4. Contr genico nello sviluppo

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Il controllo genico durante lo sviluppo
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Come si trasforma un uovo fecondato in un organismo
pluricellulare complesso?
Questo processo richiede che specifici geni vengano
attivati secondo una esatta sequenza temporale e nelle
cellule appropriate, producendo i vari tipi di tessuti e gli
specifici tipi cellulari che li compongono
La specificazione del tipo cellulare
La produzione di cellule differenziate (D) da cellule
staminali (S)
a Le
cellule
staminali
unipotenti producono un
solo
tipo
di
cellule
differenziate;
a Le
cellule
staminali
pluripotenti
possono
produrre due o più tipi di
cellule differenziate.
Sviluppo del muscolo scheletrico nei mammiferi
a La miogenesi procede attraverso tre
fasi:
- La determinazione dei precursori
delle cellule muscolari, i mioblasti;
- La moltiplicazione ed eventualmente
la migrazione;
- Il differenziamento in cellule
muscolari mature
I somiti embrionali danno origine ai mioblasti, i
precursori delle fibre muscolari scheletriche
a Durante le prime fasi dello sviluppo, i mioblasti si sviluppano da ammassi
di cellule mesodermiche, detti somiti, situati ai lati del tubo neurale
dell’embrione.
I somiti danno origine anche ad altri tessuti oltre
a quello muscolare
a Dopo la formazione del tubo neurale, da ogni somite si forma il
dermomiotomo, che dà origine alla pelle e ai muscoli, e lo sclerotomo, che
si sviluppa nelle strutture dello scheletro.
a I mioblasti si formano a livello dei bordi di ciascun dermomiotomo. I
mioblasti laterali migranoCopyright
negli
abbozzi degli arti, quelli assiali formano il
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miotomo.
Il dermotomo dà origine alle componenti della
pelle (derma), il miotomo ai muscoli assiali
Determinazione embrionale e migrazione dei
mioblasti nei mammiferi
Il differenziamento dei mioblasti
a I mioblasti sono “destinati” a diventare cellule muscolari, ma non sono
ancora differenziati; vengono definiti determinati.
a I mioblasti, per formare i muscoli, si allineano, smettono di dividersi, si
fondono per formare un sincizio (una cellula contenente molti nuclei con un
citoplasma comune), e si differenziano in fibre muscolari.
a Le cellule muscolari plurinucleate sono dette miotubi.
a In concomitanza con la fusione cellulare vengono attivati i geni necessari
per il differenziamento ed il funzionamento delle fibre muscolari
I geni miogenici sono stati identificati la
prima volta studiando fibroblasti in coltura
fibroblasti
a L’elevata frequenza con cui si osservava la conversione in miotubi delle
cellule C3H 10T1/2 trattate con 5-azacitidina suggerì che la riattivazione di
uno o di pochi geni fosse sufficiente per avviare il programma di
differenziamento delle cellule muscolari.
I geni miogenici sono stati identificati la
prima volta studiando fibroblasti in coltura
fibroblasti
Identificazione dei geni che inducono la
miogenesi
Un saggio per i geni che inducono la miogenesi
I geni che inducono la miogenesi
a Quattro geni capaci di convertire le cellule C3HT1/2 in
cellule muscolari:
myoD (gene D per la determinazione miogenica)
miogenina
myf5
mrf4
Le proteine miogeniche sono fattori di trascrizione
che contengono un dominio bHLH comune
MRF (Muscle regulatory factors)
Dominio bHLH
Il fattore di trascrizione umano Max
Interazione tra il dominio a elica-loop-elica (helixloop-helix) nella proteina omodimerica
Max e il DNA.
Le proteine bHLH
a Le proteine bHLH formano omo- ed eterodimeri che si legano ad un sito
di DNA, la sequenza E (o E box), di 6 coppie di basi (consensus:
CANNTG).
a Non tutte le sequenze E del genoma (1 ogni 256 nucleotidi su base
casuale) sono riconosciute dagli MRF
a MyoD lega il DNA con affinità maggiore come eterodimero complessata
con la proteina E2A, un’altra proteina bHLH
a E2A, espressa anche in altri tipi cellulari, è comunque necessaria per la
miogenesi delle cellule C3H 10T1/2.
a I domini di interazione con il DNA di E2A e di MyoD hanno sequenze
amminoacidiche simili, ma non identiche, e riconoscono entrambi le
sequenze E.
La specificità miogenica è dovuta alla capacità dei fattori di
trascrizione di associarsi in combinazioni diverse a livello di siti
differenti per il controllo della trascrizione
a La proteina E2A normale da sola non è in grado di avviare le
cellule C3H 10T1/2 verso la differenziazione, come MyoD.
a Una molecola E2A mutante, in cui 3 amminoacidi sono stati
sostituiti con i residui amminoacidici presenti nelle
corrispondenti posizioni di MyoD, è capace di convertire le
cellule C3H 10T1/2 in miotubi.
a Queste sostituzioni, due localizzate proprio nella regione basica
che lega il DNA e una nella regione immediatamente adiacente,
non influenzano la specificità con cui E2A lega il DNA.
a La specificità miogenica di MyoD dipende dalla capacità di
interagire con altre proteine.
MEF (fattori che si legano agli enhancer delle
cellule muscolari)
Specifici amminoacidi del dominio bHLH di tutti gli MRF
possono conferire la specificità miogenica permettendo al
complesso MRF-E2A di interagire in modo specifico con
un’altra famiglia di proteine che legano il DNA, i fattori che si
legano agli enhancer delle cellule muscolari o MEF.
I fattori MEF appartengono alla famiglia MADS di fattori di
trascrizione
Gli MEF agiscono di concerto con gli MRF nella
specificazione miogenica
Muscle regulatory factors
Muscle enhancer-binding factors
Gli MEF agiscono di concerto con gli MRF nella
specificazione miogenica
a I MEF furono considerati canditati per l’interazione con i MRF:
a) molti geni specifici per le cellule muscolari contengono
sequenze che vengono riconosciute dai domini MEF e MRF;
b) I MEF aumentano la capacità dei MRF di convertire le cellule
CH3 10T1/2 in miotubi;
c) Questo potenziamento richiede interazioni fisiche fra un
omodimero MEF e l’eterodimero MRF-E2A.
Un complesso MRF-E2A-MEF attiva la trascrizione
dei geni muscolari
a Dal momento che sia gli MRF che i MEF sono in gado di legare il DNA
indipendentemente è sufficiente un unico sito del DNA per garantire
l’assemblaggio del complesso MRF-E2A-MEF
a I MEF vengono espressi anche in altri tessuti oltre a quello muscolare
Sono state identificate le fasi della miogenesi
durante le quali agiscono gli MRF e gli MEF
Nei topi che non esprimono
miogenina
i
mioblasti
si
accumulano
nelle
posizioni
occupate dai muscoli scheletrici,
ma non si differenziano in
miotubi.
Nei doppi mutanti myf5-myoD i
mioblasti non si accumulano.
Sono state identificate le fasi della miogenesi
durante le quali agiscono gli MRF e gli MEF
I risultati dei knockout sono
coerenti con l’osservazione che le
cellule CH3 10T1/2 trattate con
Aza esprimono Myf5 e MyoD
prima di fondersi, e miogenina
solo dopo essersi fuse per
formare un sincizio.
Dati di espressione in vivo
indicano che Mrf4 viene espressa
successivamente nel corso dello
sviluppo e potrebbe contribuire
al mantenimento delle cellule
muscolari
nello
stato
differenziato.
Ruolo di E2A e dei fattori MEF nella miogenesi
a Nei topi con una mutazione che inattiva il gene E2A lo sviluppo
dei muscoli è normale mentre quello dei linfociti è impedito
a E’ probabile che esistano geni affini a E2A che ne possano
compensare la perdita
a Dal momento che il topo esprime molteplici proteine MEF, per
determinare il ruolo delle MEF nella miogenesi è stata preferita la
Drosophila che esprime una sola proteina MEF.
a Nei moscerini con mutazioni nel gene MEF non si formano
cellule muscolari differenziate, anche se i mioblasti si formano
normalmente.
MyoD e Myf5 sono necessarie per la determinazione dei mioblasti, la
miogenina e gli MEF sono importanti per il differenziamento dei
mioblasti in miotubi.
Modello del controllo genico
della miogenesi scheletrica
di mammifero in vivo,
basato su esperimenti di
knockout di geni in topo e
su mutazioni che provocano
perdita di funzione in
Drosophila
Le molteplici MRF presentano differenze funzionali
La miogenina non può
sostituire in vivo la Myf5
Recenti studi biochimici
hanno dimostrato che la
capacità di rimodellare la
cromatina di Myf5 e di
MyoD è molto maggiore di
quella della miogenina.
Le molteplici MRF rendono flessibile la regolazione dello
sviluppo
a In topi omozigoti per il knockout del gene miogenina e con una
copia del gene miogenina integrata (knockin) nel locus myf5,
cioè sotto il controllo delle sequenze regolatrici di myf5, il
knockin non è in grado di restaurare un fenotipo wild type.
a La peculiare espressione del gene miogenina, conferita dalle sue
specifiche sequenze regolatrici, è fondamentale per lo sviluppo
normale.
a La duplicazione genica ha portato all’evoluzione di geni che
codificano MRF funzionalmente diverse e la cui espressione
viene regolata da elementi di controllo della trascrizione
differenti.
Il differenziamento terminale dei mioblasti è soggetto a
controllo positivo e negativo
a Nell’embrione in via di sviluppo, i mioblasti determinati, ancora
indifferenziati, sono in grado di rispondere ai segnali
extracellulari che controllano la moltiplicazione (numero di
cellule da produrre) e la migrazione cellulare (esatta posizione
dei muscoli)
a I miotubi, le cellule muscolari differenziate, non sono in grado di
rispondere a tali segnali.
a La regolazione della transizione dallo stato determinato a quello
differenziato permette l’esatto controllo spaziale e temporale del
differenziamento cellulare.
a Sono stati scoperti alcuni dei fattori che promuovono o inibiscono
il differenziamento durante la miogenesi.
La proteina inibitrice Id (inhibitor of DNA binding)
a Nel tentativo di isolare geni simili a MyoD è stato identificato un gene
che codifica per una proteina affine che conserva le eliche per la
dimerizzazione, ma che è priva della regione basica che lega il DNA, e
pertanto non è in grado di legare le E box
a La proteina Id (inhibitor of DNA binding) interagisce con MyoD e E2A e
inibisce la formazione degli eterodimeri MyoD-E2A.
La proteina Id (inhibitor of DNA binding) interagisce con MyoD ed
E2A ed inibisce la formazione degli eterodimeri MyoD-E2A.
MyoD MyoD
E box
E2A
E2A
E2A
MyoD
E box
E box
Id
Id
M
E2
D
yo
X
A
X
E box
E box
La proteina inibitrice Id (inhibitor of DNA binding)
a La proteina Id (inhibitor of DNA binding) interagisce con MyoD e E2A
ed inibisce la formazione degli eterodimeri MyoD-E2A.
a Gli azamioblasti in moltiplicazione esprimono MyoD, E2A e Id ed i
promotori dei geni specifici per le cellule muscolari (es.: creatina
chinasi) non sono occupati. Id può mantenere in questo modo le
cellule nello stato determinato durante la loro moltiplicazione
a Se viene indotto il differenziamento terminale degli azamioblasti (per
esempio rimuovendo i fattori di crescita) la concentrazione di Id
diminuisce e i complessi MyoD-E2A possono formarsi e legarsi ai
promotori bersaglio.
Le proteine per il ciclo cellulare e la regolazione
del differenziamento
a In molte cellule l’inizio del differenziamento è associato al blocco del ciclo
cellulare, generalmente in G1.
a Le proteine che regolano il ciclo cellulare potrebbero influenzare la transizione
dallo stato determinato a quello differenziato?
a Alcuni inibitori dell’attività di proteina chinasi dei complessi ciclina-Cdk
possono indurre il differenziamento di cellule in coltura.
La sintesi di questi inibitori aumenta durante il differenziamento.
a Il differenziamento dei mioblasti in coltura può essere inibito trasfettando le
cellule con il gene della ciclina D1, tipica della fase G1, sotto il controllo di un
promotore costitutivo.
L’espressione della cilcina D1 viene stimolata in molti tipi cellulari dai fattori
mitogenici.
Una rete di interazioni reciprocamente
regolatrici mantiene il programma miogenico
Anche se il programma miogenico è indotto da segnali extracellulari
temporanei, una rete di interazioni intracellulari mantiene il programma
miogenico anche in assenza di questi segnali
Per la neurogenesi sono necessarie proteine
regolatrici analoghe alle bHLH miogeniche
a Quattro proteine bHLH, molto simili alle proteine bHLH miogeniche,
controllano la neurogenesi di Drosophila.
achaete (ac)
scute (sc)
lethal of scute (l’sc)
asense (a)
a Le proteine Achaete e Scute contribuiscono alla determinazione dei
precursoti dei neuroni,
a la proteina Asense è necessaria per il differenziamento.
a Le proteine di Drosophila Da, ed Emc, hanno struttura e funzione
simili alle proteine dei mammiferi E2A ed Id, rispettivamente.
Confronto tra i geni che regolano la neurogenesi in Drosophila e quelli
che regolano la miogenesi nei mammiferi
Neurogenesi nei vertebrati
a Una famiglia di proteine bHLH affini alle proteine Achaete e Scute è
stata identificata nei vertebrati.
a Neurogenina nei vertebrati sembra agire nella determinazione dei
precursori dei neuroni (funzione analoga a Achaete e Scute in
Drosophila).
a Neurogenina, espressa precocemente durante lo sviluppo dei
neuroni, potrebbe indurre NeuroD, un’altra proteina bHLH che agisce
in uno stadio successivo.
a NeuroD nei vertebrati avrebbe funzioni simili ad Asense
Drosophila.
in
La neurogenina agisce prima della NeuroD nella neurogenesi dei
vertebrati (a)
L’mRNA per la neurogenina viene
espresso nei precursori neurali in
moltiplicazione
della
lamina
ventricolare del tubo neurale.
L’mRNA per la NeuroD viene espresso
nei neuroblasti in fase di migrazione che
hanno
abbandonato
la
zona
ventricolare.
La neurogenina agisce prima della NeuroD nella neurogenesi dei
vertebrati (b)
L’mRNA per la neurogenina viene iniettato in una delle due cellule in un embrione precoce di Xenopus
(inj)
Le cellule vengono poi marcate con una sonda per l’mRNA della β-tubulina specifica per i neuroni
(sinistra), o con una sonda per l’mRNA per la NeuroD (destra).
Con = controllo non iniettato
Ruolo della neurogenina nella neurogenesi dei vertebrati
a Nei topi vi sono 2 geni neurogenina.
a Nei topi knockout per il gene neurogenina-1, nella regione della testa
non si sviluppa il ganglio del trigemino. Altre regioni del sistema
nervoso si sviluppano normalmente perchè probabilmente la
neurogenesi in queste regioni è regolata da neurogenina-2 o altre
proteine HLH.
a Nelle regioni del sitema nervoso centrale influenzate dalla perdita di
neurogenina-1, lo sviluppo si arresta prima dell’attivazione
dell’espressione di NeuroD (neurogenina-1 è necessaria per attivare
NeuroD in queste regioni!)
I circuiti di regolazione mediati dalle bHLH possono
agire nella specificazione di altri tipi di cellule
a La proteine bHLH chiamata SCL contribuisce alla determinazione delle
cellule staminali ematopoietiche, che si differenziano per generare i molti
tipi diversi di cellule del sangue.
a Le proteine bHLH sono molto conservate nell’evoluzione. Esempi di
proteine di questo tipo sono presenti in C. elegans e nello cnidaro Hydra
vulgaris che dal punto di vista evoluzionistico si separò dagli artropodi
circa 600 milioni di anni fa.
a I meccanismi di regolazione responsabili della restrizione di
particolari vie di sviluppo a specifiche cellule di un embrione
sono complessi e non ancora completamente chiariti.
Es.: Perchè specifiche cellule di un somite vengono
selezionate per diventare mioblasti, mentre altre cellule sono
destinate a diventare tessuti non muscolari?
a L’esempio più conosciuto della restrizione di sviluppo di
specifiche cellule si ha durante la formazione delle setole
sensitive di Drosophila.
L’espressione localizzata di specifici fattori trascrizionali prefigura la
genesi dei peli sensoriali di Drosophila.
a Le Drosophile sono dotate sul loro corpo
di molti peli, alcuni grandi ed altri piccoli.
a I peli sono organi di senso in miniatura,
componenti
del
sistema
nervoso
periferico
a Ciascun pelo è formato da 4 cellule: la
cellula
della
setola,
che
sporge
dall’epidermide, la cellula della cavità, in
cui la setola si inserisce, un neurone, che
trasmette l’informazione, ed una cellula
associata al neurone, detta di sostegno.
Struttura base di una setola meccanosensoriale
a Le 4 cellule della setola della Drosophila adulta derivano dall’epitelio di un
disco immaginale e tutte sono discendenti (nipoti o pronipoti) di un’unica
cellula madre sensoriale o anche SOP (sensory organ precursor, precursore
dell’organo sensoriale) che si distingue dalle future cellule epidermiche che le
stanno vicine. Un quinto discendente
migra lontano per diventare cellula gliale
Lo sviluppo delle setole sensoriali di Drosophila.
a I geni achaete e scute sono fondamentali per l’inizio della formazione dei peli
nell’epitelio del disco immaginale, e sono espressi proprio nelle regioni dove
si formeranno i peli.
a L’espressione di achaete e scute è transitoria, e solo un piccolo numero di
cellule che inizialmente esprimono questi geni si sviluppa in cellule madri
sensoriali. Le altre diventano epidermide comune.
a La condizione definita dall’espressione di achaete e scute viene detta
proneurale e achaete e scute sono chiamati geni proneurali.
a Le cellule proneurali hanno le istruzioni per procedere nel differenziamento
neurosensoriale, ma quello che faranno dipende dalle interazioni competitive
che si realizzano tra loro
Cellule sensoriali madri
In azzurro cellule madri sensoriali del disco immaginale dell’ala, colorate grazie a
un gene reporter lacZ inserito nel genoma vicino ad una sequenza di regolazione
che lo fa esprimere selettivamente nelle SOC .
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In viola cellule che esprimono Copyright
il gene
Lo sviluppo delle setole sensoriali di Drosophila.
a Le cellule proneurali che esprimono achaete e scute o entrambi i geni
contemporaneamente, sono presenti in gruppi nell’epitelio del disco
immaginale.
a Un solo membro del gruppo diventa una cellula madre sensoriale
a La restrizione del programma neuronale ad una sola cellula è il risultato della
riduzione nelle cellule circostanti dell’attività e dell’espressione delle proteine
proneurali Achaete e Scute.
a Ciascuna cellula madre sensoriale verrà alla fine circondata da cellule che
spengono l’espressione dei geni proneurali e sono condannate a differenziare
come epidermide.
Lo sviluppo delle setole sensoriali di Drosophila:
il ruolo delle proteine HLH inibitrici.
a Per la progressiva restrizione della potenzialità neuronale sono necessarie
proteine HLH inibitrici come la proteina Emc.
a La proteina Emc inibisce il legame di Achaete e Scute al DNA. Mutazioni nel
gene emc portano alla formazione di molteplici peli sensoriali da un solo
raggruppamento proneurale.
L’espressione di Emc è più bassa nella regione dei raggruppamenti proneurali
da cui si originerà la SOC.
Per la progressiva restrizione della potenzialità neuronale
sono necessarie sia proteine HLH inibitrici sia interazioni
cellulari locali.
La maggior parte delle cellule del disco immaginale esprime la Emc (rosa),
mentre solo piccoli gruppi di cellule, i gruppi proneurali, esprimono le proteine
bHLH proneurali (verde).
Lo sviluppo delle setole sensoriali di Drosophila:
il ruolo delle interazioni cellulari locali.
Interazioni cellulari a corto raggio circoscrivono ulteriormente la
formazione delle SOP, inibendo l’espressione di Achaete e/o
Schute in tutte le cellule del raggruppamento proneurale, tranne
una.
Un fenomeno di inibizione laterale regola l’organizzazione
fine dei tipi cellulari differenti.
a Una cellula che entra nella via di differenziazione della cellula madre
sensoriale manda alle vicine un segnale che dice loro di non fare la
stessa cosa: essa esercita la così detta inibizione laterale.
a Se ad una cellula che normalmente diventerebbe una cellula madre
sensoriale viene geneticamente impedito di farlo, una cellula proneurale
vicina, libera dall’inibizione laterale, diventerà al suo posto cellula
madre sensoriale.
Inibizione laterale.
a All’inizio tutte le cellule sono equivalenti e ciascuna invia un segnale inibitore
alle sue vicine.
a Le cellule che perdono la competizione, perdono la capacità di differenziarsi
come cellule SOP, perdendo
anche
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capacità
di inibire le cellule vicine.
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I geni responsabili dell’inibizione laterale
a I geni responsabili dell’inibizione laterale sono stati identificati mediante
studi su embrioni mutanti.
a Il gene Notch codifica per una proteina transmembrana che serve da
recettore per l’inibizione laterale. Le cellule mancanti di Notch seguono
una via di differenziamento di tipo neurale.
a Il gene Delta, codifica un’altra proteina transmembrana che sembra
essere un ligando che si lega a Notch e lo attiva; l’inibizione laterale
sembra essere trasmessa attraverso contatti cellula cellula.
a A valle di Notch i prodotti di altri geni interpretano il segnale e
sopprimono il differenziamento di tipo neuronale portando allo
spegnimento dei geni proneurali.
L’inibizione laterale è mediata dalla via di
segnalazione di Notch
a In una piccola regione, una
singola cellula - la futura
cellula sensoriale madre emerge come vincitrice dalla
competizione mandando un
forte segnale inibitore ai
suoi vicini più prossimi
senza ricevere un segnale
dello stesso tipo.
Inattivazione del fenomeno dell’inibizione laterale.
a Nel caso di mutazioni del
gene Delta, la riduzione
dell’inibizione laterale fà
sì che quasi tutte le
cellule si sviluppino come
cellule madri sensoriali
creando
un
notevole
eccesso di peli sensori
Le interazioni intercellulari che riducono l’espressione dei
geni proneurali sono fondamentali per la determinazione di
un’unica SOP in un raggruppamento proneurale
L’interazione della Delta con la Notch stimola una
via intracellulare di tramissione del segnale che
L’espressione della Delta è
attiva il fattore di trascrizione Su(H) che a sua
promossa dalla Achaete
volta induce l’espressione dei geni E(spl) che
codificano proteine HLH che inibiscono
l’espressione dei geni proneurali
tra cui ac.
Il gene Notch e lo sviluppo dei peli sensoriali
a Lo stesso meccanismo di inibizione laterale dipendente da Notch opera due
volte nella formazione dei peli:
1) per forzare le potenziali cellule madri sensoriali vicine a diventare cellule
epidermiche;
2) per far sì che le quattro cellule discendenti dalla cellula madre sensoriale
seguano vie diverse di differenziamento così da formare i quattro tipi
cellulari differenti.
a La via che opera in assenza di Notch è la via neuronale.
Numb influenza l’inibizione laterale durante lo
sviluppo delle setole
a Nello sviluppo dei diversi tipi cellulari della setola sensoriale un ruolo chiave
è svolto dalla proteina Numb
a In ciascuna delle divisioni della cellula sensoriale madre e della sua progenie, la
proteina Numb si localizza ad una estremità della cellula che si divide, così che è
ereditata solo da una delle cellule figlie;
a Numb interagisce con Notch, bloccandone l’attività.
a La cellula che contiene Numb è sorda ai segnali inibitori, mentre la sorella è
sensibile. Poichè entrambe le cellule esprimono il ligando di Notch Delta, la cellula
che eredita Numb procede sino a diventare neurone, spingendo la sorella verso un
destino non neurale
La specificazione dell’asse antero-posteriore
durante l’embriogenesi
a Oltre a diversi tipi di cellule, gli organismi pluricellulari presentano
notevoli differenze regionali nella loro organizzazione cellulare
a I tessuti delle mani e dei piedi sono composti, per esempio, dalle
stesse cellule organizzate in modo diverso.
a Quali meccanismi determinano l’organizzazione cellulare di parti
diverse di un organismo?
a Quali meccanismi specificano che un’estremità dell’embrione
diventerà la testa, mentre l’altra la coda?
a In che modo vengono controllate le dimensioni e la posizione dei
vari organi?
a Come viene definito, cioè, il piano corporeo?
Sviluppo della Drosophila dall’uovo alla mosca adulta
La Drosophila ha due forme vitali
I dischi immaginali
a Durante
la
fase
iniziale
dell’embriogenesi,
gruppi
di
cellule
apparentemente
non
differenziate, chiamati dischi
immaginali vengono separati dai
tessuti circostanti e trasportati
all’interno della larva.
a Questi gruppi di cellule danno
origine alle strutture epidermiche
dell’adulto (ali, zampe, etc.)
a Altri gruppi di cellule immaginali
formeranno l’addome e gli organi
interni del moscerino (apparato
digerente, muscolatura, sistema
nervoso centrale)
19 dischi immaginali sono disposti come 9 paia su entrambi i
lati della larva più 1 disco nel mezzo
Un oocita di Drosophila nel suo follicolo
a
a
a
Una singola cellula germinale, che si divide 4 volte, genera 16 cellule. Una di queste cellule completa
la meiosi, diventando un ovocita.
Le altre 15 cellule diventano cellule nutrici che sintetizzano proteine e RNA che vengono trasportati
nell’ovocita attraverso ponti citoplasmatici
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Ogni gruppo di 16 cellule è circondato
da
un
singolo
strato di cellule follicolari che formano
l’involucro dell’uovo.
Struttura di un ovocita di Drosophila in tre stadi della
sua maturazione
L’informazione per il piano corporeo viene generata
durante l’ovogenesi e le prime fasi dell’embriogenesi
a L’embriogenesi viene attivata dalla fecondazione
a La polarità dell’embrione precoce è già esistene nell’ovocita maturo,
le cui estremità anteriore e posteriore sono diverse
a Alcuni degli mRNA prodotti dalle cellule nutrici si localizzano in
domini spaziali dell’ovocita.
a Le prime 13 divisioni nucleari dell’uovo fecondato sono sincrone e
rapide, e non essendo accompagnate dalla divisione cellulare, danno
origine ad un sincizio.
a I nuclei migrano verso la membrana plasmatica dell’embrione e danno
vita al così detto blastoderma sinciziale.
a Attorno ai nuclei si formano quindi le membrane plasmatiche e si
genera un blastoderma
cellulare.
Sviluppo dell’uovo di Drosophila dalla sua fecondazione
allo stadio di blastoderma cellulare
= actina
= cromosomi
Sezione ottica di nuclei di blastoderma che
subiscono mitosi alla transizione fra lo stadio di
blastoderma sinciziale e quello di blastoderma
cellulare
Formazione della blastula durante la fase iniziale
dell’embriogenesi in Drosophila.
Metodi per lo studio dell’espressione genica nelle
fasi precoci dello sviluppo di Drosophila
I prodotti genici possono essere resi
visibili al microscopio mediante
l’ibridazione in situ (a) e la colorazione
con anticorpi (b).
L’espressione genica negli embrioni di
moscerino può anche essere studiata
usando in animali transgenici un
costrutto con un gene reporter, come il
gene LacZ di E. coli che codifica la βgalattosidasi, fuso ad una sequenza
regolativa di interesse.
a In Drosophila, gli eventi precoci che determinano l’organizzazione
corporea si verificano prima della formazione della blastula, cioè
prima della cellularizzazione dell’embrione.
a La regolazione dell’organizzazione spaziale dell’embrione avviene
grazie alla diffusione di proteine, prevalentemente fattori
trascrizionali, nel sincizio in via di sviluppo.
a Fino allo stato di blastoderma cellulare, lo sviluppo della Drosophila
dipende in gran parte da scorte di mRNA e di proteine materne che si
sono accumulate nell’uovo prima della fecondazione
a Questa strategia è molto diversa da quella attuata da altri organismi,
compresi i mammiferi.
I morfogeni regolano lo sviluppo in funzione della
loro concentrazione
a Morfogeno = sostanza che specifica l’identità cellulare in funzione della
sua concentrazione.
a Il gradiente continuo di concentrazione di un morfogeno può stimolare una
serie di risposte cellulari tipiche in corrispondenza di un numero finito di
concentrazioni soglia: al di sopra di una determinata concentrazione soglia
viene prodotta una risposta, al di sotto le cellule rispondono in modo
diverso.
a I morfogeni che controllano lo sviluppo lungo l’asse antero-posteriore
dell’embrione di Drosophila sono fattori trascrizionali che diffondono nel
citoplasma comune del blastoderma sinciziale.
Componenti localizzate ad una estremità dell’uovo di
Drosophila controllano la sua polarità anteroposteriore
L’embrione non svilupperà i segmenti
della testa
X
I geni materni importanti per lo sviluppo della
Drosophila.
a Lo studio delle mutazioni che influenzano le prime fasi dello sviluppo di Drosophila,
ha portato all’identificazione di quattro gruppi di geni materni che controllano
l’organizzazione corporea precoce dell’embrione di moscerino:
a I geni del gruppo anteriore Æ regione cefalica e toracica
a I geni del gruppo posteriore Æ segmenti addominali
a I geni del gruppo terminale Æ regione più rostrale e quella più caudale
a I geni del gruppo dorsoventrale Æ regioni lungo l’asse dorsoventrale.
a I geni materni vengono trascritti nelle cellule nutrici durante l’ovogenesi ed i
corrispondenti mRNA vengono trasportati nell’ovocita.
a Nell’embrione precoce di Drosophila, i gradienti di concentrazione di fattori di
trascrizione prodotti da mRNA materni controllano la trascrizione di geni zigotici in
domini spaziali circoscritti. I prodotti di questi geni zigotici, controllano la trascrizione
di altri geni zigotici definendo ulteriormente gli specifici domini spaziali dell’attività
genica dell’embrione
I domini dei sistemi anteriore, posteriore e terminale dei
geni della polarità dell’uovo
I diagrammi mostrano i destini
delle diverse regioni
dell’uovo/embrione precoce e in
bianco indicano le parti che non
si sviluppano se il sistema
anteriore, posteriore o terminale è
difettoso
La conformazioni delle strutture esterne (cuticolari) dell’embrione di
Drosophila è riproducibile e funge da indicatore dell’identità regionale.
Anteriore
Ventrale
wt
bicoid
(gruppo anteriore)
oskar
(gruppo posteriore)
L’eredità di mutazioni dei geni della polarità dell’uovo
a Tutti i geni della polarità dell’uovo delle classi anteriore, posteriore, terminale e
dorsoventrale sono geni ad effetto materno:
materno è il genoma della madre, non il genoma
dello zigote che è decisivo.
a Una mosca i cui cromosomi sono mutati in entrambe le copie del gene bicoid, ma che
nasce da una madre che porta una copia normale di bicoid si sviluppa in modo
normale.
a Se la mosca figlia è femmina, le sue uova si svilupperanno in embrioni senza testa,
indipendentemente dal genotipo del padre.
a L’uso dei geni della polarità dell’uovo è tipica solo della Drosophila e di insetti
collegati.
Il gene materno bicoid specifica la regione
anteriore di Drosophila
a Il primo morfogeno descritto a livello molecolare è
stata la proteina codificata dal locus bicoid di
Drosophila.
a L’mRNA bicoid viene sintetizzato nelle cellule nutrici
durante l’ovogenesi e poi, trasportato nell’ovocita, è
localizzato nella regione più rostrale, o polo anteriore,
dell’embrione.
a La localizzazione anteriore dell’mRNA bicoid dipende
dalla sua estremità non tradotta 3’ e dai prodotti di altri
geni materni
a La proteina Bicoid diffonde quindi allontanandosi
dall’estremità anteriore attraverso il citoplasma e
stabilisce un gradiente di concentrazione lungo l’asse
antero-posteriore.
a L’espressione del gene bicoid
è transiente
Il gene bicoid codifica un fattore trascrizionale la
cui regione di legame al DNA è un omeodominio.
Il gradiente della concentrazione della proteina Bicoid nell’uovo di
Drosophila ha effetti sull’organizzazione dei segmenti
a In assenza di bicoid, i
segmenti
dotati
di
una
caratteristica anteriore non si
formano;
a aumentando il dosaggio di
bicoid, i segmenti si formano
in
posizione
progressivamente più lontana
dall’estremità
anteriore
dell’uovo;
a La posizione dei segmenti
anteriori è determinata dalla
concentrazione
locale
di
Bicoid
Il gradiente viene messo in evidenza colorando l’embrione con un
anticorpo contro Bicoid;
L’organizzazione segmentale colorando con anticorpi contro il
prodotto del gene even-skipped, un gene pair-rule
La proteina Bicoid regola direttamente la trascrizione di
hunchback
a Il gradiente di concentrazione della
proteina Bicoid definisce la regione
in cui viene espressa la proteina
Hunchback.
a La
proteina
direttamente
la
hunchback.
Dati sperimentali:
Bicoid
regola
trascrizione
di
1) la distribuzione spaziale della
proteina Hunchback corrisponde al
gradiente di concentrazione della
proteina Bicoid (a-c).
2)
Studi
di
regolazione
dell’espressione genica (d, e).
Il promotore wt di hunchback
contiene 3 siti ad alta affinità e 3 siti a
bassa affinità per Bicoid.
La proteina Bicoid regola direttamente la trascrizione di
hunchback
Conclusioni:
a Le variazioni dei livelli dei fattori
trascrizionali e il numero e/o
l’affinità delle specifiche sequenze
regolatrici
che
controllano
differenti
geni
bersaglio,
conribuiscono
a
produrre
configurazioni
diverse
dell’espressione genica durante lo
sviluppo.
Inibitori della traduzione di origine materna contribuiscono alla
determinazione precoce dell’organizzazione corporea di Drosophila.
a Due fonti dell’mRNA di hunchback (hb)
- l’mRNA derivato dalla trascrizione zigotica di hunchback,
controllata dalla proteina Bicoid e pertanto localizzata nella parte
anteriore;
- l’mRNA hunchback di origine materna, distribuito in modo
uniforme nell’embrione.
a Anche se l’mRNA di hunchback è presente in tutto l’embrione, la
proteina Hunchback non viene espressa nella regione posteriore.
a L’esclusione della proteina Hunchback dalla parte posteriore
dell’embrione dipende da un gene materno della polarità dell’uovo
del gruppo posteriore, detto nanos.
Il gene materno nanos
a L’mRNA materno nanos, localizzato nel polo posteriore, codifica un
morfogeno che agisce inibendo la traduzione dell’mRNA materno di
hunchback.
a Altri geni materni del gruppo posteriore (es.: oskar) sono necessari per
la localizzazione dell’mRNA nanos nel polo posteriore.
Nanos regola la traduzione di Hunchback
a Nanos agisce in associazione con la
proteina Pumilio, anch’essa codificata da
un gene materno del gruppo posteriore,
inibendo
la
traduzione
dell’mRNA
hunchback.
a L’inibizione
dipende
da
sequenze
specifiche della regione 3’ UTR dell’mRNA
hunchback (NRE, Nanos responsive
element).
a Nanos
induce
la
deadenilazione
dell’mRNA hunchback e in tal modo riduce
la sua traduzione.
Nanos contribuisce a stabilire il gradiente di Hunchback
a La proteina Hunchback di origine
materna, grazie all’azione combinata di
Nanos e Pumilio, viene espressa
secondo un gradiente che va nella
stessa direzione (antero-posteriore) di
quello della proteina Hb prodotta dalla
trascrizione zigotica del gene hb
regolata da Bicoid.
Inibitori della traduzione di origine materna contribuiscono
alla determinazione precoce dell’organizzazione corporea
di Drosophila.
a Bicoid agisce anche nella regolazione di un altro gene per
l’organizzazione corporea precoce di Drosophila, il gene materno
per l’organizzazione della regione posteriore dell’embrione caudal.
a L’mRNA materno caudal, come l’mRNA materno hunchback, è
uniformemente distribuito nell’embrione precoce.
a Bicoid si lega, con il suo omeodominio, ad una sequenza specifica
nella regione 3’ UTR dell’mRNA caudal e ne inibisce la traduzione.
I geni gap.
a La proteina Bicoid di origine materna
attiva l’espressione dei geni zigotici gap
(es. hunchback) nella regione anteriore,
mentre sia la Bicoid che la Caudal
controllano l’espressione dei geni gap
in regioni più caudali.
a I geni gap (hunchback, Krüpple, knirps
e giant) vengono espressi in domini
spaziali specifici nel corso delle prime 2
ore dopo la fecondazione e prima della
cellularizzazione,
determinando
le
divisioni più grossolane dell’embrione.
I geni gap.
a Mutazioni
in
un
gene
gap
provocano ampie lacune (gap)
nella
strutturazione
anteroposteriore dell’embrione.
L’espressione differenziale dei vari geni gap suddivide
ulteriormente l’embrione di Drosophila in domini spaziali
specifici.
a I
confini
dei
domini
di
espressione
delle
proteine
Krüpple,
Knirps
e
Giant
riflettono
il
bilancio
tra
attivazione e repressione della
trascrizione da parte delle
proteine
Bicoid,
Caudal
e
Hunchback, il prodotto dei geni
gap epresso per primo durante
lo sviluppo.
L’espressione del gene Krüpple .
a Concentrazioni elevate di Hunchback inibiscono la trascrizione di Krüpple
mentre al disotto di una concentrazione critica la Hunchback attiva la
trascrizionbe di Krüpple.
Questa soglia stabilisce il confine anteriore dell’espressione di Krüppel.
a Posteriormente la concentrazione di Hunchback scende al di sotto della soglia
per l’attivazione di Krüpple.
L’espressione dei geni gap knirps e giant
a Le proteine Knirps e Giant sono localizzate in 2 domini.
L’espressione nei domini anteriori è attivata da Bicoid, mentre nei domini
posteriori è attivata dall’azione congiunta di Bicoid e Caudal.
I confini anteriori dei domini posteriori vengono stabiliti dall’inibizione della
trascrizione da parte di Hunchback.
L’espressione di tre gruppi di geni zigotici completa
l’organizzazione corporea precoce di Drosophila.
I geni materni dei gruppi anteriore e posteriore ed i geni gap suddividono
l’embrione in diversi domini di espressione, ciascuno caratterizzato da
combinazioni diverse di fattori trascrizionali.
Questi fattori, presenti in concentrazioni ed in combinazioni diverse,
suddividono ulteriormente l’embrione in specifici domini attivando la
trascrizione dei geni zigotici:
a Pair-rule
a Segment-polarity (della polarità
dei segmenti)
a Selector
L’espressione di tre gruppi di geni zigotici completa
l’organizzazione corporea precoce di Drosophila.
a I geni pair-rule e segment polarity, analogamente ai geni
materni e ai geni gap, vengono espressi temporaneamente e la
loro funzione è quella di determinare i domini spaziali in cui
vengono espressi i geni selector.
a I
geni
selector
vengono
espressi
ininterrottamente
dall’embrione fino all’adulto e sono necessari per specificare e
mantenere l’identità regionale lungo l’asse antero-posteriore.
Relazione tra i segmenti del moscerino adulto e i
parasegmenti, che sono le unità di sviluppo corrispondenti ai
domini di attività dei geni selector.
Il margine anteriore di
ciascun
parasegmento,
che
corrisponde
al
compartimento posteriore
di ciascun segmento, è
deterimato da cellule che
esprimono
il
gene
segment
polarity,
engrailed.
Segmenti
Parasegmenti
I geni pair-rule
a I geni pair-rule (fushi tarazu, hairy ed
even-skipped)
codificano
fattori
trascrizionali che vengono espressi in
bande di cellule corrispondenti a
parasegmenti, localizzate nella parte
centrale dell’embrione.
a Ciascuno dei geni pair-rule viene
espresso in sette parasegmenti, che
possono essere quelli pari o quelli
dispari.
a Mutazioni in questi geni provocano
una serie di delezioni che riguardano
segmenti
alternati,
lasciando
l’embrione con la metà dei segmenti
rispetto al normale.
WT
mut
L’espressione del gene even skipped
a Le sequenze regolatrici del gene eve sono disegnate per leggere la
concentrazione di proteine regolatrici in ciascuna posizione lungo l’embrione e
ad interpretare questa informazione in modo da far esprimere il gene in 7 strisce
lungo l’asse antero-posteriore dell’embrione.
Oraganizzazione modulare del DNA regolatore del gene eve
a Le singole strisce di espressione di eve dipendono da moduli regolatori
separati nel DNA regolatore di eve.
a La maggior parte dei geni di segmentazione ha anche funzioni importanti in altri
momenti e luoghi durante lo sviluppo della Drosophila.
Il gene eve è espresso in sottoclassi
di neuroni in precursori delle cellule muscolari e
in vari altri siti, sotto il controllo di enhancer addizionali
L’espressione del gene even skipped
a La regione regolatrice di
eve è molto grande ed è
formata da una serie di
moduli
regolatori
ciascuno dei quali è
responsabile
della
specificazione di una
particolare striscia di
espressione di eve lungo
l’embrione.
a Ciascun
regolatore
isolato.
modulo
può essere
Modulo regolatore della striscia 2 di eve.
a Il modulo regolatore della
striscia 2 di eve contiene
sequenze di riconoscimento
per
due attivatori trascrizionali
(Bicoid e Hunchback)
e
due inibitori trascrizionali
(Krüpple e Giant)
Distribuzione delle proteine regolatrici che assicurano
l’espressione di eve nella striscia 2.
a Le concentrazioni relative dei
4
fattori
trascrizionali
determinano la formazione o
meno di complessi proteici
sul modulo della striscia 2
che
accendono
la
trascrizione di eve.
a L’espressione di eve nella
striscia 2 avviene soltanto
nella posizione in cui sono
presenti i due attivatori
(Bicoid e Hunchback) e sono
assenti i due repressori
(Krüpple e Giant).
Espressione di Even-skipped (Eve) della striscia 2
nell’embrione di Drosophila.
I geni segment-polarity
a
Ogni parasegmento viene ulteriormente
suddiviso mediante l’azione dei geni
segment-polarity
(es.
Wingless
ed
engrailed).
a
La cellularizzazione dell’embrione è stata
completata.
I
geni
segment-polarity
codificano proteine di secrezione che
trasmettono alle cellule vicine segnali
concernenti gli eventi dello sviluppo
a
I geni segment-polarity sono responsabili
dell’organizzazione spaziale delle cellule
nell’ambito di ciascun segmento
a
Mutazioni in questi geni producono larve
con un numero normale di segmenti ma con
una parte di ciascun segmento deleta e
sostituita da un duplicato speculare di tutto
o di una parte del resto del segmento
Espressione del gene segment polarity engrailed
Il margine anteriore di
ciascun
parasegmento,
che
corrisponde
al
compartimento posteriore
di ciascun segmento, è
deterimato da cellule che
esprimono
il
gene
segment
polarity,
engrailed.
Segmenti
Parasegmenti
I geni selector
a I successivi geni che devono essere trascritti nella gerarchia di
regolazione che controlla la regionalizzazone dell’embrione di
Drosophila sono i geni selector.
a I prodotti dei geni selector regolano lo sviluppo dei domini
parasegmentali
a L’espressione dei geni selector viene determinato nell’embrione
precoce e mantenuto nel moscerino adulto. L’espressione continua è
necessaria per determinare le strutture delle varie parti del corpo lungo
l’asse antero-posteriore.
a Mutazioni dei geni selector spesso causano omeosi,
trasformazione di una parte del corpo in un’altra.
cioè
la
Gerarchia regolatrice dei geni della polarità dell’uovo, gap,
di segmentazione e selettori omeotici
Mutazioni dei geni selector spesso causano omeosi
(Antennapedia)
L’espressione non appropiata del gene Antennapedia (Antp), che
normalmente dirige lo sviluppo del quarto parasegmento, nell’abbozzo di
un’antenna ha come risultato il suo sviluppo in zampa anziché in antenna
Antennapedia
WT
Antennapedia
Mutazioni dei geni selector spesso causano omeosi
(Ultrabitorax)
La perdita di Ubx, che dirige il normale sviluppo del sesto parasegmento,
porta allo sviluppo di una coppia di ali al posto dei bilancieri, o altere.
Schema dell’espressione di vari geni durante lo sviluppo precoce
dell’embrione di Drosophila e localizzazione dei loro prodotti genici
Geni gap
cellularizzazione
Geni
pair.-rule
Geni
Segment-polarity
Geni selector
I prodotti dei geni gap
determinano prevalentemente
i domini di espressione dei
g e n i
s e l e c t o r .
Schema dell’espressione di vari geni durante lo sviluppo precoce
dell’embrione di Drosophila e localizzazione dei loro prodotti genici
a Al momento della cellularizzazione ogni
parasegmento è formato da 4 strisce di
cellule.
a In ciascun parasegmento ogni striscia di
cellule è caratterizzata dall’espressione di
un insieme peculiare di geni pair-rule e
segment-polarity. Queste configurazioni
dell’espressione fungono da indicatori
della posizione e distinguono ogni
striscia di cellule di un parasegmento.
a Le proteine dei geni selector specificano
l’organizzazione delle strutture larvali e
adulte
nel
contesto
dell’identità
posizionale delle cellule di ciascun
parasegmento.
I geni selector (Hox)
a I geni selector agiscono nella specificazione lungo l’asse anteroposteriore delle strutture epidermiche (la superficie esterna), della
muscolatura, del tessuto nervoso e dell’apparato digerente.
a Il ruolo dei geni selector nella regolazione dello sviluppo dell’epidermide è
conosciuto meglio.
a Due raggruppamenti di geni selector svolgono un ruolo centrale nel
controllo della regionalizzazione delle strutture esterne lungo l’asse
antero-posteriore di Drosophila:
• Il complesso bithorax (BX-C)
• Il complesso antennapedia (ANT-C)
Il complesso bithorax ed il complesso antennapedia
a Il complesso bithorax (BX-C) è costituito da 3 geni, Ultrabitorax (Ubx),
abdominalA (abdA) ed AbdominalB (AbdB), che controllano lo sviluppo
dei parasegmenti 5-14.
a Il complesso antennapedia (ANT-C) è costituito da 5 geni, labial (lab),
proboscipedia (pb), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr) ed
Antennapedia (Antp), che controllano lo sviluppo dei parasegmenti 0-5.
a Entrambi i raggruppamenti genici si trovano sul cromosoma III;
a L’ordine lineare dei geni dei due complessi corrisponde all’ordine con cui
vengono espressi lungo l’asse del corpo.
a Lo sviluppo del cervello sia nel moscerino che nei mammiferi è
controllato da un’altra serie di geni omologhi ai geni selector.
I geni selector (Hox) sono disposti nel genoma in
raggruppamenti.
Il complesso bithorax (BX-C)
controlla lo sviluppo dei parasegmenti 5-14
Contributo dei geni BX-C alla determinazione
dell’identità dei parasegmenti
(mutazioni che provocano perdita della funzione)
Le caratteristiche della cuticola della larva sono
utilizzate per attribuire un’identità a ciascun
parasegmento.
La delezione dell’intero BX-C causa
trasformazione dei parasegmenti 5-13
parasegmento 4. Il BX-C reprime l’identità
parasegmento 4 e permette la specificazione
parasegmenti più posteriori
la
nel
del
dei
I geni BX-C devono essere espressi lungo l’asse
del corpo secondo la sequenza Ubx, abdA e AbdB,
che corrisponde all’ordine con cui sono disposti
nel genoma
Mutazioni che provocano incremento della funzione dei
geni BX-C
a I ricercatori hanno studiato anche l’effetto di mutazioni che
causano incremento di funzione dei geni BX-C.
a In embrioni transgenici che esprimono il gene Ubx in modo
uniforme lungo l’asse antero-posteriore (sotto il controllo di un
promotore di un gene per lo shock termico) invece che nei soli
parasegmenti 5 e 6, i parasegmenti 6-14 si formano normalmente,
mentre i parasegmenti 1-5 si trasformano nel parasegmento 6.
Trasformazione della morfologia in senso anterioreÆposteriore
a Durante il normale sviluppo l’identità dei parasegmenti anteriori (15) è determinata dal locus ANT-C.
Contributo dei geni BX-C alla determinazione dell’identità
dei parasegmenti
a I geni selector espressi più posteriormente inibiscono l’azione dei
geni espressi in regioni più anteriori.
a Espressione ectopica di un gene Hox in una regione più anteriore
rispetto al suo dominio di espressione provoca una
trasformazione anterioreÆposteriore.
a Benchè sia chiaro che i geni del locus BX-C ed altri geni Hox
controllino la specificazione dei tessuti lungo l’asse anteroposteriore, i meccanismi che mediano tali effetti sono
scarsamente conosciuti.
a I geni Hox vengono trascritti dopo la cellularizzazione quando la
comunicazione intercellulare deve essere coinvolta nella
determinazione del piano corporeo.
La specificità della funzione delle proteine Hox di
Drosophila è mediata dalla proteina Exd.
a E’ molto probabile che, come i fattori di trascrizione espressi all’inizio
dell’embriogenesi, anche i geni dei loci BX-C e ANT-C controllino lo
sviluppo regolando l’espressione di gruppi diversi di geni bersaglio.
a Le differenti proteine Hox, tuttavia, si legano con alta affinità alla stessa
sequenza di DNA.
a La capacità delle proteine Hox di controllare l’espressione di geni diversi
dipende dal prodotto del gene extradentical (exd)
a Negli embrioni di Drosophila mutanti per exd i geni Hox si esprimono
normalmente ma le strutture da essi controllate non si sviluppano
normalmente
La specificità della funzione delle proteine Hox di
Drosophila è mediata dalla proteina Exd.
a La proteina omeodominio Exd si
associa a proteine Hox diverse,
formando eterodimeri che presentano
differenti specificità di legame.
a La proteina Exd potrebbe contribuire
anche alla specificità di funzione delle
proteine Hox convertendo quelle ad
(Deformed)
essa legate da repressori in attivatori
(Labial)
L’espressione dei geni Hox viene mantenuta mediante
autoregolazione.
a Molte proteine espresse nel periodo iniziale dell’embriogenesi che
sono necessarie per il corretto sviluppo e per stabilire le regioni
specifiche dell’espressione dei geni Hox, vengono sintetizzate solo
temporaneamente durante l’embriogenesi.
a Una volta attivati, invece, i geni Hox devono continuare ad essere
trascritti durante tutto lo sviluppo ed anche nella vita adulta.
a Le regioni di controllo della trascrizione dei geni Hox contengono siti
di legame per le proteine da essi codificate.
a Le proteine Hox mantengono la propria espressione attraverso un
ciclo di autoregolazione.
La configurazione dell’espressione della β-galattosidasi negli
embrioni transgenici riproduce quella di Lab e di Dfd
Sito GC specifico per Labial
Sito TA specifico per Deformed
Cambi nella struttura della cromatina anche
influenzano l’espressione dei geni Hox
a Per mantenere la normale espressione dei geni Hox sono anche
necessarie proteine che modulano la struttura della cromatina:
le proteine Polycomb che sono necessarie per mantenere silenti quei
geni selector omeotici che non devono essere espressi;
le proteine Trithorax che sono necessarie per mantenere attiva
l’espressione di molti geni omeotici.
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I geni Hox nei mammiferi
a I geni dei loci ANT-C e BX-C di Drosophila contengono una regione
omologa, la sequenza omeobox, che codifica il motivo omeodominio
che lega il DNA.
a Utilizzando come sonde di DNA le regioni dei geni di Drosophila che
contenevano l’omeobox, sono stati isolati i geni di mammifero
omologhi ai geni selector.
a Studi di knockout hanno dimostrato che anche i geni di mammifero
svolgono un ruolo importante nella regolazione dello sviluppo di
specifiche regioni lungo l’asse antero-posteriore
I geni dei mammiferi omologhi dei geni dei loci ANT-C and
BX-C di Drosophila sono disposti in quattro complessi Hox.
I geni omologhi situati in raggruppamenti diversi di geni Hox sono definiti paraloghi
Domini di espressione dei geni Hox negli embrioni
di Drosophila e di topo
L’ordine secondo cui i geni sono disposti nel genoma è colineare con l’ordine secondo cui
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(c) by W. antero-posteriore
H. Freeman and Company
vengono espressi lungo
l’asse
dell’organismo
I geni Hox dei vertebrati
a I meccanismi attraverso cui vengono stabilite le configurazioni
dell’espressione di geni Hox dei vertebrati sono in gran parte
sconosciuti.
a E’ molto probabile che questi meccanismi siano diversi da quelli di
Drosophila dal momento che gli embrioni dei vertebrati sono
cellularizzati e non esistono sotto forma di sincizio.
a Esistono nei mammiferi i geni omologhi del gene exd (nei mammiferi
Pbx) e dei geni dei gruppi polycomb e trithorax.
I meccanismi per il controllo della specificità di legame al DNA delle
proteine Hox e per il mantenimento della loro espressione potrebbero
essere simili nella Drosophila e negli organismi superiori.
a Anche il meccanismo attraverso cui questi geni coordinano la
determinazione del destino delle cellule controllando l’espressione di geni
specifici è in gran parte sconosciuto
Mutazioni dei geni Hox di topo
a I geni che formano i complessi Hox di Drosophila sono stati isolati in
base alle anomalie dello sviluppo osservate nei moscerini che
possedevano mutazioni in questi geni.
a I geni Hox dei mammiferi sono stati isolati in base alle omologie di
sequenza con I geni della Drosophila.
a Per determinare il ruolo funzionale dei diversi geni Hox nel topo sono
state utilizzate le tecniche del knockout di geni e dei transgeni.
a I risultati ottenuti da questi esperimenti hanno confermato che i geni
Hox dei mammiferi e del moscerino svolgono ruoli qualitativamente
simili nel controllo dell’identità regionale lungo l’asse anteroposteriore.
Mutazioni che provocano incremento della funzione del
gene Hoxd-4
a La proteina Hoxd-4 del topo è omologa alla proteina
Deformed di Drosophila codificata da un gene del
ANT-C.
a Il confine anteriore dell’espressione della proteina
Hoxd-4 nell’embrione di topo include i precursori
che normalmente danno origine alle vertebre
cervicali.
a In un topo transgenico in cui il gene Hoxd-4 viene
espresso sotto il controllo delle sequenze regolatrici
del gene Hoxa-1, che normalmente viene espresso
in un dominio più anteriore, le vertebre anteriori
(occipitali) sono morfologicamente simili a quelle
più caudali (cervicali).
a Anche
nel
topo,
come
nella
Drosophila,
l’espressione di un prodotto dei geni Hox in una
regione più craniale rispetto a quella dove è
normalmente espresso, porta ad una trasformazione
della regione in senso posteriore
Mutazioni che provocano perdita della
funzione dei geni Hox-4.
a La presenza di molteplici copie (paraloghi) dei geni Hox rende difficile
l’interpretazione dei dati dei knockout.
a Sono stati necessari doppi e tripli mutanti per comprendere la funzione dei
quattro paraloghi Hox-4.
a I paraloghi Hox-4 hanno domini di epressione che si sovrappongono ma che
non sono identici, nella regione cervicale delle prevertebre dell’embrione di
topo.
Mutazioni che provocano perdita della
funzione dei geni Hox-4 (b).
a Le vertebre assumono una
morfologia progressivamente
più anteriore a mano a mano
che
in
una
particolare
regione prevertebrale la dose
dei
paraloghi
Hox-4
diminuisce
(prevalenza
posteriore).
a I geni Hox dei vertebrati,
come
gli
omologhi
di
Drosophila,
inibiscono
l’attività di altri geni Hox
espressi in domini più
craniali
La specificazione dell’identità degli organi floreali di
Arabidopsis.
I fiori contengono quattro organi diversi
a I fiori contengono 4 organi diversi, chiamati sepali, petali, stami e carpelli,
organizzati in cerchi concentrici denominati verticilli.
a Arabidopsis possiede:
4 sepali nel verticillo 1
4 petali nel verticillo 2
6 stami nel verticillo 3
2 carpelli contenenti gli ovari nel verticillo 4
a Questi organi derivano da da un gruppo di cellule indifferenziate chiamate
meristema floreale.
a A mano a mano che le cellule al centro del meristema si dividono, uno dopo
l’altro, cominciando dall’esterno e procedendo verso l’interno si formano i
quattro anelli concentrici di primordi che daranno origine ai vari tessuti.
Tre classi di geni controllano l’identità degli organi floreali
a L’analisi delle mutazioni che causano la trasformazione di un organo
floreale in un altro ha portato all’identificazione di tre classi di geni
per l’identità degli organi floreali che sono necessarie per il normale
sviluppo del fiore.
a Queste mutazioni omeotiche sono equivalenti alle mutazioni
omeotiche dei moscerini e dei mammiferi in cui una parte del corpo
viene sostituita da un’altra
Nelle piante con mutazioni in tutte e tre le classi di geni per l’identità floreale (b) i
quattro organi floreali si trasformano in strutture simili a foglie.
Ciò indica che queste strutture sono foglie modificate
Tre classi di geni controllano l’identità degli organi
floreali
= verticillo
Tre classi di geni controllano l’identità degli organi floreali
Il modello ABC
a In base ai fenotipi dei mutanti per perdita di funzione dei geni per l’identità
degli organi floreali è stato proposto il modello ABC:
a I geni di classe A specificano l’identità dei sepali nel verticillo 1, e per
svolgere tale funzione non hanno bisogno dei geni di classe B e C;
a i geni di classe C specificano l’identità dei carpelli nel verticillo 4
indipendentemente dai geni di classe A e B;
a I geni delle classi A e B specificano i petali nel verticillo 2;
a i geni delle classi B e C specificano gli stami nel verticillo 3
a i geni A reprimono i C nei verticilli 1 e 2 e i geni C reprimono gli A nei
verticilli 3 e 4.
Tre classi di geni controllano l’identità degli organi
floreali
Espressione dei geni per l’identità degli organi
floreali
a I dati di espressione dei geni A, B e C in
piante wild type, mutanti per perdita di
funzione ed in piante transgeniche
confermano il modello ABC.
a Molti dei geni per l’identità degli organi
floreali codificano fattori trascrizionali
appartenenti alla famiglia MADS.
(gene della classe B sotto promotore gene classe A=
i geni B si esprimono in tutti i verticilli)

4. Contr genico nello sviluppo

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