mannoproteines parietales de levures

RISOLUZIONE ENO 26/2004
MANNOPROTEINE DI LIEVITI
L'ASSEMBLEA GENERALE,
Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell'accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'Organizzazione
internazionale della vigna e del vino
Su proposta della Sottocommissione dei metodi di analisi e valutazione dei vini,
DECIDE di introdurre nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi dei vini, il metodo
seguente:
MANNOPROTEINE DI LIEVITI
1. OGGETTO, ORIGINE E CAMPO DI APPLICAZIONE
Le mannoproteine sono estratte dalle pareti cellulari dei lieviti Saccharomyces
cerevisiae mediante metodi fisico-chimici o enzimatici.
Le mannoproteine presentano strutture diverse a seconda della loro massa
molecolare, il loro grado e il loro tipo di glicosilazione e la loro carica. A seconda della
modalità di estrazione, possiedono diverse attività di stabilizzazione tartarica e/o proteica
dei vini.
2. ETICHETTATURA
L’etichetta deve riportare il campo di applicazione (stabilizzazione tartarica e/o
proteica dei vini), le norme di sicurezza e di conservazione, nonché la data di scadenza.
Per i preparati in soluzione devono essere indicati inoltre la concentrazione in
mannoproteine e il tenore in anidride solforosa.
3. CARATTERIZZAZIONE
3.1 - Le mannoproteine si presentano sotto forma di polvere generalmente
microgranulata di colore bianco o beige inodore, oppure in soluzione colloidale di
colore giallastro, translucida.
3.2 - Le mannoproteine sono solubili in acqua e insolubili nell’etanolo. In soluzione
precipitano quando si aggiunge 1 volume di etanolo.
3.3 – Potere rotatorio
Il potere rotatorio specifico si misura a 589 nm (“riga D” del sodio) e viene rapportato
a una soluzione di mannoproteine di 10 g/l a una lunghezza di 1 dm.
Esemplare certificato conforme
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Secretario dell’Assemblea Generale
Federico CASTELLUCCI
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Alcune mannoproteine il cui potere rotatorio [α]D20°C è compreso tra 80 ° e 150° si
distinguono dalla gomma arabica il cui potere rotatorio è inferiore a 50°.
Altri preparati possono differenziarsi soltanto per la composizione centesimale in
zuccheri (si veda il punto 4.12).
4. PROVE
4.1 Perdita all’essiccazione
4.1.1 Mannoproteine in polvere:
Mettere 5 g di mannoproteine in una capsula di silice da 70 mm di diametro. Porre in
una stufa a 100-105 °C per 5 ore. La perdita di peso non deve essere superiore al
15 %.
4.1.2 Mannoproteine in soluzione:
Mettere 10 g di soluzione di mannoproteine in una capsula di silice da 70 mm di
diametro. Portare a 100° C in bagno d’acqua per 4 ore e quindi porre in una stufa a
100-105 °C per 3 heures.
La quantità di residuo essiccato deve essere almeno del 10%.
I limiti fissati qui appresso sono riferiti al prodotto essiccato.
4.2 Ceneri
Incenerire il residuo
superiore all’8%.
secco a 550-600°C. Il tenore in ceneri non deve essere
4.3 Preparazione della soluzione standard
Preparare una soluzione di mannoproteine a 10 g/l in acqua.
Nel caso di soluzione di mannoproteine, pesare un quantitativo corrispondente a 5 g
di residuo essiccato, evaporare quasi a secco e quindi sciogliere nuovamente in acqua
a 10 g/l.
4.4 Metalli pesanti
Sulla soluzione standard (4.3) dosare il ferro secondo il metodo descritto nel Capitolo
II del Codice Enologico Internazionale.
Il tenore espresso in piombo deve essere inferiore a 30 mg/kg.
4.5 Piombo
Sulla soluzione standard (4.3) dosare il piombo secondo il metodo descritto nel
Capitolo II del Codice Enologico Internazionale.
Il tenore in piombo deve essere inferiore a 5 mg/kg.
4.6 Mercurio
Sulla soluzione standard (4.3), ma senza evaporare la soluzione, dosare il mercurio
secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico Internazionale.
Esemplare certificato conforme
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Il tenore in mercurio deve essere inferiore a 0,15 mg/kg.
4.7 Arsenico
Sulla soluzione standard (4.3) dosare l’arsenico secondo il metodo descritto nel
Capitolo II del Codice Enologico Internazionale.
Il tenore in arsenico deve essere inferiore 1 mg/kg.
4.8 Cadmio
Sulla soluzione standard (4.3) dosare il cadmio secondo il metodo descritto nel
Capitolo II del Codice Enologico Internazionale.
Il tenore in cadmio deve essere inferiore a 0,5 mg/kg.
4.9 Azoto totale
Introdurre 5 g di mannoproteine in un matraccio da mineralizzazione da 300 ml con
15 ml di acido solforico concentrato (R) e 2 g di catalizzatore di mineralizzazione (R).
Continuare il dosaggio come indicato nel capitolo II del Codice enologico
internazionale.
Nel caso di soluzione di mannoproteine, pesare un quantitativo corrispondente a 5 g
di residuo essiccato, evaporare quasi a secco, quindi continuare come descritto in
precedenza.
Il tenore in azoto deve essere compreso tra 5 e 75 g/kg.
4.10 Analisi microbiologica
4.10.1
Flora mesofila aerobia totale
Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Devono essere presenti meno di 10 000 germi aerobi mesofili in 1 g.
4.10.2
Coliformi
Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Devono essere presenti meno di 10 UFC/g di preparato.
4.10.3
Staphylococcus aureus
Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Assenza controllata di Staphilococcus aureus in un campione di 1 g.
4.10.4
Salmonelle
Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Assenza controllata di salmonelle in un campione di 25 g.
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4.10.5
Escherichia coli
Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Assenza controllata di Escherichia coli in un campione di 25 g.
4.10.6
Batteri lattici
Procedere alla conta secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Devono essere presenti meno di 104 UFC/g di preparato.
4.10.7
Muffe
Procedere al computo secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Devono essere presenti meno di 50 UFC/g di preparato.
4.10.8
Lieviti
Procedere al computo secondo il metodo descritto nel Capitolo II del Codice Enologico
internazionale.
Devono essere presenti meno di 102 UFC/g di preparato.
4.11 Polisaccaridi
4.11.1 Principio:
Misura dell’intensità della colorazione mediante fenolo a caldo, in ambiente
solforico.
4.11.2 Prodotti:
4.11.2.1 Soluzione di mannoproteine a 15 mg/l
Sciogliere 150 mg di mannoproteine in 100 ml di acqua distillata, quindi diluire
questa soluzione all’1% con acqua distillata.
4.11.2.2 Soluzione di fenolo a 50 g/l
Sciogliere 5 g di fenolo puro in 100 ml di acqua distillata.
4.11.3 Protocollo:
A 200 µl della soluzione da dosare (4.11.2.1), sono aggiunti 200 µl di fenolo
(4.11.2.2) e poi 1 ml di acido solforico puro (R). Dopo agitazione immediata, i
tubi sono portarti in un bagno d’acqua a 100°C per 5 minuti e poi raffreddati a
0 °C.
Dopo il ritorno a temperatura ambiente, l’assorbanza viene misurata a 490 nm.
La soluzione di riferimento è una soluzione di mannosio a 100 mg/l.
(Il tenore in polisaccaridi espresso in mannosio deve essere superiore à 600
g/kg)
4.12 Composizione centesimale in momoneri glucidici
4.12.1 Principio:
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Dosaggio enzimatico del glucosio e del mannosio dopo idrolisi acida.
Il dosaggio del mannosio è realizzato dopo quello del fruttosio aggiungendo la
fosfomannosio isomerasi (PMI).
4.12.2 Prodotti:
4.12.2.1 Soluzione di mannoproteine a 5 g/l
Sciogliere 500 mg di mannoproteine in 100 ml di acqua distillata.
4.12.2.2 Soluzione di acido solforico 5 M
Porre 28 ml di acido solforico puro in 100 ml di acqua distallata.
4.12.2.3 Soluzione d’idrossido di potassio 10 M
Sciogliere 46 g d’idrossido di potassio in 100 ml di acqua distallata.
4.12.2.4 Fosfomannosio isomerasi 616 U/ml.
4.12.3 Protocollo:
Mettere 100 µl della soluzione da dosare (4.12.2.1) in provette a chiusura
ermetica, aggiungere 1ml di acido solforico (4.12.2.2) e, dopo agitazione, mettere
le provette in bagno d’acqua a 100 °C per 30 minuti e quindi raffredare a 0 °C.
Dopo il ritorno a temperatura ambiente, aggiungere 1 ml d’idrossido di potassio
per neutralizzare il mezzo.
Si può quindi effettuare il dosaggio del glucosio e del mannosio secondo il metodo
descritto nella raccolta.
Le mannoproteine devono contenere almeno il 70% di mannosio rispetto ai
polisaccaridi totali determinati al punto di 4.11.
4.13 Test di efficacia delle mannoproteine riguardo alle precipitazioni
tartariche
4.13.1 Principio:
Determinazione della dose di mannoproteine per ritardare la cristallizzazione del
tartrato acido di potassio in una soluzione idroalcolica.
4.13.2 Prodotti:
Acido tartarico cristallizzato: PM = 150,05
Etanolo al 95%
Cloruro di potassio: PM = 74,5
Tartrato acido di potassio: PM = 188
4.13.3 Protocollo:
4.13.3.1 Soluzione di mannoproteine a 10 g/l
Sciogliere 1 g di mannoproteine in 100 ml di acqua distillata.
4.13.3.2 Matrice idroalcolica
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In un matraccio tarato da 1 litro riempito a metà con l’ acqua distillata,
sciogliere:
- Acido tartarico:
2,1 g
- Cloruro di potassio:
1,1 g
- Etanolo al 95 %:
110 ml
Omogenizzare e portare a livello con acqua distillata.
4.13.4 Test:
Mettere in 5 matracci tarati da 100 ml dei quantitativi crescenti della soluzione di
mannoproteine (4.13.3.1) 0 – 1 – 2 – 3 - 4 ml, e portare a 100 ml con la matrice
idroalcolica (4.13.3.2). Tali quantitativi corrisponderanno a quantità finali di 0 –
100 – 200 – 300 - 400 mg/l di mannoproteine.
Aggiungere in ogni matraccio 100 mg di tartrato acido di potassio.
Mettere in un bagno d’acqua a 40 °C per 1 ora fino a completa solubilizzazione del
tartrato acido di potassio.
Riporre i matracci in frigorifero a 4 °C.
Osservazione dopo 48 ore:
Il matraccio testimone contenente 0 ml della soluzione di mannoproteine
(4.13.3.1) presenta cristalli di tartrato acido di potassio.
L’assenza di cristalli nei matracci conteneti mannoproteine permetterà di valutare
la loro efficacia. In ogni caso i cristalli devono essere assenti nella soluzione
contenente 400 mg/l di mannoproteine.
4.14
Test d’efficacia delle mannoproteine riguardo alle casse proteiche
4.14.1 Principio
Determinazione della dose di mannoproteine per migliorare la stabilità proteica
dei vini.
4.14.2 Prodotto:
Siero albumina bovina (Frazione V) (BSA)
4.14.3 Protocollo:
4.14.3.1 Soluzione di siero albumina bovina a 10 g/l
Sciogliere 2 g di siero albumina bovina in 200 ml di acqua distillata.
4.14.3.2 Soluzione di mannoproteine a 20 g/l
Sciogliere 2 g di mannoproteine in 100 ml di acqua distallata.
4.14.4 Test
Mettere 1 ml della soluzione BSA (4.14.3.1) in 2 matracci tarati da 100 ml;
portare ogni matraccio a 100 ml con un vino bianco secco che non si presenti
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torbido al calore (o, se necessario, stabilizzato mediante trattamento alla
bentonite in dose adeguata), omogeneizzare.
Aggiungere 0 e 1 ml della soluzione di mannoproteine (4.14.3.2), omogeneizzare.
Tali quantità corrisponderanno a dosi finali di 0 e 200 mg/l di mannoproteine.
Filtrare su membrana con pori dal diametro di 0,45 µm il testimone e la soluzione
trattata. Mettere le soluzioni filtrate in 2 matracci da 50 ml.
Mettere i 2 matracci da 50 ml in un bagno d’acqua a 80 °C per 30 minuti. Lasciare
raffreddare a temperatura ambiente per 45 minuti, misurare la torbidità delle
soluzioni testimone e trattata.
La differenza di torbidità tra il testimone e il campione trattato deve essere almeno
del 50%.
4.15
Dosaggio nei vini
Principio
Il dosaggio delle mannoproteine nei vini può essere realizzato dopo la precipitazione
mediante etanolo (5 volumi), idrolisi acida del precipitato e dosaggio del mannosio
liberato secondo il metodo descritto in allegato.
5. CONSERVAZIONE
Le mannoproteine solide hanno una durata di conservazione superiore a 2 anni se
sono conservate al riparo dall’umidità, in un imballaggio chiuso e in locali
temperati.
Le mannoproteine sotto forma di soluzioni colloidali pronte all’uso devono essere
conservate in contenitori ermeticamente chiusi.
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Allegato
Dosaggio del mannosio mediante metodo enzimatico
Principio
Il mannosio è fosforilato come il glucosio e il mannosio:
Mannosio + ATP
M6P + ADP
Dopo dosaggio del glucosio e del fruttosio, il mannosio–6-fosfato viene transformato
sotto l’azione della fosfomannosio isomerasi (PMI) in fruttosio-6-fosfato.
PMI
M-6-P
F-6-P
Il fruttosio-6-fosfato appena formato si trasforma come prima in glucosio-6-fosfato,
che viene dosato.
Protocollo
Mettere 5 ml di vino in un tubo da centrifuga e aggiungere 25 ml di etanolo al 95%,
agitare e porre i tubi per 12 ore in frigorifero a 4°C. Il precipitato formato viene
recuperato mediante centrifugazione, quindi lavato 2 volte con 10 ml di etanolo al
95%. L’idrolisi del precipitato e il dosaggio del mannosio viene realizzato come al 4.12.
Tale dosaggio non consentirà di distinguere le mannoproteine aggiunte dalle
mannoproteine naturali.
Reagente aggiuntivo, rispetto al metodo di raccolta dei metodi internazionali di
analisi dei vini e dei mosti
Soluzione 6: fosfomannosio isomerasi (616 U/ml).
La sospensione viene utilizzata senza diluizione.
Dosaggio
Dopo la misurazione di A3 secondo il metodo di raccolta dei metodi internazionali di
analisi dei vini e dei mosti, aggiungere
Soluzione 6
Bianco
0,02 ml
Dosaggio
0,02 ml
Mescolare; effettuare la misurazione dopo 30 minuti; verificare l’arresto della reazione
dopo 2 minuti. (A4)
Determinare le differenze di assorbanza:
A4 – A3 corrispondente al mannosio.
Per il bianco e il dosaggio.
Dedurre la differenza tra l’assorbanza del bianco (∆AT) e quella del dosaggio (∆AD ) e
stabilire
Per il mannosio: ∆AM= ∆AD - ∆AT
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Espressione dei risultati
Si ottiene
Per il mannosio: Cg/l = 0,423x ∆AM
Nota: Se le misurazioni sono state compiute alle lunghezze d’onda 334 o 365 nm, si
ottiene:
Misurazione a 334 nm:
Per il mannosio: Cg/l = 0,430x ∆AM
Misurazione a 365 nm:
Per il mannosio: Cg/l = 0,783x ∆AM
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