Caretta caretta
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Caretta caretta
Biol. Mar. Mediterr. (2012), 19 (1): 251-254 M. Giannetti, M.C. Fossi, M. Baini, D. Coppola, S. Maltese, C. Panti, T. Campani, I. Caliani, L. Carletti, L. Pireddu1, G. Fara1, S. Casini, L. Marsili, D. Denurra1 Dipartimento di Scienze Ambientali “G. Sarfatti”, Università di Siena, Via Mattioli, 4 - 53100 Siena, Italia. [email protected] 1 CRAMA, Centro Recupero Animali Marini Asinara, Isola dell’Asinara, Sardegna, Italia. EFFETTI TOSSICOLOGICI IN ESEMPLARI DI CARETTA CARETTA (LINNEO, 1758) CAMPIONATI NEL CENTRO RECUPERO ANIMALI MARINI DEL PARCO NAZIONALE DELL’ASINARA (SARDEGNA) TOXICOLOGICAL EFFECTS IN CARETTA CARETTA (LINNEO, 1758) FROM CRAMA RESCUE CENTRE OF ASINARA NATIONAL PARK (SARDINIA, ITALY) Abstract - Three species of sea turtle are found in the Mediterranean basin, Chelonia mydas, Dermochelys coriacea and the most common Caretta caretta. The loggerhead turtle (Caretta caretta) and green turtle (Chelonia mydas) are currently classified as ‘‘endangered” species worldwide by IUCN (International Union for Conservation of Nature). In addition to the accumulation of pollutants from food the threats for the Mediterranean population of these species are fishing, degradation of nesting beaches and solid wastes. Therefore, there is a need to develop tools to investigate the health status of the Mediterranean population of turtles. The main aims of this study were: a) to develop a nondestructive sampling method (blood, skin biopsies, excreta and carapace), b) to develop and apply a set of ecotoxicological biomarkers in order to explore different levels of interaction between contaminants and the organism, c) to investigate levels of contaminants most commonly present in the Mediterranean and d) to evaluate the responses of a set of biomarkers in the loggerhead specimens after an oil-spill. There is a lack of information concerning in particular the toxicological effects of pollutants on this endangered species, hence the need to develop sensitive non-invasive tools to evaluate the exposure to and effects of contaminants. The main results of this work are a non-lethal sampling methodology, and the assessment of biomarker responses to different levels of contaminants. This work is a contribution for the development of a complete protocol of analysis for the monitoring and protection of endangered species of turtles, highly stressed in the Mediterranean Sea. Key-words: non-destructive testing, sea turtle, biological stress, marine parks. Introduzione - Nel Mar Mediterraneo è possibile ritrovare tre specie di tartarughe marine, la tartaruga verde (Chelonia mydas - Famiglia Cheloniidae), la tartaruga liuto (Dermochelys coriacea - Famiglia Dermochelyidae) e la tartaruga comune (Caretta caretta - Famiglia Cheloniidae). Caretta caretta, attualmente classificata a livello mondiale dalla IUCN come specie EN “endangered”, nonostante sia la più diffusa nel bacino Mediterraneo, ha una popolazione nidificante considerata scarsa o molto scarsa già da due decenni (Goombridge, 1990). Come riportato nell’Action Plan per la Conservazione delle tartarughe marine nel Mar Mediterraneo (UNEP MAC RAC/SPA, 2007), c’è una chiara evidenza dell’impatto negativo delle attività umane su queste specie. Fra queste le principali sono: 1) il deterioramento degli habitat di nidificazione, 2) l’impatto diretto dell’uomo (catture accidentali nella pesca, uccisioni volontarie e collisioni con le imbarcazioni), 3) l’ingestione di materiali plastici presenti in mare, e 4) l’inquinamento antropico, con influenza sia sulla popolazione che sugli habitat. Il lungo periodo di vita di questi Rettili (long-living species) e la loro posizione nella catena trofica marina con un’alimentazione basata principalmente su crostacei, molluschi e pesci, rende le tartarughe marine particolarmente soggette agli effetti dei tossici presenti. Diversi studi hanno dimostrato che i livelli di organoclorurati (OCs) e metalli pesanti rilevati nel materiale biologico di esemplari di C. caretta 252 M. Giannetti et al. del Mar Mediterraneo sono spesso significativamente più elevati rispetto a quelli riscontrati in esemplari della stessa specie campionati in altre aree marine (Aguilar et al., 2002). Una mancanza quasi assoluta di informazioni riguarda invece gli effetti tossicologici che questi contaminanti possono avere su questa e sulle altre specie di tartarughe marine del Mediterraneo. Da ciò la necessità di sviluppare strumenti diagnostici non distruttivi e minimamente invasivi per valutarne l’esposizione e gli effetti. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare ed applicare un protocollo non-invasivo, basato sull’integrazione delle risposte di biomarkers e dei livelli di alcuni contaminanti (organoclorurati (OC), idrocarburi policiclici aromatici (IPA), ritardanti di fiamma (PBDE) ed elementi in tracce), al fine di indagare le minacce legate alla contaminazione della Caretta caretta nel Mar Mediterraneo. Gli obiettivi specifici erano: a) sviluppare una metodologia di campionamento non-distruttiva di vari materiali biologici, b) valutare i livelli di contaminanti presenti nei diversi materiali biologici in esemplari free-ranging e spiaggiati (sangue, fegato, adipe, carapace), c) sviluppare ed applicare un set di biomarkers ecotossicologici per evidenziare i diversi livelli di interazione tra i vari contaminanti e gli organismi (biomarkers di esposizione, estrogenici, di stress ossidativo, di neurotossicità, di genotossicità e di danno epatico), d) l’elaborazione statistica dei risultati ottenuti. Materiali e metodi - Il numero di esemplari presi in considerazione in questo studio sono 9 (8 Caretta caretta ed 1 Chelonia mydas), campionati tutti presso il centro di recupero del CRAMA (Centro Recupero Animali Marini Asinara) presente in Sardegna nel Parco Nazionale dell’Asinara nell’anno 2011. Su questi esemplari, classificati in tre classi d’età a seconda della lunghezza del carapace (CCL) usando il modello di von Bertalanffy: classe I (da 0 a 9 anni), classe II (da 10 a 14 anni) e classe III (oltre 15 anni), i veterinari del CRAMA hanno provveduto al campionamento di: sangue intero (un’aliquota è stata centrifugata per ottenere il plasma), carapace, biopsia cutanea (tramite punch da biopsia da 0.4 o 0.6 mm) ed excreta (dai campioni in cui è stato possibile). Tutti i campioni sono stati conservati immediatamente in azoto liquido e trasportati presso il “Laboratorio Biomarkers ed Analisi dei Residui” dell’Università di Siena per le successive indagini. Su questi campioni sono stati valutati i livelli di idrocarburi policiclici aromatici e le risposte di alcuni biomakers legati alla presenza di questo tipo di contaminanti (citocromo 1A (CYP1A), Comet assay, ENA assay e stress ossidativo). La valutazione dei livelli di IPA è stata effettuata su sangue intero secondo la metodica di Marsili et al. (1997) e la lettura è avvenuta tramite HPLC con detector a fluorescenza. L’induzione del citocromo P450, valutata sulla biopsia cutanea, è stata analizzata tramite metodica immunoenzimatica semiquantitativa del Western Blot (Fossi et al., 2008) che consente, attraverso l’utilizzo di anticorpi specifici, la valutazione dell’espressione proteica di specifiche isoforme del citocromo P450 (CYP1A). Attraverso i test del Comet assay (Frenzilli et al., 1999) e dell’ENA assay (Pacheco e Santos, 1997) applicati sul sangue intero è stato possibile valutare il danno al DNA presente in questi esemplari, da ricondurre principalmente all’esposizione a contaminanti genotossici, quali i composti aromatici come gli IPA, ma anche i composti azotati, gli inorganici radioattivi, i metalli pesanti e le diossine. Tutti questi composti hanno la capacità di interagire con il DNA delle cellule viventi causandone la perdita dell’integrità strutturale e funzionale. Lo stress ossidativo è stato valutato nel plasma tramite la metodica della perossidazione lipidica (LPO) (Bird e Draper, 1984). Questo tipo di danno può essere causato da numerosi processi fisiologici (catena respiratoria mitocondriale) e contaminanti genotossici, quali i composti aromatici come gli IPA, ma anche i composti azotati, gli inorganici radioattivi, i metalli pesanti e le diossine. Tutti questi composti hanno la capacità di interagire con il DNA delle cellule viventi causandone la perdita dell’integrità strutturale e funzionale. Lo stress ossidativo è stato valutato nel Effetti tossicologici in esemplari di C. caretta 253 plasma tramite la metodica della perossidazione lipidica (LPO) (Bird e Draper, 1984). Questo tipo di danno può essere causato da numerosi processi fisiologici (catena patologici, e dall’esposizione a sostanze di sintesi e naturali (IPA, metalli, diossine e respiratoria che mitocondriale) e patologici, e dall’esposizione a ossidanti, sostanze di sintesi e radiazioni), possono aumentare la produzione di sostanze dette specie naturali (IPA, metalli, diossine e radiazioni), che possono aumentare la produzione di reattive dell’ossigeno (ROS, Reactive Oxygen Species). sostanze ossidanti, dette specie reattive dell’ossigeno (ROS, Reactive Oxygen Species). Risultati primo risultato questo studio è stato quello di aver confermato Risultati - Il- Il primo risultato di di questo studio è stato quello di aver confermato la lavalidità validità della metodologia non distruttiva per il campionamento di materiale della metodologia non distruttiva per il campionamento di materiale biologico biologico da tartarughe marinedi aestinzione. rischio diUno estinzione. Uno dei principali risultati da tartarughe marine a rischio dei principali risultati ottenuti dalle ottenuti dalle analisi riguarda i livelli di IPA rilevati in tutti gli esemplari campionati analisi riguarda i livelli di IPA rilevati in tutti gli esemplari campionati nel centro nel centro CRAMA. Il test statistico non parametrico di Kolmogorov-Smirnov CRAMA. Il test statistico non parametrico di Kolmogorov-Smirnov ha infatti ha infatti evidenziato che i livelli di IPA rilevati in queste tartarughe erano evidenziato che i livelli di IPA rilevatidiinquelli questeritrovati tartarughe significativamente significativamente più elevati (p<0,05) neglierano esemplari di C. caretta più elevati (p<0,05) di quelli ritrovati negli esemplari di quali C. caretta analizzati analizzati precedentemente dal nostro laboratorio, alcuni dei addirittura giunti dalBrancaleone nostro laboratorio, alcuni deidiquali addirittura al centro alprecedentemente centro CRTM di ancora ricoperti petrolio (Casini,giunti comunicazione CRTM di Brancaleone di petrolio comunicazione personale). Per questo ancora motivo,ricoperti in accordo con (Casini, i veterinari del centropersonale). CRAMA, èPer stato deciso di effettuare prelievi di sanguedel negli esemplari ospedalizzati a più questo motivo, in accordo con i veterinari centro CRAMA, è stato deciso di riprese: a distanza circa 2negli mesiesemplari dal recupero la primaa volta e, successivamente, effettuare prelievi didisangue ospedalizzati più riprese: a distanza di ogni I risultatila preliminari, solamente degli 8 Iesemplari circa settimana. 2 mesi dal recupero prima volta e,riguardanti successivamente, ogni 2settimana. risultati dipreliminari, C. carettariguardanti indagati solamente (Françoise2 degli e Nicolà), hanno evidenziato una diminuzione 8 esemplari di C. caretta indagati (Françoise media del livello di IPA del una 77%,diminuzione il cui trendmedia potràdel anche confermato e Nicolà), hanno evidenziato livelloessere di IPA del 77%, ildalle cui analisi effettuate sui successivi prelievi (Fig. 1). I livelli di IPA, fino a circa 3 ppm, trend potrà anche essere confermato dalle analisi effettuate sui successivi prelievi (Fig. ritrovati negli esemplari campionati presso il centro CRAMA sono stati ricondotti 1). I livelli di IPA, fino sversamento a circa 3 ppm, neglida esemplari campionati pressonel il principalmente ad uno di ritrovati idrocarburi un impianto industriale centro CRAMA sono stati ricondotti principalmente ad uno sversamento di idrocarburi Golfo di Porto Torres a Gennaio 2011. da un impianto industriale nel Golfo di Porto Torres a Gennaio 2011. IPA Totali 3000 ng/g p.s. 2500 78% 2000 76% 1500 1000 500 0 Francoise (Maggio 2011) Francoise (Luglio 2011) Nicolà (Maggio 2011) Nicolà (Luglio 2011) Fig. - Livelli di IPA nei duecampionati esemplari campionati distanza di due mesi. Fig. 1 - Livelli di 1IPA nei due esemplari a distanzaa di due mesi. Levels of PAHs in two specimens sampled after two months. Levels of PAHs in two specimens sampled after two months. Per quel che riguarda le indagini dei biomarkers, alti livelli di stress ossidativo sono stati evidenziati nell’unico esemplare di C. mydas (Green). Una possibile spiegazione a talePer risultato può essere le data dalla lettura della “storia di vita” di questo esemplare: quel che riguarda indagini dei biomarkers, alti livelli di stress ossidativo sono negli ultimi due anni è stato ospedalizzato, liberato e nuovamente ricoverato al centro stati evidenziati nell’unico esemplare di C. mydas (Green). Una possibile spiegazione a tale risultato può essere data dalla lettura della “storia di vita” di questo esemplare: negli ultimi due anni è stato ospedalizzato, liberato e nuovamente ricoverato al centro CRAMA dopo che, grazie ad un tag satellitare collocato sulla tartaruga al momento della liberazione, se ne era rilevato un successivo spiaggiamento. Tutti i valori di stress ossidativo degli esemplari di C. caretta (animali campionati in altre zone ed in tempi diversi) sono invece risultati nella media. I test di genotossicità hanno mostrato valori superiori alla media per quanto riguarda il test dell’ENA assay ed in linea con la media di tutti gli altri esemplari da noi campionati e valutati per quanto riguarda 43_Congr SIBM form testi v. 11_feb_2010 254 M. Giannetti et al. il Comet assay, non essendo inoltre presenti dati in letteratura su quali effettuare confronti. L’espressione del CYP1A, valutata tramite la metodica del Western Blot, è risultata differente tra i diversi esemplari; in particolare hanno mostrato un’alta attività proteica di questo citocromo la tartaruga verde e tre esemplari di C. caretta denominati Stefania, Nicolà e Corse. In assoluto i valori di espressione proteica sono più alti di quelli riscontrati in altri esemplari analizzati precedentemente nel nostro Laboratorio, considerando inoltre la non presenza di dati in letteratura. Dato che l’isoforma 1A del citocromo P450 fornisce informazioni sulla contaminazione dovuta a molecole planari tra cui gli IPA, è probabile che gli elevati livelli di questi contaminanti presenti nel sangue delle tartarughe siano i responsabili dell’elevata espressione del CYP1A. Conclusioni - Le principali conclusioni che si possono trarre da questo studio sono le seguenti: a) la validazione di metodologie di campionamento non-distruttive sia su esemplari di C. caretta che per la prima volta su un solo esemplare di C. mydas; b) l’applicazione e la valutazione di un set di biomarkers sulla C. caretta con risultati molto interessanti; c) la stima dell’impatto che può avere uno oil-spill su questi Rettili marini; d) la valutazione della diminuizione a livello ematico degli IPA durante i due mesi di ospedalizzazione mostrato da 2 esemplari di C. caretta. Infine riteniamo che i risultati di questo studio potranno contribuire in modo significativo allo sviluppo di protocolli non invasivi per studiare le problematiche delle tartarughe marine, legate soprattutto ad una contaminazione di origine antropica. Inoltre permetteranno di arricchire le conoscenze sullo stato tossicologico di queste specie nel bacino del Mediterraneo, considerando che non esistono, per quanto riguarda almeno le nostre conoscenze, dati in letteratura con cui poter effettuare confronti dei dati ottenuti. Bibliografia AGUILAR A., BORREL A., REIJNDERS P.J.H. (2002) - Geographical and temporal variation in levels of organochlorine contaminants in marine mammals. Mar. Environ. Res., 53: 424-452. BIRD R.P., DRAPER H.H. (1984) - Comparative studies on different methods of malonaldehyde determination. Method. Enzymol., 105: 299-305. FOSSI M.C., CASINI S., BUCALOSSI D., MARSILI L. (2008) - First detection of CYP1A1 and CYP2B2 induction in Mediterranean cetaceans skin biopsies and cultured fibroblasts by western blot analysis. Mar. Environ. Res., 66: 3-6. FRENZILLI G., SCANCELLI V., TADDEI F., NIGRO M. (1999) - Adaptation of SCGE for monitoring marine ecosystem. Neoplasma, 46: 6-7. GROOMBRIDGE B. (1990) - Marine turtles in the Mediterranean: distribution, population status, conservation. Nature and Environment Series, 48: 98 pp. MARSILI L., FOSSI M.C., CASINI S., SAVELLI C., JIMENEZ B., JUNIN M., CASTELLO H. (1997) - Fingerprint of polycyclic aromatic hydrocarbons in two populations of southern sea lions (Otaria flavescens). Chemosphere, 34 (4): 759-770. PACHECO M., SANTOS M.A. (1997) - Induction of EROD activity and genotoxics effects by polycyclic aromatic hydrocarbons and resin acid on the juvenile eel (Anguilla anguilla L.). Ecotox. Env. Safe., 38 (3): 252-259. UNEP MAC RAC/SPA (2007) - Action Plan for the conservation of Mediterranean Marine Turtles.