Lezione Replicazione DNA File

Domande
• Come avviene la replicazione del DNA?
• Quali enzimi sono necessari?
• Quali sono le differenze fra procarioti ed Eucarioti?
Tre modelli di replicazione del DNA
Meselson e Stahl
1958
http://www.youtube.com/watch?v=Kybdh8VPiGk
Centrifugazione in CsCl per la separazione di
molecole di diversa densità
Figura box 3.1
La replicazione del DNA
è semiconservativa
Tre fasi nella replicazione del DNA
1. Inizio
2. Allungamento della catena
3. Fine
La DNA girasi
di E.coli
La girasi di E.coli è una topoisomerasi di tipo II che usa l’idrolisi di ATP
per fornire l’energia necessaria all’ introduzione di superavvolgimenti in
una molecola circolare chiusa rilassata
Si lega al DNA e lo superavvolge processivamente e cataliticamente
Continua ad introdurre superavvolgimenti nella stessa molecola di DNA
Può introdurre circa 100 superavvolgimenti al minuto
Mechanismo di Azione
I chinoloni sono farmaci battericidi.
Inibiscono la DNA girasi batterica detta anche topoisomerasi IV inibendo
così la replicazione e la trascrizione del DNA batterico.
I chinoloni entrano nel batterio attraverso dei canali detti porine e perciò
vengono usati nel trattare infezioni batteriche di patogeni che si replicano
all’interno di cellule umane quali la legionella ed il micoplasma pneumonie.
Per molti batteri gram negativi la DNA girasi è il target di questi antibatterici
mentre per molti gram positivi il target è la DNA topoisomerasi IV
Le cellule eucariotiche non contengono ne DNA girasi e ne DNA
topoisomerasi IV
Spettro di azione dei chinolonici
1° Generazione
Acido nalidissico: Escherichia coli, Proteus, Shigella, Enterobacter, e Klebsiella.
2° Generazione
Ciprofloxacina: Come quelli della prima generazione ed nei confronti della
salmonella typhy
3° Generazione
Gatifloxacina: Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae
4° Generazione
Gemifloxacina: Moraxella catarrhalis, Acinetobacter lwoffii, Klebsiella oxytoca,
Legionella pneumophila, Proteus vulgaris. - Chlamydia pneumoniae,
Mycoplasma pneumoniae
Arthur Kornberg
Scoprì la polimerasi I ed il meccanismo della
sintesi del DNA, lavorando con Escherichia coli
Sono necessari quattro componenti:
1.
dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
(deossribonucleoside 5’-trifosfato)
(zucchero-base + 3 fosfati)
2.
DNA stampo
3.
DNA polimerasi I (chiamata anche enzima di Kornberg)
(DNA polimerasi II e III scoperte successivamente)
4.
Mg 2+ (ottimizza l’attività della DNA polimerasi)
LA REPLICAZIONE DEL DNA
• La polimerizzazione del DNA avviene
sempre in direzione 5’-3’
• L’elicasi si muove in una sola direzione,
srotolando progressivamente l’elica
• I due filamenti antiparalleli non possono
essere duplicati nello stesso modo
• uno puo’ essere sintetizzato nella stessa
direzione in cui si muove l’elicasi, in
direzione 5’-3’ (filamento guida)
• l’altro non possiede un gruppo ossidrile 3’
al punto di biforcazione, non puo’ essere
sintetizzato in maniera continua, in direzione
3’-5’ (filamento in ritardo), seguendo
l’elicasi
3’
direzione
elicasi
5’
3’
3’
5’
?
5’
3’
5’
LA REPLICAZIONE DEL DNA
• Il filamento in ritardo viene invece
sintetizzato in direzione opposta a
quella in cui si muove la forchetta di
replicazione, mediante la sintesi
progressiva di una serie di piccoli
frammenti (frammenti di Okazaki),
ciascuno polimerizzato in direzione
5’-3’
• le estremita’ dei frammenti di
Okazaki vengono ricongiunte
mediante formazione di legami
covalenti ad opera dell’enzima DNA
ligasi
direzione
elicasi
5’
3’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
La sintesi di un filamento
di DNA richiede un innesco ad
RNA ed avviene sempre in
direzione 5’->3’
LA REPLICAZIONE DEL DNA
Proteine alla forca replicazione in E. coli
Proteina Rep (elicasi)
3’
5’
pol III
5’
3’
G
Primosoma
DNA ligasi
C B
proteine leganti
singolo-filamento
(SSB)
primasi
DNAc
DNAb
pol III
elicasi
DNA girasi – questa è una topoisomerase II, che
rompe e risalda il DNA per introdurre
superavvolgimenti negativi a monte della forca
27
pol I
Componenti dell’apparato di replicazione
dnaA
Primosoma
dnaB
dnaC
dnaG
DNA gyrase
Rep protein
SSB
DNA pol III
DNA pol I
DNA ligasi
lega all’origine la sequenza di DNA
elicasi (svolge il DNA all’ origine)
lega dnaB
primasi (sintetizza RNA primer)
introduce superavvolgimenti negativi in testa
alla forca di replicazione
elicasi (svolge il DNA alla forca)
si lega al singolo-filamento di DNA
principale polimerasi replicante
rimuove i primer e riempe gli intervalli
risalda gli intervalli formando legami
3’, 5’-fosfodiesterei
29
La “correzione di bozze”
I superavvolgimenti sono un problema per
la replicazione di cromosomi circolari
100 superavvolgimenti
Azione della topoisomerasi
Schema dei passaggi enzimatici nella
replicazione di E. coli
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
La topoisomerasi fa rilassare il filamento
La proteina iniziatrice si lega a ori-C
Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e
svolgono un tratto della doppia elica
Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica
singola, senza coprire le basi
La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un
innesco di circa 30 paia di basi
La DNA P III lo estende da 5’ a 3’
Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti
sbagliati (proof-reading)
La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento
adiacente, procedendo da 5’ a 3’
La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun
nucleotide
Il replicone è un segmento di DNA che
possiede un inizio di replicazione e si
replica una volta ad ogni divisione
cellulare
I repliconi dei genomi di vari organismi
Durante la replicazione, la stessa elica è,
in tratti diversi, leading e lagging
La “bolla replicativa”
In sintesi:
Peter J Russell, Genetica © 2010
Pearson Italia S.p.A
Figura 3.5
Filamento leading e filamento lagging occupano
entrambe le eliche, in posizioni diverse
Figura 3.9
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Fine della replicazione: la ligasi
Figura 3.7
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Fine della replicazione
Figura 3.6
Peter J Russell, Genetica © 2010
Pearson Italia S.p.A
Replicazione di cromosomi circolari
Nella foto: SV40
Peter J Russell, Genetica © 2010
Pearson Italia S.p.A
Figura 3.10
Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti
(ore)
Organismo
E. coli
Lievito
Piante
Uomo
M
20’
1
1
G1
25’
8
8
S
40’
12
10
G2
35’
8
5
Totale
1
2
29
24
Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli
Velocità di replicazione:
E. coli: 50000 basi al minuto
Drosophila: 2600 basi al minuto
Topo: 2200 basi al minuto
Negli eucarioti superiori
DNA P α: sintesi del primer
DNA P β: riparazione del DNA nucleare
DNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri
DNA P δ: sintesi dell’elica lagging
DNA P ε: sintesi dell’elica leading*
* Finora dimostrato solo nel lievito
SPECIE
Dimens. genoma
N repliconi
velocità replicazione/min
E. coli:
4,2 Mb
1
50000
Drosophila:
140 Mb
3500
2600
Topo:
3200 Mb
25000
2200
E alla fine?
Peter J Russell, Genetica © 2010
Pearson Italia S.p.A
Figura 3.15
LA REPLICAZIONE DEL DNA
Oltre la parte piu’ estrema di un filamento di DNA non c’e’ piu’ spazio per la
sintesi di un innesco!
• Quindi la replicazione del DNA rimane incompleta, ovvero un frammento
terminale di un cromosoma resta a singola elica
• a questo ovvia la replicazione dei telomeri ad opera dell’enzima
telomerasi, che utilizza come stampo un RNA parte dell’enzima stesso
I telomeri sono delle strutture formate da DNA e
proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari
costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza
TTAGGG
La replicazione dei
telomeri
Premio Nobel per la Medicina 2009
Carol W. Greider
Jack W.
Szostak
Elizabeth H. Blackburn
Telomerasi
La telomerasi, la trascrittasi inversa che aggiunge ripetizioni TTAGGG alle sequenze telomeriche, è il
maggior regolatore della lunghezza telomerica nelle cellule di mammifero (collins & mitchell 2002).
Consiste di due componenti principali:
TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) - una
subunità con attività di trascrittasi inversa conosciuta
come trascrittasi inversa telomerasica
TERC (Telomerase RNA component) - una molecola
di RNA conosciuta come il componente ad RNA della
telomerasi che serve da copia per la sintesi di nuove
ripetizioni telomeriche.
Nell’uomo l’attività telomerasica è stata riscontrata nelle cellule della linea germinale ed in cellule embrionali
ma non nella maggior parte dei tessuti adulti
Il 90% dei tumori presentano attivazione della telomerasi
LA TELOMERASI
La telomerasi permette di risolvere il problema
della replicazione delle estremità cromosomiche
aggiungendo ripetizioni telomeriche ad ogni ciclo di
sintesi del DNA
Telomerasi
Le regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenze
ripetute:
Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG)
Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG)
L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare alla
sequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremità
telomerica 5’: è una
DNA P – RNA dipendente
Carol Greider
Come funziona la telomerasi
Senescenza e neoplasia
Trends in Genetics 15:93-94, 1999
Figure 12.6 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Deaminazione
Depurinazione
Ossidazione
Dimeri di pirimidine
Formazione di
addotti del DNA
MAP: Myh-associated polyposis
Xeroderma pigmentosum
altissima incidenza di
maligni della pelle esposta
a raggi UV.
Figure 12.23b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Mismatch repair
Figure 12.8c The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Mismatch repair
Hereditary non-polyposis
colon cancer (HNPCC).
Difetti del mismatch repair
nel 15% dei tumori sporadi
del colon, dello stomaco,
dell'ovaio e dell'endometrio
Figure 12.8a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Homology-directed repair
Difetti di BRCA1 o BRCA2
prevengono la riparazione gui
dall'omologia.
Carcinomi della mammella e
dell'ovaio.
Figure 12.32 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Non-homologous end joining (NHEJ)
Difetto della proteina NBS
(nibrina).
Linfomi.
Figure 12.33 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Sistemi di correzione e riparo del
DNA
Correzione di bozze (“proofreading”) – durante la replicazione la
DNA polimerasi può eliminare una base incorretta attraverso l’attività
3’-5’ fosfodiesterasica
Riparo dei misappaiamenti – le coppie di basi non corrette sul
filamento nuovo vengono riparate da un complesso proteico che
segue la polimerasi in duplicazione. La metilazione del DNA
consente di distinguere il filamento vecchio dal nuovo.
Riparo per escissione – le basi modificate da agenti chimici
successivamente alla replicazione del DNA vengono riconosciute e
riparate.
Meccanismi di correzione e riparo nel DNA
CH3
Causa delle mutazioni
• Errori di replicazione
• Danni chimici. Il DNA è una molecola
fragile: perdita o alterazioni di basi,
rottura dello scheletro
• Inserimento di trasposoni
.
Riparazione del
mismatch
Mismatch repair è parte della
replicazione.
In E. coli il DNA viene
analizzato per distorsioni da
Mut S (un dimero), lo
distorce ulteriormente
Recluta MutL, che recluta
MutH che taglia il filamento
vicino al mismatch
Poi intervengono: elicasi,
esonucleasi, DNA Pol (III)
e ligasi.
Mismatch repair in
E. coli
Come fa a identificare il filamento
nuovo su cui operare il taglio ed
escissione?
Dalla metilazione della A nella
sequenza CTAG ad opera della
Dam metilasi
MutS si lega al filamento non
metilato
Mismatch repair in Eucarioti
• Gli eucarioti hanno omologhi di
Mut(s) con più alta specificità
(per mismatch, indels etc)
• Non hanno Dam Metilasi,
riconoscono il filamento stampo
dalle incisioni dei frammenti di
Okazaki. Sono associate al
sliding clamp
• Mutazioni dei geni
predispongono ai tumori