BBL Urea Agar Base Concentrate 10X BBL Urea Agar Slants

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BBL Urea Agar Base Concentrate 10X
BBL Urea Agar Slants, Complete
L007521 • Rev. 11 • settembre 2015
PROCEDURE DI CONTROLLO DI QUALITÀ (Facoltativo)
I
INTRODUZIONE
Urea Agar è un terreno usato per differenziare i membri di Enterobacteriaceae spp. in base alla
loro capacità di produrre ureasi.
II
PROCEDURA DEL TEST
A. Istruzioni per la preparazione di un terreno completo da Urea Agar Base Concentrate 10X
1. Per preparare il terreno Urea Agar, dispensare 1,7 g di agar granulare in 100 mL di acqua
purificata. Riscaldare agitando e bollire per 1 min.
2. Dispensare aliquote di 9 mL nelle provette e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.
3. Raffreddare l’agar a 45 – 50 °C e attendere che una provetta di concentrato si porti a
temperatura ambiente. Dispensare 1 mL di concentrato in ciascuna provetta da 9 mL di
soluzione agar raffreddata e mescolare accuratamente.
4. Lasciare raffreddare le provette in posizione inclinata in modo da formare slant con fondo
allungato.
B. Test del terreno completo (Urea Agar Slant)
1. Inoculare i campioni rappresentativi con le colture sotto elencate.
a. Con l’ausilio di un’ansa calibrata da 0,01 mL, inoculare le superfici slant con inoculi di
rilevante entità di colture slant di 24 – 48 h di Trypticase Soy Agar. Non inoculare il
fondo.
b. Incubare le provette – con i tappi non completamente avvitati – a 35 ± 2 °C in aerobiosi.
2. Esaminare le provette dopo 2, 4, 6 e 24 h per verificare la crescita e le reazioni.
3. Risultati attesi
Microrganismi di controllo (ceppi ATCC)
Reazione ureasi
*Proteus vulgaris ................................................... + (da rosa-rosso intenso a rosso-violetto)
ATCC 8427
Morganella morganii ssp. morganii. .................... + (da rosa-rosso intenso a rosso-violetto)
ATCC 8019
*Salmonella enterica ssp. enterica ....................... – (Nessuna variazione cromatica)
sierotipo Typhimurium
ATCC 13311
*Ceppo batterico raccomandato per il controllo di qualità a cura dell’utente.
N.B.: Questo terreno è esente dai test di controllo qualità a cura dell’utilizzatore ai sensi
della norma CLSI M22-A3.
III CONTROLLO DI QUALITÀ SUPPLEMENTARE
1. Esaminare le provette come descritto in “Deterioramento del prodotto”.
2. Eseguire un esame visivo delle provette rappresentative per garantire che l’eventuale presenza
di difetti fisici non interferisca con l’uso.
3. Determinare il pH mediante potenziometria a temperatura ambiente per verificare che rientri
nel range specificato di 6,8 ± 0,2.
4. Incubare a 20 – 25 °C e a 30 – 35 °C le provette rappresentative non inoculate ed esaminarle
dopo 7 giorni per verificare la contaminazione microbica.
INFORMAZIONI SUL PRODOTTO
IV USO PREVISTO
Urea Agar è usato per la differenziazione di microrganismi, soprattutto Enterobacteriaceae spp.,
in base alla produzione di ureasi.
V
SOMMARIO E SPIEGAZIONE
L’urea agar è stato concepito da Christensen per essere usato come terreno solido per la
1
differenziazione di bacilli enterici. Differenzia i microrganismi Proteae ureasi-positivi rapidi
(Proteus spp., Morganella morganii ssp. morganii, Providencia rettgeri e alcuni ceppi di
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Providencia stuartii) da altri microrganismi ureasi-positivi: Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella e
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batteri non Enterobacteriaceae, ossia alcune specie Bordetella e Brucella.
La base è fornita anche come soluzione concentrata 10X sterilizzata mediante filtrazione, da usare
nella preparazione di slant Urea Agar nel laboratorio dell’utente.
VI PRINCIPI DELLA PROCEDURA
Il terreno urea di Rustigian e Stuart3 è particolarmente adatto alla differenziazione della specie
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Proteus da altri bacilli enterici gram-negativi in grado di utilizzare l’urea, poiché questi ultimi
sono privi di tale proprietà in Urease Test Broth a causa delle sostanze nutritive limitate e dell’alta
capacità tamponante del terreno. Nell’intento di fornire un terreno di maggiore utilità,
1
Christensen concepì l’Urea Agar con aggiunta di peptone e destrosio e contenuto tampone
ridotto per promuovere una crescita più rapida di numerosi membri della famiglia delle
Enterobacteriaceae e consentire una riduzione del tempo di incubazione.
L’utilizzo dell’urea da parte dei microrganismi determina la formazione di ammoniaca durante
l’incubazione, con conseguente reazione alcalina di questi terreni e successivo sviluppo di una
colorazione rosa-rossa. La produzione di ureasi può pertanto essere rilevata dalla variazione
cromatica nell’indicatore rosso fenolo.
VII REAGENTI
BBL Urea Agar Base Concentrate 10X
Formula approssimata* per L di acqua purificata
Digerito pancreatico di gelatina ................................. 10,0
Destrosio ....................................................................... 10,0
Cloruro di sodio ............................................................ 50,0
Fosfato di potassio ....................................................... 20,0
Urea ............................................................................. 200,0
Rosso fenolo ................................................................... 0,12
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BBL Urea Agar Slants, Complete
Formula approssimata* per L di acqua purificata
Digerito pancreatico di gelatina ................................... 1,0
Destrosio ......................................................................... 1,0
Cloruro di sodio .............................................................. 5,0
Fosfato di potassio ......................................................... 2,0
Urea ............................................................................... 20,0
Rosso fenolo ................................................................... 0,012
Agar .............................................................................. 15,0
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*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance.
*Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance.
Avvertenze e precauzioni
Per uso diagnostico in vitro.
Aprire con estrema cautela le provette con i tappi serrati allo scopo di evitare lesioni dovute alla
rottura del vetro.
Durante tutte le procedure, adottare tecniche asettiche e seguire le precauzioni standard contro i
rischi microbiologici. Prima dello smaltimento, sterilizzare in autoclave le provette preparate, i
contenitori dei campioni e gli altri materiali contaminati.
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BD BBL Urea Agar Base Concentrate 10X, confezione da 10 provette di misura K
Attenzione
H315 Provoca irritazione cutanea. H319 Provoca grave irritazione oculare.
P103 Leggere l’etichetta prima dell’uso. P264 Lavarsi accuratamente dopo l’uso. P280 Indossare
guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso. P305+P351+P338 IN CASO DI CONTATTO
CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a
contatto se è agevole farlo. Continuare a sciacquare.
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Istruzioni per la conservazione
Al ricevimento, conservare le provette al buio a 2 – 8 °C. Evitare congelamento e surriscaldamento.
Aprire soltanto al momento dell’uso. I terreni in provetta conservati come indicato sull'etichetta sino
al momento dell’uso, possono essere inoculati fino alla data di scadenza e incubati per i tempi di
incubazione raccomandati. Ridurre al minimo l’esposizione alla luce.
Deterioramento del prodotto
Non usare le provette se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore,
essiccamento o altri segni di deterioramento.
VIII RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI
I campioni idonei per coltura possono essere manipolati con varie tecniche. Per informazioni
4,5
dettagliate, consultare la documentazione appropriata. Raccogliere i campioni prima della
somministrazione di antibiotici. Predisporre una consegna tempestiva al laboratorio.
IX PROCEDURA
Materiale fornito
BBL Urea Agar Base Concentrate 10X o
BBL Urea Agar Slants, Complete
Materiali necessari ma non forniti
Terreni di coltura accessori, reagenti, microrganismi per controllo di qualità e apparecchiature di
laboratorio necessarie.
Procedura del test
Adottare tecniche asettiche.
In caso di utilizzo di Urea Agar Base Concentrate 10X, preparare il terreno completo come
descritto nella sezione Controllo di qualità. I cristalli eventualmente formatisi nel concentrato, si
dissolvono generalmente a temperatura ambiente oppure in pochi minuti a bagnomaria a 40 °C.
Usando un inoculo di rilevante entità della crescita di una coltura pura di 18 – 24 h (TSI Agar o
altro terreno adatto), strisciare avanti e indietro su tutta la superficie slant. Non penetrare nel
fondo in quanto serve da controllo del colore. Incubare le provette – con i tappi non
completamente avvitati – a 35 ± 2 °C in incubatore o bagnomaria. Osservare le reazioni dopo
2, 4, 6 e 24 h e successivamente ogni giorno, per un totale di 6 giorni. Potrebbero essere necessari
periodi di incubazione ancora più lunghi.
Controllo di qualità a cura dell’utente
Vedere “Procedure di controllo di qualità”.
Ciascun lotto di terreno è stato testato utilizzando organismi per il controllo di qualità appropriati,
e tali test soddisfano le specifiche di prodotto e gli standard CLSI, ove opportuno. Come di
consueto, i test di controllo qualità devono essere eseguiti in ottemperanza alle normative locali,
statali, federali o nazionali vigenti, nonché ai requisiti di certificazione e/o alle procedure standard
di controllo di qualità del laboratorio specifico.
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RISULTATI
La produzione di ureasi è indicata dallo sviluppo di un colore rosa-rosso intenso (rosso-violetto)
sullo slant. Il colore può penetrare nell’agar (fondo); il grado di colore indica la velocità di idrolisi
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dell’urea.
L’assenza di variazione cromatica indica una reazione negativa; il terreno agar resta giallo
pallido – color cuoio.
Per un elenco di microrganismi ureasi-positivi, consultare la documentazione appropriata.5,7,8
XI LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA
1. Questi terreni per test dell’urea si basano sulla dimostrazione di alcalinità e pertanto non sono
specifici per l’ureasi. L’utilizzo di peptoni, soprattutto in slant agar (es., da Pseudomonas
aeruginosa) o altre proteine nel terreno può portare il pH all’alcalinità a causa dell’idrolisi
proteica e del rilascio di residui aminoacidici eccessivi, con conseguente sviluppo di reazioni
2
falsamente positive.
2. Su Urea Agar, Proteeae ureasi-positive trasformano il terreno in alcalino subito dopo l’inoculo.
Per essere considerati validi per la rilevazione di Proteeae, i risultati devono essere letti entro le
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prime 6 h di incubazione. Citrobacter freundii e Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae
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possono produrre reazioni positive entro 24 – 48 h.
3. Ai fini dell’identificazione, i microrganismi devono essere in coltura pura. Per l’identificazione
finale, è necessario eseguire test morfologici, biochimici e/o sierologici. Per informazioni
4,5,7
dettagliate e procedure raccomandate, consultare la documentazione appropriata.
XII PERFORMANCE
Kantor et al. hanno sviluppato una metodica rapida e semplificata usando un minimo di tre test e
un massimo di sette test, che i laboratori possono utilizzare routinariamente per identificare
batteri gram-negativi non fermentanti. Con questa metodica, sono stati complessivamente
identificati 229 microrganismi gram-negativi non fermentanti e 14 ceppi di riferimento. L’Urea
Agar è stato usato per differenziare Alcaligenes spp. e Pseudomonas alcaligenes da Bordetella
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bronchiseptica.
XIII DISPONIBILITÀ
N. di cat.
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221096
221097
Descrizione
BD BBL Urea Agar Base Concentrate 10X, confezione da 10 provette di misura K
BD BBL Urea Agar Slants, Complete, confezione da 10 provette di misura K
BD BBL Urea Agar Slants, Complete, scatola da 100 provette di misura K
XIV BIBLIOGRAFIA
1. Christensen, W.B. 1946. Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella
and Shigella types. J. Bacteriol. 52:461-466.
2. MacFaddin, J.F. 2000. Biochemical tests for identification of medical bacterial, 3rd ed., Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore.
3. Rustigian, R., and C.A. Stuart. 1941. Decomposition of urea by Proteus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 47:108-112.
4. Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.) 2003. Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
5. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld. 2002. Bailey & Scott’s diagnostic microbiology, 11th ed. Mosby, Inc., St. Louis.
6. Ewing, W.H. 1985. Edwards and Ewing’s identification of Enterobacteriaceae, 4th ed. Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York.
7. Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley, and S.T. Williams (ed.). 1994. Bergey’s Manual™ of determinative bacteriology, 9th ed. Williams
& Wilkins, Baltimore.
8. Farmer, J.J., III. 1999. Enterobacteriaceae: introduction and identification, p. 442-458. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and
R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
9. Kantor, L.T., S.D. Kominos, and R.B. Yee. 1975. Identification of nonfermentative gram-negative bacteria in the clinical laboratory. Am. J. Med.
Technol. 41:3-9.
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