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Scheda tecnica GENEDIA GD 315 Real Fattore V Ricerca del polimorfismo A1691G nel Fattore V di Leiden mediante Real Time PCR DESTINAZIONE D’USO: Il dispositivo Real Fattore V è un test “in vitro” per l’identificazione del polimorfismo (A1691G) gene codificante per il fattore V della coagulazione sul cromosoma 1, a partire da DNA genomico FATTORE V, SIGNIFICATO CLINICO: Alterazioni genetiche rappresentano le principali cause di trombosi ereditarie. Nel 1994 una mutazione puntiforme (sostituzione A-G) in posizione 1691, nell’esone 10 (nt 1487-1701) del gene codificante per il fattore V della coagulazione sul cromosoma 1, con conseguente sostituzione di un Arginina con una Glicina nell’aminoacido 506, è stata associata alla resistenza alla degradazione da Proteina C attivata (Bertina et al). Questa alterazione funzionale dell’emostasi sembra correlabile ad un incremento del rischio di trombosi venosa. Il saggio funzionale alla rAPC (resistenza alla proteina C attivata), si basa sulla determinazione di aPTT nel plasma del paziente in assenza ed in presenza di una concentrazione fissa di Proteina C attivata. Tale test viene naturalmente influenzato da molti fattori quali il citrato usato come anticoagulante, il cloruro di calcio, il tipo di attivatore, e la purezza della proteina C attivata. Si vede inoltre che ridotti livelli di F II e X possono alterare il risultato verso valori falsamente normali. Ciò rende impossibile la determinazione funzionale della rAPC durante la terapia anticoagulante orale, nel qual caso si deve ricorrere esclusivamente all’analisi genetica del DNA che permette di individuare la mutazione. La resistenza alla proteina C attivata è a trasmissione autosomica dominante. La mutazione è stata descritta nel 2-4% di un gruppo di controllo olandese , e nel 3-5% in quella di controllo del Regno Unito. La mutazione in eterozigosi è associata ad un aumento del 5-10% del rischio trombotico, mentre in omozigosi è associata ad un aumento del 50%. Distribuzione delle frequenze alleliche nelle diverse popolazioni. Legenda: A/A = area arancione A/G = area verde G/G = area blu Fonte: SNPedia.com/rs6025 PRINCIPIO DEL METODO Il dispositivo GD 315 Real Fattore V consente la ricerca del polimorfismo (rs6025) per il Fattore V di Leiden in campioni contenenti DNA genomico estratto da sangue intero. La procedura analitica eseguita in Real Time PCR consente la genotipizzazione, mediante l’utilizzo di due probes alleli specifici. SVILUPPATO E PRODOTTO IN ITALIA DA: GeneDia S.R.L.: VIA LOMBARDA, 169/A – 55013 LAMMARI (LU) TEL./FAX +39(0)583 962672 – EMAIL [email protected] ; WWW.GENEDIA.IT AMPLIFICAZIONE E RIVELAZIONE La reazione d’amplificazione utilizza due sonde allele specifiche che consentono la discriminazione allelica. La fluorescenza emessa dalle due sonde, in due canali distinti (FAM e JOE) durante la fase d’estensione permette al termine della reazione di determinare la presenza dell’allele ricercato. • La presenza di un segnale d’amplificazione nel canale del FAM è relativo all’allele G • La presenza di un segnale d’amplificazione nel canale del JOE è relativo all’allele A Completata la reazione d’amplificazione il software visualizza il segnale d’amplificazione per i due canali (FAM e JOE) e selezionando un campione per volta è possibile verificare la presenza dell’allele ricercato. Fig.1 Esempio di campione omozigote G/G Fig.2 Esempio di campione omozigote A/A Fig.3 Esempio di campione eterozigote G/A PLOT DI DISCRIMINAZIONE ALLELICA Cycling A .Green - No Markers Cycling A .Yellow - Circles 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 Norm. Fluoro. La normalizzazione dei due segnali d’amplificazione e la determinazione del Ciclo Soglia del campione, nei canali FAM e JOE, consente al software per la discriminazione allelica di fornire il genotipo del campione in esame. 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 Threshold 0,00 1 No. 1 Name Sample 1 •-----• •-----• 2 Sample 2 9 Sample 9 •------• 2 3 4 Genotype ALLELE A 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Cycle 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Cycling A.Green Cycling A.Yellow No Reaction Reaction Eterozigote G/A Reaction Reaction ALLELE G Reaction No Reaction SVILUPPATO E PRODOTTO IN ITALIA DA: GeneDia S.R.L.: VIA LOMBARDA, 169/A – 55013 LAMMARI (LU) TEL./FAX +39(0)583 962672 – EMAIL [email protected] ; WWW.GENEDIA.IT 29 30 GD 315 REAL FATTORE V APPLICABILITÀ: Estratti di gDNA VOLUME DEL CAMPIONE: Minimo 10 microlitri NUMERO DI TEST: 40 reazioni SPECIFICITÀ: Rs6025 - Mutazione A1691G del gene del Fattore V di Leiden PROTOCOLLO VALIDATO PER STRUMENTAZIONE: Bio-Rad: CFX96™- iQ™5. Qiagen: Rotor-Gene® Q- Rotor-Gene® 6000-Rotor-Gene® 3000. Applied Biosystems: 7500- 7300- 7000- StepOne™ e StepOnePlus™ CONSERVAZIONE: a -20°C (spedizione refrigerata) STABILITÀ: 24 mesi se correttamente conservato. REAGENTI RICHIESTI: Dispositivo per l’estrazione del gDNA da sangue periferico (GD 241 Spin blood mini kit). NON COMPRESI NEL KIT DISPOSITIVI CORRELATI GD 316 REAL FATTORE II APPLICABILITÀ: Estratti di gDNA VOLUME DEL CAMPIONE: Minimo 10 microlitri NUMERO DI TEST: 40 reazioni SPECIFICITÀ: G20210A - Mutazione puntiforme della protrombina PROTOCOLLO VALIDATO PER STRUMENTAZIONE: Bio-Rad: CFX96™- iQ™5. Qiagen: Rotor-Gene® Q- Rotor-Gene® 6000-Rotor-Gene® 3000. Applied Biosystems: 7500- 7300- 7000- StepOne™ e StepOnePlus™ CONSERVAZIONE: a -20°C (spedizione refrigerata) STABILITÀ: 24 mesi se correttamente conservato. REAGENTI RICHIESTI: Dispositivo per l’estrazione del gDNA da sangue periferico (GD 241 Spin blood mini kit). NON COMPRESI NEL KIT BIBLIOGRAFIA: • Bertina RM, Koeleman BPC, Koester T, Rosendaal FR, Dirven RJ, de Ronde H, van der Valden PA, Reitsma PH. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature. 1994;369:64–67. • Furie B, Furie CB. Molecular and cellular biology of blood coagulation. N Eng J Med. 1992;326:800–806. • Malm J, Laurell M, Nilsson IM, Dahlback B. Thromboebolic disease. Critical evaluation of laboratory investigation. Thromb Haemost. 1992;68:7–13 • De Stefano V, Leone G, Mastrangelo S, Tripodi A, Rodeghiero F, Costaman G, Barbui T, Finazzi G, Bizzi B, Mannucci PM. Clinical manifestation and management of inherited trombophilia: retrospective analysis and follow-up after diagnosis of 238 patients with congenital deficiency of antithrombin III, protein C, protein S. Thromb Haemostas. 1994;72:352–358 SVILUPPATO E PRODOTTO IN ITALIA DA: GeneDia S.R.L.: VIA LOMBARDA, 169/A – 55013 LAMMARI (LU) TEL./FAX +39(0)583 962672 – EMAIL [email protected] ; WWW.GENEDIA.IT