Analisi 04 03 – Spettrofotometria Ass. Molecolare

SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE UV/VIS
Aspetti teorici
La spettrofotometria UV/VIS si basa sull’assorbimento selettivo, da parte di molecole, delle
radiazioni con lunghezza d’onda compresa tra 10 nm e 780 nm che corrispondono alle regioni
spettrali:
 UV lontano (10 – 200 nm)
 UV vicino
(200 – 380 nm)
 Visibile
(380 – 780 nm)
Dal punto di vista analitico le regioni più interessanti sono l’UV vicino e il visibile.
Quando viene fornita energia alle molecole si provoca l’eccitazione degli elettroni di valenza che
può provocare delle transizioni elettroniche che avvengono a partire da orbitali molecolari di
legame (σ o π) o di non legame (n). La lunghezza d’onda necessaria alle diverse transizioni è
tanto maggiore quanto minore è il dislivello di energia. Queste transizioni sono caratteristiche sia
dei composti organici sia dei composti inorganici che possiedono elettroni di valenza di tipo s e p.
Legge dell’assorbimento
La legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche è la
legge di BEER, che nel caso di radiazioni monocromatiche assume la forma:
A = ε * b * C dove
 A = Assorbenza
 b = cammino ottico (cm), cioè lo spessore della soluzione attraversata dal raggio
 C = concentrazione della specie assorbente (moli/l)
 ε = coefficiente di assorbimento molare
Fissando un valore costante del cammino ottico, la legge di Beer diventa A = K*C che in pratica
non è altro che l’equazione di una retta passante per l’origine di cui K è il coefficiente angolare. Nel
caso di b = 1 cm, tale coefficiente angolare diviene uguale al coefficiente di assorbimento molare.
Un’altra grandezza utile per esprimere l’assorbimento di radiazioni in termini quantitativi è la
Trasmittanza (T):
T = I/Io
dove I = intensità della radiazione in uscita dal campione
Io = Intensità della radiazione incidente.
Trasmittanza e assorbenza sono legate tra di loro dalla relazione :
A  log
1
I
 log
T
I0
In genere la trasmittanza viene espressa come trasmittanza percentuale T% = T * 100 e
sostituendo:
A  log
100
 2  log T %  T %  10 2 A
100 %
Strumentazione
Gli strumenti usati per misurare l’assorbimento di radiazioni da parte di soluzioni sono dette
spettrofotometri. Schematicamente uno spettrofotometro è costituito da :
Sorgente
Monocromatore
Comparto celle
rivelatore
Elaborazione dati
Sorgente
Sono lampade che possono emettere nel campo UV o Visibile. Si usano lampade a filamento di
tungsteno e lampade a deuterio e per particolari impieghi analitici lampade a vapori di mercurio o
di cadmio.
Monocromatore
Il dispositivo scompone la radiazione in bande monocromatiche. La qualità di un monocromatore è
definita da due parametri
1. l’ampiezza della banda passante che è l’intervallo di lunghezza d’onda del fascio che
emerge dalla fenditura con una energia superiore al 50% dell’energia della radiazione
nominale
2. il potere risolvente ( R ) che esprime la capacità del monocromatore di separare tra loro
due diverse lunghezze d’onda. Il potere risolvente è quindi, la differenza di lunghezza
d’onda fra due radiazioni che sono separate da 1 mm sul piano della fenditura di uscita.
I monocromatori sono di due tipi, secondo il principio su cui si basano:
a) FILTRI che assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione incidente e ne
trasmettono una gamma più o meno ampia e che possono essere di assorbimento, a
interferenza, di diffusione;
b) PRISMI che diffrangono la luce policromatica separandola nelle diverse componenti
cromatiche
Rivelatore
I rivelatori trasformano l’energia radiante in un segnale elettrico che viene trasferito ad un
indicatore analogico o digitale e a un registratore. I rivelatori di uso più comune sono detti celle
fotoelettriche. Questi dispositivi si basano sulla proprietà dei semiconduttori i cui elettroni più
esterni possono essere facilmente eccitati. Le radiazioni dell’UV/VIS hanno sufficiente energia per
procurare queste transizioni elettroniche che, a loro volta, generano una corrente elettrica; la d.d.p.
prodotta è direttamente proporzionale al numero di fotoni che raggiunge il rivelatore e quindi, in
ultima analisi, alla quantità di sostanza presente.
Sistema di lettura
Il sistema di lettura converte il segnale che proviene dal rivelatore in una forma che può essere
usata dall’analista. In generale gli strumenti sono interfacciati ad un PC che provvede, tramite
apposito software, all’elaborazione dei dati, ma anche alla gestione del funzionamento dello
strumento stesso e delle procedure di controllo.
Tipologie di strumento
Le misure di assorbanza per essere attendibili devono tener conto degli assorbimenti dovuti al
solvente, alla matrice in cui l’analita è disperso e alle pareti del contenitore. Ciò significa che lo
strumento deve essere azzerato prima di ogni serie di misure; lo strumento, cioè, deve essere
informato su ciò che si considera come assorbimento nullo. Questa esigenza ha portato alla
realizzazione di diversi tipi di spettrofotometri per UV/VIS tra cui i più importanti sono:
1. Strumenti monoraggio: il raggio di luce emesso dalla sorgente raggiunge il campione dopo
essere stato selezionato dal monocromatore. La sorgente comprende due lampade, una al
DEUTERIO per l’analisi nell’UV ed una a filamento di TUNGSTENO per l’analisi nel visibile.
Uno specchio focalizzatore mobile consente di focalizzare sulla fenditura di entrata del
monocromatore la radiazione emessa dalla lampada. La radiazione colpisce l’elemento
disperdente e viene separata nelle sue componenti monocromatiche; di queste quella di
interesse analitico viene selezionata tramite un filtro ottico, fatta passare attraverso la
fenditura di uscita ed inviata verso la cuvetta che contiene l’analita. La radiazione
attraversa la soluzione con l’analita, viene rilevata e misurata dal rivelatore, in genere a
fototubo, e trasformata in segnale che viene inviato al sistema di elaborazione segnali che
provvede a decodificarlo e a trasformarlo in un dato analitico.
2. Strumenti a doppio raggio. A differenza dello spettrofotometro a singolo raggio, il raggio
uscente dal monocromatore viene sdoppiato; i due raggi così ottenuti vengono inviati,
rispettivamente, uno al campione ed uno al bianco posti in due cuvette uguali. Il dispositivo
di lettura calcola il rapporto tra le intensità dei due segnali ottenuti. Le prestazioni degli
spettrofotometri a doppio raggio variano secondo i modelli, in ogni caso lo schema a doppio
raggio consente di compensare automaticamente le fluttuazioni della lampada e quindi
consente analisi più accurate anche nel caso di singole misure di assorbanza
Celle o cuvette
Le celle o cuvette sono di vario tipo secondo l’uso ed il tipo dello strumento. In genere vengono
utilizzate micro celle con cammino ottico di 1 cm per piccoli volumi (0,5 ml), costruite in vetro o in
quarzo, ma anche in poliestere (monouso).
METODI DI ANALISI
1. Analisi qualitativa
Lo spettro di assorbimento molecolare ottenuto nell’UV/VIS dipende dalla struttura elettronica della
molecola che assorbe e quindi dalle possibili transizioni; esso corrisponde all’inviluppo di tutte le
bande elettronico – vibrazionali (e anche rotazionali in alcuni casi) centrate in corrispondenza della
lunghezza d’onda che corrisponde alla transizione più probabile (e quindi più intensa). In genere di
queste bande si indica la lunghezza d’onda di massimo assorbimento (λmax) e il relativo coefficiente
di estinzione molare (εmax).
Per sfruttare tale spettro nell’analisi quantitativa occorre innanzitutto la presenza nella molecola di
un gruppo cromoforo e successivamente occorre conoscere i fattori da cui dipendono i valori di
εmax e la posizione di λmax per le principali porzioni strutturali delle molecole. Per quanto riguarda la
posizione di λmax i fattori principali che ne influenzano la posizione sono:
 effetto Batacromo (o Red Shift) che consiste nello spostamento verso il rosso cioè a
lunghezze d’onda maggiori di λmax , per la presenza di gruppi funzionali batacromi (doppi
legami in alfa ad un carbonile)
 effetto Ipsocromo (o blue shift) che consiste nello spostamento di λmax verso lunghezze d’onda
minori, per la presenza di gruppi funzionali ipsocromi vicino al gruppo cromoforo;
 effetto Auxocromo dovuto alla presenza di un gruppo funzionale saturo detto auxocromo (-OH;
-Cl;..) legato ad un cromoforo; l’effetto, in genere, comporta un aumento sia di λmax che di εmax
 effetto solvente. Il solvente può provocare una significativa variazione nei livelli energetici di
una molecola. In particolare, un solvente polare, quando solvata una molecola, abbassa
l’energia dello stato elettronico eccitato più di quella dello stato fondamentale, perché lo stato
eccitato è più polare e quindi si solvata di più.
Per quanto riguarda il valore del coefficiente molare di assorbimento (ε ) di un cromoforo, questo
dipende da quattro fattori:
1. probabilità della transizione elettronica;
2. variazione del momento di dipolo che essa comporta;
3. natura del solvente
4. tipo di sostituenti.
In generale gli spettri UV/VIS non sono particolarmente adatti all’analisi qualitativa, perché in
genere sono poco dettagliati e quindi possono essere usati ben poco per identificare le molecole;
comunque lo spettro UV/VIS è utile per escludere la presenza di particolari strutture nella molecola
in esame. È possibile comunque identificare alcune molecole ricorrendo a particolari elaborazioni
dei segnali e precisamente:
 analisi differenziale degli spettri in derivata tracciando la derivata della funzione A/λ che esalta
la differenza tra bande sovrapposte;
 metodi dei quozienti di assorbanza che vengono calcolati dividendo l’assorbanza ad una
lunghezza d’onda vicino a λmax per le lunghezze d’onda vicino ai punti a metà altezza della
banda.
I valori così ottenuti sono caratteristici per le diverse specie chimiche, ma dipendono anche dalla
precisione dello strumento usato.
2. Analisi quantitativa
La legge di Beer esprime una relazione di proporzionalità diretta tra la concentrazione di una
specie in soluzione e l’assorbimento di una radiazione ad una determinata lunghezza d’onda.
Essa, quindi, può essere sfruttata per l’analisi quantitativa, purché siano rispettate alcune
condizioni; anzitutto la specie in soluzione deve assorbire in modo rilevabile da 200 a 900 nm e in
secondo luogo la relazione fra Assorbanza (A) e lunghezza d’onda (λ) di assorbimento deve
essere effettivamente lineare. Questo perché diversi fattori possono provocare deviazioni dalla
linearità della funzione A/C, nello specifico:
 Fattori fisici e chimici quali associazioni tra molecole per formare dimeri, polimeri o aggregati
con il solvente; variazioni del pH che influenzano l’equilibrio tra due specie con diverso ε;
variazioni di temperatura ed altri;
 Fattori strumentali quali l’ampiezza della banda passante decisiva ai fini della accuratezza e
della precisione dell’analisi; la presenza di luce diffusa che sommandosi alla radiazione
monocromatica in uscita dalla fenditura del monocromatore, attraversa il campione e ne altera
l’assorbanza, specie se è molto concentrato;
 Fattori operativi quali errori nella pesata e nella preparazione delle soluzioni; perdita di
sensibilità degli strumenti di misura; pulizia inadeguata delle cuvette; errore nella scelta della λ
con cui operare; presenza di sostanze interferenti nel campione.
In conclusione, una specie chimica può essere determinata quantitativamente per via
spettrofotometrica nell’UV/VIS solo se assorbe in questo campo e quindi se la specie è di per se
un cromoforo o può essere trasformata in un cromoforo.
La soluzione sottoposta ad analisi deve essere limpida e la scelta della λ con cui effettuare le
misure di assorbanza viene fatta in modo da lavorare in corrispondenza dei punti di massimo, dove
è migliore la soglia di rivelabilità e quindi un errore nella misura di assorbanza che diventa il
minimo possibile.
I metodi analitici più usati in spettrofotometria UV/VIS sono due:
 Metodo della retta di taratura
 Metodo dell’aggiunta multipla