UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BRESCIA Facoltà di

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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BRESCIA
Facoltà di Medicina e Chirurgia
MASTER UNIVERSITARIO DI I LIVELLO IN
MANAGEMENT E COORDINAMENTO
DELLE PROFESSIONI TECNICO-SANITARIE
E DELLA RIABILITAZIONE
Tesi di Master
PROGETTAZIONE, IMPLEMENTAZIONE E VALIDAZIONE
DI UN NUOVO SISTEMA INFORMATICO PER IL MONITORAGGIO
DEI CQ NELLA PRODUZIONE DEGLI EMOCOMPONENTI.
(Esperienza sulla sua diffusione in 20 Servizi Trasfusionali Italiani)
Relatore:
Chiar.mo Prof. Nino Manca
Candidato
Massimo Lombardi
Matricola N° 75275
Anno Accademico 2009-2010
INDICE
Introduzione
pag. 3
Scopo
pag. 7
Principi della Raccomandazione Europea R 95(15)
pag. 9
Materiali e metodi
pag. 12
Il controllo di qualità degli emocomonenti
pag. 13
-
Valutazione del volume
Il campionamento
La conta cellulare: esame emocromocitometrico e
conta citofluorimetrica
- Valutazione dei parametri conservazione
Creazione del software CQE ® ( versione 6)
pag. 21
-
Interfacciamento con sistema gestionale del Servizio
Trasfusionale (SIMT)
- Creazione sito di prova
Elaborazione statistica
-
pag. 33
Approccio alla Scan Statistics
Le carte di controllo
Risultati
-
pag. 41
Tabelle CQI
Tabelle valutazione multicentrica
Discussione
pag. 56
Bibliografia
Allegato 1; tabelle Raccomandazione Europea R 95(15)
Allegato 2; determinazioni citofluorimetriche
Allegato 3; curve di Gauss, istogrammi di frequenza e carte di controllo
2
INTRODUZIONE
La peculiarità delle attività trasfusionali, nella cornice generale di un
settore intrinsecamente delicato e complesso per i rischi associati ai prodotti ed
alle prestazioni, da vari anni è oggetto di specifica ed elevata attenzione da parte
della Comunità Europea. Questa attenzione deriva dai numerosi eventi avversi
gravissimi verificatisi in passato, che hanno coinvolto tutti gli Stati . A tutela
della sicurezza dei cittadini, oggi esiste una corposa e dettagliata normativa
comunitaria, finalizzata a garantire la terapia trasfusionale. La trasmissione di
agenti infettivi attraverso la trasfusione di prodotti ematici e gli effetti
immunomodulanti, conseguenti alla stimolazione esercitata dagli alloantingeni
delle cellule ematiche, sono i due principali problemi che gli operatori di
Medicina Trasfusionale hanno dovuto affrontare e cercare di risolvere e che
tuttora sono chiamati a far fronte. In Italia si praticano oltre 11.000 trasfusioni al
giorno, ognuna delle quali, anche nei migliori assetti organizzativi e
professionali, porta con sé le potenzialità lesive tipiche dei prodotti biologici ad
uso terapeutico, per quanto oggi siano estremamente ridotte grazie alla
introduzione di misure di sicurezza sempre più avanzate e restrittive.
L’implementazione nei Servizi Trasfusionali del Sistema Gestione Qualità, il
controllo di ogni fase di processo ha contribuito notevolmente raggiungimento di
un elevato livello di omogeneità, standardizzazione, efficacia e trasparenza alle
attività trasfusionali.
La natura biologica della materia prima, implica un livello elevato di variabilità
nella composizione dei prodotti, non permettendo una completa
standardizzazione delle varie fasi di produzione; per questo motivo il controllo di
qualità interno (CQI) degli emocomponenti risulta essere una attività preminente
ed indispensabile per una buona ed efficace produzione degli stessi e deve altresì
essere utilizzato come indicatore della performance del laboratorio di
produzione.
Un ruolo fondamentale in questa direzione è svolto dalla Raccomandazione
Europea R 95(15)(1) del Comitato dei Ministri del Consiglio d’Europa che nelle
sue varie edizioni ha consentito in maniera trasparente di avere delle specifiche
di standard di prodotto, nonché dalla normativa vigente a livello nazionale in
materia di emocomponenti, Decreto Ministeriale 3 marzo 2005 (2) e dalla legge
219/2005(3).
Tali requisiti , in un Servizio Trasfusionale (ST) , possono essere garantiti se le
varie fasi di lavorazione sono state implementate seguendo i principi delle GP
(Good Practice) in un Sistema Gestione Qualità (SGQ).
3
Un approccio sicuramente utile per un ST è quello di conoscere la composizione
del prodotto da trasfondere; un passo importante verso questa direzione è quello
di poter riportare sull’etichetta di validazione definitiva i valori relativi ai
parametri di maggiore interesse clinico(4-5). L’obiettivo finale è quello di fornire
un prodotto sicuro ed efficace , riducendo l’esposizione del paziente a terapie
trasfusionali inutili e ripetute.
Il controllo del processo di produzione, delle apparecchiature utilizzate e
del prodotto finito, in regime di sistema qualità, permette quindi di evidenziare
cause di non conformità che possono portare alla periodica revisione delle
procedure di produzione, garantendo la validazione di prodotti di sicura efficacia
terapeutica.
Il controllo di qualità interno (CQI) è l’insieme delle procedure atte a presidiare
l’aspetto tecnico della qualità, mentre la valutazione esterna della qualità (VEQ)
è una indicazione di efficacia del sistema qualità e del sistema di controllo
attivato nel laboratorio. Entrambi sono contemplati tra i requisiti strutturali,
tecnologici ed organizzativi minimi previsti dalla legge per l’esercizio delle
attività sanitarie (6).
Una caratteristica fondamentale è che se per i laboratori di analisi i controlli di
qualità sia interni che esterni rappresentano ormai un realtà presente e condivisa,
per i laboratori di produzione degli emocomponenti le fasi di valutazione della
qualità risultano essere solamente delle verifiche interne.
Tutto ciò è sicuramente dovuto al fatto che se per i laboratori di analisi il CQI e
la VEQ sono parametri che tengono monitorati dei risultati di analisi, per i centri
di produzione degli emocomponenti vengono valutati dei prodotti reali molto
simili per caratteristiche a prodotti farmaceutici che devono possedere delle
caratteristiche ben precise.
Un passaggio in questa direzione è stato dato dall’implementazione a livello
europeo di un programma di VEQ “Low Level Leucocyte Counting Scheme”,
fornito dall’organizzazione internazionale UK NEQAS (United Kingdom
National External Quality Assessment Schemes) che valuta l’accuratezza delle
procedure analitiche sugli emocomponenti leucodepleti tra diversi laboratori; la
partecipazione del nostro centro a questo programma ci permette di tenere
monitorato il livelli degli emocompoennti prodotti sottoposti a leucodeplezione
(7)
.
In Francia un percorso simile è stato intrapreso dalla EFS (Etablissement francais
du sang) che effettua dal 2005 una EQA (external qualità control) sugli
emocomponenti leucodepleti prodotti nei loro centri (8) e dell’AFSSaPS (Agence
4
Francaise de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (9) per la valutazione dei
concentrati piastrinici ed il fattore VIIIc delle unità di plasma da parte.
Altre esperienze simili sono state effettuate in Giappone con un programma di
controllo degli emocomponenti (CQ) leucodepleti prodotti e testati dalla JRC
(Japan Red Cross) (10) e dal Service du Sang ( Belgian Red Cross in Belgio) dove
dal 2007 è nata una collaborazione con un Istituto di statistica per la valutazione
dei CQ dei concentrati eritrocitari e piastrinici (11).
Una verifica di qualità esterna degli emocomponenti, non solo concentrata
sulla
valutazione
di
concentrazioni
leucocitarie
mediante
conte
citofluorimetriche, ma allargata ad un programma che valuti tutte le componenti
cellulari e non, potrebbe rappresentare una apertura reale alla creazione di un
benchmarking di processo, inteso come approccio sistemico e continuo per
identificare gli standard di prestazione (Benchmark), confrontare se stessi con
questi e identificare le prassi (practices) che permettono di diventare il nuovo
standard di riferimento che centra l’osservazione sui processi di produzione e non
solo sul prodotto (output) (12).
L’esecuzione e l’elaborazione statistica dei controlli di qualità degli
emocomponenti implica un considerevole impegno di mezzi e personale, ma
deve essere considerato come prioritario nell’organizzazione di un ST.
Per questo motivo il Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale
dell’Azienda Spedali Civili di Brescia ha implementato dal 2002 un sistema
informatico che posto come livello minimo i disposti legislativi cogenti
nazionali e le linee guida Europee, faciliti gli operatori nell’elaborazione dei dati
e delle rispettive statistiche (13-14).
Ritenendo opportuno che i risultati dei CQ degli emocomponenti elaborati dal
nostro Servizio dovessero essere condivisi con altri centri per effettuare una
valutazione multicentrica che potesse migliorare i nostri processi produttivi, nel
2006 in relazione agli obiettivi per l’attuazione del 5° Piano sangue della
Regione Lombardia, è stato presentato dal SIMT di Brescia il progetto
“Progettazione di un sistema informatico per la gestione dei controlli di qualità
degli emocomponenti – Validazione del sistema – Diffusione regionale,
approvato con decreto DGS Regione Lombardia 7917 (15). Tale progetto di
valutazione dei CQ al livello regionale è stato presentato in collaborazione con i
SIMT delle aziende ospedaliere di Cremona, Bergamo e Desenzano del Garda e
ci ha permesso di progettare e validare il sistema informatico e migliorare le
procedure di produzione degli emocomponenti.
Attraverso la creazione di questo programma di valutazione multicentrica, si è
creato un sistema rete di ST che non solo utilizza lo stesso supporto informatico,
5
ma che possiede lo stesso linguaggio informatico e può condividere le
informazioni dei dati ed elaborale.
L’elaborazione dei dati ci ha permesso inoltre di creare un statistica di
alcuni parametri di interesse clinico con una valutazione periodica trimestrale
delle medie e 2 deviazioni standard; tali valori sono stati esportati
informaticamente verso il sistema gestionale informatico (Emonet – Insiel) ed
attualmente sono presenti sulle etichette di validazione delle unità come
parametri statistici.
Nel 2009 è stato presentato dal SIMT di Brescia uno studio multicentrico dei CQ
degli emocomponenti, che ha permesso di ampliare la registrazione e il passaggio
dei dati a livello interregionale; tale applicazione ha coinvolto 15 centri di
lavorazione dislocati in 4 regioni in Italia (16).
Sicuramente nel corso di questi ultimi anni molto si è fatto per migliorare la
performance di produzione degli emocomponenti sia dal punto di vista
organizzativo (SGQ sistema gestione qualità), sia dal punto di vista informativo;
tutto ciò ha permesso di avvicinarsi alla realtà delle GMPs (Good Manufactoring
Practices)(17) della produzione dei farmaci che in questo momento sono state
applicate negli stati dell’Austria e della Germania, ma che in questo momento
sarebbero poco realizzabili negli stati come l’Italia visto l’elevato grado di
decentramento delle attività produttive dei servizi trasfusionali. Basta pensare
che gli FDA manufacturing standards e le GMP chiedono nel campo
farmacologico di indicare con precisione in mg o g dose, la concentrazione finale
dei farmaci messi in produzione (18).
6
SCOPO
Diversi studi dimostrano che il CQ degli emocomponenti rappresenti uno dei
punti di verifica principale per dimostrare che il processo di produzione degli
stessi sia sotto controllo. In particolare, gli indicatori richiesti e le rispettive
frequenze di controllo segnalate dalle normative vigenti nazionali ed europee,
suggeriscono ai ST di verificare costantemente le buone prassi di produzione
(GP) al fine di ottenere emocomponenti efficaci e sicuri dal punto di vista
trasfusionale.
La verifica costante dei risultati deve avvenire mediante l’utilizzo di una corretta
analisi statistica che consente di ricavare considerazioni utili per il monitoraggio
costante del processo; in particolare la Raccomandazione Europea R 95(15)(1)
suggerisce che l’approccio ai controlli di qualità, deve essere inteso come un
intero processo statistico di controllo ( SPC Statistical Process Control ).
Lo scopo principale di questo studio è stato quello di creare un sistema rete (19)
per la gestione dei CQ degli emocomponenti a livello multicentrico, che permetta
la creazione di link fra i vari servizi trasfusionali (nodi) e la realizzazione di un
centro elaboratore dati ( HUB) che sia in grado di effettuare, in conformità a
quanto indicato dalla normativa vigente, una valutazione del processo della
produzione degli emocomponenti sul territorio. Tale rete potrebbe comprendere
Servizi Trasfusionali che siano rappresentativi delle regioni a livello nazionale e
possano rappresentare lo stato dell’arte della produzione degli emocomponenti in
Italia.
Attualmente il software CQE.6® elaborato dal Servizio di Immunoematologia e
Medicina Trasfusionale dell’Azienda Spedali Civili di Brescia è stato installato
in circa 24 centri: Brescia, San Carlo Borromeo di Milano, Cremona, Oglio Po’,
Arezzo, Valdarno, Vimercate, Istituto nazionale dei Tumori di Milano, Sondrio,
Varese, Bergamo, Venezia Mestre, Desenzano del Garda, Busto Arsizio,
Niguarda di Milano, Melzo, Tortona, Grosseto, Novi Ligure, Alessandria,
Torino, Città di Castello di Perugia e ASP 2 di Caltanisetta.
Ogni servizio è in grado di registrare informaticamente i propri CQ, valutare il
proprio processo di produzione di ogni emocomponente attraverso le carte di
controllo interne, le statistiche di frequenza e dei prodotti non conformi e le
report riassuntive.
Gli stessi risultati possono essere esportati informaticamente sottoforma di file
“txt” o “dat” ed inviati al centro elaboratore che è in grado di creare delle
statistiche multicentriche dei dati forniti dai vari SIMT.
7
Un altro aspetto misurato in questo studio, è stata una valutazione sull’utilizzo di
alcuni parametri statistici e metodi di monitoraggio del processo, per capire quali
potessero rappresentare al meglio lo stato dell’arte della separazione degli
emocomponenti, stante l’origine biologica del prodotto e quindi la sua variabilità.
In particolare sono stati calcolati a livello locale e a livello multicentrico una
serie di indici statistici di frequenza e di posizione per valutare l’andamento dei
nostri risultati campionari (CQ) con l’obiettivo di stimare al meglio la nostra
popolazione.
Successivamente abbiamo valutato l’utilizzo delle carte di controllo, degli
istogrammi di frequenza e dei grafici della scan statistic per valutare quale fra
questi possano essere usati come indicatore per la valutazione dell’ intero
processo statistico di controllo ( SPC Statistical Process Control ).
8
RACCOMANDAZIONE EUROPEA R (95) 15 – 15A EDIZIONE
La normativa vigente al livello italiano e la Raccomandazione Europea R(95)
15 del Consiglio dei Ministri d’Europa impongono l’organizzazione,
l’esecuzione e la documentazione del controllo di qualità interno su tutte le
attività di raccolta, produzione e analisi di laboratorio e prevedono inoltre che
debbano essere conservate per almeno dodici mesi le registrazioni relative a: T°
di conservazione del sangue e degli emocomponenti, controlli di sterilità,
controlli di qualità sugli emocomponenti, reagenti strumentazione e attività
analitica.
La Raccomandazione Europea R(95) 15, che contiene l’allegato “Linee guida
sulla preparazione, uso e garanzia degli emocomponenti” descrive più
dettagliatamente le caratteristiche che un emocomponente deve possedere per
essere considerato di sicura efficacia terapeutica.
Lo scopo principale di questa Raccomandazione è sempre stato quello di fornire
una serie di linee-guida e principi per l’uso, la preparazione e la qualità degli
emocomponenti.
Essa è essenzialmente suddivisa in 5 parti: (a) Sistema della qualità nei servizi
trasfusionali, (b) Raccolta del sangue, (c) Emocomponenti, (d) Procedure tecniche,
(e)
Pratica trasfusionale.
Gli emocomponenti possono essere preparati direttamente attraverso le procedure
aferetiche o attraverso la donazione del sangue intero, che successivamente viene
separato per ottenere le varie componenti rappresentate dai concentrati
eritrocitari (CE), concentrati piastrinici (CP) e dalle unità di plasma. La
sedimentazione delle cellule presenti nel sangue è determinata dalle loro
dimensioni e dalle differenze fra la loro densità e quella del fluido circostante .
Tab. [1] Volume e densità dei principali elementi del sangue
Densità media (g / mL)
Volume medio (10 -15/L)
Plasma
1,026
-
Piastrine
1,058
9
Moniciti
1,062
470
Linfociti
1,070
230
Neutrofili
1,082
450
Eritrociti
1,100
87
9
Nel paragrafo 12 del capitolo 3 viene descritto che “per qualsiasi aspetto la
preparazione degli emocomponenti deve seguire i principi della Good
Manufactoring Practice (GMP)”.
Successivamente nei capitoli che si dedicano in maniera approfondita ai controlli
che devono essere eseguiti su tutti gli emocomponenti, vengono sempre indicati i
seguenti aspetti:
Definizione
Proprietà
Metodiche di preparazione
Etichettatura
Conservazione e stabilità
Controlli di qualità
Trasporto
Precauzioni nell’uso
Effetti collaterali
In maniera particolare, per ogni emocomponente descritto, nella parte indicante i
controlli di qualità vengono delineati: parametro da controllare, risultati richiesti,
frequenza di controllo e laboratorio che ha eseguito il controllo. In alcuni casi
viene anche descritta il possibile limite percentuale di conformità che si può
raggiungere nei controlli di qualità.
L’elenco degli emocomponenti descritti nella Raccomandazione Europea R(95)
15 è schematizzato nella tabella n°2.
Tab. [2] Emocomponenti descritti nella Raccomandazione Europea R (95) 15 15a Edizione
Sangue Intero
Concentrato eritrocitario
Concentrato eritrocitario privo di buffy-coat (BCR)
Concentrato eritrocitario in soluzione additiva (AS)
Concentrato eritrocitario in soluzione additiva e privo di buffy-coat (AS-BCR)
Emazie lavate
Concentrato eritrocitario leucodepleto
Emazie congelate
Emazie da aferesi
Concentrati piastrinici da singole unità
Concentrati piastrinici da aferesi
Plasma fresco congelato
Crioprecipitato
Plasma privo di crioprecipitato
Piastrine crioconservate da afersi
Concentrati granulocitari da aferesi
Autotrasfusione mediante predeposito
Emocomponenti per uso prenatale, neonatale e pediatrico
10
E’ bene precisare che nel 2007 sono stati presentati gli “Standard di Medicina
Trasfusionale” (20-21) che classificano gli emocomponenti raccolti e prodotti in un
servizio trasfusionale, in due categorie: 1° livello, ottenuti dal frazionamento del
sangue intero (emocomponenti eritrocitari non trattati, plasma, buffy-coat,
concentrati piastrinici da PRP e da singolo BC, emocomponenti leucodepleti
mediante filtrazione in linea pre-storage, emocomponenti ottenuti direttamente da
procedure di aferesi); 2° livello ( emocomponenti leucodepleti post-storage in
laboratorio e bedside, irradiati, lavati, sottoposti a inattivazione microbiologica,
derivanti da assemblaggio di singoli altri come i CP da pool di BC, derivanti dal
frazionamento di altre unità, eritrociti e piastrine congelate).
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MATERIALI E METODI
Gli emocomponenti che vengono sottoposti a controllo di qualità interno
presso il Servizio di immunoematologia e medicina trasfusionale dell’Azienda
Spedali Civili di Brescia sono il sangue intero, i concentrati eritrocitari privi di
buffy-coat in soluzione conservante, i concentrati eritrocitari leucodepleti e
lavati, il plasma fresco congelato da singola unità e da aferesi, i concentrati
piastrinici da pool di buffy-coat e da aferesi. Le unità di plasma e di piastrine da
aferesi vengono prodotte anche con metodica multicomponent.
Per ogni emocomponente sottoposto a CQI vengono analizzati e controllati i
parametri richiesti dalla Raccomandazione Europea R (95) 15; le frequenze di
controllo delle unità dipendono direttamente dalle percentuali indicate in base
alle unità che vengono raccolte dal SIMT come da Registro sangue ( Allegato 1).
Per ogni unità devono essere analizzati il peso, le concentrazioni cellulari e
alcuni parametri di conservazione; il peso dell’unità viene rilevato e trasmesso al
Gestionale del SIMT dagli scompositori durante la fase di separazione; nel
nostro servizio a campione il peso viene ricontrollato mediante una bilancia
analitica (bilancia Sartorius TUV certificata ISO 9001 con taratura fino a 5000
gr).
Le concentrazioni cellulari degli emocomponenti vengono eseguite tramite un
esame emocromocitometrico e solo per il conteggio dei leucociti degli
emocomponenti leucodepleti mediante una analisi citofluorimetrica. I parametri
di conservazione analizzati sono l’emolisi ( Hemocue Plasma/Low Hb), il
dosaggio del fattore VIIIc e il pH.
Le unità di sangue intero prelevate e separate presso il nostro SIMT sono di tipo
top&botton ( Fenwall), vengono centrifugate a 3900 rpm per 10 minuti (
centrifuga Heraeus 6000i) e separate con gli scompositori Optipress II (Fenwall)
ottenendo unità di emazie concentrate prive di buffy-coat in sag-mannitolo, una
unità di plasma fresco congelato e una unità di buffy-coat. La preparazione delle
unità di CP da pool di BC avviene attraverso l’unione di 5 unità di buffy-coat
AB0 compatibili ( 50 gr l’uno) e 300 mL di soluzione conservante per piastrine (
T-Sol); l’assemblaggio delle unità avviene attraverso delle connessioni sterili (
Connettore sterile TSCD Terumo) e dei kit di assemblaggio (Pool Kit Fenwall).
La centrifugazione delle sacche avviene a 1100 rpm per 11 minuti a 22°C e la
preparazione definitiva dei CP avviene con gli compositori Optipress II con una
filtrazione (leucodeoplezione) in linea.
Le emazie leucodeplete possono essere preparate attraverso una filtrazione in
linea o attraverso un filtro connesso sterilmente in laboratorio ( Filtro Pall).
Terminata la fase di preparazione, gli emocomponenti possono essere campionati
per i CQ. Le emazie lavate invece vengono preparate attraverso 3 fasi di lavaggio
con soluzione fisiologica e centrifugate a 3000 rpm per 10 minuti.
12
IL CONTROLLO DI QUALITA’ DEGLI EMOCOMPONENTI
Il controllo di qualità degli emocomponenti permette di monitorare quali sono
le concentrazioni dei componenti cellulari e non, presenti nelle unità raccolte e/o
separate e verificare che i parametri valutati rientrino nei range della normativa.
Il CQ interno può essere eseguito su i singoli emocomponenti (random) oppure
su quelli ottenuti dalla scomposizione di una unità di sangue intero frazionata;
queste due modalità di approccio al CQ, sono state descritte in passato come una
verifica statica o dinamica del controllo (22). Nel secondo caso si è in grado non
solo di verificare l’idoneità dell’unità controllata, ma anche l’intero processo di
separazione ( fasi di centrifugazione e scomposizione) e quindi mettere in
evidenza eventuali problematiche e porre degli interventi correttivi.
Il CQI degli emocomponenti in un servizio trasfusionale, può essere
schematizzato in quattro parti:
1) Campionamento dell’ unità
2) Determinazione del volume ( pesatura e trasformazione del peso
dell’unità in volume mL)
3) Conta cellulare e parametri cellulari ( Rbc, Plt, Wbc, Hct, Hb, ecc.)
4) Valutazione di alcuni parametri di conservazione ( Emolisi, Fattore VIIIc,
Swirling, ecc.
- Valutazione del volume
La prima fase del CQI è conoscere la quantità di volume dell’unità; in
maniera particolare dopo aver effettuato la pesatura della sacca, bisogna
effettuare un calcolo che permetta di conoscere il volume netto dell’unità.
Per qualsiasi tipo di emocomponente che si sottopone a CQI deve essere
applicata la seguente formula:
Peso Lordo (gr) – Tara sacca (gr)
Volume in mL =
* Fattore di conversione
* Il fattore di conversione permette la trasformazione dei grammi in mL e dipende direttamente
dall’emocomponente e le sue caratteristiche; per esempio il fattore per una unità di sangue
intero o di emazie concentrate prive di BC in soluzione additiva è pari a 1,053, quello delle
emazie concentrate è pari a 1,1 (23).
13
- Campionamento dell’unità.
Come detto precedentemente il CQI degli emocomponenti valuta dei
prodotti reali molto simili per caratteristiche a prodotti farmaceutici che devono
possedere delle caratteristiche ben precise; per questo motivo è di fondamentale
importanza che il campione che viene analizzato sia completamente
rappresentativo dell’unità. Una problematica è legata al tubo che viene
campionato manualmente attraverso delle pinze; deve essere assolutamente
utilizzato il tubo apposito per la campionatura della sacca e non quello utilizzato
durante la scomposizione. In questo caso, qualora il campionamento sia errato,
può provocare un sovradosaggio, per esempio di leucociti e piastrine nelle unità
dei CE.
Un’altra questione è la corretta miscelatura dell’unità durante il campionamento;
ad intervalli è necessario “strippare” il tubo di raccordo, miscelare l’unità e
riprendere successivamente il contenuto miscelato nella sacca nel raccordo di
campionamento. Tale operazione deve essere svolta almeno 5 volte per unità.
Un ultimo accorgimento è la fase di conservazione del campione provetta, che
deve essere mantenuto alla T° indicata per la conservazione di quel determinato
emocomponente; per esempio se viene campionato una unità di concentrato
piastrinico, la provetta in attesa della conta deve essere conservata ad una
temperatura di circa 22°C in agitazione. Prima dell’esecuzione dell’esame
emocromocitometrico, il campione deve essere miscelato e portato a TA.
- L’esame emocromocitometrico per la determinazione delle concentrazioni
cellulari degli emocomponenti.
Gli analizzatori in ematologia sono normalmente predisposti per effettuare il
conteggio cellulare in campioni di sangue intero di pazienti. Nelle banche del
sangue o nei servizi di immunoematologia e medicina trasfusionale questi
analizzatori, oltre ad essere impiegati per l’esame emocromocitometrico dei
donatori, vengono anche usati per effettuare il conteggio delle cellule presenti
negli emocomponenti ( CQI ).
Normalmente, in Europa, le banche del sangue centrifugano tutte le unità di
sangue intero donate in emocomponenti standard, quali globuli rossi concentrati
(RBC), unità di plasma povero di piastrine ( PPP ) e buffy-coat ( BC ).
Quest’ultimo emocomponente contiene approssimativamente
il 70% dei
leucociti ( WBCs ) e il 90% delle piastrine ( PLTs ).
14
Mediante l’assemblaggio di 4-6 unità di BC, risospeso in una unità di plasma o
soluzione conservante, vengono prodotti dei concentrati piastrinici ( CP ) che
prospettano una concentrazione piastrinica media pari ad almeno 3 x 1011 Plt per
unità; inoltre, la presenza eritrocitaria e leucocitaria nei CP da pool di BC è
ridotta al minimo, basti pensare che il livello dei globuli bianchi deve essere
inferiore a 1 x 106 Wbc per unità.
L’esame emocromocitometrico su prodotti diversi dal sangue intero non
comporta particolari problemi per quanto riguarda parametri come Hb e Hct
richiesti dalla normativa.
Più complessa è l’attendibilità delle conte cellulari in particolare piastrine e
globuli bianchi. Nel nostro servizio viene utilizzato il Principio
Impedenziometrico Coulter dove in una camera di lettura viene effettuato il
conteggio e il dimensionamento volumetrico di Globuli Rossi (RBC) e Piastrine
(PLT). L’analisi dimensionale degli impulsi, effettuata con specifiche soglie
volumetriche, consente di classificare le cellule e differenziare i Globuli Rossi
dalle Piastrine.
Nei prodotti pressoché privi di RBC tipo i CP o PFC, l’assenza potrebbe
comportare la sottostima del numero di piastrine presenti nella camera di lettura
che discrimina le due popolazioni cellulari in base alle dimensioni (24-25) . Un altro
fattore importante da tenere in considerazione è l’elevato numero di piastrine,
che può causare il passaggio di più cellule nella camera ed essere contate come
un unico evento.
L’eventuale pre-diluizione dei campioni con una soluzione (Isoton) inoltre può
determinare un rigonfiamento della piastrina che assume un volume corpuscolare
( MPV ) superiore; tale modifica cellulare determina il non conteggio dell’evento
di passaggio riconosciuto come una piastrina (26).
Tutte queste situazioni possono determinare una sottostima di circa il 35% del
numero di piastrine effettivamente presenti nell’unità.
La conta piastrinica dei CP deve essere attendibile al fine di ottenere
l’incremento piastrinico desiderato in un determinato paziente in cui sono noti il
peso e la concentrazione piastrinica basale.
L'algoritmo più ampiamente usato per la determinazione della dose da
trasfondere di piastrine richiesta è l'incremento corretto di conteggio (CCI)(25) .
Per quanto riguarda il conteggio dei globuli bianchi residui negli emocomponenti
leucodepleti e nel plasma, l’esame emocromocitometrico può rivelarsi
inadeguato perché la soglia minima rilevabile di conteggio è già ampiamente
superiore alla valore atteso dai CQ . Per tale motivo è necessario ricorrere a
15
metodiche più sensibili (citofluorimeteria, camera di Nageotte) che garantiscono
di non riscontrare prodotti falsamente non conformi.
- Il conteggio dei leucociti mediante metodica citofluorimetrica
Il decreto ministeriale del 3 MARZO 2005 (G.U. 13 aprile 2005, n. 85), che
esplicita le caratteristiche e modalità per la donazione del sangue e di
emocomponenti, nonché la Raccomandazione Europea R (95) 15 riportano i
seguenti valori limite per la contaminazione da rWBC:
Emocomponent
Limite Conc. Leucocitaria
CE privi di buffy-coat
1,2 x 109 /
CE leucodepleti
1 x 106 /
CP da pool di BC
1 x 106 /
CP da Aferesi e Multiconponent
1 x 106 /
PFC, Plasma da Aferesi e Multicomponent
0,1 x 109 / Litro
CP da singola unita (PRP e BC)
0,2 e 0,05 x 109 /
Il metodo per il conteggio dei leucociti deve quindi avere una sensibilità non
inferiore a 2 cellule/µl.
I metodi correntemente impiegati per il conteggio di leucociti residui (rWBC)
negli emocomponeneti leucodepleti sono rappresentati principalmente da:
conta con camera di Nageotte
Polymerase Chain Reaction
citometria volumetrica capillare
citometria a flusso
A tale scopo, presso il Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale,
nel 2006 è stato messo a punto un metodo di conteggio citofluorimetrico (CFM)
per la valutazione dei leucociti residui negli emocomponenti leucodepleti. Questi
conteggi rientrano nell’ambito dell’analisi di eventi rari. Tipicamente, si vanno a
contare cellule nel range di 0-5/µl nelle condizioni più restrittive per la qualità
delle sacche leucodepleti. Nessuno dei metodi convenzionali non
citofluorimetrici si è dimostrato sufficientemente sensibile, preciso e accurato in
questo ambito di valori. La metodologia di conta dei rWBC è basata sulla
fluorescenza nucleare con Ioduro di Propidio e conta assoluta in singola
piattaforma con microsfere fluorescenti a concentrazione nota. Il protocollo di
16
analisi è impostato secondo le linee guida suggerite dall’United Kingdom
National External Quality Assessment Scheme (UKNEQAS) (27-28).
Reagenti impiegati
a) Soluzione ipotonica: Sodio citrato 0.1% in acqua distillata (ha la funzione di
lisare i globuli rossi ).
b) Ioduro di propidio (PI): lo ioduro di propidio è un colorante specifico per
DNA/RNA che colora tutte le cellule nucleate. Viene eccitato a 488 nm ed ha il
picco di emissione a 617 nm. Viene analizzato sul canale FL2. La brillante
fluorescenza dei leucociti consente una buona separazione dagli elementi non
nucleati come gli eritrociti e le piastrine, che non legano il colorante.
c) RNasi: l’ RNasi ha la funzione di digerire enzimaticamente l’RNA presente
nel campione allo scopo di ridurre le colorazioni specifiche.
d) Detergente (NP40): ha lo scopo di permeabilizzare le membrane dei globuli
bianchi per consentire l’ingresso del colorante degli acidi nucleici.
e) Fluorosfere: fluorosfere FLOW-COUNT a concentrazione nota per la conta
assoluta dei globuli bianchi.
f) Soluzione colorante: Sodio Citrato (0.1%), NP-40 (0.5%), Ioduro di propidio
(50 µg/ml), RNAasi 0.1mg/ml (aggiunta al momento dell’uso).
Protocollo
►Campioni e controlli
-
Emocomponenti leucodepleti (emazie concentrate, piastrine da aferesi,
pool piastrinici, plasma fresco)
- Controllo positivo fresco (sangue periferico di un donatore in EDTA
diluito in PBS alla concentrazione di 20 WBC/µl sulla base del dato
emocromocitometrico)
- Controllo negativo (soluzione di colorazione)
►Colorazione
-
-
Distribuire 100 µl di campione nelle provette per citofluorimetria
Distribuire 100 µl di controllo positivo diluito opportunamente
Distribuire 100 µl di controllo negativo
Aggiungere 500 µl di tampone di colorazione
Mescolare su vortex ed incubare 30-60 minuti al buio
Appena prima dell’analisi, mescolare con cura le fluorosfere ed
aggiungerne 100 µl /provetta utilizzando la stessa pipetta impiegata per la
distribuzione dei campioni
Agitare e acquisire al citofluorimetro il campione fino al raggiungimento
di almeno 20.000 FLOW-COUNT
17
Analisi citofluorimetrica (r/WBC)
L’analisi dei campioni è stata effettuata creando una serie di “dot Plot” di analisi
ed il calcolo dei rWBC si ottiene dalla formula:
n° di nuclei
x
Conc. delle Flow-Count / µl
r WBC / µl =
n° di Flow-Count singole
La conta assoluta di rWBC per sacca di emocomponente = rWBC/µl x volume
dell’emocomponente x 1000.
Il laboratorio nel periodo 2006-2009, ha effettuato 1121 determinazioni
citofluorimetriche su emocomponenti leucodepleti e partecipa al controllo di
qualità esterno UKNEQAS “Low Level Leucocyte Counting (LLLC)”.
I risultati relativi ai punteggi (Score) ottenuti sono riportati nelle seguenti grafici.
SCORE VEQ LLLC (PLT) 2006-2009
SCORE VEQ LLLC (RBC) 2006-2009
100
100
valutazione soddisfacente = score <100
valutazione soddisfacente = score <100
80
score ottenuto
score ottenuto
80
60
40
20
60
40
20
0
244
254
264
274
284
294
304
314
324
334
344
354
0
364
244
n.ro invio
254
264
274
284
294
304
314
324
334
344
354
364
n.ro invio
Nelle figure (Allegato n° 2) sono presenti degli esempi di conta leucocitaria
mediante metodica citofluorimetrica di un controllo positivo, una campione
negativo ed una campione di plasma fresco congelato ( emocomponente non
leucodepleto) che presenta livelli di Wbc elevati.
18
Parametri di conservazione
- La valutazione dell’emolisi
Il livello di emolisi a fine conservazione nelle unità di emazie concentrate
è un parametro indicativo della buona conservazione del prodotto ma anche del
corretto processo di produzione dell’emocomponente stesso.
L’emolisi è infatti diretta conseguenza del danno della parete cellulare dei globuli
rossi con conseguente liberazione di emoglobina nel mezzo di sospensione
(plasma, anticoagulante e soluzione additiva nelle unità di globuli rossi
concentrati).
Nonostante la scelta dei materiali, e le metodiche di produzione siano rivolte e
salvaguardare l’integrità cellulare, ci sono numerosi fattori che intervengono
durante la raccolta e la produzione, la conservazione e la trasfusione che
aumentano il rischio di emolisi (29-30).
Nella fase di preparazione può essere determinante il tempo di raccolta e la
velocità di miscelazione con l’anticoagulante o il tempo che intercorre tra la
raccolta e la separazione .
Le caratteristiche della centrifugazione possono influire sul grado di emolisi
qualora si tenda ad estrarre una maggior quantità di plasma centrifugando ad alta
velocità e sottoponendo pertanto le cellule a maggiore stress.
La scomposizione del sangue intero dopo centrifugazione può sottoporre i
globuli rossi a danni meccanici per il passaggio attraverso strozzature dei tubi di
raccordo tra le sacche satelliti.
Se i globuli rossi sono sottoposti a trattamenti ulteriori quali filtrazione,
irraggiamento o lavaggio, il grado di emolisi può aumentare ulteriormente.
Durante la conservazione delle unità anche in condizioni di ottimali,
l’invecchiamento delle cellule porta inevitabilmente ad un incremento del livello
di emolisi ulteriormente amplificato nelle unità non leucodeplete dove la lisi dei
globuli bianchi induce la liberazione di proteasi fortemente dannose per la
membrana dei globuli rossi.
Le linee guida europee stabiliscono come criterio di valutazione del grado di
emolisi la quantificazione in percentuale al termine della conservazione
dell’unità: a fine conservazione la percentuale di emolisi non deve essere
superiore a 0,8%.
Il grado di emolisi nelle unità a fine concentrazione viene valutato utilizzando lo
strumento Plasma /low Hb Photometer (EMOCUE).
19
Questo sistema sfrutta la reazione chimica che trasforma l’emoglobina in
azidemetaemoglobina (principio di Vanzetti).
Il fotometro legge l’assorbanza a 2 lunghezze d’onda (570 e 880nm).
La percentuale di emolisi viene poi calcolata appilcando la seguente formula:
gr / dL di Hb x (1 – Hct / 100) x100
% di Emolisi =
Hb su unità
Il calendario dei controlli di qualità prevede il campionamento di 4 unità al mese
di GRC a fine conservazione (generalmente vengono sottoposte al test unità che
hanno subito anche lavorazioni come filtrazione e irraggiamento).
-
La valutazione del Fattore VIIIc
Secondo
la
normativa
vigente
(Decreto
Ministeriale
2005;Raccomandazione Europea R95(15)), il Plasma Fresco Congelato (PFC)
ottenuto sia dal frazionamento del Sangue intero si ottenuto mediante l’uso di
separatori cellulari deve essere congelato nel più breve tempo possibile (entro 18
ore dalla raccolta e entro 1 ora dall’inizio del processo di congelamento) (31-32).
Tale modalità d congelamento fino ad una temperatura < a -25°C garantisce la
conservazione dell’attività di fattori della coagulazione tremolabili come il FVIII.
Il target richiesto dalla normativa è il mantenimento del 70% dell’attività del
FVIII nel plasma dopo un mese di conservazione rispetto al valore registrato alla
raccolta.
Il controllo di qualità sulla produzione di PFC prevede il campionamento di 4
unità al mese e il dosaggio del FVIII a tempo 0.
Le stesse unità vengono conservate per un mese e sottoposte nuovamente al
dosaggio dopo ascongelamento.
Il dosaggio è effettuato presso il 1° Laboratorio di analisi chimico cliniche.
20
CREAZIONE DEL SOFTWARE CQE.6®
Il Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale dell’Azienda
Spedali Civili di Brescia ha implementato dal 2002 un sistema informatico che
posto come livello minimo i disposti legislativi cogenti nazionali e le linee guida
Europee, sia in grado di gestire automaticamente cinque fasi essenziali del
controllo di qualità degli emocomponenti: [1] il calcolo automatico delle
concentrazioni cellulari presenti all’interno delle unità sottoposte a CQI e il
rispettivo stato di conformità o non dell’emocomponente, [2] l’utilizzo di report e
grafici (carte di controllo) che permettano il monitoraggio continuo del processo
di produzione, [3] menu di verifica delle statistiche di frequenze di controllo in
base ai dati del registro sangue e frequenze dei prodotti non conformi, [4] la
creazione di un file di esportazione dati (file txt di interscambio) che possa essere
utilizzato per passare i dati statistici di alcuni parametri di interesse clinico, al
Servizio Gestionale Informativo del SIMT ( EMONET – Insiel) e [5] la creazione
di un sistema rete che permetta l’esportazione dei risultati dei CQI dei centri
utilizzatori del programma, per la creazione di una statistica multicentrica dei CQ
degli emocomponenti.
La programmazione del software è avvenuta nel linguaggio Visual Basic 6.0, le
registrazioni vengono immagazzinate e rielaborate attraverso delle query in
Access, le stampe vengono create attraverso il programma Cristal report.
L’accesso al programma necessità di un password di ingresso, che permette sia
una rintracciabilità degli operatori, sia una diversificazione delle configurazioni
di accesso in base ad una distinzione fra profili di “administrator” e di “user”.
Il menu principale è suddiviso nei seguenti sottomenu; archivi, statistiche,
stampe, documenti, configurazione, strumenti.
a) Archivi
I menu di accesso per la registrazione dei controlli di qualità presenti
attualmente nel programma CQE.6® sono i seguenti: sangue intero, emazie
concentrate prive di buffy-coat in soluzione additiva, emazie leucodeplete,
emazie lavate, emazie da multicomponent, plasma fresco congelato da singola
unità, da aferesi e da multicomponent, concentrati piastrinici da singola unità, da
aferesi e da multicomponent, buffy-coat.
I campi che possono essere registrati nei menu archivi sono rappresentati nella
tabella n° 4 ed in ogni menu sono presenti solo i campi che riguardano quel
determinato emocomponente.
21
Tab. [4] Elenco Campi di registrazione
Campo di inserimento
N° unità
Data
Centro prelievo
Peso in grammi
Hb gr / dL
Emolisi
Hct
Wbc x 103 / µL
Wbc x µL
Plt x 103 / µL
Rbc x 106 / µL
Codice separatore
MPV fL
pH
Swirling
Mezzo di
sospensione
Fattore VIIIc
Perdite liquide
Proteine mg /dL
N° BAG
Descrizione del campo
Codice identificativo UNI dell’unità sottoposta a CQ
Data in cui è stato eseguito il CQ
Codice del centro in cui è stato eseguito il prelievo dell’unità
Peso dell’unità al lordo in grammi
Valore
dell’emoglobina
come
da
esame
emocromocitometrico
Valore dell’emolisi riscontrato in valore percentuale (%) o in
abs
Valore dell’ematocrito in percentuale come da esame
emocromocitometrico
Valore dei leucociti come da esame emocromocitometrico
Valore dei leucociti come da conteggio citofluorimetrico
Valore delle piastrine come da esame emocromocitometrico
Valore degli eritrociti come da esame emocromocitometrico
Codice del separatore utilizzato
Valore dell’MPV come da esame emocromocitometrico
Valore del pH misurato
Positività o negatività della presenza dello swirling
Registrazione del mezzo di sospensione utilizzato
Valore del fattore VIIIc
Presenza o assenza di perdite liquide
Valore del contenuto proteico come da dosaggio
Numero della bag utilizzata qualora ve ne siano più di una
Terminata la fase di inserimento, il salvataggio del record permette di
visualizzare i risultati del CQ rispetto all’unità; nelle figura n° 3 è possibile
notare che nella parte superiore sono presenti i campi di inserimento, mentre
nella parte sottostante sono visualizzati i risultati ottenuti dopo l’operazione del
salvataggio.
L’operazione di salvataggio crea, attraverso delle formule presenti nelle query di
access, il calcolo automatico in due fasi; [1] valutazione del volume dell’unità
con conseguente conversione dei grammi in mL e [2] la conversione del dato di
laboratorio ( per es. valore dell’emoglobina in gr/dL - grammi di Hb nell’unità).
Un passaggio fondamentale è dato dal fatto che i campi dei risultati sono “attivi”
e quindi qualora un risultato di un parametro fosse non conforme ai parametri
della Raccomandazione Europea R (95) 15, tale cella si evidenzia. Questa fase
permette all’operatore di verificare in tempo reale se i dati inseriti sono corretti.
22
Fig. [3a] Maschera di registrazione – Emazie concentrate
Fig. [3b] Maschera di registrazione – Emazie concentrate con campo non
conforme
23
Tab. [5a] Elenco unità di misura in ingresso
Peso
SI
gr
EC
gr
PSU
gr
CP AF
gr
CP Pool
gr
Wbc
x103/µL
x103/µL
x103/µL
x µL (*)
x µL (*)
Rbc
6
x10 /µL
6
x10 /µL
6
x10 /µL
NP
NP
3
x10 /µL
NP
gr / dL
%
NP
NP
NP
3
x10 /µL
NP
gr / dL
%
NP
NP
NP
3
x10 /µL
fL
gr / dL
NP
NP
NP
NP
3
x10 /µL
fL
NP
NP
NP
NP
NP
x103/µL
fL
NP
NP
NP
NP
NP
Peso
PFC
gr
PL AF
gr
EC LAV
gr
EC FILTR
gr
BC
gr
Wbc
x103/µL
x µL (*)
x103/µL
x µL (*)
x103/µL
Rbc
x106/µL
x106/µL
NP
NP
x106/µL
Plt
MPV
Hb
Hct
Fattore VIIIc
Proteine
IgA
x103/µL
NP
NP
NP
UI
NP
NP
x103/µL
NP
NP
NP
UI
NP
NP
x103/µL
NP
gr / dL
%
NP
gr / dL
gr / dL
x103/µL
NP
gr / dL
%
NP
NP
NP
x103/µL
NP
gr / dL
%
NP
NP
NP
Plt
MPV
Hb
Hct
Fattore VIIIc
Proteine
IgA
Peso
EC MULTI PL MULTI CP MULTI
gr
gr
gr
Wbc
x103/µL
x103/µL
x103/µL
Rbc
x106/µL
x106/µL
NP
3
3
x103/µL
fL
NP
NP
NP
NP
NP
Plt
MPV
Hb
Hct
Fattore VIIIc
Proteine
IgA
x10 /µL
NP
gr / dL
%
NP
NP
NP
x10 /µL
NP
NP
NP
UI
NP
NP
SI (Sangue Intero), EC (Emazie concentrate prive di buffy-coat in sol Additiva),
PSU (CP da singola unità), CP AF (CP da Aferesi), CP Pool (CP da pool di
buffy-coat), PFC (Plasma fresco congelato), PL AF (Plasma da aferesi), EC LAV
(Emazie lavate), EC FILTR (Emazie leucodeplete),BC (Buffy-coat), EC Multi
(Emazie concentrate da multicomponent), PL MULTI (plasma da
multicomponent), CP MULTI (CP da multicomponent).
24
Tab. [5b] Elenco unità di misura di calcolo
Volume
Wbc
Rbc
Plt
MPV
Hb
Hct
Fattore VIIIc
Proteine
IgA
Volume
Wbc
Rbc
Plt
MPV
Hb
Hct
Fattore VIIIc
Proteine
IgA
SI
mL
EC
mL
PSU
mL
x109/unità
x109/unità
x109/unità
NP
x109/unità
x109/unità
x109/unità
x109/unità
CP AF
mL
x106/unità
(*)
NP
x109/unità
NP
gr / unità
%
NP
NP
NP
gr / unità
%
NP
NP
NP
x109/unità
fL
NP
NP
NP
NP
NP
x1011/unità x1011/unità
fL
fL
NP
NP
NP
NP
NP
NP
NP
NP
NP
NP
PFC
mL
PL AF
mL
EC LAV
mL
x109/L
x109/L
x109/L
NP
NP
NP
x109/L
x109/L
x109/L
NP
NP
NP
x109/Unità
NP
x109/Unità
NP
UI
NP
NP
UI
NP
NP
gr / unità
%
NP
mg / unità
mg / unità
25
EC FILTR
mL
x106/Unità
(*)
NP
x109/Unità
NP
gr / unità
%
NP
NP
NP
CP Pool
mL
x106/unità
(*)
NP
BC
mL
x109/Unità
x109/Unità
x109/Unità
NP
gr / unità
%
NP
NP
NP
b) Statistiche
Dal menu statistiche è possibile monitorare in tempo reale tutta la parte
che riguarda le frequenze di controllo, ossia il numero di unità sottoposte a CQI
in riferimento a quanto prelevato come da registro sangue e le frequenze dei
prodotti non conformi.
Una caratteristica importante della Raccomandazione Europea R(95) 15 è data
dal fatto che per ogni emocomponente vengono indicati i parametri da verificare,
gli intervallo di riferimento di conformità del prodotto, ma soprattutto il numero
di unità che devono essere sottoposte a CQI in base alle unità che vengono
prelevate e/o preparate dal servizio; è quindi di fondamentale importanza
valutare per ogni centro trasfusionale quale è la percentuale di unità monitorate
in base ai dati del registro sangue. Nella figura 4 è evidenziato il menu di filtro
che valuta le frequenze di controllo.
Fig. [4] Maschera frequenze di controllo
Nell’allegato n°1 sono elencate le tabelle di controllo della Raccomandazione
Europea R(95)15.
Una parte fondamentale del monitoraggio del processo di produzione è il
controllo continuo dei prodotti non conformi; in particolare attraverso il software
utilizzato siamo in grado di visualizzare non solo il numero delle unità non
conformi suddivise per mese, anno e parametro, ma anche il risultato in
percentuale (figura n°5).
26
Il dato statistico fornito viene poi valutato insieme ai grafici che evidenziano solo
i prodotti non conformi e si è in grado di visualizzare la percentuale dei parametri
che influiscono sulle non conformità.
Fig. [5] Maschera frequenze dei prodotti non conformi
27
c) Stampe
Le stampe che vengono elaborate direttamente dal programma CQE.6
elaborato dal Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale
dell’Azienda Spedali Civili di Brescia, hanno un duplice scopo; quello di essere
facilmente utilizzabili dagli operatori e quello di permettere di tenere
sottocontrollo il processo di produzione degli emocomponenti, valutando in
maniera particolare la presenza degli emocomponenti non conformi che possano
essere considerati rappresentativi della popolazione in esame.
Per questo motivi le report create sono essenzialmente di due tipi; la prima
descrittiva che evidenzia i risultati complessivi del CQI e alcuni parametri di
interesse statistico, la seconda che analizza solo i parametri non conformi è crea
attraverso dei grafici degli andamenti per monitorare non solo il numero delle
non conformità, ma anche la suddivisione per parametro.
Ogni stampa può essere creata per intervallo di analisi, per tutti o solo un
emocomponente (figura n°6-7).
Fig. [6] Report riassuntiva CQI di esempio - Emazie concentrate per periodo di
analisi
28
Fig. [7a] Report riassuntiva risultati Non conformi di esempio - “Tutti gli
emocomponenti” per periodo di analisi
Stampa riassuntiva dei prodotti non conformi e istogramma di frequenza
percentuale a torta
Istogramma di frequenza percentuale a torta dei parametri non conformi per ogni
emocomponente.
29
INTERFACCIAMENTO CON IL SISTEMA GESTIONALE DEL
SIMT
Un obiettivo perseguito dal nostro servizio è stato quello di rendere
disponibili i risultati trimestrali dei CQ degli emocomponenti sull’etichetta di
validazione dell’unità. In particolare, sono stati selezionati per ciascun
emocomponente alcuni parametri significativi dal punto di vista clinico.
In seguito alla registrazione e alla valutazione di attendibilità dei risultati presenti
nel sistema informatico, vengono elaborati; media, deviazione standard, valore
minimo e massimo. I valori che vengono presi in considerazione sono i risultati
ottenuti dai CQ durante un trimestre.
L’esportazione dei valori avviene automaticamente attraverso la creazione di file
di interscambio ( file txt) che vengono successivamente importati nel sistema
gestionale del SIMT.
Il file che viene creato contiene tutte le informazioni necessarie; il codice UNI
del servizio ( Es. I0414, dove I = Italia, 04 = Lombardia 14 = Simt Brescia), il
periodo dell’analisi ( trimestre e anno), il codice emocomponente e parametro, il
risultato della media e della 2a deviazione standard ( Fig. 8).
Fig. [8] File di interscambio software CQE – gestionale SIMT Emonet
Nel periodo dal 1 gennaio 2009 al 31 marzo 2010 sono stati esportati i dati
statistici di 5 trimestri; i parametri esportati e stampati sull’ etichetta di
validazione sono emoglobina ed ematocrito per i concentrati eritrocitari, i
leucociti e le piastrine per i concentrati piastrinici da aferesi e da pool di buffycoat, il leucociti per le unità di plasma da aferesi e l’emoglobina, l’ematocrito e i
leucociti per i concentrati eritrocitari leucodepleti.
I livelli leucocitari attestano la qualità dei processi di filtrazione durante la
preparazione degli emocomponenti.
Nella figura 9 sono presenti la maschera di importazione dei risultati ed un
esempio di etichetta di validazione con i risultati.
30
Fig. [9] Maschera di importazione risultati CQ gestionale SIMT Emonet e
etichetta di validazione formato UNI.
CREAZIONE SITO DI PROVA
Durante questo studio il Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale
dell’Azienda Spedali Civili di Brescia ha implementato un sito di prova che
viene attualmente utilizzato per scaricare le versioni di prova del programma e
gli aggiornamenti.
L’accesso avviene solamente con password ed ogni servizio ha la possibilità di
mantenere l’anonimato per quanto concerne la gestione dei propri dati.
Un passaggio fondamentale sarà la creazione di una maschera ove ogni SIMT
sarà in grado di scaricare le statistiche a livello locale e multicentrico ( formato
pdf) per poter valutare le proprie performance e se necessario, attraverso il
confronto, sarà in grado di rivedere le prassi del proprio processo verso gli
indicatori presi in considerazione ed effettuare un cambiamento per raggiungere
un nuovo standard di prodotto (output) che migliori le performance per efficacia
ed efficienza. Nella figura successiva viene presentata le maschera di accesso al
sito di prova (http: \\ exquality.xoom.it ).
31
Maschere del sito di prova - http: \\ exquality.xoom.it
32
ELABORAZIONE STATISTICA (CQI)
Il controllo statistico di un processo produttivo è un insieme di strumenti,
utili per raggiungere la stabilità del processo e per migliorare la produttività
attraverso la riduzione della variabilità. Un processo è detto “sotto controllo” se
la sua variabilità è provocata solo da fattori casuali, mentre è detto “fuori
controllo” se funziona in presenza di fattori specifici; quando il processo è sotto
controllo, la maggior parte dei valori della grandezza oggetto di controllo cade
tra i limiti di specifica, quando è fuori controllo si ha un elevato numero di
determinazioni campionarie che cade al di fuori dei limiti.
Attraverso la statistica descrittiva si è in grado di effettuare una analisi dei
dati grezzi osservati, prescindendo sia da qualsiasi modello probabilistico che
descriva il fenomeno in esame, sia dal fatto che l’insieme dei dati sia un
campione estratto da una popolazione più vasta o sia invece l’intera popolazione
(33)
. Lo scopo infatti della statistica descrittiva è quello di ridurre il volume dei
dati osservati esprimendo una informazione contenuta in tali dati per mezzo di
grafici e indicatori numerici che li descrivono; quest’ultimi svolgono
l’importante funzione di essere delle variabili ad alto contenuto informativo (
osservare un fenomeno nel tempo), che consentono una valutazione sintetica di
fenomeni complessi e forniscono gli elementi necessari ad orientare le decisioni
da prendere (34).
Nel caso del controllo di qualità degli emocomponenti, le variabili oggetto di
rilevazioni statistiche sono numeriche ( quantitative) che si possono mettere in
corrispondenza con l’insieme n dei numeri naturali.
Un passaggio iniziale preso in considerazione per studiare i nostri dati elaborati
con il software CQE.6 ed esportati in fogli di lavoro Excel, è stato quello di
dividerli in classi e determinare il numero dei risultati appartenenti a ciascuna
classe ( frequenza della classe ); questa suddivisione ci ha permesso di analizzare
la distribuzione dei nostri dati verificando le frequenze di classe, relative e
percentuali.
La frequenza assoluta è un numero intero compreso tra 0 e il numero (n) totale di
osservazioni; la frequenza relativa è un numero reale compreso tra 0 e 1 e la
frequenza percentuale è un numero reale compreso fra 0 e 100. La somma delle
frequenze assolute è sempre uguale al numero totale delle osservazioni, la
somma delle frequenze relative è sempre uguale a 1, la somma delle frequenze
assolute è uguale a 100.
Il numero delle classi è la loro ampiezza dipende dai dati osservati; le regole per
la creazione delle classi utilizzate, devono sicuramente comprendere tutti i
risultati, non devono essere quantitativamente troppe o poche per non avere
dispersione dei dati e l’ampiezza dipende direttamente dal numero dei dati.
33
Una semplice regola da applicare per determinare il numero delle classi è
utilizzare la radice quadrata del numero dei dati:
Esempio: n osservazioni = 784
k = 28 classi di frequenza
L’ampiezza delle classi invece può essere determinata applicando la formula,
dove R è il campo di variazione o range dei dati, cioè la differenza fra il valore
minimo e massimo:
Esempio : R = 144
a = 144 / 28 = 5,14
Utilizzando quindi questa applicazioni otterremo degli intervalli di classe con dei
limiti inferiori e superiori.
I risultati delle frequenze in funzione delle classi di appartenenza possono essere
elaborate attraverso diagrammi circolari, dove le ƒ%( frequenze percentuali )
sono rappresentate da settori circolari aventi ampiezze proporzionali alle
frequenze stesse e da istogrammi che sono un modo molto usato per
rappresentare graficamente le informazioni contenute in una tabella di
distribuzione di frequenza.
Nelle elaborazioni statistiche di questo studio i diagrammi circolari sono stati
utilizzati per conoscere in tempo reale le ƒ% dei vari parametri per ogni
emocomponente, risultati non conformi in funzione del numero totale dei
prodotti non conformi ( pag 28 ); gli istogrammi sono stati utilizzati per valutare
le ƒ% del numero di controlli eseguiti per emocomponente e per analizzare i
nostri risultati dei CQ suddivisi per classi di frequenza.
Per meglio comprendere i risultati e la loro dispersione, per ogni parametro di
ogni emocomponente sono stati calcolati alcuni indici numerici statistici utili per
descrivere la loro distribuzione di frequenza; media, mediana, moda e lo scarto
quadratico medio o deviazione standard.
La Media aritmetica o campionaria è uguale alla somma dei valori di risultato di
un test diviso la sua numerosità, ossia il numero dei valori di risultato; la
mediana M di un insieme di n dati ordinati in ordine di grandezza crescente è il
valore centrale dei dati, se n è dispari, o la media aritmetica dei due valori
34
centrali, se n è pari. La moda di un insieme di n dati è il valore a cui corrisponde
la massima frequenza assoluta.
Questi parametri statistici sono detti indici di posizione o indici di tendenza
centrale, perché descrivono attorno a quale è centrato l’insieme dei dati; in
particolare la mediana viene utilizzata quando si vogliono eliminare gli effetti di
valori estremi molti diversi dagli altri dati. La mediana spesso è un indicatore più
significativo della media: se fra i dati con valore alto ve ne sono alcuni con
valore altissimo (che danno luogo a una "coda" sulla destra dell'istogramma),
questa presenza "strana", mentre non incide sul valore della mediana, può
influenzare molto il valore della media.
Un altro indice di posizione elaborato per i nostri CQ sono i percentili, che
dividono l’insieme di dati ordinati in un dato numero di parti uguali ( indice di
posizione non centrale) che sono usati normalmente per ampi insiemi di dati;
nella nostra statistica sono stati individuati e utilizzati i percentili 2,5%, 50% e
97,5%.
Come indice statistico significativo per la misura della variabilità di una
distribuzione di frequenza è stato calcolato lo scarto quadratico medio o
deviazione standard ( radice quadrata della varianza )che insieme alla media
sono i due indici di posizione e di dispersione più usati. In particolare la
deviazione standard misura la dispersione dei dati attorno alla media.
In ultimo per ogni raggruppamento è stato valutato il coefficiente di variazione
CV che esprime lo scarto quadratico medio come percentuale della media.
Per visualizzare la distribuzione di ƒ dei nostri CQ, i risultati dopo essere stati
ordinati numericamente ( dal valore minimo a quello massimo), sono stati
elaborati in istogrammi di frequenza e in diagrammi con la distribuzione della
curva di Gauss normalizzata che è simmetrica, il valore della media coincide con
quello della mediana. La funzione della distribuzione normale è la seguente:
1
f ( x) =
2πσ
2
e
−
( x−µ )2
2σ 2
La distribuzione gaussiana dipende dai parametri µ (media) e σ (deviazione
standard) e questi a loro volta dipendono dai valori delle unità di misura xi che
sono i valori in esame.
Attraverso i valori della µ e σ si è in grado di valutare le aree di probabilità legate
ai valori ± 1σ (68,27%), ± 2σ (95%) e ± 3σ (99%).
Volendo una distribuzione normale standardizzata, ossia che non dipenda
dall’unità di misura xi,, si può trasformare mediante la relazione:
z=
x−µ
σ
35
Approccio alla Scan Statistics
La raccomandazione Europea R(95) 15 spiega in modo dettagliato ( Cap.
27) , che l’approccio ai controlli di qualità, deve essere inteso come un intero
processo statistico di controllo ( SPC Statistical Process Control ) e tutta
l’organizzazione deve tendere a monitorare i risultati nel tempo per valutare se
l’intero processo di produzione degli emocomponenti sia sotto controllo.
Per permettere ad una struttura trasfusionale che produce emocomponenti un
approccio valido per un buon SPC che tende a monitorare e mantenere elevati gli
standard di produzione seguendo i principi delle GMP, la Raccomandazione
indica due tipologie di avvicinamento alla gestione dei risultati dei CQ: il metodo
della “Scan Statistics” e l’utilizzo delle “carte di controllo”.
La statistica indicata utilizza un modello per la determinazione delle frequenze di
controllo che usa i concetti statistici della “Spatial Scan Statistic (35) (Martin
Kulldorff) normalmente utilizzata per la determinazione di clusters ad alta o
bassa incidenza di malattie su statistiche di origine geografica. Dato che, per i
CQ degli emocomponenti non esiste una variabile geografica ma temporale,
questo processo di verifica tende a monitorare i risultati nel tempo suddivisi in
finestre, la cui ampiezza può variare da 30 a 120 valori.
Fra i motivi che avvalorano la tesi che questo approccio statistico sia utile per il
monitoraggio dei CQ degli emocomponenti, troviamo l’elevato numero di
procedure di preparazione, talvolta utilizzate raramente, la frequenza di controllo
che deve essere usata ( la FDA pensa che si possa arrivare fino a 60 unità
sottoposte a CQ per ogni mese) e in particolare che intervalli di confidenza si
possono utilizzare (36).
Tutte le osservazioni dei CQ vengono suddivise in blocchi di m osservazioni
consecutive ( ogni blocco viene considerata una finestra ) la cui estensione può
variare da 30 a 60 sino a 120 determinazioni. In ogni finestra (window) viene
rilevato il n° di prodotti risultati non conformi ( k = failure ) ad intervalli di
confidenza del 95 o 99%.
Se una finestra di osservazioni fosse fissata con un m = 60, il primo blocco
sarebbe formato dal campione n°1 al n°60, il secondo dal n°2 al n°61, il terzo dal
n°3 al n°62, ecc.
(1)
1
2
3
60
61
62
Numero di osservazioni suddivise in blocchi da 60
36
40
In queste finestre deve essere calcolato il numero dei prodotti non conformi (k ) e
deve essere valutato nel tempo; si ritiene che per poter iniziare ad effettuare una
statistica di questo tipo si debba avere almeno 1 anno di determinazioni e la
tabella che viene indicata richiede dai 400 ai 1200 test all’anno.
Questi parametri possono rappresentare un limite di questa statistica in quanto un
elevato numero di determinazioni non rappresenta attualmente un valore
raggiungibile se si considera che questi controlli vanno effettuati su ogni singolo
parametro di ogni emocomponente. Nella tabella seguente sono indicati i valori
raccomandati.
Maximum
Number
False
Failure
number of
Number of tests in
Positive
Rate for a
failed
of tests a moving
Rate of
Conforming
tests in
for year "window"
test
Process
window
(m)
criterion
(k)
400
25%
1200
400
10%
1200
400
5%
1200
400
1%
1200
400
25%
1200
30
16
2,5%
60
26
2,9%
30
17
2,0%
60
27
3,8%
30
9
3,5%
60
14
2,7%
30
10
2,8%
30
6
3,7%
60
9
2,3%
30
7
2,2%
30
3
1,0%
60
4
0,9%
60
4
2,7%
30
1
1,1%
60
1
2,0%
30
1
3,2%
120
2
0,7%
Qualora in qualsiasi finestra analizzata il k è sempre maggiore del limite, il
processo può essere considerato fuori controllo.
37
► Le carte di controllo (per CQI e per valutazione multicentrica)
Le carte di controllo sono diagrammi in cui sono riportati i punti rappresentativi
dei sottogruppi e servono a controllare le caratteristiche di processi o prodotti e
valutare opportune azioni correttive.
Nella costruzione delle nostre carte di controllo i valori dei CQ vengono inseriti
in un diagramma in funzione della µ e della σ.
Per ogni emocomponente vengono create delle carte di controllo per tutti i
parametri richiesti dalla Raccomandazione Europea R (95) 15 (vedi allegato 1)
che evidenziano l’andamento dei risultati e i parametri statistici µ, ±2σ, CV,
Valore minimo e massimo, n unità analizzate.
Nella figura 10 è presentato un esempio di carta di controllo ad uso interno; tale
report viene creata automaticamente in base all’intervallo di analisi di interesse in
formato PDF.
Fig. [10] Esempio di una carta di controllo interna – Concentrati eritrocitari.
Indici statistici
38
Carte di controllo per parametro
A livello multicentrico invece vengono create delle carte di controllo che
segnalano gli indici statistici del SIMT in oggetto in riferimento rispetto a quelli
elaborati nello stesso periodo da tutti i SIMT partecipanti allo studio.
Per meglio comprendere l’andamento del proprio parametro vengono creati dei
grafici che riproducono i livelli mensili in un periodo di analisi.
Nella figura 11 sono rappresentati, una report riassuntiva le carte di controllo del
sangue intero ( volume in mL) e dei concentrati piastrinici da pool di buffy-coat
(Plt x 1011).
39
Fig. [11] Esempio di una carta di controllo multicentrica
Report degli indici statistici
Esempio di Carte di controllo create dal software CQE.6
40
RISULTATI (CQI)
Per ogni emocomponente, sono stati analizzati i risultati del CQI per ogni
parametro a partire dal gennaio 2007 sino al maggio del 2010; per una
valutazione complessiva si è deciso di analizzare le frequenze che riguardano il n
dei controlli totali, le ƒ numeriche e percentuali dei prodotti non conformi, gli
indici statistici per le distribuzione di frequenza, di posizione e di dispersione dei
dati. Il controllo citofluorimetrico degli emocomponenti leucodepleti è stato
esaminato per il periodo 2007 – 2009. Gli istogrammi elaborati rappresentano la
ƒ dei dati suddivisi per classi e la distribuzione normale standardizzata elaborata
mediante un file di Excel (Wittwer, J. W., "Graphing a Normal Distribution in
Excel" From Vertex42.com, November 1, 2004).
Il n totale dei parametri analizzati con l’esame emocromocitometrico nel periodo
indicato è il seguente: sangue intero ( volume in mL 784, Hb gr 703), Emazie
concentrate prive di buffy-coat in soluzione additiva ( Hb gr 773, Hct % 769,
Wbc x109 682, Plt x 109 775), CP da pool di BC ( Plt x 1011 5315), CP da aferesi
(Plt x 1011 293), concentrati eritrocitari leucodepleti ( Hb gr 296, Hct % 296),
concentrati eritrocitari lavati ( Hb gr 15, Hct % 15), PFC (Plt x 109 823, Rbc x
109 828) Plasma da aferesi (Plt x 109 160, Rbc x 109 161) per un totale n 12688
parametri analizzati.
Il n totale dei wbc x 106 mediante la conta citofluoruimetrica nel periodo indicato
è il seguente: CP da pool di BC ( Wbc x 106 168), CP da aferesi (Wbc x 106 316),
PFC* ( Wbc x 106 129), Plasma da aferesi ( Wbc x 106 168), concentrati
eritorcitari leucodepleti ( Wbc x 106 340), per un totale n 1121 parametri di Wbc
analizzati.
Emocomponente
Sangue Intero
CE Privi di BC in Sol. Add.
CP da Pool di Bc
CP da aferesi
CE leucodepleti
CE lavati
Plasma da aferesi
Totale
n totale
controlli
1487
2999
5483
609
932
30
1780
489
ƒ%
11,7%
23,6%
43,2%
4,8%
7,3%
0,2%
14,0%
3,9%
12688
100,0%
Come è possibile notare il n dei controlli è maggiore negli emocomponenti a
largo
*
Nel caso delle unità di plasma fresco congelato, anche se si tratta di un emocomponente non leucodepleto, il conteggio
leucocitario viene effettuato mediante metodica citofluorimetrica in quanto l’unità di misura dell’esame emocromocitometrico è
pari a 0,1 Wbc x 103 / µL; quindi qualora vengano contati pochi leucociti lo strumento segnala una concentrazione pari al valore
sopraindicato. Dato che quel dato è pari a 100 leucociti x µL, tutti i prodotti risulterebbero non conformi.
41
consumo (es. concentrati eritrocitari); per quanto concerne le verifiche sui
concentrati piastrinici, quelli da pool di BC sono numerosi in quanto sono
preparati con una metodica semiautomatica e conoscere la concentrazione
piastrinica è importante dal punto di vista clinico (23). I concentrati piastrinici da
aferesi o da multicomponent invece essendo preparati attraverso una metodica
automatica hanno già una stima piastrinica al termine della procedura, quindi il n
dei controlli dipende direttamente da quanto richiesto dalla Raccomandazione
Europea R (95) 15.
14,0%
0,2%
Sangue Intero
3,9%
7,3%
11,7%
CE Privi di BC in Sol. Add.
23,6%
CP da Pool di Bc
CP da aferesi
CE leucodepleti
4,8%
CE lavati
43,2%
Plasma da aferesi
Per alcuni emocomponenti che interessano maggiormente il processo di
separazione, sono stati effettuati delle elaborazioni di Scan statistic per capire se
tale approccio possa risultare utile e snello per tenere sotto controllo il processo.
L’elaborazione dei dati esportati dal software CQE.6 sono stati esaminati
seguendo il seguente processo:
-
Indici statistici in funzione delle curve di Gauss normalizzate e degli
istogrammi di ƒ elaborati mediante esportazione dati
-
Andamento dei parametri attraverso le carte di controllo elaborate con
CQE.6
-
Comparazione degli istogrammi di ƒ elaborate con CQE.6 con
l’andamento secondo metodo Scan statistic di alcuni parametri di interesse
Gli indici statistici presi in considerazione sono; media (µ) , deviazione standard
(σ), conteggio (n), coefficiente di variazione (CV), valori minimi e massimi,
Mediana e i percentili (P2,5 – P50 – P97,5).
42
RISULTATI DELLA STATISTICA MULTICENTRICA
Per la valutazione dei parametri statistici a livello multicentrico ad ogni SIMT
partecipante è stato associato un codice anonimo che permette di soddisfare i
criteri della privacy. Il passaggio dei CQ di ogni servizio avviene attraverso una
esportazione automatica dei dati che vengono salvati in formato di file .dat e .txt .
In ogni file che rappresenta attualmente le registrazioni mensili di ogni centro ( si
ipotizza che successivamente il file potrebbe essere anche trimestrale ), sono
contenuti tutte le informazioni necessarie per individuare il servizio, il periodo di
riferimento e i risultati dei parametri analizzati per ogni emocomponente.
Questi parametri vengono importati in una postazione server che è in grado di
elaborare in formato pdf le carte di controllo e gli indici statistici sia a livello
locale che a livello multicentrico; successivamente ogni servizio sarà in grado di
ottenere tali report scaricandole direttamente dal sito espressamente costruito per
questi tipi di elaborazioni.
Per provare il processo di esportazione / importazione dei risultati sono stati
utilizzati i risultati ottenuti da 14 SIMT nel periodo gennaio 2008/marzo 2009
impiegati per un lavoro multicentrico dei CQ (16). Attualmente, il software CQE.6
®
è installato per prova o è in uso per la gestione dei CQ in routine in 21 SIMT
dislocati in 6 regioni (14-15-16); tale diffusione ci consente una valutazione della sua
fattibilità sia a livello locale che a livello interregionale.
Nel periodo di analisi preso in considerazione, sono stati analizzati 10444 unità
sottoposte a CQ nei vari SIMT ed in particolare sono stati analizzati 41179
43
parametri. La distribuzione dei controlli è di 1616 unità di sangue intero ( 3627
parametri) , 1596 emazie concentrate prive di buffy-coat in soluzione additiva (
6708 parametri) , 512 emazie leucodeplete (1756 parametri), 170 emazie lavate (
716 parametri), 116 emazie da multicomponent (674 parametri) , 1063 CP da
aferesi (5175 parametri), 2885 CP da pool di BC (14152 parametri), 117 CP da
multicomponent (540 parametri), 310 CP da singola unità (1359 parametri), 665
plasma da aferesi ( 1805 parametri) e 1394 unità di plasma fresco congelato
(4667 parametri). Le f di controllo riferite per emocomponente confermano
quelle riscontrate a livello del CQI del nostro servizio.
f controllo Stat. Multicentrica per Emocomponente
SI
6%
f controllo Stat. Multicentrica per n di parametri
EC
4%
13%
3%
3%
1%
EC FILT
EC LAV
EC MULTI
CP AF
SI
EC
EC FILT
EC LAV
EC MULTI
CP AF
CP POOL
CP MULTI
CP SU
PL AF
11%
9%
1%
15%
16%
CP POOL
29%
CP MULTI
35%
15%
5%
10%
2%
CP SU
4%
PL AF
2%
13%
2%
PFC
PFC
1%
Anche per l’elaborazione dei dati esportati dal software CQE.6 server i risultati
sono stati esaminati seguendo il seguente processo:
-
Indici statistici in funzione delle curve di Gauss normalizzate e degli
istogrammi di ƒ elaborati mediante esportazione dati
-
Andamento dei parametri attraverso le carte di controllo elaborate con
CQE.6
-
Comparazione degli istogrammi di ƒ elaborate con CQE.6 con
l’andamento secondo metodo Scan statistic di alcuni parametri di interesse
Gli indici statistici presi in considerazione sono gli stessi utilizzati per la
valutazione del CQI.
44
TABELLE RISULTATI
I risultati ottenuti dalle elaborazioni statistiche di tutti i SIMT sono stati elaborati
e confrontati per la valutazione degli indici statistici in tabelle suddivise per
SIMT con codice anonimo e a livello multicentrico
Sangue intero
Volume sangue intero
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
Mean (µ)
456,89
460,33
450,07
464,48
414,91
430,69
460,47
425,94
Standard Deviation (σ)
11,81
7,58
10,72
12,89
44,76
22,34
22,53
6,73
784
184
117
365
52
307
95
247
3
1
3
2
14
12
0
2
2,58%
1,65%
2,38%
2,77%
10,79%
5,19%
4,89%
1,58%
Conteggio (n)
n° Prodotti NC
Coefficient of variation (CV)
Valore minimo
376,07
431,15
400,76
408,57
306,60
308,64
408,36
391,26
Valore massimo
520,42
495,73
459,64
596,19
468,96
485,28
513,77
452,99
Mediana
458,69
462,49
452,99
465,71
433,87
432,10
465,34
424,50
Percentile 2,5
420,70
448,79
413,77
440,10
309,51
371,46
412,49
415,01
Percentile 50
458,69
462,49
452,99
465,71
433,87
432,10
465,34
424,50
Percentile 97,5
474,34
469,54
457,83
479,90
467,94
465,34
499,81
438,75
Volume
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
2DS+ (s)
480,5
475,5
471,5
490,2
504,4
475,4
505,5
439,4
2DS- (s)
433,3
445,2
428,6
438,7
325,4
386,0
415,4
412,5
%prodotti NC
0,4%
0,5%
2,6%
0,5%
26,9%
3,9%
0,0%
0,8%
CV
2,6%
1,6%
2,4%
2,8%
10,8%
5,2%
4,9%
1,6%
Hb gr sangue intero
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
Mean (µ)
59,8
58,4
60,3
65,4
50,9
62,4
65,3
9,0
4,6
4,5
10,8
7,5
7,0
4,1
Conteggio (n)
703
184
116
55
52
64
247
n° Prodotti NC
Coefficient of variation
(CV)
11
0
0
0
11
0
0
15,04%
7,85%
7,51%
16,46%
14,82%
11,15%
6,29%
Valore minimo
33,7
48,7
48,9
50,0
27,6
50,8
55,4
Valore massimo
117,7
73,9
75,8
97,0
64,6
94,4
79,0
Mediana
59,5
57,8
60,8
62,9
52,3
61,8
65,4
Percentile 2,5
44,7
50,9
51,0
50,2
36,7
53,6
57,1
Percentile 50
59,5
57,8
60,8
62,9
52,3
61,8
65,4
Percentile 97,5
85,9
68,2
68,8
93,5
62,8
76,0
72,6
Emoglobina
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
2DS+ (σ)
77,7
67,6
69,4
87,0
66,0
76,4
73,5
2DS- (σ)
41,8
49,2
51,2
43,9
35,8
48,5
57,1
%prodotti NC
1,6%
0,0%
0,0%
0,0%
21,2%
0,0%
0,0%
CV
15,0%
7,8%
7,5%
16,5%
14,8%
11,1%
6,3%
45
Emazie concentrate prive di buffy-coat in soluzione additiva
Hb Emazie concentrate
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
AN11
Mean (µ)
56,4
58,6
57,1
53,5
58,6
49,8
48,6
58,3
52,2
50,8
54,5
7,2
6,5
4,9
6,8
5,6
7,9
8,6
7,3
5,0
4,5
6,2
Conteggio n
768
35
178
115
55
54
62
95
181
120
91
n° Prodotti NC
18
0
0
8
0
8
12
1
6
4
2
12,78%
11,12%
8,63%
12,73%
9,56%
15,88%
17,73%
12,54%
9,52%
8,90%
11,40%
Valore minimo
37,0
45,7
43,4
38,0
46,3
31,3
25,6
41,3
34,6
40,0
33,3
Valore massimo
91,1
74,1
71,0
71,2
70,9
64,8
78,8
74,4
75,8
68,9
69,8
Mediana
56,4
59,1
56,6
54,3
58,6
51,3
47,7
58,1
52,3
51,1
55,7
Percentile 2,5
43,0
46,3
47,9
41,2
46,5
33,4
34,5
44,1
42,6
43,0
43,7
Percentile 50
56,4
59,1
56,6
54,3
58,6
51,3
47,7
58,1
52,3
51,1
55,7
Percentile 97,5
71,8
69,4
67,3
66,6
67,5
61,7
66,2
72,5
60,4
59,2
64,6
Emoglobina
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
AN11
2DS+ (σ)
70,8
71,6
66,9
67,1
69,8
65,7
65,9
72,9
62,2
59,8
66,9
2DS- (σ)
42,0
45,6
47,2
39,9
47,4
34,0
31,4
43,7
42,3
41,7
42,1
%prodotti NC
2,3%
0,0%
0,0%
7,0%
0,0%
14,8%
19,4%
1,1%
3,3%
3,3%
2,2%
CV
12,8%
11,1%
8,6%
12,7%
9,6%
15,9%
17,7%
12,5%
9,5%
8,9%
11,4%
Hct Emazie concentrate
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
AN11
Mean (µ)
58,0
61,9
56,0
60,2
60,8
57,6
56,7
59,0
56,6
58,0
58,4
5,7
3,3
3,6
4,8
3,1
3,9
8,6
6,9
3,4
3,6
4,1
Conteggio n
767
35
179
115
55
54
62
95
180
120
91
n° Prodotti NC
38
0
7
5
0
2
13
4
6
5
4
9,79%
5,32%
6,50%
8,04%
5,07%
6,73%
15,23%
11,62%
6,01%
6,18%
7,09%
47,2
Valore minimo
40,2
55,8
44,6
44,2
53,7
47,5
31,3
7,2
42,0
48,0
Valore massimo
86,5
67,9
71,3
79,4
69,3
63,3
89,2
72,7
82,4
78,6
72,0
Mediana
57,4
61,8
55,8
60,6
60,8
58,5
55,9
59,9
56,7
58,5
58,7
Percentile 2,5
47,4
56,1
48,4
50,5
54,3
48,7
41,4
52,4
50,0
49,5
49,8
Percentile 50
57,4
61,8
55,8
60,6
60,8
58,5
55,9
59,9
56,7
58,5
58,7
Percentile 97,5
72,5
67,3
65,0
69,7
67,7
63,0
72,6
67,6
60,8
62,3
67,7
Ematocrito
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
AN11
2DS+ (σ)
69,4
68,5
63,3
69,8
66,9
65,4
73,9
72,8
63,4
65,2
66,7
2DS- (σ)
46,6
55,3
48,7
50,5
54,6
49,9
39,4
45,3
49,8
50,8
50,1
%prodotti NC
5,0%
0,0%
3,9%
4,3%
0,0%
3,7%
21,0%
4,2%
3,3%
4,2%
4,4%
CV
9,8%
5,3%
6,5%
8,0%
5,1%
6,7%
15,2%
11,6%
6,0%
6,2%
7,1%
46
Wbc x109 Emazie concentrate
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
Mean (µ)
0,67
0,51
0,63
0,49
0,56
0,65
0,80
0,70
0,60
0,66
0,69
0,34
0,25
0,33
0,41
0,34
1,08
0,82
0,31
0,38
Conteggio n
678
35
179
115
55
54
61
180
120
91
n° Prodotti NC
99
1
0
7
3
4
8
13
4
6
102,7%
66,4%
39,8%
68,0%
74,3%
53,0%
134,0%
117,4%
51,6%
57,7%
Valore minimo
0
0,042
0,107
0,033
0,016
0,192
0,015
0
0,097
0
Valore massimo
4,88
1,61
1,19
1,55
1,81
1,43
7,53
10,19
1,92
2,01
Mediana
0,47
0,43
0,59
0,41
0,45
0,57
0,53
0,59
0,53
0,56
Percentile 2,5
0,02
0,10
0,23
0,06
0,04
0,20
0,09
0,14
0,13
0,12
Percentile 50
0,47
0,43
0,59
0,41
0,45
0,57
0,53
0,59
0,53
0,56
2,52
1,21
1,15
1,33
1,61
1,37
2,76
1,60
1,23
1,68
Percentile 97,5
Wbc
x109
2DS+ (σ)
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
2,05
1,18
1,13
1,16
1,38
1,33
2,95
2,34
1,23
1,42
-0,10
2DS- (σ)
-0,71
-0,17
0,13
-0,18
-0,27
-0,04
-1,35
-0,94
-0,02
%prodotti NC
14,6%
2,9%
0,0%
6,1%
5,5%
7,4%
13,1%
7,2%
3,3%
6,6%
CV
102,7%
66,4%
39,8%
68,0%
74,3%
53,0%
134,0%
117,4%
51,6%
57,7%
Plt x109 Emazie concentrate
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
Mean (µ)
1,84
1,49
7,22
2,08
6,36
1,56
1,19
3,33
3,84
3,07
3,96
0,92
6,68
0,94
10,47
0,58
0,61
3,00
3,39
3,33
Conteggio n
775
35
178
115
55
54
62
181
120
91
3
0
4
0
5
0
0
1
0
0
108,6%
n° Prodotti NC
215,0%
62,1%
92,5%
45,3%
164,5%
36,9%
50,8%
90,1%
88,3%
Valore minimo
0
0
0
0,477
0,742
0,547
0,2
0,528
0,301
0
Valore massimo
69,37
3,05
58,92
4,96
57,08
3,48
2,79
26,71
14,57
19,56
2,18
Mediana
1,06
1,43
6,11
1,97
2,56
1,41
1,07
2,62
2,66
Percentile 2,5
0,00
0,24
0,30
0,53
0,86
0,66
0,25
0,56
0,44
0,13
Percentile 50
1,06
1,43
6,11
1,97
2,56
1,41
1,07
2,62
2,66
2,18
Percentile 97,5
8,03
3,03
19,44
4,51
36,58
3,12
2,58
10,19
13,65
13,69
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
Plt x109
2DS+ (σ)
9,77
3,33
20,58
3,97
27,30
2,71
2,41
9,32
10,62
9,72
2DS- (σ)
-6,08
-0,36
-6,14
0,20
-14,57
0,41
-0,02
-2,67
-2,94
-3,59
%prodotti NC
0,4%
0,0%
2,2%
0,0%
9,1%
0,0%
0,0%
0,6%
0,0%
0,0%
CV
215,0%
62,1%
92,5%
45,3%
164,5%
36,9%
50,8%
90,1%
88,3%
108,6%
47
Concentrati piastrinici da aferesi
Piastrine x1011Plt Af e Multi
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
Mean (µ)
4,16
4,81
3,66
3,25
3,11
4,67
2,73
1,52
1,52
0,60
0,72
0,72
1,02
0,65
Conteggio n
291
164
130
75
15
466
46
n° Prodotti NC
49
6
2
5
2
7
17
36,6%
31,6%
16,3%
22,0%
23,3%
21,7%
23,7%
Valore minimo
1,05
1,67
1,74
2,00
1,52
1,27
1,19
Valore massimo
9,92
11,22
5,08
5,96
4,46
7,22
4,61
Mediana
4,13
4,66
3,76
3,05
2,90
4,86
2,71
Percentile 2,5
1,71
2,41
1,98
2,14
1,81
2,61
1,55
Percentile 50
4,13
4,66
3,76
3,05
2,90
4,86
2,71
7,00
7,97
4,60
5,07
4,40
6,59
3,77
Percentile 97,5
Piastrine x10
11
2DS+ (σ)
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
7,21
7,85
4,85
4,69
4,56
6,71
4,02
2DS- (σ)
1,11
1,77
2,47
1,82
1,66
2,64
1,43
%prodotti NC
16,8%
3,7%
1,5%
6,7%
13,3%
1,5%
37,0%
CV
36,6%
31,6%
16,3%
22,0%
23,3%
21,7%
23,7%
Leucociti x106 CP da aferesi
AN1
AN2
AN3
Mean (µ)
1,53
0,76
0,20
16,31
2,61
1,81
316
159
130
4
17
1
Conteggio n
n° Prodotti NC
1064,6%
344,4%
896,6%
Valore minimo
0,00
0,00
0,00
Valore massimo
199,55
24,83
20,70
Mediana
0,02
0,36
0,02
Percentile 2,5
0,00
0,00
0,00
Percentile 50
0,02
0,36
0,02
Percentile 97,5
0,26
1,77
0,20
Leucociti x106
AN1
AN2
AN3
2DS+ (σ)
34,15
5,97
3,83
2DS- (σ)
-31,08
-4,46
-3,42
%prodotti NC
1,3%
10,7%
0,8%
CV
1064,6% 344,4%
896,6%
48
Concentrati piastrinici da pool di buffy-coat
Piastrine x1011Pool di buffycoat
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
Mean (µ)
2,94
3,11
3,04
3,36
3,06
4,05
3,43
2,95
0,50
0,45
1,12
0,59
0,48
0,58
0,74
0,76
Conteggio n
5315
263
24
123
123
116
377
64
n° Prodotti NC
Valore minimo
959
15
9
2
15
3
39
15
17,0%
14,6%
36,7%
17,4%
15,8%
14,4%
21,7%
25,6%
1,07
1,89
1,34
1,87
1,72
1,77
1,12
1,63
Valore massimo
5,55
5,03
5,54
4,72
4,33
5,69
5,61
6,41
Mediana
2,94
3,10
2,95
3,30
3,07
4,09
3,43
2,93
Percentile 2,5
1,99
2,29
1,50
2,51
1,96
2,86
1,82
1,89
Percentile 50
2,94
3,10
2,95
3,30
3,07
4,09
3,43
2,93
Percentile 97,5
3,94
4,12
5,27
4,42
3,90
4,98
4,76
4,96
Piastrine x1011
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
2DS+ (σ)
3,95
4,01
5,28
4,53
4,02
5,21
4,92
4,46
2DS- (σ)
1,94
2,20
0,81
2,19
2,09
2,89
1,95
1,44
%prodotti NC
18,0%
5,7%
37,5%
1,6%
12,2%
2,6%
10,3%
23,4%
CV
17,0%
14,6%
36,7%
17,4%
15,8%
14,4%
21,7%
25,6%
Leucociti x106Pool di buffy-coat
AN1
AN2
AN3
AN4
Mean (µ)
0,077
0,057
0,014
0,117
0,422
0,074
0,015
0,302
168
29
24
95
3
0
0
2
Conteggio n
n° Prodotti NC
551,0%
128,2%
106,6%
258,4%
Valore minimo
0,000
0,017
0,000
0,000
Valore massimo
4,718
0,377
0,037
2,649
Mediana
0,000
0,034
0,006
0,045
Percentile 2,5
0,000
0,017
0,000
0,000
Percentile 50
0,000
0,034
0,006
0,045
Percentile 97,5
0,603
0,251
0,034
0,577
Leucociti
x106
AN1
AN2
AN3
AN4
2DS+ (σ)
0,92
0,20
0,04
0,72
2DS- (σ)
-0,77
-0,09
-0,02
-0,49
%prodotti NC
1,8%
0,0%
0,0%
2,1%
CV
551,0%
128,2%
106,6%
258,4%
49
Concentrati eritrocitari leucodepleti
Emoglobina Emazie leucodeplete
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
Mean (µ)
55,49
53,08
78,06
62,08
51,67
51,57
6,07
7,54
27,26
37,06
5,51
8,90
Conteggio n
296
44
97
99
204
18
0
5
0
1
4
4
10,9%
14,2%
34,9%
59,7%
10,7%
17,3%
Valore minimo
41,75
31,92
54,05
35,24
36,27
34,66
Valore massimo
77,41
66,42
143,51
417,12
71,24
61,47
Mediana
55,22
53,66
64,07
57,45
51,68
54,50
Percentile 2,5
44,19
35,34
55,67
45,58
40,66
34,92
Percentile 50
55,22
53,66
64,07
57,45
51,68
54,50
Percentile 97,5
69,61
63,57
132,03
82,28
61,91
61,43
n° Prodotti NC
Emoglobina
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
2DS+ (σ)
67,62
68,16
132,57
136,20
62,70
69,38
2DS- (σ)
43,36
37,99
23,54
-12,04
40,65
33,77
%prodotti NC
0,0%
11,4%
0,0%
1,0%
2,0%
22,2%
CV
10,9%
14,2%
34,9%
59,7%
10,7%
17,3%
AN1
AN2
AN3
AN4
Mean (µ)
0,055
0,022
1,488
0,078
0,292
0,016
6,812
0,205
340
44
98
99
Leucociti x106 emazie leucodeplete
Conteggio n
n° Prodotti NC
Valore minimo
3
0
19
1
535,4%
73,6%
457,7%
263,1%
0
0,011
0
0
Valore massimo
4,658
0,085
63,700
1,783
Mediana
0,000
0,015
0,003
0,015
Percentile 2,5
0,000
0,012
0,000
0,000
Percentile 50
0,000
0,015
0,003
0,015
Percentile 97,5
0,377
0,072
11,105
0,471
Leucociti x106
AN1
AN2
AN3
AN4
2DS+ (σ)
0,64
0,05
15,11
0,49
2DS- (σ)
-0,53
-0,01
-12,14
-0,33
%prodotti NC
0,9%
0,0%
19,4%
1,0%
CV
535,4%
73,6%
457,7%
263,1%
50
Leucociti x109 L PFC
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
Mean (µ)
0,032
0,000
0,111
0,057
0,037
0,097
0,031
0,081
0,200
0,043
0,000
0,097
0,050
0,060
0,100
0,051
0,129
0,300
129
9
15
133
53
69
184
208
9
9
0
5
24
3
20
8
39
1
134,2%
0,0%
87,3%
87,8%
163,0%
Valore minimo
0,000
0,000
0,020
0,005
0,000
0,000
0,000
0,000
0,100
Valore massimo
0,226
0,000
0,360
0,342
0,390
0,490
0,480
1,000
1,000
Mediana
0,015
0,000
0,080
0,041
0,020
0,060
0,010
0,042
0,100
Percentile 2,5
0,000
0,000
0,027
0,007
0,003
0,010
0,000
0,005
0,100
Percentile 50
0,015
0,000
0,080
0,041
0,020
0,060
0,010
0,042
0,100
Percentile 97,5
0,147
0,000
0,318
0,175
0,193
0,416
0,133
0,531
0,820
Conteggio n
n° Prodotti NC
Leucociti
102,8% 163,5%
159,2% 150,0%
x109 LITRO
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
2DS+ (σ)
0,118
0,000
0,306
0,157
0,158
0,297
0,133
0,340
0,800
2DS- (σ)
-0,054
0,000
-0,083
-0,043
-0,084
-0,103
-0,070
-0,178
-0,400
%prodotti NC
7,0%
0,0%
33,3%
18,0%
5,7%
29,0%
4,3%
18,8%
11,1%
CV
134,2%
0,0%
87,3%
87,8%
163,0%
102,8%
163,5%
159,2%
150,0%
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
Mean (µ)
10,13
11,56
25,73
9,14
14,25
22,74
19,82
20,57
8,70
8,36
5,13
32,85
4,31
6,00
11,08
16,71
9,40
5,27
Conteggio n
823
9
15
133
53
69
185
208
89
5
0
2
0
0
2
2
1
0
Plt x 109 Litro PFC
n° Prodotti NC
82,5%
44,4%
127,6%
47,2%
42,1%
48,7%
84,3%
45,7%
60,6%
Valore minimo
0,00
5,00
6,00
0,78
3,00
6,00
0,00
2,24
1,00
Valore massimo
66,40
18,00
115,00
24,80
36,00
58,00
213,00
59,20
37,00
Mediana
8,00
11,00
14,00
8,30
14,00
21,00
17,00
20,45
8,00
Percentile 2,5
2,00
5,20
7,05
2,20
5,30
7,70
6,60
3,41
1,20
Percentile 50
8,00
11,00
14,00
8,30
14,00
21,00
17,00
20,45
8,00
Percentile 97,5
35,34
18,00
108,35
18,07
25,00
49,10
36,40
40,73
18,00
Piastrine
x109 LITRO
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
2DS+ (σ)
26,86
21,81
91,43
17,76
26,24
44,90
53,25
39,36
19,24
2DS- (σ)
-6,59
1,30
-39,96
0,52
2,25
0,58
-13,61
1,78
-1,85
%prodotti NC
0,6%
0,0%
13,3%
0,0%
0,0%
2,9%
1,1%
0,5%
0,0%
CV
82,5%
44,4%
127,6%
47,2%
42,1%
48,7%
84,3%
45,7%
60,6%
51
Plasma da aferesi
Plt x 109 Litro Plasma aferesi
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
Mean (µ)
1,14
10,34
20,17
5,55
36,83
8,17
0,93
12,09
17,00
1,77
10,90
10,47
Conteggio n
160
47
119
47
47
205
0
0
6
0
5
1
81,4%
117,0%
84,3%
31,8%
29,6%
128,1%
n° Prodotti NC
Valore minimo
0,00
1,00
0,00
2,00
18,00
0,00
Valore massimo
8,00
43,00
66,30
10,00
71,00
56,50
Mediana
1,00
3,00
15,70
6,00
37,00
0,00
Percentile 2,5
0,00
1,00
0,00
3,00
19,15
0,00
Percentile 50
1,00
3,00
15,70
6,00
37,00
0,00
Percentile 97,5
3,00
40,40
56,03
9,00
62,85
31,16
Piastrine
x109 LITRO
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
2DS+ (σ)
3,00
34,53
54,17
9,09
58,63
29,11
-12,77
2DS- (σ)
-0,72
-13,85
-13,82
2,02
15,03
%prodotti NC
0,0%
0,0%
5,0%
0,0%
10,6%
0,5%
CV
81,4%
117,0%
84,3%
31,8%
29,6%
128,1%
AN1
AN2
AN3
Mean (µ)
0,079
0,000
0,026
0,605
0,002
0,039
168
29
118
2
0
0
Wbc x 106 Litro Plasma aferesi
Conteggio n
n° Prodotti NC
769,7%
0,0%
148,2%
Valore minimo
0,000
0,000
0,000
Valore massimo
7,660
0,010
0,409
Mediana
0,000
0,000
0,023
Percentile 2,5
0,000
0,000
0,002
Percentile 50
0,000
0,000
0,023
Percentile 97,5
0,256
0,003
0,067
Leucociti
x109 LITRO
AN1
AN2
AN3
2DS+ (σ)
1,288
0,004
0,104
2DS- (σ)
-1,131
-0,003
-0,051
%prodotti NC
1,2%
0,0%
0,0%
CV
769,7%
0,0%
148,2%
52
Tabelle risultati a livello multicentrico.
Sangue Intero
N°CQ SI 2008-2009
Hb (gr)
Hct %
Emolisi
1591
942
943
151
Media
447,02
62,12
41,40
0,03
DS
23,55
19,49
15,82
0,07
DS 2
47,10
38,99
31,63
0,15
N° CQ
Vol (mL)
n
1800
1600
1400
1200
1000
1591
942
943
800
600
400
200
0
151
Vol (mL)
Hb (gr)
Hct %
Emolisi
Parametri Sangue Intero
Emazie concentrate prive di buffy-coat in sol additiva
N° EC 2008-2009
Hb (gr)
Hct %
Wbc
Plt
Emolisi
n
1588
1253
1254
1235
1243
135
Media
283,98
54,47
57,63
0,63
3,18
0,01
DS
21,19
7,84
5,39
0,57
5,01
0,04
DS 2
42,39
15,68
10,77
1,13
10,01
0,08
N° CQ
Vol (mL)
1800
1600
1400
1588
1254
1253
1235
1243
1200
1000
800
600
400
200
0
135
Vol (mL)
Hb (gr)
Hct %
Wbc
Plt
Emolisi
Parametri Emazie concentrate
Emazie lavate
N° EC Lavate 2008-2009
Hb (gr)
Hct %
Proteine
Emolisi
Wbc
n
162
162
165
60
7
160
Media
225,56
48,40
71,74
74,11
0,03
0,17
DS
44,12
7,54
40,16
79,07
0,03
0,25
DS 2
88,25
15,09
80,32
158,14
0,05
0,49
N° CQ
Vol (mL)
180
160
140
162
165
162
160
120
100
80
60
60
40
20
0
7
Vol (mL)
Hb (gr)
Hct %
Proteine
Emolisi
Wbc
Parametri Emazie Lavate
Emazie leucodeplete
N°EC Filtrate 2008-2009
600
504
500
Hb (gr)
Wbc x10e6
Emolisi
Hct %
n
504
465
313
6
468
Media
272,80
54,84
0,04
0,20
60,41
DS
28,33
18,20
0,12
0,15
25,45
DS 2
56,66
36,40
0,24
0,31
50,91
468
465
400
N° CQ
Vol (mL)
313
300
200
100
6
0
Vol (mL)
Hb (gr)
Wbc x10e6
Emolisi
Parametri Emazie Filtrate
53
Hct %
CP da singola unità
N°CP da singola unità 2008-2009
350
300
300
299
300
300
Plt
Wbc
pH
MPV
Rbc
n
300
300
299
81
79
300
Media
66,26
90,37
0,14
6,92
18,89
16,38
DS
23,83
77,33
0,68
0,21
95,18
114,58
DS 2
47,65
154,66
1,37
0,42
190,36
229,15
250
N° CQ
Vol
200
150
81
79
pH
MPV
100
50
0
Vol
Plt
Wbc
Rbc
Parametri CP Singola unità
CP da aferesi
N°CQ CP da Aferesi 2008-2009
1200
994
979
1000
Vol
Plt
Wbc
pH
MPV
Rbc
Rapp Vol
979
782
811
MPV
Rbc
800
994
979
511
119
782
811
979
309,88
4,34
0,62
6,80
8,17
28,47
1,11
DS
94,03
1,22
6,74
0,69
22,92
361,87
0,35
400
DS 2
188,06
2,45
13,48
1,38
45,83
723,74
0,70
200
N° CQ
n
Media
511
600
119
0
Vol
Plt
Wbc
pH
Rapp
Vol
Parametri CP da Aferesi
CP da Pool BC
N°CQ CP da Pool BC 2008-2009
3000
2849
2844
2844
Vol
Plt
Wbc
MPV
pH
Rbc
Rapp Vol
n
2849
2844
545
2378
165
2527
2844
Media
332,23
3,06
0,08
8,89
6,77
23,29
1,70
DS
33,96
0,64
0,24
32,81
0,32
470,65
0,40
1000
DS 2
67,93
1,28
0,47
65,63
0,65
941,30
0,81
500
2527
2378
2500
N° CQ
2000
1500
545
165
0
Vol
Plt
Wbc
MPV
pH
Rbc
Rapp
Vol
90
90
Rbc
Rapp
Vol
Parametri CP da Pool BC
CP da Multicomponent
N° CQ CP da Multi 2008-2009
Plt
Wbc
pH
Mpv
Rbc
90
90
90
35
55
90
Rapp Vol
90
Media
289,48
4,00
0,36
6,90
9,08
24,75
1,20
DS
43,84
1,53
2,84
0,22
0,72
22,32
0,39
DS 2
87,68
3,06
5,69
0,43
1,43
44,64
0,78
N° CQ
Vol
n
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
90
90
90
55
35
Vol
Plt
Wbc
pH
Mpv
Parametri CP da Multi
54
N°CQ PFC 2008-2009
3000
Rbc
Wbc x10e9
Plt
Fatt VIII to
Fatt VIII
n
1294
1127
836
1143
126
141
Media
264,68
2,47
0,06
13,29
121,08
101,36
DS
35,01
5,56
0,11
12,23
43,62
34,59
DS 2
70,01
11,13
0,23
24,46
87,24
69,18
2844
2527
2378
2500
2000
N° CQ
Vol
2849
1500
1000
545
500
165
0
Vol
Plt
Wbc
MPV
pH
Rbc
Parametri PFC
Plasma da Aferesi
Vol
Rbc
Wbc x10e9
Plt
Fatt VIII to
Fatt VIII
n
622
521
90
519
25
28
Media
530
3
0
13
96
93
DS
51
5
0
15
20
24
DS 2
101
10
0
30
39
47
N° CQ
N° CQ Plasma da Aferesi 2008-2009
700
600
500
400
300
200
100
0
622
521
519
437
90
Vol
Rbc
Wbc
x10e9
25
Plt
28
Fatt VIII Fatt VIII
to
Wbc
x10e6
Parametri Plasma da Aferesi
Nell’allegato n° 3 sono presenti diversi esempi dell’elaborazioni grafiche di
Curve di Gauss normalizzate, istogrammi di frequenza e carte di controllo.
55
DISCUSSIONE
Il controllo di qualità degli emocomponenti rappresenta sicuramente uno
degli indicatori principali per il monitoraggio dell’attività produttiva; in ogni
servizio è obbligatorio predisporre ed applicare specifiche procedure per
definire, pianificare ed eseguire i CQ degli emocomponenti prodotti. Ogni SIMT
inoltre deve svolgere una attività sistematica di monitoraggio e di analisi
statistica dei dati relativi alla qualità, al fine di individuare criticità e di
intraprendere adeguate azioni correttive e preventive (21) (Standard di Medicina
Trasfusionale).
Gli standard devono sicuramente essere adottati ad integrazione delle specifiche
previste dalle norme nazionali e dalla Raccomandazione Europea R (95) 15.
Dato che la pianificazione dei CQ riguarda diverse attività, l’utilizzo di un
sistema informatico come il software CQE.6® progettato e implementato dal
Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale dell’Azienda Spedali
Civili di Brescia e validato anche in altre strutture (SIMT) dislocate sul territorio
italiano, facilita e rende possibile, da un lato la valutazione statistica dei dati
raccolti e dall’altro l’interscambio di informazioni fra servizi trasfusionali.
Il punto di forza dell’utilizzo di un unico sistema informatico è sicuramente
rappresentato dalla standardizzazione delle registrazioni (calcoli, unità di misura,
rintracciabilità dati e operatori, elaborazioni grafiche) che permette di effettuare
una analisi certa dei risultati sia a livello locale (CQI) che a livello multicentrico.
La creazione di un sito inoltre ci permette una comunicazione e una trasmissione
di dati e informazioni in tempo reale fra SIMT; attualmente, si è in grado di
scaricare le versioni di prova e i vari aggiornamenti del programma. L’obiettivo
prossimo sarà quello di creare un Comitato Scientifico che elabori una procedura
comune per creare in via definitiva una statistica multicentrica dei CQ degli
emocomponenti con delle registrazioni e delle statistiche che saranno messe a
confronto e rese disponibili in formato pdf sul sito. Tali esercizi comprenderanno
sicuramente le carte di controllo e i più utili indici statistici, per permettere una
valutazione di confronto propositiva e migliorativa.
Un altro aspetto fondamentale dell’utilizzo del software CQE.6® è la possibilità a
livello locale di avere costantemente aggiornato il monitoraggio della produzione
degli emocomponenti; attraverso le carte di controllo, le statistiche di ƒ% dei
prodotti sottoposti a CQ e dei prodotti non conformi, siamo in grado di
visualizzare se esistono situazioni abnormi nella produzione, ed in particolare a
carico di quale emocomponente e parametro analizzato.
56
Negli ultimi anni diversi lavori hanno evidenziato l’importanza della conta
leucocitaria residua negli emocomponenti leucodepleti con metodiche
citofluorimetriche ed è stato implementato a livello europeo un programma di
VEQ “Low Level Leucocyte Counting Scheme”, fornito dall’organizzazione
internazionale UK NEQAS (United Kingdom National External Quality
Assessment Schemes) che valuta l’accuratezza delle procedure analitiche sugli
emocomponenti leucodepleti tra diversi laboratori (7). La possibilità di poter
creare un sistema che permetta il monitoraggio dei CQ di tutti gli
emocomponenti e i lori principali parametri e non solo la concentrazione
leucocitaria delle unità leucodeplete, permetterebbe un miglioramento delle
informazioni fra i servizi.
In questo studio sono stati elaborati statisticamente i risultati dei CQ degli
emocomponenti sia a livello locale che a livello multicentrico; di ogni parametro
sono stati espressi gli indici della media (µ), della deviazione standard (±2 σ) e
del CV per misurare la distribuzione dei dati e la loro variabilità, e la mediana e i
percentili come indici di posizione.
Abbiamo rilevato che il valore della media (µ), risulta essere utile ed attendibile
per quei parametri come i volumi, i grammi di emoglobina, le concentrazioni
piastriniche e i valori dell’ematocrito, dove il risultato è sovrapponibile a quello
della mediana e quindi rappresentativo della nostra popolazione. Se si esegue il
rapporto fra i parametri della media sulla mediana e i rapporti delle ±2DS sui
percentili (P2,5 e P97,5) per questi parametri, il risultato si attesta tra lo 0,9 e 1.
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
Rapp (-2DS/P2,5)
1,03
0,99
1,04
1,00
1,05
1,04
1,01
0,99
Rapp (m/P50)
1,00
1,00
0,99
1,00
0,96
1,00
0,99
1,00
Rapp (+2DS/P97,5)
1,01
1,01
1,03
1,02
1,08
1,02
1,01
1,00
Volume sangue intero
Hb Emazie concentrate
AN1
AN2
AN3
AN4
AN5
AN6
AN7
AN8
AN9
AN10
AN11
Rapp (-2DS/P2,5)
0,98
0,98
0,99
0,97
1,02
1,02
0,91
0,99
0,99
0,97
0,96
Rapp (m/P50)
1,00
0,99
1,01
0,99
1,00
0,97
1,02
1,00
1,00
0,99
0,98
Rapp (+2DS/P97,5)
0,99
1,03
0,99
1,01
1,03
1,06
1,00
1,01
1,03
1,01
1,04
Anche il coefficiente di variazione che analizza la dispersione dei dati, conferma
che questi parametri, media (µ) e deviazione standard (±2DS σ), risultano essere
degli indici di riferimento attendibili; l’elaborazione degli istogrammi di
frequenza e della Curva di Gauss normalizzata rafforzano questa tesi.
57
Normal (Gaussian) Distribution
Mean:457,68 DS: 12,07 Zmin: -4 Zmax: 4
Volume mL SI 2007-2010
Istogramma di ƒ Volume mL SI 2007 - 2010
300
P50
P97.5
P25
100
0,025
0,02
0,015
50
0,01
0
0,6
0,5
-1DS
-2DS
495
+2DS
+1D
S
0,4
0,3
0,2
6
0 1
5
9 2
4 9
4
2
8 7
4
2
7
7 7
4 8
4
4 7
4 6
8
6 3
4
3
4 5
3
4 8
4 5
4
9
4
3
4 4
4
4
0
1
4
4
-2DS
Istogramma di Frequenza Emoglobina EC 2007 - 2010
Median
a
-1DS Media +1DS +2DS
200
P50
180
1,1
160
1
0,05
Probability Density
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
P25
100
P97.5
80
60
40
0
0,1
0
24 26 29 31 34 36 39 42 44 47 49 52 54 57 59 62 64 67 69 72 75 77 80 82 85 87
120
20
0,2
0,01
LVI
140
Frequenze
0,06
0
3 9
0
Cumulative Probability
Normal (Gaussian) Distribution
Mean:56,47 DS: 8,18 Zmin: -4 Zmax: 4
Emoglobina gr EC 2007-2010
0,1
515
2 4
475
4 2
455
4
435
9
415
1 4
395
Volume in mL
0,02
0,7
Media
0,005
375
0,03
0,9
0,8
Mediana
25
37
49
61
0
73
85
97
109
121
133
gr
Per quanto concerne le elaborazioni degli indici statistici del conteggio
leucocitario residuo degli emocomponenti leucodepleti, abbiamo notato che la
presenza di pochi prodotti non conformi, tende a creare valori della media (µ) e
della deviazione standard (±2 σ), non attendibili, ossia non rappresentativi della
popolazione analizzata.
Wbc x106 CP da aferesi
media (µ) = 1,53 x106
mediana = 0,02 x106
+2DS σ = 34,15 x106
percentile P97,5 = 0,26 x106
conteggio (n)= 316
non conformi = 4 unità ( 1,3%)
CV = 1064%
Wbc x106 CP da Pool di buffy-coat
media (µ) = 0,07 x106
mediana = 0 x106
+2DS σ = 0,91 x106
conteggio (n)= 168
CV = 551%
Wbc x106 concentrati eritrocitari
media (µ) = 0,054 x106
mediana = 0 x106
+2DS σ = 0,63 x106
conteggio (n)= 340
58
CV = 535%
Cumulative Probability
LVS
LVI
150
1
Probability Density
0,03
4 1
Frequenza ƒ
0,035
200
0,04
1,1
0,04
250
Wbc x106 Plasma da Aferesi
media (µ) = 0,078 x106
mediana = 0 x106
+2DS σ = 1,28 x106
conteggio (n)= 168
CV = 769%
Come è possibile notare il CV del conteggio dei leucociti di questi prodotti indica
una elevata dispersione dei dati dovuta alla presenza di una esigua percentuale di
prodotti non conformi. Se tenessimo conto del valore della media, in un caso (CP
da aferesi) addirittura il dato si attesta ad un valore superiore al range consentito
dalla Raccomandazione Europea R (95) 15 (1 x106) .
Il valore degli indici di posizione, mediana e percentile P97,5, invece risultano più
attendibili per rappresentare la reale distribuzione della nostra popolazione
confermato dall’istogramma di frequenza dei dati suddivisi per classi.
In uno studio della durata di 5 anni (2001-2005) condotto in Francia dalla EFS
(Etablissement Francais du Sang) solo sui livelli di leucociti residui nei
concentrati eritrocitari leucodepleti, sono stati valutati gli indici della media
(µ) e della DS σ per esprimere i valori dell’emoglobina, mentre sono stati
utilizzati l’indice della mediana e la percentuale dei prodotti non conformi per la
concentrazione leucocitaria (37).
Nel nostro studio inoltre, abbiamo confrontato diversi istogrammi per valutare
quali fossero maggiormente utili per il monitoraggio del processo di separazione
(SPC Statistical Process Control).
Sia a livello locale che a livello multicentrico riteniamo che l’utilizzo delle carte
di controllo sia l’approccio ottimale per visualizzare l’andamento del parametro
analizzato nel tempo; tali grafici permettono sia di osservare variazioni della
qualità di produzione, sia di verificare se gli indici statistici appropriati per ogni
parametro subiscano variazioni rilevanti.
Un concetto fondamentale nella produzione di emocomponenti è dato dal fatto
che la presenza di non conformità nella produzione degli stessi è un dato di fatto,
e questo aspetto è anche indicato dalla Raccomandazione Europea R (95) 15
che suggerisce delle percentuali di accettabilità.
Questo fattore è ulteriormente appesantito dal fatto che in un SIMT sono presenti
per motivi clinici diverse procedure di produzione affiancate ad altri altrettanti
trattamenti; tutto ciò comporta una diversificazione dei CQ che in alcuni casi
devono essere effettuati sul 100% della produzione (emocomponenti a basso
consumo) (8-37).
59
Per queste motivazioni, è di fondamentale importanza possedere una percorso
pianificato di controllo per valutare costantemente il numero dei prodotti non
conformi rispetto a quelli sottoposti a CQ e capire quale sia la frequenza delle
verifiche in base al numero delle unità che un SIMT preleva e prepara.
In questo studio abbiamo verificato che gli istogrammi di f che visualizzano in
tempo reale il rapporto dei prodotti conformi suddivisi per mese, ci consente di
conoscere costantemente la % precisa. Quest’ultima, può essere ulteriormente
confrontata con gli istogrammi a torta dei soli prodotti non conformi, che
mettono in evidenza quali sono le percentuali di failure dei vari prodotti e i loro
parametri.
Il metodo della scan statistic, che rappresenta un andamento dei valori nel tempo
suddiviso per finestre di 30 o 60 campioni, tende ad essere utile per quei
parametri che normalmente possono avere un numero di non conformità
stabilmente presente.
Nel nostro studio abbiamo notato che il numero di k ( failure) che non deve
superare il valore di 5 (IC 99%) o di 9(IC 95%) per la quasi totalità dei prodotti
non viene mai superato; solo in alcuni parametri come il livello di leucociti nei
concentrati eritrocitari (1,2 x 109) e il livello piastrinico nella metodica
semiautomatica dei concentrati da pool di buffy-coat ( 2,5 x10 11), il valore k (
failure) tende ad assumere valori superiori nel periodo analizzato a livello locale,
ma tale risultato non raggiunge mai un valore superiore del 46%, a fronte di un
numero di prodotti non conformi totali pari al 13,8%.
Nei grafici che seguono come esempio, sono rappresentati gli istogrammi di f dei
prodotti non conformi e l’andamento del valore di k (failure) della scan statistic
dell’emoglobina e dei leucociti nei concentrati eritrocitari e nei concentrati da
aferesi per meglio comprendere la differenza di valutazione nei parametri.
Istogramma di f prodotti non conformi (Hb)
Emoglobina
2008
2007
2009
2010
60
Istogramma di f prodotti non conformi (Wbc)
Leucociti
2008
2007
2009
2010
Scan Statistic: numero di k (failure) Hb- Emazie concentrate
Distribuzione f
Rate 5% = ( k > 9)
Window presenti:
k =7
k =6
D i st r i buz i one f
R a t e 1% = k > 4
k =5
k=0
k < 5 = 5 9 4 w ( 9 3 , 1%)
k=0
k =4
k > 4 = 4 4 w ( 6 , 9 %)
Wi ndow pr e se nt i :
k=1
k>4
k=2
k<5
k=3
k =3
k =1
k =2
k>4
k=4
k<5
k=5
k=6
k=7
E m o glo bina E m azie
C o nc ent ra t e
Periodo
2007-2010
n test NC
23 (3,29%)
n totale CQ
697
M ( n Window ) da 60
638
Valori di k
f (frequenza )
k=0
106
k=1
212
k=2
123
k=3
59
k=4
94
k=5
19
k=6
11
k=7
14
Valore di k Periodo 2007 -2010 Emoglobina gr EC ( rate 5% k < 10 )
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
window
Valore di k
61
Scan Statistic: numero di k(failure) Wbc- Emazie concentrate
Leucociti x 10 9
Emazie Concentrate
Periodo
2007-2010
n test NC
88 (13,8%)
n totale CQ
k = 19
637
M ( n Window) da 60
Distribuzione f
Rate 5%= k > 9
Window presnti:
k = 20
k =0
k =1
k =2
k =3
k =4
k =5
k =6
k =7
k =8
k =9
k = 10
k = 11
k = 12
k = 13
k = 14
k = 15
k = 16
k = 17
k = 18
k = 19
k = 20
k = 18
Valori di k
578
f (frequenza )
k=0
40
k = 11
18
k=1
90
k = 12
43
k=2
35
k = 13
37
k=3
3
k = 14
40
k=4
4
k = 15
23
k=5
3
k = 16
31
k=6
48
k = 17
23
k=7
25
k = 18
13
k=8
24
k = 19
12
k=9
40
k = 20
2
k = 10
24
k = 16
k =0
k = 17
k = 15
k =1
k = 14
k =2
k = 13
k =3
k = 12
k = 11 k = 10
k =9
k =8
k =7
k =4
k =5
k =6
Valore di k Periodo 2007 -2010 Wbc x10 9 EC
22
21
20
19
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Valore di k
Scan Statistic: numero di k(failure) Wbc-CP da Aferesi
6
Wbc x 10 CP da Periodo 2007 2010
aferesi
Distribuzione Freq window
Rate 5%( k < 6)
k=2
n test NC
4 (1,26%)
n ( N°CQ)
316
M( n°Window) da 30
288
Valori di k
f (frequenza)
k=0
207
k=1
52
k=2
29
k=3
0
k=3
k=0
k=1
k=1
k=2
k=3
k=0
Valore di k Periodo 2006 -2009
Wbc x 106 CPda Aferesi ( rate 1% k < 6 )
6
5
4
3
2
1
0
n°Window
62
Valore di k
Come è possibile notare per parametri come l’emoglobina o il livello dei
leucociti residui non supera mai il valore di k=9 (95%); nel caso dei Wbc dei CP
da aferesi il valore di k non è mai superiore a 5 (99%). Nei concentrati eritrocitari
invece il valore dei WBC tende ad essere stabilmente presente per artefatti
tecnici o per la formazione di coaguli nei tubi di raccordo che contengono un
elevato numero di leucociti e piastrine; in questo caso infatti il valore di finestre
con valore di k superiore a 9 è significativo.
Riteniamo che gli istogrammi di frequenza rappresentano comunque un mezzo
utile come la scan statistic per valutare se un processo è mantenuto sotto
controllo.
In ultimo, in seguito questo studio, riteniamo opportuno far notare che una
valutazione multicentrica potrebbe risultare utile non solo per evidenziare gli
indici statistici e i processi di controllo, ma anche per valutare quale sia la
frequenza di controllo che un SIMT debba mettere in pratica, in base al numero
di unità prelevate e preparate dallo stesso in base ai dati del registro sangue, e in
base alla percentuale di prodotti non conformi che esso riscontra normalmente
durante la lavorazione.
Abbiano infatti notato che la percentuale di prodotti non conformi ( NC / n° CQ)
rispetto la numero totale degli stessi, sia un indicatore fondamentale per
conoscere la reale situazione della produzione di emcomponenti in un SIMT,
soprattutto per quei servizi e per quei parametri di bassa produzione e/o
controllo.
In relazione al basso numero di campionamenti, tuttavia, il riscontro di un solo
dato non conforme rappresenta evidentemente un peso difficilmente
interpretabile.
L’importanza dello studio multicentrico non si basa quindi solo sull’opportunità
del confronto tra realtà diverse, ma anche sulla possibilità di ottenere un numero
di dati sufficientemente cospicuo da poter attribuire il corretto significato ai
campioni non conformi e da consentire di individuare il numero significativo di
campionature da eseguire in base non solo al carico di lavoro ma anche
all’incidenza delle non conformità registrate.
63
RINGRAZIAMENTI
Desidero ringraziare:
Paola, Filippo e Mattia, la mia vera fonte di energia.
I miei genitori, che sempre mi sostengono moralmente.
Mio fratello Fabio, che mi aiuta costantemente e con pazienza nella
programmazione informatica.
Il Prof. Nino Manca relatore di questa tesi, la dott.ssa Mirella Marini Direttore
del mio Servizio, per la loro disponibilità e cortesia dimostratemi durante le
stesura.
La mia sincera gratitudine ad Ornella, con cui ho sempre lavorato e collaborato
con enorme piacere.
Al mio amico Stefano.
A tutto il personale del SIMT di Brescia e a tutti i Servizi Trasfusionali che
hanno partecipato allo studio.
“Di Dio ci fidiamo. Tutti gli altri portino dati.
64
(Walter Deming)”
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produzione nazionale degli emoderivati ( Gazzetta Ufficiale n. 251 del 27
ottobre 2005)
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Biologique 2008 ;15 :8590
67

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