docPolimerase Chain Reaction: la tecnica che ha rivoluzionato
download 
Reclamo Transcript
Polimerase Chain Reaction: la tecnica che ha rivoluzionato
Polimerase Chain Reaction: la tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare Dr.ssa Lucia Collini - Trento, 26/XI/2011 Polimerase Chain Reaction (PCR): ideata nel 1983 da Kary Mullis, permette l’amplificazione in miliardi di copie di qualsiasi frammento di DNA di cui siano note le sequenze fiancheggianti. 1993 Premio Nobel per la Chimica La scoperta della PCR (Polimerase Chain Reaction) «Sometimes a good idea comes to you when you are not looking for it» E’ la tecnica di studio degli acidi nucleici (DNA-RNA) che ha più contribuito alla semplificazione tecnologica, alla diffusione e allo sviluppo della biologia molecolare in tutti gli ambiti di ricerca e di diagnostica clinica. Che cosa è la PCR? E’ la sintesi enzimatica in vitro che permette di ottenere molte copie di uno specifico frammento di DNA (sequenza target) PCR Richiede reagenti semplici, poco costosi e poco tempo -DNA stampo -Primers, oligonucleotidi (~20bp) a singola catena -DNA polimerasi (termostabile) -dNTPs -Mg2+ -Tampone (Buffer) DNA polimerasi di Thermus aquaticus PCR E’ una tecnica che consente di amplificare piccole quantità di DNA Cicli termici ripetuti Trenta cicli incrementano la quantità di DNA di oltre un miliardo di volte PCR ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE Primers Base Azotata (Adenina, Timina, Citosina, Guanina, Uracile) DNA polimerasi DNA STAMPO DESOSSIRIBOSIO Desossi Nucleotidi trifosfati (dNTP) Siti dei primers DNA target Lunghezza DNA amplificato DNA estratto dal campione PCR fase 1 DENATURAZIONE La doppia elica di DNA stampo è aperta al calore 95° °C PCR fase 2 ANNEALING I primers si appaiano alle sequenze complementari sul DNA stampo 37-72° °C PCR fase 3 ESTENSIONE La DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce 2 nuove catene di DNA 72° °C IL PROCESSO SI RIPETE 95° °C Ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA “copiato” raddoppia Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una singola copia di DNA Numero di cicli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Numero di molecole di amplificati 2 4 8 DNA 16 1 32 64 PCR 128 1 x 109 256 512 1.024 2.048 4.096 8.192 16.384 32.768 65.536 Y= N2n 131.072 262.144 524.288 1.048.576 Y= numero molecole di DNA 2.097.152 4.194.304 amplificato 8.388.608 N= numero molecole di DNA 16.777.216 35.544.432 di partenza 67.777.216 134.217.728 n= numero dei cicli di PCR 268.435.456 536.870.912 1.073.741.724 LA REAZIONE DI PCR Plateau Fase Lineare Log [DNA] Fase Geometrica n° ° cicli PRINCIPALI FATTORI CHE INFLUENZANO LA RESA DELLA PCR Specificità Sensibilità Riproducibilità Scelta dei primers Condizioni di reazione Contaminazione Scelta dei primers Eterogeneità genomica Presenza di inibitori Tipo di campione Efficienza della reazione Standardizzazione delle fasi del metodo: preparazione del campione protocollo di PCR sistema di rivelazione I REAGENTI DELLA REAZIONE DI PCR DNA TARGET Omogeneo (plasmide purificato): ogni molecola è identica e rappresenta la sequenza da amplificare Eterogeneo (mix di diverse molecole di DNA, come il DNA genomico, sospensione cellulari o materiale biologico) DNA TARGET Inibitori della PCR Troppo DNA Troppo RNA Presenza di emoglobina Eparina Ioni metallici SDS Composti Aromatici Etanolo Urea Detergenti OLIGONUCLEOTIDI O PRIMERS SPECIFICI UNIVERSALI DEGENERATI Estrema cura nella scelta della regione da amplificare (evitare sequenze inusuali come serie di purine o pirimidine) Estrema purezza (intesa come assenza di componenti che diminuiscono l’efficienza della PCR) Lunghezza: 20-30 paia di basi (non meno di 16 bp) Equilibrato rapporto AT/GC Evitare sequenze DISEGNO palindromiche che provocano strutture DEI secondarie (loop). PRIMERS Le estremità 3’ non devono essere tra -OH loro complementari: Taq formazione dei OH“primers-dimeri” -OH DNA POLIMERASI (Taq polimerasi) attività 3’ esonucleasica 3’ attività attività 5’ esonucleasica catalitica 5’ 5’ 3’ DNA stampo Primer a RNA Nuovo filamento DNA polimerasi DNA polimerasi termostabile 5’ Primer oligonucleotidico Nuovo filamento 3’ 5’ 3’ DNA stampo 3’ Primers a RNA Nuovo filamento 3’ 5’ 5’ LE CONDIZIONI DI REAZIONE DENATURAZIONE SEPARAZIONE DELLE DUE ELICHE DEL DNA TARGET 94-95° °C per 15-60 secondi ANNEALING INCONTRO E IBRIDAZIONE DEI PRIMERS CON IL DNA TARGET FASE PIU’ DELICATA DELLA PCR Calcolo della temperatura di annealing (37-72°C) La durata dipende dal tipo di strumento utilizzato ESTENSIONE POLIMERIZZAZIONE DI NUOVE MOLECOLE COMPLEMENTARI AL DNA TARGET 60° °-72° °C per 15-60 secondi TIPI DI PCR Quale metodo di PCR ? PCR Real-time Multiplex PCR LCR PCR nested Branched DNA NASBA (Nucleic Acid Sequence Base Amplification) NESTED - PCR Vantaggio: aumenta la specificita’ e la sensibilita’ dell’ amplificazione. Infatti eventuali prodotti secondari della prima reazione non vengono 5’ nella seconda. amplificati 3’ - DNA TARGET - Primo step: Primers Esterni I AMPLIFICATO Secondo Step: Primers Interni II AMPLIFICATO RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE PCR nested regione nota cDNA 3’ I primer specifico regione ignota TTTTT 5’ II primer specifico Il secondo primer specifico dovrà corrispondere ad una regione interna a quella nota e più al 5’ del cDNA e cioè più al 3’ nella regione nota dell’ mRNA La seconda amplificazione perderà la regione corrispondente al primo primer, -si tratta di sequenza già nota e non si perde informazione, -probabilità alta di avere un frammento specifico -probabilità bassa di due sequenze omologhe limitrofe due volte nel genoma. - si può ricorrere ad un terzo primer interno. PCR MULTIPLEX permette l’analisi di più target contemporaneamente vengono usati miscele di primers o primers degenerati Multiplex PCR for automatic Detection TAT 5 ore, applicabile su campioni di sangue, materiale periodontale, liquido articolare, liquor, sputo e altri liquidi biologici LIGASE CHAIN REACTION (LCR) DNA stampo primers antisenso primers senso ligasi termostabile primers “legati” il processo si ripete per 30 o più cicli primers legati: prodotti di LCR viene sfruttata l'azione di una ligasi termostabile e la presenza di quattro oligonucleotidi in grado di appaiarsi, a due a due, a specifiche sequenze della molecola di DNA. LCR REAL TIME PCR amplificazione e rivelazione del prodotto amplificato (DNA target) avvengono contemporaneamente. Il DNA target è riconosciuto e rilevato attraverso l’impiego di sonde fluorescenti (Taqman, Molecolar Beacon etc..). L’incremento della fluorescenza è proporzionale alla quantità di DNA amplificato (nella fase iniziale). PCR Real-time VIRUS •Erpetici •Enterovirus •Parvovirus •Citomegalovirus •HIV •HCV •HBV Metodi di PCR Real-time permettono di identificare e/o quantificare il genoma di tutti i virus riportati (con i relativi sierotipi) in più matrici biologiche: -liquor -sangue intero -plasma, etc utilizzano uno stesso profilo termico permettendo di amplificare più genomi virali contemporaneamente con: -riduzione dei tempi di esecuzione -aumento della sensibilità (> 99%) e specificità alta (> 99%) Branched DNA Metodo quantitativo che utilizza speciali sonde chemioluminescenti che si legano specificatamente alla sequenza di acido nucleico da identificare creando una struttura ramificata “branched DNA”(bDNA). A N D d e h c n a r B Il segnale ottenuto alla fine della reazione è proporzionale alla quantità di bersaglio presente nel campione. (Nucleic Acid Sequence Base Amplification) NASBA: da RNA a DNA e di nuovo a RNA Utilizzando: 3 enzimi(RNA polimerasiT7, RT, RNASiH) e 2 primer specifici consente l’amplificazione sia di RNA sia di DNA in maniera esponenziale. Il prodotto della reazione NASBA è un RNA a singolo filamento, che rappresenta 106-109 volte la sequenza bersaglio, sembra fornire maggiori garanzie di specificità. La tecnica si pone come alternativa al metodo RT-PCR in molte occasioni, specie quando la sequenza di partenza è di RNA. Rispetto alla PCR, il NASBA permette: -Maggiore efficacia di amplificazione di RNA in una miscela ricca di DNA -Condizioni di lavoro isotermiche (di solito 41° °C) -Maggiore rapidità dei test -Rivelazioni di minori quantità di acido nucleico APPLICAZIONI della Polymerase chain reaction Applicazioni di diagnostica infettivologica Le tecniche molecolari PATOGENO CAUSA PATOGENO CAUSA PATOGENO PATOGENO SINDROME tecnica molecolare CAUSA CAUSA PATOGENO CAUSA PATOGENO CAUSA PATOGENO CAUSA Più patogeni danno la stessa sindrome clinica, 1 sola tecnica molecolare per la causa reale PCR nella diagnosi di infezione del sistema nervoso centrale Caso clinico Agosto 2011: M.Z., ragazzo di 15 anni, entra in Pronto Soccorso con febbre, cefalea, rigor nucalis, stato confusionale, e eruzione cutanea rubeoliforme su torace Anamnesi: soggiorno in campeggio, in terapia con cefalosporina di terza generazione Consulenza infettivologica: rachicentesi Liquor TORBIDO Esame chimico-fisico: Accertamenti eseguiti Proteine: 50 mg/dl Glucosio: 45 mg/dl Leucociti: 2500 (65% polimorfonucleati, 25% linfociti) Colorazione gram: negativa Latex test: negativo, Esame colturale: negativo Biologia molecolare per batteri: negativa Biologia molecolare per Enterovirus POSITIVA IgM per CoxsachieVirusA POSITIVE, IgG negative Applicazioni mediche diagnosi pre e post-natale di malattie genetiche (es. Anemia falciforme) diagnosi di tumori (es. linfomi) Applicazioni mediche Gene therapy Aggiunta di un gene a correzione di un disordine ereditario Lo scopo è quello di sostituire dei geni “cattivi” con i geni “buoni” oppure per migliorare le “prestazioni” di una specie Applicazioni mediche Proteine Possono venire prodotte in cellule batteriche -Insulina -Interferone -Peptidi Atriali -Attivatore tissutale del plasminogeno -Ormone della crescita Applicazioni mediche clonare, sequenziare e modificare i geni o in generale segmenti di DNA La tecnica per ottenere questi nuovi vaccini si basa sull’ identificazione della proteina o delle proteine di un agente infettivo che siano in grado di indurre una risposta immunitaria protettiva simile a quella stimolata dall’agente infettivo completo. In questo modo tramite tecniche di ingegneria genetica, si possono selezionare i geni corrispondenti, clonarli e farli esprimere in vettori diversi, oppure eliminarli mediante una delezione selettiva. Una variante di questo sistema sarebbe, una volta identificata la proteina di interesse immunologico, ottenere la o le proteine per sintesi proteica. Vaccini Applicazioni in agronomia Attività insetticida Resistenza a erbicidi Tolleranza a stress ambientali Vita più lunga o maturazione ritardata Migliori qualità nutrizionali (nutraceutics) Allungamento dei tempi di conservazione Il riso è l’unica fonte di cibo per molte popolazioni, soprattutto asiatiche, ma manca della provitamina A (β -carotene) La sua carenza porta a cecità e immunodeficienze Sono stati introdotti geni in modo che venga espresso il β -carotene nell’endosperma dei semi. Vantaggi: la provitamina A è espressa nel riso quindi anche alimentandosi di solo riso si garantisce l’apporto di ßcarotene nella dieta Golden rice Applicazioni in agronomia Golden rice -modificazione genetica per produrre beta-carotene (provitamin A) -viene convertita in vitamina A Daffodil phytoene synthase gene (psy) Bacterial carotene desaturase gene (crtI) Daffodil lycopene β-cyclase gene (lcy) Genes introduced into rice genome Rice chromosome psy crtI lcy Phytoene synthase Carotene desaturase β-Cyclase Expression in endosperm GGPP Phytoene Lycopene β-Carotene (Provitamin A) Applicazioni in agronomia CRY1Ab l'endotossina di Bacillus thuringiensis, La linea di mais MON 810 ottenuta tramite trasformazione con metodo biolistico utilizzando il plasmide PV- MBK07 Mais BT Bacillus thuringiensis Il mais brevettato dalla Novartis contiene un gene del Bacillus thuringiensis (Bt) che produce la proteina (Cry Protein) che cristallizza nell’intestino delle larve di piralide provocandone la morte, ma innocua per l’uomo e per molti insetti utili. Mais BT Bacillus thuringiensis BT (un batterio del suolo) ha gene proteina insetticida Cry (delta-endotossina) Ingegneria genetica: gene isolato e inserito nel corredo genetico piante mais Piante GM esprimono tali proteine Piralide si nutre di mais GM Ingerisce Pro-tossina Proteasi Tossina Legame con recettori nell’epitelio intestinale delle larve Succhi gastrici PH 9.5-12 Diffusione endotossina nell‘ intestino Pori compromettono equilibrio flussi ionici cellulari annullamento metabolismo cellulare, malfunzionamento apparato digerente Morte insetto Efficacia inversamente proporzionale a età insetto Caratteri Mais BT Mammiferi non possiedono tali recettori Insensibili ad azione della tossina Specificità proteine Cry su diverse specie Applicazioni forensi “CSI effect” L’analisi forense del DNA • Casi criminali: indagato/vittima- traccia • Test di paternità: paternità controversa • analisi prenatali: determinazione del sesso • Soggetti scomparsi: relazioni famigliari • Studio di DNA antichi: identificazioni storiche di mummie Applicazioni forensi Analisi forense del DNA • Raccolta del campione • Valutazione tipo di traccia (sangue, saliva, sperma, ecc.) = diagnosi generica • Estrazione del DNA • Quantificazione del DNA • Analisi • Interpretazione Sorgenti di DNA • Presente in ogni materiale cellulare che contiene un nucleo • Presente nel materiale biologico lasciato sulla scena del crimine Applicazioni forensi Tipizzazione ed analisi dei polimorfismi del DNA Test di paternità Applicazioni forensi Casi criminali IL RISULTATO DEL “TEST DEL DNA” • ESCLUSIONE: L’INDAGATO E LA TRACCIA NON HANNO LO STESSO PROFILO GENETICO • NON ESCLUSIONE: L’INDAGATO NON PUO’ ESSERE ESCLUSO DALL’AVER LASCIATO LA TRACCIA • RISULTATO NON CONCLUSIVO (AD ES. PER SCARSA QUANTITA’ O QUALITA’ DEL DNA) Applicazioni forensi Identificazioni storiche Il 19 settembre 1991 una coppia di escursionisti tedeschi (eccellenti alpinisti), Erika ed Helmut Simon, scorse, a 3.200 metri di altitudine, sul massiccio dell' Őtzal, un cadavere umano che emergeva dalla neve congelata Secondo lo studio del DNA contenuto nei suoi mitocondri, Ötzi appartiene a un sottogruppo che non ha lasciato eredi Il Dna mitocondriale e' un orologio biologico dell'evoluzione molto piu' puntuale rispetto al Dna cromosomico perche' si trasmette unicamente per via materna ed e' piu' soggetto alle variazioni molecolari dovute alle influenze dell'ambiente esterno, a differenza del Dna cromosomico che, racchiuso all'interno del nucleo della cellula, e' piu' protetto. campioni del contenuto dell'intestino prima di morire aveva mangiato carne di stambecco Your DNA is 99.7 percent like that of the person next to you The 0.3 percent difference is immensely important It means we differ at 6 million letters We are both very alike and very different
