biologia cellulare e biotecnologie vegetali
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BIOLOGIA CELLULARE E BIOTECNOLOGIE VEGETALI cap00.indd I 17/05/2011 11.15.49 Dello stesso Editore: ARIENTI – Le basi molecolari della nutrizione BARNES/HUGHES – Ecologia marina BATCHELET – Matematica per biologi BELLI – Patologia vegetale BREWER – Principi di ecologia BROWN – Genetica molecolare BRUNI/NICOLETTI – Dizionario di erboristeria e di fitoterapia CABRAS/MARTELLI – Chimica degli alimenti CASTINO/ROLETTO – Statistica applicata CHIARELLI – Dalla Natura alla Cultura: Principi di antropologia biologica e culturale CHRISPEELS/SADAVA – Biologia vegetale applicata CONNER/HARTL – Elementi di genetica ecologica COOPER/HAUSMAN – La cellula: un approccio molecolare COZZANI/DAINESE – Biochimica degli alimenti e della nutrizione CROMER – Fisica per medicina, farmacia e scienze biologiche D’ALESCIO – Il laboratorio di chimica organica DE CICCO/BERTOLINI/SALERNO – Patologia post-raccolta dei prodotti vegetali DEL GOBBO – Immunologia DEWICK – Chimica, biosintesi e bioattività delle sostanze naturali D’ISCHIA – La chimica organica in laboratorio DOLARA – Tossicologia generale e ambientale DURANTI/PAGANI – Enzimologia EVANGELISTI/RESTANI – Prodotti dietetici FANTONI/BOZZARO/DEL SAL/FERRARI/TRIPODI – Biologia cellulare e Genetica FESSENDEN/FESSENDEN – Chimica organica FINESCHI – Catalogo tassonomico delle rose del Roseto botanico “Carla Fineschi” FOYE’S – Principi di chimica farmaceutica FRANCHINI/CALZOLARI – L’educazione alimentare nell’età evolutiva FREEMAN – Atlante di anatomia degli invertebrati FREIFELDER – Biologia molecolare: l’essenziale FREUND/WILSON – Metodi statistici GALLI/CORSINI/MARINOVICH – Tossicologia GALZIGNA – Elementi di enzimologia GARRETT/GRISHAM – Principi di biochimica GASTALDO – Compendio della flora officinale italiana GIGLIOTTI/VERGA – Biotecnologie alimentari GIUDICE/AUGUSTI-TOCCO/CAMPANELLA – Biologia dello sviluppo GIUNCHEDI/CONTI/GALLITELLI/MARTELLI – Elementi di virologia vegetale GRASSI/LABRA/SALA – Introduzione alla biodiversità del mondo vegetale HARRISON – Biologia umana HOGNESS – Analisi qualitativa JANEWAY/TRAVERS/WALPORT/SHLOMCHIK – Immunobiologia JAWETZ/MELNICK/ADELBERG – Microbiologia medica JUDD et al.– Botanica sistematica + CD JUNQUEIRA/CARNEIRO – Istologia KEISLER – Elementi di analisi matematica KOLTHOFF – Clinica analitica quantitativa LEPORATTI/FODDAI/TOMASSINI – Testo-atlante di anatomia vegetale e delle piante officinali MADER – Biologia l’essenziale MAFFEI – Biochimica vegetale cap00.indd II MARZONA – Chimica delle fermentazioni e microbiologia industriale MASTERTON/HURLEY – Chimica: Principi e reazioni MAUGINI/MALECI BINI/MARIOTTI LIPPI – Manuale di botanica farmaceutica MCKNIGHT/HESS – Geografia fisica MCMURRY – Chimica organica MCNEILL/ALEXANDER – Gli invertebrati MEZZOGIORNO/MEZZOGIORNO – Compendio di anatomia umana MICHELIN LAUSAROT/VAGLIO – Stechiometria per chimica generale MILLER – Ambiente, Risorse, Sostenibilità MINELLI/DEL GRANDE – Anatomia comparata dei vertebrati MITA/FEROCI – Fisica biomedica MONESI – Istologia NIELSEN/FORLANI – Gli erbicidi ODUM – Fondamenti di ecologia PAGANI/ABBOTTO – Chimica eterociclica PASQUA/ABBATE/FORNI – Botanica generale e diversità vegetale PETRUCCI/HARWOOD/HERRING – Chimica generale PILATO – Guida pratica per il riconoscimento dei gruppi animali PIPKIN – Geologia ambientale QUADERNI DI BIOCHIMICA QUADERNI DI BIOLOGIA VEGETALE Serie Verde: SALA/CELLA – Colture di cellule vegetali LOVISOLO et al. – Le infezioni da virus nelle piante BENNICI – Lo sviluppo nei vegetali superiori RIGANO – Ciclo biologico dell’azoto GAVAZZI/SALAMINI – Mutagenesi e miglioramento delle piante coltivate BALDACCI – La diagnosi delle malattie delle piante ALPI et al. – Ormoni delle piante e fitoregolatori sintetici BONFANTE/GIOVANNETTI – Le micorizze VERONA – Unità biologiche individuali come biocenosi NUTI – La fissazione biologica dell’azoto GAVAZZI – La genetica dei pigmenti nelle piante PACINI/FRANCHI – Il polline: biologia e applicazioni RANALLI – Miglioramento della patata NIELSEN/FORLANI – Gli erbicidi RAVEN/JOHNSON/MASON/LOSOS/SINGER – Biologia RHOADES/PFLANZER – Fisiologia generale e umana RIGHETTO – L’ecosistema urbano RINALLO – Botanica delle piante alimentari ROHEN/YOCOCHI/LÜTJEN-DRECOLL – Atlante a colori di anatomia umana descrittiva e topografica RUPPERT/BARNES – Zoologia: gli invertebrati SAVELLI/BRUNO – Analisi chimico farmaceutica SENATORE – Biologia e botanica farmaceutica SICA/ZOLLO – Chimica dei composti eterociclici farmacologicamente attivi SILIPRANDI/TETTAMANTI – Biochimica medica SLOWINSKI – Laboratorio di chimica TAIZ/ZIEGER – Fisiologia vegetale WHITTEN/DAVIS/PECK/STANLEY – Chimica generale WILSON/BOSSERT – Introduzione alla biologia delle popolazioni ZIEGLER – Conoscenze attuali in nutrizione 17/05/2011 11.16.26 GABRIELLA PASQUA BIOLOGIA CELLULARE E BIOTECNOLOGIE VEGETALI AUTORI S. COZZOLINO, G.P. DI SANSEBASTIANO, C. FORNI, A. GENRE, L. LANFRANCO, A. MICCHELI, G. PASQUA, L. TRAINOTTI, A. VALLETTA cap00.indd III 17/05/2011 11.16.26 Tutti i diritti sono riservati È VIETATA PER LEGGE LA RIPRODUZIONE IN FOTOCOPIA E IN QUALSIASI ALTRA FORMA È vietato riprodurre, archiviare in un sistema di riproduzione o trasmettere sotto qualsiasi forma o con qualsiasi mezzo elettronico, meccanico, per fotocopia, registrazione o altro, qualsiasi parte di questa pubblicazione senza autorizzazione scritta dell’Editore. Ogni violazione sarà perseguita secondo le leggi civili e penali. ISBN 978-88-299-2124-9 Stampato in Italia © 2011, by Piccin Nuova Libraria S.p.A., Padova www.piccin.it cap00.indd IV 17/05/2011 11.16.26 AUTORI Prof. Salvatore Cozzolino Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale Complesso Universitario di Monte S. Angelo Università di Napoli “Federico II” Dr. Gian Pietro Di Sansebastiano Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e Ambientali Università del Salento Prof.ssa Luisa Lanfranco Dipartimento di Biologia Vegetale Università di Torino Dr. Alfredo Miccheli Dipartimento di Chimica Università di Roma “Sapienza” Prof.ssa Gabriella Pasqua Dipartimento di Biologia Ambientale Università di Roma “Sapienza” Prof.ssa Cinzia Forni Dipartimento di Biologia Università di Roma “Tor Vergata” Prof. Livio Trainotti Dipartimento di Biologia Università di Padova Dr. Andrea Genre Dipartimento di Biologia Vegetale Università di Torino Dr. Alessio Valletta Dipartimento di Biologia Ambientale Università di Roma “Sapienza” cap00.indd V 17/05/2011 11.16.26 cap00.indd VI 17/05/2011 11.16.26 PREFAZIONE Il testo si propone di approfondire lo studio dell’organizzazione strutturale e funzionale della cellula vegetale, di cui sono state poste le basi nel corso di Botanica Generale e di illustrare le potenzialità biotecnologiche di cellule, tessuti ed organismi vegetali. Il testo è stato scritto grazie all’esperienza degli autori stessi nei campi della Biologia Cellulare, della Biochimica e delle Biotecnologie Vegetali e sulla base delle più recenti acquisizioni pubblicate su riviste internazionali e monografie di rilievo. Il testo è rivolto principalmente agli studenti dei corsi di laurea in Biologia, Biotecnologie ed Agraria ed i contenuti sono stati pensati per rispondere alle esigenze dei nuovi ordinamenti didattici; non solo per fornire gli strumenti utili a superare gli esami, ma anche per stimolare la curiosità in campi in rapida e costante evoluzione. Alla fine di ogni capitolo sono state indicate alcune letture di approfondimento che si possono trovare facilmente nel web ed ogni docente che adotterà questo testo potrà stimolare gli studenti a cercare nuovi articoli per restare aggiornati. Il libro è diviso in quattro parti: la prima e la seconda trattano della Biologia Cellulare Vegetale che, grazie all’apporto di nuove tecnologie ed anche alla luce di tutte le nuove conoscenze derivanti dalle scienze “omiche”, ha fatto passi da gigante. Questo ha contribuito ad una migliore comprensione dei processi biologici, con una visione integrata dell’organismo, come un sistema complesso, portan- cap00.indd VII do alla nascita della “Biologia dei Sistemi”. Inoltre lo studio delle cellule staminali in campo animale ha fatto emergere grande attenzione e prospettive anche in campo vegetale, precedentemente relegato a pochi specialisti. Nella terza e quarta parte vengono descritti i principali sistemi sperimentali e le tecniche di studio della biologia cellulare, classiche e innovative, con l’obiettivo di far comprendere le profonde e molteplici connessioni tra ricerca di base ed applicata. La realizzazione di questo testo si deve ad un gruppo di giovani docenti e ricercatori della Biologia Vegetale italiana, altamente considerati nel mondo scientifico internazionale, con i quali ho avuto il piacere di collaborare perché entusiasti del loro lavoro, e che hanno trattato i diversi argomenti, spesso complessi, in modo esauriente ed aggiornato. Il testo è corredato di un’ampia iconografia a colori con immagini e schemi originali che, grazie anche al prezioso aiuto dell’illustratore Marco Marzola, possono rendere lo studio più attraente. Vorrei rivolgere un grazie particolare all’Editore Dr. Massimo Piccin che mi ha stimolato a scrivere questo testo, dopo il successo che ha riscosso nei diversi atenei italiani il libro di Botanica Generale e Diversità Vegetale, mettendomi a disposizione il suo prezioso staff che ha collaborato con grande competenza e pazienza. GABRIELLA PASQUA 17/05/2011 11.16.26 cap00.indd VIII 17/05/2011 11.16.26 INDICE GENERALE PARTE PRIMA LA CELLULA VEGETALE 1 • Lo studio della cellula vegetale . . . . . . . 3 A. Genre, G.P. Di Sansebastiano 1.1 La cellula vegetale come massima espressione della complessità degli eucarioti. . 3 1.1.1 Dinamicità della cellula vegetale . . . . . . . . . 4 1.2 Mitocondri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.3 Microcorpi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.4 La biologia della cellula vegetale come modello per la comprensione della cellula umana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.4.1 Segnali legati alla luce e ciclo circadiano. . . 10 1.4.2 Immunità innata e recettori intracellulari . . 11 1.4.3 Proteine Argonauta e silenziamento genico. . 11 1.4.4 Scoperta di nuovi meccanismi molecolari e nuove potenzialità sperimentali. . . . . . . . . . 11 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2 • Il nucleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 S. Cozzolino 2.1 Organizzazione generale del nucleo e del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1.1 Involucro nucleare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.1.2 Scambi nucleo-citoplasma . . . . . . . . . . . . . 14 2.1.3 DNA e cromosomi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.4 Proteine istoniche e non istoniche . . . . . . . 17 2.1.5 Controllo epigenetico della trascrizione: l’imprinting genomico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2 Il ciclo cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2.1 Ciclo cellulare mitotico. . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2.2 Regolazione del ciclo cellulare . . . . . . . . . . 20 2.2.3 Divisione cellulare: mitosi e meiosi . . . . . . 21 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3 • Il genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 L. Lanfranco 3.1 Il genoma nucleare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.1.1 Progetti genoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 cap00.indd IX 3.2 Il DNA mitocondriale: origine ed evoluzione, organizzazione e contenuto . . . . . . . . . . . . . . 30 3.2.1 Ricombinazione ed eteroplasmia . . . . . . . . 33 3.2.2 Sterilità maschile citoplasmatica . . . . . . . . 34 3.3 Il DNA plastidiale: origine ed evoluzione, organizzazione e contenuto . . . . . . . . . . . . . . 35 3.4 Il trasferimento di DNA dagli organelli al nucleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.5 L’espressione genica negli organelli . . . . . . . 40 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 4 • Il sistema di endomembrane . . . . . . . 43 G.P. Di Sansebastiano 4.1 Il Reticolo Endoplasmico . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.1.1 Reticolo Endoplasmico Rugoso . . . . . . . . . 46 4.1.2 Traslocazione e maturazione delle proteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.1.3 Reticolo Endoplasmico Liscio. . . . . . . . . . . 47 4.1.4 Altri domini funzionali del reticolo endoplasmico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.2 L’apparato di Golgi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.1 Matrice del Golgi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.2 Funzioni dell’apparato di Golgi . . . . . . . . . 50 4.3 Il Trans Golgi Network e l’endocitosi . . . . . . 51 4.4 Esocitosi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.5 Maturazione delle membrane attraverso variazioni della loro composizione lipidica e proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.6 Trasporto vescicolare . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.7 Determinanti della specificità nel traffico vescicolare: SNARE e Rab. . . . . . . . . . . . . . . 55 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 5 • I vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 G.P. Di Sansebastiano, C. Forni 5.1 Biogenesi dei vacuoli e organizzazione del complesso vacuolare. . . . . . . . . . . . . . . . . 59 5.2 Il succo vacuolare. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 5.2.1 Meccanismi di accumulo dei flavonoidi nei vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 17/05/2011 11.16.27 X 5.3 Proteine intrinseche del tonoplasto . . . . . . . . 64 5.4 Acidificazione dei compartimenti endomembranosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 5.5 Crescita per distensione, turgore e movimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 5.6 Accumulo e degradazione delle proteine . . . . 66 5.6.1 Trasporto delle proteine solubili verso i vacuoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 5.6.2 VSD sequenza specifici e loro recettori. . . . 67 5.6.3 VSD C-terminali e i loro recettori. . . . . . . . 67 5.6.4 VSD influenzati dalla struttura fisica della proteina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 5.6.5 Compartimento pre-vacuolare . . . . . . . . . . 69 5.6.6 Trasporto alternativo al vacuolo . . . . . . . . 69 5.7 Potenziale biotecnologico . . . . . . . . . . . . . . . 69 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . . 70 6 • Il citoscheletro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 A. Genre 6.1 Le componenti del citoscheletro . . . . . . . . . . 71 6.1.1 Microtubuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 6.1.2 Microfilamenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 6.1.3 Filamenti intermedi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 6.1.4 Proteine associate al citoscheletro . . . . . . . 78 6.2 Il citoscheletro nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 6.2.1 Il citoscheletro durante il ciclo mitotico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 6.3 La regolazione del citoscheletro . . . . . . . . . . 85 6.4 Il citoscheletro nelle interazioni tra piante e microrganismi . . . . . . . . . . . . . . . 86 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 7 • La parete cellulare. . . . . . . . . . . . . . . . 89 L. Trainotti 7.1 I polimeri della parete . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 7.1.1 Cellulosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 7.1.2 Emicellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 7.1.3 Pectine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 7.1.4 Proteine strutturali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 7.1.5 Lignina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 7.1.6 Acqua e altre molecole . . . . . . . . . . . . . . . . 97 7.2 La biosintesi dei polimeri di parete . . . . . . . . 98 7.2.1 Biosintesi della cellulosa . . . . . . . . . . . . . . 98 7.2.2 Biosintesi dei polimeri di matrice . . . . . . . 100 7.2.3 Biosintesi della lignina e degli altri composti fenolici. . . . . . . . . . . . 102 7.2.4 Assemblaggio dei componenti della parete. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 7.3 La struttura della parete . . . . . . . . . . . . . . . . 103 cap00.indd X INDICE GENERALE 7.3.1 Lamella mediana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 7.3.2 Parete primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 7.3.3 Parete secondaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 7.4 Ruolo della parete nella crescita e nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . 104 7.4.1 Divisione ed espansione cellulare e loro controllo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 7.4.2 Modificazioni della parete nel differenziamento cellulare . . . . . . . . . . . 107 7.4.3 Separazione cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . 109 7.4.4 Plasmodesmi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 7.5 Le funzioni della parete . . . . . . . . . . . . . . . . 111 7.5.1 Trasporto apoplastico e simplastico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 113 8 • I plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 G. Pasqua 8.1 Proplastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 8.2 Biogenesi e differenziamento dei plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 8.2.1 Divisione dei plastidi . . . . . . . . . . . . . . . . 117 8.2.2 Stromuli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 8.3 Morfologia, struttura e funzione dei differenti tipi di plastidi . . . . . . . . . . . . . 119 8.3.1 Cloroplasti e pigmenti fotosintetici. . . . . . 119 8.3.2 Interazioni tra DNA nucleare e plastidiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 8.3.3 Cromoplasti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 8.3.4 Ezioplasti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 8.3.5 Leucoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 8.3.6 Gerontoplasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 8.4 Origine evolutiva dei plastidi . . . . . . . . . . . . 129 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 130 9 • La comunicazione cellulare. . . . . . . . 131 A. Genre, L. Lanfranco 9.1 I recettori di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . 131 9.2 La segnalazione mediata da endosomi. . . . . 135 9.2.1 Endocitosi dei recettori di membrana. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 9.2.2 Endosomi come piattaforme citoplasmatiche di segnalazione. . . . . . . . . . 136 9.3 Le MAP chinasi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 9.4 Il ruolo del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 9.4.1 Generazione del segnale . . . . . . . . . . . . . . 140 9.4.2 Decodifica del segnale . . . . . . . . . . . . . . . 141 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 143 17/05/2011 11.16.27 XI INDICE GENERALE PARTE SECONDA CRESCITA E DIFFERENZIAMENTO 10 • Crescita e differenziamento cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 G. Pasqua, C. Forni 10.1 Totipotenza delle cellule vegetali. . . . . . . . 147 10.2 Crescita per divisione e per distensione. . . 152 10.3 Cellule meristematiche e cellule adulte . . . 153 10.4 Controllo del destino cellulare . . . . . . . . . . 155 10.4.1 RNA, proteine che si legano al RNA e regolazione dell’espressione genica . . . . . 156 10.4.2 Ruolo dei ribosomi nello sviluppo . . . . . 160 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 161 11 • Morte cellulare programmata e necrosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 G. Pasqua 11.1 Morte cellulare programmata (apoptosi) e necrosi nei diversi organismi (animali, piante, batteri) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 11.2 Morte cellulare nelle piante: meccanismi di attivazione, geni coinvolti e modelli di studio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166 11.3 Morte cellulare programmata nei processi di sviluppo vegetativi e riproduttivi . . . . . . . 167 11.4 Morte cellulare programmata nel differenziamento degli elementi vascolari xilematici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 11.5 Morte cellulare programmata in risposta ai patogeni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 11.6 Senescenza e abscissione . . . . . . . . . . . . . . 170 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 171 PARTE TERZA TECNICHE CELLULARI E MOLECOLARI 12 • Microscopia ottica. . . . . . . . . . . . . . 175 A. Valletta 12.1 Il microscopio ottico composto . . . . . . . . . 176 12.1.1 Percorso della luce . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 12.1.2 Ingrandimento e potere di risoluzione . . 177 12.1.3 Obiettivi a secco e ad immersione . . . . . 178 12.1.4 Profondità di campo . . . . . . . . . . . . . . . . 179 12.1.5 Contrasto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 12.2 Preparazione del campione per il MO . . . . 180 12.2.1 Prelievo e fissazione . . . . . . . . . . . . . . . . 180 cap00.indd XI 12.2.2 Disidratazione, diafanizzazione, infiltrazione ed inclusione . . . . . . . . . . . . . . 181 12.2.3 Taglio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 12.2.4 Colorazione. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 12.3 Microscopio stereoscopico. . . . . . . . . . . . . 184 13 • Microscopia a fluorescenza . . . . . . 187 A. Genre 13.1 La fluorescenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 13.2 I fluorocromi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 13.2.1 Proteine fluorescenti . . . . . . . . . . . . . . . . 189 13.3 Il microscopio ottico a epifluorescenza . . . 192 13.4 Preparazione del campione . . . . . . . . . . . . 195 13.5 Applicazioni in ambito vegetale. . . . . . . . . 196 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 198 14 • Microscopia confocale . . . . . . . . . . . . 199 A. Genre 14.1 Il microscopio confocale a scansione laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 14.1.1 Laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 14.1.2 Pinhole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 14.1.3 Fotomoltiplicatori . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200 14.1.4 Che cosa significa confocale?. . . . . . . . . 201 14.2 Sezioni ottiche e ricostruzioni 3D . . . . . . . 201 14.3 Applicazioni della microscopia confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 14.3.1 FRET e FRAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 14.4 Altri tipi di microscopi confocali . . . . . . . . 207 14.4.1 Microscopio confocale a disco di Nipkow . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207 14.4.2 Microscopio confocale multifotone. . . . . 208 14.5 La microscopia confocale su campioni vegetali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 210 15 • Microscopia elettronica . . . . . . . . . . . 211 A. Valletta 15.1 Microscopia elettronica a scansione . . . . . 211 15.1.1 SEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 15.1.2 Interazione tra il fascio elettronico incidente e il campione e generazione dei segnali. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213 15.1.3 Preparazione del campione. . . . . . . . . . . 216 15.1.4 ESEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 15.2 Microscopia elettronica a trasmissione . . . 218 15.2.1 TEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218 15.2.2 Preparazione dei campioni biologici per l’osservazione al TEM . . . . . . . . . . . . . . 220 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 222 17/05/2011 11.16.27 XII 16 • Ibridazione in situ ed immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . 223 A. Valletta, C. Forni 16.1 Tipi di sonda impiegati per l’ISH e loro sintesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 16.2 Preparazione del campione per l’ISH . . . . 227 16.3 Reazione di ibridazione e lavaggi . . . . . . . 227 16.4 Rivelazione dei segnali di ibridazione . . . . 228 16.5 Controllo della specificità dell’ibridazione . 228 16.6 Ibridazione in situ fluorescente e genomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 16.7 Immunocitochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 16.7.1 Antigeni ed anticorpi. . . . . . . . . . . . . . . . 231 16.8 Immunolocalizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . 232 18.1.1 Marker. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 16.8.2 Preparazione del campione. . . . . . . . . . . 233 16.8.3 Metodi per IEM. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni . . . . . . . . . . . . . . . 235 17 • Dalla genomica alla metabolomica verso la biologia dei sistemi . . . . . . . . . . 237 S. Cozzolino, C. Forni, L. Lanfranco, A. Miccheli 17.1 Genomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 17.1.1 Metodi classici di sequenziamento del genoma: BAC e WGS . . . . . . . . . . . . . . . 237 17.1.2 Tecnologie di sequenziamento massimo di nuova generazione. . . . . . . . . . . 241 17.2 Trascrittomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 17.2.1 RT-PCR quantitativa . . . . . . . . . . . . . . . . 244 17.2.2 Array . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244 17.2.3 Sequenziamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 17.3 Profili di espressione genica: dagli organi alle cellule . . . . . . . . . . . . . . . . 249 17.4 Proteomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251 17.4.1 Separazione delle proteine . . . . . . . . . . . 252 17.4.2 Profili proteici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 17.4.3 Spettrometria di massa . . . . . . . . . . . . . . 254 17.4.4 Proteomica quantitativa . . . . . . . . . . . . . 255 17.4.5 Purificazione per affinità di complessi proteici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 17.5 Metabolomica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256 17.5.1 Metodi analitici. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 17.5.2 Analisi multivariata dei dati e modelli . . 260 17.5.3 Analisi dei flussi metabolici mediante impiego di substrati marcati con 13C: analisi degli isotopomeri . . . . . . . . . . . . . . . 261 17.5.4 Applicazioni della metabolomica nella biologia vegetale . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Letture di approfondimento e fonti delle illustrazioni. . . . . . . . . . . . . . . . 265 cap00.indd XII INDICE GENERALE PARTE QUARTA BIOTECNOLOGIE CELLULARI VEGETALI 18 • Coltura in vitro di cellule e tessuti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 A. Valletta 18.1 Selezione, sterilizzazione e messa in coltura degli espianti . . . . . . . . . . . . . . . . 269 18.2 Mezzi colturali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 18.3 L’utilizzo di regolatori di crescita nelle colture in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 18.4 Principali tipi di colture in vitro . . . . . . . . . 275 18.4.1 Colture di cellule indifferenziate. . . . . . . 275 18.4.2 Colture di organi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 18.4.3 Saggi di vitalità cellulare . . . . . . . . . . . . 282 18.5 Variabilità somaclonale . . . . . . . . . . . . . . . 284 18.5.1 Origine della variabilità somaclonale . . 284 18.5.2 Selezione di varianti somaclonali . . . . . . 285 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 285 19 • Propagazione in vitro delle piante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287 G. Pasqua 19.1 Micropropagazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288 19.2 Coltura di apici vegetativi per risanamento delle piante da virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 19.3 Organogenesi in vitro (caulogenesi, rizogenesi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 19.4 Embriogenesi somatica . . . . . . . . . . . . . . . 292 19.4.1 Confronto tra embiogenesi zigotica e somatica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293 19.4.2 Embriogenesi somatica diretta e indiretta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294 19.4.3 Fattori induttivi e ruolo degli ormoni . . . 294 19.4.4 Analisi molecolare e marcatori dell’embriogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296 19.4.5 Fecondazione in vitro . . . . . . . . . . . . . . . 297 19.4.6 Semi artificiali o sintetici . . . . . . . . . . . . 298 19.5 Embriogenesi da polline, produzione di piante apolidi e diploidi omozigoti . . . . . 299 19.5.1 Manipolazione genetica del polline e produzione di embrioni transgenici. . . . . . 301 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 302 20 • Conservazione ex situ del germoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 C. Forni 20.1 Biodiversità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 20.2 Strategie per la conservazione del germoplasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 17/05/2011 11.16.27 XIII INDICE GENERALE 20.3 Metodi di conservazione del germoplasma ex situ . . . . . . . . . . . . . . . . 304 20.3.1 Conservazione negli Orti Botanici . . . . . 304 20.3.2 Banche del seme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 20.3.3 Crioconservazione . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 308 21 • Cellule vegetali come biofabbriche di prodotti chimici e farmaceutici . . . . . 311 G. Pasqua con la collaborazione di A.R. Santamaria 21.1 Metaboliti secondari e loro ruolo nelle piante . . . . . . . . . . . . . . . . 311 21.2 Uso dei metaboliti secondari in campo farmaceutico, cosmetico ed agroalimentare. . 315 21.3 Metaboliti secondari da colture di cellule ed organi in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 317 21.4 Strategie per incrementare la produzione di metaboliti secondari in sistemi in vitro . . 319 21.4.1 Ottimizzazione delle condizioni colturali per aumentare la resa. . . . . . . . . . . . . . . . . . 319 21.4.2 Selezione delle linee cellulari, trasformazioni geniche ed ingegneria metabolica per aumentare la produttività di metaboliti secondari. . . . . . . . . . . . . . . . . 320 21.4.3 Permeabilizzazione di membrane per il recupero dei metaboliti . . . . . . . . . . . . 321 21.4.4 Immobilizzazione cellulare . . . . . . . . . . . 322 21.4.5 Elicitazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322 21.4.6 Produzione di metaboliti in bioreattore . 323 21.5 Biotrasformazione di substrati per produrre molecole di interesse industriale . . . . . . . . . 324 21.6 Estrazione ed analisi chimica dei metaboliti secondari . . . . . . . . . . . . . . . . 325 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 326 22 • Bioproduzioni e biomasse . . . . . . . 329 C. Forni, G.P. Di Sansebastiano 22.1 Biomassa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329 22.2 Uso energetico delle biomasse . . . . . . . . . 330 22.3 Biocarburanti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 22.3.1 Produzione di olio vegetale puro e biodiesel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331 22.3.2 Produzione di bioetanolo . . . . . . . . . . . . 332 22.3.3 Produzione di biogas. . . . . . . . . . . . . . . . 334 22.4 Valutazione delle biomasse per la sostituzione dei combustibili fossili e la diminuzione dei cambiamenti climatici . . 334 22.5 Bioproduzione di polimeri . . . . . . . . . . . . . 335 22.5.1 “Biotecnologie bianche” . . . . . . . . . . . . 335 22.5.2 “Biotecnologie rosse”. . . . . . . . . . . . . . . 336 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 339 cap00.indd XIII 23 • Dalla scala di laboratorio alla scala industriale: sistemi cellulari . . . . . . . . . . 341 A. Miccheli 23.1 Dalle cellule in sospensione alle cellule immobilizzate. . . . . . . . . . . . . . . 341 23.2 Idrogeli e tecnologie per l’immobilizzazione in gel. . . . . . . . . . . . . . . 343 23.2.1 Sodio alginato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 344 23.2.2 Preparazione delle sfere di alginato . . . . 345 23.3 Sistemi cellulari immobilizzati: aspetti diffusivi e relativi modelli. . . . . . . . . 346 23.3.1 Diffusione in gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 347 23.3.2 Diffusione in gel contenente cellule . . . . 348 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 348 24 • Dalla scala di laboratorio alla scala industriale: bioreattori . . . . . . 349 A. Miccheli 24.1 Modelli cinetici di crescita cellulare . . . . . 350 24.2 Trasferimento di massa in bioreattori . . . . 351 24.2.1 Modello di trasferimento dell’ossigeno . 352 24.2.2 Ossigeno come substrato limitante la crescita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 24.3 Bioreattori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354 24.3.1 Shake flasks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 355 24.3.2 Stirred tank reactors . . . . . . . . . . . . . . . . 356 24.3.3 Bioreattori pneumatici o airlift reactors . 356 24.3.4 Bioreattori a letto fisso o a letto fluidizzato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 357 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 358 25 • Ingegneria genetica nelle piante . . 359 L. Trainotti, L. Lanfranco, G.P. Di Sansebastiano 25.1 Tecniche di trasformazione genica. . . . . . . 359 25.1.1 Metodi chimico-fisici. . . . . . . . . . . . . . . . 361 25.1.2 Metodi biologici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363 25.2 “Strumenti molecolari” dell’ingegneria genica . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 25.2.1 Vettori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371 25.2.2 Sistemi di selezione . . . . . . . . . . . . . . . . . 372 25.2.3 Promotori per le biotecnologie vegetali . 375 25.2.4 Geni reporter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 377 25.3 Il silenziamento genico mediato da piccoli RNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378 25.3.1 Basi molecolari dei meccanismi di silenziamento mediato da piccoli RNA. . . 378 25.3.2 Applicazioni del silenziamento genico mediato da piccoli RNA per la manipolazione genetica . . . . . . . . . . . 385 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 388 17/05/2011 11.16.27 XIV 26 • Aspetti applicativi della transgenesi nei sistemi vegetali . . . . . . . . . . . . . . . . . 389 L. Lanfranco, G.P. Di Sansebastiano, L. Trainotti 26.1 I sistemi sperimentali vegetali . . . . . . . . . . 390 26.1.1 Specie modello . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 26.1.2 Dicotiledoni: Arabidopsis, Solanaceae, Pioppo, Fabaceae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 390 26.1.3 Monocotiledoni: riso, mais . . . . . . . . . . . 393 26.1.4 La briofita Physcomitrella patens . . . . . . 394 26.2 I caratteri ingegnerizzabili . . . . . . . . . . . . . 395 26.2.1 Piante transgeniche di prima generazione: resistenza agli insetti, agli erbicidi e ai virus . . . . . . . . . . . . . . . . . 395 cap00.indd XIV INDICE GENERALE 26.2.2 Piante transgeniche per il miglioramento degli aspetti nutrizionali . . . 397 26.2.3 Piante transgeniche come bioreattori per la produzione di proteine eterologhe . . . 398 26.2.4 Piante transgeniche per la produzione di biocombustibili . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400 26.3 Il dibattito sul rischio biotecnologico . . . . 402 Letture di approfondimento . . . . . . . . . . . . . . . . 404 Indice analitico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405 17/05/2011 11.16.27