR13
Página 29 de 29

C. difficile Assay

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