imaging mass spectrometry - University of Milano

IMAGING MASS SPECTROMETRY
m/z 4940
m/z 4554
Veronica Mainini
PhD Biomedical Technologies
Post-DOC researcher
Clinical Proteomics Unit
Dept. Of Health Science
Università degli studi di Milano-Bicocca
m/z 10165
Mainini V., Angel PM, Magni F., Caprioli RM.
Rapid Communications in Mass Spectrometry
2011 25(1):199-204
IMAGING MASS SPECTROMETRY
(IMS)
• Tecnologia che permette di analizzare componenti
sia endogeni che esogeni presenti nei tessuti,
mantenendo nel contempo la loro orientazione
spaziale .
IMS
•
•
•
•
Rileva analiti di varia natura
Analisi condotta direttamente sul campione nativo
Non necessita di marcatori, purificazioni, etc…
Fornisce informazioni relative alla distribuzione
spaziale
• Combina le informazioni molecolari ottenute
mediante MS con informazioni derivanti dalla
microscopia ottica.
IMS: quale spettrometro???
• Spettrometro (TOF, TOF-TOF, orbitrap, synapt, FT-ICR, Q-TOF...)
• Ionizzazione
MALDI
Proteine, peptidi, lipidi, farmaci
SIMS
Piccole molecole, elementi
DESI
Piccole molecole, lipidi
• Risoluzione Spaziale
Ø area colpita
• Range di Massa
MALDI
10 µm -200 µm
SIMS
100 nm – 10 µm
DESI
300 µm - 500 µm
MALDI
0-30 K m/z– fino 150 K m/z
SIMS
< 1000 m/z
DESI
< 3000 m/z
• Velocità dell’acquisizione Frequenza del laser 200Hz – 2kHz
Ec = ½ mv2
Ec = zeV
zeV = ½ mv2
t = L √ m/2zeV
v = √ 2zeV/m
m/z 4940
m/z 4554
INTENSITY SCALE
0%
100%
MALDI-TOF Imaging/Profiling
MATRIX
Large Droplets
(µL)
Uniform Coating
(spray)
Small Droplets
(pL)
LOW
SPATIAL RESOLUTION
PROFILING
HIGH
IMAGING
A
B
C
Find discriminatory patterns
Proteins/peptides spatial distribution
Manuscript in press
Wild Type
IRF6 -/-
3 mm
PROFILING
IMAGING
PROFILING RESULTS….
IMAGING RESULTS!
IMS_Tecnologia
• Spessore della sezione: 5-20 µm ↑spessore = ↓ conduttività
• Tipologia di campione:
-qualsiasi tipo di cellula o tessuto (cellule da coltura,
colonie batteriche, tessuti, biopsie…)
-tessuti freschi o FFPE
•Degradazione del campione
Campione:
•Inclusione in polimero OCT (Optimal Cutting Temperature,
polyvinyl alcohol + polyethylene glycol ) o altre resine.
no OCT
con OCT
•Lavaggi per eliminare interferenti
•tipo di matrice:
Matrice:
4. Ferulic acid [(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)prop-2-enoic acid] has been
recently reported for the detection of high molecular weight proteins on thin tissue
sections.
•Preparazione
della matrice !
•Deposito: automatizzato/manuale
Matrice:
Kaletas KB, et al Proteomics 2009; 9 (10):2622-33
AUTOMATED SPOTTING
VANTAGGI
- riproducibilità
- buona qualità spettri
SVANTAGGI
- cristallizzazione della mx
- costo elevato
- ris. spaziale limitata
- tempistiche lunghe
SHIMADZU ChIP
Chemical Inkjet Printer
LABCYTE PORTRAIT 630
Spotter Acustico
TLC Sprayer
SPRAY MANUALE
Ris. Spaziale: 50-150 µm
VANTAGGI - Basso costo
- Elevata risoluzione spaziale
SVANTAGGI: Scarsa riproducibilità
Airbrush
SPRAY AUTOMATIZZATO
Ris. Spaziale: 50µm
VANTAGGI: Riproducibile
Buona risoluzione
spaziale
SVANTAGGI: Costo
elevato
SUBLIMAZIONE
IMS e PROTEOMICA CLINICA
IMS si focalizza sul fenotipo della
patologia
Tecnica veloce ed efficace capace di
valutare una finestra di centinaia di
segnali proteici in un range di massa
molto ampio
Firme proteiche legate alla malattia
primaria
Ricerca di firme molecolari:
vantaggio combinatoriale
1
3
2
il
1_Informazione clinica
2_Dati sperimentali
3_Analisi biocomputazionale
Imaging Mass Spectrometry (IMS)
Distribuzione spaziale e caratterizzazione in situ di biomarcatori proteici
Marcatori diagnostici e target terapeutici
Risposta al trattamento terapeutico
Studio del microambiente della lesione
Biologia dello sviluppo
Distribuzione spaziale di piccole molecole (<1KDa) nel tessuto
 Xenobiotici (composti farmaceutici e loro metaboliti, droghe, tossine,..)
Farmacocinetica
Farmacodinamica
 IMS = alternativa all’autoradiografia!
No molecole radioattive
Metaboliti
Tissues comparison:
normal vs disease
Tissue protein profiling by MS
Intensity (arb. u.)
MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)
32
30
*
Normale
RCC
Spettri Normale : 23
Spettri RCC : 20
28
26
*
24
22
20
18
Differenze statisticamente
significative
*
16
Spettro medio del normale
14
Spettro medio RCC
12
10
*
8
6
4
*
2
0
4000
6000
8000
10000
m/z
12000
14000
16000
18000
20000
–RCC (Renal Cell Carcinoma)_II
7.5
7.0
Spettro medio del normale
Spettro medio RCC
6.5
6.0
RCC
Normale
5.5
AREA DEL PICCO
Intensity (arb. u.)
MALDI-TOF Profiling
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
P-Value = 0.00335
Normale
2.0
RCC
1.5
1.0
0.5
0.0
9800
10000
10200
10400
10600
m/z
10800
11000
11200
11400
–RCC (Renal Cell Carcinoma)_III
Spettro medio del normale
47.5
45.0
Spettro medio RCC
42.5
Normale
40.0
RCC
37.5
35.0
32.5
Normale
30.0
RCC
27.5
22.5
20.0
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
AREA DEL PICCO
25.0
AREA DEL PICCO
Intensity (arb. u.)
MALDI-TOF Profiling
P-Value = 6.24e-005
P-Value = 6.24e-005
RCC
Normale
RCC
Normale
2.5
0.0
2900
3000
3100
3200
3300
m/z
3400
3500
3600
3700
3800
3900
Applicazioni TUMORE: definizione margini istologici e margini molecolari
Molecular Tumor Margin!
TUMORE ALLO STOMACO
• Non esistono Biomarker diagnostici affidabili
• CEA e CA19-9 non sono sufficientemente
sensibili né specifici
• Difficile interpretazione istologica delle lesioni
precancerose da quelle di stadio più avanzato.
Controls n=43
Patients n=63
Histology driven approach !!!
CTRL vs DISEASE
PCA
Sensitivity 94%
Specificity 96%
SUMMARY
• Histology driven approach allowed to apply
profiling analysis in order to:
- detect diagnostic pattern characterizing
gastric cancer
- define molecular patterns discriminating
intestinal and diffuse histological lesions
- differentiate stage Ia lesions to more
advanced lesions (support to prognosis/aid in
resolving ambiguous ultrasonography/TAC
MALDI IMS: Applications
Tissue Imaging by MS
Terapia adiuvante preoperatoria condotta con
Paclitaxel + radioterapia:
- Pazienti con risposta completa (pCR)
- Pazienti che non rispondono alla terapia (NR)
α-defensine: peptidi ad effetto citotossico
coinvolti nel processo di difesa mediato dai neutrofili
POTENZIALI MARKER PROGNOSTICI – RISPOSTA AL TRATTAMENTO
OLANZAPINA:
2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-tieno[2,3-b][1,5]
benzodiazepina, utilizzata per il trattamento di
schizofrenia e disturbi bipolari.
2h
OLANZAPINE
m/z 256
N-desmethyl
m/z 256
2-hydroximethyl
m/z 272
6h
OLANZAPINE
m/z 256
N-desmethyl
m/z 256
2-hydroximethyl
m/z 272
PDZ = primary decidual zone M= mesometrial pole
SDZ = secondary decidual zone AM= antimesometrial pole
Distribuzione di sfingomieline e fosfatidilcoline
durante lo sviluppo embrionale
Distribuzione di lisofosfatidilinositolo, fosfatidilinositolo,
fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerolo e fosfatidilserina
durante lo sviluppo embrionale
SUMMARY OF APPLICATIONS
 PROFILING
• Normale vs Tumorale
• Definizione dei margini tumorali
• Diagnosi e prognosi di lesioni tumorali:
presenza/assenza della lesione, grado
della lesione, caratterizzazione istotipo
 IMAGING
• Risposta al trattamento
• Farmacocinetica e farmacodinamica
• Lipidomica e proteomica per la definizione
di pathways cellulari rilevanti in specifici
processi patologici
LIMITI e PROSPETTIVE
Sensibilità: aumentare il numero e la varietà dei composti osservabili
Risoluzione spaziale: laser; ionizzazione (SIMS, DESI)
Identificazione: metodi più semplici, veloci ed efficaci ad elevata
risoluzione/ proteomica top down
Integrazione dati: correlazione con altre tecniche di imaging (es:PET,
MRI) e complementazione con metodologie tradizionali (es:shotgun, 2DE)
Validazione: nuovi software biostatistici
Quantificazione
MALDI IMS:
IMPROVING SENSITIVITY
LIVER
0.05% TRITON X-100 matrix
0.05% SDS matrix
No detergent
BRAIN
0.05% TRITON X-100 matrix
0.05% SDS matrix
No detergent
HEART
0.05% TRITON X-100 matrix
0.05% SDS matrix
No detergent
NO DETERGENT
MATRIX
SDS
MATRIX
m/z 4554
m/z 4940
m/z 8956
INTENSITY SCALE
0%
100%
NO DETERGENT
MATRIX
m/z 10165
TRITON X-100
MATRIX
m/z 11083
m/z 14004
INTENSITY SCALE
0%
100%
Imaging Mass Spectrometry:
NEW TECHNOLOGIES
&
ADVANCED APPROACHES
MALDI imaging_ visualizzazione 3D
MBP 8
Unident.
Prot.
MBP 5
Anna C. Crecelius et Al. Three-Dimensional Visualization of Protein Expression in Mouse Brain Structures Using Imaging
Mass Spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry, Volume 16, Issue 7, 2005, 1093-1099
Andersson M, Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume
reconstruction. Nat Methods. 2008 Jan;5(1):101-8.
MALDI imaging:
visualizzazione 3D e RMI
TUMOR
Immagini 2D
- Localizzazione di proteine in specifiche
regioni istologiche
es:
HISTONE H4
TUMORE
GB protein γ7
STRIATUM
Cyt c OXase
polypeptide VIIc
NORMALE
Immagini 3D
- Ricostruzione 3D (IMS + imm. Ottiche)
- Correlazione immagini in 3D
(MRI + IMS + imm. Ottiche)
Piano colorato
MRI
Piano nero
IMS
proteine
NORMALE
STRIATUM
IDENTIFICAZIONE PROTEINE – sequenziamento su sezioni tissutali
1. Molecular Scanner Approach
Tatiana C. Rohner, Dieter Staab, Markus Stoeckli.
MALDI mass spectrometric imaging of biological
tissue sections. Mechanisms of Ageing and
Development 126 (2005) 177–185
2. Digestione proteolitica in situ
M. Reid Groseclose, Malin
Andersson, William M. Hardesty and
Richard M. Caprioli. Identification
of proteins directly from tissue: in
situ tryptic digestions coupled
with imaging mass spectrometry.
J. Mass Spectrom. 2007; 42: 254–
262
IMS di materiale archiviato: tessuti FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)
Spettro MS
* Peptidi di siero
amiloide A
Principale metodo di
conservazione e stoccaggio
rimozione della paraffina e
digestione triptica in situ
MALDI-IMS
1550 m/z
Vaste librerie correlate a dati
clinici accurati
Spettro MS/MS del
peptide a 1550 m/z
diagnosi
prognosi
progressione della malattia
trattamento terapeutico
IMS con digestione triptica in situ su sezione
conservata in formaldeide del 1899 di milza di paziente
malato di amiloidosi
ΔMW=0.061Da
LIPIDI in RENE murino
LIPIDOMICA: FT-ICR e Ion Mobility
Specie molecolari isobare
Strumenti ad elevata risoluzione
(FT-ICR: R=1 x 106)
Separazione per
mobilità ionica
oltre che per
tempo di volo
IMAGING LIPIDI
Nello stesso
campione lipidi
distinti da altre
piccole molecole
con stessa massa
nominale
PROFILING LIPIDI
Specie difficilmente frazionabili
BIBLIOGRAFIA – REVIEWS & BOOKS • Mass Spectrometry Imaging Principles and Protocols Rubakhin SS,
Sweedler JV .Methods in Molecular Biology 656 Humana Press
• Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chughtai K,
Heeren RM. Chem Rev. 2010 May 12;110(5):3237-77. Review.
• Imaging of intact tissue sections: moving beyond the microscope. Seeley
EH, Schwamborn K, Caprioli RM. J Biol Chem. 2011 Jul 22;286(29):2545966.
• MALDI imaging mass spectrometry of human tissue: method challenges
and clinical perspectives. Seeley EH, Caprioli RM. Trends Biotechnol. 2011
Mar;29(3):136-43
• MALDI imaging mass spectrometry--painting molecular pictures.
Schwamborn K, Caprioli RM. Mol Oncol. 2010 Dec;4(6):529-38.
• Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical
histology. Schwamborn K, Caprioli RM. Nat Rev Cancer. 2010
Sep;10(9):639-46.
• Imaging mass spectrometry: viewing the future. Schwartz SA, Caprioli RM.
Methods Mol Biol. 2010;656:3-19.
BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 1 • Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal
carcinoma. Oppenheimer SR, Mi D, Sanders ME, Caprioli RM. J Proteome Res. 2010
May 7;9(5):2182-90.
• Gastric cancer-specific protein profile identified using endoscopic biopsy samples
via MALDI mass spectrometry. Kim HK, Reyzer ML, Choi IJ, Kim CG, Kim HS, Oshima
A, Chertov O, Colantonio S, Fisher RJ, Allen JL, Caprioli RM, Green JE. J Proteome
Res. 2010 Aug 6;9(8):4123-30. Erratum in: J Proteome Res. 2011 Jan 7;10(1):361.
• Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic
analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and
radiation Bauer JA, Chakravarthy BA, Rosenbluth JM et al. Clin Canc Res 2010;
16:681-690
• Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI
mass spectrometry. Khatib-Shahidi S, Andersson M, Herman JL, Gillespie TA,
Caprioli RM. Anal Chem. 2006 Sep 15;78(18):6448-56.
• Spatial and temporal alterations of phospholipids determined by mass
spectrometry during mouse embryo implantation. Burnum KE, Cornett DS,
Puolitaival SM, Milne SB, Myers DS, Tranguch S, Brown HA, Dey SK, Caprioli RM. J
Lipid Res. 2009 Nov;50(11):2290-8.
• 3D Imaging by Mass Spectrometry: a new frontier Seeley EH, Caprioli RM Anal
Chem 2012 Mar 6;84(5):2105-10.
BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 2 •Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume proteomics Andersson M.
Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM Nat Meth vol 5, n.1 Jan2008; 101-108
• MALDI Imaging and Profiling Mass Spectrometry in Neuroproteomics. Andersson M, Andren
P, Caprioli RM. In: Alzate O, editor. europroteomics. Boca Raton (FL): CRC Press; 2010. Chapter
7.
• Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass
spectrometry. Casadonte R, Caprioli RM. Nat Protoc. 2011 Oct 13;6(11):1695-709.
•Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical
treatment of tissue sections Seeley EH, Oppenheimer SR, Deming M, Chaurand P, Caprioli RM
J Am Soc Mass Spec 2008; 19(8): 1069-1077.
• Detergent enhancement of on-tissue protein analysis by matrix-assisted laser
desorption/ionization imaging mass spectrometry Mainini V, Angel PM, Magni F, Caprioli RM
Rapid Comm Mass Spec 2011; 25: 199-204.
• Detection of high molecular weight proteins by MALDI imaging mass spectrometry Mainini V,
Bovo G, Chinello C, Gianazza E, Grasso M, Cattoretti G, Magni F.
• Multiplex target protein imaging in tissue sections by mass spectrometry – TAMSIM Thiery G,
Schepinov MS, Southern EM, et al RCM 2007; 21:823-829.
• Tag-Mass: specific molecular imaging of transcriptome and proteome by mass spectrometry
based on photocleavable tag. Lemaire R et al. J Prot Res 2007; 6(6):2057-2067.
• Improvements of Targeted multiplex mass spectrometry Imaging. Thiery G, Anselmi E etal
Proteomics 2008; 8:3725-3734