Riggio Marilisa, Scudiero Rosaria, Borrelli Lucia, De Stasio Roberta

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Riggio Marilisa, Scudiero Rosaria, Borrelli Lucia, De Stasio Roberta
I Vertebrati ectotermi
del Parco Regionale del Matese, 2002
A cura di Odierna G. e Guarino F.M., pp. 139-147
Analisi del contenuto di “metalli traccia” e
dei meccanismi molecolari che ne controllano l’omeostasi
in Anfibi e Rettili del Parco del Matese
RIGGIO MARILISAa, SCUDIERO ROSARIAa,b, BORRELLI LUCIAa
DE STASIO ROBERTAa, FILOSA SILVANAa
a
Dipartimento di Biologia Evolutiva e Comparata
Università degli Studi di Napoli Federico II
b
Istituto di Biochimica delle Proteine ed Enzimologia, CNR, Napoli
Abstract
Heavy metals such as Zn, Cu, Fe, Mn are essential for life. However, a paradox exists
in that certain levels of heavy metals become toxic for organisms and, therefore, they
may result environmental pollutants. A number of organisms are used in environmental
biomonitoring as biological indicators to provide information about heavy metal pollution.
The impacts that heavy metal pollution produce on biological systems drive the interest
towards the mechanisms that organisms use to handle heavy metals.
We have focus our attention on reptiles and amphibia living in the protected area of
Matese Park, to be used potentially as indicator species of the environmental pollution.
In particular, we have measured metal content (zinc, copper and cadmium) in different
tissues and have cloned cDNA encoding metallothioneins (MTs) and high affinity copper
transporter (CTR), that are proteins involved in the homeostasis of heavy metals.
Introduzione
I metalli pesanti (zinco, rame, cadmio, mercurio, argento, nichel, cobalto) sono
componenti minori ed ubiquitari della biosfera. Essi sono presenti nell’ambiente
in quantità generalmente bassa, essendo per lo più sequestrati nei sedimenti, nel
suolo e nei giacimenti minerari. Per effetto di attività antropiche, la concentrazione dei metalli può aumentare di vari ordini di grandezza e, direttamente o attraverso la catena alimentare, essi possono essere accumulati nei tessuti degli organismi viventi.
I suddetti elementi, definiti “metalli traccia” perché in condizioni fisiologiche sono
presenti negli organismi viventi in quantità limitata, sono generalmente suddivisi
in due classi: la prima è composta da elementi come Zn, Cu, Fe, Mn, Mg, Co che,
a basse concentrazioni, si comportano come micronutrienti essenziali per la vita,
mentre risultano notevolmente tossici a concentrazioni elevate; la seconda classe
140
RIGGIO ET AL
comprende elementi quali Cd, Hg, Cr e Pb che risultano estremamente tossici
per gli organismi anche a basse concentrazioni e non sembrano avere funzione
biologica.
L’assunzione degli oligoelementi metallici da parte degli organismi è mediata dall’alimentazione: lo zinco e il rame sono assorbiti attraverso l’apparato
gastrointestinale, messi in circolo sotto forma di complessi proteici con l’albumina e rapidamente distribuiti agli organi (Cousin, 1985).
A livello cellulare i meccanismi di trasporto dei metalli attraverso le membrane
non sono completamente chiariti. Specifici trasportatori sono implicati nell’uptake
e nella secrezione cellulare degli oligoelementi essenziali. Nei lieviti (Kamizono &
Coll, 1989) e nei Mammiferi (Palmiter & Findley, 1995) sono state identificate le
proteine omologhe ZnT1, localizzate a livello della membrana plasmatica, responsabili del trasporto dello zinco. L’assenza di tali proteine in linee cellulari
mutate causa un’aumentata sensibilità alla tossicità dello zinco (Palmiter & Findley,
1995). Analogamente, le ATPasi transmembrana ad elevata affinità per il rame
(CTR) sono responsabili del trasporto del Cu attraverso le membrane plasmatiche
in S. cervisiae, S. pombe (Eide, 1998; Labbe & Thiele, 1999) e nei Mammiferi
(Pena & Coll, 1999). All’interno della cellula, i metalli possono reagire con vari
componenti citosolici, essere compartimentalizzati in organuli come i lisosomi e i
mitocondri o essere trasportati nel nucleo. È noto che la maggior parte dei metalli
risultano notevolmente tossici se presenti in forma libera nella cellula. Essi non
subiscono biotrasformazione e la tolleranza biologica nei loro confronti non può
essere realizzata, come nel caso delle sostanze organiche, da processi di demolizione in prodotti meno tossici. Pertanto la loro omeostasi è finemente regolata e la
richiesta fisiologica di oligoelementi metallici è correlata a meccanismi molecolari
adibiti al trasporto e al deposito di metalli in forma non tossica. Tali meccanismi
sono rappresentati dalle metallotioneine (MT), proteine di basso peso molecolare
(6-8 KDa), ricche di residui cisteinici in grado di formare complessi con i metalli
pesanti. Le MT sono state rinvenute in taluni procarioti, nei microrganismi
eucarioti, in molti vegetali e in numerosi phyla del regno animale (Kojima &
Hunziker, 1991). Le MT sono particolarmente abbondanti nei tessuti
parenchimatosi (il fegato e il rene mostrano la più forte immunoreattività), ma
esse sono presenti anche in altri tessuti e tipi cellulari (Shimada et al., 1997).
L’espressione delle MT è indotta in seguito all’esposizione dell’organismo ad elevate concentrazioni di metalli pesanti e questa risposta costituisce una difesa rapida ed efficiente da parte degli organismi viventi all’esposizione indesiderata ai
metalli tossici come il cadmio.
Attualmente è di grande interesse il monitoraggio della contaminazione ambientale da metalli pesanti attraverso l’utilizzo di bioindicatori. L’alga marina Fucus
Micronutrienti metallici e metalli pesanti in Anfibi e Rettili del Matese
141
vesciculosis è capace di accumulare metalli, e il contenuto intracellulare di metalli
pesanti è un indice dei livelli di inquinamento dell’ambiente in cui l’alga vive.
Altri organismi modello, come il verme Lumbricus rubellus e la trota, possono
essere impiegati come indicatori dell’inquinamento da metalli pesanti rispettivamente negli ecosistemi terrestri e di acqua dolce (Morris et al., 1999). Studi condotti su organismi acquatici, come molluschi e pesci, sottoposti ad un forte inquinamento ambientale hanno dimostrato che ad un aumento di contaminanti quali
cadmio e mercurio corrisponde un’aumentata sintesi di MT (Overnell & Combs,
1978; Kito et al., 1982). D’altra parte l’inquinamento degli ecosistemi acquatici
da parte di sali di metalli tossici sta seriamente minacciando la sopravvivenza di
numerose popolazioni di pesci.
Di particolare interesse per lo studio dei meccanismi coinvolti nella detossificazione
da contaminanti metallici risultano non solo le specie che vivono in ambienti
fortemente contaminati, ma anche quelle che sono sottoposte a minimi livelli di
inquinamento. Pertanto l’area del parco del Matese costituisce un laboratorio utile per lo studio di specie che vivono in ambienti non direttamente sottoposti ad
attività antropiche. Inoltre, tale area può risultare utile per valutare gli effetti degli
inquinanti presenti in aree limitrofe sugli animali che vivono in zone protette.
L’obiettivo del presente studio è stato quello di determinare il contenuto di “metalli traccia” nei tessuti di Anfibi e Rettili che vivono nel parco del Matese, nonché
di accertare la presenza di proteine adibite al trasporto e all’omeostasi dei metalli
nelle cellule. In particolare, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli
oligoelementi zinco e rame, in qualità di metalli “fisiologici”, e sul cadmio, in
qualità di metallo tossico, essendo tale elemento uno dei contaminanti ambientali
più diffusi. Per quanto riguarda le proteine coinvolte nell’omeostasi dei metalli,
abbiamo verificato sia la presenza di proteine di membrana implicate nel trasporto
del rame, sia la presenza di MT.
Materiali e metodi
Animali
In tutti gli esperimenti sono stati utilizzati esemplari adulti dei Rettili Podarcis
sicula e Podarcis muralis (famiglia Lacertidae), Anguis fragilis (famiglia Anguidae) e
dell’Anfibio Rana synklepton esculenta (famiglia Ranidae), catturati nel Parco del
Matese.
Determinazione del contenuto di “metalli traccia”
I tessuti prelevati sono stati sottoposti a combustione in HNO3 e analizzati per
contenuto di zinco, rame e cadmio mediante spettrofotometria ad assorbimento
atomico. L’analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il programma
Systat (Systat, Intelligent Software, Evaston, IL).
142
RIGGIO ET AL
Cromatografia per gel filtrazione di un estratto da fegato di Podarcis sicula
Campioni di fegato prelevati dal lacertiliano Podarcis sicula sono stati omogenizzati
in acetone preraffreddato e centrifugati. I residui sono stati essiccati sotto vuoto a
temperatura ambiente. Le polveri acetoniche ottenute sono state estratte in tampone Tris-HCl 50 mM pH 8,6 e successivamente sottoposte ad un doppio trattamento con solventi organici, che determina la precipitazione selettiva delle
metalloproteine (Comeau et al., 1992). Il campione ottenuto è stato incubato
con CdCl2 e cromatografato su una colonna di Sephadex G-75 equilibrata con
tampone Tris-HCl 20 mM pH 8,6. L’eluato è stato analizzato per contenuto di
Cu e Cd ed assorbanza a 280 nm (Scudiero et al., 1997).
Retrotrascrizione dell’RNA epatico, amplificazione del cDNA codificante le proteine
MT e CTR e 5' RACE
L’RNA totale è stato estratto dal fegato di P. sicula e A. fragilis utilizzando il reagente TRI-REAGENT (Sigma Chemical), secondo il metodo messo a punto da
Chomcyznski & Sacchi (1987). Il cDNA a singola elica è stato prodotto dall’
RNA totale da tessuto epatico di P. sicula e A. fragilis mediante polimerizzazione
con l’enzima Trascrittasi inversa.
La PCR è stata condotta utilizzando come DNA stampo il cDNA a singola elica
ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa. Per ciascuna reazione sono stati
utilizzati un primer non specifico e un primer specifico disegnato sulla base di
sequenze consenso delle proteine MT e CTR. I prodotti da PCR sono stati clonati
in vettori plasmidici (Riggio et al., 2000).
La 5'-RACE è stata effettuata utilizzando il kit di amplificazione Marathon (fornito dalla Clontech). Per la reazione di PCR sono stati utilizzati come primer
specifici oligonucleotidi disegnati sulla base delle sequenze parziali delle proteine
MT e CTR precedentemente ottenute. Le sequenze nucleotidiche e
amminoacidiche sono state analizzate utilizzando programmi al computer, quali
Blast, Fasta e Clastal X, presenti al sito www.ebi.ac.uk.
Risultati e discussione
Accumulo di metalli pesanti nei tessuti di P. muralis e di Rana synklepton esculenta
Allo scopo di determinare il contenuto di “metalli traccia” nei tessuti delle specie esaminate, frammenti di tessuto sono stati sottoposti a combustione totale
come descritto nei metodi, e il contenuto di zinco, rame e cadmio è stato determinato mediante spettrofotometria ad assorbimento atomico. I risultati ottenuti,
riportati nelle tabelle I e II, dimostrano che lo zinco e il rame sono presenti in tutti
i tessuti esaminati e il contenuto di zinco è generalmente maggiore rispetto a
quello del rame. Ciò non è sorprendente perché, di norma, in situazioni fisiologiche, il contenuto tissutale di rame è di uno o più ordini di grandezza inferiore a
Micronutrienti metallici e metalli pesanti in Anfibi e Rettili del Matese
143
Zinco (ng/mg tessuto)
Tessuti
Fegato
Intestino
Pelle
Muscolo
Lingua
1
2
76.00 132.00
3
4
5
6
7
8
84.00 240.00 120.00 24.00 70.00 140.00
10
11
12
13
90.00 40.00 50.00 40.00 35.00
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
142.00
40.00
42.00
68.00 36.00 N.D. 40.00 43.00
50.00 60.00 50.00 40.00 70.00
40.00 240.00
58.00
82.00 35.00 53.00 50.00
50.00 50.00
N.D. 60.00 60.00
N.D. 55.00 100.00 90.00
N.D. 130.00 70.00
100.00 148.00 226.00
N.D. N.D. 110.00
9
44.00 47.00 N.D.
N.D. 110.00 50.00 80.00 40.00 60.00
N.D.
Rame (ng/mg tessuto)
Tessuti
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Fegato
4.50
10.50
11.56
44.2
6.8
4.00
1.70
16.5
6.10
2.80
2.30
3.90
2.80
Intestino
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D. N.D.
7.10
N.D.
7.40
3.30
2.80
3.60
4.10
Pelle
4.44
2.74
1.38
3.20
2.70 N.D.
1.70
2.30
2.20
0.80
1.50
1.40
1.13
Muscolo
1.34
8.06
6.06
7.420
3.30
6.20
1.30
N.D.
1.05
5.30
N.D.
1.50
3.26
Lingua
5.20
17.54
42.00
2.60
5.20 N.D.
N.D.
2.90
2.10
3.20
N.D.
3.00
2.30
Cadmio (ng/mg tessuto)
Tessuti
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Fegato
0.90
1.19
2.40
3.10
0.97
1.70
0.80
1.50
1.00
2.40
1.60
1.00
0.32
Intestino
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D. N.D.
2.30
N.D.
0.90
1.60
1.70
1.20
1.10
Pelle
0
0
0
0
0 N.D.
0
0
0
0
0
0
0
Muscolo
0
0
0
0
0
0
0
N.D.
0
0
N.D.
0
0
Lingua
0
0
0
0
0 N.D.
N.D.
0
0
0
N.D.
0
0
Tabella I. Contenuto di zinco, rame e cadmio nei tessuti di P. muralis
quello dello zinco. Dall’analisi statistica dei dati, non si riscontrano differenze
significative nel contenuto di zinco e rame nei vari tessuti. Il cadmio è presente in
quantità rivelabili solo nel fegato e nell’intestino degli individui esaminati. Poiché
l’assunzione degli oligoelementi metallici è mediata dall’alimentazione, è verosimile ipotizzare la presenza di una contamiznazione ambientale da cadmio. Tuttavia tale eventuale contaminazione non è necessariamente riconducibile ad attività
antropiche localizzate nell’area del Matese, essendo il cadmio un elemento volati-
RIGGIO ET AL
144
Zinco (ng/mg tessuto)
Tessuti
1
2
3
4
5
6
Fegato
34.00
29.00
47.00
46.00
39.00
36.00
Pelle
55.00
30.00
62.00
60.00
40.00
29.00
Muscolo
27.00
35.00
15.00
17.00
9.00
11.00
Lingua
14.00
16.00
21.00
19.00
11.00
19.00
Rame (ng/mg tessuto)
Tessuti
1
2
3
4
5
6
Fegato
119.2
122.7
74.10
79.4
104.7
22.30
Pelle
5.87
5.89
3.30
6.0
1.28
2.93
Muscolo
1.34
1.70
2.46
1.54
0.77
0.66
Lingua
1.47
1.72
1.22
0.96
0.85
4.20
Cadmio (ng/mg tessuto)
Tessuti
1
2
3
4
5
6
Fegato
0.64
0.35
0.37
1.35
0.069
0.120
Pelle
0
0
0
0
0
0
Muscolo
0
0
0
0
0
0
Lingua
0
0
0
0
0
0
Tabella II. Contenuto di zinco, rame e cadmio nei tessuti di R. synklepton esculenta
le che può essere trasportato a grandi distanze dagli agenti atmosferici.
Proteine coinvolte nel trasporto del rame
Al fine di studiare i meccanismi cellulari coinvolti nell’uptake dei metalli pesanti, è stato clonato e sequenziato il cDNA codificante una ATPasi Cu-dipendente dal fegato di P. sicula. Per tale scopo sono state applicate tecniche di RTPCR e 5' RACE descritte nei metodi. Il cDNA a doppio filamento è stato amplificato usando come primer 5' specifico un oligonuclotide degenerato denominato
CTR Forw, complementare alla sequenza codificante la regione consenso
(MMMMP/HM) presente nelle proteine di trasporto del rame. Per la 5' RACE è
stato utilizzato il primer specifico CTR Rew. La sequenza nucleotidica ottenuta
consiste di una regione codificante di 576 bp, fiancheggiata da due sequenze non
tradotte al 5' e al 3', di 35 e 135 nucleotidi rispettivamente. La sequenza nucleotidica
di 576 bp codifica una proteina di 191 aminoacidi che presenta l’85.9% di similarità
con la Ctr1 umana e l’82.1% di similarità con la Ctr1 di ratto. Le tre proteine
Micronutrienti metallici e metalli pesanti in Anfibi e Rettili del Matese
145
condividono le stesse caratteristiche topologiche, con tre domini transmembrana
e un dominio idrofilico extracellulare aminoterminale comprendente regioni ricche di istidina e di metionina.
Proteine coinvolte nell’accumulo di metalli traccia nei lacertiliani P.sicula e P. muralis
Le metalloproteine contenute nel fegato di Podarcis sicula sono state identificate mediante la procedura descritta nei materiali e metodi. L’estratto epatico, dopo
precipitazione con solventi organici, è stato incubato con CdCl2 al fine di sostituire lo Zn++, naturalmente complessato con le proteine, con il Cd++. Tale sostituzione è stata effettuata allo scopo di rendere più sensibile la determinazione del contenuto di metallo mediante lo spettrofotometro ad assorbimento atomico. L’estratto
è stato frazionato per cromatografia di permeazione molecolare su colonna di
Sephadex G-75. Il profilo di eluizione dimostra che i due metalli coeluiscono
sotto forma di due picchi (I e II). Il picco I eluisce con proteine di elevato peso
molecolare, il picco II eluisce nella zona in cui eluisce la MT di mammifero utilizzata come standard.
Le sequenze aminoacidiche delle metallotioneine di P. sicula e di P. muralis sono
state dedotte dalle sequenze nucleotidiche dei cDNA clonati. I cDNA a doppio
filamento sono stati amplificati usando come primer 5' specifico un oligonuclotide
denominato PMT1 disegnato sulla sequenza codificante i primi sette aminoacidi
della sequenza N-terminale di una MT di osteitto. I prodotti da PCR ottenuti, di
circa 350 bp, contenevano l’estremità carbossiterminale della proteina e la regione
non tradotta al 3'. La sequenza completa del cDNA è stata ottenuta applicando il
protocollo per la 5' RACE descritto nei Metodi, usando come primer specifico un
oligonucleotide denominato PMT2, complementare ad un tratto di sequenza
comune ad entrambe le MT. I prodotti da PCR sono stati ligati nel vettore
plasmidico TOPO TA vector, clonati in E. coli e sequenziati. La sequenza
nucleotidica della MT di P. sicula consiste di una regione codificante di 189 bp,
fiancheggiata da due sequenze non tradotte al 5' e al 3' di 30 e 108 nucleotidi
rispettivamente. La sequenza della MT di A. fragilis comprende una regione codificante di 189 nucleotidi e due regioni non codicanti al 5' e al 3' di 12 e120
nucleotidi rispettivamente.
Dall’allineamento delle sequenze aminoacidiche delle MT di Podarcis sicula e Anguis
fragilis con le MT di altri Vertebrati risulta che la sequenza N-terminale (MDPQD),
il maggiore epitopo antigenico della molecola, è identica in Podarcis, Anguis, Xenopus
e negli Uccelli, mentre differisce da quella degli Osteitti, nella quale mancano i
residui glutammina (Q) e acido aspartico (D), e da quella dei Mammiferi, in cui
manca la glutammina (Q) e l’ acido aspartico (D) è sostituito dall’asparagina (N).
È noto che l’espressione tissutale delle MT può aumentare in conseguenza dell’
incremento della concentrazione di metalli pesanti presente nell’ambiente in cui
146
RIGGIO ET AL
gli organismi vivono. L’utilizzo dei profili di espressione delle MT, in qualità di
indicatori dei livelli di metallo presenti nell’ambiente, è attualmente oggetto di
studi (Morris et al., 1999). Pertanto potrebbe risultare vantaggioso utilizzare il
cDNA codificante le MT di P. sicula e P. muralis come sonda in esperimenti di
Northern blotting, per valutare l’eventuale correlazione tra l’esposizione sperimentale ai metalli pesanti e l’espressione genica delle MT nei lacertiliani dell’area
del Matese.
Conclusioni
L’analisi del contenuto tissutale dei metalli nei Rettili e negli Anfibi del parco
del Matese dimostra che lo zinco e il rame, oligoelementi essenziali che svolgono
un ruolo fisiologico, sono presenti in tutti i tessuti esaminati mentre il cadmio,
oligoelemento notevolmente tossico, è contenuto in quantità rivelabili solo nel
fegato e nell’intestino. La contaminazione ambientale da cadmio potrebbe derivare dal trasporto del cadmio proveniente da zone limitrofe all’area protetta del Matese
ad opera degli agenti atmosferici. Nei Rettili studiati, la presenza delle proteine
CTR e MT, il cui cDNA è stato clonato e sequenziato dal fegato, dimostra l’esistenza di meccanismi omeostatici coinvolti nel trasporto e nel deposito di metalli
in forma non tossica. In prospettiva, lo studio del profilo di espressione di tali
proteine in animali sottoposti a trattamenti sperimentali con metalli potrebbe
essere vantaggioso per valutare la capacità di risposta degli animali ad una situazione di stress.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata effettuata nell’ambito del programma di ricerca “Salvaguardia
dei Vertebrati del Parco del Matese attraverso lo Studio delle caratteristiche Genomiche,
Riproduttive e di Struttura di Popolazione”. Programma finanziato dalla Regione
Campania (Programma POP, azione 5.4.2). Esemplari catturati con autorizzazione del 1/06/2000 n. SCN/2D/2000/9213 del Ministero dell’Ambiente.
Riassunto
I metalli pesanti Zn, Cu, Fe, Mn sono indispensabili per gli organismi viventi. Tuttavia,
quando sono presenti in concentrazioni elevate, essi risultano tossici e di conseguenza
possono rappresentare contaminanti ambientali. I danni agli organismi derivanti dall’inquinamento da metalli pesanti spiegano l’interesse verso i meccanismi biomolecolari responsabili dell’omeostasi dei metalli pesanti. Attualmente numerosi organismi indicatori
sono utilizzati nel biomonitoraggio ambientale dell’inquinamento da metalli pesanti.
Nel presente studio abbiamo preso in considerazione, in qualità di potenziali bioindicatori
ambientali, Rettili e Anfibi che vivono nell’area del Parco del Matese. In particolare, abbiamo misurato il contenuto di metallo (Zn, Cu e Cd) in diversi tessuti e abbiamo clonato
il cDNA codificante le metallotioneine (MT) e le proteine di trasporto ad elevata affinità per
il rame (CTR) , che sono coinvolte nell’omeostasi dei metalli pesanti.
Micronutrienti metallici e metalli pesanti in Anfibi e Rettili del Matese
147
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