GNR Traffic Light™ PNA FISH

Reagenti
GNR Traffic Light PNA FISH comprende i seguenti componenti del kit:
GNR Traffic Light™ PNA FISH®
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae
e Pseudomonas aeruginosa
Kit per identificazione da coltura
C
h
KT011
X
GN Fixation Solution
Soluzione di fissaggio GN
3 ml di soluzione salina con
detergente tamponata con fosfato.
GNR Traffic Light PNA
GNR Traffic Light PNA
1,5 ml di sonde PNA in soluzione di
ibridazione. Contiene il 30% di
formamide.
60x Wash Solution
Soluzione di lavaggio 60x
50 ml di soluzione salina con
detergente tamponata con Tris
Mounting Medium
Soluzione di montaggio
3 ml di inibitore fotosbiancante in
glicerolo.
50
Precauzioni
Uso previsto
UE: per uso diagnostico in vitro.
Il GNR Traffic Light PNA FISH è un esame qualitativo e multicolore
basato sulla ibridazione dell’acido nucleico e che viene utilizzato per
l’identificazione di Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e
Pseudomonas aeruginosa su vetrini per microscopia preparati da
emocolture positive o da campioni di urina contenenti bastoncini (Gram
negativi) osservati da colorazione di Gram o altre colorazioni
microbiologiche.
Esclusivamente per uso professionale da parte di personale addestrato
nelle tecniche di laboratorio e con esperienza nella microscopia a
fluorescenza.
Precauzioni di sicurezza
Il GNR Traffic Light PNA contiene il 30% di formamide. Può essere
nocivo per i nascituri. Tenere lontano dalla portata dei bambini. Evitare
l’esposizione - Richiedere istruzioni speciali prima dell’uso. La scheda
tecnica di sicurezza è disponibile su richiesta. La formamide non è
pericolosa una volta diluita nella soluzione di lavaggio e durante la fase
di lavaggio.
Il trasferimento a sottocoltura delle emocolture positive è necessario per
il recupero degli organismi per i test di sensibilità e/o per la
differenziazione di crescita mista.
L’esame GNR Traffic Light PNA FISH è indicato per l’utilizzo come
ausilio nella diagnosi di batteriemie da E. coli, K. pneumoniae e P.
aeruginosa e di infezioni del tratto urinario.
Stabilire le precauzioni contro i rischi biologici.
Non mangiare, bere, fumare, usare cosmetici, conservare o preparare
cibo nell’area di lavoro.
UE: per uso diagnostico in vitro.
Smaltire i reagenti in conformità alle normative nazionali, regionali e
locali.
Riepilogo e spiegazione
Precauzioni tecniche
I reagenti non devono essere utilizzati dopo le date di scadenza riportate
sulle etichette.
E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa sono riconosciute come le cause
di batteriemie e infezioni del tratto urinario (IVU) acquisite sia in ambito
comunitario sia nosocomiale.
I reagenti sono forniti in concentrazioni fisse. L’alterazione o la
conservazione dei reagenti in modo non conforme alle condizioni
raccomandate (descritte in “Conservazione dei componenti del kit”) può
influire sul rendimento dell’esame.
L’identificazione di E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa si basa
solitamente sull’identificazione presuntiva di bastoncini Gram negativi
seguita da un’identificazione finale dopo sottocoltura e analisi biochimica
(1).
Evitare la contaminazione microbiologica dei reagenti.
Il GNR Traffic Light PNA FISH è un metodo di ibridizzazione a
fluorescenza in situ (FISH, Fluorescence In Situ Hybridization)
multicolore che utilizza sonde a PNA che vanno a ibridarsi con le
corrispondenti sequenze di RNA ribosomiale di E. coli, K. pneumoniae e
P. aeruginosa. Il test consente di identificare rapidamente E. coli, K.
pneumoniae e P. aeruginosa su vetrini per microscopia preparati da
emocolture positive e da campioni di urina.
Evitare la contaminazione crociata dei campioni e dei reagenti, in quanto
questo potrebbe causare risultati erronei.
Non lasciare che la punta del flacone contagocce tocchi la superficie del
vetrino, in quanto ciò potrebbe provocare la contaminazione crociata del
materiale tra i vetrini o la contaminazione del reagente.
Non usare filtri diversi dal filtro a doppia banda (AC003).
Principio della procedura
Non usare vetrini per microscopia diversi da quelli raccomandati (AC001).
Una miscela di sonde a PNA specifiche per E. coli marcate con
fluoresceina, sonde a PNA specifiche per K. pneumoniae marcate con
fluoresceina e tetrametilrodamina e sonde a PNA specifiche per P.
aeruginosa marcate con Texas Red, viene aggiunta a un vetrino per
microscopia preparato da una coltura. L’ibridazione viene effettuata a
55°C per 30 min. L’ibridazione è seguita da un lavaggio di postibridazione in acqua a 55°C per la rimozione dei coprioggetti, seguito a
sua volta da un lavaggio in soluzione di lavaggio a 55°C per 30 minuti.
Infine al vetrino viene aggiunta la soluzione di montaggio e viene quindi
esaminato mediante microscopia a fluorescenza.
È importante che il microscopio funzioni correttamente. Assicurarsi che
la lampadina del microscopio sia regolata correttamente e che non abbia
un tempo operativo superiore a quello raccomandato dalla casa
costruttrice.
Conservazione e preparazione dei componenti del kit
Per garantire una prestazione ottimale del kit è importante che i
componenti siano conservati e preparati secondo le istruzioni seguenti:
1
Conservazione
Conservare i componenti del kit a 2-8°C. Portare i componenti del kit a
temperatura ambiente prima di usarli e riportarli a 2-8°C dopo l’uso.
 Imbuti cytospin e citocentrifuga (solo per i campioni di urina).
Procedura d’esame
Tutte le fasi avvengono a temperatura ambiente, se non diversamente
indicato.
Preparazione del lavaggio in acqua
Mettere 200 ml di acqua distillata o deionizzata nella vaschetta di
colorazione e iniziare il riscaldamento a bagnomaria a 55°C.
Prima di iniziare la procedura d’esame, preparare la soluzione di
lavaggio alla concentrazione richiesta nella vaschetta di colorazione,
aggiungere il coperchio e iniziare il preriscaldamento a bagnomaria
(55 ± 1°C). Non riutilizzare la soluzione di lavaggio, ma prepararne una
nuova alla concentrazione richiesta per ogni ciclo. In una seconda
vaschetta di colorazione coperta posizionare 200 ml di acqua e
preriscaldare allo stesso modo. Per la dimensione della vaschetta di
colorazione e il volume della soluzione di lavaggio, consultare le note
procedurali.
Preparazione della soluzione di lavaggio
Preparare la soluzione di lavaggio alla concentrazione richiesta,
aggiungendo 4 ml di soluzione di lavaggio 60x, seguiti da 240 ml di
acqua fresca deionizzata o distillata direttamente nella vaschetta di
colorazione. Preparare una nuova soluzione di lavaggio alla
concentrazione richiesta per ogni sessione. Conservare il concentrato
rimanente a 2-8°C.
Preparazione della soluzione di montaggio
La soluzione di montaggio dovrebbe essere lasciata a temperatura
ambiente per almeno 5 min. prima dell’uso.
Ibridazione
Raccolta e preparazione dei campioni
 Aggiungere il coprioggetto. Evitare le bolle d’aria.
 Aggiungere una goccia di GNR Traffic Light PNA al pozzetto sul
vetrino per microscopia.
 Incubare per 30 ± 5 min. a 55 ± 1°C.
Preparazione dei vetrini da emocoltura
Lavaggio in acqua calda
 Collocare una goccia di soluzione di fissaggio GN in un pozzetto sul
vetrino da microscopia.
 Trasferire i vetrini nell’apposito cestello
 Trasferire 10 µl o una piccola goccia da un ago di ventilazione di
coltura alla soluzione di fissaggio GN e miscelare delicatamente per
emulsionare.
 Immergere il cestello dei vetrini nell’acqua preriscaldata a 55°C per ≤
1 min. e rimuovere il coprioggetti con attenzione. Spesso i coprioggetti
scivolano via agitando delicatamente il vetrino nella soluzione di
lavaggio. Talvolta i coprioggetti devono essere rimossi con le pinze.
 Fissare i vetrini riscaldandoli per 20 min. a 55-80°C o lasciandoli
asciugare e fissarli mediante metanolo o fiamma.
Lavaggio a stringenza controllata
Preparazione dei vetrini da urina
 Trasferire i vetrini dal cestello alla soluzione di lavaggio preriscaldata a
55°C.
 Aggiungere 250 μl di urina estemporanea (<24 ore) nell’imbuto della
centrifuga cytospin collegato al vetrino per microscopia.
 Incubare per 30 ± 5 min. a 55 ± 1°C.
 Citocentrifugare a 2.000 giri/min. per 5 min. (circa 450 g).
 Lasciare asciugare il vetrino all’aria.
 Aggiungere una goccia di soluzione di fissaggio.
Montaggio
 Fissare i vetrini riscaldandoli per 20 min. a 55-80°C.
 Aggiungere una goccia di soluzione di montaggio al vetrino.
Procedura del test
 Aggiungere il coprioggetto. Evitare le bolle d’aria.
 Esaminare il vetrino entro 2 ore, come descritto di seguito.
Materiale fornito
GNR Traffic Light™ PNA FISH®
Non esporre i vetrini alla luce solare diretta o ad altre sorgenti di luce, in
quanto ciò può provocare l’indebolimento della fluorescenza.
KT011
Ogni kit contiene materiale sufficiente per 50 test. I reagenti sono forniti
pronti per l’uso, tranne dove espressamente indicato diversamente. La
data di scadenza del kit è indicata sull’etichetta della scatola esterna.
Controllo della qualità
Il materiale di controllo deve essere testato secondo le linee guida o i
requisiti delle normative locali, regionali e/o nazionali o delle
organizzazioni accreditate, inclusi i controlli cresciuti in mezzi liquidi.
Materiale necessario e disponibile da AdvanDx
Microscope Slides Vetrini per microscopio a 1 pozzetto
AC001
Coverslips Coprioggetti, 22 x 22 mm, spessore: 0,15 mm
AC002
Dual Band Filter Filtro a doppia banda
AC003
Staining Dish
AC004
Vaschetta di colorazione con coperchio e supporto per vetrino
PNA FISH Workstation
Il controllo della qualità per testare la fluorescenza deve essere eseguito
a ogni test. I risultati del CdQ dovrebbero consentire il monitoraggio delle
condizioni di test adeguate, specialmente per quanto riguarda la
stringenza dell’ibridazione e la penetrazione della parete cellulare,
poiché la metodologia PNA è concepita per ottimizzare la penetrazione
nella parete cellulare più facilmente.
Piastra riscaldante per vetrini (55 ± 1°C) AC005
Water Bath Bagnomaria (55 ± 1°C).
AC006
GNR Traffic Control Slide Vetrino di controllo GNR Traffic Light
CS011
Utilizzare il vetrino di controllo AdvanDx GNR Traffic (CS011) oppure
preparare dei vetrini da colture liquide di laboratorio o da ceppi di
riferimento di E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa, come controllo
positivo su vetrini separati oppure mescolati su un solo vetrino, e
Klebsiella oxytoca come controllo negativo, come già descritto alla voce
“Raccolta e preparazione dei campioni”. I vetrini possono essere
conservati fino a 1 mese a temperatura ambiente. Non esporre i vetrini a
elevata umidità in quanto ciò causerebbe la formazione di cristalli, cosa
che comporta una ridotta durata di conservazione dei vetrini preparati
per il controllo qualità o conservati in condizioni essiccate.
Contiene un controllo positivo preparato da coltura liquida a base di
E. coli ATCC n. 35218, K. pneumoniae ATCC n. 13882 e P. aeruginosa
ATCC n. 10145 e un controllo negativo preparato da coltura liquida a
base di K. oxytoca ATCC n. 43086.
Materiale necessario ma non fornito
 Acqua, deionizzata o distillata.
E. coli deve apparire in verde, P. aeruginosa deve apparire in rosso e K.
pneumoniae deve apparire in giallo, come delineato nell’interpretazione
dei risultati indicata qui di seguito.
 Microscopio a fluorescenza con obiettivo in olio da 60x o 100x.
 Olio per immersione. Deve essere conforme all’obiettivo del
microscopio e non fluorescente.
2
Note procedurali
Preparazione dei vetrini
Si raccomanda di usare lo stesso tipo di fissaggio (calore, metanolo o
fiamma) utilizzato per la colorazione di Gram.
Limitazioni
Controllo della temperatura
È importante che la temperatura della piastra riscaldante (incubatore)
per vetrino abbia raggiunto i 55°C prima di iniziare l'ibridazione e che la
soluzione di lavaggio abbia raggiunto i 55°C prima dell'immersione dei
vetrini. La temperatura deve essere controllata con un termometro, in
quanto le letture esterne della temperatura potrebbero non essere
accurate.
I risultati rossi falsi positivi possono verificarsi con Brevundimonas
diminuta, Herbaspirillum huttiense, e Acinetobacter radioresistens.
I risultati verdi falsi positivi possono verificarsi con Shigella spp.,
Escherichia albertii e Escherichia fergusonii a causa dello somiglianza di
sequenza.
I risultati gialli positivi possono verificarsi con Escherichia vulneris.
Test in parallelo mediante test PNA FISH differenti. I kit PNA FISH sono
concepiti per il test in parallelo. La soluzione di lavaggio 60x e il mezzo di
montaggio sono identici e possono essere scambiati tra loro tra un test e
l’altro. Si raccomanda di utilizzare vaschette di colorazione separate con
la soluzione di lavaggio preriscaldata per ciascun test.
Il tipo e la condizione della strumentazione usata influenzeranno l’aspetto
visivo dell’immagine ottenuta. La fluorescenza può variare in base al tipo di
microscopio impiegato, alla sorgente luminosa e al livello di rRNA nelle
cellule. Ogni laboratorio deve stabilire i propri criteri per la lettura dei
risultati, adottando controlli adeguati.
La soluzione di fissaggio GN è progettata per prestazioni ottimali
nell’individuazione di batteri Gram negativi e non deve pertanto essere
scambiata con altre soluzioni di fissaggio provenienti da altri test PNA
FISH per batteri e lieviti Gram positivi.
L’autofluorescenza verde falsa positiva può verificarsi in caso di uso di un
filtro FITC al posto del filtro a doppia banda.
I risultati falsi negativi possono verificarsi più raramente a causa di crescita
mista o per un errore nella tecnica d’esame.
Interpretazione dei risultati
Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza. Il vetrino appare
generalmente rossastro. E. coli viene identificato come bastoncini
multipli di colore verde vivo fluorescente in campi visivi multipli, P.
ferruginosa viene identificato come bastoncini multipli di colore rosso
vivo fluorescente in campi visivi multipli e K. pneumoniae è identificato
come bastoncini multipli di colore giallo vivo fluorescente in campi visivi
multipli. Gli organismi non-E. coli, K. pneumoniae, e P. aeruginosa non
appaiono fluorescenti.
L’isolamento su mezzi solidi è necessario per differenziare la crescita
mista con altri organismi.
Il prodotto non è stato validato con campioni diversi dalle emocolture e dai
campioni di urina estemporanea (< 24 ore).
Risultati previsti
Il tasso di risultati previsti combinati per E. coli, K. pneumoniae, e P.
aeruginosa da flaconi di emocoltura positivi ai bastoncini Gram negativi è
di circa il 37%, 18% e 13% rispettivamente, ma può variare a seconda
dell’istituto e della popolazione di pazienti (2). In studi clinici, il tasso di
risultati positivi per E. coli, K. pneumoniae, e P. aeruginosa da bastoncini
(Gram negativi) proveniente da campioni d’urina è stata del 62%, 19% e
19% rispettivamente.
Caratteristiche prestazionali
Studi clinici
Le prestazioni di GNR Traffic Light PNA FISH sono state validate in un
totale di 358 normali flaconi da emocoltura positiva GNR provenienti dalle
nostre cliniche negli Stati Uniti. Gli studi hanno mostrato il 100% di
sensibilità (135/135) per E. coli, , il 98,7% di sensibilità (77/78) per K.
pneumoniae e il 94,4% di sensibilità (34/36) per P. aeruginosa. La
specificità è stata del 97,5% (115/118) per flaconi di emocoltura GNR
positivi.
Esempi rappresentativi dei risultati del test con E. coli in verde (in alto a
sinistra), K. pneumoniae in giallo (in alto al centro), P. aeruginosa in
rosso (in alto a destra), di un insieme di E. coli in verde, K. Pneumoniae
in giallo e P. aeruginosa in rosso (in basso a sinistra) e di risultati
negativi (in basso al centro).
Studio
Risoluzione dei problemi
 Risultati falsi positivi del controllo e del campione possono verificarsi
in assenza del filtro a doppia banda (AC003) o in caso di
contaminazione dei campioni.
 L’autofluorescenza falsa positiva può verificarsi in caso di uso di un
filtro standard al posto del filtro a doppia banda.
Sensibilità
Sensibilità Sensibilità
Sistema di
E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa Specificità emocoltura
A
35/35
17/17
7/93
35/374
BACTEC
B
31/31
30/30
11/11
36/36
BacT/ALERT
C
48/48
28/28
8/8
29/305
BACTEC
1
2
D
21/21
2/3
8/8
15/15
VersaTREK
Totale
100%
(135/135)
95% CI
(97,8-100)
98,7%
(77/78)
95% CI
(93,1-100)
94,4%
(34/36)
95% CI
(81,3-99,3)
97,5%
(115/118)
95% CI
(92,8-99,5)
N=367
1.
2.
3.
4.
Include 4 campioni addizionati con isolati clinici di P. aeruginosa.
Un falso negativo per K. pneumoniae in una coltura mista di E. coli e K. pneumoniae.
Entrambi i falsi negativi sono stati osservati in colture miste di P. aeruginosa e K. pneumoniae.
Un falso positivo verde E. cloacae (negativo in seguito alla riesame) e un falso positivo rosso
A. baumannii.
5. Un falso positivo rosso Acinetobacter radioresistens in coltura mista con E. faecalis
 Risultati falsi negativi del controllo e del campione possono verificarsi
in assenza dei vetrini per microscopia AdvanDx (AC001) o se la
temperatura non è controllata accuratamente durante l’ibridazione e il
lavaggio.
 I risultati falsi negativi possono verificarsi più raramente e sono dovuti
a crescita mista o a un errore nella tecnica d’esame.
Le prestazioni di GNR Traffic Light PNA FISH sull’urina sono state
descritte in due studi e riassunte di seguito, con i risultati del PNA FISH
confrontati con i risultati ottenuti dalla sottocoltura e dalla successiva
identificazione tramite agar standard e piastre di agar sangue, in
concomitanza con API, Vitek 2 o con i sistemi di identificazione MicroScan.
Consultare le sezioni “Precauzioni” e “Limitazioni” nel foglietto illustrativo
o rivolgersi ad AdvanDx.
3
Studio
Sensibilità
Specificità
Sensibilità Sensibilità
E. coli K. pneumoniae P. aeruginosa
E
93,3%
(14/15)
100%
(3/3)
F
100%
(11/11)
Totale
96,2%
(25/26)
100%
(5/5)
(0/0)
100%
(8/8)
100%
(4/4)
(0/0)
100%
(8/8)
100%
(8/8)
100%
(4/4)
Metodo di
screening
dell’urina
Bibliografia
1. Baron, E.J. 1998. Processing and interpretation of blood cultures,
chap. 2.3. In: H.D. Isenberg (Ed.) Essential procedures for clinical
microbiology, ASM Press, Washington DC.
Colorazione di
Gram
Esame a
fresco
2. Karlowsky, J. A., M. E. Jone, D. C. Draghi, C. Thornsberry, D. F.
Sahm, and G. A. Volturo. 2004. Prevalence and antimicrobial
susceptibilities of bacteria isolated from blood cultures of hospitalized
patients in the United States in 2002. Ann. of Clin. Microbiol. and
Antimicrob. 3:7.
Sensibilità analitica
Il limite di rilevamento per E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa è
risultato corrispondere approssimativamente a 105 unità formanti colonie
per ml tramite le diluizioni seriali di colture positive. Ciò è coerente con la
sensibilità analitica delle tecniche di colorazione basate su vetrini.
Definizioni
h
i
X
M
P
H
g
l
Specificità analitica
Il GNR Traffic Light PNA FISH è stato utilizzato per testare un totale di 138
microrganismi compresi 119 ceppi Gram negativi, 13 organismi Gram
positivi e 6 lieviti. Tutti (19/19) i ceppi di E. coli sono risultati verdi positivi,
(15/15) K. pneumoniae sono risultati gialli positivi, (20/20) P. aeruginosa
sono risultati rossi positivi e altri 56 bastoncini Gram negativi sono risultati
negativi. Tre Shigella spp. (sierogruppo A, B e D), un Escherichia albertii e
un Escherichia fergusonii hanno avuto una reazione crociata a creare un
segnale verde. Un Brevundimonas diminuta, un Herbaspirillum huttiense e
un Acinetobacter radioresistens hanno avuto una reazione crociata a
creare un segnale rosso. Un Escherichia vulneris ha avuto una reazione
crociata a creare un segnale giallo. Il GNR Traffic Light PNA FISH è stato
inoltre testato su 13 ceppi di batteri Gram positivi e su 6 specie di lieviti,
ognuno dei quali ha dato risultati negativi.
Riproducibilità
Sul GNR Traffic Light PNA FISH è stato analizzato un pannello di 19 ceppi
su 14 vetrini in triplicato in tre giorni separati in tre diverse cliniche.
Sommario dei risultati di riproducibilità per sito nei 3 giorni
Sito 1
Concordanza in positivo
sul verde
Concordanza in positivo
sul rosso
Concordanza in positivo
sul giallo
Concordanza in negativo
Concordanza sul totale
Controllo
positivo/negativo
Sito 2
Sito 3
45/45
45/45
1
43/45
45/45
45/45
45/45
45/45
45/45
45/45
36/36
2
36/36
171/171 171/171
(100%) (100%)
9/9
9/9
33/36
Concordanza
sul totale
133/135
(98,5%)
135/135
(100%)
135/135
(100%)
98,7%
(77/78)
166/171
(97,1)
508/513
(99,0%)
9/9
27/27
Codice prodotto/numero di catalogo
Consultare le istruzioni per l’uso
Contenuto sufficiente per <n> test
Produttore
Rappresentante autorizzato
Usare entro
Codice lotto
Limiti della temperatura di conservazione
Consulenza tecnica e assistenza clienti
Per qualsiasi richiesta contattare AdvanDx o il proprio distributore locale:
Neomed s.r.l. – Via G. Di Vittorio, 2/a – 20017 Mazzo di Rho (Milano) –
Italia
Tel. 02 93900652 – Fax 02 93900968
e-mail : [email protected]
1. Un E. coli ha dato un falso colore rosso e uno ha dato un falso colore giallo
2. Un vetrino negativo ha prodotto risultati falsi verdi, rossi e gialli
M
P
Sommario dei risultati di riproducibilità per giorno nei 3 siti
AdvanDx, Inc.
400 TradeCenter
Woburn, MA 01801
USA
AdvanDx A/S
Bygstubben 11
2950 Vedbæk
Danimarca
Tel.:
Fax:
Tel.:
Fax:
Giorno 1Giorno 2 Giorno 3
Concordanza in positivo
sul verde
Concordanza in positivo
sul rosso
Concordanza in positivo
sul giallo
Concordanza in negativo
Concordanza sul totale
Concordanza in
positivo/negativo
45/45
45/45
43/451
45/45
45/45
45/45
45/45
45/45
45/45
36/36
36/36
33/362
171/171 171/171
(100%) (100%)
9/9
9/9
Concordanza
sul totale
133/135
(98,5%)
135/135
(100%)
135/135
(100%)
98,7%
(77/78)
166/171
(97,1%)
508/513
(99,0%)
9/9
27/27
+1 781 376 0009
+1 781 376 0111
+45 45 16 07 99
+45 45 16 07 98
[email protected]
www.PNA-FISH.com
Prodotto su licenza di Boston Probes, Inc.
Il prodotto non deve essere usato per citochimica umana basata su vetrini, citogenetica
oncologica basata su ISH e citometria a flusso.
14 October 2011
PN2013A
L’acquisto di questo kit consente l’utilizzo dello stesso su licenza ai sensi dei seguenti numeri di
brevetto: US 5,985,563; US 5,888,733; US 6,395,474; US 6,357,163; US 5,539,082;
US 7,223,833; EP 862,650; EP 804,456
1. Un E. coli ha dato un falso colore rosso e uno ha dato un falso colore giallo
2. Un vetrino negativo ha prodotto risultati falsi verdi, rossi e gialli
4