CI MICROBIOLOGIA MEDICINA - 6a lezione genetica batterica

Genetica batterica
Giovanni Di Bonaventura, PhD, B.Sc.
Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.)
Fondazione Università “G. d’Annunzio”
0871 54 15 19 (lab)
333 169 65 59 (cell)
[email protected]
Genoma batterico
Il genoma batterico (o nucleoìde) consta di
due componenti:
- Cromosoma (geni essenziali)
- Elementi extracromosomici “mobili” (MGEs)
(non essenziali, responsabili del trasferimento
genetico orizzontale o verticale)
- plasmidi
- elementi trasponibili
- sequenze di inserzione
- trasposoni
- elementi invertibili
Cromosoma batterico
Singolo (microrganismi aploidi)
DNA bicatenario
DNA (prevalentemente) circolare
lineare in Streptomyces coelicolor e Borrelia
burgdorferi
Mosaico in natura – soggetto agli effetti del
trasferimento genetico orizzontale (contiene geni di
diversa provenienza)
Trasferimento genetico orizzontale – il trasferimento
(e successiva integrazione) di geni tra diverse cellule
Dimensioni variabili (0.6-8.6 Mb; 1100-1400 m)
Replicazione bidirezionale, da una singola origine
Replicazione DNA batterico
Escherichia coli: cromosoma
rilasciato in seguito a lisi batterica
MGEs: Plasmidi
 Elementi genetici extracromosomici in grado di
replicarsi autonomamente
 Episoma = plasmide in grado di integrarsi nel
cromosoma batterico
 DNA bicatenario circolare (lineare in Streptomyces spp)
 Presenza di numerosi e “caratteristici” (gruppi di
compatibilità) plasmidi in un singolo batterio: dimensioni =
1/k n. copie
 Qualità dell’informazione genetica
•
•
•
Scarsa omologia (“estranei”) con il cromosoma e raramente
indispensabili per la sopravvivenza e moltiplicazione
batterica in condizioni “ottimali”
Informazione per replicazione indipendente (se unica
informazione = plasmidi “criptici”)
Codificano per fattori di virulenza batterica:
•
•
•
•
Produzione di pili, tossine, adesine, siderofori,
Fattori R: determinanti dell’antibiotico-resistenza
Plasmidi F: sessuali o coniugativi
Plasmidi F’ (Hfr): integrati nel cromosoma (alternanza tra
forma libera ed integrata = episoma)
Plasmidi
Duplicazione “rolling circle” di DNA-plasmidi
1. Plasmide
circolare
2. Rottura di
una catena
nick
3. Spiazzamento
di catena
Punto di nuova
sintesi di DNA
5’
Catena
spiazzata
4. Sintesi DNA
5. Termine replicazione, ligazione
Replicazione
discontinua
DNA sintetizzato
Roll
3’
3’
5’
Roll
5’
una catena completa
3’
5’
Altri MGEs: Elementi trasponibili
(1 di 2)
Caratteristica traslocazione tra “elementi” diversi
(cromosoma, plasmidi) del genoma batterico.
Generalmente, la traslocazione avviene all’interno
della STESSA cellula (a differenza dei meccanismi di
trasferimento di materiale genetico)
eccezione: trasposoni coniugativi (coniugazione)
Due meccanismi di trasposizione:
conservativa – nessuna duplicazione di elemento
replicativa – duplicazione di elemento
La trasposizione induce un effetto “mutageno”:
mutazione letale
mutazione non letale
Altri MGEs: Elementi trasponibili
Sequenze di Inserzione
(IS) – piccole dimensioni
(800-2.000 bp), integrazione
sito-specifica mediante
sequenze invertite e ripetute,
“core” codificante solo per
trasposizione (solo effetto
mutageno).
Trasposoni – rilevanti
dimensioni (> 2.000 bp),
integrazione sito-specifica
mediante IS, “core”
contenente uno o più geni (es.
geni per farmaco-resistenza).
(1 di 2)
Altri MGEs: Elementi trasponibili
(2 di 2)
Elementi invertibili – oltre a geni codificatori per la
trasposizione, presenza di “DNA-invertasi” capace di
invertire l’elemento di 180° (rispetto ad un asse
centrale virtuale) nella sua locazione cromosomica –
“variazione di fase flagellare” H1/H2 in Salmonella
Isole genomiche – integrate nel cromosoma mediante
fago, veicolano geni per la patogenicità (pathogenicity
island) e per la vita simbiontica
Meccanismi di variazione batterica
Mutazione genica
Trasferimento genico e ricombinazione
Coniugazione
Trasformazione
Trasduzione
Conversione lisogenica
Fusione del protoplasto
Mutazioni
 Mutazione = modificazione della sequenza nucleotidica
 Mutazioni spontanee (10-7- 10-11 bp / generazione) insorte durante la
duplicazione del DNA (low frequency) o in seguito a fenomeni di
inversione/traslocazione (high freq.).
 Mutazioni indotte da agenti mutageni chimici (ag. alchilanti, ac.
nitrico, 5-bromouracile), fisici (raggi X, U.V.), biologici (virus)
 Tipologie:
– Mutazioni MICROlesionali (puntiformi):
• Transizione (sostituzione tra basi puriniche/pirimidiniche)
• Transversione (sostituzione base pur/pirim con base pirim/pur)
• Frameshift (inserzione o perdita di una base)
– Mutazioni MACROlesionali:
• Delezione (di sequenze)
• Duplicazione (di sequenze)
• Inversione e Traslocazione (di sequenze)
 Effetti sul fenotipo:
– Generalmente, sono compatibili con la sopravvivenza del batterio, grazie
alla sua eterogeneità genetica
– Mutazioni missense (silente: sequenza aa immutata), nonsense (STOP
codon), frameshift (sequenza aa modificata)
– Possono essere “letali”
Mutazioni missense (transversione),
nonsense e frameshift
Coniugazione
Coniugazione = trasferimento genico unidirezionale mediato
da plasmide che richiede un contatto “fisico” tra due
cellule batteriche:
Pilo sessuale (Gram-negativi)
Ferormoni (Gram-positivi)
Plasmidi coniugativi – plasmidi che possono essere
trasferiti tra cellule mediante coniugazione
Plasmide F – plasmide della “fertilità” (F – fertility)
geni rep – codificano per la replicazione
geni tra - codificano per il trasferimento
geni mob - codificano per la mobilizzazione
4 elementi IS – mediano l’integrazione nell’endogenote
Coniugazione: tipi cellulari
Cellula F+ - cellula contenente un plasmide F
- (cellula donatrice o “maschile”)
Cellula F- - cellula non contenente un plasmide F
- (cellula ricevente o “femminile”)
Cellula Hfr – cellula contenente un plasmide F integrato
nel cromosoma (Hfr – high frequency of recombination)
- (cellula donatrice o “maschile”)
Pilo sessuale – struttura superficiale prodotta da cellule
F+ che media lo specifico contatto tra cellule F+ e F-, ed
il trasferimento del plasmide
Coniugazione: F+ x F1. F+ (donatore) contenente un
plasmide F+ codificante per il
pilo sessuale.
2. Formazione “coppia
coniugativa”. Rottura in oriT di
una catena del plasmide F+.
3. Retrazione del pilo sessuale e
formazione di un ponte
intercellulare. Una catena del
plasmide F+ entra in F-.
4. Sintesi della catena
complementare di F+ in
entrambi i batteri, adesso in
grado di produrre il pilo
sessuale.
Nella coniugazione F+ x F- non
si assiste a trasferimento di
DNA cromosomico
1
2
3
4
Coniugazione: F+ x F-
1
Coniugazione: Hfr x F1. Formazione Hfr: inserzione di un
plasmide F+ nel nucleoide del
batterio accettore.
2. Formazione “coppia
coniugativa”. Rottura
monocatenaria del DNA a livello
del plasmide F+ integrato.
3. Retrazione pilo sex e formazione
ponte intercellulare. Ingresso del
DNA monocatenario nel batterio
accettore. Interruzione
spontanea della coniugazione:
solo una parte del DNA donatore
verrà trasferita all’accettore.
4. Il donatore sintetizza una copia
complementare del DNA
rimanendo Hfr. L’accettore
sintetizza una catena
complementare del DNA
trasferito.
4
2
3
-Degradazione
(nessun effetto)
-Circolarizzazione
(plasm. coniugativo)
-Integrazione
(nuovi caratteri)
Integrazione del plasmide F nel cromosoma
a formare una cellula Hfr
plasmide F
cellula
F+
IS3
sequenze di
inserzione
(IS) nel
plasmide
gd
IS3
IS2
integrazione del plasmide F
cellula Hfr
plasmide F
IS
plasmide F
integrato
cromosoma
IS
ricombinazione
omologa tra
elementi IS
Coniugazione: Hfr x F-
Pilo F
Cellula F
+
Cellula F
-
Coniugazione nei Gram+
• Enterococcus faecalis
• Produzione e rilascio di ferormoni da parte
della cellula “accettrice” (femminile)
• Ferormoni inducono produzione della
sostanza aggregante alla superficie della
cellula “donatrice” (maschile)
• Formazione di aggregati cellulari con
trasferimento del plasmide coniugativo
Significato della coniugazione
Significato clinico:
Principale meccanismo di trasferimento
di geni per l’antibiotico-resistenza
Trasferimento di geni codificanti per fattori
di virulenza (enterotossine, adesine, siderofori)
Significato ambientale:
Trasferimento di resistenza a erbicidi ed
idrocarburi aromatici
Resistenza batterica ai metalli pesanti
Trasferimento di geni per la fissazione dell’azoto
tra Rhizobia
Plasmidi Ti da Agrobacterium possono trasferire
geni alle piante
(meccanismo di trasferimento genico tra Domini)
Significato evoluzionistico:
Principale meccanismo evolutivo/adattativo batterico
Trasformazione
 Assunzione di frammenti di DNA solubile
dall’ambiente circostante da parte di cellule
batteriche “competenti” (Bacillus, Haemophilus,
Neisseria, Pneumococcus)
Meccanismo di trasferimento genetico
“evoluto” da una primitiva esigenza nutrizionale
Influenzato da:
Dimensioni DNA
Sensibilità DNA a nucleasi
“Competenza” della cellula “accettrice”
naturale o indotta artificialmente
Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)
Streptococcus pneumoniae
Scoperta della trasformazione (Griffith, 1928)
Avery, McCarty e McLeod (1944) identificarono
nel DNA la “sostanza trasformante”
1
Trasformazione batterica
1. Morte e degradazione del
batterio “donatore”.
2. Un frammento di DNA
bicatenario (ds) interagisce
con specifiche proteine (DNAbinding protein) alla superficie
della cellula “competente”. Il
DNA è reso monocatenario
(ss) da una nucleasi.
3. La proteina Rec A promuove
la ricombinazione omologa tra
il DNA ss donatore e quello ss
recipiente.
4. Lo scambio è completato.
Formazione di heteroduplex:
una sola delle cellule figlie
risulterà essere “trasformata”.
2
3
4
Trasformazione batterica
Trasformazione batterica: competenza
La cellula accettrice, per poter essere trasformata,
deve trovarsi in una particolare condizione che prende
il nome di competenza
Competenza – capacità cellulare di “catturare” il DNA.
“Fattore di competenza” (Gram+) induce:
 modificazioni di parete cellulare (autolisina)
formazione/attivazione di proteine DNA-binding
e nucleasi
 competenza naturale (Bacillus, Neisseria spp.)
 competenza indotta artificialmente (P. aeruginosa,
E. coli, S. typhimurium) – trattamento “a freddo”
con CaCl2 (bassa efficienza, utilizzato di routine
nel clonaggio di DNA in E. coli) - elettroporazione
Trasformazione batterica nei GramMancanza del “fattore di competenza”, sostituito
da particolari condizioni del mezzo colturale:
Ad esempio, 100% competenza in Haemophilus spp.
in condizioni permissive per la sintesi proteica ma
non per la crescita completa.
Significato della trasformazione
Significato biotecnologico:
Clonaggio di geni “utili”
Significato evoluzionistico:
Meccanismo di evoluzione/adattamento batterico
Trasduzione
 La trasduzione consiste nel trasferimento di
frammenti di DNA tra due cellule batteriche
mediante un batteriofago (virus batterico).
 Esistono 2 tipi di trasduzione:
1. Trasduzione generalizzata: (teoricamente)
qualsiasi gene può essere trasferito
2. Trasduzione specializzata: solo specifici geni
possono essere trasferiti
Batteriofago T4
…infetta Escherichia coli
Trasduzione
generalizzata (1 di 2)
1
1. Un fago litico adsorbe ad un
batterio sensibile.
2. Penetrazione del genoma
2
fagico nel batterio. Utilizzo
dei sistemi metabolici cellulari
per la sintesi e l’assemblaggio
delle componenti virali.
3. In alcuni casi, un frammento di
DNA batterico o un plasmide
possono essere erroneamente
inseriti in alcuni capsidi virali
(particelle trasducenti).
3
Trasduzione
generalizzata (2 di 2)
4. Rilascio dei fagi batterici in
seguito a lisi batterica.
5. Il fago trasduttore adsorbe
ad un batterio sensibile.
4
5
6. Penetrazione del DNA fagico.
7. DNA fagico ricombina con il
DNA della cellula accettrice.
7
6
Trasduzione generalizzata
1
Trasduzione
specializzata (1 di 2)
1-2. Un fago temperato adsorbe al
batterio sensibile e vi inietta
il suo genoma.
3.
Il genoma fagico ricombina
con il nucleoide batterico
divenendo un profago.
4.
In presenza di stimoli adeguati,
un frammento del DNA batterico
viene escisso come parte del
genoma fagico.
2
4
3
Trasduzione
specializzata (2 di 2)
5. Durante la replicazione fagica il
DNA batterico viene inserito nel
genoma fagico. Tutti i fagi
veicolano il frammento di DNA
batterico.
5
6
6. Il fago adsorbe ad una batterio
sensibile iniettandovi il suo genoma.
7. Il genoma fagico contenente il DNA
trasdotto ricombina con il nucleoide
della cellula accettrice.
7
Trasduzione specializzata
Adattamento ed evoluzione batterica
Mutazione e selezione “classiche”
(Selezione naturale ed evoluzione)
Acquisizione di geni da altri batteri Trasferimento genico ORIZZONTALE:
- Coniugazione
- Trasformazione
- Trasduzione
 Ricombinazione genica (omologa o sito-specifica)
Trasferimento genico VERTICALE
La ricombinazione genica è coinvolta in ogni
fenomeno generante variabilità genica
Quantità (valori percentuali) di DNA “atipico”
(trasferito) nei genomi batterici
Circa il 13% del genoma di E. coli K12 è stato acquisito mediante
trasferimento genico orizzontale.
Ricombinazione genica
Scambio “fisico” di materiale
genetico tra due molecole di DNA
Importante processo evolutivo in
quanto promuove la diversità
genetica (permettendo un rapido
adattamento)
Coinvolta nella coniugazione,
trasformazione, trasduzione e
trasposizione
Ricombinazione tra DNA
lineare (a) e plasmidico (b).
Ricombinazione genica
A) Ricombinazione OMOLOGA – scambio genetico tra
sequenze di DNA omologhe
Molto complessa - in E.coli richiede oltre 25 geni,
Alcuni prodotti genici coinvolti:
RecA – catalizza la ricombinazione,
ubiquitaria nei procarioti
RecBCD – attività nucleasica ed elicasica
proteine leganti DNA singola elica stabilizzano il DNA a singola elica
B) Ricombinazione SITO-SPECIFICA:
trasposizione (nella trasposizione)
meccanismo integrasi-mediato (nei fagi)
trasposoni integrativi e coniugativi
Ricombinazione omologa nei batteri
Meccanismo e Tipologie
Conversione lisogenica
• Integrazione del genoma fagico
mediante ricombinazione sitospecifica
• DNA profagico “silente”
• Occasionale (essiccamento, U.V.,
radiazioni ionizzanti, agenti
mutageni) derepressione di parte
del DNA profagico
• Espressione di numerose proprietà
patogene dei batteri:
• Produzione di tossine (tox difterica,
indotta da carenza di Fe3+)
• Adesine ed antigeni di superficie
(Salmonella O antigen)
Fusione del protoplasto
• Protoplasto = citoplasma + nucleo
• Fusione di due protoplasti trattati
con lisozima e penicillina