Consuntivo Ricerca Scientifica 2014

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UNIVERSITÀ DI MILANO
“CENTRO DINO FERRARI”
PER LA DIAGNOSI E LA TERAPIA DELLE MALATTIE
NEUROMUSCOLARI E NEURODEGENERATIVE
FONDAZIONE I.R.C.C.S. CA’ GRANDA
OSPEDALE MAGGIORE POLICLINICO
FONDAZIONE DI RICOVERO E CURA A CARATTERE
SCIENTIFICO DI NATURA PUBBLICA
CONSUNTIVO DELLA RICERCA
SCIENTIFICA
2014
DIRETTORE PROF. NEREO BRESOLIN
Via F. Sforza, 35 - 20122 Milano – Tel. 02.5503.3809 - Fax 02.5503.3800
E-mail: [email protected] - [email protected] - www.centrodinoferrari.com
SEZIONI DEL “CENTRO DINO FERRARI”
LABORATORIO RADIOISOTOPI DI BIOCHIMICA E GENETICA
Pag.
LABORATORIO DI NEUROIMMUNOLOGIA CLINICA
Pag. 29
LABORATORIO CELLULE STAMINALI NEURALI
Pag. 41
U.O.S.D. MALATTIE NEURODEGENERATIVE
Pag. 55
LABORATORIO DI CELLULE STAMINALI
Pag. 69
U.O.S.D. MALATTIE NEUROMUSCOLARI E RARE
Pag. 81
SEDE DISTACCATA DEL “CENTRO DINO FERRARI” PRESSO
U.O.NEUROLOGIA – STROKE UNIT E LABORATORIO DI NEUROSCIENZE UNVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
I.R.C.C.S. ITITUTO AUXOLOGICO ITALIANO
Pag. 95
SEDE DISTACCATA DEL “CENTRO DINO FERRARI” PRESSO IL LA
BORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE, CITOGENETICA,
ANALISI BIOCHIMICO-CLINICHE, BIOINFORMATICA – I.R.C.C.S. E.
MEDEA
Pag. 117
3
LABORATORIO RADIOISOTOPI DI BIOCHIMICA E GENETICA
Responsabile:
Prof. Giacomo P. Comi, Professore Associato
Medici:
Dott.ssa Stefania Corti
Dott.ssa Francesca Magri
Dott. Alessio Di Fonzo
Dott.ssa Sara Bonato
Dott.ssa Michela Ranieri
Dott.ssa Alessandra Govoni
Dott.ssa Giulietta Riboldi
Dott.ssa Simona Brajkovic
Dott.ssa Roberta Brusa
Biologi:
Dott. Roberto Del Bo
Dott.ssa Sabrina Lucchiari
Dott.ssa Sabrina Salani
Dott.ssa Gianna Ulzi
Dott.ssa Domenica Saccomanno
Dott.ssa Daniela Piga
Biotecnologi:
Dott. Dario Ronchi
Dott.ssa Serena Pagliarani
Dott.ssa Mafalda Rizzuti
Dott.ssa Valentina Melzi
Tecnici:
Sig.ra Andreina Bordoni
Sig. Francesco Fortunato
3
PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA 2014
STUDIO DELLE MALATTIE MITOCONDRIALI
Nel corso del 2014 il Laboratorio di Biochimica e Genetica del Centro Dino Ferrari diretto dal
professor Giacomo Pietro Comi ha continuato le indagini molecolari e biochimiche in pazienti
pediatrici e adulti affetti da malattie riconducibili a un difetto nel metabolismo ossidativo.
In particolare, è stata riesaminata l’intera casistica di pazienti affetti da miopatia caratterizzata
da accumulo di DNA mitocondriale parzialmente difettivo (sindromi da delezioni multiple del
DNA mitocondriale). Questa revisione delle caratteristiche cliniche, biochimiche e molecolari
ci ha consentito di evidenziare elementi peculiari associati a mutazioni negli stessi geni o
nelle proteine appartenenti ai medesimi pathways. Il database che ne è derivato, costituisce la
base per la ricerca razionale (gene candidato) oppure unbiased (next-generation sequencing)
per la ricerca di ulteriori cause molecolari.
Un altro dei temi affrontati riguarda come la disfunzione mitocondriale contribuisca alla
patogenesi di malattie neurodegenerative dell’adulto come la Sclerosi Laterale Amiotrofica o
l’Atrofia Multisistemica.
1) Malattie mitocondriali associate ad accumulo di delezioni multiple del mtDNA:
patogenesi molecolare e variabilità̀ fenotipica
Le malattie mitocondriali presentano una grande eterogeneità nelle manifestazioni fenotipiche
e nei meccanismi eziopatogenetici a essi sottesi. La variabilità della clinica e la non specificità
della maggior parte dei marcatori disponibili rendono difficoltoso per il clinico la definizione
della diagnosi e della prognosi sia nell’adulto che nel bambino.
Negli ultimi 20 anni numerosi difetti in geni nucleari codificanti per proteine coinvolte
nell’omeostasi del DNA mitocondriale (mtDNA) sono stati associati a reperti peculiari, come
l’accumulo muscolare di delezioni multiple del mtDNA, osservabile mediante specifici saggi
di Southern blot e di PCR.
In questo lavoro, sono stati studiati 133 pazienti di età compresa tra i 15 e 85 anni afferenti
presso il Centro Dino Ferrari negli ultimi 20 anni con una clinica suggestiva di malattia
mitocondriale e documentato accumulo di delezioni multiple nel muscolo. I dati clinici,
genetici, biochimici e istologici disponibili sono stati organizzati in un database per valutare
l’eventuale presenza di correlazioni genotipo-fenotipo. È stato poi eseguito uno studio
approfondito del DNA mitocondriale muscolare attraverso metodiche tradizionali e
quantitative per identificare dei pattern tipici predittivi di coinvolgimento di un singolo gene o
gruppo di geni. Quest’analisi ha consentito di correlare specifiche alterazioni del DNA
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mitocondriale a specifici difetti molecolari. Questi risultati potrebbero essere utili per
individuare mutazioni causative in nuovi geni anche nel gruppo di pazienti attualmente privi
di diagnosi.
Infine, le informazioni raccolte nel database hanno guidato la selezione di un gruppo di
pazienti in cui effettuare lo screening dei geni SPG7 e CHCD10, recentemente associati a
malattie neurodegenerative con alterata omeostasi del DNA mitocondriale, individuando una
mutazione recessiva in SPG7 in uno di essi.
Pubblicazioni su riviste internazionali
Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Donati A, Minetti C,
Moggio M, Mongini T, Servidei S, Tonin P, Toscano A, Uziel G, Bruno C,Ienco EC, Filosto
M, Lamperti C, Catteruccia M, Moroni I, Musumeci O, Pegoraro E, Ronchi D, Santorelli FM,
Sauchelli D, Scarpelli M, Sciacco M, Valentino ML, Vercelli L, Zeviani M, Siciliano G. The
m.3243A>G mitochondrial DNA mutation and related phenotypes. A matter of gender? J
Neurol. 2014 Mar;261(3):504-10. doi: 10.1007/s00415-013-7225-3.
Abstract presentati a congressi internazionali
Ronchi D., SciaccoM., Bordoni A., Colombo I., Piga D., Fortunato F., Moggio M., Comi G.P.
The novel non-sense mutation m.4214G>A in MT-ND1 results in mitochondrial myopathy
with severe complex I deficiency
19th International Congress of The World Muscle Society, 7-11 October 2014 Berlin,
Germany.
Abstract presentati a congressi nazionali
Ronchi D., Ahmed N., Di Fonzo A., Bordoni A., Piga D., Rizzuti M., Melzi V., Corti S.,
Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. The application of next-generation
sequencing in the discovery of novel genetic defects in adult patients affected by
mitochondrial disorders featuring muscle mtDNA instability.
Il sequenziamento di nuova generazione in genetica umana e medica. Convegno nazionale
della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU), 30-31 Ottobre 2014 Bologna.
Ronchi D., Di Fonzo A. Ahmed N., Piga D., Bordoni A., Rizzuti M., Corti S., Bresolin N.,
Comi G.P. In-depth analysis of muscle mitochondrial DNA in adult onset disorders featuring
mitochondrial genome instability. 2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014,
Milano.
2) Il ruolo del metabolismo del Coenzima Q10 nell’Atrofia Multisistemica (MSA)
L’atrofia multisistemica (MSA) è una malattie neurodegenerativa ad eziologia ignota,
caratterizzata dalla perdita delle funzione autonome in combinazione con parkinsonismo poco
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responsivo alla Levodopa, disfunzione cerebellare e segni piramidali. Mutazioni recessive nel
gene COQ2, che codifica per un enzima coinvolto nella biosintesi del Coenzima Q10, sono
state recentemente descritte in un singolo studio come possibili cause nelle forme familiari e
sporadiche di MSA.
Abbiamo deciso di analizzare il gene COQ2 in una corte di 14 pazienti con diagnosi di MSA
probabile (tipo P: 2 casi familiari e 12 apparentemente sporadici) e 6 pazienti sporadici con
MSA di tipo C. Questo screening ci ha consentito di individuare uan nuova variante
omozigote (p.A43G) in un paziente italiano sporadico con MSA-C, assente nei controlli. In
più abbiamo evidenziato la variante eterozigote p.N180S in un singolo paziente con MSA-P.
Questa variante cade in un dominio transmembrana precedentemente implicato in malattie
con alterato metabolismo del Coenzima Q10. Un set di saggi molecolari, proteici e biochimici
(in collaborazione con il Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie dell’Università di
Bologna, prof.sa Fato) ci ha permesso di analizzare le conseguenze di queste varianti in
tessuti umani patologici e di controllo. Siamo arrivati alla conclusione che la variante
omozigote identificata non ha particolari effetti funzionali sulla espressione del gene COQ2,
la maturazione della proteina o la biosintesi di Coenzima Q10.
La nostra esperienza ci porta a dire che mutazioni nel gene COQ2 non rappresentano una
causa comune di MSA nei pazienti familiari e sporadici con MSA nella popolazione italiana,
parimenti a quanto osservato da altri ricercatori in altri gruppi di pazienti.
Ronchi D., Bonato S., Di Biase E., Melzi V., Trezzi I., Corti S., Bresolin N., Comi G.P., Di
Fonzo A. Mutational analysis of COQ2 in Italian patients with MSA.
American Academy of Neurology 66th Annual Meeting, April 26 to May 3, 2014 in
Philadelphia, PA, USA.
ASPETTI GENETICI NELLE AMIOTROFIE SPINALI (SMA)
Il Laboratorio di Biochimica e Genetica è un punto di riferimento nazionale per la diagnosi
dell’Amiotrofia Spinale 5q (SMA5q) e ha partecipato negli ultimi anni anche alla definizione
di nuovi difetti molecolari associati ad altre forme di amiotrofia spinale. Nel corso del 2014
abbiamo descritto una nuova e rara variante di splicing nel gene SMN1 e abbiamo concluso lo
studio, iniziato nel 2010, sul coinvolgimento del gene MAPT (proteina Tau) in una forma ad
esordio adulto di amiotrofia spinale.
1) Una nuova mutazione di splicing in SMN1 determina un fenotipo di SMA-I molto
grave in un paziente italiano.
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In questo case report abbiamo identificato un genotipo piuttosto insolito nella SMA5q che è
classicamente associata a delezioni omozigoti nel gene SMN1 oppure alla presenza di una
delezione in eterozigosi composita con una variante missense. Gli effetti delle varianti
puntiformi sono difficilmente prevedibili e ancora più rari sono i contributi che hanno per
oggetto varianti di splicing. Abbiamo descritto una nuova mutazione nel gene SMN1 che
interessa il sito donatore di splicing dell’esone 7. Analisi del trascritto condotte su RNA
estratto da linfociti hanno permesso di chiarire il grave effetto di questa variante che
impedisce in modo quasi assoluto l’inclusione dell’esone 7 nell’mRNA del paziente. La
presenza di una sola copia di SMN2 non è in grado di compensare di questo difetto e porta ad
una forma aggressiva di SMA con esordio o precoce e esito fatale a 4 mesi.
Ronchi D, Previtali SC, Sora MG, Barera G, Del Menico B, Corti S, Bresolin N, Comi GP.
Novel Splice-Site Mutation in SMN1 Associated with a very Severe SMA-I Phenotype. J Mol
Neurosci. 2015 Jan 9. [Epub ahead of print]
Ronchi D., Ripolone M., Barca E., Berardinelli A., Mora M., Morandi L., Bordoni A.,
Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Vallejo D., Corti S, Toscano A., Sciacco M., Di Mauro
S., Comi G.P., Moggio M.. Defective muscle mitochondrial biogenesis in spinal muscular
atrophy
Ronchi D., Previtali S., Magri F., Corti S., Comi G.P. A novel splice-site mutation in SMN1
resulting in a very severe SMA1 phenotype
Germany.
Ronchi D., Ripolone M., Rizzuti M., Bordoni A., Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Corti
S., Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P. Defective muscle mitochondrial
biogenesis and delayed muscle maturation in spinal muscular atrophy
2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano
Ripolone M., Ronchi D., Violano R., Vallejo D., Fagiolari G., Lucchini V., Barca E.,
Berardinelli A., Ballottin U., Morandi L., Mora M., Toscano A., Grimoldi N., Tiberio F.,
Bordoni A., Fortunato F., Corti S., Di Mauro S., Comi G.P., Sciacco M., Moggio M. Muscle
mitochondrial dysfunction due to defective mitochondrial biogenesis in SMA patients.
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XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione 2014
2) Una nuova mutazione nel gene MAPT associata ad una forma ad esordio adulto di
amiotrofia spinale senza demenza in una grande famiglia italiana.
Le probande da cui è partito lo studio sono due sorelle, ampiamente caratterizzate da un punto
di vista clinico. Cause molecolari in geni noti potenzialmente responsabili della loro
condizione sono state escluse mediante sequenzialmente diretto.
Attraverso un’analisi di linkage effettuata con microarray genomici, abbiamo individuato una
regione del cromosoma 17 quale locus candidato principale. In questa regione trova sede il
gene MAPT, codificante per la proteina TAU. La proteina TAU integra la struttura dei
neuroni, stabilizzando il sistema dei microtubuli. Mutazioni nella proteina TAU sembrano
perturbare l'architettura dei neuroni, interferendo con i fenomeni di comunicazione e scambio
fra le cellule nervose. Mutazioni nel suo gene codificante sono state associate a numerosi
fenotipi ma in particolare a demenza frontotemporale (FTD, MIM#600274), una forma
relativamente rara di demenza, che colpisce in genere pazienti con una fascia di età precoce
rispetto alla malattia di Alzheimer e generalmente compresa fra i 50 ed 60 anni di età.
La sequenza del gene MAPT nei soggetti affetti della famiglia attualmente studiata ha portato
alla identificazione di una nuova variante nell’esone 12 del gene MAPT. Questa variante
segrega con la malattia ed è assente in più di 300 cromosomi controllo della popolazione
italiana.
Abbiamo allestito linee cellulari di neuroblastoma e cellule NSC34 che sono state stabilmente
trasfettate con un vettore per l’espressione di MAPT (4R e 3R) wildtype e mutata. Dopo
l’induzione di un fenotipo neuronale abbiamo eseguito analisi proteiche mediante western
blot e studi di immunocitochimica. Le cellule che esprimono la forma mutata sembrano
manifestare una riduzione del processo di accrescimento dei neuriti e una ridotto
localizzazione tra Tau e microtubuli. Un saggio per studiare il binding tra la proteina mutata e
il network microtubulare non ha evidenziato particolari effetti in presenza della mutazione
mentre lo studio di specifici marcatori proteici ci ha consentito di ipotizzare la riduzione della
clearence mediata dal proteasoma della proteina mutata. Lo studio neuropatologico di una
delle probande ci ha consentito di definire meglio gli aspetti qualitativi e quantitativi della
morte moto neuronale osservata in questa peculiare forma di “taupatia”.
Reference
Di Fonzo A, Ronchi D, Gallia F, Cribiù FM, Trezzi I, Vetro A, Della Mina E, Limongelli I,
Bellazzi R, Ricca I, Micieli G, Fassone E, Rizzuti M, Bordoni A, Fortunato F, Salani S, Mora
8
G, Corti S, Ceroni M, Bosari S, Zuffardi O, Bresolin N, Nobile-Orazio E, Comi GP. Lower
motor neuron disease with respiratory failure caused by a novel MAPT mutation. Neurology.
2014 Jun 3;82(22):1990-8.
ASPETTI GENETICI NELLA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
1) Screening del gene CHCHD10 in pazienti familiari e sporadici con SLA, FTD e SLAFTD.
Alcuni recenti lavori hanno identificato mutazioni nel gene CHCHD10 causative di vari tipi
di malattie del motoneurone e, in particolare, di SLA con segni di demenza. CHCHD10
codifica
per
una
proteina
dello
spazio
mitocondriale
transmembrana,
coinvolta
nell’assemblaggio della catena respiratoria. Lo studio originale identifica una mutazione in
una famiglia francese con SLA-FTD, segni cerebellari e ipoacusia neurosensoriale. Ulteriori
mutazioni sono state poi osservate in casi familiari tedeschi, finlandesi e nord americani così
come in pazienti sporadici, prevalentemente bulbari. CHCHD10 è stato anche coinvolto in
una forma ad esordio adulto di amiotrofia spinale e in un caso familiare di miopatia
mitocondriale apparentemente pura.
Dato che alcuni anni fa abbiamo evidenziato come la disfunzione mitocondriale muscolare sia
un reperto comune nella SLA sporadica (talvolta in grado di precedere la disfunzione
motoneuronale), abbiamo deciso di investigare CHCHD10 in 222 pazienti sporadici (11 dei
quali con SLA-FTD), 16 casi familiari di SLA e 1 caso familiare di SLA-FTD.
Abbiamo identificato la nuova variante eterozigote c.239C>T (p.Pro80Leu) in un paziente
con fenotipo SLA flail arm con esordio a 25 anni che è evoluto nel corso di 8 anni in una
tetraparesi grave con coinvolgimento respiratorio. L’analisi del muscolo bioptico ha
evidenziato una grave riduzione dei complessi della catena respiratoria, il deficit istologico di
Citocromo C Ossidasi ma inalterato DNA mitocondriale. Questa variante è stata anche
osservata in un paziente con una forma classica di SLA. Infine abbiamo identificato la
variante p.P34S in una donna di 75 anni con SLA e deficit cognitivo.
Il nostro studio conferma la modesta ma non trascurabile incidenza delle mutazioni nel gene
CHCHD10 anche nei pazienti italiani con SLA o SLA-FTD sporadica. Questa incidenza è
lievemente inferiore rispetto a quella descritta in altri lavori (1,4% contro 2,6%). Inoltre
varianti nel gene CHCHD10 rafforzano il legame tra disfunzione mitocondriale e malattia del
motoneurone e, di fatto, costituiscono la prima causa diretta di danno mitocondriale nella
SLA. Altri studi sono necessari per capire come questi difetti producano la morte del moto
neurone e possano originare fenotipi anche molto differenti.
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Ronchi D, Riboldi G, Del Bo R, Ticozzi N, Scarlato M, Galimberti D, Corti S, Silani V,
Bresolin N, Comi GP. CHCHD10 mutations in Italian patients with sporadic amyotrophic
lateral sclerosis. Brain. 2015 Jan 8. pii: awu384. [Epub ahead of print]
2) Identificazione del nuovo gene malattia TUBA4A
Lo studio condotto su 363 casi indice affetti da SLA familiare mediante analisi exome wide di
varianti rare ha evidenziato un numero di varianti in TUBA4A, gene codificante per la
proteina Tubulina Alpha 4A. L'exome sequencinq ha rivelato un totale di 5 mutazioni non
sinonime in TUBA4A, tutte localizzate nell'esone 4 e confermate da sequenziamento diretto
in Sanger, nessuna di esse identificata nei controlli e tutte localizzanti in posizioni altamente
conservate della proteina. Tra le mutazioni vi sono due mutazioni missenso nello stesso
residuo (R320C/H) ed una mutazione nonsenso (W407X) che determina la assenza degli
ultimi 41 amminoacidi: tale regione C-terminale prende contatto con la subunità beta-tubulina
così come con il dominio delle chinesine e con altre proteine associate ai microtubuli.
Solamente tre cambiamenti non sinonimi sono stati osservati nei 4300 controlli, tutti stimati
essere benigni.
Analisi mediante sequenziamento di ulteriori 272 casi di SLA familiare e 5510 controlli
interni ha rilevato un eccesso significativo di portatori della mutazione fra i pazienti: la analisi
combinata sulle coorti di identificazione e di replicazione ha rivelato una overespressione
statisticamente significativa di rare varianti; delle due mutazioni osservate nella coorte di
replica, la variante T145P ha segregato con la malattia in una famiglia, mentre una variante
K430N non è stata identificata in un primo cugino affetto del probando sequenziato,
suggerendo che questo è anche un polimorfismo neutro. Non sono state identificate mutazioni
in TUBA4A in 131 campioni SLA con mutazioni/espansioni di repeats noti. Tutti i pazienti
recanti le mutazioni TUBA4A avevano un onset spinale, classica SLA, con segni del primo e
del secondo motoneurone; due casi hanno anche sviluppato declino cognitivo di tipo frontale,
in linea con una diagnosi di FTD.
La capacità di aggregazione dei mutanti di TUBA4A è stata valutata mediante l'espressione di
costrutti di TUBA4A emoagglutinina (HA)-tagged in motoneuroni primari (PMNs) e in
cellule HEK293: la variante W407X non si incorpora nel network di microtubuli e forma
piccole inclusioni citoplasmatiche ubiquitinate in circa il 40% dei PMNs e in circa l'85% delle
HEK293; l'immunoistochimica di tessuto cerebrale e di midollo spinale derivanti da pazienti
SLAs (senza mutazioni) non ha identificato aggregati di TUBA4A. Non è nemmeno stata
osservata co-aggregazione in cellule coesprimenti un frammento C-terminale di TDP-43
prono all'aggregazione insieme a TUBA4A wild type. Mentre gli altri mutanti di TUBA4A
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formano aggregati nel 10-30% delle HEK293, non si hanno aggregati di tali mutanti nei
PMNs ma solo alterazioni nella loro distribuzione (come ad esempio un più diffuso staining
rispetto alla proteina wild-type, che è principalmente incorporata nel network di microtubuli).
E' stata dunque indagata la capacità di TUBA4A mutante di formare efficientemente
microtubuli mediante un sistema cell-free, per quantificare la sua incorporazione in dimeri di
alfa-beta tubulina. Ogni mutante è stato sottoposto a traduzione in vitro (lisato di reticolociti
di coniglio); i prodotti sono poi stati analizzati su gel elettroforesi in condizioni denaturanti
per misurare l'incorporazione della proteina in dimeri di tubulina: la variante
TUBA4AW407X non ha prodotto dimeri distinguibili, mentre la A383T e R320 hanno
mostrato livelli significativamente più bassi di assemblaggio rispetto alla proteina wild-type;
gli altri mutanti non hanno differito dal controllo. In parallelo è stata testata l'incorporazione
di TUBA4A mutante in microtubuli in cellule in coltura (cellule astrogliali primarie),
effettuando un'analisi dell'incorporazione dei costrutti TUBA4A (HA)-tagged; la frazione fra
le intensità di fluorescenza dei filamenti rispetto allo staining totale, che va da 0 a 1, è stato
usato per categorizzare ogni cellula come affetta da fenotipo normale (1-0,75), moderato
(0,75-0,5), o grave (0,25-0). La proteina wild-type ha prodotto circa il 70% di cellule con alto
livello di incorporazione di microtubuli, a differenza dei diversi mutanti di TUBA4A che
hanno mostrato alterata incorporazione in microtubuli, in particolare la TUBA4AW407X, che
ha anche determinato la produzione di multiple inclusioni simil-aggregati.
Dalle analisi funzionali emerge che le TUBA4A mutate destabilizzano il network dei
microtubuli, diminuendo la capacità di ri-polimerizzazione. Queste evidenze enfatizzano
ulteriormente il ruolo patogenetico dei difetti del citoscheletro nella SLA e la potenzialità di
analisi gene-based di varianti rare in situazioni in cui geni causali non riescono ad essere
identificati tramite le tradizionali analisi di segregazione.
In conclusione, quindi, le varianti di TUBA4A associate alla malattia interessano residui
conservati della proteina; risultati ottenuti dalla caratterizzazione biologica hanno fornito una
forte evidenza che supporta l'effetto deleterio della maggior parte delle varianti: in particolare,
le varianti SLAf-associate hanno la caratteristica di formare in modo non efficiente dimeri di
alfa/beta tubulina in vitro, vi è una diminuzione di incorporazione nei microtubuli in colture
cellulari, inibizione dell'assemblaggio del network di microtubuli e riduzione della stabilità
strutturale. Sulla base di queste informazioni, dunque, mutazioni in TUBA4A sembrano
distruggere la dinamica dei microtubuli e la stabilità attraverso un meccanismo dominantenegativo, come dimostrato attraverso la valutazione della abilità di cellule COS7 trasfettate di
ripristinarsi dopo depolimerizzazione transiente di microtubuli. Per questo saggio sono state
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comparate le proteine wild-type, mutante R320C e mutante W407X, queste ultime due
associate rispettivamente a fenotipo intermedio e severo. Mentre l'80% delle cellule trasfettate
con TUBA4A wild-type hanno formato centrosomi positivi per la proteina TUBA4A (HA)tagged entro 5 minuti dalla rimozione di noncodazolo, solo il 20% di cellule trasfettate con
TUBA4AR320C hanno formato nuovi microtubuli contenenti la proteina mutante a 15
minuti. L'espressione di TUBA4A mutante ha anche interferito con la capacità da parte della
proteina endogena di formare microtubuli; risultati simili si sono osservati in cellule
contenenti aggregati TUBA4AW407X-positivi, mentre, al contrario, cellule esprimenti il
mutante TUBA4AW407X senza la presenza di aggregati non hanno mostrato alcun difetto nel
rate di ripolimerizzazione dei microtubuli. Questi risultati suggeriscono che la TUBA4A
mutante può distruggere la dinamica dei microtubuli attraverso un meccanismo dominantenegativo (tramite incorporazione nei microtubuli). Tuttavia, la mutazione troncante
TUBA4AW407X conferisce incapacità nel formare i dimeri o nell'incorporarli nel network di
microtubuli: questo è evidenziato dalla osservazione secondo cui in cellule esprimenti la
mutazione troncante TUBA4AW407X senza aggregati non sembra esserci un evidente difetto
nella ripolimerizzazione dei microtubuli, suggerendo che questo può avere una diminuita
capacità di agire come dominante-negativo. Comunque, dal momento che la variante
TUBA4AW407X mostra tendenza all'aggregazione analogamente ad altre proteine mutanti
associate a SLA, il suo effetto deleterio potrebbe esprimersi attraverso un diverso
meccanismo, come ad esempio il sequestro in aggregati di proteine
tubulina-binding o
attraverso sovraccarico del sistema ubiquitino-proteasoma.
Mutazioni in almeno sette altri membri della famiglia di tubuline (TUBA1A, TUBA8,
TUBB2B, TUBB4A e TUBG1) sono state descritte causare diversi disordini del
neurosviluppo e neurodegenerativi.
La proteina TUBA4A è ubiquitariamente espressa nei tessuti umani, ma in modo maggiore
nel cervello (Rustici et al., 2013). Nonostante sia stata evidenziata una downregolazione dei
geni della subunità alfa tubulina nei motoneuorni di pazienti SLA sporadici (Jiang et al.,
2005), fino ad ora non è stato descritto un ruolo specifico per TUBA4A nei motoneuroni.
TUBA4A si aggiunge quindi ad altri geni associati a SLA codificanti per proteine del
citoscheletro, come PFN1, DCTN1, PRPH e NNEFH, rafforzando così l'ipotesi che
alterazioni che interessano l'architettura e la dinamica del citoscheletro esercitano un
importante ruolo nella patogenesi della SLA.
12
Smith BN, et al. Ticozzi N, Fallini C, Gkazi AS, Topp S, Kenna KP, Scotter EL, Kost J,
Keagle P, Miller JW, Calini D, Vance C, Danielson EW, Troakes C, Tiloca C, Al-Sarraj S,
Lewis EA, King A, Colombrita C, Pensato V, Castellotti B, de Belleroche J, Baas F, Ten
Asbroek AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, McLaughlin RL, Polak M, Asress S, EstebanPérez J, Muñoz-Blanco JL, Simpson M; SLAGEN Consortium, van Rheenen W, Diekstra FP,
Lauria G, Duga S, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G, Morrison KE, Williams KL,
Nicholson GA, Blair IP, Dion PA, Leblond CS, Rouleau GA, Hardiman O, Veldink JH, van
den Berg LH, Al-Chalabi A, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, GarcíaRedondo A, Wu Z, Glass JD, Gellera C, Ratti A, Brown RH Jr, Silani V, Shaw CE, Landers
JE. Exome-wide Rare Variant Analysis Identifies TUBA4A Mutations Associated with
Familial ALS. Neuron. 2014 Oct 22;84(2):324-31.
3) Analisi della variabilità polimorfica del gene KIFAP3
Recentemente il polimorfismo rs1541160 è stato descritto come un importante fattore
genetico in grado di modulare la sopravvivenza nei pazienti affetti da SLA. In particolare,
nello studio condotto da Landers e collaboratori la presenza del genotipo CC si associava ad
una sopravvivenza aumentata di 14 mesi nei pazienti rispetto alla presenza dei genotipi TT e
TC. Il nostro gruppo ha partecipato con la propria coorte di pazienti SLA sporadici in uno
studio multicentrico atto a confermare tale evidenza sperimentale.
Sono stati reclutati un totale di 2362 pazienti (di origine belga, tedesca, irlandese, italiana,
olandese e svedese) dei quali 1220 portatori del genotipo TT, 949 del genotipo CT e 192 (pari
al 8.1%) portatori del genotipo CC.
Attraverso l’analisi di sopravvivenza con il modello Kaplan-Meier le frequenze genotipiche
CC sono state confrontate con quelle degli altri genotipi CT e TT. L’analisi Log-Rank
(Mantel-Cox) non ha evidenziato alcuna differenza significativa in termini di sopravvivenza
tra i genotipi (p=0.26). Anche gli hazard ratio aggiustati per sesso, età di insorgenza e sito i
insorgenza non hanno mostrato alcuna differenza statisticamente significativa.
La sopravvivenza è stata inoltre valutata tenendo conto dei singoli paesi d’origine. Anche in
questo caso non è emerso alcun dato statisticamente significativo.
Presi nella loro totalità i dati di questo studio multicentrico condotto su un’ampia coorte di
pazienti escludono dunque che la variabilità genotipica del gene KIFAP3 rappresenti un
fattore di modulazione nella SLA sporadica.
van Doormaal PT, Ticozzi N, Gellera C, Ratti A, Taroni F, Chiò A, Calvo A, Mora G,
Restagno G, Traynor BJ, Birve A, Lemmens R, van Es MA, Saris CG, Blauw HM, van Vught
13
PW, Groen EJ, Corrado L, Mazzini L, Del Bo R, Corti S, Waibel S, Meyer T, Ludolph AC,
Goris A, van Damme P, Robberecht W, Shatunov A, Fogh I, Andersen PM, D'Alfonso S,
Hardiman O, Cronin S, Rujescu D, Al-Chalabi A, Landers JE, Silani V, van den Berg LH,
Veldink JH. Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter
survival study. Neurobiol Aging. 2014 Oct;35(10):2420.e13-4.
ASPETTI GENETICI NEI DISORDINI DEL MOVIMENTO
I disordini del movimento comprendono un gruppo di patologie caratterizzate da alterazioni
del movimento volontario e presenza di movimenti involontari. Tali disordini vengono
clinicamente classificati in due grandi categorie: disordini di tipo acinetico-rigido, di cui fa
parte la malattia di Parkinson, e disordini di tipo ipercinetico, che comprendono le distonie.
1) Una nuova variante omozigote di PLA2G6 causa dystonia-parkinsonismo.
La neurodegenerazione associata PLA2G6 (PLAN) è una malattia autosomica recessiva
dovuta a mutazioni nel gene che codifica per la fosfolipasi A2. E’ la seconda forma più
frequente di neurodegenerazione con accumulo cerebrale di ferro (NBIA) e solitamente e’
associata a Distrofia Neuroassonale Infantile (INAD). Il fenotipo dell’adulto e’ generalmente
caratterizzato da parkinsonismo, distonia, deficit cognitivo e psichiatrico e atrofia ottica.
In questo studio abbiamo descritto il caso di una donna di 29 anni che si presenta con una
progressiva compromissione della deambulazione da 2 anni dovuta a rigidita’ dell’arto
inferiore destro e incontinenza. Successivamente ha sviluppato distonia generalizzata,
bradicinesia, ipomimia, disartria e segni piramidali. L’esame neuropsicologico ha rivelato
disforia, ansia e anosognosia. Il trattamento con Levodopa ha migliorato i segni motori, ma ha
peggiorato i sintomi psichiatrici. La risonanza magnetica cerebrale mostra depositi di ferro
nella sostanza nera e atrofia subcorticale. Il DAT-SCAN mostra denervazione dopaminergica
bilaterale. Abbiamo quindi effettuato uno screening molecolare dei principali geni associati a
distonia-parkinsonismo, come FBXO7, PARK2, PINK1, DJ-1, ATP13A2 e PLA2G6.
Questo screening ha permesso di individuare la nuova variante missenso omozigote
c.1547C>T nel gene PLA2G6 (NM_003560), che determina il cambiamento aminoacidico
p.Ala516Val. Tale variante è assente in un ampio numero di controlli sani di origine caucasica
ed interessa un residuo aminoacidico altamente conservato tra gli ortologhi; inoltre numerosi
algoritmi, tra cui Polyphen2 e SIFT, ne predicono la patogenicita’. Pertanto l’identificazione
della nuova variante A516V in un caso di dystonia-parkisonismo ad esordio precoce consente
di ampliare lo spettro mutazionale associato al gene PLA2G6.
2) Identificazione di una nuova mutazione di BPAN e evidenze di eterogeneita’ genetica
in casi di NBIA
14
La neurodegenerazione con accumulo di ferro (NBIA, Neurodegeneration with brain iron
accumulation) comprende un gruppo di patologie clinicamente e geneticamente eterogenee
caratterizzate da disturbi extrapiramidali del movimento, declino cognitivo e un caratteristico
deposito di ferro nei gangli della base.
In questo lavoro riportiamo due casi di pazienti con NBIA, su cui sono state effettuate analisi
genetiche. La paziente 1 ha esordito a 2 anni con ritardo psicomotorio ed ha mantenuto
caratteristiche cliniche stabili durante l'infanzia e l'adolescenza. A partire dai 24 anni, è
iniziato un declino delle sue capacità motorie e intellettive e, tre anni dopo, l'esame
neurologico ha rilevato un rallentamento psicomotorio globale con linguaggio quasi assente,
demenza, oftalmoplegia, spasticità e iperreflessia. La risonanza magnetica cerebrale (MRI) ha
rivelato atrofia cerebellare e cortico-sottocorticale sopratentoriale. Le sequenze T2 mostrano
una significativa ipointensità dei nuclei pallidi e della sostanza nera. Le immagini in T1
evidenziano una iperintensità mesencefalica. Il sequenziamento del gene WDR45 ha
permesso di individuare una nuova mutazione di splicing (c.519+1_3delGTG het). La
paziente 2 si presenta a 10 mesi con ipotonia, accompagnata da ritardo motorio e del
linguaggio. A 7 anni è stata diagnosticata con un moderato ritardo mentale e una sindrome
cerebellare. A 32 anni mostra disturbi del linguaggio, lieve oftalmoplegia laterale, riflessi
vivaci, marcato tremore intenzionale e distonico, dismetria e andatura a livello base con
distonia bilaterale del piede. Le sequenze T2 alla risonanza magnetica mostrano ipointensità
dei nuclei dentati, dei nuclei rossi, della sostanza nera e dei nuclei pallidi. Sono stati analizzati
tutti i geni finora associati a NBIA senza pero’ individuare delle varianti patogenetiche.
Anche se i risultati del neuroimaging di entrambi i pazienti risultatano coerenti con una
diagnosi di NBIA, la mancanza di diagnosi molecolare della paziente 2 suggerisce un'ulteriore
eterogeneità genetica.
ASPETTI GENETICI NELLE MALATTIE CEREBROVASCOLARI
Le malformazioni cerebrali cavernose (CCM) sono delle rare malformazioni vascolari del
sistema nervoso centrale. Questa condizione è geneticamente eterogenea ma tradizionalmente
associata a varianti eterozigoti nei geni CCM1/KRIT1, CCM2/malcavernin e CCM3/PDCD10.
In questo studio abbiamo analizzato le caratteristiche cliniche, neuroradiologiche e molecolari
in una famiglia italiana con maformazioni cavernose che interessano anche il midollo spinale.
L’analisi del DNA ci ha consentito di trovare una nuova variante nell’introne 3 del gene
CCM1 (c.263-10A>G), che segregava con il fenotipo ma assente in un gruppo di 340
cromosomi controllo. Abbiamo quindi caratterizzato gli effetti a livello di trascritto di questa
variante, scoprendo che essa consente la parziale ritenzione di una parte dell’introne 3 in
15
grado di produrre un codone di stop prematuro che comporta la perdita dell’espressione
dell’allele. La conoscenza del difetto molecolare nelle forme familiari e sporadiche di CCM è
di grande importanza, anche per l’inclusione dei pazienti in trial clinici di prossimo avvio.
Articoli pubblicati
Lanfranconi S, Ronchi D, Ahmed N, Civelli V, Basilico P, Bresolin N, Comi GP, Corti S. A
novel CCM1 mutation associated with multiple cerebral and vertebral cavernous
malformations. BMC Neurol. 2014 Aug 3;14:158. doi: 10.1186/s12883-014-0158-3.
Lanfranconi, S. Ronchi, D. Ahmed, N. Basilico, P. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. A novel
mutation in KRIT1 gene associated with familial cerebral cavernous malformations
Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, Turkey
STUDIO DELLE MALATTIE DA ACCUMULO DI GLICOGENO
Il nostro laboratorio da molti anni porta avanti lo studio delle malattie dovute all'accumulo
muscolare di glicogeno.
1) Estesa descrizione fenotipica e nuovi difetti molecolari in un gruppo di pazienti del
Nord Italia con glicogenosi di tipo 2 ad esordio adulto.
Nel corso del 2014 i risultati conseguiti negli ultimi anni di studio sulla glicogenosi di tipo 2
(deficit di enzima maltasi acida) sono confluiti in una pubblicazione che rivede la nostra
intera casistica alla luce di studi clinici, biochimici e molecolari.
La glicogenosi di tipo II (Glycogen Storage Disease type 2, GSDII o malattia di Pompe,
OMIM *606800) è una patologia progressiva, spesso fatale, causata da una riduzione
dell’attività dell'alfa-1,4-glucosidasi acida (maltasi acida), un enzima lisosomiale che
idrolizza il glicogeno in glucosio. Questo deficit determina una miopatia prossimale con
accumulo di glicogeno nel fegato, nel cuore e nel muscolo scheletrico. Alla bse della GSDII
vi sono mutazioni recessive nel gene GAA.
Abbiamo rivisto i dati clinici, biochimici e molecolari nella nostra casistica di pazienti con
deficit di maltasi acida, costituita da 36 soggetti caratterizzati da un fenotipo adulto. Abbiamo
confrontato le caratteristiche del nostro campione con quello degli altri gruppi di pazienti
descritti in letteratura e tentato una correlazione genotipo-fenotipo, fino a questo momento
scarsamente informativa.
Tutti i pazienti diagnosticati presentano in eterozigosi l’IVS1-32-13T>G (frequenza allelica
50%). Questo dato conferma la prevalenza riportata in letteratura di questa variante nella
popolazione adulta caucasica con deficit di maltasi acida. Abbiamo quindi diviso i pazienti
sulla base della gravità della mutazione del secondo allele, identificandone 21 con una
16
mutazione particolare deleteria e associati da un quadro clinico più grave, con precoce e
ingravescente compromissione respiratoria. Questi dati e l’identificazione di nuovi fattori
prognostici potrebbe rivelarsi importante per una migliore definizione del follow-up e
dell’algoritmo decisionale per l’accesso alla terapia enzimatica sostitutiva.
Articoli pubblicati
Remiche G, Ronchi D, Magri F, Lamperti C, Bordoni A, Moggio M, Bresolin N, Comi GP.
Extended phenotype description and new molecular findings in late onset glycogen storage
disease type II: a northern Italy population study and review of the literature.
J Neurol. 2014 Jan;261(1):83-97. doi: 10.1007/s00415-013-7137-2.
Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P.,
Fortunato F., Bordoni A., Tonin P., Filosto M., Previtali S., Mongini T., Vercelli L.,
Vittonatto E., Toscano A., Musumeci O., Barca E., Angelini C., Lamperti C., Mora M.,
Morandi L., Moggio M. Late-onset Pompe Disease: Histopathological, biochemical and
clinical assessment before and after ERT.
Germany.
Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P.,
Morandi L., Moggio M. Late-onset Pompe disease: Histopathological, biochemical and
clinical assessment before and after ERT.
XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), July 5-10 2014,
Nice, France
2) Glicogenosi di tipo 3
La glicogenosi di tipo III (GSDIII) è una rara malattia genetica a trasmissione autosomica
recessiva del metabolismo del glicogeno ed è causata da mutazioni nel gene AGL che codifica
per l’enzima deramificante (GDE), caratterizzata da accumulo di glicogeno nei tessuti,
principalmente in fegato e muscolo scheletrico. La malattia in genere si manifesta
nell’infanzia con epatomegalia, ritardo di crescita e crisi ipoglicemiche, mentre durante l’età
adulta si presenta una miopatia. Attualmente, i meccanismi patogenetici della GSDIII non
sono stati ancora completamente chiariti e i pazienti sono trattati con una dieta appropriata,
che comprende pasti frequenti, e terapie sintomatiche.
17
Il nostro laboratorio studia da anni questa patologia attraverso il dosaggio del contenuto di
glicogeno dei tessuti, il dosaggio dell’attivita’ dell’enzima deramificante e la diagnosi
genetica.
Il lavoro sulla glicogenosi di tipo III si e’ ulteriormente sviluppato con la generazione del
modello murino di questa patologia. I topi KO Agl presentano epatomegalia importante, ma
non abbiamo rilevato segni di cirrosi o adenomi. Nei tessuti affetti i depositi di glicogeno
sono aumentati rispetto ai topi controllo, compreso il sistema nervoso centrale, che non è mai
stato indagato nell’uomo. I dati biochimici sono in accordo con i dati istologici che mostrano
chiaramente l’alterazione dei tessuti causata dall’eccesso di glicogeno. La microscopia
elettronica ha evidenziato che le infiltrazioni di glicogeno vanno a distruggere l’apparato
contrattile della miofibra. Inoltre, i topi affetti adulti sembrano meno attivi dei controlli, e
mostrano cifosi alla colonna vertebrale. Già all’età di tre mesi i topi affetti non riescono a
correre e gli animali adulti risultano intolleranti all’esercizio fisico. Ancora, i topi più anziani
hanno un ritmo respiratorio accelerato anche in condizioni di riposo, fenomeno dovuto
all’accumulo di glicogeno nel diaframma. Depositi di zucchero sono presenti anche nella
lingua dei topi affetti. Questi risultati dimostrano che il modello descritto è affidabile nel
riprodurre la GSDIII poiché riassume le caratteristiche essenziali della malattia.
Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti S,
Corti S, Moggio M, Bresolin N, Comi GP. Glycogen storage disease type III: A novel Agl
knockout mouse model. Biochim Biophys Acta. 2014 Nov;1842(11):2318-28.
Comi GP, Pagliarani S, Ulzi G, Lucchiari S, Seidita F, Bordoni A, Nizzardo M, Corti S,
Violano R, Ripolone M, Moggio M, Bresolin N. “ A constitutive knockout animal model for
Glycogen Storage Disease type III”. PS2-236/#175. ICNMD XIII 13th International congress
on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia.
Sabrina Lucchiari. “Glycogen Storage Disease Type III: a novel Agl KO mouse model”. V
Congreso Internacional de Glucogenosis, 4-8 Giugno 2014, Barcellona, Spagna.
3) Malattia da corpi poliglucosanici
La malattia da accumulo di corpi poliglucosanici (APBD) è una rara malattia recessiva ad
esordio adulto dovuta al deficit dell’enzima ramificante il glicogeno (GBE1). La APBD e’
una patologia allelica con la glicogenosi di tipo IV, cioe’ entrambe le patologie sono causate
da mutazioni nello stesso gene. Sono presenti disfunzione urinaria, paraplegia spastica con
perdita della sensibilità pressoria e di vibrazione, neuropatia periferica e disordini cognitivi. Il
18
nostro laboratorio si occupa sia della diagnosi biochimica, con il dosaggio dell’attivita’
enzimatica, sia della diagnosi genetica, con la ricerca delle mutazioni che causano malattia.
Nel 2014 abbiamo studiato dal punto di vista clinico, istologico, biochimico e genetico una
famiglia italiana con 3 fratelli affetti da APBD. In questa famiglia la presentazione clinica nei
tre soggetti affetti e’ stata eterogenea e in 2 fratelli la biopsia muscolare e’ risultata essere
nella norma. Abbiamo individuato una nuova mutazione nel gene GBE1 e una gia’ descritta
precedentemente. Nonostante la presentazione clinica all’esordio della malattia fosse
eterogenea, tutti i fratelli presentavano lo stesso pattern di danno neurologico se studiati con
neuroimaging. Questi dati sono confluiti in un lavoro sottomesso a Neuromuscular Disorders.
Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D’Adda E,
Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M. “Adult
polyglucosan body disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian family”. PS2237/#205. ICNMD XIII 13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio
2014, Nice, Francia.
Morandi L, Farina L, Riva M,
Prelle A, Sciacco M,
Comi G, Moggio M. “Adult
Polyglucosan Body Disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian family”.
EFNS-ENS Joint Congress of Neurology, 31 Maggio – 3 Giugno 2014, Istanbul, Turchia.
Morandi L, Farina L, Riva M, Grimoldi N, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M.
“Heterogeneity of an Italian family affected with Adult polyglucosan body disease”. XIV
Congresso Nazionale Associazione Italiana di Miologia, 8-10 Maggio 2014, Sirmione, Italia.
4) Glicogenina 1
Recentemente, mutazioni a carico del gene Glicogenina1 (GYG1) sono state descritte causare
una miopatia progressiva il cui hallmark istologico e’ l’accumulo di corpi poliglucosanici. I
corpi poliglucosanici sono anomali accumuli di amilopectine che si ritrovano in miopatie in
cui sono coinvolti geni legati al metabolismo del glicogeno come la malattia da corpi
poliglucosanici (APBD), la glicogenosi di tipo IV, la glicogenosi di tipo VII e la miopatia
associata a cardiomiopatia causata da mutazioni nel gene RBCK1.
Abbiamo screenato il gene GYG1 in alcuni soggetti senza diagnosi genetica la cui biopsia
presentava la presenza corpi poliglucosanici e abbiamo individuato una nuova famiglia
italiana con mutazioni nel gene GYG1 in due affetti. La sorella maggiore, che presenta una
19
compromissione muscolare maggiore rispetto alla sorella minore, e’ seguita dal nostro centro
da piu’ di 30 anni.
CANALOPATIE MUSCOLARI
Le canalopatie muscolari sono caratterizzate da un’alterata eccitabilità della membrana
muscolare e si dividono in miotonie non-distrofiche e paralisi periodiche. Esordiscono
principalmente nelle prime due decadi di vita e sono caratterizzate da rigidità muscolare,
dolore, debolezza e fatica. Sono causate da mutazioni nei geni CLCN1, SCN4A, CACNA1S e
KCNJ2 che codificano rispettivamente per i canali del cloro, del sodio, del calcio e del
potassio muscolari. Negli ultimi anni abbiamo caratterizzato un’ampia coorte di pazienti
affetti sia da miotonie non-distrofiche che da paralisi periodica.Nel nostro laboratorio le
indagini genetiche sono eseguite sia come completamento dell’iter diagnostico sia come
aspetto di pura ricerca sulle cause genetiche delle canalopatie muscolari nella popolazione
italiana. Relativamente al canale del cloro muscolo specifico (CLCN1), l’attività di
diagnostica, corredata da studi funzionali e di espressione in sistemi in vitro per casi
selezionati, ha permesso di collezionare in pochi anni una coorte di oltre 70 soggetti
Thomsen/Becker.
Abbiamo effettuato il primo studio di valutazione del potenziale patogenetico di nuove
mutazioni di splicing usando il Mini-gene Assay, che si basa sull’analisi del DNA genomico.
Le varianti di splicing costituiscono il 23% di quelle trovate nei nostri pazienti con Miotonia
Congenita. I risultati ottenuti confermano l’importanza di analizzare sperimentalmente la
natura dei riarrangiamenti associati con questa classe di mutazioni ed il loro effetto sui
trascritti finali. In particolare, le mutazioni di splilcing che si suppone possano produrre
trascritti in-frame possono in realtà generare mRNA out-of-frame che impediscono la sintesi
di un canale funzionale. Dal punto di vista clinico, un’errata valutazione molecolare può
produrre una diagnosi errata o tardiva della malattia.
La nostra coorte consta, inoltre, di 23 soggetti affetti da paralisi periodica (paralisi periodica
ipokaliemica, paralisi periodica iperkaliemica e sindrome di Andersen-Tawil e di circa 30
pazienti affetti da miotonia del canale del sodio. Nuove mutazioni sono state identificate e
analizzate con studi funzionali. Questi studi finora sono stati presentati a congressi
internazionali e hanno portato alla pubblicazione su riviste internazionali di articoli, alcuni dei
quali in collaborazione con altri gruppi che si occupano dello studio delle canalopatie
muscolari.
20
Ulzi G, Sansone VA, Magri F, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Lucchiari S. In vitro analysis of
splice site mutations in the CLCN1 gene using the minigene assay. Mol Biol Rep. 2014
May;41(5):2865-74.
Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D’Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte
Camerino D. “Functional and pharmacological characterzation of a new hNav1.4 sodiun
channel mutation causing myotonia permanens”. PS2-195#383. ICNMD XIII 13th
International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia.
Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D’Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte
Camerino D. “Pharmacogenetics of hNav1.4 sodium channel mutations causing myotonia.
XIV Congresso Nazionale Associazione Italiana di Miologia, 8-10 Maggio 2014, Sirmione,
Italia.
Lucchiari S, Pagliarani S, Ulzi G, Modoni A, Scarlato M, Magri F, D’Amico A, Previtali S,
Corti S, Meola G, Lo Monaco M, Sansone V, Comi GP. “ Genetic analysis of non-dystrophic
myotonias in Italian patients”.
DISTROFIE MUSCOLARI, DISTROFIE E MIOPATIE CONGENITE
1) Distrofia Muscolare di Duchenne: partecipazione a Trial clinici nazionali e
internazionali
E’ proseguita la partecipazione attiva a trial clinici Nazionali ed Internazionali in pazienti
affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne. Nell’ambito dei trial clinici sono attualmente
seguiti 20 bambini affetti da Distrofia muscolare di Duchenne e la valutazione ai fini
dell’arruolamento ha previsto la valutazione di più di 40 soggetti.
Nel corso del 2014 è terminato lo studio sperimentale con l’oligonucleotide antisenso
Drisapersen, l’analisi dei risultati è attualmente in corso. Lo studio ha coinvolto tre pazienti
affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne seguiti per oltre tre anni.
E’ proseguito inoltre lo studio open label con farmaco Ataluren ed è iniziato da ottobre 2013
uno studio di fase III in doppio cieco sempre con lo stesso farmaco, molecola in grado di
promuovere il reading through di stop codon patologici. Questi studi hanno previsto
l’arruolamento di 12 soggetti. Nel corso di quest’anno sono stati inoltre pubblicati i risultati
dello studio di fase 2b, condotto negli scorsi anni anche presso la nostra UO. Questi risultati,
positivi, hanno consentito di porre le premesse non solo per la prosecuzione dello studio di
fase III ma anche per una possibile commercializzazione del farmaco.
Infine nel corso del 2014 è stata iniziata la fase di estensione del trial clinico con farmaco
Givinostat ed è stata iniziata una nuova sperimentazione con il farmaco Tadalafil, donatore di
21
ossido nitrico, Questi farmaci, utilizzati sempre nella popolazione DMD, agiscono con
meccanismi differenti sui processi a valle rispetto alla perdita di distrofina incrementando i
processi di rigenerazione muscolare. Poiché la Distrofia Muscolare di Duchenne è una
patologia che colpisce soggetti in età infantile e presenta un andamento inesorabilmente
progressivo con decesso nella terza decade di vita, qualsiasi tentativo terapeutico è essenziale
anche in considerazione della attuale mancanza di terapie realmente efficaci.
Bushby K(1), Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW,
Flanigan KM, Goemans N, Jones KJ, Mercuri E, Quinlivan R, Renfroe JB, Russman B, Ryan
MM, Tulinius M, Voit T, Moore SA, Lee Sweeney H, Abresch RT, Coleman KL, Eagle M,
Florence J, Gappmaier E, Glanzman AM, Henricson E, Barth J, Elfring GL, Reha A, Spiegel
RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP.
Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy.Muscle Nerve. 2014
Oct;50(4):477-87.
2) Distrofie Muscolari dei cingoli
E’ stata proseguita la raccolta dati di pazienti affetti da Distrofia Muscolare dei Cingoli
(LGMD) nell’ambito del network italiano realizzato tramite il Progetto Telethon GUP 10006.
In particolare sono stati raccolti dati prospettici e retrospettivi di più di 400 pazienti affetti da
queste forme di distrofia muscolare. Lo studio tramite sequenziamento di geni candidati della
sottopopolazione di pazienti non geneticamente determinati ha consentito di porre la diagnosi
molecolare in circa 30 ulteriori pazienti, portando a 310 il numero di soggetti geneticamente
determinati.
Lo studio analitico dei dati ha permesso di definire l’epidemiologia di queste forme in Italia e
i parametri più importanti per la diagnosi differenziale.
Tra i pazienti con nuova diagnosi molecolari alcuni soggetti sono risultati portatori di
mutazioni raramente responsabili di LGMD, quali un soggetto adulto con mutazione nel gene
codificante la proteina merosina, generalmente responsabile di gravi forme neonatali.
Il lavoro di ricerca è stato oggetto di abstract e comunicazioni orali in congressi nazionali e
internazionali ed ha anche posto le basi per una revisione della letteratura e degli aspetti
molecolari che è stato oggetto di review.
Inoltre è in corso lo studio di una sottopopolazione di soggetti che, dopo revisione delle
caratteristiche cliniche e bioptiche, è risultata portatrice alla biopsia muscolare di deficit di
alfa-Distroglicano I geni che codificano per proteine responsabili della glicosilazione di
questa proteina sono in aumento negli ultimi anni e responsabili prevalentemente di forme
22
congenite. Obiettivo dello studio è verificare la presenza di mutazioni in questi geni nella
sottopopolazione di pazienti LGMD privi di diagnosi molecolare.
Magri F, Brajkovic S, Govoni A, Brusa R, Comi GP. Revised genetic classification of Limb
Girdle Muscular Dystrophies. Curr Mol Med. 2014 Oct 10.
Savarese M, Di Fruscio G, Mutarelli M, Torella A, Magri F, Santorelli F, Comi G, Bruno C,
Nigro V. MotorPlex provides accurate variant detection across large muscle genes both in
single myopathic patients and in pools of DNA samples. Acta Neuropathol Commun. 2014
Sep 11;2(1):100.
Magri F., Govoni A., Del Bo R., D'angelo MG., Gandossini S., Brusa R., Colombo I., Moroni
I., Mongini T., Mora M., Angelini C., Tomelleri G., Siciliano G., Toscano A., Corti S.,
Bresolin N., Comi GP., Natural history and peculiar aspects in LGMD2B. XIII International
Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, 2014.
Magri F., Govoni A., Brusa R., Angelini C., D’Angelo MG, Mongini T., Toscano A.,
Siciliano G., Tomelleri G., Mora M., Nigro V., Pegoraro E., Morandi L., Musumeci O.,
Sciacco M, Ricci G., Moroni I., Gandossini S. Del Bo R., Fortunato F., Ronchi D., Corti S.,
Moggio M., Bresolin N., Comi GP. The National Registry of Limb Girdle Muscular
Dystrophy: clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients. 19th
International Congress of the World Muscle Society, Berlin, October 7th-11th, 2014.
Neuromuscular disorders, vol.24 (9-10), p.892, 2014.
F. Magri, A. Govoni, R. Brusa, C. Angelini, M.G. D’Angelo, T. Mongini, A. Toscano, G.
Siciliano, G. Tomelleri, M. Mora, V. Nigro, E. Pegoraro, L. Morandi, O. Musumeci , M.
Sciacco, G. Ricci, I. Moroni , S. Gandossini, R. Del Bo, F. Fortunato, D. Ronchi, S. Corti, M.
Moggio, N. Bresolin, G.P. Comi The National Registry of Limb Girdle Muscular Dystrophy:
clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients. XIV Congress of
the Italian Association of Myology (AIM), May 8-10 2014
F. Magri, I. Colombo, R. Del Bo, A. Govoni, M. Scarlato, R. Brusa, P. Ciscato, S. Previtali,
D. Piga, M.G. D’Angelo, M. Moggio, G.P. Comi ISPD mutations account for a small
proportion of Italian limb girdle muscular dystrophy. XIV Congress of the Italian Association
of Myology (AIM), May 8-10 2014
23
3) Distrofie congenite e miopatie congenite
Nel corso dell’anno è stata completata la raccolta dei dati clinici della casistica di pazienti
affetti da Distrofie congenite e miopatie congenite seguiti presso il nostro Istituto. Scopo della
raccolta è stato raggiungere una migliore caratterizzazione fenotipica e definire, all’interno di
un network italiano, la frequenza relativa delle differenti forme nella popolazione Italiana. Il
nostro gruppo ha contribuito allo studio raccogliendo e organizzando i dati clinici dei pazienti
seguiti presso l’UO dell’Ospedale Maggiore Policlinico e dell’IRCCS E Medea Bosisio
Parini.
Le Miopatie Congenite sono un gruppo estremamente eterogeneo di patologie muscolari che
hanno esordio alla nascita o nei primi anni di vita e presentano un decorso variabile,
caratterizzato da ipotonia, atrofia, debolezza muscolare, ritardo nell’acquisizione delle tappe
motorie, malformazioni osteoarticolari, dismorfismi facciali, oftalmoplegia e difficoltà nella
nutrizione. Sono forme rare, familiari e occasionalmente sporadiche, causate da
un’alterazione geneticamente determinata di varie proteine strutturali della fibra muscolare. In
genere sono caratterizzate da aspetti istopatologici specifici che consentono una certa
suddivisione. Le principali Miopatie Congenite sono la Miopatia Central-Core, la Miopatia
Nemalinica, la Miopatia Centronucleare, la Miopatia Minicore, la Miopatia Miofibrillare e la
Miopatia con Disproporzione delle Fibre.
1) Caratterizzazione clinica e genetica delle Miopatie Nemaliniche in una coorte di
pazienti italiani.
Dallo studio di questa casistica è stato possibile estrapolare un sottogruppo di pazienti privo di
diagnosi molecolare nei quali è attualmente in corso uno studio molecolare tramite metodiche
di nuova generazione (next generation sequencing). Obiettivo dello studio è identificare nuovi
fenotipi associati a geni noti o nuovi geni malattia.
All’interno del network delle Miopatie Congenite il nostro laboratorio si e’ occupato dello
screening di un gruppo di pazienti italiani affetti da Miopatia Nemalinica. Tramite Target
Region Capture Sequencing del gene NEB, responsabile del 50% dei casi di miopatie
nemaliniche, abbiamo identificato 11 varianti in 8 pazienti, di cui 7 nuove. Le varianti sono
state selezionate prendendo in considerazione solo quelle che determinano un’alterazione
sostanziale della sequenza proteica. Per escludere i polimorfismi si sono usati i data base
dbSNPs e 1000 Genome data base e si è valutata la patogenicità usando dei programmi di
predizione, come Polyphen. Si è poi controllata la segregazione delle mutazioni all’interno
della famiglia, la loro assenza nell’Exome variant server e in un gruppo di 240 cromosomi
controllo.
24
Concludendo la Target Region Capture Sequencing ha permesso una più facile
determinazione delle mutazioni: missense, frameshift, stop codon e mutazioni nei siti di
splicing. In particolare lo screening dei nostri pazienti ha permesso un’alta frequenza di
determinazione delle mutazioni. Queste mutazioni sono distribuite lungo tutto il gene,
confermando la mancanza di un hotspot mutazionale. Pertanto questo metodo di analisi
sembra essere promettente per una più facile determinazione delle mutazioni in quei geni
complessi che presentano un gran numero di esoni, ampie regioni codificanti e non presentano
hotspots mutazionali.
2) Caratterizzazione clinica e genetica di tre famiglie con Miopatia Central-Core e Fiber
Type Disproportion.
La miopatia “central core” è una delle forme più frequenti di Miopatia Congenita,
caratterizzata da aree centrali, con disorganizzazione della struttura miofibrillare e assenza di
mitocondri. Il gene maggiormente affetto è RYR1 codificante per il recettore rianodinico e
coinvolto nel processo di eccitazione-contrazione in quanto funziona come canale di rilascio
del calcio nel muscolo scheletrico. Sono state riportate mutazioni di tipo sia dominante che
recessivo. Nella maggior parte dei casi le varianti causano una patologia autosomica
dominante associata a Miopatia Central-Core e/o associata a suscettibilità per l’Ipertermia
Maligna. Invece le mutazioni recessive predominano in pazienti con Miopatia Multiminicore,
Centronucleare o con Disproporzione delle Fibre.
RYR1 è uno dei geni più grandi del genoma umano, essendo costituito da 106 esoni, quindi
l’analisi mediante sequenziamento Sanger risulta essere molto lunga e costosa. L’utilizzo
della Next Generation Sequencing permette invece una più rapida determinazione di varianti
in vari geni, che però devono essere validate.
Abbiamo analizzato 12 pazienti affetti da Miopatia Congenita usando questo sistema di
sequenziamento ad alta definizione su una piattaforma di 98 geni coinvolti in differenti
patologie neuromuscolari. In questo modo siamo riusciti a caratterizzare geneticamente tre
famiglie, identificando 6 mutazioni nel gene RYR1, di cui 4 nuove. In particolare l’analisi di
una famiglia con 4 membri affetti ha evidenziato un differente decorso clinico associato allo
stesso aplotipo, caratterizzato dalla presenza di due mutazioni dominanti, una associata a
Miopatia Central-Core e l’altra responsabile di Ipertermia Maligna.
Articoli pubblicati
Piga D; Magri F; Ronchi D; Corti S; Cassandrini D; Mercuri E; Tasca G; Bertini E; Fattori F;
Toscano A; Messina S; Moroni I; Mora M; Moggio M; Colombo I; Pane M; Fiorillo C;
D’Amico A; Bruno C; Bresolin N; Comi GP.
25
New mutations in NEB gene discovered by targeted next generation sequencing in nemaline
myopathy Italian patients. (Manoscritto sottomesso)
Pegoraro E., Cassandrini D., Astrea G., Codemo V., D'Amico A., Fiorillo C., Maggi L.,
Magri F., Pane M., Tasca G., Tosatto S., Battini R., Bernasconi P., Bertini E., Comi G.P.,
Messina S., Mongini T., Mora M., Morandi L., Minetti C., Ricci E., Mercuri E., Santorelli
FM., Bruno C. Expanding the clinicopathological and genetic spectrum of RYR1 related
Congenital Myopathies with cores and minicores: an Italian population study. XIII
International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10,
2014.
F. Polenghi, I. Colombo, F. Magri, M. Sciacco, G. Fagiolari, S. Gandossini, E. Brighina, D.
Piga, G.P. Comi, N. Bresolin, M. Moggio, M.G. D’Angelo Late onset ophthalmoplegia in a
typical neonatal congenital myopathy. XIV Congress of the Italian Association of Myology
(AIM), May 8-10 2014 (oral presentation)
D. Piga, F. Magri, M. Moggio, G. Fagiolari, M.G. D’Angelo, A. Cavallini, N. Bresolin, G.P.
Comi, V. Nigro. New RYR1 mutations discovered by next generation sequencing in
congenital myopathy patients with different phenotypes. XIV Congress of the Italian
Association of Myology (AIM), May 8-10 2014.
4) Studio delle Distrofie Muscolari tramite Risonanza Magnetica Muscolare
Nel corso dell’anno sono state poste le premesse per studiare l’evoluzione di alcune forme di
patologie muscolare tramite Risonanza Magnetica (RM). In particolare presso l’UO
Neuroradiologia dell’Ospedale Policlinico di Milano sono stati studiati alcuni pazienti affetti
da miopatia congenita ed è stato impostato il follow-up di alcuni pazienti affetti da Distrofia
Muscolare di Duchenne, anche nell’ambito dei trial clinici.
Presso L’Istituto IRCCS E. Medea (Bosisio Parini) l’anno corrente è stato necessario per
provvedere all’aggiornamento dei software di risonanza al fine di renderli adatti allo studio
muscolare. L’aggiornamento è stato recentemente completato ed è stata messa a punto la
metodica su soggetti controllo. Questo consente di porre le premesse per iniziare uno studio
longitudinale in pazienti affetti da distrofia muscolare dei cingoli che avrà inizio nel prossimo
anno.
5) Importanza delle misure funzionali e di outcome nelle malattie muscolari.
E’ proseguita la raccolta di dati longitudinali-relativi a misure di outcome (6 minute walking
test, North star ambulatory assessment, Motor function measure scale) nei pazienti affetti da
26
Distrofie muscolari. Questo studio osservazionale è volto a valutare l’efficacia di alcune scale
funzionali in pazienti affetti da patologie muscolari. Al fine di definire la reale efficacia di
queste misure nel descrivere la storia naturale di queste patologie è necessario tuttavia uno
studio su lungo periodo. La definizione di misure di out come è tuttavia fondamentale in
quanto la possibilità di dimostrare la reale efficacia di terapie sperimentali è strettamente
correlata alla capacità di individuare parametri quantitativi dei quali si possa seguire nel
tempo la modifica.
Pane M, Mazzone ES, Sormani MP, Messina S, Vita GL, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente
Y, D'Amico A, Lanzillotta V, Viggiano E, D'Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S, Bello L,
Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Bianco F, Van der Haawue M, Magri F,
Palermo C, Rossi F, Donati MA, Alfonsi C, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G, Mongini
T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali SC, Napolitano S, Bruno C, Politano L, Comi GP,
Bertini E, Morandi L, Gualandi F, Ferlini A, Goemans N, Mercuri E. 6 minute walk test in
Duchenne MD patients with different mutations: 12 month changes. PLoS One. 2014 Jan
8;9(1):e83400.
Villa L., Testolin, S., Peverelli L., Ciscato P., Magri F., Sciacco M., Comi GP, Moggio M.
Morphologic and morphometric analysis of muscle degeneration in DMD: evolution in
patients aged from 1 to 10 years. XIII International Congress on Neuromuscular Diseases
(ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, 2014
L. Villa, S. Testolin, L. Peverelli, P. Ciscato, F. Magri, F. Tiberio, M. Sciacco, G. Comi, M.
Moggio Natural history of muscle pathology in 40 DMD patients aged 1 to 10 years:
morphologic and morphometric analysis. XIV Congress of the Italian Association of
Myology (AIM), May 8-10 2014
27
28
LABORATORIO DI NEUROIMMUNOLOGIA CLINICA
Prof. Giacomo P. Comi
Neurologo
Dott.ssa Domenica Saccomanno
Biologa Nutrizionista
Laboratorio di Neuroimmunologia: Certificazione di qualità INSTAND (europeo) anno 2014
per le Sindromi paraneoplastiche.
Diagnostica:
Il Laboratorio di Neuroimmunologia si occupa del dosaggio dei principali anticorpi associati a
neuropatie periferiche (NP) disimmuni quali:
polineuropatia cronica infiammatoria
demielinizzante (CIDP), neuropatia motoria multifocale (MMN), neuropatia sensitivomotoria demielinizzante associata a gammopatia monoclonale IgM, sindromi neurologiche
paraneoplastiche, sindrome di Guillain Barré (GBS) e le sue varianti e la sindrome di Miller
Fisher (MFS).
Ricerca:
Studio di collaborazione tra il il Dip. Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti,
Sezione di Neuroscienze, Centro Dino Ferrari, Università degli Studi di Milano: Dott.ssa
Domenica Saccomanno, Dott.ssa Francesca Magri, Prof. Giacomo Pietro Comi e il Centro per
la Prevenzione e Diagnosi della Malattia Celiaca della Fondazione IRCCS Ca’ Granda
Ospedale Maggiore Policlinico di Milano: Dott.ssa Carolina Tomba, Dott.ssa Leda
Roncoroni, Dott. Luca Elli, Prof.ssa Maria Teresa Bardella.
STUDIO CLINICO SULLA PRESENZA DI ANTICORPI ANTI GANGLIOSIDI NEI
PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIA CELIACA ED EFFETTI DELLA DIETA SENZA
GLUTINE
La malattia celiaca (MC) è un’enteropatia autoimmune (Th1) scatenata dall’ingestione di
glutine, in particolare da alcune sue componenti proteiche, chiamate gliadine. La diagnosi si
basa sulla presenza di autoanticorpi circolanti (anti transglutaminasi tipo 2), conferma
bioptica (danno atrofico della mucosa intestinale) e risposta alla dieta senza glutine (DGS).
Al momento l’unica terapia consiste nel seguire per tutto l’arco della vita una DSG al fine di
proteggere il paziente dall’insorgenza di complicanze, associate appunto alla MC non trattata.
Le complicanze neurologiche sono state riportate in letteratura in circa il 10% dei pazienti
affetti da MC e possono interessare il sistema nervoso centrale e quello periferico, con NP
disimmuni associate alla presenza nel siero dei pazienti di anticorpi anti gangliosidi. Anticorpi
anti-gangliosidi sono stati trovati in pazienti celiaci con neuropatia ed altre manifestazioni
29
neurologiche associate, ma nessuno degli studi finora riportati in letteratura ha indagato la
presenza degli anticorpi anti-GM3, GD3, GT1a e Sulfatide. E’ stata quindi indagata la
presenza degli anticorpi anti-gangliosidi, dosando il pannello completo in tutti i campioni dei
pazienti adulti celiaci, con e senza disturbi neurologici, alla diagnosi di MC.
La MC può esordire con quadri clinici molto differenti, in un range ampio che va dalla totale
asintomaticità fino a sintomi severi e talvolta invalidanti. Non sono emerse sostanziali
differenze tra i due gruppi di pazienti affetti da MC classica e non classica, pur evidenziando
nei pazienti asintomatici l’importanza dei segni extraintestinali nel sospetto e nella diagnosi di
MC. Inoltre nella maggior parte dei pazienti i disturbi neurologici precedono la diagnosi di
MC e migliorano con la DSG.
L’indagine degli anticorpi anti gangliosidi ha permesso di evidenziare la presenza di anticorpi
anti-sulfatide in pazienti adulti celiaci, con una prevalenza della positività in pazienti senza
disturbi neurologici e assenza di anticorpi anti-gangliosidi associati a specifici fenotipi clinici
in pazienti con disturbi neurologici.
In letteratura, è stata riportata una reattività anti-sulfatide IgG e IgA solo in pazienti con NP
acuta ed una reattività IgM in pazienti con neuropatia prevalentemente sensitiva. Inoltre è
stata rilevata la presenza di anticorpi diretti contro almeno uno o più dei seguenti gangliosidi (
GM1, GM2, GD1a e GD1b) di classe IgG in 6 pazienti adulti celiaci con neuropatia sensitiva
distale, suggerendo una risposta autoimmune anti-ganglioside mediata dai linfociti T. Altri
studi, riportano una positività IgG per almeno uno dei 3 anticorpi anti-gangliosidi testati (antiGM1, GD1b e GQ1b) nel 64% dei pazienti celiaci non trattati, con disturbi neurologici e nel
30% dei pazienti celiaci senza disturbi neurologici.
Nell’ ipotesi di un possibile coinvolgimento del glutine nella reattività anti-sulfatide trovata, è
stata valutata la riduzione o scomparsa degli autoanticorpi al controllo, dopo almeno 6 mesi di
DSG. Gli anticorpi anti-sulfatide IgG (36%) si sono negativizzati in tutti i pazienti celiaci con
e senza disturbi neurologici e la loro scomparsa suggerisce un ruolo del glutine nella reattività
IgG contro i gangliosidi, trovata nei pazienti del nostro studio mentre la reattività IgA (14%) è
risultata indipendente dall’esposizione al glutine e dovuta verosimilmente ad una maggiore
suscettibilità autoimmune.
Abstract presentato a congresso internazionale
D. Saccomanno, C. Tomba, F. Magri, L. Roncoroni, M.T. Bardella, G.P. Comi, N. Bresolin,
L. Elli.
Anti-sulphatide reactivity in patients with celiac disease.
9th International Congress on Autoimmunity, Nizza, Francia, 26-30 Marzo 2014
30
ELENCO LAVORI SCIENTIFICI 2014
Articoli in extenso
1.Forni D, Pozzoli U, Cagliani R, Tresoldi C, Menozzi G, Riva S, Guerini FR, Comi GP,
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3.Pane M, Mazzone ES, Sivo S, Sormani MP, Messina S, D Amico A, Carlesi A, Vita G,
Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, Lanzillotta V, Viggiano E, D Ambrosio P, Cavallaro F,
Frosini S, Barp A, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Graziano A, Magri F,
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Battini R, Pegoraro E, Previtali S, Bruno C, Politano L, Comi GP, Bertini E, Mercuri E.
Long term natural history data in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy: 36month changes.
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EA, King A, Colombrita C, Pensato V, Castellotti B, de Belleroche J, Baas F, Ten Asbroek
AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, McLaughlin RL, Polak M, Asress S, Esteban-Pérez J,
Muñoz-Blanco JL, Simpson M; SLAGEN Consortium, van Rheenen W, Diekstra FP, Lauria
G, Duga S, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G, Morrison KE, Williams KL, Nicholson
GA, Blair IP, Dion PA, Leblond CS, Rouleau GA, Hardiman O, Veldink JH, van den Berg
LH, Al-Chalabi A, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, García-Redondo A, Wu
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Torrente Y, D'Amico A, Lanzillotta V, Viggiano E, D'Ambrosio P, Cavallaro F, Frosini S,
Bello L, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E, Bianco F, Van der Haawue M, Magri
F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Alfonsi C, Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello G,
Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali SC, Napolitano S, Bruno C, Politano L,
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22.Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Donati A, Minetti C,
Moggio M, Mongini T, Servidei S, Tonin P, Toscano A, Uziel G, Bruno C, Ienco EC, Filosto
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24.Fogh I, Ratti A, Gellera C, Lin K, Tiloca C, Moskvina V, Corrado L, Sorarù G, Cereda C,
Corti S, Gentilini D, Calini D, Castellotti B, Mazzini L, Querin G, Gagliardi S, Del Bo R,
Conforti FL, Siciliano G, Inghilleri M, Saccà F, Bongioanni P, Penco S, Corbo M, Sorbi S,
Filosto M, Ferlini A, Di Blasio AM, Signorini S, Shatunov A, Jones A, Shaw PJ, Morrison
KE, Farmer AE, Van Damme P, Robberecht W, Chiò A, Traynor BJ, Sendtner M, Melki J,
33
Meininger V, Hardiman O, Andersen PM, Leigh NP, Glass JD, Overste D, Diekstra FP,
Veldink JH, van Es MA, Shaw CE, Weale ME, Lewis CM, Williams J, Brown RH, Landers
JE, Ticozzi N, Ceroni M, Pegoraro E, Comi GP, D'Alfonso S, van den Berg LH, Taroni F, AlChalabi A, Powell J, Silani V; SLAGEN Consortium and Collaborators.
A genome-wide association meta-analysis identifies a novel locus at 17q11.2 associated with
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26.Remiche G, Ronchi D, Magri F, Lamperti C, Bordoni A, Moggio M, Bresolin N, Comi
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27.Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Riboldi G, Faravelli I, Zanetta C,
Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Minimally invasive transplantation of iPSC-derived ALDHhiSSCloVLA4+ neural stem cells
effectively improves the phenotype of an amyotrophic lateral sclerosis model.
Hum Mol Genet. 2014 Jan 15;23(2):342-54. doi: 10.1093/hmg/ddt425.
28.van Doormaal PT, Ticozzi N, Gellera C, Ratti A, Taroni F, Chiò A, Calvo A, Mora G,
Veldink JH.
Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter survival study.
Neurobiol Aging. 2014 Oct;35(10):2420.e13-4. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.04.014.
29.Rango M, Arighi A, Bonifati C, Del Bo R, Comi G, Bresolin N.
The brain is hypothermic in patients with mitochondrial diseases.
J Cereb Blood Flow Metab. 2014 May;34(5):915-20. doi: 10.1038/jcbfm.2014.38.
JIMD Rep. 2014 Apr 17. [Epub ahead of print]
30.Ronchi D, Previtali SC, Sora MG, Barera G, Del Menico B, Corti S, Bresolin N, Comi GP.
Novel Splice-Site Mutation in SMN1 Associated with a very Severe SMA-I Phenotype.
J Mol Neurosci. [Epub ahead of print]
31.Ronchi D, Riboldi G, Del Bo R, Ticozzi N, Scarlato M, Galimberti D, Corti S, Silani V,
Bresolin N, Comi GP.
CHCHD10 mutations in Italian patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Brain. 2015 Jan 8. pii: awu384. [Epub ahead of print]
Lavori pubblicati come Abstract a congressi internazionali
1. Magri F., Govoni A., Del Bo R., D'angelo MG., Gandossini S., Brusa R., Colombo I.,
Moroni I., Mongini T., Mora M., Angelini C., Tomelleri G., Siciliano G., Toscano A., Corti
S., Bresolin N., Comi GP.,
Natural history and peculiar aspects in LGMD2B. XIII International Congress on
Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France, July 5-10, 2014
34
2. Villa L., Testolin, S., Peverelli L., Ciscato P., Magri F., Sciacco M., Comi GP, Moggio M.
Morphologic and morphometric analysis of muscle degeneration in DMD: evolution in
patients aged from 1 to 10 years.
XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), Nice, France,
July 5-10, 2014
3. Pegoraro E., Cassandrini D., Astrea G., Codemo V., D'Amico A., Fiorillo C., Maggi L.,
Magri F., Pane M., Tasca G., Tosatto S., Battini R., Bernasconi P., Bertini E., Comi G.P.,
Messina S., Mongini T., Mora M., Morandi L., Minetti C., Ricci E., Mercuri E., Santorelli
FM., Bruno C. Expanding the clinicopathological and genetic spectrum of RYR1 related
Congenital Myopathies with cores and minicores: an Italian population study.
July 5-10, 2014
4. Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., DalMas A., Bucchia M., Frattini
E., Stuppia G., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi GP., Corti S.
Amelioration of spinal muscular atrophy using RNA therapy to increase SMN level and
modulate other secondary therapeutic targets.
July 5-10, 2014
5.Corti S., Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M., Rinchetti
P., Zanetta C., Faravelli I., Magri F., Bresolin N., Comi GP:
Improvement of SMARD1 phenotype using iPSC-derived neural stem cells transplantation.
July 5-10, 2014
6. Ronchi D., Previtali S., Magri F., Corti S. Comi G.P.
A novel splice-site mutation in SMN1 resulting in very severe SMA1 phenotype.
19th International Congress of the World Muscle Society, Berlin, , October 7th-11th,
2014. Neuromuscular disorders, vol.24 (9-10), p.886, 2014
7. Magri F., Govoni A., Brusa R., Angelini C., D’Angelo MG, Mongini T., Toscano A.,
Sciacco M, Ricci G., Moroni I., Gandossini S. Del Bo R., Fortunato F., Ronchi D., Corti S.,
Moggio M., Bresolin N., Comi GP. The National Registry of Limb Girdle Muscular
Dystrophy:
clinical and molecular characterization of a sample of 466 Italian patients.
19th International Congress of the World Muscle Society, Berlin, October 7th-11th, 2014.
Neuromuscular disorders, vol.24 (9-10), p.892, 2014
8. Ronchi D., SciaccoM., Bordoni A., Colombo I., Piga D., Fortunato F., Moggio M., Comi
G.P. The novel non-sense mutation m.4214G>A in MT-ND1 results in mitochondrial
myopathy with severe complex I deficiency
Germany.
9.Ronchi D., Bonato S., Di Biase E., Melzi V., Trezzi I., Corti S., Bresolin N., Comi G.P., Di
Fonzo A.
Mutational analysis of COQ2 in Italian patients with MSA.
35
10. Ronchi D., Ripolone M., Barca E., Berardinelli A., Mora M., Morandi L., Bordoni A.,
Fortunato F., Fagiolari G., Violano R., Vallejo D., Corti S, Toscano A., Sciacco M., Di Mauro
S., Comi G.P., Moggio M..
Defective muscle mitochondrial biogenesis in spinal muscular atrophy
11. Ronchi D., Previtali S., Magri F., Corti S., Comi G.P.
A novel splice-site mutation in SMN1 resulting in a very severe SMA1 phenotype
Germany.
12. Lanfranconi, S. Ronchi, D. Ahmed, N. Basilico, P. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S.
A novel mutation in KRIT1 gene associated with familial cerebral cavernous malformations
Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, Turkey
13. Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P.,
Morandi L., Moggio M.
Late-onset Pompe Disease: Histopathological, biochemical and clinical assessment before
and after ERT.
Germany.
14. Sciacco M., Ronchi D., Ripolone M., Violano R., Lucchini V., Xhani R., Comi G.P.,
Morandi L., Moggio M.
Late-onset Pompe disease: Histopathological, biochemical and clinical assessment before
and after ERT.
XIII International Congress on Neuromuscular Diseases (ICNMD XIII), July 5-10 2014,
Nice, France
15. Comi GP, Pagliarani S, Ulzi G, Lucchiari S, Seidita F, Bordoni A, Nizzardo M, Corti S,
Violano R, Ripolone M, Moggio M, Bresolin N.
“ A constitutive knockout animal model for Glycogen Storage Disease type III”. PS2236/#175. ICNMD XIII
13th International congress on Neuromuscular Diseases, 5-10 Luglio 2014, Nice, Francia.
16. Sabrina Lucchiari.
“Glycogen Storage Disease Type III: a novel Agl KO mouse model”.
V Congreso Internacional de Glucogenosis, 4-8 Giugno 2014, Barcellona, Spagna.
17. Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D’Adda E,
Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M.
“Adult polyglucosan body disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian
family”. PS2-237/#205. ICNMD XIII
18. Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D’Adda
E, Morandi L, Farina L, Riva M, Prelle A, Sciacco M, Comi G, Moggio M.
36
“Adult Polyglucosan Body Disease: clinical and histological heterogeneity of an Italian
family”. EFNS-ENS
Joint Congress of Neurology, 31 Maggio – 3 Giugno 2014, Istanbul, Turchia.
19. Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D’Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte
Camerino D.
“Functional and pharmacological characterzation of a new hNav1.4 sodiun channel mutation
causing myotonia permanens”. PS2-195#383. ICNMD XIII
20 Desaphy JF, Carbonara R, Modoni A, D’Amico A, Pagliarani S, Lo Monaco M, Conte
Camerino D.
“Pharmacogenetics of hNav1.4 sodium channel mutations causing myotonia.
Italia.
21. Lucchiari S, Pagliarani S, Ulzi G, Modoni A, Scarlato M, Magri F, D’Amico A, Previtali
S, Corti S, Meola G, Lo Monaco M, Sansone V, Comi GP.
“ Genetic analysis of non-dystrophic myotonias in Italian patients”.
22. D. Saccomanno, C. Tomba, F. Magri, L. Roncoroni, M.T. Bardella, G.P. Comi, N.
Bresolin, L. Elli.
Anti-sulphatide reactivity in patients with celiac disease.
9th International Congress on Autoimmunity, Nizza, Francia, 26-30 Marzo 2014
23.Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S,
DalMas A, Bucchia M, Frattini E, Stuppia G, Magri F, Bresolin N, Pagani F, Comi G, Corti
S.
Spinal Muscular Atrophy Phenotype Is Ameliorated Either By SMN Increase Or Modulation
Of Secondary Cell Death Events With RNA Therapy.
66th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014, Neurology
2014
24.Corti S, Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Bucchia M, Rinchetti P,
Zanetta C, Faravelli I, Monguzzi E, Magri F, Bresolin N, Comi G.
iPSC-Derived Neural Stem Cells Ameliorate The Phenotype Of Spinal Muscular Atrophy with
Respiratory Distress Type 1 (SMARD1).
2014
25.Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S,
S.
2014
26.Riboldi, G. Rizzo, F. Ranieri, M. Brajkovic, S. Stuppia, G. Nizzardo, M. Simone, C.
Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Magri, F. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S.
TI Modelling pathogenesis and treatment of Mitofusin 2 disease using patient-specific iPSCs
EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY, 21 EP1161 BP 136 EP 136 SU 1 PD MAY 2014
37
Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY
European Federat Neurol Soc PT J
27.Ranieri, M. Riboldi, G. Brajkovic, S. Corti, S. Simone, C. Nizzardo, M. Rizzo, F.
Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Rinchetti, P. Zanetta, C. Faravelli, I. Monguzzi, E. Magri,
F. Bresolin, N. Comi, G. P.
TI iPSC-derived neural stem cells improve the phenotype of spinal muscular atrophy with
respiratory distress type 1 (SMARD1) EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21
EP4117 BP 328 MAY 2014
Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY SP
European Federat Neurol Soc
28.Brajkovic, S. Riboldi, G. Ranieri, M. Nizzardo, M. Simone, C. Rizzo, F. Ruggieri, M.
Salani, S. Dal Mas, A. Bucchia, M. Frattini, E. Stuppia, G. Magri, F. Bresolin, N. Pagani, F.
Comi, G. P. Corti, S.
TI RNA-based strategies leading to either an increase of SMN or modulation of disease
pathways ameliorated spinal muscular atrophy phenotype EUROPEAN JOURNAL OF
NEUROLOGY VL 21 EP4119 MAY 2014
29.Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., DalMas A., Bucchia M.,
Frattini E., Stuppia G., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi GP., Corti S.
July 5-10, 2014
July 5-10, 2014
31.Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Riboldi G., Salani S., Bucchia M.,
Rinchetti P., Porro F., Bresolin N., Comi GP Corti S.
iPSC-derived neural stem cells act via kinase inhibition to exert neuroprotective effects in
SMARD1, SFN 2014
32.Bucchia M., Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Dametti S., Ramirez A., Frattini
E., Pagliarani S., Bresolin N., Pagani F., Comi GP, Corti S.
Regulation of SMN and other key pathogenetic events in Spinal Muscular Atrophy (SMA):
Moving to RNA-Based treatment strategies, SFN
Lavori pubblicati come Abstract a congressi nazionali
1. S.Lucchiari, S.Pagliarani, G.Ulzi, A.Modoni, M.Scarlato, F.Magri, A.D’Amico, S.Previtali,
S.Corti, G.Meola, M. Lo Monaco, V.Sansone, G.P. Comi
Genetic analysis of non-dystrophic myotonias in Italian patients.
XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May 8-10 2014 (oral
presentation)
2. F. Polenghi, I. Colombo, F. Magri, M. Sciacco, G. Fagiolari, S. Gandossini, E. Brighina, D.
Piga, G.P. Comi, N. Bresolin, M. Moggio, M.G.
38
D’Angelo Late onset ophthalmoplegia in a typical neonatal congenital myopathy.
presentation)
3. F. Magri, A. Govoni, R. Brusa, C. Angelini, M.G. D’Angelo, T. Mongini, A. Toscano, G.
Siciliano , G. Tomelleri, M. Mora, V. Nigro, E. Pegoraro, L. Morandi, O. Musumeci , M.
Sciacco, G. Ricci, I. Moroni , S. Gandossini, R. Del Bo, F. Fortunato, D. Ronchi, S. Corti, M.
Moggio, N. Bresolin, G.P. Comi
The National Registry of Limb Girdle Muscular Dystrophy: clinical and molecular
characterization of a sample of 466 Italian patients.
presentation – presenting author)
4. S. Corti, C. Simone; M. Nizzardo, F. Rizzo, M. Ruggieri, S. Salani, M. Bucchia, P.
Rinchetti, F. Magri, N. Bresolin, G. Comi
spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1
presentation)
5. L. Villa, S. Testolin, L. Peverelli, P. Ciscato, F. Magri, F. Tiberio, M. Sciacco, G. Comi, M.
Moggio
Natural history of muscle pathology in 40 DMD patients aged 1 to 10 years: morphologic and
morphometric analysis.
XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), May 8-10 2014
6. F. Magri, I. Colombo, R. Del Bo, A. Govoni, M. Scarlato, R. Brusa, P. Ciscato, S. Previtali,
D. Piga, M.G. D’Angelo, M. Moggio, G.P. Comi
ISPD mutations account for a small proportion of Italian limb girdle muscular dystrophy.
7. D. Piga, F. Magri, M. Moggio, G. Fagiolari, M.G. D’Angelo, A. Cavallini, N. Bresolin,
G.P. Comi, V. Nigro.
New RYR1 mutations discovered by next generation sequencing in congenital myopathy
patients with different phenotypes.
8. M. Nizzardo, C. Simone, S. Dametti, A. Ramirez, A. Dal Mas, E. Frattini, G. Riboldi, F.
Magri, N. Bresolin, F. Pagani, G.P. Comi, S. Corti.
RNA therapy for Spinal Muscular Atrophy by SMN increase or modulation of secondary cell
death events.
9.Ronchi D., Ahmed N., Di Fonzo A., Bordoni A., Piga D., Rizzuti M., Melzi V., Corti S.,
Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P.
The application of next-generation sequencing in the discovery of novel genetic defects in
adult patients affected by mitochondrial disorders featuring muscle mtDNA instability.
Il sequenziamento di nuova generazione in genetica umana e medica.
Convegno nazionale della Società Italiana di Genetica Umana (SIGU), 30-31 Ottobre
2014 Bologna.
10.Ronchi D., Di Fonzo A. Ahmed N., Piga D., Bordoni A., Rizzuti M., Corti S., Bresolin N.,
Comi G.P.
39
In-depth analysis of muscle mitochondrial DNA in adult onset disorders featuring
mitochondrial genome instability.
2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano.
11.Ronchi D., Ripolone M., Rizzuti M., Bordoni A., Fortunato F., Fagiolari G., Violano R.,
Corti S., Sciacco M., Moggio M., Bresolin N., Comi G.P.
Defective muscle mitochondrial biogenesis and delayed muscle maturation in spinal muscular
atrophy
2nd INGM-Policlinico Research Day, 6 Novembre 2014, Milano
12. Ripolone M., Ronchi D., Violano R., Vallejo D., Fagiolari G., Lucchini V., Barca E.,
Bordoni A., Fortunato F., Corti S., Di Mauro S., Comi G.P., Sciacco M., Moggio M.
Muscle mitochondrial dysfunction due to defective mitochondrial biogenesis in SMA patients.
13. Colombo I, Pagliarani S, Testolin S, Salsano E, Napoli L, Bordoni A, Salani S, D’Adda E,
Morandi L, Farina L, Riva M, Grimoldi N, Prelle A, Sciacco M, Comi GP, Moggio M.
“Heterogeneity of an Italian family affected with Adult polyglucosan body disease”.
Italia.
14. Lucchiari S., Pagliarani S., Ulzi G., Modoni A., Scarlato M., Magri F., D’Amico A.,
Previtali S., Corti S., Meola G., Lo Monaco M., Sansone V., Comi G.P.
Genetic analysis of non- dystrophic myotonias in Italian patients,
15. Corti S., Simone C.; Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M.,
Rinchetti P., Magri F., Bresolin N., Comi G.
spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione 2014
16.Nizzardo M., Simone C., Dametti S., Ramirez A., Dal Mas A., Frattini E., Riboldi G.,
Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi G.P., Corti S.
death events XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione 2014
40
LABORATORIO CELLULE STAMINALI NEURALI
Responsabile:
Dott.ssa Stefania Corti
Medici:
Dott.ssa Giulietta Riboldi
Dott.ssa Irene Favarelli
Biologi:
Dott. Sabrina Salani
Dott. Chiara Simone
Dott. Federica Rizzo
Dott. Monica Bucchia
Dott. Agnese Ramirez
Dott. Sara Dametti
Dott. Valeria Parente
Biotecnologi
Dott. Monica Nizzardo
Dott. Paola Rinchetti
41
L’attività di ricerca del Laboratorio di Cellule Staminali Neurali è dedicata allo sviluppo di
strategie terapeutiche cellulari e molecolari per patologie neurodegenerative (in particolare
malattie del motoneurone ad esordio infantile – Atrofia Muscolare Spinale e Atrofia
muscolare spinale con distress respiratorio – o adulto come la Sclerosi Laterale Amiotrofica)
e neuropatie ereditarie (Malattia di Charcot-Marie-Tooth 2 di tipo 2A).
Il trapianto di cellule staminali può rappresentare un possibile approccio terapeutico per le
malattie neurodegenerative ed in particolare per le malattie del motoneurone. I meccanismi
attraverso i quali agisce sono molteplici ed includono oltre alla sostituzione cellulare, anche il
rilascio di fattori neuroprotettivi prodotti dalle cellule trapiantate.
Nel nostro laboratorio sono inoltre allo studio strategie terapeutiche molecolari con
oligonucleotidi in particolare con chimica morfolino e di terapia genica con vettori adenoassociati (AAV).
Sono qui presentati in sintesi i risultati ottenuti dalle nostre ricerche nel 2014.
Utilizzo di cellule staminali neuronali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte
(iPSC) per lo sviluppo di una terapia cellulo-mediata per l’Atrofia Muscolare Spinale
con Distress Respiratorio di tipo 1 (Simone et al., 2014)
L’Atrofia Muscolare Spinale con Distress Respiratorio di tipo 1 (SMARD1) è una patologia
neuromuscolare autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene IGHMBP2. Attualmente
non esiste una cura risolutiva per questa patologia.
Il trapianto di cellule staminali neuronali (NSC) rappresenta una strategia terapeutica
promettente per le malattie del motoneurone: le NSC, una volta trapiantate ed integrate nel
tessuto ospite, possono agire attraverso diversi meccanismi tra i quali il rilascio di fattori
neuroprotettivi, la riduzione di sostanze tossiche nel microambiente e la sostituzione di altre
cellule non-neuronali.
Nel nostro laboratorio le NSC sono state generate da cellule staminali pluripotenti indotte
umane (iPSC) ed è stato dimostrato il loro elevato potenziale terapeutico applicato a questa
patologia. Precedentemente abbiamo documentato che le NSC trapiantate nel modello murino
di SMARD1 sono in grado di integrarsi correttamente nel tessuto ospite, di differenziare in
neuroni, astrociti e oligodendrociti e di migliorare il fenotipo patologico svolgendo un’azione
neuroprotettiva sui motoneuroni endogeni in degenerazione. Abbiamo ottenuto un modello
umano in vitro della patologia differenziando in motoneuroni le iPSC derivate da pazienti
affetti da SMARD1. Queste cellule ricapitolano alcuni aspetti della malattia umana, tra cui
una significativa riduzione della sopravvivenza cellulare e della lunghezza assonale. Abbiamo
42
riscontrato un miglioramento del fenotipo patologico nei motoneuroni SMARD1 posti in cocoltura con NSC umane sane. Ulteriori indagini sperimentali ci hanno permesso di
approfondire i meccanismi molecolari mediante i quali le NSC esercitano il loro effetto
neuroprotettivo: abbiamo dimostrato la capacità delle NSC derivate da iPSC di produrre
fattori neurotrofici in grado di inibire due chinasi, GSK-3 e HGK, coinvolte nell’attivazione
di un pathway che determina la morte cellulare.
I nostri dati supportano il ruolo delle iPSC come modello di malattia SMARD1 e il loro
potenziale traslazionale come terapia per le malattie del motoneurone.
Pubblicazioni
Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Riboldi G, Salani S, Bucchia M, Bresolin N,
Comi GP, Corti S.
Stem Cell Reports. 2014 Aug 12;3(2):297-311.
Sviluppo di una terapia cellulo-mediata per la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA)
(Nizzardo et al., 2014)
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurologica caratterizzata dalla
degenerazione selettiva dei motoneuroni. Attualmente non esistono terapie risolutive per
questa patologia. La nostra ricerca ha come oggetto lo sviluppo di una terapia cellulo-mediata
per la SLA basata sul trapianto di cellule staminali neuronali (NSCs) ottenute da cellule
staminali pluripotenti indotte (iPSC). Nel nostro laboratorio, abbiamo generato linee cellulari
iPSC da pazienti SLA e da soggetti sani con un metodo non virale e le abbiamo caratterizzate
verificandone la pluripotenza e l’espressione di marker specifici di staminalità. Abbiamo
quindi differenziato le iPSCs in NSCs isolando diverse sottopopolazioni cellulari in
particolare una sottopopolazione con una elevata attività aldeide deidrogenasica, basso side
scatter ed elevata espressione per il marcatore VLA4. Dopo aver differenziato le cellule
NSCs-ALDHhiSSCloVLA4 mediante l’utilizzo di specifici protocolli già validati nel nostro
laboratorio, le abbiamo trapiantate a livello sistemico e a livello intratecale nel modello
murino di SLA SOD1G93A. Le cellule NSC trapiantate hanno dimostrato una buona capacità
di migrazione e di integrazione nel sistema nervoso ospite con entrambi i metodi di
somministrazione. I modelli SLA trattati hanno presentato un miglioramento delle funzioni
neuromuscolari e un aumento della sopravvivenza soprattutto a seguito dell’iniezione
sistemica. Abbiamo inoltre identificato la produzione di fattori neurotrofici e la riduzione di
micro e macrogliosi, come i meccanismi molecolari responsabili di questi effetti positivi,
43
come dimostrato dagli esperimenti di immunoistochimica e di ELISA. Abbiamo inoltre
dimostrato che le NSC inducono un decremento dell’astrogliosi reattiva attraverso
l’attivazione del recettore vanilloide TRPV1. Attualmente stiamo valutando la possibilità di
selezionare le NSCs non solo per l’integrina VLA4, ma anche per CXCR4, un recettore
importante per la migrazione cellulare. Il nostro studio ha dimostrato che il trapianto di NSC
può avere un effetto positivo nella SLA, potenzialmente utile anche nell’ambito di altre
malattie del motoneurone.
Pubblicazioni
Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Riboldi G, Faravelli I, Zanetta C,
Hum Mol Genet. 2014 Jan 15;23(2):342-54.
Sviluppo di una terapia genica per l’Atrofia Muscolare Spinale con Distress
Respiratorio di tipo 1 (Nizzardo et al., submitted)
La causa della SMARD1 è stata attribuita ad una mutazione localizzata sul cromosoma 11q13
a livello del gene IGHMBP2. In un’altra patologia del motoneurone, l’Atrofia Muscolare
Spinale (SMA), è stato dimostrato recentemente che la terapia genica mediata dall’adenovirus
AAV9 può portare al recupero del fenotipo nel modello animale. Attualmente è in corso un
trial clinico che prevede l’utilizzo di questa strategia nella SMA.
Nel nostro studio abbiamo dimostrato che sostituendo il gene mutato nel modello animale di
SMARD1 è possibile recuperarne il fenotipo patologico. Abbiamo somministrato per via
sistemica il gene wild-type IGHMBP2 utilizzando come vettore l’adenovirus associato del
sierotipo 9 (AAV9) e abbiamo riscontrato, in seguito a questo trattamento, il ripristino dei
livelli di proteina wild-type e il recupero delle funzioni motorie, della fisiologia
neuromuscolare e della sopravvivenza. Per valutare questa strategia nel modello cellulare
umano, motoneuroni derivati dalle iPSC generate da fibroblasti di pazienti affetti da
SMARD1 sono stati trasfettati con il gene wild-type IGHMBP2. Anche in questo modello
cellulare è stato possibile rilevare un aumento della sopravvivenza e della lunghezza assonale
dei motoneuroni trattati.
I nostri data supportano il potenziale traslazionale di una terapia genica mediata da AAV9 per
la patologia SMARD1, ponendo le basi per poter testare questo approccio terapeutico in trial
clinici umani.
Pubblicazioni
44
Monica Nizzardo, Chiara Simone, Federica Rizzo, Sabrina Salani, Sara Dametti, Paola
Rinchetti, Roberto Del Bo, Kevin Foust, Brian Kaspar, Nereo Bresolin, Giacomo P. Comi, and
Stefania Corti. Gene therapy rescues disease phenotype in a SMARD1 mouse model.
Manuscript submitted
Sviluppo di una terapia con oligonucleotidi per l’Atrofia Muscolare Spinale e la Sclerosi
Laterale Amiotrofica (SLA) (Nizzardo et al., 2014)
L’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) e la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) sono malattie
del motoneurone per le quali attualmente non esiste una terapia efficace. La SMA è causata da
mutazioni del gene “Survival Motor Neuron 1” (SMN1), con conseguente riduzione dei livelli
della proteina SMN. Nel genoma umano è presente un gene paralogo di SMN1, ossia SMN2,
che differisce da SMN1 per pochi nucleotidi tra cui un nucleotide critico nell’esone 7. Questo
nucleotide determina una modificazione nello splicing di SMN2, con conseguente perdita
dell’esone 7 nel trascritto maturo e produzione di una proteina SMN tronca e non funzionante.
Un promettente approccio terapeutico è rappresentato dall’utilizzo di oligonucleotidi
antisenso (ASO) in particolare con chimica morfolino (MO), per modificare lo splicing di
SMN2 ed incrementare l’espressione della proteina SMN. In questo progetto abbiamo
disegnato e prodotto una molecola di MO della lunghezza di 25 nucleotidi, complementare
alla regione ISS-N1 del gene SMN2. Abbiamo dimostrato che questa sequenza è in grado di
modificare lo splicing di SMN2 nel modello murino di SMA, con aumento dei livelli di
espressione della proteina SMN funzionale. I topi trattati hanno presentato un miglioramento
fenotipico con una maggiore sopravvivenza e ripristino della funzionalità neuromuscolare.
Partendo da questi presupporti stiamo studiando un metodo per incrementare la
biodistribuzione del morfolino nei tessuti attraverso la coniugazione con peptidi.
Mentre la SMA è una malattia a causa genetica, la maggior parte dei casi di SLA non
presentano una chiara eziologia genetica e sono definiti come casi sporadici, mentre il 10%
sono casi familiari. Tuttavia sono stati identificati diversi geni correlati allo sviluppo della
patologia e particolarmente frequenti sono risultate le mutazioni a carico del gene che codifica
per una proteina, la Cu/Zn superossidodismutasi 1 (SOD1). È stato ipotizzato che alterazioni
della proteina SOD1, quali l’errato misfolding con successiva aggregazione all’interno del
citoplasma, abbiano un effetto tossico sia nei casi familiari sia in quelli sporadici, quindi la
riduzione della quantità di proteina mutata potrebbe rallentare la progressione della malattia.
Abbiamo quindi pensato di applicare la strategia con oligonucleotidi antisenso per ridurre la
45
sintesi della proteina SOD1 mutata. I nostri dati preliminari dimostrano l’efficacia degli
oligonucleotidi nel ridurre la proteina mutata in vitro e in vivo.
Il nostro lavoro contribuirà allo sviluppo di una terapia per le malattie del motoneurone a
causa genetica, applicabile successivamente, con le dovute modifiche, ad altre patologie
neurodegenerative.
Pubblicazioni
Monica Nizzardo, Chiara Simone, Sabrina Salani, Marc-David Ruepp, Federica Rizzo,
Margherita Ruggieri, Simona Brajkovic, Hong Moulton, Oliver Muehlemann, Nereo Bresolin,
Giacomo P. Comi and Stefania Corti,
Combined Systemic and Local Morpholino Treatment Rescues the Phenotype of SMA Δ7
Mouse Model. Clinical Therapeutics, 2014
Manoscritto in preparazione
Cellule staminali pluripotenti indotte per lo sviluppo di un approccio terapeutico per la
Charchot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) (Rizzo et al., manuscript in preparation)
La malattia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2A (CMT2A) è una polineuropatia sensitivomotoria caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni motori e sensitivi, che risulta in una
progressiva debolezza agli arti, atrofia muscolare e perdita della sensibilità. La patologia è
dovuta a mutazioni nel gene Mitofusina 2 (MFN2), che codifica per una proteina localizzata a
livello dei mitocondri, essenziale per la sopravvivenza delle cellule e per il loro corretto
funzionamento. Ad oggi, purtroppo non esistono terapie risolutive per questa patologia.
Obiettivo del nostro studio è approfondire la conoscenza dei meccanismi responsabili della
malattia, identificare nuovi bersagli terapeutici e definire biomarcatori del fenotipo
patologico.
In questo progetto, abbiamo inizialmente ottenuto fibroblasti da pazienti affetti da CMT2A
che presentavano diverse mutazioni nel gene MFN2. La riprogrammazione di queste cellule in
iPSC e il successivo differenziamento in motoneuroni e neuroni sensitivi ci ha offerto la
possibilità di ottenere un modello in vitro specifico della malattia. Sfruttando questa metodica,
abbiamo ottenuto diverse linee di iPSC da pazienti CMT2A e abbiamo dimostrato il
differenziamento in motoneuroni paziente specifici. Le cellule così ottenute presentano alcuni
aspetti tipici della patologia, come le alterazioni della localizzazione dei mitocondri, la
riduzione della quantità di DNA mitocondriale e dell’attività dei complessi della catena
respiratoria. Questi difetti sono risultati più evidenti nelle cellule neuronali rispetto ai
fibroblasti, in accordo con la specificità neuronale della patologia. Accanto ai modelli in vitro,
abbiamo condotto le analisi degli stessi aspetti anche nell’unico modello murino attualmente
46
disponibile di CMT2A (MitoCharc1), con lo scopo di caratterizzarlo in modo approfondito e
di individuare biomarcatori specifici del fenotipo patologico. Ci siamo dedicati anche allo
sviluppo di un approccio terapeutico per questa patologia. A questo proposito, abbiamo
silenziato il gene MFN2 endogeno mediante short hairpin RNA (shRNA) nei fibroblasti
CMT2A. In parallelo, nelle stesse cellule, per recuperare i normali livelli di espressione del
gene MFN2, abbiamo introdotto il c-DNA del gene MFN2 sano modificato in modo da
resistere al processo di silenziamento. I risultati ottenuti con questa strategia nei fibroblasti
CMT2A sono stati molto promettenti e ci hanno permesso di ottenere alcuni dati preliminari
anche nel modello murino.
Questo studio ha contribuito ad approfondire i meccanismi molecolari patogenetici attraverso
la generazione di un modello in vitro di CMT2A con iPSC specifiche dei pazienti e di
identificare una possibile strategia terapeutica per la CMT2A.
Pubblicazioni
Manoscritto in preparazione
Sviluppo di una terapia per l’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) attraverso un approccio
di genome editing (Dametti et al.; Nizzardo et al., manuscripts in preparation)
L’Atrofia Muscolare Spinale (SMA) è una malattia a trasmissione autosomica recessiva,
caratterizzata dalla progressiva perdita dei motoneuroni spinali. La SMA costituisce la causa
genetica più comune di mortalità infantile. Essa è dovuta a mutazioni a livello del gene
Survival Motor Neuron 1 (SMN1), che causano la diminuzione dei livelli cellulari della
proteina SMN da esso codificata. Questa proteina svolge un ruolo fondamentale nella
sopravvivenza dei motoneuroni: una quantità insufficiente di SMN ha come conseguenza la
degradazione dei motoneuroni. Nel genoma umano è presente il gene omologo SMN2, che
differisce da SMN1 per pochi nucleotidi. In particolare, la transizione nucleotidica C-T
nell’esone 7 causa un’alterazione di splicing che comporta l’esclusione dell’esone 7 nella
maggior parte dei trascritti (SMNΔ7). Solo il 10% della proteina codificata da SMN2 è full
lenght e funzionante; il rimanente 90% consiste in una forma proteica tronca e
funzionalmente difettosa. Non esiste una terapia della SMA, quindi la ricerca di nuove
strategie terapeutiche è fondamentale.
Un possibile approccio sperimentale consiste in un intervento a livello della sequenza del
gene SMN2 in modo da compensare la perdita di SMN1 utilizzando le tecniche di genome
editing, che offrono la possibilità di effettuare la correzione in situ del gene. Lo sviluppo delle
Zinc Finger Nuclease (ZFN) ha permesso l’applicazione del genome editing in linee cellulari
primarie e pluripotenti, tra cui le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). È stato
47
dimostrato che le ZFN sono in grado di promuovere un efficiente genome editing attraverso il
processo di riparazione per ricombinazione omologa, inducendo una rottura sito-specifica nel
doppio filamento di DNA.
Nel nostro laboratorio stiamo elaborando una strategia terapeutica per la SMA utilizzando le
NSC differenziate da cellule staminali specifiche di pazienti SMA corrette ex-vivo.
Inizialmente abbiamo corretto nelle iPSCs-SMA il gene SMN2, convertendolo in SMN1,
attraverso la strategia delle ZFN. Abbiamo in programma il differenziamento delle iPSCs
corrette in NSC, che verranno trapiantate, per via intratecale, nel modello murino di SMAΔ7.
Confronteremo l’efficacia terapeutica delle cellule corrette rispetto alle cellule wild-type e
alle cellule SMA non corrette e ne valuteremo parametri quali la sopravvivenza,
differenziamento e funzionalità.
Pubblicazioni
Nizzardo M., Simone C., Dametti S., Ramirez A., Dal Mas A., Frattini E., Riboldi G., Magri
F., Bresolin N., Pagani F., Comi G.P., Corti S.
Bucchia M., Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Dametti S., Ramirez A., Frattini E.,
Pagliarani S., Bresolin N., Pagani F., Comi GP, Corti S.
Moving to RNA-Based treatment strategies, SFN
Manoscritti in preparazione
48
ELENCO LAVORI SCIENTIFICI 2014
Articoli in extenso
1: Frattini E, Ruggieri M, Salani S, Faravelli I, Zanetta C, Nizzardo M, Simone C, Magri F,
Corti S. Pluripotent stem cell-based models of spinal muscular atrophy. Mol Cell Neurosci.
2014 Dec 12;64C:44-50. doi: 10.1016/j.mcn.2014.12.005. [Epub ahead of print]
PubMed PMID: 25511182.
2: Smith BN, Ticozzi N, Fallini C, Gkazi AS, Topp S, Kenna KP, Scotter EL, Kost J, Keagle
P, Miller JW, Calini D, Vance C, Danielson EW, Troakes C, Tiloca C, Al-Sarraj S, Lewis
EA, King A, Colombrita C, Pensato V, Castellotti B, de Belleroche J, Baas F, ten Asbroek
AL, Sapp PC, McKenna-Yasek D, McLaughlin RL, Polak M, Asress S, Esteban-Pérez J,
Muñoz-Blanco JL, Simpson M; SLAGEN Consortium, van Rheenen W, Diekstra FP, Lauria
G, Duga S, Corti S, Cereda C, Corrado L, Sorarù G, Morrison KE, Williams KL, Nicholson
GA, Blair IP, Dion PA, Leblond CS, Rouleau GA, Hardiman O, Veldink JH, van den Berg
LH, Al-Chalabi A, Pall H, Shaw PJ, Turner MR, Talbot K, Taroni F, García-Redondo A, Wu
Z, Glass JD, Gellera C, Ratti A, Brown RH Jr, Silani V, Shaw CE, Landers JE.
Exome-wide rare variant analysis identifies TUBA4A mutations associated with familial ALS.
Neuron. 2014 Oct 22;84(2):324-31. doi: 10.1016/j.neuron.2014.09.027. Epub 2014 Oct 22.
3: Rizzuti M, Nizzardo M, Zanetta C, Ramirez A, Corti S.
Therapeutic applications of the cell-penetrating HIV-1 Tat peptide. Drug Discov Today. 2014
Sep 30. pii: S1359-6446(14)00383-3. doi: 10.1016/j.drudis.2014.09.017. [Epub ahead of
print]
4: Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Riboldi G, Salani S, Bucchia M, Bresolin N,
Comi GP, Corti S.
Stem Cell Reports. 2014 Aug 12;3(2):297-311. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.06.004. Epub
2014 Jul 4. PubMed PMID: 25254343; PubMed Central PMCID: PMC4176534.
5: Porro F, Rinchetti P, Magri F, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Zanetta C, Faravelli I,
Corti S. The wide spectrum of clinical phenotypes of spinal muscular atrophy with respiratory
distress type 1: a systematic review.
J Neurol Sci. 2014 Nov 15;346(1-2):35-42. doi: 10.1016/j.jns.2014.09.010. Epub 2014 Sep
16. PubMed PMID: 25248952.
6: Faravelli I, Bucchia M, Rinchetti P, Nizzardo M, Simone C, Frattini E, Corti S.
Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells:
experimental approaches and clinical perspectives.
Stem Cell Res Ther. 2014 Jul 14;5(4):87. doi: 10.1186/scrt476. PubMed PMID: 25157556;
PubMed Central PMCID: PMC4100331.
7: Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti
S, Corti S, Moggio M, Bresolin N, Comi GP.
Glycogen storage disease type III: A novel Agl knockout mouse model. Biochim Biophys Acta.
2014 Nov;1842(11):2318-28. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.07.029. Epub 2014 Aug 1. PubMed
PMID: 25092169.
49
8: Lanfranconi S, Ronchi D, Ahmed N, Civelli V, Basilico P, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
A novel CCM1 mutation associated with multiple cerebral and vertebral cavernous
malformations. BMC Neurol. 2014 Aug 3;14:158. doi: 10.1186/s12883-014-0158-3. PubMed
PMID: 25086949; PubMed Central PMCID: PMC4236643.
9: Bushby K, Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW,
RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP
(Corti S).
Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy.
Muscle Nerve. 2014 Oct;50(4):477-87. doi: 10.1002/mus.24332. PubMed PMID: 25042182;
PubMed Central PMCID: PMC4241581.
10: van Doormaal PT, Ticozzi N, Gellera C, Ratti A, Taroni F, Chiò A, Calvo A, Mora G,
Veldink JH.
Analysis of the KIFAP3 gene in amyotrophic lateral sclerosis: a multicenter survival study.
Neurobiol Aging. 2014 Oct;35(10):2420.e13-4. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.04.014.
Epub 2014 Apr 19. PubMed PMID: 24838185.
11: Riboldi G, Zanetta C, Ranieri M, Nizzardo M, Simone C, Magri F, Bresolin N, Comi GP,
Corti S.
Antisense oligonucleotide therapy for the treatment of C9ORF72 ALS/FTD diseases.
Mol Neurobiol. 2014 Dec;50(3):721-32. doi: 10.1007/s12035-014-8724-7. Epub 2014 May
9. PubMed PMID: 24809691.
12: Di Fonzo A, Ronchi D, Gallia F, Cribiù FM, Trezzi I, Vetro A, Della Mina E, Limongelli
I, Bellazzi R, Ricca I, Micieli G, Fassone E, Rizzuti M, Bordoni A, Fortunato F, Salani S,
Mora G, Corti S, Ceroni M, Bosari S, Zuffardi O, Bresolin N, Nobile-Orazio E, Comi GP.
Lower motor neuron disease with respiratory failure caused by a novel MAPT mutation.
Neurology. 2014 Jun 3;82(22):1990-8. doi: 10.1212/WNL.0000000000000476. Epub 2014
May 7. PubMed PMID: 24808015.
13: Pupillo E, Messina P, Giussani G, Logroscino G, Zoccolella S, Chiò A, Calvo A, Corbo
M, Lunetta C, Marin B, Mitchell D, Hardiman O, Rooney J, Stevic Z, Bandettini di Poggio
M, Filosto M, Cotelli MS, Perini M, Riva N, Tremolizzo L, Vitelli E, Damiani D, Beghi E;
EURALS Consortium (Corti S).
Physical activity and amyotrophic lateral sclerosis: a European population-based casecontrol study.
Ann Neurol. 2014 May;75(5):708-16. doi: 10.1002/ana.24150. Epub 2014 May 21. PubMed
PMID: 24706338.
14: Faravelli I, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Zanetta C, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Stem cell transplantation for amyotrophic lateral sclerosis: therapeutic potential and
perspectives on clinical translation.
Cell Mol Life Sci. 2014 Sep;71(17):3257-68. doi: 10.1007/s00018-014-1613-4. Epub 2014
Apr 4. Review. PubMed PMID: 24699704.
50
15: Nizzardo M, Simone C, Salani S, Ruepp MD, Rizzo F, Ruggieri M, Zanetta C, Brajkovic
S, Moulton HM, Müehlemann O, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Effect of combined systemic and local morpholino treatment on the spinal muscular atrophy
Δ7 mouse model phenotype.
Clin Ther. 2014 Mar 1;36(3):340-56.e5. doi: 10.1016/j.clinthera.2014.02.004. PubMed
PMID: 24636820.
16: Ulzi G, Sansone VA, Magri F, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Lucchiari S.
In vitro analysis of splice site mutations in the CLCN1 gene using the minigene assay.
Mol Biol Rep. 2014 May;41(5):2865-74. doi: 10.1007/s11033-014-3142-5. Epub 2014 Jan
23. PubMed PMID: 24452722.
17: Zanetta C, Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Faravelli I, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Molecular, genetic and stem cell-mediated therapeutic strategies for spinal muscular atrophy
(SMA).
J Cell Mol Med. 2014 Feb;18(2):187-96. doi: 10.1111/jcmm.12224. Epub 2014 Jan 8.
PubMed PMID: 24400925; PubMed Central PMCID: PMC3930406.
18: Zanetta C, Nizzardo M, Simone C, Monguzzi E, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Molecular therapeutic strategies for spinal muscular atrophies: current and future clinical
trials. Clin Ther. 2014 Jan 1;36(1):128-40. doi: 10.1016/j.clinthera.2013.11.006. Epub 2013
Dec 17. PubMed PMID: 24360800.
19: Fogh I, Ratti A, Gellera C, Lin K, Tiloca C, Moskvina V, Corrado L, Sorarù G, Cereda C,
Corti S, Gentilini D, Calini D, Castellotti B, Mazzini L, Querin G, Gagliardi S, Del Bo R,
Conforti FL, Siciliano G, Inghilleri M, Saccà F, Bongioanni P, Penco S, Corbo M, Sorbi S,
Filosto M, Ferlini A, Di Blasio AM, Signorini S, Shatunov A, Jones A, Shaw PJ, Morrison
KE, Farmer AE, Van Damme P, Robberecht W, Chiò A, Traynor BJ, Sendtner M, Melki J,
Meininger V, Hardiman O, Andersen PM, Leigh NP, Glass JD, Overste D, Diekstra FP,
Veldink JH, van Es MA, Shaw CE, Weale ME, Lewis CM, Williams J, Brown RH, Landers
JE, Ticozzi N, Ceroni M, Pegoraro E, Comi GP, D'Alfonso S, van den Berg LH, Taroni F,
Al-Chalabi A, Powell J, Silani V;
SLAGEN Consortium and Collaborators. A genome-wide association meta-analysis identifies
a novel locus at 17q11.2 associated with sporadic amyotrophic lateral sclerosis.
Hum Mol Genet. 2014 Apr 15;23(8):2220-31. doi: 10.1093/hmg/ddt587. Epub 2013 Nov 20.
20: Compagnucci C, Nizzardo M, Corti S, Zanni G, Bertini E.
In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology.
Cell Mol Life Sci. 2014 May;71(9):1623-39. doi: 10.1007/s00018-013-1511-1. Epub 2013
Nov 20. PubMed PMID: 24252976.
21: Ruggieri M, Riboldi G, Brajkovic S, Bucchia M, Bresolin N, Comi GP, Corti S.
Induced neural stem cells: methods of reprogramming and potential therapeutic applications.
Prog Neurobiol. 2014 Mar;114:15-24. doi: 10.1016/j.pneurobio.2013.11.001. Epub 2013
Nov 15. PubMed PMID: 24246715.
22: Rizzo F, Riboldi G, Salani S, Nizzardo M, Simone C, Corti S, Hedlund E.
Cellular therapy to target neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis.
Cell Mol Life Sci. 2014 Mar;71(6):999-1015. doi: 10.1007/s00018-013-1480-4. Epub 2013
Oct 8. PubMed PMID: 24100629; PubMed Central PMCID: PMC3928509.
51
23: Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Riboldi G, Faravelli I, Zanetta C,
Hum Mol Genet. 2014 Jan 15;23(2):342-54. doi: 10.1093/hmg/ddt425. Epub 2013 Sep 4.
Abstracts presentati a Congressi Internazionali
1 Ronchi D, Ripolone M, Barca E, Berardinelli A, Morandi L, Mora M, Bordoni A, Fortunato
F, Fagiolari G, Violano R, Vallejo D, Corti S, Toscano A, Sciacco M, DiMauro S, Comi G,
Moggio M.
Defective Muscle Mitochondrial Biogenesis in Spinal Muscular Atrophy.
2014.
2 Ronchi D, Bonato S, Di Biase E, Melzi V, Trezzi I, Corti S, Bresolin N, Comi GP, Di
Fonzo A. Mutational Analysis of COQ2 in Italian Patients with MSA.
2014
3 Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S,
S.
2014
4 Corti S, Simone C, Nizzardo M, Rizzo F, Ruggieri M, Salani S, Bucchia M, Rinchetti P,
Zanetta C, Faravelli I, Monguzzi E, Magri F, Bresolin N, Comi G. iPSC-Derived Neural Stem
Cells Ameliorate The Phenotype Of Spinal Muscular Atrophy with Respiratory Distress Type
1 (SMARD1). 66th Annual Meeting of American Academy of Neurology, Philadelphia 2014,
Neurology 2014
5 Riboldi G, Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Ruggieri M, Pagliarani S, Ulzi G, Salani S,
S.
2014
6 Corti S and Hedlund H.
Identification of oculomotor-restricted genes with motor neuron protective properties for the
development of ALS therapeutics.
TLF meeting 2014
7 Nizzardo M, Simone C, Rizzo F, Bucchia M, Dametti S, Ramirez A, Corti S
ALS therapy via transplantation of an iPSC-derived LeX+CXCR4+VLA4+ neural stem cell
subpopulation.
ENCALS meeting Leuven 2014
52
8 Riboldi, G. Rizzo, F. Ranieri, M. Brajkovic, S. Stuppia, G. Nizzardo, M. Simone, C.
Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Magri, F. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S.
TI Modelling pathogenesis and treatment of Mitofusin 2 disease using patient-specific iPSCs
EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY, 21 EP1161 BP 136 EP 136 SU 1 PD MAY 2014
Joint Congress of European Neurology MAY 31-JUN 03, 2014 CL Istanbul, TURKEY
European Federat Neurol Soc PT J
9 Lanfranconi, S. Ronchi, D. Ahmed, N. Basilico, P. Bresolin, N. Comi, G. P. Corti, S. P.
TI A novel mutation in KRIT1 gene associated with familial cerebral cavernous
malformations EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21 EP2115 BP 184 MAY 2014
10 Ranieri, M. Riboldi, G. Brajkovic, S. Corti, S. Simone, C. Nizzardo, M. Rizzo, F.
Ruggieri, M. Salani, S. Bucchia, M. Rinchetti, P. Zanetta, C. Faravelli, I. Monguzzi, E. Magri,
F. Bresolin, N. Comi, G. P.
TI iPSC-derived neural stem cells improve the phenotype of spinal muscular atrophy with
respiratory distress type 1 (SMARD1) EUROPEAN JOURNAL OF NEUROLOGY VL 21
EP4117 BP 328 MAY 2014
11 Brajkovic, S. Riboldi, G. Ranieri, M. Nizzardo, M. Simone, C. Rizzo, F. Ruggieri, M.
Salani, S. Dal Mas, A. Bucchia, M. Frattini, E. Stuppia, G. Magri, F. Bresolin, N. Pagani, F.
Comi, G. P. Corti, S.
TI RNA-based strategies leading to either an increase of SMN or modulation of disease
pathways ameliorated spinal muscular atrophy phenotype EUROPEAN JOURNAL OF
NEUROLOGY VL 21 EP4119 MAY 2014
12 Magri F., Govoni A., Del Bo R., D'angelo MG., Gandossini S., Brusa R., Colombo I.,
Moroni I., Mongini T., Mora M., Angelini C., Tomelleri G., Siciliano G., Toscano A., Corti
S., Bresolin N., Comi GP.,
Natural history and peculiar aspects in LGMD2B.
July 5-10, 2014
13 Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., DalMas A., Bucchia M.,
Frattini E., Stuppia G., Riboldi G., Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi GP., Corti S.
July 5-10, 2014
July 5-10, 2014
15. Simone C., Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Riboldi G., Salani S., Bucchia M.,
Rinchetti P., Porro F., Bresolin N., Comi GP Corti S.
53
SMARD1,
SFN 2014
16 Bucchia M., Nizzardo M., Simone C., Rizzo F., Ulzi G., Dametti S., Ramirez A., Frattini
E., Pagliarani S., Bresolin N., Pagani F., Comi GP, Corti S.
Moving to RNA-Based treatment strategies,
SFN
Abstracts presentati a Congressi Nazionali
1. Lucchiari S., Pagliarani S., Ulzi G., Modoni A., Scarlato M., Magri F., D’Amico A.,
Previtali S., Corti S., Meola G., Lo Monaco M., Sansone V., Comi G.P.
Genetic analysis of non- dystrophic myotonias in Italian patients,
2. Corti S., Simone C.; Nizzardo M., Rizzo F., Ruggieri M., Salani S., Bucchia M.,
Rinchetti P., Magri F., Bresolin N., Comi G.
spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 XIV Congress of the Italian Association of Myology (AIM), Sirmione 2014
3. Magri F., Govoni A., Brusa R., Angelini C., D’Angelo M.G., Mongini T., Toscano A.,
Sciacco M., Ricci G., Moroni I., Gandossini S., Del Bo R., Fortunato F., Ronchi D., Corti S.,
Moggio M., Bresolin N., Comi G.P.
The National Registry of limb Girdle Muscular dystrophy: clinical and molecular
characterization of a sample of 466 Italian patients
4. Nizzardo M., Simone C., Dametti S., Ramirez A., Dal Mas A., Frattini E., Riboldi G.,
Magri F., Bresolin N., Pagani F., Comi G.P., Corti S.
5. Ripolone M., Ronchi D., Violano R., Vallejo D., Fagiolari G., Lucchini V., Barca E.,
Bordoni A.,
Fortunato F., Corti S., Di Mauro S., Comi G.P., Sciacco M., Moggio M. Muscle
mitochondrial dysfunction due to defective mitochondrial biogenesis in SMA patients.
54
UOSD MALATTIE NEURODEGENERATIVE
Direttore: Prof. Elio Scarpini
Professore Associato di Neurologia
Dott.ssa Daniela Galimberti
Dottore di Ricerca Scienze Neurologiche e del
Dolore –Tecnico Laureato Università di Milano
Dottore di Ricerca Scienze Neurologiche e del
Dolore – Assegnista Università di Milano
Dottoranda di Ricerca Medicina Molecolare –
Università di Milano
Dottore di Ricerca in Medicina Molecolare Assegnista Università di Milano
Biologa - Borsista OMP
Biotecnologa-Borsista OMP
Neurologa Specialista – Dirigente medico OMP
Neurologa Specialista – Dirigente medico OMP
Neurologo Specialista - Dirigente medico OMP
Medico Specializzando
Psicologo –Borsista OMP
Psicologa- Dottore di Ricerca - Borsista OMP
Psicologa- Dottore di Ricerca – Borsista OMP
Psicologo – Dottorando di Ricerca - Università di
Milano
Segretaria – Borsista OMP
Segretario – Borsista OMP
Tecnico Laboratorio Ospedaliero
Laureanda Biologia
Dott.ssa Chiara Fenoglio
Dott.ssa Rossana Bonsi
Dott.ssa Maria Serpente
Dott.ssa Sara Cioffi
Dott.ssa Marina Arcaro
Dott.ssa Milena De Riz
Dott.ssa Anna Pietroboni
Dott. Andrea Arighi
Dott. Giorgio Fumagalli
Dott.ssa Laura Ghezzi
Dott. Alberto Calvi
Dott.ssa Paola Basilico
Dott. Roberto Vimercati
Dr.ssa Emanuela Rotondo
Dr.ssa Priscilla Corti
Dott. Matteo Mercurio
Sig.ra Daniela Da Lisca
Sig. Marco Milianti
Sig.ra Mahin Fardipoor
Sig.ra Serena Di Giorgio
55
1 - ATTIVITÀ CLINICA ED ASSISTENZIALE
Dal punto di vista clinico, il gruppo si è occupato di ricerche cliniche nel campo della Sclerosi
Multipla e della malattia di Alzheimer e demenze correlate. I pazienti sono stati seguiti dai
componenti del gruppo presso i seguenti Ambulatori Specialistici di “secondo livello”:
1.1. Ambulatorio Malattie Demielinizzanti del Sistema Nervoso Centrale
Nel corso dell’anno 2014 sono giunti all’ambulatorio per le Malattie Demielinizzanti circa 80
nuovi pazienti.
Il numero totale di visite nel corso del 2014 è stato di più di 800 in ambulatori dedicati alla
Sclerosi Multipla, attivi sia al mattino che al pomeriggio.
È operativo un servizio di Day Hospital per consentire ai pazienti di sottoporsi a trattamenti
quali la somministrazione di cortisonici ad alto dosaggio e. v. e l’infusione di
Immunoglobuline e.v. nonché di effettuare tutte le procedure diagnostiche. Sono stati
effettuati circa 200 ricoveri in Day Hospital.
Il Servizio è riconosciuto tra i Centri Provinciali autorizzati dalla Regione Lombardia alla
dispensazione del beta-Interferone Ia e Ib, del Copaxone, del Tysabri (Natalizumab) e del
Gylenia (Fingolimod). In particolare, sono al momento registrati in File F per il trattamento
260 pazienti.
1.2. Ambulatorio per la Diagnosi e la Terapia dei Disturbi Cognitivi e della Memoria
Nel corso dell’anno sono giunti all’ambulatorio per la Diagnosi e la Terapia dei Disturbi
Cognitivi e della Memoria circa 250 nuovi pazienti. Complessivamente sono state eseguite
circa 1200 visite, in ambulatori attivi dal lunedì al venerdì, sia mattina che pomeriggio.
Sono stati effettuati 200 ricoveri in regime di Day Hospital per accertamenti diagnostici.
Dall’ottobre 2000 il Centro è stato riconosciuto da parte della Regione Lombardia come
“Unità Valutazione Alzheimer” (U.V.A) ed inserito nel Progetto CRONOS del Ministero della
Sanità. Presso tale Centro afferiscono pazienti con sospetto decadimento cognitivo, inviati dal
medico di base o dallo specialista, onde essere sottoposti ad un inquadramento diagnostico
rivolto alla malattia di Alzheimer e demenze correlate, ai fini dell’inserimento nel progetto
CRONOS che prevede l’erogazione gratuita dei nuovi farmaci anticolinesterasici. Nell’ambito
del progetto CRONOS risultano al momento registrati per terapia con anticolinesterasici 260
pazienti. Inoltre, 8 pazienti sono registrati in File F per trattamento con memantina (Ebixa).
Riguardo gli esami diagnostici per Sclerosi Multipla, malattia di Alzheimer e Degenerazione
Lobare Frontotemporale, sono state effettuate le seguenti prestazioni (sia per pazienti degenti
che richieste da ospedali esterni):
- esame liquor, IEF per diagnosi di sclerosi multipla: 170
-
dosaggio Amiloide, Tau totale e fosforilata nel liquor per diagnosi Alzheimer: 250
-
progranulina plasmatica: 130
-
estrazione DNA, mutazioni MAPT, progranulina, PS1 e 2, APP: 90.
2 - SPERIMENTAZIONI CLINICHE (multicentriche, randomizzate)
Open-label, single-arm extention study to the duble-blind, randomized, multicenter, placebocontrolled, parallel-group study comparing the efficacy and safety of 0.5 mg FTY720
administered orally once daily versus placebo in patients with primary progressive multiple
sclerosis CFTY720D2306E1
56
Long term, prospective, non-interventional,multinational, parallel-cohort study monitoring
safety in patients with MS recently initiated with fingolimod once daily or treated with
another approved disease-modifying therapy, Novartis, prot. CFTY720D2406
Transition: A two-year observational study to evaluate the safety profile of fingolimod in
patients with MS who switch from natalizumab to fingolimod, Novartis, prot.
CFTY720D2405
Studio multicentrico, in aperto, a un solo gruppo di trattamento per valutare la sicurezza , la
tollerabilità e l’efficacia a lungo termine di 0.5 mg di fingolimod (FTY720) somministrato
per via orale una volta al giorno in pazienti con sclerosi multipla, Novartis, prot.
CFTY720D2399
A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study of the efficacy of
Natalizumab on reducing disability progression in subjects with Secondary Progressive
Multiple Sclerosis, with optional open-label extension, Biogen, prot. 101MS326
A multicenter, randomized, double-blind, parallel-group, placebo-controlled variable
treatment duration study evaluating the efficacy and safety of Siponimod (BAF312) in
patients with secondry progressive MS, Novartis, prot. CBAF312A2304
Studio osservazionale, della durata di 12 mesi, prospettico, che valuta l'impatto del
trattamento con DMT sui disturbi dell'umore nei pazienti che hanno ricevuto una diagnosi
recente di SM, TEVA, prot. POSIDONIA
A Phase 2/3, Multi-Center, Randomized, Double-Blind, placebo-controlled (Part A) and
double-blind, double-dummy, active-controlled (Part B), parallel group study to evaluate the
efficacy and safety of RPC1063 administered orally to relapsing MS patients, Receptos, prot.
RPC1063
Observational, single-arm, multicenter one-day trial in Relapsing-remitting Multiple Sclerosis
(RRMS) patients to characterize (in term of demographic, clinical and neurovegetative
aspects) the population for whom extended monitoring after the first dose of fingolimod
(Gilenya) was necessary CFTY720DIT08
A prospective observational study to depict the role of adherence as a tool of treatment
decision making in RMS subject experiencing first clinical relapse while on 1st line DMDs
(CHOICE)
Observational study mobility improvements with spasticity in multiple sclerosis with
additional treatment using sativex oromucosal spray (MOVE2)
A randomized, multicountry study to evaluate the effectiveness of flobetapir (18F) PET
imaging in changing patient management and to evaluate the relationship between florbetapir
(18F) PET scan status and cognitive decline (AVID)
Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Parallel-Group, 12-Month trial of leucomethylthioninium bis (hydromethanesulfotane) in subjects with Mild to moderate AD, TauRx
Therapeutics Ltd, prot. Trx-237-015
A Placebo-controlled, double-blind, parallel-group, Bayesian Adaptive randomization design
and dose Regimen-finding Study to evaluate safety,tolerability and efficacy of BAN2401 in
subjects with Early Alzheimer’s Disease, EISAI, prot. BAN2401
57
Randomised, double-blind, parallel-group, placebo-controlled, fixed-dose study of Lu
AE58054 in patients with mild-moderate AD treted with donepezil, Lundbeck, 14861A
A randomized, Placebo Controlled, Parallel-group, Double Blind efficacy and safety Trial of
MK-8931 in Subjects with mild to moderate Alzheimer’s Disease, Merck Serono, MK-8931017
A phase III, Randomized, placebo-controlled, parallel-group, double-blind clinical trial to
study the efficacy and safety of MK-8931 in subject with Amnestic Mild Cognitive
Impairment due to Alzheimer’s Disease (Prodromal AD), MK-8931-019
Continued Efficacy and Safety monitoring of solanezumab, an anti-amyloid beta antibody in
patients with Alzheimer’s disease (H8A-MC-LZAO)
Studio osservazionale in pazienti affetti da SM RR trattati con immunomodulanti
volontariamente non complianti, Quintiles, prot. OAK BIIT0112
Effect of passive Immunization on the progression of mild Alzheimer’s disease: Solanezumab
(LY2062430) versus Placebo H8A-MC-LZAX
A randomized, double-blind, Placebo-controlled, Parallel-group, 26-week, phase 3 study of
two doses of EVP-6124 or placebo in subjects with mild to moderate AD currently or
previously receiving an Acetylcholinesterase Inhibitor Medication EVP-6124-025
3. ATTIVITÀ DI RICERCA DI BASE
È attualmente presente presso la UOS Malattie Neurodegenerative e Demielinizzanti una
banca biologica comprendente:
1) circa 3300 campioni di DNA. Le patologie più rappresentate sono:
- 600 pazienti con diagnosi di Malattia di Alzheimer
- 400 con altri tipi di demenza (Degenerazione Lobare Frontotemporale, demenza a corpi
di Lewy, demenza vascolare, paralisi sopranucleare progressiva, degenerazione
corticobasale)
- 600 con diagnosi di Sclerosi Multipla
2) circa 400 campioni di liquido cerebrospinale, siero e plasma. Tra questi:
- 300 pazienti con Sclerosi Multipla
- 300 con patologie neurodegenerative (prevalentemente malattia di Alzheimer)
3) circa 500 cDNA ricavati da RNA estratto da cellule del sangue
Nel corso del 2014 l’attività del gruppo si è articolata sulle seguenti tematiche:
1)
Ruolo dei microRNA nella Sclerosi Multipla (SM)
Sono continuate le ricerche iniziate nel corso dello scorso anno, in particolare lo studio di
espressione di una nuova classe di molecole, i microRNA (miRNA) che diverse evidenze
sperimentali suggeriscono come possibili marcatori in patologie di varia natura ed eziogenesi. I
miRNA sono dei modulatori trascrizionali di numerosissimi geni tra i quali anche geni
propriamente implicati nella patogenesi della SM. Lo scopo di questo nuovo filone di ricerca è
quello di verificare la funzione e il livello di espressione di queste molecole al fine di stabilire
la loro possibile utilità come marcatore di patologia. Nel corso degli scorsi anni abbiamo
identificato alcuni microRNA deregolati nelle cellule circolanti di pazienti con SM (Fenoglio et
al., Multiple Sclerosis 2013), e messo a punto una tecnica per dosare i livelli di miRNA
circolanti, che permette di ottenere dati senza bisogno di isolare le cellule (Ridolfi et al., 2013).
Nel 2014 abbiamo proseguito questi studi in pazienti sottoposti a diversi tipi di trattamento
58
immonomodulante, e correlato l’andamento dei livelli di miRNA con i dati clinici e radiologici,
al fine di identificare un marcatore che predica la risposta al trattamento.
2) Analisi di mutazioni in pazienti con Degenerazione Lobare Frontotemporale e patologie
psichiatriche
Sono stati identificate nuove mutazioni in famiglie con forme autosomiche dominanti sia di
patologie neurodegenerative che con disturbo bipolare o schizofrenia. Sulla popolazione di
pazienti sporadici sono stati effettuati studi di associazione ed identificati fattori di rischio
genetici e sono stati analizzati i livelli di molecole infiammatorie nel siero e nel liquido
cefalorachidiano.
3) Studi di associazione e di espressione in pazienti con malattia di Alzheimer e studio dei
miRNA circolanti a livello del liquido cefalorachidiano e del siero.
I progetti di ricerca sono stati sviluppati grazie alla collaborazione con Centri sia italiani che
stranieri.
Tra i primi vi sono:
- Prof. A. Maggi, Centro di Biotecnologie Farmacologiche, Dipartimento di Scienze
Farmacologiche, Università di Milano
- Prof. C. Mariani, Ospedale L. Sacco, Milano
- Dott. G. Forloni, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano
- Dr. G. Frisoni, IRCCS S. Giovanni di Dio Fatebenefratelli, Brescia
- Dr. S. Cappa, Ospedale S. Raffaele Ville Turro, Milano
- Prof. A. Padovani, Università di Brescia
- Prof. I. Rainero, prof.ssa M.T. Giordana, Università di Torino
Tra i centri esteri:
- Dr. R.P. Lisak, Dip. di Neurologia, Detroit (USA)
- Prof. P. Scheltens, Dept. of Neurology, VU University Medical Center, Amsterdam, The
Nertherlands
- Dr. Howard Feldman, Dept. of Neurology, University of British Columbia, Vancouver,
Canada
- Prof. A. Compston, Dr. Steven Sawcer, Dept. of Neurology, Cambridge, UK
- Dr. A. Reif, Dept. Of Psychiatry and Psychotherapy, Julius-Maximilians-University,
Wurzburg, Germany
- Dr. Anne Cross, University of Saint Louis, USA
- Prof. Philippe Amouyel, Lille, France
- Dr. Jonathan Rohrer, UCL, London, UK
4. PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI CENSITE 2014
1. Borroni B, Grassi M, Bianchi M, Bruni AC, Maletta RG, Anfossi M, Pepe D,
Cagnin A, Caffarra P, Cappa S, Clerici F, Daniele A, Frisoni GB, Galimberti D,
Parnetti L, Perri R, Rainero I, Tremolizzo L, Turla M, Zanetti O, Padovani A.
Estimating the Inheritance of Frontotemporal Lobar Degeneration in the Italian
Population.
Journal of Alzheimer’s Disease 2014; 41(2):371-6. IF=3,612
2. Galimberti D, Arosio B, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi SM, Bonsi R, Rossi P,
Abbate C, Mari D, Scarpini E.
59
Incomplete Penetrance of the C9ORF72 Hexanucleotide Repeat Expansions:
Frequency in a Cohort of Geriatric Non-Demented Subjects.
Journal of Alzheimer’s Disease 2014;39(1):19-22. IF=3,612
3. Carecchio M, Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Scarpini E, Comi C, Terazzi
E, Cantello R.
Evidence of Pre-Synaptic Dopaminergic Deficit in a Patient with a Novel Progranulin
Mutation Presenting with Atypical Parkinsonism.
Journal of Alzheimer’s Disease 2014; 2014;38(4):747-52. IF=3,612
4. Grande G, Vanacore N, Maggiore L, Cucumo V, Ghiretti R, Galimberti D, Scarpini
E, Mariani C, Clerici F.
Physical Activity Reduces the Risk of Dementia in Mild Cognitive Impairment
Subjects: A Cohort Study.
Journal of Alzheimer’s Disease 2014;39(4):833-9. IF=3,612
5. Borroni B, Ferrari F, Galimberti D, Nacmias B, Barone C, Bagnoli S, Fenoglio C,
Piaceri I, Archetti S, Bonvicini C, Gennarelli M, Turla M, Scarpini E, Sorbi S,
Padovani A. Heterozygous TREM2 mutations in frontotemporal dementia.
Neurobiology of Aging 2014; 35(4):934.e7-10. IF=4,853
6. Calvi A, De Riz M, Pietroboni AM, Ghezzi L, Maltese V, Arighi A, Fumagalli GG,
Jacini F, Donelli C, Comi G, Galimberti D, Scarpini E.
Partial recovery after severe immune reconstitution inflammatory syndrome in a
multiple sclerosis patient with progressive multifocal leukoencephalopathy.
Immunotherapy 2014; 6(1): 23-8. IF=2,44
7. Galimberti D, Reif A, Dell'osso B, Palazzo C, Villa C, Fenoglio C, Kittel-Schneider
S, Leonhard C, Olmes DG, Serpente M, Paoli RA, Altamura AC, Scarpini E.
C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion as a rare cause of bipolar disorder.
Bipolar Disorders 2014; 16(4):448-9. IF=4,888
8. Galimberti D, Reif A, Dell'osso B, Kittel-Schneider S, Leonhard C, Herr A, Palazzo
C, Villa C, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi SM, Prunas C, Paoli RA, Altamura AC,
Scarpini E.
The C9ORF72 hexanucleotide repeat expansion is a rare cause of schizophrenia.
Neurobiology of Aging 2014; 35(5):1214.e7-1214.e10. IF=4,853
9. Fenoglio C, De Riz M, Villa C, Serpente M, Ridolfi E, Bonsi R, Cioffi SM, Barone
C, Pietroboni A, Calvi A, Scarpini E, Galimberti D.
C9ORF72 repeat expansion not detected in patients with multiple sclerosis.
10. Guaschino C, Esposito F, Liberatore G, Colombo B, Annovazzi P, D'Amico E,
Cavalla P, Capello E, Capra R, Galimberti D, Tedeschi G, Grimaldi L;
PROGRESSO Group; PROGEMUS Group, Leone M, D'Alfonso S, Martinelli V,
Comi G, Martinelli-Boneschi F.
Familial clustering in Italian progressive-onset and bout-onset multiple sclerosis.
Neurological Sciences 2014; 35(5):789-91. IF=1,495
11. Galimberti D, Prunas C, Paoli RA, Dell'osso B, Fenoglio C, Villa C, Palazzo C,
Cigliobianco M, Camuri G, Serpente M, Scarpini E, Altamura AC.
Progranulin gene variability influences the risk for bipolar I disorder, but not bipolar
II disorder.
60
Bipolar Disorders 2014; 16(7):769-72. IF=4,888
12. Abbate C, Arosio B, Galimberti D, Nicolini P, Rossi PD, Ferri E, Gussago C, Deriz
M, Fenoglio C, Serpente M, Scarpini E, Mari D.
Phenotypic Variability associated with the C9ORF72 Hexanucleotide Repeat
Expansion: A Sporadic Case of Frontotemporal Lobar Degeneration with Prodromal
Hyposmia and Predominant Semantic Deficits.
13. Serpente M, Bonsi R, Scarpini E, Galimberti D.
Innate immune system and inflammation in Alzheimer's disease: from pathogenesis to
treatment.
Neuroimmunomodulation 2014; 21(2-3):79-87. IF=1,779
14. Guerini FR, Clerici M, Cagliani R, Malhotra S, Montalban X, Forni D, Agliardi C,
Riva S, Caputo D, Galimberti D, Asselta R, Fenoglio C, Scarpini E, Comi GP,
Bresolin N, Comabella M, Sironi M.
No association of IFI16 (interferon-inducible protein 16) variants with susceptibility
to multiple sclerosis.
Journal of Neuroimmunology 2014; 271(1-2):49-52. IF=2,786
15. Xi Z, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Bruni AC, Maletta RG, Nacmias B, Sorbi S,
Galimberti D, Surace EI, Zheng Y, Moreno D, Sato C, Liang Y, Zhou Y, Robertson
J, Zinman L, Tartaglia MC, St George-Hyslop P, Rogaeva E.
Hypermethylation of the CpG-island near the C9orf72 G4C2-repeat expansion in
FTLD patients.
Human Molecular Genetics 2014; 23(21):5630-7. IF=6,677
16. Caso F, Agosta F, Magnani G, Galantucci S, Spinelli EG, Galimberti D, Falini A,
Comi G, Filippi M.
Clinical and MRI correlates of disease progression in a case of nonfluent/agrammatic
variant of primary progressive aphasia due to progranulin (GRN) Cys157LysfsX97
mutation.
Journal of the Neurological Sciences 2014; 342(1-2):167-72. IF=2,262
17. Escott-Price V, Bellenguez C, Wang LS, Choi SH, Harold D, Jones L, Holmans P,
Gerrish A, Vedernikov A, Richards A, DeStefano AL, Lambert JC, IbrahimVerbaas CA, Naj AC, Sims R, Jun G, Bis JC, Beecham GW, Grenier-Boley B,
Russo G, Thornton-Wells TA, Denning N, Smith AV, Chouraki V, Thomas C,
Ikram MA, Zelenika D, Vardarajan BN, Kamatani Y, Lin CF, Schmidt H, Kunkle
B, Dunstan ML, Vronskaya M; the United Kingdom Brain Expression Consortium,
Johnson AD, Ruiz A, Bihoreau MT, Reitz C, Pasquier F, Hollingworth P, Hanon O,
Fitzpatrick AL, Buxbaum JD, Campion D, Crane PK, Baldwin C, Becker T,
Gudnason V, Cruchaga C, Craig D, Amin N, Berr C, Lopez OL, De Jager PL,
Deramecourt V, Johnston JA, Evans D, Lovestone S, Letenneur L, Hernández I,
Rubinsztein DC, Eiriksdottir G, Sleegers K, Goate AM, Fiévet N, Huentelman MJ,
Gill M, Brown K, Kamboh MI, Keller L, Barberger-Gateau P, McGuinness B,
Larson EB, Myers AJ, Dufouil C, Todd S, Wallon D, Love S, Rogaeva E, Gallacher
J, George-Hyslop PS, Clarimon J, Lleo A, Bayer A, Tsuang DW, Yu L, Tsolaki M,
Bossù P, Spalletta G, Proitsi P, Collinge J, Sorbi S, Garcia FS, Fox NC, Hardy J,
Naranjo MC, Bosco P, Clarke R, Brayne C, Galimberti D, Scarpini E, Bonuccelli U,
Mancuso M, Siciliano G, Moebus S, Mecocci P, Zompo MD, Maier W, Hampel H,
Pilotto A, Frank-García A, Panza F, Solfrizzi V, Caffarra P, Nacmias B, Perry W,
61
Mayhaus M, Lannfelt L, Hakonarson H, Pichler S, Carrasquillo MM, Ingelsson M,
Beekly D, Alvarez V, Zou F, Valladares O, Younkin SG, Coto E, Hamilton-Nelson
KL, Gu W, Razquin C, Pastor P, Mateo I, Owen MJ, Faber KM, Jonsson PV,
Combarros O, O'Donovan MC, Cantwell LB, Soininen H, Blacker D, Mead S,
Mosley TH Jr, Bennett DA, Harris TB, Fratiglioni L, Holmes C, de Bruijn RF,
Passmore P, Montine TJ, Bettens K, Rotter JI, Brice A, Morgan K, Foroud TM,
Kukull WA, Hannequin D, Powell JF, Nalls MA, Ritchie K, Lunetta KL, Kauwe JS,
Boerwinkle E, Riemenschneider M, Boada M, Hiltunen M, Martin ER, Schmidt R,
Rujescu D, Dartigues JF, Mayeux R, Tzourio C, Hofman A, Nöthen MM, Graff C,
Psaty BM, Haines JL, Lathrop M, Pericak-Vance MA, Launer LJ, Van Broeckhoven
C, Farrer LA, van Duijn CM, Ramirez A, Seshadri S, Schellenberg GD, Amouyel P,
Williams J.
Gene-Wide Analysis Detects Two New Susceptibility Genes for Alzheimer's Disease.
PLoS One 2014;9(6):e94661. IF=3,534
18. Ferrari R, Hernandez DG, Nalls MA, Rohrer JD, Ramasamy A, Kwok JB, DobsonStone C, Brooks WS, Schofield PR, Halliday GM, Hodges JR, Piguet O, Bartley L,
Thompson E, Haan E, Hernández I, Ruiz A, Boada M, Borroni B, Padovani A,
Cruchaga C, Cairns NJ, Benussi L, Binetti G, Ghidoni R, Forloni G, Galimberti D,
Fenoglio C, Serpente M, Scarpini E, Clarimón J, Lleó A, Blesa R, Waldö ML,
Nilsson K, Nilsson C, Mackenzie IR, Hsiung GY, Mann DM, Grafman J, Morris
CM, Attems J, Griffiths TD, McKeith IG, Thomas AJ, Pietrini P, Huey ED,
Wassermann EM, Baborie A, Jaros E, Tierney MC, Pastor P, Razquin C, OrtegaCubero S, Alonso E, Perneczky R, Diehl-Schmid J, Alexopoulos P, Kurz A, Rainero
I, Rubino E, Pinessi L, Rogaeva E, St George-Hyslop P, Rossi G, Tagliavini F,
Giaccone G, Rowe JB, Schlachetzki JC, Uphill J, Collinge J, Mead S, Danek A,
Van Deerlin VM, Grossman M, Trojanowski JQ, van der Zee J, Deschamps W, Van
Langenhove T, Cruts M, Van Broeckhoven C, Cappa SF, Le Ber I, Hannequin D,
Golfier V, Vercelletto M, Brice A, Nacmias B, Sorbi S, Bagnoli S, Piaceri I, Nielsen
JE, Hjermind LE, Riemenschneider M, Mayhaus M, Ibach B, Gasparoni G, Pichler
S, Gu W, Rossor MN, Fox NC, Warren JD, Spillantini MG, Morris HR, Rizzu P,
Heutink P, Snowden JS, Rollinson S, Richardson A, Gerhard A, Bruni AC, Maletta
R, Frangipane F, Cupidi C, Bernardi L, Anfossi M, Gallo M, Conidi ME, Smirne N,
Rademakers R, Baker M, Dickson DW, Graff-Radford NR, Petersen RC, Knopman
D, Josephs KA, Boeve BF, Parisi JE, Seeley WW, Miller BL, Karydas AM, Rosen
H, van Swieten JC, Dopper EG, Seelaar H, Pijnenburg YA, Scheltens P, Logroscino
G, Capozzo R, Novelli V, Puca AA, Franceschi M, Postiglione A, Milan G,
Sorrentino P, Kristiansen M, Chiang HH, Graff C, Pasquier F, Rollin A,
Deramecourt V, Lebert F, Kapogiannis D, Ferrucci L, Pickering-Brown S, Singleton
AB, Hardy J, Momeni P.
Frontotemporal dementia and its subtypes: a genome-wide association study.
Lancet Neurology 2014;13(7):686-99. IF=21,823
19. Gallone S, Boschi S, Rubino E, De Martino P, Scarpini E, Galimberti D, Fenoglio
C, Acutis PL, Maniaci MG, Pinessi L, Rainero I.
Is HCRTR2 a Genetic Risk Factor for Alzheimer's Disease?
Dementia & Geriatric Cognitive Disorders 2014; 38(3-4):245-253. IF=2,812
20. Dell‫׳‬Osso B, D‫׳‬Addario C, Carlotta Palazzo M, Benatti B, Camuri G, Galimberti D,
Fenoglio C, Scarpini E, Di Francesco A, Maccarrone M, Carlo Altamura A.
Epigenetic modulation of BDNF gene: Differences in DNA methylation between
unipolar and bipolar patients.
62
Journal of Affective Disorders 2014; 166:330-3. IF=3,705
21. Guerini FR, Agliardi C, Sironi M, Arosio B, Calabrese E, Zanzottera M, Bolognesi
E, Ricci C, Costa AS, Galimberti D, Griffanti L, Bianchi A, Savazzi F, Mari D,
Scarpini E, Baglio F, Nemni R, Clerici M.
Possible Association between SNAP-25 Single Nucleotide Polymorphisms and
Alterations of Categorical Fluency and Functional MRI Parameters in Alzheimer's
Disease.
22. Galimberti D, Villa C, Fenoglio C, Serpente M, Ghezzi L, Cioffi SM, Arighi A,
Fumagalli G, Scarpini E.
Circulating miRNAs as Potential Biomarkers in Alzheimer's Disease.
23. Lattante S, Le Ber I, Galimberti D, Serpente M, Rivaud-Péchoux S, Camuzat A,
Clot F, Fenoglio C; The French research network on FTD and FTD-ALS, Scarpini
E, Brice A, Kabashi E.
Defining the association of TMEM106B variants among frontotemporal lobar
degeneration patients with GRN mutations and C9orf72 repeat expansions.
24. Millecamps S, De Septenville A, Teyssou E, Daniau M, Camuzat A, Albert M,
LeGuern E, Galimberti D;
The French research network on FTD and FTD-ALS, Brice A, Marie Y, Le Ber I.
Genetic analysis of matrin 3 gene in French amyotrophic lateral sclerosis patients
and frontotemporal lobar degeneration with amyotrophic lateral sclerosis patients.
Neurobiology of Aging 2014; 35(12): 2882.e13-5. IF=4,853
25. Talarico G, Canevelli M, Tosto G, Piscopo P, Confaloni A, Galimberti D, Fenoglio
C, Scarpini E, Gasparini M, Bruno G.
Binge eating and fast cognitive worsening in an early-onset bvFTD patient carrying
C9ORF72 expansion.
Neurocase 2014; 26:1-5. IF=1,381
26. Gnanapavan S, Hegen H, Khalil M, Hemmer B, Franciotta D, Hughes S, Hintzen R,
Jeromin A, Havrdova E, Tumani H, Bertolotto A, Comabella M, Frederiksen J,
Alvarez-Cermeño JC, Villar L, Galimberti D, Myhr KM, Dujmovic I, Fazekas F,
Ionete C, Menge T, Keir G, Deisenhammer F, Teunissen C, Giovannoni G.
Guidelines for uniform reporting of body fluid biomarker studies in neurologic
disorders. Neurology 2014; 83(13):1210-6. IF=8,303
27. Salvadores N, Shahnawaz M, Scarpini E, Tagliavini F, Soto C.
Detection of misfolded Aβ oligomers for sensitive biochemical diagnosis of
Alzheimer's disease.
Cell Reports 2014; 7(1):261-8. IF=7,207
28. Ferrucci R, Vergari M, Cogiamanian F, Bocci T, Ciocca M, Tomasini E, De Riz M,
Scarpini E, Priori A.
Transcranial direct current stimulation (tDCS) for fatigue in multiple sclerosis.
Neurorehabilitation 2014;34(1):121-7. IF=1,736
29. Filippi M, Rocca MA, Pagani E, De Stefano N, Jeffery D, Kappos L, Montalban X,
Boyko AN, Comi G; ALLEGRO Study Group (including E. Scarpini). Placebo63
controlled trial of oral laquinimod in multiple sclerosis: MRI evidence of an effect
on brain tissue damage. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 2014;
85(8):851-8. IF=5,580
5. COMUNICAZIONI SU RIVISTE CENSITE 2014
1. Fenoglio C, Serpente M, Bonsi R, Cioffi SM, Arighi A, Ghezzi L, Callea A, Donelli
C, Mercurio M, Scarpini E, Galimberti D.
Cytokine gene expression in peripheral cells from patients with frontotemporal lobar
degeneration due to GRN and C9ORF72 mutation. European Journal of Neurology
2014; 21 (Suppl. 1): 18-19.
European Neurological Society-European Federation of Neurological Societies,
May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey.
2. Galimberti D, Fenoglio C, Villa C, Serpente M , Bonsi R, Cioffi SM, Ghezzi L, Arighi
A, Basilico P, Callea A, Scarpini E.
Circulating and intrathecal miRNAs as potential biomarkers for Alzheimer’s disease.
European Journal of Neurology 2014; 21 (Suppl. 1): 34. European Neurological
Society-European Federation of Neurological Societies, May 31-June 3, 2014,
Istanbul, Turkey.
3. Ghezzi L,. Fenoglio C, Villa C, Arighi A, Basilico P, Pietroboni A, Rotondo E, Corti
P, Mercurio M, Serpente M, Cioffi S, Scarpini E, Galimberti D.
Circulating miRNAs as potential biomarkers in primary progressive aphasia.
European Journal of Neurology 2014; 211 (Suppl. 1):
34. European Neurological Society-European Federation of Neurological
Societies, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey.
4. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Barone C, Arighi A, Ghezzi L,
Clerici F, Grande G, Maggiore L, Mariani C, Scarpini E.
TREM2 genetic variability in patients with Alzheimer’s disease and frontotemporal
lobar degeneration. European Journal of Neurology 2014; 321 (Suppl. 1):
5. Calvi A, Fenoglio C, De Riz M, Pietroboni AM, Ghezzi L, Maltese V, Serpente M,
Bonsi R, Barone C, Cioffi S, Frigerio F, Turrini R, Galimberti D, Scarpini E.
Restoration of aberrant circulating miRNAs levels after fingolimod treatment in
patients with relapsing remitting multiple sclerosis. European Journal of Neurology
2014; 341 (Suppl. 1):
6. Campisi GM, Cioffi SMG, Serpente M, Fenoglio C, Bonsi R, Arighi A, Fumagalli G,
Scarpini E, Galimberti D.
Profiling of ubiquitination pathway genes in peripheral cells from C9orf72 mutation
carriers with frontotemporal lobar degeneration. Clinical Neuropathology 33(3): 212
(2014). 50°Annual Meeting of the Italian Association of Neuropathology and Clinical
Neurobiology (AINP-NC) –
40° Meeting of the Italian Association for Research on Brain Aging (AIRIC), June
5-7, 2014, Verbania, Italy.
64
7. Cioffi SMG, Fenoglio C, Serpente M, Bonsi R, Ridolfi E, Arighi A, Fumagalli G,
Ghezzi L, Clerici F, Mariani C, Scarpini E, Galimberti D.
Trem2 genetic variability in Italian populations of FTLD and AD patients. Clinical
Neuropathology 33(3): 216 (2014). 50°Annual Meeting of the Italian Association of
Neuropathology and Clinical Neurobiology (AINP-NC) –
8. Galimberti D, Scarpini E.
Role of non-coding RNA in neurodegenerative and demyelinating diseases of the
central nervous system. Clinical Neuropathology 33(3): 222 (2014). 50°Annual
Meeting of the Italian Association of Neuropathology and Clinical Neurobiology
(AINP-NC) –
9. Bocchetta M , Pievani M, Babiloni C, Bruni AC, Scarpini E, Sorbi S, Tagliavini F,
Padovani A, Benussi L, Bernardi L, Binetti G, Borroni B, Di Fede G, Di Maria E,
Fostinelli S, Galimberti D, Gennarelli M, Ghidoni R, Marzano N, Mega A, Nacmias
B, Piaceri I, Porteri C, Rossi G, Suardi S, Vecchio F, Frisoni GB.
Italian network for autosomal dominant Alzheimer’s disease and Frontotemporal
Lobar Degeneration (Italian DIAfN). Alzheimer’s & Dementia 2014; 10(4): P38.
Alzheimer's Association International Conference 2014, July 12-17, Copenhagen
(Denmark).
10. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Bonsi R, Cioffi S, Ghezzi L, Arighi A,
Basilico P, Callea A, Donelli C, Scarpini.
Circulating and intrathecal miRNAs as potential biomarkers for Alzheimer’s disease.
Alzheimer’s & Dementia 2014; 10(4): P318-9.
(Denmark).
11. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Arighi A, Ghezzi L, Clerici F,
Grande G, Maggiore L, Mariani C, Scarpini E.
TREM2 genetic variability in patients with Alzheimer’s disease and Frontotemporal
Lobar Degeneration. Alzheimer’s & Dementia 2014; 10(4): P319.
(Denmark).
12. Gardini S, Galimberti D, Fenoglio C, Cioffi S, Pietroboni A, Calvi A, Scarpini E,
Concari L, Barocco F, Spallazzi M, Ghetti C, Ruffini L, Caffarra P.
A novel mutation in progranulin gene in behavioural variant Frontotemporal
dementia. Alzheimer’s & Dementia 2014; 10(4): P666.
(Denmark).
13. Bocchetta M, Pievani M, Babiloni C, Bruni AC, Scarpini E, Sorbi S, Tagliavini F,
Padovani A, Benussi L, Bernardi L, Binetti G, Borroni B, Di Fede G, Di Maria E,
Fostinelli S, Galimberti D, Gennarelli M, Ghidoni R, Marzano N, Mega A, Nacmias
B, Piaceri I, Porteri C, Rossi G, Suardi S, Vecchio F, Frisoni GB.
Italian network for autosomal dominant Alzheimer’s disease and Frontotemporal
Lobar Degeneration (Italian DIAfN). Alzheimer’s & Dementia 2014; 10(4): P810.
65
(Denmark).
14. Galimberti D, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Clerici F, Grande G, Maggiore L,
Arighi A, Ghezzi L, Mariani C, Scarpini E.
Role of TREM2 in patients with Alzheimer’s disease: genetic variability and mRNA
expression. Neurological Sciences 35, Suppl.: S23, 2014.
XLV Congress of the Italian Neurological Society, October 11-14, 2014, Cagliari,
Italy.
15. Ghezzi L, Fenoglio C, Villa C, Arighi A, Pietroboni A, Serpente M, Cioffi S, Scarpini
E, Galimberti D.
Circulating miRNAs as potential biomarkers in primary progressive aphasia.
Neurological Sciences 35, Suppl.: S23, 2014.
Italy.
16. Calvi A, Cioffi S, Caffarra P, Fenoglio C, Serpente M, Pietroboni A, Arighi A, Ghezzi
L, gardini S, Scarpini E, Galimberti D.
The novel GRN g1159_1160delTG mutation is asociated with behavioral variant
Frontotemporal Dementia. Neurological Sciences 35, Suppl.: S43, 2014.
Italy.
17. Arighi A, Rango M, Pietroboni A, De Riz M, Fumagalli G, Ghezzi L, Donelli C, Calvi
A, Basilico P, Zago S, Rotondo E, Corti P, Mecurio M, Vimercati R, Fenoglio C,
Serpente M, Galimberti D, Scarpini E.
Magnetic resonance spectroscopy in posterior cortical atrophy. Neurological Sciences
35, Suppl.: S219, 2014.
Italy.
18. Galimberti D, Serpente M, Fenoglio C, Bonsi R, Cioffi S, Arighi A, Ghezzi L,
Scarpini E. Profiling of ubiquitination pathway genes in peripheral cells from C9orf72
and GRN mutation carriers with frontotemporal lobar degeneration. American
Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): 151.
9th International Conference on Frontotemporal Dementias October 23-25, 2014
Vancouver, Canada.
19. Benussi A, Archetti S, Galimberti D, Parnetti L, Nacmias B, Ferrari F, Sorbi S,
Scarpini E, Padovani A, Borroni B.
CSF p-Tau181/Tau ratio as biomarker for TDP pathology in frontotemporal lobar
degeneration. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3
(Supplementary Issue 1): 189.
Vancouver, Canada.
20. Galimberti D, Cioffi S, Calvi A, Caffarra P, Fenoglio C, Serpente M, Pietroboni A,
Arighi A, Ghezzi L, Gardini S, Scarpini E.
The novel GRN g.1159_1160delTG mutation is associated with behavioural variant
frontotemporal dementia. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3
66
Vancouver, Canada.
21. Xi Z, Rainero I, Rubino E, Pinessi L, Bruni A, Maletta R, Nacmias B, Sorbi S,
Galimberti D, Surace E, Tartaglia M, van Blitterswijk M, Rademakers R, Yunusova
Y, Robertson J, St. George-Hyslop P, Zinman L, Rogaeva E.
Epigenetic study of C9orf72 in FTD and ALS patients including the family with
identical twins. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3
Vancouver, Canada.
22. Bonsi R, Fenoglio C, Serpente M, Cioffi S, Arighi A, Ghezzi L, Mercurio M, Scarpini
E, Galimberti D.
Cytokine and chemokine gene expression in peripheral cells from patients with
frontotemporal lobar degeneration due to GRN and C9orf72 mutations. American
Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue 1): 285.
Vancouver, Canada.
23. Borroni B, Turrone R, Galimberti D, Nacmias B, Antonella A, Caffarra P, Caltagirone
C, Cappa S, Frisoni G, Ghidoni R, Marra C, Padovani A, Rainero I, Scarpini E, Silani
V, Sorbi S, Tagliavini F, Tremolizzo L, Bruni A,
FTD Group SINDEM.
Italian frontotemporal dementia network (FTD Group
SINDEM): sharing clinical and diagnostic procedures in Frontotemporal Dementia in
Italy. American Journal of Neurodegenerative Disease 2014; 3 (Supplementary Issue
1): 285.
Vancouver, Canada.
6. PARTECIPAZIONEN A EDITORIAL BOARD DI RIVISTE INTERNAZIONALI O
NAZIONALI CON IF>0
-
Dott. D. Galimberti - Editorial Board Member della rivista The Open Geriatric Medicine
Journal
Dott. D. Galimberti - Senior Editor della rivista Journal of Alzheimer’s disease
Prof. E. Scarpini – Editorial Board Member della rivista Journal of Neurology
Prof. E. Scarpini – Associate Editor della rivista Journal of Alzheimer’s disease
Prof. E. Scarpini – Associated Editor della rivista Journal of the Neurological Sciences
7. CHAIRMAN A MANIFESTAZIONI INTERNAZIONALI
-
-
Dott.ssa D. Galimberti - European Neurological Society-European Federation of
Neurological Societies Joint meeting, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. Oral session
on dementia
Prof. E. Scarpini - European Neurological Society-European Federation of Neurological
Societies Joint meeting, May 31-June 3, 2014, Istanbul, Turkey. Oral session on dementia
8. MEMBERSHIP SOCIETÀ SCIENTIFICHE
Dott.ssa D. Galimberti – Secretary of the European Federation of Neurological Societies
Prof. E. Scarpini – socio fondatore e segretario dell’Associazione per la ricerca sulle demenze
della Società Italiana di Neurologia (SINDEM)
67
Dott.ssa D. Galimberti – membro dell’Associazione per la ricerca sulle demenze della Società
Italiana di Neurologia (SINDEM)
Prof. E Scarpini – coordinatore del Gruppo di Lavoro Patologie Neurologiche Progressive Sottogruppo Demenze: “Percorso diagnostico, terapeutico ed assistenziale”. Documento
presentato all’Assessorato alla Salute - Regione Lombardia
9. RELAZIONI SU INVITO
50° Annual Meeting of the Italian Association of Neuropathology (AINP) – XL Meeting of
the Italian Association for Research on Brain Aging (AIRIC). Titolo: “Role of non coding
RNA in neurodegenerative and demyelinating disorders of the central nervous system”. June
10. FINANZIAMENTI
-
-
-
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-
68
Joint Program for Neurodegenerative Disorders “BIOMARKAPD” 30.000 € (Giugno
2012-Maggio 2015)
Ricerca Finalizzata Ministero della Salute “Italian network for autosomal dominant
Alzheimer’s disease and frontotemporal lobar degeneration” 40.980 € (30/11/201229/11/2015)
Giovani Ricercatori, Ministero della Salute “The topological organization of
anatomical and functional cortical brain networks in patients with the behavioral
variant of frontotemporal dementia and primary progressive aphasia” 27.000 € (scad.
30/11/2015)
Ricerca Corrente, Ministero della Salute “Long Non Coding RNAs (Lnc-RNAs) e
Sclerosi Multipla: identificazione di nuovi possibili bio-marcatori prognostici e di
risposta al trattamento” 137.153 €
Ricerca Concorso (Maria Serpente), “Long non-coding RNAs (nc-RNAs) e Sclerosi
Multipla: identificazione di nuovi possibili biomarcatori prognostici e di risposta al
trattamento” 50.000€
5x1000 2012 (Daniela Galimberti), “Ruolo delle molecole infiammatorie e degli RNA
non codificanti (micro e long RNAs) nella patogenesi della Degenerazione Lobare
Frontotemporale (Demenza di Pick) e dei disturbi psicotici” 30.000 €
Fondazione Monzino “Malattia di Alzheimer e Degenerazione Lobare
Frontotemporale: ricerca di marcatori da associare alla patologia mediante studi
genetici e di espressione per migliorare la diagnosi differenziale e l’efficacia della
terapia” 450.000 € (2013-2015).
LABORATORIO CELLULE STAMINALI
Responsabile:

Dottor Yvan Torrente, Neurologo Universitario in convenzione
Personale:

Marzia Belicchi biologa con contratto a tempo indeterminato di tecnico di laboratorio
laureato universitario

Mirella Meregalli biologa con contratto a tempo determinato di tecnico di laboratorio
laureato universitario

Federica Colleoni biologa, con borsa annuale ospedaliera

Paola Razini biotecnologa con borsa annuale ospedaliera

Andrea Farini biologo, PostDoc contrattista pluriannulae universitario

Silvia Erratico biotecnologa, contrattista annuale

Letizia Cassinelli, biologa con contratto annuale

Paola Frattini, biotecnologa con borsa annuale ospedaliera

Clementina Sitzia, biotecnologa, medico, con borsa annuale ospedaliera

Stefania Banfi, biologa con borsa annuale ospedaliera

Francesca De Santis, biologa con borsa annuale ospedaliera

Chiara Villa, bioingegnere, Phd/student contrattista pluriannuale universitario

Gloria Marelli, studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale

Mattia Piovani studente della facoltà di Biotecnologie , tirocinante per tesi magistrale dei
5 anni

Veronica Nervi studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale

Giorgia Riolo studente della facoltà di Biotecnologie tirocinio per tesi triennale

Naima Guarrata, dottore in economia, project manager contrattista annuale
69
Consuntivo dell’attività di ricerca svolta nel corso dell’anno 2014 da parte del Gruppo di
lavoro, diretto dal Dr. Yvan Torrente, attivo presso il Laboratorio Cellule Staminali - “Centro
Dino Ferrari” dell’Università degli Studi di Milano.
L’attività di ricerca svolta dal gruppo di lavoro diretto dal dott. Torrente è di tipo traslazionale
e verifica la possibilità di trasformare le scoperte scientifiche che arrivano dal laboratorio in
applicazioni cliniche. L’obiettivo, in altre parole, è quello di costruire una sorta di ponte tra
la scienza e la medicina, per poter utilizzare nel modo migliore le scoperte dei ricercatori.
L’interesse primario del gruppo è costituito, da anni, dallo studio delle cellule staminali adulte
con potenzialità miogeniche per una loro applicazione clinica e, nello specifico, per il loro
utilizzo nello sviluppo di nuove terapie cellulari per la lotta alle distrofie muscolari, in
particolare alla distrofia muscolare di Duchenne, patologia che rimane ancora priva di cure
efficaci e risolutive. Le distrofie muscolari (MDs) sono un gruppo eterogeneo di patologie
ereditarie, in cui la progressiva atrofia e debolezza muscolare sono spesso associate
all’esaurimento del potenziale rigenerativo del muscolo. Sebbene ad oggi il muscolo
scheletrico sia un tessuto con proprietà fisiologiche ben conosciute, non ci sono ancora
trattamenti risolutivi per queste patologie. Il gruppo del dott. Torrente ha pubblicato
quest’anno sulla rivista scientifica “Frontiers in Physiology” una review in cui descrive i
progressi fatti nell'isolamento di nuove sottopopolazioni di cellule staminali e nella creazione
di nicchie artificiali di cellule staminali, ed argomenta come queste tecnologie emergenti
offrano importanti premesse per futuri approcci terapeutici alle malattie muscolari e all’atrofia
muscolare associate all’invecchiamento. La terapia cellulare è ad oggi uno dei più promettenti
approcci per correggere difetti causa delle malattie genetiche dal momento che è stato
dimostrato ampiamente che le cellule possono partecipare attivamente alla rigenerazione
tessutale; in tal senso la recente identificazione di differenti tipologie di cellule staminali
multipotenti, alcune delle quali particolarmente adeguate per essere utilizzate in protocolli di
terapia cellulare, ha creato nuove interessanti prospettive nel trattamento di malattie genetiche
che ancora oggi non hanno una terapia efficace e risolutiva, tra queste la distrofia muscolare
di Duchenne (DMD) è una delle più comuni e aggressive. Negli ultimi 10 anni infatti sono
stati fatti importanti passi avanti nella conoscenza delle cellule staminali: la definizione di
nicchia, l’identificazione di segnali regolatori della mobilizzazione e dell’homing; progressi
questi che costituiscono degli strumenti fondamentali per lo sviluppo di nuovi promettenti
protocolli di terapia cellulare. Le cellule mesenchimali (MSCs), in particolare, sono cellule
staminali non ematopoietiche con potenzialità di differenziare in diversi lineages; tali cellule
possono essere isolate da diverse fonti tissutali, quali il tessuto adiposo, il midollo osseo e lo
stesso tessuto muscolare, e sono in grado di rilasciare molecole con proprietà antiinfiammatorie capaci di modulare la risposta immunitaria umorale e cellulare. Recentemente
sono stati pubblicati molti studi realizzati a livello preclinico e clinico che prevedono
l’utilizzo di cellule mesenchimali. In tal senso, il team del dott. Torrente ha descritto sulla
rivista scientifica “Stem Cells International”, le caratteristiche delle cellule MSCs e come
tale popolazione cellulare, grazie alle proprie potenzialità immuno-modulanti, possa essere
considerata uno strumento prezioso per il trattamento di patologie infiammatorie,
degenerative ed autoimmuni. Dalla letteratura emerge come la distrofia muscolare di
Duchenne sia una malattia caratterizzata da assenza della distrofina, da infiammazione
cronica, da danni al sarcolemma, e dalla degenerazione dei muscoli scheletrici. Tra i
molteplici meccanismi patogeni proposti per la DMD, lo stress ossidativo e l'infiammazione
sono direttamente coinvolti nel processo distrofico. Numerosi elementi caratteristici del
fenotipo distrofico, soprattutto l'infiammazione e l'attivazione della risposta immunitaria
innata o acquisita, sono caratteristiche importanti di tutte le distrofie muscolari. Sono stati
pubblicati numerosi studi in cui si dimostra la possibilità di una risposta immunitaria verso il
vettore virale utilizzato in terapia genica per veicolare ad esempio porzioni geniche per
70
ripristinare il corretto schema di lettura nelle cellule muscolari di un paziente distrofico e
stimolare la produzione della nuova proteina.
A tal proposito il gruppo del dott. Torrente ha pubblicato sulla rivista internazionale
“Biomed Research International” le attuali conoscenze scientifiche circa il coinvolgimento
della risposta del sistema immunitario alle terapie sperimentali oggi utilizzate per la distrofia
muscolare. Da alcuni anni la letteratura scientifica ha più volte sottolineato come per
patologie degenerative, come appunto la DMD, sia risultato vincente un approccio che
preveda la combinazione di terapia genica e terapia cellulare. Inoltre, è stato messo in risalto
come la combinazione di terapia genica e terapia cellulare con utilizzo di cellule staminali
adulte consenta, ad oggi, di avere discrete chances per la gestione e la terapia della DMD.
Negli ultimi decenni differenti tecnologie, quali ad esempio la modificazione genetica
mediata da vettori virali, sono state oggetto di indagine tesa a risolvere il deficit di distrofina,
causa della DMD. Sono stati fatti molti progressi che hanno portato a migliorare la terapia
genica in termini di efficacia e di sicurezza in particolare per superare gli ostacoli costituiti
dal ridotto trasferimento genico, dal basso livello di espressione della proteina, dal rischio di
mutagenesi per l’integrazione casuale del vettore virale, dall’immunogenicità dei vettori stessi
e, qualche volta, dello stesso transgene. Da diversi anni gli studi del gruppo di lavoro diretto
dal dott. Torrente sono volti alla realizzazione di un trial clinico di fase I/II che prevede la
combinazione della terapia genica e terapia cellulare con l’utilizzo cellule staminali muscolari
CD133+. Questo studio clinico, di fase I, monocentrico, non randomizzato consiste nel
trapianto autologo di cellule staminali muscolari ingegnerizzate con metodica di exon
skipping nel muscolo adduttore del mignolo della mano sinistra di bambini DMD. La
tecnologia di exon skipping ha il vantaggio di essere diretta contro il trascritto endogeno della
proteina distrofina che presenta la mutazione, preservando il naturale livello di proteina.
Inoltre, il trapianto autologo consente di superare il problema di una risposta immunitaria
durante approcci di terapia genica che prevedano l’utilizzo diretto in vivo di vettori virali. Il
primo passo verso la realizzazione di questo trial clinico, il primo a livello mondiale, è stato
sottomettere al Comitato Etico della Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore
Policlinico il progetto di validazione dal titolo “STUDIO DI VALIDAZIONE DELLE
CELLULE STAMINALI MUSCOLARI CD133+ INGEGNERIZZATE (CD133-LV(U7))
CON UN VETTORE LENTIVIRALE GMP/GLP”, che in data 22/5/2014 è stato approvato
con parere favorevole 240 (determina 878/14). Il protocollo presentato descrive uno studio di
validazione del prodotto medicinale costituito da cellule staminali CD133 positive isolate da
biopsie muscolari di pazienti pediatrici affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne. Un
gruppo di dodici pazienti verrà selezionato sulla base dell’età, del quadro clinico e
dell’assenza di patologie concomitanti non correlate. Tra questi, cinque pazienti saranno
inclusi negli studi di validazione del processo di isolamento e preparazione delle cellule
ingegnerizzate con vettore lenti-virale GMP/GLP. In caso di materiale biologico insufficiente,
miogenesi cellulare non soddisfacente o complicazioni causate da effetti collaterali avversi, i
pazienti verranno sostituiti. Le cellule staminali CD133 positive saranno isolate dalla biopsia
muscolare in laboratori certificati GMP della Fondazione IRCCS Policlinico di Milano,
saranno infettate con un vettore lenti virale GMP/GLP in grado di favorirne la loro correzione
genica e successivamente saranno mantenute in coltura al fine di incrementarne il numero in
visione di un futuro trapianto.
Questo studio biologico di validazione permetterà di progettare e successivamente realizzare
un primo trial clinico di fase I/II che prevederà il trapianto autologo delle cellule muscolari
CD133+ ingegnerizzate con il vettore GMP validate in codesto studio, nel muscolo Abductor
Digiti Minimi (ADM) sinistro dei pazienti distrofici precedentemente inclusi. Tale studio
clinico è stato progettato in conformità alle regole di buona pratica clinica italiana ed europea,
determinate nella Conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH) E6, e sono state
71
soddisfatte tutte le richieste degli organi regolatori quali l’Istituto Superiore di Sanità, il
Ministero della Salute, AIFA e comitati etici di ricerca locale italiana.
Seguendo la normativa in materia di utilizzo di cellule staminali ingegnerizzate a scopo di
sperimentazione clinica il dott. Torrente ha contattato i principali enti regolatori italiani, in
particolare l'Istituto Superiore di Sanità (ISS), il Ministero della Salute e l'Agenzia Italiana del
Farmaco (AIFA) per pianificare lo studio e condividere il protocollo clinico con i
rappresentanti di AIFA e ISS. La risultante di questi incontri è quella di procedere con un
primo studio che prevede una singola iniezione intramuscolare di cellule staminali CD133+
ingegnerizzate isolate da biopsie muscolari di pazienti DMD e di farlo seguire in un secondo
momento dall’iniezione sistemica nell’arteria femorale dei pazienti distrofici. Il protocollo di
sperimentazione clinica, il CRF dello studio e i documenti complementari richiesti dagli
Organi Regolatori verranno presentati al Comitato Etico della Fondazione IRCCS Cà Granda
Policlinico nel corso del 2015.
Negli ultimi anni gli scienziati hanno scoperto molti geni associati a specifiche malattie
mettendo in evidenza che tutti noi abbiamo diversi livelli di predisposizione genetica verso
patologie quali ad esempio il cancro, il diabete e le malattie cardiovascolari. Tuttavia è stato
stabilito che la presenza e la gravità di queste malattie sono fortemente influenzate da fattori
ambientali come la dieta , il fumo e lo stile di vita. Recenti studi confermano sempre più la
connessione tra l'alimentazione e i geni perché il cibo può accenderli o spegnerli, modificando
la loro espressione: il DNA non si può cambiare, ma è possibile intervenire sui meccanismi
con cui la dieta può attivare o disattivare alcuni geni. E' in quest'ottica di ricerca che la
genomica nutrizionale sta cercando di capire come diversi cibi e composti naturali possano
portare sollievo e cura verso alcune malattie cosiddette genetiche come Alzheimer, cancro e
sclerosi multipla. Cibi che funzionino come mattoncini di blocco o semplici operai riparatori
dei geni malati o difettosi. In un regime dietetico sano, volto al recupero della forma fisica
fare uso di alcuni cibi funzionali detti anche nutraceutici deve essere una cosa prioritaria;
ovvero fare uso di alimenti che hanno una funzione benefica sulla salute umana, inclusi la
prevenzione o il trattamento di una malattia non dovrebbe essere trascurato. I ricercatori a
causa delle basi genetiche delle distrofie muscolari hanno iniziato a studiare strategie
alternative a quelle farmacologiche per il trattamento di questo gruppo di patologie. La
ricerca, infatti, si è da tempo attivata in diversi ambiti al fine di individuare tutte le possibili
strade da percorrere nella gestione della distrofia, con l’obiettivo ultimo non di curare ma di
migliorare la qualità della vita dei pazienti. In tal senso il gruppo del Dott. Torrente in una
pubblicazione sulla rivista internazionale “BioMed Research International” ha valutato gli
affetti di una dieta a base di una miscela di polifenoli naturali (ProAbe) sull’architettura e la
funzionalità muscolare di topi distrofici mdx. I muscoli dei topi trattati quotidianamente con il
composto hanno mostrato una riduzione della fibrosi e della necrosi muscolare oltre ad una
migliore vascolarizzazione. Il recupero delle caratteristiche morfologiche del muscolo
distrofico porta ad un incremento della resistenza dei topi distrofici che hanno ricevuto il
ProAbe. Questi dati confermano che una dieta a base di una miscela di polifenoli, importanti
agenti antiossidanti, potrebbe rappresentare una strategia coadiuvante un trattamento per la
distrofia muscolare di Duchenne. Durante quest’ultimo anno il team del dott. Torrente ha
continuato a collaborare con diversi gruppi di ricerca nazionali ed internazionali sia per studi
clinici sia per sviluppare temi importanti per la ricerca di base nel campo delle malattie
neuromuscolari. In collaborazione con l’Ospedale San Raffaele di Milano sono stati
pubblicati sulla rivista scientifica “Plos One”, i risultati di un nuovo studio clinico eseguito su
un gruppo di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne di età compresa tra i 5 e i 12
anni ed ancora in grado di camminare. In tale studio si descrive un protocollo clinico
osservazionale longitudinale che prende in analisi la forza muscolare dei pazienti distrofici
utilizzando un test muscolare quantitativo (QMT) e qualitativo con misurazioni funzionali
quali North Star Ambulatory Assessment (NSAA) o il 6-min walk test (6MWT).
72
Quest’ultimo test è stato recentemente scelto come principale strumento di valutazione in trial
clinici multicentrici internazionali per pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne
(DMD) ancora in grado di camminare. Lo scopo di questo studio è stato quello di registrare i
cambiamenti osservati durante il terzo anno di valutazione dei singoli pazienti e stabilire una
possibile correlazione con età, terapia con steroidi e la valutazione basale effettuata all’inizio
dello studio con il medesimo test. Sono stati osservati 96 pazienti provenienti da 11 centri e
sono stati valutati con 6 minute walk test e con North Star Ambulatory Assessment a 12, 24 e
36 mesi dalla visita iniziale. I risultati ottenuti con questo studio, il primo che ha collezionato
dati relativi a suddetti tests per 36 mesi in pazienti affetti da DMD, potrebbero non solo
fornire informazioni riguardo alla progressione di questa malattia, ma anche costituire un
riferimento importante da utilizzare per poter comparare i risultati di futuri studi clinici. La
medesima collaborazione ha portato il gruppo del dott. Torrente a pubblicare sulla stessa
rivista “Plos One” un altro studio clinico osservazionale atto a stabilire se un elevato gruppo
di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne (191 pazienti ancora in grado di
camminare) con diverse mutazioni presentino differenti valutazioni effettuate con il test
6MWT tra la misurazione basale e dopo 12 mesi di follow up. Nonostante siano state
osservate alcune differenze nei vari sottogruppi, i valori medi delle valutazioni a 12 mesi in
ciascun gruppo si sono mostrate tutti all'interno di un intervallo ristretto. Queste informazioni
potranno essere d’aiuto a disegnare un trial clinico con un ristretto gruppo di pazienti, affetti
da patologia rara. Ulteriori collaborazioni che favoriscono l’integrazione di diversi know how
e competenze hanno permesso al gruppo concretizzare le proprie ricerche in pubblicazioni in
importanti riviste scientifiche internazionali. In tal senso la proficua collaborazione con il
gruppo di chimici diretto dalla Dott.ssa Lenardi presso la piattaforma di Micro e Nano
Fabbricazione del Bioincubatore Filarete ha portato a pubblicare sulla rivista “Journal Tissue
Engineering Regen” un lavoro in cui si descrive un nuovo idrogelo termosensibile
P(NIPAAM-co-HEMA) costituito da due diversi biomateriali in grado di consentire il
distacco di “fogli” di cellule muscolari, strumento utile nell’ottica di una futura applicazione
in vivo nel tessuto muscolare. Si sono identificati infatti diversi idrogeli con una struttura in
grado di far aderire e proliferare la linea murina di mioblasti C2C12 formando strati di cellule
che si possono staccare dal substrato temperatura-sensibile, caratteristica importante per fare
sì che tale materiale possa essere considerato una nuova ed innovativa superficie per colture
cellulari. Pertanto, questi risultati rappresentano una prova iniziale per un’ulteriore
applicazione di questa tecnologia in modelli animali di danno muscolare, in prospettiva di una
futura applicazione clinica.
In collaborazione con il gruppo del prof. Rustichelli dell’Università Politecnica delle Marche,
Di.S.C.O. - Sezione di Biologia, Biochimica e Fisica di Ancona, si è pubblicato sulla rivista
internazionale Tissue Engineering Part C Methods un lavoro scientifico di approfondimento
di come le cellule, ed in particolare le cellule staminali, siano in grado di interagire con un
bioscaffold e di come il tipo di biomateriale e le sue caratteristiche riescano ad influenzarne
ed a controllarne la crescita e/o il differenziamento delle cellule. In questo studio, frutto della
collaborazione di diverse figure professionali tra le quali biologi, fisici e bioingegneri,
afferenti a diverse università italiane, sono state analizzati i comportamenti in vitro di diverse
tipologie di progenitori cellulari umani: progenitori endoteliali (ECFCs) isolati da soggetti
sani e soggetti affetti dalla sindrome di Kaposi (una patologia angioproliferativa) e cellule
staminali muscolari CD133+, coltivati su uno scaffold di acido polilattico poliglicolico. Gli
scaffold 3D sono stati analizzati con la microtomografia X-ray (micro-CT), una tecnologia
con un’elevata risoluzione, fino a centinaia di nanometri (submicron), che permette di
valutare la proliferazione e l’organizzazione delle cellule sullo scaffold e come e quanto tale
organizzazione si modifica durante la coltura in vitro. Da molti anni il gruppo del dott.
Torrente collabora con numerosi gruppi di ricerca che operano all’interno della Fondazione
73
IRCCS Ca’ Granda Policlinico di Milano ed in particolare con il gruppo della dott.ssa Porretti
con cui quest’anno ha pubblicato, sulla rivista scientifica “Plos One”, uno studio in cui si è
analizzata l’espressione media delle proteine ABC ed il ruolo dei vacuoli citoplasmatici nel
processo di multi-drug resistance in sei linee cellulari di epatocarcinoma; inoltre si è
confermato l’accumulo di farmaci antitumorali in vacuoli giganti e piccoli di origine
lisosomiale. Il test MTT inoltre ha mostrato che le linee cellulari con lisosomi giganti sono
più resistenti al trattamento con il farmaco antitumorale sorafenib rispetto alle cellule con
lisosomi piccoli e che il trattamento con verapamil è in grado di modificare questa resistenza.
Il dott. Torrente ha in corso una collaborazione con il professore Gorka Orive del
Dipartimento di Farmacologia dell’Università dei Paesi Baschi di Vittoria che ha dato origine
ad una pubblicazione sulla rivista “Current Pharmaceutical Biotechnology”, in cui vengono
descritte alcune delle tecnologie emergenti negli ultimi anni in relazione allo sviluppo di
nuovi biomateriali, all’ottimizzazione di alcune micro- e nano-tecnologie per il delivery di
farmaci e cellule o per l’applicazione di cellule staminali come prodotti terapeutici, inoltre ne
vengono discussi tutti i potenziali benefici.
Il gruppo del Dott. Torrente durante quest’anno ha scritto e pubblicato anche due capitoli di
libro: uno pubblicato su “Horizon in Neuroscience Research” in cui gli autori descrivono le
cellule staminali e le potenzialità della terapia cellulare a base di cellule staminali nel
trattamento di patologie neuromuscolari e neurodegenerative.; l’altro invece pubblicato su
“From Pre-clinic to Biodiversity” in cui gli autori realizzano una overview delle possibili
terapie cellulari a base di cellule staminali applicate a studi preclinici in diversi modelli
animali di distrofia muscolare. L’attenzione è focalizzata sui pro- e i contro del traslare
risultati scientifici da una fase preclinica realizzata su modelli animali all’applicazione clinica.
Durante quest’anno il Dott. Torrente è stato impegnato anche nell’organizzazione di eventi
scientifici divulgativi nazionali ed internazionali, aventi come tema le cellule staminali e
rivolti a ricercatori, medici, biologi e studenti universitari; da ricordare in modo particolare le
giornate di studio e i convegni organizzati da Unistem all’ Università degli Studi di Milano.
Durante il 2014 il dott. Torrente ha continuato la sua attività di revisore di lavori scientifici
per numerose prestigiose riviste internazionali e di progetti di ricerca ministeriali; inoltre fa
parte dell’editorial board della rivista scientifica CellR4, un giornale multidisciplinare
focalizzato in particolare sulla riprogrammazione, differenziamento e rigenerazione cellulare.
In conclusione, come si evince dalla letteratura scientifica sempre in evoluzione, ogni anno la
ricerca scientifica riesce ad ampliare le conoscenze e a realizzare promettenti risultati nel
campo delle cellule staminali e in particolare della terapia cellulare e genica. Significative
informazioni, nuove conoscenze e soprattutto nuove tecnologie sempre più all’avanguardia
sono gli strumenti essenziali per poter arrivare ad un’applicazione clinica delle cellule
staminali adulte in sperimentazioni cliniche nel campo di patologie neurodegenerative e
neuromuscolari per cui non esiste ancora una cura risolutiva, prima tra tutte, appunto, la
distrofia muscolare di Duchenne.
ELENCO PUBBLICAZIONI SU RIVISTE INTERNAZIONALI RECENSITE
1.
74
Federico Colombo, Elena Trombetta, Paola Cetrangolo, Marco Maggioni, Paola
Razini, Francesca De Santis, Yvan Torrente, Daniele Prati, Erminio Torresani, Laura
Porretti
Giant Lysosomes as a Chemotherapy Resistance Mechanism in Hepatocellular
Carcinoma Cells
PLOS ONE: 0114787 December 10, 2014
I.F: 3.53 SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE,
ORGANI E TESSUTI Linea 8:Terapia Genica e Cellulare
2.
Pane M, Mazzone ES, Sivo S, Sormani MP, Messina S, D Amico A, Carlesi A, Vita
G, Fanelli L, Berardinelli A, Torrente Y, Lanzillotta V, Viggiano E, D Ambrosio P,
Cavallaro F, Frosini S, Barp A, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E,
Graziano A, Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Sacchini M, Arnoldi MT,
Baranello G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E, Previtali S, Bruno C,
Politano L, Comi GP, Bertini E, Mercuri E.
Long term natural history data in ambulant boys with Duchenne muscular
dystrophy: 36-month changes.
PLOS ONE. 2014 Oct 1;9(10) I.F: 3.53
SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E
TESSUTI
Linea 6: Neuroscienze Cliniche e di Base
3. Farini A, Sitzia C, Erratico S, Meregalli M, Torrente Y.
Influence of immune responses in gene/stem cell therapies for muscular dystrophies.
Biomed Res Int. 2014;2014 I.F.: 2.71
TESSUTI
Linea 8:Terapia Genica e Cellulare
4.
Farini A, Sitzia C, Erratico S, Meregalli M, Torrente Y.
Clinical applications of mesenchymal stem cells in chronic diseases.
Stem Cells International Volume 2014, Article ID 306573, 11 pages I.F.: 2.81
TESSUTI
5.
Villa C, Martello F, Erratico S, Tocchio A, Belicchi M, Lenardi C, Torrente Y.
P(NIPAAM-co-HEMA) thermoresponsive hydrogels: an alternative approach for
muscle cell sheet engineering.
J Tissue Eng Regen Med. 2014 May 5. I.F.: 4.428
TESSUTI
6.
Meregalli M, Farini A, Sitzia C, Torrente Y.
Advancements in stem cells treatment of skeletal muscle wasting.
Front Physiol. 2014 Feb 12;5:48. I.F.: (primo IF nel 2015)
TESSUTI
7.
Pane M, Mazzone ES, Sormani MP, Messina S, Vita GL, Fanelli L, Berardinelli A,
Torrente Y,
D'Amico A, Lanzillotta V, Viggiano E, D'Ambrosio P,
Cavallaro F, Frosini
S, Bello L, Bonfiglio S, Scalise R, De Sanctis R, Rolle E,
Bianco F, Van der Haawue M,
Magri F, Palermo C, Rossi F, Donati MA, Alfonsi C,
Sacchini M, Arnoldi MT, Baranello
G, Mongini T, Pini A, Battini R, Pegoraro E,
Previtali SC, Napolitano S, Bruno C, Polittano L, Comi GP, Bertini E, Morandi L,
Gualandi F, Ferlini A, Goemans N, Mercuri E.
75
6 Minute walk test in Duchenne MD patients with different mutations: 12 month
changes.
PLOS ONE. 2014 Jan 8; 9(1): I.F.: 3.53
TESSUTI
Linea 6:Neuroscienze Cliniche e di Base
8. Giuliani A, Moroncini F, Mazzoni S, Belicchi ML, Villa C, Erratico S, Colombo E,
Calcaterra F, Brambilla L, Torrente Y, Albertini G, Della Bella S.
Polyglycolic acid-polylactic acid scaffold response to different progenitor cell in
vitro cultures: a demonstrative and comparative X-ray synchrotron radiation phasecontrast microtomography study.
Tissue Eng Part C Methods. 2014 Apr; 20(4):308-16. I.F.: 4.254
ETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E
TESSUTI
9. Clementina Sitzia, Andrea Farini, Federica Colleoni, Francesco Fortunato, Paola
Razini,
Silvia Erratico, Alessandro Tavelli, Francesco Fabrizi, Marzia Belicchi,
Mirella Meregalli, Giacomo Comi, Yvan Torrente.
Improvement of endurance of DMD animal model using natural polyphenols
BioMed Research International , Issue “Nutrients and Muscle Disease (MDIS) "
I.F.:
2.71
TESSUTI
10. Orive G, Cobos R, Gorriti, Pedraz JL, Meregalli M, Torrente Y.
Emerging Technologies for Tissue repair and Regeneration
Special issue of Current Pharmaceutical Biotechnology I.F.: 3.40
TESSUTI
11.
F. Colleoni, M. Pluderi, M. Belicchi, P. Razini, N. Bresolin, D. Spagnoli, F. Raneri, P.
Rampini, S. Gatti, M. Vergari, N. Grimoldi, Y. Torrente
Skin Derived Stem Cells Scaffold Regenerate Axons of Injured Dorsal Root
CellR4 2014; 2 (1): e809
TESSUTI
CAPITOLI DI LIBRO
1.
Sitzia Clemetina, Erratico Silvia, Farini Andrea, Torrente Yvan, Meregalli Mirella
Stem cells in dystrophic animal models: from pre-clinic to clinical studies
From Pre-clinic to Biodiversity. 2014
TESSUTI
2.
76
M. Meregalli, A. Farini, C. Sitzia, Y. Torrente.
Cell Replacement Therapy in Neuromuscular and Neurodegenerative Diseases.
Horizon in Neuroscience Research. Nova Publishers 2014
TESSUTI
ELENCO CONGRESSI 2014
1.
Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation)
RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea 8:
Terapia Genica e Cellulare
Autologous skin-derived stem cells and platelet-rich plasma as treatment for traumatic
spinal cord injury. Y. Torrente, N. Grimoldi, M. Belicchi, S. Erratico, M.
Pluderi, R. Giordano, T.
Francesca, M. Marconi, P. Rampini, N. Bresolin.
IRCCS Global Controls in Stem Cells,
Singapore. November 5-7, 2014
2.
Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation)
Stem cell-mediated exon skipping of the dystrophin gene by the bystander effect. Y.
Torrente, M. Meregalli, C. Beley, A. Farini, C. Sitzia, P. Razini, L. Cassinelli, F.
olleoni, A. Tavelli, M. Belicchi, L. Garcia. IRCCS Global Controls in Stem Cells,
Singapore. November 5-7, 2014
3. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation)
RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI Linea
6:Neuroscienze Cliniche e di Base
Improvement of endurance of DMD animal model using natural polyphenols. S.E.
Erratico, C. Sitzia, A. Farini, F. Colleoni, P. Razini, F. Fortunato, F. Fabrizi, M.
Belicchi, M. Meregalli, G. Comi, Y.Torrente. 2nd World Congress on Targeting
Microbiota. Institut
Pasteur, Paris, France. October 16-17, 2014
4. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation, Invited speaker)
Aspetti neurologici delle cellule staminali. Y. Torrente. Uso delle cellule staminali
cordonali per scopi non ematologici. European Biotech Week. Università
degli Studi “Tor Vergata”,
Roma. 6 Ottobre 2014.
5.
Comunicazione scientifica su riviste non censite (Postar presentation)
Terapia Genica e Cellulare Full-Length Dysferlin Expression Driven by Engineered
Human Dystrophic Blood-Derived
CD133+ Stem Cells. M. Meregalli, C.
Navarro, C. Sitzia, A. Farini, P. Razini, C. Beley, L.
Cassinelli, D.
Parazzoli, Y. Torrente. 13th International Congress on neuromuscular
diseases – ICNMD. Acropolis Convention Center, Nice, France. July 5-10th, 2014
6.
Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation, Invited speaker)
6:Neuroscienze Cliniche e di Base
Cortical and spinal motor neurons controlling muscle behavior. Y. Torrente. MOTOR
EURON DISEASES - Molecular and Cellular Basis of Selective Vulnerability. Sala
Napoleonica, Università degli Studi di Milano. July 3rd, 2014
77
7.
Predicted miRNAs in murine dystrophin gene. L.M. Cassinelli, F. Gandolfi, M.
Forcato, S. Bicciato, M. Meregalli, Y. Torrente. 2014 New Directions in Biology and
Disease of Skeletal Muscle Conference. Chicago, Illinois. June 29-July 2, 2014
8.
8:Terapia Genica e Cellulare
Full-Length Dysferlin Expression Driven by Engineered Human Dystrophic BloodDerived CD133+ Stem Cells. M. Meregalli, C. Navarro, C. Sitzia, A. Farini, E.
Montani, N. Wein, P. Razini, C. Beley, L. Cassinelli, M. Belicchi, D. Parazzoli,
L. Garcia, Y. Torrente. 2014 New Directions in Biology and Disease of
Skeletal Muscle Conference. Chicago, Illinois. June 29-July 2, 2014
9.
Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation)
Stem Cell Salvage of injured peripheral nerve. N. Grimoldi, F. Colleoni, F. Tiberio, I.
G. Vetrano, A. Cappellari, A. Costa, M. Belicchi, P. Razini, R. Giordano, D.
Spagnoli, M. Pluderi, M. Morbin, S. M. Gaini, P. Rebulla, N. Bresolin and Y.
Torrente. EFNS-ENS Joint Congress of European Neurology. Istanbul, Turkey. May
31st-June 3rd, 2014
10. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation)
Autologous skin derived stem cells and platelet-rich plasma as treatment for Traumatic
spinal cord injury. Y. Torrente, N. Grimoldi, M. Belicchi, S. Erratico, M. Pluderi, R.
Giordano, T. Francesca, M. Marconi, P. Rampini, N. Bresolin. EFNS-ENS Joint
Congress of European Neurology. Istanbul, Turkey. May 31st-June 3rd, 2014
11. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Oral presentation)
Terapia Genica e Cellulare Autologous transplantation of bone marrow-derived
CD133+ stem cells in facioscapulohumeral dystrophy. Y. Torrente, P. Razini, M.
Belicchi, A. Mazza, A. Schiavetta, R. Giordano, M. Marconi, N. Bresolin. EFNS-ENS
Joint Congress of European Neurology. Istanbul, Turkey. May 31st-June 3rd, 2014
12. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Poster presentation)
Terapia Genica e Cellulare Role Of Mesenchymal Stem Cells In Human IUGR
Placentas. C. Novielli, P. Razini, C. Mandò, A. Tavelli, G.M. Anelli, M. Belicchi, I.
Capriata, S. Erratico, I. Cetin, Y. Torrente. Reproductive sciences. Society for
Gynaecological Investigation (SGI) Annual Meeting. Florence. March
26-29, 2014
13. Comunicazione scientifica su riviste non censite (Co-Chaiman and Oral presentation)
78
Le cellule Staminali nella Sperimentazione Clinica. Y. Torrente. Giornata UniStem L’Italia
Unita dalla Scienza: il lungo e affascinante viaggio della ricerca sulle cellule staminali.
Aula Magna, Università degli Studi di Milano. 14 marzo 2014.
ELENCO DEI PROGETTI DI RICERCA FINANZIATI ED ANCORA IN CORSO
1. Ricerca Corrente 2014 della Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore
Policlinici
“Caratterizzazione del midollo osseo di pazienti distrofici” - Ricerca
Corrente – Fondazione
IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di
Milano
Finanziamento 28.000 Euro
2. Ricerca Finalizzata Ref. n. RF-2009-1547384 (2012-2014) "Design of a clinical trial
using CD133-LV(U7)"
Finanziamento totale 600.000 Euro (I tranche 240.000 Euro erogata nel 2013)
3. “Gene therapy for alpha-dystroglycan muscular dystrophy (MDC1C)” _Fondazione
Opsis Onlus
4. “Studio genetico e nutrizionale finalizzato alla cura delle Miopatie Miofibrillari” –
Fondazione Roby ONLUS
5.“Motor neuron degeneration in Spinal and Bulbar Muscular Atrophy: molecular
approaches to counteract mutant androgen receptor neurotoxicity” – Telethon Grant
2014
79
80
U.O.S.D. MALATTIE NEUROMUSCOLARI e RARE
Responsabile:
M. Moggio
Collaboratori:
M. Sciacco: Dirigente Medico Fondazione - Neurologo, Dottore di ricerca in Scienze
Neurologiche, co-responsabile ”Banca tessuto muscolare scheletrico, nervo
periferico, DNA e colture cellulari”
G. Fagiolari: Biologo - tecnico ospedaliero Fondazione
M. Ripolone: Biologo borsista Fondazione
P. Ciscato:
Tecnico ospedaliero Fondazione
R. Violano: Biologo - borsista Fondazione
L. Napoli:
Biologo - borsista Telethon
V. Lucchini: Neurologo - Dottore di ricerca in medicina molecolare - Borsista Fondazione
(sino a luglio 2014)
I. Colombo: Neurologo specializzato da luglio 2014
L. Peverelli: Specializzando in Neurologia
L. Villa:
Specializzanda in Neurologia
P. Valentini: Architetto - amministrativa - Borsista Telethon
R. Xhani:
Laureata in Medicina e Chirurgia, Borsista Fondazione (sino a novembre 2014)
S. Testolin:
Laureata in Medicina e Chirurgia, Borsista Fondazione
81
ATTIVITA’ DIAGNOSTICA
Nell'anno 2014 l’attività ambulatoriale globale riguardante le malattie neuromuscolari è
sovrapponibile a quella dell’anno precedente.
In particolare, sono state effettuate n. 1.100 visite nell’ambulatorio per le malattie
neuromuscolari in collaborazione con la UO di Neurologia.
Inoltre, sono stati effettuati n. 250 accessi di DH per le suddette patologie.
Sono state studiate e refertate 227 biopsie muscolari e 15 biopsie di nervo.
I prelievi bioptici afferiscono al laboratorio della UOSD Malattie Neuromuscolari e Rare della
Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico provenienti da:





UOC di Neurologia
UOSD Malattie Neuromuscolari e Rare
Dipartimento di Medicina della Fondazione
Altri Dipartimenti della Fondazione
Altri Ospedali quali: Ospedale S. Gerardo di Monza, Istituto Auxologico-Ospedale San
Luca, Istituto Mondino di Pavia, Istituto Humanitas, Istituto Don Gnocchi di Milano,
Ospedale San Paolo, Ospedale Sacco, Ospedale Valduce di Como, Ospedale Cantonale di
Lugano, Ospedale di Niguarda, Ospedale di Desio, Ospedale di Lugo di Romagna,
Ospedale di Faenza, Ospedale di Ravenna, Ospedale di Rimini, Ospedale di Gallarate,
Ospedale di Busto Arsizio, Ospedale di Melegnano, Ospedale di Ravenna, Ospedale di
Vimercate, Ospedale di Legnano, Ospedale Policlinico di Pavia, Ospedale Santa Corona
di Garbagnate e occasionalmente da altre strutture ospedaliere.
Regolari Convenzioni o rapporti di fatturazione intercorrono fra il Servizio di Diagnostica e i
citati Enti ospedalieri.
Il laboratorio provvede alla tecnicazione delle biopsie, alla refertazione delle medesime, alla
loro conservazione e alla spedizione dei referti ai vari enti ospedalieri.




82
Dall’anno 1999 il Laboratorio ha avuto il riconoscimento di “Banca Telethon di DNA,
tessuto muscolare scheletrico, nervo periferico e colture cellulari”. I diversi campioni
biologici stoccati nella banca sono a disposizione dei ricercatori italiani e stranieri
interessati
e
sono
elencati
in
un
dedicato
sito
web:
http://www.centrodinoferrari.com/laboratori/u-o-d-diagnostica-malattie-neuromuscolarie-rare/.
Dall’anno 2001 la banca è parte dell’Eurobiobank, un network di banche di Istituti
scientifici di diversi paesi della Comunità Europea.
Dall’anno 2002 la banca è anche parte del Progetto Finalizzato dell’Ospedale Maggiore
“Bioredepositary”.
Dal Luglio 2002 l’Unità operativa ha ottenuto la certificazione ISO 9001:2000.
Biopsie Muscolari
Microscopia ottica
Durante l’anno 2014 sono state eseguite N° 227 biopsie muscolari indagate con metodiche
istologiche, istoenzimatiche e immunoistochimiche.
Tutte le biopsie di pazienti col sospetto clinico di distrofia sono state studiate anche con
metodiche immunologiche con anticorpi contro le varie proteine coinvolte in queste patologie
(distrofina, merosina, sarcoglicani, disferlina, caveolina, emerina, alfadistroglicano, miotilina,
desmina, etc.).
Tutte le biopsie di pazienti col sospetto di patologia infiammatoria sono state studiate
mediante specifici markers immunocitochimici. In particolare, sono stati utilizzati anticorpi
anti-HLA 1 (A,B,C), anti-membrane attack complex, anti-linfociti T (CD4 e CD8) e anti-B
(CD 19).
Biopsie con il sospetto di IBM vengono studiate con la colorazione Rosso Congo. In totale,
relativamente a quanto sopra specificato, sono stati eseguiti 3.178 tests.
Microscopia elettronica
Le biopsie muscolari sono state studiate con metodiche ultrastrutturali quando ritenuto
necessario e sono stati eseguiti 84 tests.
In particolare, vengono studiate tutte le biopsie di pazienti affetti da miopatie dismetaboliche
per la conferma delle seguenti diagnosi: glicogenosi, lipidosi, mitocondriopatie, miopatie a
corpi inclusi e miopatie congenite. Sono infine analizzate tutte le biopsie nelle quali gli studi
istologici, istoenzimologici, biochimici e genetici non sono indicativi di una particolare
miopatia.
Biopsie di nervo
Microscopia ottica
Durante l’anno 2014 sono state eseguite N° 15 biopsie di nervo periferico. Tutti i prelievi
bioptici sono studiati su sezioni criostatiche con le comuni metodiche istologiche e su sezioni
semifini incluse in resina per la microscopia elettronica colorate con blu di toluidina, sono
stati eseguiti 55 tests (istologia e reazioni immunocitochimiche).
Viene eseguita una valutazione quantitativa della densità delle fibre mieliniche con apposito
analizzatore di immagini su sezioni semifini.
Di tutte le biopsie vengono allestite apposite preparazioni atte all’analisi di singole fibre
nervose isolate (metodica del teasing) e per ogni paziente se ne studiano almeno 100.
Nelle biopsie di nervo con sospetto di patologia infiammatoria vengono inoltre eseguiti studi
immunoistochimici con Abs anti HLA, MAC e linfociti.
Nel sospetto di patologia da accumulo di amiloidosi viene eseguita la colorazione per il rosso
congo.
Microscopia elettronica
Le biopsie di nervo sono state incluse in resine epossidiche e tecnicate per le osservazioni in
microscopia elettronica, per l’isolamento delle singole fibre nervose e per la valutazione
quantitativa della densità fibrale. A tal fine sono stati eseguiti circa 45 tests (sezioni semifini e
griglie per ultrastruttura).
83
In particolare vengono studiate tutte le biopsie nelle quali gli esami istologici e quantitativi
non riescono ad indirizzare la diagnosi verso una particolare neuropatia.
ATTIVITA’ DI RICERCA
L'attività di ricerca è stata condotta utilizzando gli stessi laboratori e apparecchi impiegati per
la diagnostica neuromuscolare. Anche i reagenti utilizzati sono, almeno per l’80%, quelli
comunemente impiegati per la diagnostica.
L’attività di ricerca ha prodotto nel 2014 i seguenti risultati:
PRODUTTIVITÀ SCIENTIFICA ANNO 2014
SETTORE URGENZA-EMERGENZA: FISIOPATOLOGIA DELLA RELAZIONE
TRA PERSONA E AMBIENTE E MALATTIE RARE
Linea 1:Epidemiologia Clinica
Gang Q, Bettencourt C, Machado PM, Fox Z, Brady S, Healy E, Parton M, Holton JL, HiltonJones D, Shieh PB, Zanoteli E, De Paepe B, De Bleecke Jr, Shaibani A, Ripolone M, Violano
R, Moggio M, Barohn RJ, Dimachkie MM, Mora M, Mantegazza R, Zanotti S, Hanna MG,
Houlden H.
The effects of an intronic polymorphism in TOMM40 and APOE genotypes in sporadic
inclusion body myositis.
Neurobiology of Aging, 31 dec 2014 PII: S0197-4580(15)00003-2.
DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.12.039 Reference: NBA 9179 I.F. 4.853
Il lavoro ha visto il contributo della nostra UO come fornitore di campioni biologici di
pazienti affetti da miopatia da corpi inclusi e custoditi nella banca della UO. Sono stati
individuati dei polimorfismi a carico del gene TOMM40 e del del gene APOE che sono stati
correlati a differenti quadri clinici.
Colombo I, Scoto M, Manzur AY, Robb SA, Maggi L, Gowda V, Cullup T, Yau M, Phadke
R, Sewry C, Jungbluth H, Muntoni F.
Congenital myopathies: Natural history of a large pediatric cohort.
Neurology. 2014 Nov 26. pii: 10.1212/WNL.0000000000001110. [Epub ahead of print]
PMID: 25428687 [PubMed - as supplied by publisher] I.F. 8.303
Si tratta di uno studio retrospettivo su125 pazienti affetti da Miopatia Congenita in età
pediatrica, volto a valutare la storia naturale di tale malattia rara. Una caratterizzazione
genetica è stata possibile nel 79.2% dei casi, con mutazioni del gene RYR1 come più
frequenti. Si è riscontrata una mortalità del 12% nel primo anno di vita, la perdita della
deambulazione nel 9%, il ricorso a ventilazione notturna e gastrostomia in un terzo dei
pazienti, e a chirurgia per scoliosi nel 13%. Specifiche correlazioni genotipo-fenotipo sono
state altresì descritte.
Bertoldo F, Zappini F, Brigo M, Moggio M, Lucchini V, Angelini C, Semplicini C, Filosto
M, Ravaglia S, Cotelli S, Todeschini A, Scarpelli M, Pancheri S, Tonin P.
Prevalence of asymptomatic vertebral fractures in late-onset Pompe disease.
J Clin Endocrinol Metab. 2014 Nov 14:jc20142763. [Epub ahead of print]
Si tratta di un lavoro multicentrico volto a stabilire la prevalenza delle fratture vertebrali
morfometriche e a valutare la massa ossea in soggetti adulti affetti da malattia di Pompe. Lo
studio ha permesso di riscontrare fratture vertebrali morfometriche nel 77% dei pazienti
studiati (17 su 22). Tutte le fratture erano asintomatiche e atraumatiche e la loro presenza
84
era indipendente dal quadro miopatico e respiratorio. Osteopenia e osteoporosi erano
presenti in oltre il 50% dei pazienti. Lo studio sottolinea la necessità di effettuare uno
screening per la presenza di fratture vertebrali nei soggetti con malattia di Pompe
indipendentemente dalla gravità della patologia.
Levy RJ, Ríos PG, Akman HO, Sciacco M, Vivo DC, DiMauro S.
Long survival in patients with leigh syndrome and the m.10191T>C mutation in MT-ND3 : a
case report and review of the literature.
J Child Neurol. 2014 Oct;29(10):NP105-10. doi: 10.1177/0883073813506783. Epub 2013
Nov 27.
PMID: 24284231 [PubMed - in process] I.F. 1.666
Riportiamo il caso atipico di una donna affetta da sindrome di Leigh con mutazione
m.10191T>C nel complesso I del gene MT-ND3. Nonostante l'esordio infantile e la gravità
dei sintomi la paziente è sopravvissuta fino all'età adulta grazie ad un regime dietetico mirato
e al supporto familiare. Si tratta di un ulteriore testimonianza di sopravvivenza in età adulta di
un soggetto affetto da sindrome di Leigh.
De Filippi P, Saeidi K, Ravaglia S, Dardis A, Angelini C, Mongini T, Morandi L, Moggio M,
Di Muzio A, Filosto M, Bembi B, Giannini F, Marrosu G, Rigoldi M, Tonin P, Servidei S,
Siciliano G, Carlucci A, Scotti C, Comelli M, Toscano A, Danesino C.
Genotype-phenotype correlation in Pompe disease, a step forward.
Orphanet J Rare Dis. 2014 Aug 8;9:102. doi: 10.1186/s13023-014-0102-z.
PMID: 25103075 [PubMed - in process]I.F. 3.96
Si tratta di uno studio multicentrico relativo ad un ampio numero di pazienti affetti da
glicogenosi tipo II (malattia di Pompe) dei quali sono stati raccolti i dati clinici e strumentali
(parametri respiratori e dosaggio CPK). Tali dati sono stati confrontati con le mutazioni
genetiche di ciascun paziente e con la presenza o meno di alcuni polimorfismi genetici in
grado di influenzare le caratteristiche del tessuto muscolare. Ciò ha consentito di individuare i
sottogruppi di pazienti che, in base al genotipo, tendono a sviluppare più precocemente la
malattia e/o ad avere una più marcata sintomatologia algica muscolare.
Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Catteruccia M, Pegoraro E, Carelli V,
Valentino ML, Comi GP, Minetti C, Bruno C, Moggio M, Ienco EC, Mongini T, Vercelli L,
Primiano G, Servidei S, Tonin P, Scarpelli M, Toscano A, Musumeci O, Moroni I, Uziel G,
Santorelli FM, Nesti C, Filosto M, Lamperti C, Zeviani M, Siciliano G.
Myoclonus in mitochondrial disorders.
Mov Disord. 2014 May;29(6):722-8. doi: 10.1002/mds.25839. Epub 2014 Feb 7.
Il mioclono è una manifestazione di frequente riscontro nelle malattie mitocondriali, in
particolare, insieme all'epilessia e alla presenza di fibre ragged red alla biopsia muscolare,
rappresenta il cardine della sinndrome di MERFF (epilessia mioclonica con fibre Ragged
Red). Scopo di questo studio multicentrico è quello di studiare la prevalenza del mioclono
in soggetti affetti da mitocondiopatie e di valutare quali fenotipi clinici vi si associano, oltre
alla nota sindrome di MERRF. La revisione dei pazienti è stata fatta grazie ai dati contenuti
nel database del Network Italiano per le Malattie Mitocondriali. Dallo studio è emerso che
il mioclono è una caratteristica clinica piuttosto rara (3.6% dei 1,086 pazienti registrati nel
network), che non sottende un fenotipo o genotipo specifico, che solo uno su tre pazienti
con sindrome di MERFF ha la mutazione tipica di questa patologia (8344 A>G) e che il
mioclono si associa più spesso all'atassia cerebellare che non all'epilessia.
85
Remiche G, Ronchi D, Magri F, Lamperti C, Bordoni A, Moggio M, Bresolin N, Comi GP.
J Neurol. 2014 Jan;261(1):83-97. doi: 10.1007/s00415-013-7137-2. Epub 2013 Oct 25.
Review.
PMID: 24158270 [PubMed - indexed for MEDLINE] I.F. 3.841
Gli autori hanno effettuato una correlazione genotipo-fenotipo in 36 pazienti affetti da
glicogenosi di tipo II (Malattia di Pompe) ad esordio tardivo allo scopo di identificare quali
siano le mutazioni più deleterie ossia quelle che si associano ad una maggior disabilità dal
punto di vista muscolare e respiratorio. L’obiettivo è quello di identificare fattori prognostici
il più possibile accurati anche per meglio definire le strategie di follow-up e l’algoritmo per la
somministrazione di enzima ricombinante.
Linea 3:Nuove Emergenze per la Cura della Salute
Esposito S, Bruno C, Berardinelli A, Filosto M, Mongini T, Morandi L, Musumeci O,
Pegoraro E, Siciliano G, Tonin P, Marrosu G, Minetti C, Servida M, Fiorillo C, Conforti G,
Scapolan S, Ansaldi F, Vianello A, Castaldi S, Principi N, Toscano A, Moggio M.
Vaccination recommendations for patients with neuromuscular disease.
Vaccine. 2014 Oct 14;32(45):5893-900. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.09.003. Epub 2014 Sep
16.
PMID: 25223270 [PubMed - in process]I.F. 3.485
Il lavoro presenta le raccomandazioni relative alla problematica delle vaccinazioni in
pazienti affetti da malattie neuromuscolari. Il lavoro presenta il consenso delle diverse
società scientifiche che hanno congiuntamente redatto il consenso.
Brunetti D, Dusi S, Giordano C, Lamperti C, Morbin M, Fugnanesi V, Marchet S, Fagiolari
G, Sibon O, Moggio M, d'Amati G, Tiranti V.
Pantethine treatment is effective in recovering the disease phenotype induced by ketogenic
diet in a pantothenate kinase-associated neurodegeneration mouse model.
Brain. 2014 Jan;137(Pt 1):57-68. doi: 10.1093/brain/awt325. Epub 2013 Dec 6.
Analisi di un modello animale (tipo knockout) per il gene PANK2, le cui mutazioni sono
responsabili di un disturbo autosomico recessivo caratterizzato da distonia, disartria, rigidità,
retinite pigmentosa e accumulo di ferro a livello encefalico. Il lavoro dimostra che la
somministrazione di pantetina può impedire lo sviluppo del fenotipo patologico
neuromuscolare nei topi, suggerendo la possibilità di un utilizzo della sostanza a livello
sperimentale nei soggetti affetti.
Regulating Biobanks in Humans: The Use of Adult and Children Biomaterials for Clinical
and Research Purposes.
Editor: Elena Salvaterra
Contributing Authors: E. Salvaterra, R. Giorda, M.T. Bassi, R. Borgatti, L. Knudsen, A.
Martinuzzi, M. Nobile, U. Pozzoli, G.P. Ramelli, G.L. Reni, D. Rivolta, M.A. Stazi, S.
Strazzer, C. Thijs, V. Toccaeli, A. Trabacca, A.C. Turconi, S. Zanini. C. Zucca, N. Bresolin,
L. Lenzi, S. Giovanelli, B. Butti, M.T. Bardella, P.A. Bertazzi, S. Bosari, G. Coggi, D. A.
Coviello, F. Lalatta, M. Moggio, M. Nosotti, A. Zanella, and P. Rebulla.
Nova Publisher 2014
86
Il lavoro presenta il consenso dei maggiori esperti nazionali in ambito di "biobanche", relativo
alle modalità di stoccaggio, e distribuzione di materiale biologico nonché relativo alle corrette
procedure di raccolta del consenso informato e dei dati sensibili relativi ad ogni donatore.
Linea 4: Terapia Personalizzata (neonato, bambino, anziano …)
Bushby K, Finkel R, Wong B, Barohn R, Campbell C, Comi GP, Connolly AM, Day JW,
RJ, O'donnell MW, Peltz SW, Mcdonald CM; PTC124-GD-007-DMD STUDY GROUP.
Ataluren treatment of patients with nonsense mutation dystrophinopathy.
Muscle Nerve. 2014 Oct;50(4):477-87. doi: 10.1002/mus.24332.
Risultati dello studio multicentrico, condotto in doppio cieco e controllato da placebo,
relativo al trattamento con Ataluren di bambini affetti da Distrofia Muscolare di Duchenne
(DMD) con mutazione nonsense sul gene della distrofina. Le mutazioni nonsense
rappresentano circa il 13% dei casi di DMD. Ataluren è stato sviluppato per interagire coi
ribosomi e consentire di bypassare gli stop codons prematuri indotti dalla mutazione genetica
sull'RNA messaggero in modo da consentire alle cellule di produrre una proteina di lunghezza
normale e funzionante. Ataluren è stato ben tollerato e i risultati in base agli endpoint primari
e secondari sono promettenti.
SETTORE RIPARAZIONE E SOSTITUZIONE DI CELLULE, ORGANI E TESSUTI
Montagnese F, Portaro S, Musumeci O, Migliorato A, Moggio M, Fagiolari G, Rodolico C.
Sporadic late-onset nemaline myopathy in a woman with multiple myeloma successfully
treated with lenalidomide/dexamethasone.
Muscle Nerve. 2014 Dec 19. doi: 10.1002/mus.24545. [Epub ahead of print] No abstract
available. PMID: 25524603 [PubMed - as supplied by publisher] I.F. 2.311
Descrizione di un caso clinico di paziente affetta da miopatia nemalinica ad esordio tardivo,
complicata da mieloma multiplo, che ha risposto positivamente al trattamento con
associazione lenalidomide-desametasone.
Moggio M, Colombo I, Peverelli L, Villa L, Xhani R, Testolin S, Di Mauro S, Sciacco M.
Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge.
Acta Myologica 2014; XXXIII: p. 86-93.
Lavoro descrittivo delle numerose complicanze cliniche e multisistemiche associate alla
presenza di malattie mitocondriali. Il lavoro si prefigge di tracciare delle linee guida su come
individuare, monitorare e, quando possibile, trattare le diverse complicanze allo scopo di
migliorare la prognosi dei pazienti.
Mora M, Angelini C, Bignami F, Bodin AM, Crimi M, Di Donato JH, Felice A, Jaeger C,
Karcagi V, LeCam Y, Lynn S, Meznaric M, Moggio M, Monaco L, Politano L, de la Paz MP,
Saker S, Schneiderat P, Ensini M, Garavaglia B, Gurwitz D, Johnson D, Muntoni F, Puymirat
J, Reza M, Voit T, Baldo C, Bricarelli FD, Goldwurm S, Merla G, Pegoraro E, Renieri A,
Zatloukal K, Filocamo M, Lochmüller H.
The EuroBioBank Network: 10 years of hands-on experience of collaborative, transnational
biobanking for rare diseases.
87
Eur J Hum Genet. 2014 Dec 24. doi: 10.1038/ejhg.2014.272. [Epub ahead of print]
Il network della EuroBioBank (EBB) (www.eurobiobank.org) è il primo network di
biobanche europee in grado di fornire campioni di DNA e di altri tessuti biologici alla
comunità scientifica per promuovere la ricerca sulle malattie rare (Rare Diseases, RD). La
EBB, riconosciuta e finanziata dalla Comunità Europea nel 2002 (5th framework
programme) subito dopo la sua fondazione, ha partecipato negli anni a vari programmi tra
cui il TREAT-NMD, e ha preso parte alla pianificazione della European Biobanking and
Biomolecular Resources Research Infrastructure. Recentemente, EBB è diventata partner di
RD-Connect, un programma europeo dedicato alle malattie rare mirato a coordinare
biobanche, registri e dati bioinformatici.
Melchionda L, Haack TB, Hardy S, Abbink TE, Fernandez-Vizarra E, Lamantea E, Marchet
S, Morandi L, Moggio M, Carrozzo R, Torraco A, Diodato D, Strom TM, Meitinger T,
Tekturk P, Yapici Z, Al-Murshedi F, Stevens R, Rodenburg RJ, Lamperti C, Ardissone A,
Moroni I, Uziel G, Prokisch H, Taylor RW, Bertini E, van der Knaap MS, Ghezzi D, Zeviani
M.
Mutations in APOPT1, encoding a mitochondrial protein, cause cavitating
leukoencephalopathy with cytochrome c oxidase deficiency.
Am J Hum Genet. 2014 Sep 4;95(3):315-25. doi: 10.1016/j.ajhg.2014.08.003. Epub 2014
Aug 28.
In questo lavoro si evidenzia come grazie alle tecniche di sequenziamento dell'intero
genoma sia stato possibile individuare mutazioni nel gene APOPT1 in due sorelle italiane,
in un paziente turco e in tre bambini tra loro non imparentati che presentavano
leucodistrofia alla RM cerebrale oltre che deficit di COX alla biopsia muscolare. Le
caratteristiche cliniche di questa nuova entità nosologica vanno dal grave scompenso
metabolico in età infantile alla comparsa di segni neurologici minori durante l'adolescenza.
Il lavoro descrive in dettaglio gli esperimenti che hanno permesso di individuare come
APOPT1 codifichi per una proteina mitocondriale e come le funzioni di tale proteina
vengano compromesse dalla mutazione genetica.
Protti A, Fortunato F, Caspani ML, Pluderi M, Lucchini V, Grimoldi N, Solimeno LP,
Fagiolari G, Ciscato P, Zella SM, Moggio M, Comi GP, Gattinoni L.
Mitochondrial changes in platelets are not related to those in skeletal muscle during human
septic shock.
PLoS One. 2014 May 1;9(5):e96205. doi: 10.1371/journal.pone.0096205. eCollection 2014.
Le piastrine possono essere utilizzate per studiare la funzione, o la disfunzione
mitocondriale in numerose patologie. In questo studio, tramite spettrofotometria, abbiamo
effettuato uno studio biochimico della catena respiratoria mitocondriale nelle piastrine e nel
muscolo tricipite di 30 pazienti ricoverati per shock settico acuto e di dieci controlli
(prelievo in occasione di intervento chirurgico programmato). I pazienti con shock settico
hanno mostrato un'inibizione di alcuni enzimi della catena respiratoria nelle piastrine, ma
non nel muscolo tricipite, rispetto ai controlli. Sembra quindi che lo shock settico induca
delle alterazioni mitocondriali focali, in questo caso nelle piastrine, che non sono presenti
in altri organi e tessuti.
88
Diodato D, Invernizzi F, Lamantea E, Fagiolari G, Parini R, Menni F, Parenti G, Bollani L,
Pasquini E, Donati MA, Cassandrini D, Santorelli FM, Haack TB, Prokisch H, Ghezzi D,
Lamperti C, Zeviani M.
Common and Novel TMEM70 Mutations in a Cohort of Italian Patients with Mitochondrial
Encephalocardiomyopathy.
JIMD Rep. 2014 Apr 17. [Epub ahead of print]
Studio multicentrico di dieci soggetti italiani con quadro clinico caratterizzato da acidosi
lattica neonatale, insufficienza respiratoria, ipotonia, cardiomiopatia e ritardo psicomotorio
che presentano mutazioni a trasmissione autosomica recessiva nel gene TMEM70. La
proteina TMEM70, la cui funzione interferisce col funzionamento del complesso v della
catena respiratoria e porta ad un deficit di ATP sintasi, è risultata assente nei campioni
muscolari di tutti i soggetti studiati. Alcune delle mutazioni individuate rappresentano varianti
note, ma sono anche state individuate quattro varianti nuove.i pazienti studiati presentavano
anche un deficit a carico degli altri complessi della catena respiratoria e l'analisi
ultrastrutturale del tessuto muscolare di uno dei soggetti affetti ha mostrato marcate
alterazioni morfologiche a carico dei mitocondri. tali risultati indicano che il deficit di
complesso v induce una riduzione indiretta degli altri complessi della catena respiratoria
causando grave alterazione a carico dei mitocondri.
Pagliarani S, Lucchiari S, Ulzi G, Violano R, Ripolone M, Bordoni A, Nizzardo M, Gatti S,
Corti S,Moggio M, Bresolin N, Comi GP.
Glycogen storage disease type III: A novel Agl knockout mouse model.
Biochim Biophys Acta. 2014 Nov;1842(11):2318-28. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.07.029.
Epub 2014 Aug 1.
Nicholls TJ, Zsurka G, Peeva V, Schöler S, Szczesny RJ, Cysewski D, Reyes A, Kornblum C,
Sciacco M, Moggio M, Dziembowski A, Kunz WS, Minczuk M.
Linear mtDNA fragments and unusual mtDNA rearrangements associated with pathological
deficiency of MGME1 exonuclease.
Hum Mol Genet. 2014 Dec 1;23(23):6147-62. doi: 10.1093/hmg/ddu336. Epub 2014 Jun 30.
Si tratta di uno studio biomolecolare mirato ad approfondire le funzioni di MGME1,
un'esonucleasi mitocondriale coinvolta nei processi di replicazione e mantenimento del
DNA mitocondriale (mtDNA). Mutazioni nel gene che codifica per questa proteina causano
una grave patologia mitocondriale a trasmissione autosomica recessiva caratterizzata da
cachessia ed insufficienza respiratoria ingravescenti. lo studio in oggetto approfondisce le
conoscenze sul ruolo della proteina che risulta essere essenziale per la corretta replicazione
del genoma mitocondriale mediante interazione con la replicasi PolgA. Non escludibile un
suo ruolo nei processi di ricombinazione intramolecolare del mtDNA.
Cortese A, Tucci A, Piccolo G, Galimberti CA, Fratta P, Marchioni E, Grampa G, Cereda C,
Grieco G, Ricca I, Pittman A, Ciscato P, Napoli L, Lucchini V, Ripolone M, Violano R,
Fagiolari G, Mole SE, Hardy J, Moglia A, Moggio M.
Novel CLN3 mutation causing autophagic vacuolar myopathy.
Neurology. 2014 Jun 10;82(23):2072-6. doi: 10.1212/WNL.0000000000000490. Epub 2014
May 14.
89
Si tratta dello studio clinico, morfologico e biomolecolare di due fratelli con quadro clinico di
deficit del visus, crisi comiziali e cardiomiopatia in assenza di deficit motorio e con associato
lieve decadimento cognitivo. La biopsia muscolare mostrava vacuoli autofagici e uno studio
biomolecolare combinato (homozigosity mapping ed exome sequencing) ha consentito di
individuare una nuova mutazione, p.Gly165Glu, nel gene CLN3.
Kalko SG, Paco S, Jou C, Rodríguez MA, Meznaric M, Rogac M, Jekovec-Vrhovsek M,
Sciacco M,Moggio M, Fagiolari G, De Paepe B, De Meirleir L, Ferrer I, Roig-Quilis M,
Munell F, Montoya J, López-Gallardo E, Ruiz-Pesini E, Artuch R, Montero R, Torner F,
Nascimento A, Ortez C, Colomer J, Jimenez-Mallebrera C.
Transcriptomic profiling of TK2 deficient human skeletal muscle suggests a role for the p53
signalling pathway and identifies growth and differentiation factor-15 as a potential novel
biomarker for mitochondrial myopathies.
BMC Genomics. 2014 Feb 1;15:91. doi: 10.1186/1471-2164-15-91.
E' noto che mutazioni nel gene timidina chinasi (TK2) causano una encefalomiopatia
mitocondriale infantile con associata deplezione del DNA mitocondriale (mtDNA). Lo scopo
di questo lavoro è quello di individuare i meccanismi che sottendono la patologia al fine di
individuare potenziali strategie terapeutiche. I risultati dello studio hanno consentito di
individuare fattori regolatori trascrizionali che potrebbero spiegare l'alterata espressione del
gene in oggetto a livello muscolare, in particolare p53, un soppressore tumorale, e GDF-15,
un fattore di crescita e differenziazione attivo a livello muscolare e sierico, che potrebbe
costituire un potenziale nuovo biomarcatore di disfunzione mitocondriale.
Mancuso M, Orsucci D, Angelini C, Bertini E, Carelli V, Comi GP, Donati A, Minetti
C, Moggio M, Mongini T, Servidei S, Tonin P, Toscano A, Uziel G, Bruno C, Ienco EC,
Filosto M, Lamperti C, Catteruccia M, Moroni I, Musumeci O, Pegoraro E, Ronchi D,
Santorelli FM, Sauchelli D, Scarpelli M, Sciacco M, Valentino ML, Vercelli L, Zeviani M,
Siciliano G.
The m.3243A>G mitochondrial DNA mutation and related phenotypes. A matter of gender?
J Neurol. 2014 Mar;261(3):504-10. doi: 10.1007/s00415-013-7225-3. Epub 2013 Dec 29.
Studio retrospettivo del fenotipo clinico di 126 pazienti italiani (facenti parte del database
nazionale) portatori della mutazione puntiforme m.3243A>G del DNA mitocondriale
(mutazione “MELAS”, encefalopatia mitocondriale con acidosi lattica ed episodi “strokelike”). Analisi e commenti in merito alla marcata eterogeneità clinica sottolineando come i
sintomi più comuni siano costituiti da ipoacusia e diabete, seguiti da episodi “stroke-like”.
Questi ultimi, almeno nella popolazione italiana, sembrano essere più frequenti nei soggetti di
sesso maschile.
Sancisi V, Germinario E, Esposito A, Morini E, Peron S, Moggio M, Tomelleri G, DanieliBetto D, Tupler R.
Altered Tnnt3 characterizes selective weakness of fast fibers in mice overexpressing FSHD
region gene 1 (FRG1).
Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2014 Jan 15;306(2):R124-37. doi:
10.1152/ajpregu.00379.2013. Epub 2013 Dec 4.
Studio di un modello animale (topo FRG1) per la distrofia Facio-Scapolo-Omerale in cui si
evince che la fibre muscolari rapide, le più compromesse dal processo distrofico, mostrano
90
anomalie nell’isoforma “veloce” delle troponina muscolare. Ciò correla col riscontro nei
pazienti distrofici di uno splicing aberrante nella troponina T scheletrica (TNNT3). Gli autori
concludono che le alterazioni della troponina potrebbero rappresentare un marker biologico
della gravità della malattia e della sua progressione.
De Palma C, Morisi F, Cheli S, Pambianco S, Cappello V, Vezzoli M, Rovere-Querini P,
Moggio M,Ripolone M, Francolini M, Sandri M, Clementi E.
Autophagy as a new therapeutic target in Duchenne muscular dystrophy.
Cell Death Dis. 2014 Aug 7;5:e1363. doi: 10.1038/cddis.2014.312. No abstract available.
PROGETTI IN CORSO

Prosegue il progetto “Correlazioni genotipo fenotipo nella distrofia Facio Scapolo
Omerale (FSHD)” nell’ambito del Consorzio Italiano per la FSHD con particolare
attenzione per i casi con “aplotipi permissivi” A166. Lo studio è condotto su 23 famiglie
che appartengono ai circa 700 casi indice studiati in corso del precedente progetto. Si
tratta di un progetto in collaborazione con tutti i centri presenti in Italia che seguono
pazienti affetti da tale malattia e che sono riuniti nel Telethon network of FSHD.

E’ in fase di validazione la messa a punto di una nuova e aggiornata scheda di
valutazione clinica di pazienti affetti da FSHD che, rispetto a quella in uso, permette un
maggior dettaglio clinico e quindi migliori correlazioni genotipiche.

E’ iniziato il percorso per un consenso attinente i requisiti diagnostici dei pazienti affetti
da FSHD2, ovvero tutti quei pazienti che, pur presentando un quadro clinico compatibile
con la distrofia FSHD, non sono portatori di una contrazione dell’allele D4Z4.

Continua lo studio di una famiglia composta da due germani, un maschio di 30 anni e una
femmina di 23 anni, entrambi affetti da distrofia facio-scapolo omerale (FSHD) con
compromissione clinica rispettivamente moderata e lieve. Entrambi sono portatori di un
frammento corto D4Z4 sul cromosoma 4q35 considerato diagnostico della patologia in
questione. Anche la madre e il nonno materno presentano lo stesso difetto genetico, ma
non sono clinicamente compromessi. Ciò potrebbe essere spiegato da una penetranza
incompleta della patologia, in alternativa, potrebbe trattarsi di una forma a trasmissione
autosomica recessiva nella quale il frammento corto D4Z4, ereditato in questo caso per
via materna, unitamente ad un fattore genetico sconosciuto ereditato per via paterna,
determina la malattia. Nel corso dell’ultimo anno, i risulati di uno studio di next
generation sequencies (NGS) hanno evidenziato nei probandi una serie di alterazioni in
eterozigosi di geni responsabili di altre malattie neuromuscolari

Proseguono le indagini bioptiche morfologiche e biochimiche in pazienti affetti da
Glicogenosi di tipo II e che assumono terapia con enzima ricombinante (ERT Therapy).
Lo studio è coordinato dal nostro laboratorio assieme ai colleghi dell’Istituto Besta e
prevede una analisi bioptica muscolare dopo 6 mesi, un anno e due anni dall’inizio della
terapia. Oltre alle valutazioni morfologiche ed ultrastrutturali classiche, verrà indagato il
sistema fagosomi/lisosomi con reazioni immunocitochimiche nonché eseguito un
dosaggio biochimico dell’enzima alpha glicosidasi. Si tratta di un progetto multicentrico
che coinvolge tutte le UUOO che in Italia somministrano enzima ricombinante a pazienti
affetti da glicogenosi tipo II. Il progetto, iniziato due anni fa, è proseguito nel 2013 con
l’acquisizione di 19 seconde biopsie provenienti, oltre che dal nostro Istituto, dai centri
91
nazionali parte del network. Sono in corso le valutazioni sopraindicate e confermiamo i
risultati preliminari che sembrano attestare l’efficacia della terapia. Nel corso dell’ultimo
anno il numero di pazienti è aumentato a 18. In tutti è stato dimostrato un incremento
dell’attività enzimatica GAA nelle seconde biopsie e in nove di questi, tramite metodica
di WB, è stato dimostrato un incremento della proteina GAA nelle seconde biopsie.

E’ stato ultimato il progetto: studio della deplezione del DNA mitocondriale (mtDNA) in
soggetti affetti da atrofia muscolare spinale (SMA). Tale deplezione è ritenuta di tipo
secondario, conseguente alla marcata ipotrofia muscolare indotta dalla patologia di base.
Abbiamo pertanto iniziato una revisione sistematica di 17 biopsie muscolari provenienti
da altrettanti pazienti affetti da SMA (tipo I, II o III). Dati preliminari mostrano come vi
sia un deficit di citocromo c ossidasi (COX) nella maggior parte dei campioni bioptici, e
come il deficit sia più marcato nella forma più grave e ad esordio precoce, la SMA I. Il
deficit non interessa soltanto le fibre ipotrofiche, inoltre, lo studio parallelo di frammenti
muscolari provenienti da pazienti pari-età affetti da altre patologie neurogene, mostra
un’attività COX nella norma. Ciò supporta l’ipotesi che la disfunzione mitocondriale
nella SMA non sia di tipo secondario, ma, piuttosto, contribuisca all’eziopatogenesi della
malattia. I nostri dati hanno evidenziato una riduzione di espressione di geni deputati alla
replicazione mitocondriale.

Continua la rivalutazione retrospettiva di biopsie muscolari della nostra Banca per
evidenziare miopatie indotte da mutazioni nei geni che causano miopatie miofibrillari e
miopatie congenite”.

E’ stato completato il progetto “Analisi biochimica, istologica e test comportamentali per
lo studio della glicogenosi di tipo III nel modello murino knockout Agl” in
collaborazione con il Prof. Comi Giacomo Pietro, Laboratorio di Genetica e Biochimica Dipartimento di Scienze Neurologiche dell’Università di Milano – Fondazione IRCCS Cà
Granda – Ospedale Maggiore Policlinico di Milano. Abbiamo iniziato lo studio dei
modelli knockout, trattati con terapia retro virale (adenovirus), per verificare se tale
terapia porti ad una diminuzione delle vaste raccolte di glicogeno libero intramuscolare.

Prosegue lo Studio istopatologico, morfometrico e ultrastrutturale del topo transgenico
che overesprime DRP1, una proteina che svolge un ruolo critico nella fissione dei
mitocondri; in collaborazione con il Prof. Clementi Emilio, Unità di Farmacologia,
IRCCS San Raffaele, Milano.

E’ stato ultimato il Progetto “Vaccinazioni e malattie neuromuscolari”. IL progetto, in
collaborazione con i colleghi pediatri e quelli della UO di Igiene, ha affrontato il delicato
aspetto delle vaccinazioni in pazienti affetti dalle più frequenti malattie neuromuscolari.
FINANZIAMENTI IN CORSO

Ministero della Salute Ricerca corrente 2015
"Storia naturale delle alterazioni istopatologiche muscolari in una larga coorte di pazienti
affetti da distrofia muscolare di Duchenne sia in terapia steroidea, sia senza tale terapia"

Telethon Network
“Progetto Telethon Network of Genetic Biobank” anni 2014-2018

Telethon Network
“Development of the Italian National Registry for FSHD” anni 2014-2016
92

Telethon Network
“Building a Nation-wide Italian collaborative network for muscle glycogenoses: registry
and natural history” anni 2014-2015
93
94
SEDE DISTACCATA DEL
“CENTRO DINO FERRARI” - UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO
presso U.O. NEUROLOGIA – STROKE UNIT
LABORATORIO DI NEUROSCIENZE
UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO
IRCCS ISTITUTO AUXOLOGICO ITALIANO
Responsabile
Prof. Dott. Vincenzo Silani
______________________________________________________________________
U.O. Neurologia:
Dott.ssa Laura Adobbati
Dott. Luca Maderna
Dott. Stefano Messina
Dott. Andrea Ciammola
Dott. Barbara Corrà
Dott. Nicola Ticozzi
Dott.ssa Claudia Morelli
Dott. Luca Campana
Dott. Riccardo Doronzo
Dott.ssa Carolina Lombardi
Dott.ssa Paola Mattaliano
convenzione
Dott. Niccolò Mencacci
Dott. Alberto Lerario
Dott. Alberto Doretti
Dott. Federico Verde
Dirigente I° Livello – Stroke Unit
IRCCS Istituto Auxologico Italiano
Dirigente I° Livello,Neurofisiologo
Dirigente I° Livello
Dirigente I° Livello
Dirigente I livello – Stroke Unit
Neurologo, Ricercatore Universitario
Università degli Studi di Milano
Neurologa, Contrattista a Progetto
Neurologo, Contrattista a Progetto
Neurologo, Consulente in Convenzione
Neurofisiologa, Dirigente I° Livello
Centro Medicina del Sonno
Neurofisiologo,
Consulente
in
Neurologo, Dottorato – UCL
Institute of Neurology- Londra
Specializzando in Neurologia
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Dott. Davide Sangalli
Dott.ssa Barbara Poletti
Dott.ssa Annalisa Lafronza
Dott. Laura Carelli
Dott.ssa Federica Solca
Dott. Paolo Banfi
Barbara Riccardi
Francesca Gregorini
Patrizia Nelli
Psicologa, Consulente in Convenzione
Psicologa, Contrattista a Progetto
Pneumologo, Consulente in Convenzione
Tecnico neurofisiologa
Tecnico neurofisiologa
Segreteria Scientifica U.O. Neurologia
Laboratorio di Neuroscienze
Dott.ssa Antonia Ratti
Dott.ssa Lidia Cova
Dott.ssa Isabella Fogh
Dott.ssa Patrizia Bossolasco
Dott.ssa Claudia Colombrita
A
Dott.ssa Cinzia Tiloca
Dott.ssa Jenny Sassone
Dott. ssa Elisa Onesto
Dott.ssa Valentina Diana
Dott. ssa Daniela Calini
Dott.ssa Annamaria Maraschi
96
Biologa, Ricercatore Universitario
ConfermatoUniversità degli Studi di
Milano
Biologa, Contrattista a Progetto
Biologa, Sovvenzione
Associazione Centro “Dino Ferrari”
King’s College di Londra
Biologa, Assegni di ricerca Post doc -Tipo
Biotecnologa, Dottoranda
Biotecnologa, Contrattista a Progetto
Biotecnologa, Contrattista a Progetto
CTF, Contrattista a Progetto
Dott.ssa Francesca Sassone
Rapporti di collaborazione:
Nazionali:
Centro “Dino Ferrari”
IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico
Prof. Nereo Bresolin, Prof. Giacomo Comi
Dott.Maurizio Moggio, Prof. Elio Scarpini,
Dott.ssa Daniela Galimberti, Dott.ssa
Stefania Corti, Dott. Roberto Del Bo
IRCCS Istituto C. Besta, Milano
Dott.ssa Cinzia Gellera, Dott.Tagliavini
Dott. Franco Taroni
IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico
Prof. Paolo Rebulla
Dott.ssa Lorenza Lazzari
Prof. Giorgio Lambertenghi,
IRCCS Istituto Mondino, Pavia
Dott. Fabio Blandini,
Dr.ssa Marie Armentero
Centro Clinico Nemo
Dott. Christian Lunetta
Dipartimento di Endocrinologia
Prof. L. Persani
Dipartimento di Farmacologia
Università di Milano - CEND
Dott. Luigi Sironi, Dott. A.E. Rigamonti,
Neuroimaging Research Unit and
Department of Neurology,
Institute of Experimental Neurology,
Division of Neuroscience and
Department of Neuroradiology,
Vita-Salute University and
San Raffaele Scientific Institute, Milan
Prof. Massimo Filippi
Dott. ssa Federica Agosta
Prof. Giacomo Comi
IRCCS Istituto Mondino, Pavia
Dott. Fabio Blandini, Dott.ssa Cristina
Cereda
Prof. Andrea Falini
Internazionali:
University of Massachussetts Medical
School of Boston
Prof. Robert H. Brown, John Landers
Università di Ulm, Germania
Dipartimento di Neurologia
Prof. Albert Ludolph
King’s College, London
Prof. Al-Chalabi, Christian Shaw
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Prof. John Powell
Università di St. Gallen, Svizzera
Prof. Markus Weber
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ATTIVITÀ SCIENTIFICA – ANNO 2014
La Sede Distaccata del Centro "Dino Ferrari" presso la U.O. di Neurologia e Laboratorio di
Neuroscienze dell' Università di Milano - IRCCS Istituto Auxologico Italiano ha prodotto nel
2014 una serie di lavori scientifici incrementando l’ attività clinica e diversificandosi a
cogliere la complessità della patologia neurodegenerativa.
È proseguita l’operazione di formazione dei più giovani ricercatori e medici che con successo
sono stati inviati in Laboratori sia in Nord America che in Europa. La crescita degli
investimenti in apparecchiature dedicate alla genetica ed alla biologia molecolare ha dato
rilievo alle collezioni di materiale biologico ed ha permesso continuare l’ operato del
Consorzio SLAGEN con un lavoro sinergico tra 6 diverse Istituzioni Italiane. Il Centro “Dino
Ferrari” è stato l’ interlocutore per informazioni sulle casistiche Italiane per quanto riguarda le
malattie neurodegenerative e la SLA in particolare. Il mondo della Demenza FrontoTemporale (FTD) è divenuto continuo con quello della SLA dopo le recenti evidenze
biologiche e il Centro ha aderito all’ Italian Frontotemporal dementia network (FTD Group –
SINDEM). Le équipe multidisciplinari sono state l’ obiettivo perseguito per le diverse
patologie e ciò ha permesso di sviluppare tematiche di ricerca come Brain-Computer Interface
(BCI) ed Eye Tracking (ET) per la comunicazione dei pazienti. Un moderno ed umano
approccio alle più temibili malattie neurodegenerative quali SLA, Demenze, Malattie di
Huntington, Malattia di Parkinson rappresenta l’ obiettivo perseguito della U.O. di Neurologia
di cui il Centro “Dino Ferrari” fa parte operante, vicino alla matrice storica della IRCCS
Fondazione Ca’ Granda Ospedale Maggiore di Milano dove è originariamente nato. L’ aprirsi
degli interessi alla patologia cerebrovascolare è stato di dovere dopo l’ affidamento della
nuova Stroke Unit dal 2007 e ciò ha fornito nuovi spunti di ricerca intersecati alla patologia
neurodegenerativa. In particolare è maturato un largo interesse per la patologia amiloidotica
primitiva dei vasi cerebrali.
Nel 2014 è stata ulteriormente sviluppata la Neurofisiologia con studio anche della patologia
nel sonno, mediante proficua interazione con la U.O. di Cardiologia diretta dal Prof.
Gianfranco Parati.
Il momento riabilitativo ha molto occupato l’ attenzione del Centro “Dino Ferrari” che ha
collaborato a disegnare le fasi successive alla diagnosi nelle diverse patologie, proponendo
studi clinici ed innovativi approcci riabilitativi spesso in sintonia con gli organismi Sanitari
Regionali anche per l’ analisi dei costi.
La ricercata interazione tra eccellenza clinica e ricerca di base si è espressa nel 2014 con il
completamento della pù vasta metanalisi di GWA in oltre 13.000 campioni di DNA con
identificazione di un locus sul cromosoma 17 associato alla SLA sporadica (Fogh et al., Hum
Mol Gen 2014). Inoltre, nell’ ambito di un vasto progetto colalborativo è stato identificato il
gene TUBA4A quale associato alla SLA (Smith et al., Neuron, 2014) ed identificato un
biomarcatore liquorale nei pazienti affetti da SLA/FTD e portatori di espansione per C9orf72
(Su et al., Neuron, 2014). Una review dedicata alla terapia della SLA è stata firmata dal prof.
Silani unitamente a H. Mitsumoto e Brooks (Mitsumoto , Brooks e Silani, Lancet Neurol,
2014). Di rilievo anche l’ evidenza di una interazione tra parkina e i recettori GluK2 nella
Malattia di Parkinson ( Maraschi et al., Nature Comm 2014). Di recente un vasto studio dell’
esoma (circa 3000 esomi) di pazienti affetti da SLA ha maturato una accettazione dei dati
sulla prestigiosa rivista Science (Cirulli et al., in press, 2015)
La Sede Distaccata del Centro “Dino Ferrari” ha ulteriormente ottimizzato gli investimenti in
ricerca presso il Centro di Ricerche e Tecnologie Biomediche di Cusano Milanino dove ha
locazione il Laboratorio di Neuroscienze. L’ acquisizione dell’apparecchiatura Illumina,
piattaforma per l’analisi più approfondita di polimorfismi a singolo nucleotide (SNIP) in
relazione alle patologie neurodegenerative di cui il Centro "Dino Ferrari" per tradizione si
99
occupa, ha permesso il completamento appunto del progetto di associazione genica tipo
“genoma wide” (GWA) per la definizione di geni di suscettibilità nella SLA sporadica dopo
creazione del Consorzio SLAGEN per la raccolta dei campioni di DNA e una sincronia di
ricerca presso Centri Italiani di grande prestigio. La diagnostica molecolare è stata
ulteriormente arricchita potendo fornire oggi un pannello diagnostico completo per le malattie
del motoneurone (SLA), per i disturbi extrapiramidali (Malattia di Huntington e di Parkinson)
e per alcune miopatie (Distrofia Miotonica, Miopatia Oculo-Faringea, etc.).
L' attività clinica presso l’U.O. di Neurologia – Stroke Unit dell’IRCCS Istituto Auxologico
Italiano è stata ulteriormente sviluppata con la creazione di èquipe multidisciplinari per le
diverse patologie neurodegenerative (SLA, Disturbi del Movimento, Malattie
Cerebrovascolari, Disturbi Cognitivi). Sono stati ampliati, in particolare, gli ambulatori ed i
servizi dedicati all' inquadramento multidisciplinare dei Disturbi Cognitivi e dei Disturbi del
Movimento. È stata completata la richiesta per il riconoscimento di un Centro Regionale
dedicato ai Disturbi Cognitivi (I° e II° livello). È proseguita sotto la direzione della U.O. di
Neurologia l’attività della moderna Stroke Unit con 6 letti di cui 4 con monitorizzazione fissa
che ha comportato l’acquisizione e la formazione di nuovo personale specializzato, medico
che infermieristico. È stata avviata una intensa attività clinica con monitoraggio innovativo di
diversi parametri funzionali e studio del sonno in pazienti ricoverati per ictus acuto, in stretta
collaborazione con la U.O. di Cardiologia diretta dal Prof. Gianfranco Parati. La
collaborazione con il Dipartimento di Neuroscienze della IRCCS Fondazione Ca’ Granda
Ospedale Maggiore – Università di Milano ha permesso di completare con successo
molteplici procedure di trombolisi endovenosa ed endoarteriosa con limitata incidenza di
effetti collaterali, contando sulla consulenza neurochirurgica della medesima istituzione. L’
acquisizione di una nuova RM 3T rappresenta il presupposto per una nuova ricerca volta, in
particolare, allo studio della patologia neurodegenerativa e cerebrovascolare.
Il Servizio di Neurofisiologia coordinato dal Dott. Luca Maderna ha dato impulso sia
dell’attività clinica che di ricerca di base con sviluppo di tecniche innovative di registrazione
del muscolo diaframma utile a porre indicazione precoce per la ventilazione non invasiva in
pazienti affetti da SLA e diverse patologie muscolari (Distrofia Miotonica di Steinert), allo
studio del nervo periferico mediante utilizzo di Ecodoppler ed all’ apprendimento di una
moderna tecnica per la determinazione del numero di motoneuroni fisiologicamente attivi
(MUNE).
L' attività didattica è stata espletata nel 2014 per Specializzandi in Neurologia affidati alla
U.O. di Neurologia, Studenti in Medicina e Chirurgia che hanno selezionato la struttura per
elaborare la Tesi di Laurea e Studenti in Biologia o Biotecnologie che hanno scelto di
frequentare il Laboratorio di Neuroscienze per il tirocinio pre-laurea elaborando la Tesi.
Dottorandi di Ricerca hanno concluso il loro iter con la discussione delle relative Tesi.
I rapporti con diversi ricercatori del Centro "Dino Ferrari" sono stati molto attivi con l'
avanzamento di comuni progetti. In particolare, il progetto di studio relativo alla
caratterizzazione istochimica ed immunoistochimica di prelievi bioptici di nervo e di muscolo
di pazienti affetti da diversa patologia neuromuscolare (Prof. Maurizio Moggio) con analisi
biochimica o molecolare in casi selettivi (Prof. Giacomo Comi).
La ricerca di base si è articolata in diverse tematiche che hanno rappresentato la fisiologica
evoluzione di studi in parte avviati nel 2013, in armonia con le problematiche cliniche
istituzionali di cui il Centro "Dino Ferrari" si interessa.
In particolare, la Dott.ssa Antonia Ratti ha dato ulteriore impulso agli studi di ribonomica
aprendo nuovi scenari per la comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie
neurodegenerative (memoria-ippocampo-demenza e malattie del motoneurone) e ha definito
ulteriormente il ruolo patogenetico di angiogenina, TDP43, FUS/TLS, Optineurina nei
pazienti affetti da SLA sporadica. Particolare rilievo è stato dato allo studio di pazienti con
SLA e Demenza Fronto-Temporale: dal Settembre 2011 è stato formulato un importante
100
impiego di ricerca per la definizione delle espansioni del gene C9orf72 nella popolazione dei
pazienti affetti da SLA, Demenza Fronto-Temporale e svariata patologia extrapiramidale.
La Dott.ssa Lidia Cova ha concluso la caratterizzazione di cellule staminali neurali endogene
in un modello di ratto iperteso che spontaneamente sviluppa ictus accanto alla iniziale
definizione dell’ uso di traccianti per monitorare le cellule dopo trapianto utilizzando RM 7
Tesla.
La Dott.ssa Jenny Sassone ha continuato la caratterizzazione di tessuti periferici di pazienti
affetti da Malattia di Huntington definendo ulteriormente la patologia mitocondriale e le basi
molecolari della neurotossicità glutammatergica in un modello cellulare di PARK-2.
Il Dott. Nicola Ticozzi ha completato una serie di lavori di estremo interesse quali lo sviluppo
ulteriore del progetto di Exome Sequencing supportato da Arisla EXOMEFALS che è esitato
nelal scoperta di TUBA4A e l’ avvio dello studio nei trios (ricerca di mutazioni de novo
acquisendo, oltre il DNA del probando, anche il DNA dei genitori quando vioventi).
Nel 2014 il Centro ha mantenuto la funzione direttiva nell’ ambito dell' European ALS
Consortium (EALSC), organizzazione Europea dedicata allo sviluppo delle problematiche
inerenti le malattie del motoneurone (il Prof. V. Silani ne è stato Chairman). Diversi Teaching
Course sono stati organizzati nell’ ambito della European Academy of Neurology (EAN): il
Prof. Silani è co-chairman del l’ EAN Subspeciality Scientific panel ALS and Frontotemporal
Dementia. .
Il Centro è inoltre rappresentato in diverse Commissioni della Regione Lombardia avendo
attivamente partecipato alla elaborazione di diverse linee guida relative alla SLA, Malattia
Neuromuscolari, Extrapiramidali e Demenza.
Il Prof. Vincenzo Silani è parte all’ editorial Board di European Neurology, ALS e American
Joural of Neurodegenerative Diseases.
La migliore espressione dell’attività svolta dalla Sede Distaccata del Centro “Dino Ferrari” sta
nell’ ulteriore consenso internazionale raggiunto nel 2014 anche per un rilevante numero di
ricercatori (no. 4) che stanno svolgendo o hanno completato periodi formativi in qualificati
Laboratori in Europa o nel Nord-America con cui il Centro “Dino Ferrari” ha scambi
collaborativi di elevato livello. In particolare, la Dr. Isabella Fogh ha la responsabilità presso
il King’s College di Londra dell’ ulteriore completamento dell’ analisi relativa al GWA delle
forme sporadiche di SLA, il Dott. Niccolò Mencacci si trova a Londra presso il Laboratorio
diretto dal Prof. John Hardy per un PhD in Neurogenetica.
La Dott.ssa Claudia Morelli ed il Dott. Nicola Ticozzi sono anche i primi due neurologi
Italiani divenuti Fellows dell’ European Board of Neurology dopo avere sostenuto il relativo
esame internazionale all’ ENS di Barcellona (2013).
PRINCIPALI ARGOMENTI DI RICERCA:
1. CARATTERIZZAZIONE DEI LIVELLI CIRCOLANTI DI ADIPONECTINA
PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIE NEURODEGENERATIVE
IN
Nel corso del 2014 sono stati analizzati mediante enzyme-linked immunosorbent assay kits
(ELISA) 150 sieri così distribuiti: 38 donatori metabolicamente sani, 8 soggetti obesi, 46
pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA), 6 pazienti affetti da Demenza Frontotemporale (FTD), 8 pazienti affetti da Malattia di Alzheimer (AD) e 46 pazienti con altre
patologie neuronali (OND). Tutti i soggetti erano abbinati per età e sesso.
E’ stato possibile confermare mediante questo studio alcuni dati di letteratura. I soggetti obesi
hanno infatti mostrato un ridotto livello di adiponectina sierica mentre livelli statisticamente
superiori a quelli dei controlli sono stati riscontrati nei pazienti affetti da AD. Nuovi risultati
sono inoltre emersi da questa ricerca. In particolare, i pazienti affetti da FTD presentavano
valori elevati di adiponectina sierica confermando la correlazione tra l’aumento di questa
adipochina e la demenza. Per quanto riguarda i pazienti affetti da SLA nella loro globalità, i
101
valori di adiponectina non risultavano diversi da quelli dei controlli sani o dei pazienti affetti
da OND e nessuna correlazione veniva evidenziata con il peso corporeo ed i livelli di
HDL/colesterolo. Suddividendo però i pazienti per sesso, emergeva un andamento opposto
dei valori sierici. I livelli di adiponectina dei pazienti maschi risultavano statisticamente
inferiori a quelli dei pazienti femmine e dei soggetti sani dello stesso sesso. Un andamento
opposto si osservava per le pazienti SLA che mostravano livelli statisticamente più elevati sia
rispetto alle donne controllo che agli uomini SLA. Questo dato, mai riportato in letteratura,
merita di essere ulteriormente indagato in particolare alla luce di nuovi dati di letteratura che
indicano una diversa sopravvivenza e progressione di malattia legata all’adiposità sub-cutanea
e correlata al sesso del paziente.
FATTORI GETICI ASSOCIATI ALL’ANGIOPATIA ILOID CEREBRALE
3. STUDIO DEI FATTORI GENETICI ASSOCIATI ALL’ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRALE
2. STUDIO DEI FATTORI GENETICI ASSOCIATI ALL’ANGIOPATIA AMILOIDE
CEREBRALE.
Sono stati collezionati complessivamente 20 casi di pazienti affetti da angiopatia amiloide
cerebrale (CAA) secondo i criteri di Boston oltre a 13 controlli. Sono stati sottoposti a
screening ematologico, MAP 24 ore, TAC e RMN encefalo con sequenze in GE, ad alcuni di
essi hanno completato anche la valutazione NP. Tutti sono stati prelevati per eseguire il
sequenziamento degli esoni dei geni potenzialmente coinvolti nella patogenesi della
malattia.
UDIO DFATTORI GENETICI ASSOCIATI ALL’ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRALE
3. CARATTERIZZAZIONE DELL’ESPRESSIONE DI RNA NEGLI ESOSOMI DERIVATI
DAL SANGUE PERIFERICO DEI PAZIENTI SLA
Nel presente progetto ci si proponeva di analizzare il profilo dell’RNA esosomiale nel siero di
pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) rispetto a controlli comparabili per età.
Nel corso dell’anno l’attiva collaborazione tra la clinica (Dip. Neurologia dell’Ospedale S.
Luca diretta dal Prof. Silani) e la Dr.ssa Cova del Laboratorio di Neuroscienze ha portato alla
raccolta standardizzata di:
1. n°31 campioni di siero da pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA)
sporadica o legata a mutazioni specifiche,
2. n°18 campioni comparabili da soggetti sani
3. n°52 campioni di pazienti affetti da altre patologie del sistema nervoso centrale
Tutti i prelievi di sangue effettuati vengono raccolti ed immediatamente processati per
produrre nel più breve tempo possibile (1 ora al massimo) campioni omogenei (1 ml di siero
per ogni paziente) direttamente congelati e mantenuti a -80°C fino al momento dell’utilizzo.
Per l’estrazione degli esosomi si è preferito ricorrere a un kit commerciale specifico per
garantire l’uniformità dei campioni ottenuti. Nel corso di quest’anno si è preceduto inoltre
alla validazione degli esosomi ottenuti (indispensabile per i successivi saggi di espressione di
mRNA e microRNA) tramite: a) analisi al citofluorimetro (FACS) accoppiate a microbiglie
per visualizzare gli esosomi le cui ridotte dimensioni impedisconono una visualizzazione
diretta); b) kit ELISA specifici per il marcatore cd63 (selettivamente espresso dagli esosomi);
c) analisi in microscopia elettronica (sia su siero che su surnatante ottenuto da fibroblasti in
coltura di pazienti SLA): d) estrazione di mRNa e anche di piccole molecole come i
microRNA per l’analisi in RealTime di trascritti comuni (housekeeping) e/o riconosciuti
come altamente espressi negli esosomi sierici; e) analisi in Risonanza Magnetica (NMR) dei
campioni di esosomi.
Le procedure di ottimizzazione delle metodiche complesse elencate ha richiesto tutto un
notevole sforzo personale, la collaborazione attiva di altri collaboratori del Laboratorio (in
102
particolare la Dr.ssa Patrizia Bossolasco), dalla clinica (in particolare del Dr. Alberto Doretti
e della Sig.ra Patrizia Nelli), con il Politecnico di Milano e di Zurigo (ETH) e ha reso
necessaria l’attivazione di una consulenza specifica con il Consorzio MIA dell’Università
Milano Bicocca diretto dal Dr Antonello Villa.
Complessivamente l’insieme dei dati raccolti ha confermato che gli esosomi prodotti da siero
di pazienti possiedono un elevato standard di purezza e concentrazione assolutamente
paragonabili a quelli presentati nelle pubblicazioni di letteratura e costituiscono quindi una
ottima base di partenza per le successive analisi. L’analisi in NMR ha anche evidenziato dati
interessanti e peculiarità specifiche dei campioni SLA da sviluppare ed approfondire.
4. DETERMINAZIONE LIQUORALE DEI LIVELLI LIQUORALI DI TDP-43 E FUS IN
PAZIENTI AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
Lo studio si inserisce nell’ambito della ricerca tesa a definire possibili marcatori biologici
liquorali della Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA).
L’ angiogenina è stata dosata a livello liquorale in 80 pazienti affetti da malattia del
motoneurone (inclusi due casi sporadici mutati nel gene TARDBP e un caso familiare
portatore di mutazione nel gene SOD1) e 81 soggetti di controllo. Non sono state evidenziate
differenze significative tra i pazienti SLA e i soggetti di controllo ma, dato interessante, nei
pazienti SLA le concentrazioni liquorali di angiogenina non correlavano con sesso ed età,
contrariamente a quanto osservato nei controlli. Infatti, in questo gruppo abbiamo rilevato
valori liquorali di angiogenina maggiori nei soggetti di sesso maschile rispetto a quelli di
sesso femminile ed una correlazione positiva con l’età. Tali risultati potrebbero indicare un’
alterata espressione di angiogenina nei pazienti SLA rispetto ai controlli. Non è stata trovata
alcuna differenza tra i pazienti con malattia ad esordio bulbare o spinale, né una correlazione
tra i valori di angiogenina liquorali e la durata di malattia. I pazienti affetti da SLA e
decadimento cognitivo tipo demenza fronto-temporale (SLA-FTD) presentavano invece valori
di angiogenina liquorale più elevati rispetto ai pazienti SLA senza decadimento cognitivo.
Interessante è anche il riscontro, nel gruppo di controllo, di valori liquorali di angiogenina
significativamente più elevati nei soggetti affetti da FTD rispetto ai controlli affetti da altre
malattie. Questi dati suggeriscono un possibile ruolo di angiogenina nella FTD.
Nel corso del 2012 si è proceduto all'analisi del gene ANG codificante per angiogenina nei
pazienti con SLA-FTD (7 soggetti) e nei pazienti affetti da FTD (5 soggetti). Nessuno di loro
è risultato mutato per ANG.
Questo lavoro fornisce dati interessanti nell’ambito della ricerca di biomarcatori liquorali
nella SLA e ha permesso di fare esperienza nell’utilizzo della metodica ELISA su liquor nel
Laboratorio di Neuroscienze, fungendo da “propedeutica” alla determinazione mediante
ELISA di TDP-43. Si è proceduto al dosaggio di TDP-43 ricombinante mediante colorazione
Comassie, al fine di determinare le concentrazioni standard della proteina da utilizzare per
l’ELISA. Tuttavia, riteniamo che i kit ELISA per la determinazione, rispettivamente, di TDP43 full-length e TDP-43 fosforilata, recentemente messi in commercio, rappresentino
un’alternativa che potrebbe facilitare dal punto di vista metodologico lo studio.
Non esistendo alcun dato in proposito in letteratura, auspichiamo di procedere anche alla
determinazione liquorale di FUS a livello liquorale, una volta conclusi i dosaggi di TDP-43.
5. CELLULE STAMINALI UMANE: USO DI FLUOROCROMI E/O NANOPARTICELLE
MAGNETICHE
Nel corso dell’ anno di ricerca 2014, si è proceduto nella marcatura genetica delle cellule
staminali derivate da liquido amniotico (hAFCs) provenienti da eccedenze diagnostiche
103
derivanti dalla Citogenetica di Istituto, previo consenso informato, in collaborazione con
l’Università degli Studi di Milano (Prof Lucignani-Dr.ssa Ottobrini, Dipartimento di
Fisiopatologia Medico-chirurgica e dei Trapianti). Le cellule son state infettate con un
costrutto retrovirale esprimente la Luciferasi come gene reporter. L’attività della Luciferasi e
la vitalità cellulare sono state monitorate immediatamente dopo trasfezione e nel corso dell’
espansione successiva (da giorno 3 al 21giorno di coltura). L’infezione è stata ottimizzata
utilizzando diversi tempi di incubazione (4 , 8 e 16 ore) e due reagenti carriers (Polybrene e
Polilisina). L’attività luciferasica è stata verificata per ogni tempistica e condizione
utilizzando un apposito test biochimico che ha evidenziato come solo l’utilizzo di Polisina
porti a una riduzione del segnale nel tempo. La vitalità cellulare al FACS non ha invece
mostrato differenze significative né tra cellule infettate e controllo né tra le diverse condizioni
e carriers. Analogamente, l’analisi al microscopio confocale post infezione ha evidenziato
come nel tempo il vettore resti integrato nelle cellule con un’alta efficienza di espressione ed
infezione ai diversi passaggi in coltura.
La strategia tramite inserzione del gene luciferasi permette di quantificare la concentrazione
della proteina reporter prodotta o della sua attività enzimatica in vitro ed in vivo. In
particolare, il lentivirus codificante il gene Luciferasi è stato utilizzato per la marcatura
genetica bioluminescente sfruttandone le proprietà di alta attività specifica e mancanza di
attività endogena (basso background). L’analisi è stata effettuata tramite un apposito
strumento (IVIS Spectrum/CT device) nelle cellule in vivo (utilizzando diverse concentrazioni
cellulari) dimostrando una diretta correlazione tra la quantità di cellule marcate e l’intensità
del flusso fotonico. Inoltre è stata testata l’attività luciferasica direttamente nell’animale (topo
nudo) in diversi distretti tissutali (iniezione sottocutanea, intramuscolare e intracerebrale)
tramite imaging bioluminescente (BLI) sia in 2D che in 3D. Le analisi delle immagine
ottenute in 2D ha permesso di evidenziare come l’intensità del segnale bioluminescente fosse
ridotta per i siti di iniezione più profondi (intramuscolo e intracranico). L’acquisizione del
segnale ripetuta nel tempo tramite BLI combinata alla Tomografia computerizzata ha
permesso inoltre di dimostrare la corretta localizzazione del segnale bioluminescente in
relazione alle coordinate sterotassiche di iniezione con una persistenza del segnale nel tempo.
L’insieme dei dati prodotti verrà utilizzato per l’ottimizzazione del modello sperimentale
animale murino con lesione da neurotossina 6 idrossidopamina (6-OHDA) e imaging delle
staminali impiantate.
Il presente progetto ha permesso di raggiungere quindi molteplici risultati grazie alla
cooperazione dei vari gruppi partecipanti, sia intra- che inter- Istituto.
I risultati ottenuti sono stati utilizzati per la preparazione di n° 1 presentazioni poster al:
CONGRESSO CONGIUNTO AINPeNC – AIRIC e Corso di Aggiornamento
NEUROPATOLOGIA E NEUROIMAGING organizzato dall’ Istituto Auxologico
Italiano a Verbania il 5-7 Giugno 2014
6. COMPRENSIONE IL CONTINUUM BIOLOGICO TRA SLA E FTD: VERSO UN PIÙ
EFFICACE MODELLO ASSISTENZIALE PER I PAZIENTI
Nel corso dell’anno 2014 sono proseguiti gli studi genetici sui pazienti affetti da SLA
familiare e sporadica reclutati presso l’Istituto Auxologico Italiano. In particolare, è stato
effettuato uno studio caso-controllo, exome-wide di varianti rare, che ha permesso di
identificare nuove mutazioni patogenetiche associate alla SLA nel gene TUBA4A, codificante
la subunità 4A della tubulina alfa e coinvolto nell’integrità del citoscheletro neuronale
104
7. SICUREZZA ED EFFICACIA DELL’INIBIZIONE DI SOD1 DA PIRIMETAMINA NELLA
SLA FAMILIARE
Tra il gennaio 2013 ed il gennaio 2014 sono stati arruolati sette pazienti. Di questi, due
hanno completato lo studio, uno ha ritirato il proprio consenso per motivi personali dopo
avere eseguito le prime due visite (in ottava settimana), uno ha interrotto lo sperimentazione
per aggravamento clinico con impossibilità a raggiungere l'Istituto per le valutazioni, tre
proseguono regolarmente lo studio. Nessun paziente al momento ha riportato reazioni
avverse gravi derivanti dalla terapia sperimentale. Una paziente ha presentato una reazione
avversa di lieve entità, che non ha comportato una modificazione dell'iter sperimentale,
mentre un'altra paziente ha riportato una reazione avversa di moderata entità, attesa, con
necessità di ridurre la posologia della pirimetamina somministrata.
Sono state regolarmente effettuate le valutazioni cliniche, strumentali e laboratoristiche,
come previsto dal protocollo. Si è in particolare provveduto al prelievo ed alla conservazione
del materiale biologico (plasma, linfociti, globuli rossi e liquor), come da protocollo.
8. ANALISI DI GLUK2 QUALE NUOVO TARGET TERAPEUTICO
PER
I
PARKINSONISMI GIOVANILI AUTOSOMICI RECESSIVI (ARJP) NEI NEURONI
PRIMARI, NEI MODELLI ANIMALI DI PARK2 E NELLE CELLULE IPS DA PAZIENTI
PARK2
Nel corso dell’anno 2014 abbiamo valutato, come da programma, i livelli delle subunità dei
recettori Glutammato nei topi parkin-Q311X. Abbiamo osservato come l’unica ad aumentare
significativamente sia la subunità Gluk2 dei recettori Kainato. Nessuna variazione nei
recettori NMDA, una diminuzione in AMPAR1, probabilmente dovuto ad un meccanismo
compensatorio.
Abbiamo valutato le correnti KAR nel modello animale, utilizzando slices di
VentralTegumentalArea (VTA), area ricca in neuroni dopaminergici. La visualizzazione dei
neuroni di interesse è stata possibile grazie all’incrocio del nostro modello parkin-Q311X con
il topo TH-GFP, che permette con l’espressione del fluoroforo GFP di marcare le cellule TH
positive (dopaminergiche), visibili al semplice miscroscopio. L’analisi delle correnti è stata
possibile grazie al trattamento delle fettine con Kainato (agonista) e NS102 (antagonista
selettivo dei recettori KAR), in modo da riuscire a visualizzare la componente kainato, come
corrente NS102 sensibile. Da questi esperimenti è stato possibile osservare come la
componente Kainato nel modello PARK2 sia superiore rispetto al controllo.
Questo ci dimostra come una perdita di funzione di parkin induca non solo un accumulo del
recettore Gluk2, ma anche che tale accumulo corrisponde con un incremento delle correnti
KAR mediate.
Per la valutazione dell’effetto eccitotossico in modelli PARK2 mutati, abbiamo valutato due
noti marker di eccitotossicità (Calcineurina A e spectrin) in lisati di Substantia Nigra del
modello animale parkin-Q311X, osservando un aumento di entrambi i livelli.
9. VALIDAZIONE ITALIANA DI UNO STRUMENTO DI SCREENING COGNITIVO
(EDINBURGH COGNITIVE AND BEHAVIOURAL ALS SCREEN – ECAS) IN PAZIENTI
AFFETTI DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
Il presente studio è stato volto a validare, su una popolazione italiana, lo strumento di
screening cognitivo ECAS, al fine di disporre di una misura sensibile alle alterazioni
cognitive presenti nella SLA e somministrabile anche in presenza di limitazioni nelle capacità
verbo-motorie. Come ulteriori sotto-obiettivi, in questo ambito, risultano:
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- L’indagine delle componenti di validità concorrente e di costrutto dell’ECAS, condotta
mediante l’inclusione, nel protocollo di assessment, di prove testali standardizzate e
tradizionalmente impiegate nell’indagine del funzionamento cognitivo globale e
dell’efficienza frontale sia nella SLA, che in altre patologie.
- La messa a punto e somministrazione di un questionario di valutazione dell’usabilità
percepita dai partecipanti rispetto allo strumento ECAS, utile ai fini di eventuali future
revisioni dello stesso.
- L’integrazione dello screening cognitivo e comportamentale con ulteriori dati concernenti
il profilo clinico-neuropsicologico (anosognosia e anosodiaforia), mediante l’inclusione di
domande concernenti il livello di consapevolezza, da parte dei pazienti, delle eventuali
alterazioni cognitive e comportamentali presenti.
Ulteriore obiettivo è rappresentato dall’indagine della correlazione presente tra gli indici
cognitivi rilevati mediante le prove testali ed i dati di genetica e di laboratorio, che consentirà
di identificare peculiari pattern genotipo-fenotipo, utili al fine di meglio caratterizzare i profili
clinici presenti nella patologia e, pertanto, fornire ulteriori evidenze di natura diagnostica e
prognostica. A conclusione dello studio, la rilevazione delle prestazioni ottenute alle prove
neuropsicologiche, in particolar modo concernenti le abilità fronto-esecutive, rende possibile
ricavare indici relativi all’integrità cognitiva dei pazienti e quindi di valutare la capacità di
assumere decisioni relative a questioni finanziarie, ai trattamenti invasivi proposti nel corso
della malattia e alle decisioni di fine vita nei pazienti affetti da SLA negli stadi più avanzati di
malattia.
10. IMPORTANZA DELL’ECTASIA ARTERIOSA
NELL’EZIOPATOGENESI DELLO STROKE
DEL
CIRCOLO
POSTERIORE
Sono stati arruolati nello studio 160 pazienti della Stroke Unit, così classificati:
 27 pazienti con stroke vertebro-basilare
 133 pazienti con stroke in altro territorio vascolare
L’eziologia degli eventi ischemici è stata stabilita utilizzando la scala TOAST.
Tutti i pazienti sono stati sottoposti a TC encefalo e/o RMN encefalo; 20 pazienti sono stati
sottoposti ad AngioTC del circolo intracranico.
Sono state ottenute misure del diametro vertebrale per tutti i 160 pazienti, su immagini
bidimensionali degli esami EDTSA eseguiti con Ecografo GE Vivid 7 ed
EsaoteMyLabClassC.
L’analisi dei dati ha dimostrato che l’ipoplasia vertebrale sinistra valutata con EDTSA è
correlata in modo statisticamente significativo con lo stroke del circolo posteriore. L’analisi
successiva confronterà i dati attuali con quelli provenienti dalle immagini neuroradiologiche e
si concentrerà sulla correlazione eventuale fra anatomia sfavorevole e sindrome metabolica.
11. IL METABOLISMO MITOCONDRIALE NEI FIBROBLASTI DI PAZIENTI AFFETTI
DA SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA
Il presente progetto si propone di studiare l’attività mitocondriale in modelli cellulari di
malattia ottenuti direttamente da paziente con mutazioni in geni coinvolti nella regolazione
degli RNA. Nello specifico verranno studiati colture primarie di fibroblasti di pazienti
portatori di mutazioni nei geni TARDBP, FUS e C9ORF72. In tali modelli cellulari di malattia
in cui l’espressione dei mutanti TDP-43, FUS e C9ORF72 è a livelli fisiologici e non indotta,
valuteremo e confermeremo se e come il metabolismo energetico e l’attività mitocondriale
sono alterati e se tali alterazioni sono specifiche per TDP-43 o comuni anche agli altri geni e
ai casi sporadici senza mutazioni. Obiettivo secondario sarà quello di capire il meccanismo
molecolare attraverso cui si esplica tale effetto, ovvero se una disregolazione a vari livelli del
106
metabolismo degli RNA mediata dai diversi mutanti può influenzare indirettamente anche la
funzionalità mitocondriale oppure se le proteine mutanti direttamente agiscono e si
localizzano nel mitocondrio, come recentemente suggerito in letteratura da dati sperimentali
preliminari.
Nel corso del primo anno di progetto abbiamo studiato e caratterizzato l’attività mitocondriale
in fibroblasti derivanti da pazienti SLA con mutazioni nei geni TARDBP (n=4) e C9ORF72
(n=4) rispetto a fibroblasti di individui sani di controllo (banca Telethon, n=4). In particolare
abbiamo determinato il potenziale di membrana mitocondriale, i livelli di ATP e la massa.
Tutti gli esperimenti sono stai eseguiti mantenendo per 48h le cellule in carenza di glucosio e
in presenza di galattosio per favorire un metabolismo ossidativo rispetto alla glicolisi e
cercare di mimare così un metabolismo simile a quello post-mitotico neuronale. I nostri
risultati indicano alterazioni nell’attività mitocondriale in entrambi i gruppi di fibroblasti SLA
in modo mutazione-dipendente. Nei fibroblasti TARDBP, infatti, si osserva una riduzione del
potenziale di membrana mitocondriale, mentre nei fibroblasti C9ORF72 si osserva una
iperpolarizzazione accompagnata da aumentati livelli di ATP. Il dosaggio delle attività dei
singoli complessi della catena respiratoria non indica, però, difetti di attività enzimatica in
entrambi i casi.
Abbiamo studiato la morfologia mitocondriale, quale potenziale indice di funzionalità
mitocondriale, mediante transfezione e visualizzazione dei mitocondri con il plasmide
dsMitoRed e analisi dei parametri di “form factor” (FF) e “aspect ratio” (AR) con software di
analisi ImageJ e di “plug-in” specifici. La morfologia mitocondriale appare alterata in modo
significativo nei fibroblasti TARDB-mutati con una evidente frammentazione del network
mitocondriale rispetto ai fibrobalsti di controllo. L’analisi dei fattori proteici coinvolti nei
processi di fusione (MFN1) e fissione (FIS1) mediante WB conferma che la dinamica
mitocondriale è alterata nei fibroblasti SLA con mutazioni nel gene TARDBP.
12. SCREENING MUTAZIONALE DEI GENI TARDBP E FUS IN PAZIENTI AFFETTI DA
MALATTIA DI PARKINSON E PARKINSONISMI
Il presente progetto ha come obiettivo lo screening mutazionale dei geni TARDBP e FUS in
una coorte di pazienti affetti da Malattia di Parkinson (PD) e da Parkinsonismi primari, tra cui
degenerazione cortico-basale (CBD) e paralisi sopranucleare progressiva (PSP).
Diverse evidenze cliniche suggeriscono che mutazioni di tali geni, già associati alle forme
familiari e sporadiche di Sclerosi Laterale Amiotrofica, possono essere implicati anche nel PD
e in disturbi del movimento correlati.
In questo primo anno abbiamo analizzato il gene TARDBP una coorte costituita da 782
pazienti PD (212 casi familiari e 570 casi sporadici) e da 157 Parkinsonismi primari (CBD e
PSP). L’analisi molecolare è stata condotta sull’esone 6 del gene TARDBP, mediante
sequenziamento diretto di Sanger sui campioni di DNA estratti da sangue periferico. Sebbene
il gene TARDBP sia formato da 5 esoni codificanti, nel nostro studio abbiamo deciso di
analizzare l’esone 6 codificante per il 60% della proteina TDP-43, perché in base ai dati
epidemiologici rappresenta un “hot spot” mutazionale con oltre 50 varianti missenso finora
identificate nella SLA. La nostra indagine ha permesso di rilevare quattro mutazioni
missenso (p.Gly294Val; p.Gly295Ser; p.Asn267Ser, p.Ser393Leu) in sei pazienti. Quattro di
questi individui sono affetti da PD, mentre gli altri due pazienti sono, rispettivamente, un caso
di degenerazione cortico-basale e un caso di paralisi sopranucleare progressiva.
Le quattro varianti da noi identificate sono state in precedenza riportate come mutazioni
patogenetiche in pazienti SLA (http://alsod.iop.kcl.ac.uk/) e risultano assenti in oltre controlli
di dataset pubblici (6503 individui di NHLBI Exome Sequencing Project, 1092 individui di
1000 Genome Project). In particolare, la variante TARDBP p.Asn267Ser sembra essere
associata ad un fenotipo clinico variabile, essendo stata da noi identificata sia in due pazienti
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con Parkinsonismo sia in un paziente con PD tipico. Studi in silico e funzionali condotti
suggeriscono che tale variante possa determinare la formazione di nuovo sito di fosforilazione
con possibili effetti sui livelli proteici di TDP-43 (Borroni et al, Hum Mutat. 2009). Anche la
variante p.Gly295Ser, che determina la sostituzione di un amminoacido del dominio Cterminale con una serina, potrebbe aumentare lo stato di fosforilazione della proteina.
Nel nostro studio non abbiamo invece identificato la mutazione p.Ala382Thr, che per un
effetto fondatore era stata precedentemente identificata in oltre il 30% dei casi SLA e in una
significativa porzione (~2.5%) di pazienti PD sporadici nella popolazione sarda (Quadri et al,
Neurogenetics 2011). I risultati preliminari del nostro studio sembrano suggerire un ruolo
patogenetico delle mutazioni di TARDBP anche in altri disordini neurodegenerativi diversi da
SLA/FTD.
14. IDENTIFICATION OF DE NOVO MUTATIONS IN AMYOTROPHIC LATERAL
SCLEROSIS USING A TRIOBASED EXOME SEQUENCING APPROACH
Nel corso dell’anno 2014 sono state validate le mutazioni de novo evidenziate mediante
exome sequencing nei trio selezionati (costituiti da un individuo affetto da SLA e dai suoi
genitori non affetti). Gli esoni contenenti le mutazioni de novo sono stati amplificati mediante
PCR utilizzando primer customizzati e successivamente sequenziati mediante Sanger
sequencing. La frequenza mutazionale dei geni candidati è stata successivamente valutata in
due coorti costituite da 600 pazienti con SLA familiare e 200 pazienti con SLA sporadica.
15. IDENTIFICATION OF RISK VARIATS ASSOCIATED WITH SUSCEPTIBILITYTO
SPORADIC
AMYOTROPHIC
LATERAL
SCEROSIS
USING
AN
EXOME
SEQUENCINGAPPROACH
La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa a prognosi infausta
causata dalla perdita selettiva dei motoneuroni. Circa il 10% dei casi di SLA sono familiari
(FALS) e gli studi genetici hanno permesso l’individuazione delle mutazioni causative nella
maggior parte di essi. Al contrario, l'eziologia della SLA sporadica (SALS) è in gran parte
sconosciuta, benché si ritenga che fattori genetici giochino un ruolo importante nel
determinare la suscettibilità alla malattia. L'identificazione di tali fattori di rischio darebbe un
enorme contributo alla comprensione attuale della patogenesi della SLA. In questo progetto ci
proponiamo quindi di compiere uno studio caso-controllo di sequenziamento dell’esoma
(exome sequencing) al fine di identificare varianti rare associate alla suscettibilità per SALS,
di validarle in una coorte indipendente di pazienti e di stabilirne il ruolo funzionale nella
patogenesi della malattia. Il nostro studio è stato progettato per sfruttare al meglio il
campionamento selettivo di pazienti SLA con esordio precoce, suggestivo per una forte
componente genetica, e per adottare metodi complementari per l'analisi statistica, al fine di
massimizzare le possibilità di successo.
Obiettivi: Il progetto IrisALS è articolato su tre obiettivi principali:
a) Selezione dalla nostra banca biologica di 500 campioni di DNA da pazienti SALS ad
esordio precoce (< 40 anni ), omogenei dal punto di vista fenotipico e ben caratterizzati dal
punto di vista clinico; exome sequencing dei campioni selezionati al fine di individuare
polimorfismi (SNP) rari potenzialmente associati alla malattia.
b) Conduzione di un’analisi bioinformatica caso-controllo utilizzando diversi modelli
statistici, al fine di ordinare gli SNP identificati sulla base della loro probabilità di contribuire
alla patogenesi di SALS. Gli esomi di controllo saranno ottenuti dai database 1000Genomes
project, NHLBI Exome Sequencing Project e da campioni già sequenziati nel nostro
laboratorio.
c) Validazione dei top ranking SNP tramite:
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1) analisi in silico di 500 esomi FALS già sequenziati da noi e dai nostri collaboratori per
valutare il loro possibile contributo alla patogenesi delle forme familiari di SLA;
2) confronto con i dati GWAS già generati dal nostro laboratorio, al fine di identificare SNP
comuni;
3) genotipizzazione high-throughput dei 6000 top ranking SNP in una coorte aggiuntiva di
2.000 SALS e 2.000 controlli;
4) sequenziamento diretto dei geni contenenti i 20 top ranking SNP per identificare ulteriori
varianti;
5) determinazione del ruolo patogenetico dei top ranking SNP.
CENTRO SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA (SLA)
Nell'anno 2014, circa 350 pazienti affetti da patologia motoneuronale (prevalentemente SLA)
sono stati esaminati nel Centro SLA. Alla valutazione clinica sono state accostate diverse
indagini ed iniziative terapeutiche:
 ricerca di mutazioni per i geni SOD1, angiogenina, SETX, VAPB, TDP43, FUS/TLS,
OPT, VCP, C9orf72, Profilina1, Malattia di Kennedy, SMN in parte presso il
Laboratorio di Neuroscienze ed in parte in collaborazione con l'Istituto C. Besta di
Milano (Dott.ssa Cinzia Gellera). Tali indagini hanno permesso di identificare
mutazioni in pazienti apparentemente affetti da SLA sporadica (TARDP per TDP-43,
FUS/TLS, C9orf72 in particolare). Oggi il Centro offre la diagnostica molecolare delle
principali patologie motoneuronali;
 sviluppo di nuovi parametri neurofisiologici per definizione del numero residuo di
Unità Motorie (MUNE) ed analisi neurofisiologica della funzionalità diaframmatici
per porre indicazione alla NIV;
 analisi delle caratteristiche nutrizionali con studio della PEG, BMI, etc, in
collaborazione con l'Unità di Endocrinologia dell'IRCCS Istituto Auxologico Italiano;
 valutazione neuropsicologica longitudinale del paziente affetto da SLA mediante
valutazione seriata per evidenziare specifici deficit neuropsicologici; particolare
attenzione al coinvolgimento fronto-temporale anche con tecniche di eye-tracking e
sviluppo di BCI (studio ECAS);
 partecipazione a nuovi trial terapeutici (Pirimetamina nella SLA Familiare SOD1
mutata).
Il Centro "Dino Ferrari" ha partecipato a diverse iniziative nazionali ed internazionali per
l'ottimizzazione delle cure palliative, la definizione dei costi della malattia, l' educazione dei
medici e paramedici in stretto rapporto con l'AISLA (Associazione Italiana Sclerosi Laterale
Amiotrofica), la definizione dei criteri di invalidità in collaborazione con la Regione
Lombardia. Il Centro "Dino Ferrari" è implicato nel Gruppo di Studio Malattie del
Motoneurone della Società Italiana di Neurologia - SIN) e nell’ European ALS Consortium. Il
Prof. Silani è divenuto membro del Website Management Committee della World Federation
of Neurology in rapporto alla ALS/MND.
Nell' ambito dell’ ALS European Consortium il Prof. Silani ha tenuto vari Teaching Courses
nell’ ambito dell’ ENS ed EFNS . Nell' ambito della nascente EAN il Prof. V. Silani è stato
nominato referente per il gruppo Malattie del Motoneurone e Demenza Frontotemporale con il
Prof. Albert Ludolph.
109
CENTRO DISTURBI COGNITIVI
Nel corso del 2014 è stato progressivamente creato un centro di riferimento con particolare
attenzione alle principali patologie associate a decadimento mentale e disturbi cognitivi.
Particolare attenzione è stata dedicata alle Demenza Frontotemporale (FTD) curando, in
particolare, le interazioni specifiche con la SLA. L’ Interazione con l’ Associazione Italiana
FTD è stata particolarmente fruttuosa.
CENTRO MALATTIE EXTRAPIRAMIDALI
Nel corso dell'anno 2014, oltre 300 nuovi pazienti circa affetti da diversi disordini
extrapiramidali del movimento (Morbo di Parkinson, Paralisi Sopranucleare Progressiva,
Atrofia Multisistemica e Degenerazione Cortico-Basale, Corea di Huntington, ect.) sono stati
esaminati e trattati presso il “Centro Disturbi del Movimento” che ha eseguito circa 900 visite
ambulatoriali. È stata creata una stretta collaborazione con l'Associazione Parkinson Milano di
cui il Prof. Silani fa parte del Comitato Scientifico creando un interscambio scientifico e di
pazienti. È stata creata una èquipe multispecialistica per la presa in carico del paziente. Il
Centro è riconosciuto nell'ambito del NECTAR (Network for European CNS Transplantation
and Regeneration) dedicato alle malattie extrapiramidali. Maggior impeto è stato dato inoltre
alla creazione di un Centro dedicato alla Malattia di Huntington con creazione di una equipe
plurispecialistica formata da neurologi, psichiatri, neuropsicologi e fisiatri nell'intento di
fornire un approccio interdisciplinare al paziente, garantendo così un supporto ed un
riferimento costante nel tempo che è stato esteso anche ai familiari. Nell'ambito della Malattia
di Huntington l'assenza di una cura risolutiva della malattia comporta un particolare impatto
emotivo nel soggetto che ancora asintomatico decide di testarsi per la mutazione. Ciò impone
un continuo supporto psicologico al paziente durante tutto il lungo processo che porta alla
diagnosi pre-clinica. Per questo è stato sviluppato ed applicato un protocollo di test predittivo
nella Malattia di Huntington secondo le linee guida dell'International Huntington Association
e della Federazione Mondiale di Neurologia. Sono state seguite dodici famiglie affette da
Malattia di Huntington e seguiti sei pazienti nell'iter del test predittivo. Dal 2005 il Centro è in
grado di formulare diagnosi molecolare di Malattia di Huntington. Alla valutazione clinica
sono state accostate diverse indagini ed iniziative terapeutiche quali lo studio del sonno nei
pazienti affetti da M. di Huntington in collaborazione con il Centro del Sonno (Dott.ssa
Carolina Lombardi). Particolare attenzione è oggi dedicata alla cura della disfagia, principale
causa di morte dei pazienti accanto alle complicanze polmonari. Il Dott. Andrea Ciammola ha
dato particolare impulso a questa iniziativa unitamente alla équipe multidisciplinare.
CENTRO DISTURBI COGNITIVI
Nell'anno 2014 vi è stato un ulteriore incremento di pazienti rivoltisi al nostro centro per una
valutazione diagnostica di tipo neuropsicologico; infatti sono state effettuate oltre 6.000
prestazioni neuropsicologiche e psicodiagnostiche per pazienti degenti in regime di ricovero
ordinario o in Day Hospital, nonché 900 colloqui psicologici clinici in pazienti affetti da
molteplici forme di coinvolgimento cognitivo a partire dal Mild Cognitive Impairment (MCI),
Malattia di Alzheimer, Demenza Fronto-Temporale, Demenza a Corpi di Lewy, Parkinson’s
Demenza, Demenza di Huntington, Paralisi Sopranucleare Progressiva, Degenerazione
Cortico-Basale ecc. Al già presente ambulatorio neuropsicologico convenzionato S.S.N. è
stato aggiunto un nuovo ambulatorio di Valutazione Multidimensionale dei Disturbi Cognitivi
(VMD) condotto congiuntamente da neurologo/neuropsicologo nell’ottica di fornire al
paziente affetto da patologia cognitiva un’approccio multidisciplinare che tenga conto delle
molteplici problematiche che spesso ne caratterizzano il decorso clinico. Particolare
110
attenzione è stata posta alla valutazione neuropsicologica longitudinale dei pazienti affetti da
patologia motoneuronale (SLA, PLS) esaminati nel Centro SLA. Sono stati effettuati, in
collaborazione con altri presidi ospedalieri quali l’Ospedale S. Anna di Como ed il Centro
UVA di Bussolengo a Verona, studi sugli aspetti cognitivi, psico-emotivi e di personalità
nella Sclerosi Multipla, nella SLA, nelle cefalee e nella Malattia di Parkinson. Si sono inoltre
organizzati diversi eventi formativi ECM in merito all’inquadramento dei disturbi cognitivi,
agli aspetti di diagnosi differenziale e gestione dei disturbi psico-emotivi delle malattie
neurodegenerative. Particolare attenzione ha richiesto la messa a punto, con il Centro dedicato
alla Malattia di Huntington, di un protocollo di test predittivo per la malattia che ha visto nel
supporto psicologico fornito ai pazienti, ai loro familiari ed ai soggetti asintomatici che si
sottopongono al test, un ruolo fondamentale. Sempre più spazio è stato dato al caregiver
nell’ascolto delle problematiche di gestione quotidiana della patologia cognitiva dei loro
congiunti allo scopo di migliorare la qualità diagnostica, clinica ed assistenziale fornita a
questa tipologia di pazienti.
La consulenza del Centro Disturbi Cognitivi è stata offerta anche al CIERRECI, nuova
struttura dell’ IRCCS Istituto Auxologico Italiano per lo studio dell’ invecchiamento.
È in fase di considerazione l’ apertura di un Centro Disturbi Cognitivi con l’approvazione
della Regione Lombardia.
CENTRO DI MEDICINA DEL SONNO
È continuata nel corso del 2014 l’attività del Centro di Medicina del Sonno presso l’ IRCCS
Istituto Auxologico Italiano, Ospedale San Luca, diretto dal Prof. G.F. Parati e dal Prof. V.
Silani e coordinato dalla dott.ssa Lombardi.
Nello 2014 sono state eseguite circa oltre 700 visite ambulatoriali e polisonnografie portatili,
150 video polisonnografie in laboratorio di medicina del sonno, 50 monitoraggi
polisonnografici prolungati (24 ore) e 10 actigrafie.
Le patologie osservate nel centro, vista anche l’ispirazione volutamente multidisciplinare,
riguardano ad ampio spettro le malattie cardiovascolari associate a disturbi respiratori durante
il sonno (ipertensione arteriosa, scompenso cardiaco, stroke) e tutte le patologie neurologiche
coinvolgenti il sonno, comprendendo quindi i disturbi del respiro in corso di sonno (Sindrome
delle Apnee Ostruttive nel Sonno – OSAS -, Sindrome delle Apnee Centrali, Ipoventilazione
Centrale, alterazioni del pattern ventilatorio nelle patologie neuromuscolari), le ipersonnie
(narcolessia, ipersonnie secondarie a malattie neurodegenerative), le parasonnie REM e
NREM (disturbo comportamentale della fase REM, sonnambulismo, bruxismo ecc), le
epilessie ad estrinsecazione prevalentemente notturna (Nocturnal Frontal Lobe Epilepsy) i
disturbi del movimento in corso di sonno (Sindrome delle Gambe senza Risposo) e tutte le
forme di insonnia.
Oltre alle attività assistenziali, il Centro cura un’ampia sfera di ricerca.
STROKE UNIT
Nel 2014 l’ attività della Stroke Unit a direzione neurologica si è ulteriormente consolidata
con ottimizzazione della moderna struttura che offre 6 letti di cui 4 completamente
monitorizzati con possibilità di inquadramento del paziente affetto da evento cerebrovascolare
acuto. L’ attività direttiva della Dott.ssa Laura Adobbati, coordinatrice, è stata particolarmente
efficace, avendo portato gli standards dell’ attività della Stroke Unit a livello competitivo sia
dal punto di vista medico che organizzativo. Il paziente che accede al Pronto Soccorso in
tempo utile viene rapidamente inquadrato e può essere sottoposto nei casi indicati a trombolisi
intravenosa, intrarteriosa o posizionamento di stent in rapida sequenza anche per la attiva
collaborazione con la U.O. di Neuroradiologia e Neurochirurgia dell’ IRCCS Ca’ Granda
Ospedale Maggiore di Milano. L’ angiografia diagnostica classica viene eseguita nella sala
angiografica dell’ Istituto Auxologico Italiano come il posizionamento di stents extracranici
111
ed una serie di procedure è stata conclusa con successo: 15 trombolisi intravenose sono state
eseguite nel 2014 con successo e senza complicanze. Un numero rilevante di trombolisi
intrarteriose sono state completate con successo e senza rilevanti effetti collaterali.
La stretta collaborazione con la UO di Cardiologia diretta dal prof. Gianfranco Parati
garantisce un attento monitoraggio cardiologico con una ottimizzazione del monitoraggio
clinico per la migliore impostazione terapeutica e lo studio del sonno è stato completato con la
collaborazione del Centro del Sonno (dott.ssa Carolina Lombardi) e della consulenza
pneumologica (Dott. Paolo Banfi ed èquipe).
Una stretta collaborazione è in corso con l’ U.O.di Neurochirurgia della Fondazione Ospedale
Maggiore di Milano (Consulente Dott. Mario Locatelli) e con la U.O. di Neuroradiologia del
medesimo Istituto anche per lo sviluppo della RM 3 Tesla acquisita dell’ Istituzione.
Il percorso del paziente post-ictus è assicurato da due U.O. di Riabilitazione nella Istituzione.
Oltre all’ allestimento del database, diversi studi sono stati impostati tra i quali quello del
sonno e delle apnee ostruttive in stretta relazione con l’ evento ischemico e la ricerca genetica
nelle forme familiari. In stretta collaborazione con le altre Stroke Unit di Milano e con la
Regione Lombardia, la Stroke Unit collabora a diversi studi programmatici regionali offrendo
la propria disponibilità e competenza. Particolare attenzione è rivolta alla patologia
cerebrovascolare rare per mitocondriopatie, per esempio,che vengono attivamente studiate
con esecuzione di biopsie muscolari e ricerca di mutazioni in collaborazione con il Centro
“Dino Ferrari” dell’ IRCCS Ospedale Maggiore di Milano.
Le potenzialità diagnostiche e d’intervento della Stroke Unit in acuto sono ad ora ottimizzate
dalla pronta disponibilità di una RM 1.5 Tesla ed, ora, di una RM 3 Tesla per cui è stata
programmata un’attività di ricerca volta ulteriormente ad ottimizzare la diagnosi precoce dell’
evento ischemico nella prospettiva della più adeguata terapia.
PRODUZIONE SCIENTIFICA 2014
Pubblicazioni su Riviste Internazionali Indicizzate
1.
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Morelli C., Salmona M, Tagliavini F.
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and sow unusual structural and functional features.
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I.F. 1.495
TOT. I.F.
139.395
Registri




Registro Nazionale delle Malattie Rare - Istituito dall’Istituto Superiore di Sanità.
Studio Epidemiologico sull’incidenza delle malattie rare: 40 nuovi casi
Registro Lombardo della Sclerosi Laterale Amiotrofica.
Studio epidemiologico su pazienti affetti da Sclerosi Laterale Amiotrofica: 32
Corsi ECM
115



La Malattia di Parkinson ed i parkinsonismi
Sala Convegni CIERRECI – Milano, 27/03/2014
Le Demenze Fronto-temporali (FTD)
Sala Convegni Ospedale San Luca – Milano, 25/09/2014
Ictus Ischemico
La malattia di Huntington
Charcotiadi : i giovedì dell’aggiornamento clinico
 Clinico
 Laboratorio di Neuroscienze
 Clinico/laboratorio
 Lezioni magistrali
I mercoledì dell’aggiornamento di laboratorio
 Discussione dei dati di laboratorio relativi ai differenti gruppi di ricerca
I mercoledì del gruppo di lavoro SLA/FTD
 Aggiornamenti sulle Linee Guida
 Novità cliniche e terapeutiche
 Sperimentazioni nazionali ed internazionali
ATTIVITÀ PROMOZIONE E DIDATTICA
Partecipazione Editorial Board Internazionali
 Amyotrophic Lateral Sclerosis and other Neuron Disorders
 European Neurology
 American Journal of Neurodegenerative Diseases
Stage all’estero di ricercatori:
 Dott.ssa Cinzia Calzarossa – Karolinska, Stoccolma, Svezia
 Dott.ssa Claudia Fallini – Massacchussets, Atlanta, USA
 Dott.ssa Isabella Fogh - King’s College – London, UK
 Dott. Niccolò Mencacci – UCL Institute of Neurology – London , UK
116
SEDE DISTACCATA DEL CENTRO “DINO FERRARI” PRESSO IL
LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE, CITOGENETICA,
ANALISI BIOCHIMICO-CLINICHE, BIOINFORMATICA- IRCCS E.
MEDEA
Responsabile Prof Nereo Bresolin
Personale strutturato:
Dott Maria Teresa Bassi- Biologo IRCCS E. Medea
Dott. Maria Clara Bonaglia- Biologo IRCCS E. Medea
Dott. Rachele Cagliani- Biologo IRCCS E. Medea
Dott Roberto Giorda - Biologo IRCCS E. Medea
Ing Uberto Pozzoli – Bioingegnere IRCCS E. Medea
Dott. ME Raggi- Biologo IRCCS E. Medea
Dott. Manuela Sironi - Biologo IRCCS E. Medea
Dott. Chiara Vantaggiato - Biologo IRCCS E. Medea
Dott. Alessia Arnoldi - Biologo IRCCS E. Medea
Dott. Silvana Beri - Biologo IRCCS E. Medea
Personale Borsista laureato:
Dott. Francesca Ciceri, Biologo Borsista IRCCS E. Medea
Dott. Marianna Castelli, Biologo Borsista IRCCS E. Medea
Dott. Andrea Citterio, Biotecnologo Borsista
Dott. Sara Bertuzzo, Biologo Borsista IRCCS E Medea
Dott Alessandra Mozzi, Biotecnologa IRCCS E.Medea
Dott Jacopo Vertemara, Biotecnologo IRCCS E.Medea
Ing. Erika Molteni, Ingengere Biomedico – IRCCS E.Medea
Dottorandi:
Dott. Diego Forni, Biotecnologo - Universita’ di Milano
Dott. Chiara Pontremoli, Biologa - Universita’ di Milano
Dott. Shikha Vashisht, Biotecnologa - SEMM
Personale tecnico strutturato
Cinzia Baschirotto - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea
Giulietta Gottardi - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea
Paola Pozzi - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea
Chiara Mapelli- tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea
Stefania Riva - tecnico di laboratorio IRCCS E. Medea
Giorgia Menozzi- Programmatrice IRCCS E. Medea
117
ATTIVITA’ SCIENTIFICA – ANNO 2014
L’attivita’ del laboratorio dell’IRCCS E. Medea - Ass.ne La Nostra Famiglia, sede distaccata
del Centro “Dino Ferrari”, nel corso del 2014 si e’ focalizzata su diverse linee di ricerca
distribuite nelle sezioni di biologia molecolare, citogenetica e bioinformatica. Nelle sezioni di
biologia molecolare e citogenetica sono attualmente in corso progetti incentrati sulla
caratterizzazione genetico-molecolare di forme di 1) ritardo mentale, autismo ed epilessia 2)
patologie e neurodegenerative dell’eta’ pediatrica o giovane-adulta. L’attivita’ della sezione
di bionformatica si sta concentrando da alcuni anni sull’applicazione di approcci innovativi
per analizzare i dati di variabilità genetica nell'uomo.
Nell’ambito della ricerca su patologie con ritardo mentale sindromico e autismo si e’
continuata l’attivita’ iniziata nell’anno precedente sulla caratterizzazione di casi di sindrome
di Phelan McDermid (PMS, MIM 606232) dovute a delezione di una porzione del
cromosoma 22 che contiene il gene SHANK3. Questo gene fa parte della famiglia dei geni
Shank; le proteine Shank sono caratterizzate dalla presenza di piu’ domini funzionali e sono
implicate nell’attivita’ sinaptica e nel processo di maturazione delle spine dendritiche
neuronali.
Tutti i pazienti con PMS mostrano ritardo dello sviluppo e del linguaggio; molti hanno
problemi motori, comportamenti di tipo autistico, e talvolta sintomi epilettici. E’ stata creata
un ‘associazione per la questa patologia l’Associazione Italiana per la Sindrome di PhelanMcDermid ONLUS (AISPHEM ONLUS). L’IRCCS E. Medea, attraverso una partecipazione
attiva di AISPHEM, ha avviato l’implementazione di una biobanca per la collezione di
campioni biologici di pazienti con PMS con l’obiettivo di promuovere la ricerca nel campo di
questa malattia. I pazienti che hanno ricevuto una diagnosi di Sindrome di Phelan-McDermid
sono per la maggior parte bambini. Recentemente sono stati identificati anche alcuni pazienti
adulti estremamente utili per lo studio dell’evoluzione clinica e della storia naturale della
sindrome. Sono poco chiare le cause dell’estrema variabilità dei sintomi clinici, solo
parzialmente imputabili alle diverse dimensioni della porzione di cromosoma 22 deleto nei
diversi pazienti. E’ in corso pertanto presso l’IRCCS E. Medea un progetto di ricerca clinicogenetico che prevede l’analisi di una coorte di 60 pazienti di età differenti, tra cui bambini,
adolescenti e adulti affetti da PMS. L’obiettivo è delineare con maggiore precisione le
correlazioni genotipo/fenotipo attraverso un approccio clinico inter-disciplinare e un followup sistematico. Cercheremo di conoscere anche il funzionamento del loro cervello mediante
studi elettroencefalografici (EEG) e di risonanza magnetica (MRI 3 Tesla). Allo stesso tempo,
verificheremo se i pazienti, al di là della comune delezione del cromosoma 22, abbiano altre
modifiche genetiche (mutazioni/polimorfismi) che possano spiegare la variabilità dei sintomi
nei diversi pazienti con PMS mediante tecniche di next-generation sequencing. I dati sono in
corso di analisi.
Una seconda linea di ricerca si occupa di malattie del motoneurone ad insorgenza precoce ed
in particolare di paraparesi spastiche ereditarie. Si e’ proseguita l’ attivita’ di genotipizzazione
della casistica dei pazienti a disposizione per i geni nuovi identificati nel 2013 con
l’identificazione di nuove mutazioni in SPG56, SPG46, SPG54
e SPG11.
Contemporaneamente abbiamo completato lo studio degli effetti di mutazioni in spastizina in
cellule (fibroblasti e linfoblasti) di pazienti con mutazioni missenso e troncanti nel gene,
precedentemente identificate nel laboratorio.
Nel 2014 abbiamo proseguito l’analisi della funzione di spastizina nell’autofagocitosi e la
caratterizzazione dei difetti di maturazione degli autofagosomi in presenza di mutazioni
missenso e troncanti di spastizina. Dopo aver dimostrato che spastizina interagisce con
Beclin1, abbiamo dimostrato anche che questa proteina ‘ un componente dei complessi
118
autofagici di Beclin1, ma è esclusa dal complesso Atg14-Beclin1. Beclin1 regola
l’autofagocitosi formando un complesso centrale con Vps15 e Vps34 e regolando l’attività
della chinasi Vps34 tramite l’interazione con una varietà di proteine, tra cui Atg14L, UVRAG
e Rubicon. Il complesso generato dall’interazione con Atg14 regola la sintesi del PI3P, la
formazione delle isolation membranes e la generazione degli autofagosomi. Il complesso
generato dall’interazione con Uvrag regola sia la formazione che la maturazione degli
autofagosomi (Liang et al., 2006, 2008). Infine il legame di Rubicon al complesso contenete
Uvrag regola negativamente la maturazione degli autofagosomi (Zhong et al., 2009).
Per identificare altre proteine che intervengono nella maturazione degli autofagosomi
abbiamo analizzato l’effetto delle mutazioni di spastizina sulle interazioni tra UVRAG e i
suoi effettori e sullo stato di attivazione di RAB7. A tal proposito non si e’ osservata nessun
effetto delle mutazioni di spastizina sullo stato di attivazione di RAB7. Abbiamo inoltre
proseguito nell’analisi del ruolo di spastizina nel traffico endosomiale studiando
l’internalizzazione e la degradazione del recettore EGFR. Tali studi sono in corso.
Nei neuroni primari abbiamo dimostrato che la spastizina colocalizza parzialmente con il
PI3P, gli endosomi precoci ed il reticolo endoplasmatico, confermando i dati dei
localizzazione della forma transfettata nelle cos7 e suggerendo che la proteina potrebbe
effettivamente avere un ruolo nella regolazione del traffico endosomale. Abbiamo poi testato
l’effetto del silenziamento della spastizina nelle prime fasi del differenziamento neuronale
utilizzando colture embrionali di ippocampo ottenute da embrioni al 18° giorno di vita
embrionale. Il silenziamento della spastizina ha determinato una diminuzione nella lunghezza
del neurite nei neuroni derivanti dalle P19, in modo analogo a quanto osservato
nell’ippocampo.
L’attivita’ della sezione di bioinformatica si sta concentrando da alcuni anni sull’applicazione
di approcci innovativi per analizzare i dati di variabilità genetica nell'uomo. Tali approcci
prevedono l'utilizzo di strumenti di genetica di popolazione per identificare geni o regioni
geniche che sono stati sottoposti a selezione naturale, partendo dal presupposto che le forze
selettive agiscono su un locus specifico appunto perché tale locus contiene una variante
polimorfica funzionale e che tali forze lasciano un “segno” che può essere utilizzato per
identificare le varianti selezionate. E' noto che, durante la storia evolutiva dell'uomo,
pathways specifici fondamentali per la sopravvivenza sono stati soggetti a pressione selettiva,
ed è per questo che abbiamo applicato le metodiche di genetica di popolazione a geni di
interesse biomedico quali, ad esempio, geni coinvolti nella regolazione della pressione
arteriosa, nel pathway della coagulazione e fibrinolisi, nella regolazione metabolica. Abbiamo
inoltre studiato i geni coinvolti nella risposta immune e nell'autoimmunità. Abbiamo inolte
messo a punto un approccio complementare che prevede l'analisi evolutiva a livello interspecifico (tra mammaiferi o tra primati) al fine di identificare siti o regioni di particolare
importanza dal punto di vista funzionale.
Ricerche svolte presso il nostro laboratorio hanno dimostrato che le malattie infettive hanno
agito come una potente forza selettiva sul genoma umano. Conseguentemente, il pattern di
variabilità genetica nell'uomo è determinato anche dalla esposizione agli agenti patogeni
subita dalle popolazioni umane in diverse aree geografiche. In particolare, tale
sovrapposizione è evidente per i geni che codificano per molecole regolatorie dell'attivazione
dei linfociti T (Forni et al., Immunity, 2013). Inoltre, abbiamo potuto identificare nuove
varianti di suscettibilità al morbo di Crohn applicando un approccio evolutivo (Cagliani et al.,
Mol Biol Evol, 2013). In particolare, abbiamo dimostrato che numerose varianti di rischio per
tale malattia sono aumentate in frequenza nelle popolazioni umane a causa di una pressione
selettiva esercitata da protozoi.
119
Similmente, è probabile che la variabilità genetica in loci coinvolti nello sviluppo delle facoltà
cognitive sia stata modellata da forze selettive. Ad esempio, abbiamo studiato il gene THBS4,
che codifica per una glicoproteina coinvolta in diversi processi tra cui imfiammazione e
sinaptogenesi. Il gene THBS4 è espresso a livelli molto più alti nel cervello umano rispetto ai
cervelli di scimpanze e macachi e la proteina si accumula nell placche di beta-amiloide.
Abbiamo identificato una regione del gene THBS4 che è stata sottoposta a selezione
bilanciante durante la storia evolutiva dell'uomo. Tale regione porta varianti che modulano
l'espressione cerebrale del gene e che hanno un effetto sulla modulazione del volume di
sostanza grigia (misurati tramite risonanza magnetica) in pazienti affetti da malattia di
Alzheimer (Cagliani et al., 2013).
Nel corso del 2012 il laboratorio di Bioinformatica ha iniziato a mettere a punto una serie di
strumenti per l'analisi dei dati prodotti da due sequenziatori NGS recentemente acquisiti.
Sfruttando le competenze e gli strumenti messi a punto nel corso degli anni (in particolare la
libreria GeCo++), è stato possibile implementare software di analisi particolarmente avanzati.
Particolare cura è stata posta nella configurazione di una infrastruttura hardware/software in
grado di garantire, oltre alla suddetta flessibilità nelle analisi, la possibilità di mettere a
disposizione dei diversi gruppi strumenti accessibili attraverso interfacce web relativamente
semplici nell'utilizzo e che non richiedano conoscenze informatiche troppo avanzate. L'idea è
quella di costruire una sistema che possa integrare informazioni di diversa natura (database di
annotazioni, dati clinici, software per l'analisi funzionale) per rispondere in modo il piu'
possibile intuitivo ai quesiti posti da ogni esperimento.
I software a disposizione consentono di analizzare i dati da diversi punti di vista: l'analisi
dell'effetto di una variante su di un trascritto viene effettuata valutandone la sua posizione,
l'effetto sul prodotto proteico, sullo splicing e sull'espressione. Ciascuna di queste tipologie di
analisi richiede l'accesso a database di annotazioni, motivi regolatori, fattori di trascrizione,
nonché' l'impiego di software specifici. Per un impiego efficace è necessario dunque avere a
disposizione un sistema informatico in grado di correre diversi software
contemporaneamente, garantendo l'accesso alle fonti di dati e integrando poi i risultati in
tabelle di semplice lettura e consultazione. I progetti di ricerca del nostro laboratorio, quasi
sempre di natura genome-wide, ci hanno consentito non solo di mettere a punto algoritmi
specifici per i diversi aspetti di queste analisi ma anche di sviluppare il software proprio
tenendo conto delle esigenze di flessibilità e integrazione citate sopra. In particolare la libreria
GeCo++, che è stata sviluppata nel nostro laboratorio come supporto a progetti di ricerca
genome wide. Ha trovato una efficace applicazione nei problemi posti dal sequenziamento
NGS e, in particolare dall'analisi terziaria dei risultati. In altre parole l'aver pensato in termini
genome wide fin dal momento della prima versione del genoma umano, ci consente ora di
affrontare le problematiche NGS in modo efficiente sia in termini di tempi di realizzazione
degli strumenti di analisi che di risorse necessarie.
Elenco delle Ricerche sviluppate nel corso del 2014 presso il laboratorio di biologia
molecolare citogenetica e bioinformatica:
1) Caratterizzazione dei meccanismi patogenetici coinvolti in forme recessive di
paraparesi spastica ereditaria ad insorgenza precoce
2) Variabilità fenotipica e aploinsufficienza nella sindrome di Phelan/McDermid:
identificazione di nuovi geni mediante sequenziamento dell'esoma.
3) Alterazioni bioenergetiche e delle vie di clearance cellulare: ruolo nella patogenesi
delle patologie degenerative del sistema muscolare e nervoso.
120
4) Sviluppo di soluzioni Next Generetion (NGS) per la diagnosi delle epilessie
idiopatiche e forme isolate e sindromiche di disabilità intellettiva
5) Malattie del motoneurone: analisi di modelli di Drosophila per lo studio del ruolo del
metabolismo lipidico nei processi neurodegenerativi
6) Approccio integrato (genetica di popolazione e next generation sequencing) per
l'identificazione di varianti funzionali con effetto patologico.
7) Analisi RNA - seq per l'identificazione de - novo di isoforme di trascrizione e di
splicing in pazienti neuromuscolari
8) Applicazione di un approccio di Next-Generation-Sequencing per l'identificazione di
varianti causative/predisponenti a malattie autoimmuni (Sclerosi Multipla e Morbo di
Crohn)
9) Implementazione di una biobanca per ricerca secondo un pre-esistente studio di
fattibilità basato sul coinvolgimento delle Associazioni dei pazienti.
Progetti attivi nel 2014
-Lipid metabolism in the legia: genes, biomarkers, and models for therapy (NEUROLIPID)(2014-206) ERARE JTC
-Role of DRP1 and mitochondrial dynamics in neuronal and muscular disorders: molecular
mechanisms and therapeutics implications (2014-2016) prog GR-2011-02350544 (Ministero
della salute)
- Definizione del difetto molecolare in una popolazione di soggetti affetti da forme
sindromiche di ritardo mentale e quadri neurodegenerativi: analisi di sequenze, meccanismi
molecolari e analisi statistica delle varianti funzionali associate. (5X mille) 2012-2014
Collaborazioni
Prof E. I Rugarli- Institute for Genetics CECAD Research Center
University of Cologne Joseph-Stelzmann-Str. 26 50931 Köln Germany
Prof W Griffith- Institute of Mass Spectrometry College of Medicine Grove Building
Swansea University Singleton Park Swansea SA2 8PP Wales, UK.
Prof Luca De Gioia - Department of Biotechnology and Biosciences, University of MilanBicocca, 20126 Milan, Italy.
Prof. Mario Clerici -Department of Physiopathology and Transplantation, University of
Milan, 20090 Milan, Italy. and Don C. Gnocchi Foundation ONLUS, IRCCS, 20148 Milan,
Italy.
Edward J Hollox - Department of Genetics, University of Leicester, Leicester LE2 1TE, UK
Prof Giuseppe Bianchi - Nephrology and Dialysis Unit, San Raffaele Scientific Institute,
University Vita Salute San Raffaele, Milan, Ita
Nasser M. Al-Daghri - Biomarker research program, Biochemistry Department, College of
Science, King Saud University, Riyadh 11451, Kingdom of Saudi Arabia (KSA) and Prince
Mutaib Chair for Biomarkers of Osteoporosis, Biochemistry Department, College of science,
King Saud University, Riyadh, KSA
Dott. Franca Guerini - Don C. Gnocchi Foundation ONLUS, IRCCS, 20100 Milan, Italy
Dott. Mara Biasin - Department of Biomedical and Clinical Sciences, University of Milan,
20157 Milan, Italy
Prof. Roberto de Franchis - IBD Unit, Chair of Gastroenterology, Luigi Sacco University
Hospital, 20157 Milan
Dott. Sergio Lo Caputo - S. Maria Annunziata Hospital, 50122 Florence, Italy
Dott. Rosanna Asselta - Dipartimento di Biotecnologie Mediche e Medicina Traslazionale,
Università degli Studi di Milano, Milano, Italy.
Dott. Juan Antonio Pineda - Infectious Diseases and Microbiology Clinical Unit. Valme
Hospital, Seville, Spain
121
Dott. Antonio Rivero-Juarez - Maimonides Institut for Biomedical Research (IMIBIC)-Reina
Sofia Universitary Hospital-University of Cordoba, Spain
Dott. Antonio Caruz - Immunogenetics Unit, Department of Experimental Biology,
University of Jaen, Jaen, Spain
Dott. Manuel Comabella - Hospital Universitari Vall d´Hebron (HUVH). Barcelona, Spain
Dott. Matteo Fumagalli - UCL Genetics Institute, Department of Genetics, Evolution and
Environment, University College London, Gower Street, London WC1E 6BT, United
Kingdom
Dott. Matteo Cereda - Department of Experimental Oncology, European Institute of
Oncology (IEO), 20139 Milan, Italy
Prof. Jernej Ule - Department of Molecular Neuroscience, UCL Institute of Neurology, Queen
Square, London WC1N 3BG, UK
Bonaglia Maria Clara, Giorda Roberto, Zanini Sergio (2014);
a new patient with a terminal de novo 2p25.3 deletion of 1.9 mb associated with early-onset
of obesity, intellectual disabilities and hyperkinetic disorder;
Molecular Cytogenetics, 7:53
Doi: 10.1186/1755-8166-7-53PMID: 25126114
I.F. 2013: 2,662
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I.F. 2013: 3,959
Cagliani Rachele, Forni Diego, Biasin Mara, Comabella Manuel, Guerini Franca Rosa, Riva
Stefania, Pozzoli Uberto, Agliardi Cristina, Caputo Domenico, Malhotra Sunny, Montalban
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