k I - Spiro

Tecniche di super-risoluzione
.
(F)PALM – STORM – PALMIRA – 3D STORM
Schema dei contenti
- Rivelazione di una singola molecola fluorescente
- Proteine fluorescenti fotoattivabili
- Tecniche stocastiche di super-risoluzione:
sincrona (FPALM e STORM)
asincrona (PALMIRA)
con presentazione di alcuni risultati per ciascuna tecnica
- Nuove frontiere: 3D-STORM
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Rivelazione di una singola molecola fluorescente
Determinazione del centroide e del rms generato dalla radiazione emessa da
una singola molecola fluorescente
y
Minimizzazione
di1
χ 2 ( x) = ∑
( n − N ( x))
i
σ
i
2
i
2
i
ni: # fotoni contati nella cella i-esima
a
ni
Ni(x): # fotoni attesi dalla cella i-esima
generati dalla molecola posta in x
σi2 = Ni(x) + b2
x
(distrib. Poisson: molti fotoni incidenti con una piccola sez. d’urto di rivelazione)
piano oggetto
b: background (fotoni per cella; viene assunto costante)
dχ
=0
dx
2
∆x ≃ −
espans. Ni(x)-Ni(x0)≈0
'
2
∆
n
N
σ
∑ i i i
i
'
2
N
σ
∑ i i
i
Ni’(x): derivata di Ni(x) calcolata in x0
∆ni = Ni(x0) - ni
1:
trattazione solo lungo l’asse x; analogamente per l’asse y
( ∆x )
2
=
1
∑ Ni' σ i2
i
intro
Super resolution
Assumendo che
( ∆x )
2
PA-FPs
Ni =
N
e
s 2π
(F)PALM/STORM
−
i2
2 s2
e sostituendo
PALMIRA
∑ → ∫ di
3D-STORM
si ottiene
i
s 2 + a 2 12
(se σi2 = Ni(x)) rumore statistico
N
=
4 π s 3b 2
aN 2
(se σi2 = b2 ) rumore di background
che generalizzato a due dimensioni con
Ni, j =
N
e
s 2π
−
i2 + j2
2 s2
a 2 12
e aggiunto il termine statistico
dovuto alla distribuzione uniforme
N
( ∆x )
2
s ≃ R0 =
s + a 12 8π s b
=
+ 2 2
N
a N
2
0.61λ0
NA
2
4 2
- N (# fotoni raccolti) deve essere il più grande possibile
- b deve essere il più piccolo possibile
- occorre trovare il giusto rapporto a/s
s: rms della distribuzione dello spot (riportato nel piano oggetto) generato dal
sistema ottico che focalizza la molecola fluorescente
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Limiti della trattazione
a 2 12 è necessario aggiungerlo a posteriori
N
2
- introduzione errore costante (-10% su ( ∆x ) ) dovuto al calcolo infinitesimale
- il rumore statistico
∑ → ∫ di
i
- errore (scelta volta alla velocizzazione del fit) nell’approssimazione
Ni , j =
−
N
e
s 2π
i2 + j2
2 s2
Linea: teoria
Linea tratteggiata: simulazione
Cerchi: dati
b=0.7 fotoni
s=208nm
a=130nm
Linea: teoria
Il primo grafico mostra che
esiste uno scarto del 30%
tra la teoria e i dati raccolti
Il secondo grafico mostra
che esiste un valore
ottimale per il rapporto a/s
 a  96π b
  =
N
s
4
Linea tratteggiata: teoria + 30%
Cerchi: simulazione
N=100
Thompson et al., Biophys. J. 82, 2775 (2002)
Se a>>s (gli N fotoni sono in gran
parte contenuti in un unico pixel) la
simulazione diverge dalla teoria;
2
( ∆x ) dovrebbe tendere ad a 2 12
(indipendente da N)
2
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Problemi e limiti dei microscopi a fluorescenza convenzionali
Per quanto visto fino ad ora, una singola molecola fluorescente può essere localizzata
con precisione arbitraria, dipendente solo da N, b, a/s
L’osservazione di un campione richiede
però la localizzazione di un gran numero
di molecole fluorescenti.
Problemi da affrontare
- Axial blurring
- Limite di diffrazione
http://www.olympusfluoview.com/theory/confocalintro.html
Confocale: risolve il problema dell’axial blurring
PSF: ∆x,∆y ≈ 200nm
∆z ≈ 500nm
4Pi: miglioramento del limite di diffrazione lungo z
PSF: ∆x,∆y ≈ 200nm
∆z ≈ 80-150nm
Hell, S.W., Science 316, 1153-1158 (2007)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Superamento del limite di diffrazione
Problema: due molecole fluorescenti adiacenti,
distanti meno di 0.61λ0/NA non sono risolvibili
se fatte fluorescere contemporaneamente
Soluzione: occorre che le due molecole non
fluorescano contemporaneamente
d<
A1
0.61λ0
NA
A2
Si considerino due stati, A e B, nei quali una
molecola fluorescente può trovarsi
AB transiz. fotoinducibile
kAB= IσAB
BA transiz. che può avvenire in ogni modo
kBA= E + kBAsp + IσABab
agenti esterni
spontanea
indotta da I
NA, NB : # di molecole, normalizzato, in A o B
dN A
dN
= − N A k AB + N B k BA = − B
dt
dt
N A + NB = 1
Hell, S.W., Phys. Lett. 326, 140-145 (2004)
intro
Super resolution
PA-FPs
k BA
1
N A∞ = N A ( t → ∞ ) =
=
k AB + k BA 1 + I I sat
(F)PALM/STORM
con I sat ≡
PALMIRA
k BAspont
σ AB
=
3D-STORM
1
σ ABτ B
N A∞
E’ importante osservare che se I>>Isat allora
∞
I I sat
N
Sfruttando la relazione non lineare tra
A e
N A∞ → 0
è possibile superare il
limite di diffrazione di Abbe.
Si consideri un profilo di intensità del tipo I ( x ) = f ( x ) I max
Se I(x) = 0 per certi x, allora in tali punti N A∞ = 1
∞
L’idea è quella di creare un profilo I(x) tale che la regione in cui N A = 1
sia sufficientemente piccola.
intro
Super resolution
Se ad esempio
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
 2π x 
f ( x ) = sin 2 

λ
 AB 
allora la FWHM della regione
all’interno della quale le molecole si
trovano nello stato A, circondate da
molecole nello stato B, è
Hell, S.W., Phys. Lett. 326, 140-145 (2004)

1
∆x ≃
arcsin 

2 NA
 1 + I max I sat
λAB
e se
 λAB
1
 ≃
 2 NA 1 + I max I sat
I max I sat ≫ 1 allora ∆x → 0
Si osserva inoltre che se Imax=0
(transizione spontanea) si ottiene
il noto limite di diffrazione di Abbe
NB: questo meccanismo di
localizzazione delle molecole
entro ∆x non è diffracion limited
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Problema: la richiesta Imax >> Isat impone delle intensità eccessive con
le quali illuminare il campione.
Ad esempio: fluorescina
τ fluorescina =
1
k BAspont
≈ 4 ⋅10−9 s
σ ( 488nm ) = 3 ⋅10−16 cm2
⇒
I sat
1
W
=
= 3.4 ⋅10
τσ
cm 2
I max I sat > 10
Con la tecnica STED si è arrivati ad un fattore
ma per spingersi a valori ancora più elevati non si può aumentare
eccessivamente Imax, quanto piuttosto occorre ridurre Isat
occorre aumentare τ
5
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Esempio: GSD (Ground State Depletion)
sfrutta il livello T1 per incrementare τ
103 ns <
1
spont
k BA
< 106 ns
⇒
I sat = 10 ÷ 104
W
cm 2
Con la tecnica GSD si riduce
Imax anche di 104 volte, a parità
di risoluzione, rispetto a STED
Hell, S.W., Science 316, 1153-1158 (2007)
La situazione ideale è quella nella quale gli stati A e B sono stabili, e quindi
ben controllabili (Isat0)
proteine fluorescenti fotoattivabili
Le PA-FPs sono degli oggetti estremamente non lineari, in quanto
funzionano come degli interruttori on-off
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Proteine fluorescenti fotoattivabili (PA-FPs)
Proteine aventi la capacità di modificare le loro proprietà fluorescenti se illuminate con una particolare
radiazione. Il cambiamento delle proprietà fluorescenti può essere reversibile
PA-GFP
KAEDE
assorb max: 400nm
emiss max: 515nm
attivazione: UV-violetto
(irreversibile)
assorb max: 508nm
assorb max: 504nm
emiss max: 517nm
assorb max: 572nm
emiss max: 518nm
attivazione: UV-violetto
(irreversibile)
emiss max: 580nm
Spetto di emissione di PA-GFPs prima (B) durante (C) e dopo (D)
l’attivazione (405nm laser) sotto la illuminazione di un laser Ar+ (488nm)
(Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006))
Lukyanov et al., Nat. Rev.
Mol. Cell Biol. 6:885–891 (2005)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
PA-FPs disattivabili
Coppia di molecole legate tramite un segmento di
DNA o un anticorpo: un fluoroforo e un cromoforo
(rispettivamente Cy5 e Cy3 in figura (a))
Cy5: molecola fluorescente il cui dark state è lo
stato di tripletto (τtripl~100ms)
Il cromoforo Cy3 modifica le proprietà fluorescenti
di Cy5 in funzione della distanza R (fig (a) e (b)):
si crea un nuovo dark state particolarmente stabile
(τoff~1hour). La nuova molecola fotoattivabile è in
grado di essere attivata e disattivata centinaia di
volte prima del bleaching.
I grafici in basso mostrano il meccanismo di
accensione e spegnimento della molecola
Cy5/DNA/Cy3
- un laser verde (532 nm) attiva le molecole del
campione per un certo periodo di tempo
- un laser rosso (638 nm) fa fluorescere le
molecole attivate e le disattiva
- se il laser verde non attiva le molecole, non si
osserva fluorescenza
Bates et al., Phys. Rev. Lett. 94, 108101 (2005)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Oltre alla coppia Cy3-Cy5, è possibile
creare molte molecole fotoattivabili e
disattivabili tramite la combinazione,
per mezzo di un segmento di DNA o
un anticorpo, di un fluoroforo e di un
cromoforo.
Fluorofori: Cy5, Cy5.5, Cy7, Alexa647
Cromofori: Cy2, Cy3, Alexa405
Esempio: Cy2/Cy5 e Cy3/Cy5 hanno
entrambe un picco di emissione
fluorescente a ~650nm, ma è possibile
distinguerle (assegnando al centroide
dello spot rivelato un certo colore:
fig A-C) poiché hanno differenti spettri
di attivazione.
Multicolor-STORM applicata a tre differenti
molecole legate ad un filamento di DNA
Bates et al., Science 317, 1749–1753 (2007)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
PA-FPs: rates di attivazione, disattivazione e photobleaching
kAΦA+k0+kxΦRA
NI
kBC+kDΦD
kxΦB
NA
NB
NI, NA, NB: numero di molecole Inattivate, Attivate, Bleached
ka, k0: rate di attivazione, attivazione spontanea
kx: rate di diseccitazione delle molecole attivate
kBC: rate di disattivazione spontanea
kD: rate di disattivazione indotta dal read out laser
ΦA: rendimento del processo di attivazione
ΦRA: rendimento del processo di attivazione dovuto al readout laser
ΦB: rendimento del processo di photobleaching
ΦD: rendimento del processo di disattivazione indotta dalla radiazione
dN I
= − N I ( k AΦ A + k0 + k x Φ RA ) + N A ( k BC + k D Φ D )
dt
dN A
= − N A ( k BC + k D Φ D + k x Φ B ) + N I ( k AΦ A + k0 + k x Φ RA )
dt
dN B
= N AkxΦ B
dt
NI + N A + NB = C
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
kAΦA+k0+kxΦRA
NI
kBC+kDΦD
PALMIRA
3D-STORM
kxΦB
NA
NB
Date le equazioni precedenti si vuole determinare il rapporto tra NI ed NA ottimale, e successivamente
anche il massimo NA ottenibile in una sola immagine, per poter acquisire delle immagini che diano
informazioni sulla distribuzione spaziale delle PAFPs con una risoluzione migliore rispetto al limite di Abbe
È possibile scegliere kx e kA in modo tale che
da cui
N A = NI
k AΦ A + k0 + k x Φ RA
≪ NI
k BC + k x Φ B + k D Φ D
N A ≪ NI e
dN A
=0
dt
Condizione non necessaria, ma utile
per ottenere un’espressione per NA/NI
Affinché sia possibile distinguere le PAFPs con una risoluzione migliore del limite di Abbe occorre
che esse siano attivate ed eccitate in un numero sufficientemente piccolo, precisamente
S
≫ R0 2 + 4 Dtm
NA
S: area illuminata dal laser di attivazione
R0 =
0.61λ0
NA
D: coefficiente di diffusione (se la molecola alla quale la PAFP è legata è fissata, allora D = 0 µ m 2 s )
4Dtm: area potenzialmente spaziabile dalla PAFP durante il tempo tm di acquisizione del frame
E’ possibile scegliere
S
= β ( R0 2 + 4 Dtm ) con β=16
NA
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Un esempio:
stima di NA e di tm necessari per la visualizzazione di PA-GFPs fissate (D=0µm2/s)
con una risoluzione di 80 nm
Nota: per poter parlare di risoluzione di 80 nm occorre che le molecole distino tra loro meno di tale
distanza. In questo esempio si impone che σx = σy = 80 nm
Si suppone che NPA-GFPs = 100
su di un’area 80 nm x 80 nm
se STOT = 10 µm x 10 µm allora NTOT=1.56 106 molecole
Supponendo che solo il 10% delle molecole ricopra un’area interessante del campione
S = 10 µm2
N=1.56 105 molecole
Ricordando la richiesta
D=0µm2/s
S
S
NA ≪ 2
= 2
R0 + 4 Dtm R0
N 1.56 ⋅105
=
= 1.76 ⋅104
NA
9
⇒
S
10µ m 2
NA =
=
=9
β R0 2 16 ⋅ ( 0.263µ m )2
# frames da acquisire
Parametri: b=1.02 photons/pixel
a=0.121 µm
R0=0.263 µm
s 2 + a 2 12 8π s 4b 2
+ 2 2
⇒
Nγ = 48.4 # fotoni rivelati per molecola
( ∆x ) = 80nm =
Nγ
a Nγ
Nγ
Nγ
48.4 γ molec
Se Iread-out<Isat allora
=
=
= 0.0121 s frame
emiss ( rivelati )
k PA
Φ
Φ
I
4000
s
⋅
molec
σ
λ
γ
(
)
−GFP
DET
FL ( RA ) RA
ms
tTOT = 0.0121
⋅1.73 ⋅104 frames = 209.3s
frame
2
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Un esempio: immagine di una goccia di PA-GFP
Sovrapposizione delle immagini di una goccia di soluto
contenente PA-GFPs ottenute con le tecniche di microscopia
wide-field (macchie verdi) e FPALM (punti gialli)
(Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006))
All’aumentare del numero di frames acquisiti, il numero di
fotoni per frame diminuisce esponenzialmente a causa
del photobleaching delle molecole già visualizzate
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Proprietà che le PAFPs devono avere per poter essere sfruttare
nelle tecniche di super-risoluzione (F)PALM/STORM o PALMIRA
kAΦA+k0+kxΦRA
NI
kBC+kDΦD
kxΦB
NA
NB
1) kx ΦB >> kBC + kD ΦD ((F)PALM/STORM - sincrono)
kx ΦB << kBC + kD ΦD (PALMIRA - asincrono)
kA ΦA + kx ΦRA >> k0
k Φ +k +k Φ
2) kx ΦB + kBC + kD ΦD >> kA ΦA + kx ΦRA + k0
N A = N I A A 0 x RA ≪ N I
k BC + k x Φ B + k D Φ D
3) N >>1 : # fotoni acquisiti il più grande possibile
4) b≈0
GFP
5) ΦB piccolo ma non nullo
tlifetime
= 2.11ns
ΦA , ΦFL ≈ 1
1
γ
k BC = GFP = 4.74 ⋅108
≈ 0 ((F)PALM/STORM - sincrono)
tlifetime
s
ΦRA =
k BC
W
γ
I sat =
= 7.13 ⋅1024 2 = 2.805 ⋅106 2
> 0 (PALMIRA - asincrono)
cm s
cm
σ ( λRA )
NB: la condizione 3) è molto importante. Il rate di fotoni rivealti è (con IRA<Isat)
kemiss = Φ DET Φ FLσ ( λRA ) I RA
e nel caso di PA-GFP, con un readout laser di intensità 64W/cm2 sul campione, con ΦFL=0.79,
ΦDET=0.05 e con σ(λRA=504nm) = 6.65·10-17cm2 (hν=2.46 eV) si ottiene circa
emiss ( rivelati )
k PA
= 4000 photons ( s ⋅ molec )
− GFP
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
PA-FP
Caratteristiche (extinction coefficient, cross section, lungh d’onda d’attivazione, eccitazione ed
emissione, …) delle PA-FPs che verranno usate nelle tecniche (F)PALM/STORM e PALMIRA
λattiv [nm]
λeccit [nm]
λemis [nm]
ΦFL
ε(λeccit)
[l/M·cm]
η (I<Isat)
[phot/s·molec]
Cy2
--
489
506
0.12
150000
?
Cy3
--
550
570
0.04
150000
?
Cy5
--
649
670
0.28
250000
?
Alexa 405
--
401
421
34000
?
Alexa 647
--
652
668
0.33
237000
?
PA-GFP
UV-viola
504
517
0.79
17400
4000
Kaede
UV-viola
572
580
0.33
60400
?
Cy3/Cy5
verde
649
670
0.28
250000
?
Cy3/Alexa 647
verde
652
668
0.33
237000
?
Cy2/Alexa 647
blu
652
668
0.33
237000
?
Alexa 405/Cy5
viola
649
670
0.28
250000
?
rsFastLime
384
496
522
0.68
125000
?
Nota: il rate di attivazione delle molecole del tipo Cy3/Cy5, ecc … dipende anche dalla distanza R
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
(F)PALM / STORM
Le due tecniche sono molto simili, poiché sfruttano entrambe il principio secondo il quale attivando ed osservando
poche molecole per volta è possibile localizzarle con una risoluzione piccola a piacere. Le due tecniche si distinguono
per i tipi di fluorofori utilizzati (disattivabili nel caso di STORM)
- Activation: un laser di attivazione a bassa
potenza illumina un’area del campione
attivando un certo numero di molecole NA
- Readout: le molecole attivate vengono fatte
fluorescere tramite un secondo laser (segue
il photobleaching o la disattivazione)
- Registrazione e localizzazione: tramite una
Camera si localizzano gli “spot” di ciascuna
molecola e ad ognuno si assegna un
centroide ed uno scarto quadratico medio
- Ciclizzazione delle fasi di attivazione e di
readout tramite uno shutter (S)
(Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006))
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
(F)PALM
(Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy
FPALM: Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006)
Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope)
Activation: 405 nm (7.3 W/cm2 sul campione) (impulso di 10s)
Readout: Ar+ laser (64 W/cm2 sul campione) (illuminazione continua)
24.8% @ 476.5nm
72.0% @ 496.5nm
3.2% @ <470nm
Acquisizione: 400 frames da 1 s ciascuno (una sola attivazione)
totale: 400 s (48746 molecole su 33µm x 33µm)
Fluoroforo: FA-GFP
Si introduce una soglia (ad es. 30γ/pixel/frame) per
distinguere le molecole fluorescenti dal fondo: soluzione al
problema dell axial blurring
Costruzione dell’immagine:
- se un pixel di un frame supera la soglia allora viene
centrato in una regione di interesse di dimensioni 7px x 7px
- se due regioni di interesse si sovrappongono allora
vengono scartate
- se il massimo di un evento si verifica nello stesso pixel in
frames successivi, allora tutti gli eventi aventi il massimo in
quel pixel vengono sommati tra loro
- viene fatto un fit gaussiano della regione di interesse
Sovrapposizione delle immagini di una goccia di
soluto contenente PA-GFPs ottenute con le
tecniche di microscopia wide-field (macchie
verdi) e FPALM (punti gialli)
(Hess et al., Biophys J 91:4258–4272 (2006))
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
PALM: Betzig et al., Science 313, 1642–1645 (2006)
Microscopio: Olympus Fluoview FV1000 (fluor. microscope) + TIRF
Activation: 405 nm (12.7 W/cm2 sul campione) (impulso di 0.11.0s)
Readout: Ar+ laser (51 W/cm2 sul campione) (illuminazione continua)
24.8% @ 476.5nm
72.0% @ 496.5nm
3.2% @ <470nm
Acquisizione: 20 frames da 0.5 s ciascuno (per 1000 attivazioni)
totale: 10000 s (10858 molecole su 7.2µm x 7.2µm)
Fluoroforo: KAEDE
3D-STORM
Crescita esponenziale per
compensare il numero sdi molecole
disattivate permanentemente
Le PA-FPs utilizzate nella tecnica
(F)PALM non sono disattivabili:
una volta attivate le si fa
fluorescere fino al photobleaching
Per massimizzare Nγ occorre che ΦB sia piccolo,
quindi il rate di photobleaching kxΦB = IRAσ(λRA)ΦB
deve essere piccolo, ma non nullo: compromesso
tra risoluzione e tempo di acquisizione
Proteina CD63 evidenziata con PA-FPs KAEDE.
Confronto fra TIRF convenzionale (A) e PALM (B)
(Betzig et al., Science 313, 1642–1645 (2006))
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
STORM
Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy
Apparato strumentale identico a quello della
tecnica (F)PALM
Molecole in genere utilizzate per la tecnica
- Cy3/Cy5
- Cy3/Alexa647
- Cy2/Cy5
- Alexa405/Cy5
-…
Attivabili e disattivabili centinaia di volte
prima che raggiungano un dark state
irreversibile.
Localizzazione ripetuta della stessa
molecola e media del cluster ottenuto
(v. figure)
In alto: due molecole Cy3/Cy5
legate direttamente ad una
catena di DNA. A fianco: DNA
ricoperto da RecA, sul quale
sono legati anticorpi trasportanti
molecole Cy3/Cy5.
M. J. Rust, M. Bates, X. Zhuang,
Nature Methods 3, 793-795 (2006)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
STORM: Rust, et al., Nature Methods 3, 793-795 (2006)
Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope) TIRFM
Activation: Nd:YAG laser (532nm) (1 W/cm2 sul campione)
impulso <0.1s (un impulso ogni 5s, per 60 volte)
Readout: He-Ne laser (633 nm)
(30 W/cm2 sul campione)
illuminazione continua
Acquisizione: 50 frames da 0.1 s ciascuno (per 60 attivazioni)
totale: 300 s
Fluoroforo: Cy3/Cy5
300nm
Costruzione dell’immagine finale:
- fit dello spot di ciascun frame con una
gaussiana 2D ellissoidale: se σx e σy
- se i due differiscono di più del 15%
allora il fit viene scartato
- se il fit contiene meno di 2000
fotoelettroni allora viene scartato
- ciascun cluster (centroidi contenuti nello
stesso pixel) di punti ottenuti viene infine
mediato con un fit gaussiano pesato
Localizzazione di molecole fluorescenti Cy3/Cy5, tramite
TIRFM (in alto) e STORM (in basso), trasportate da
anticorpi legati a RecA, il quale ricopre un catena di DNA
Schema della ciclizzazione dei processi di attivazione e radout. In
azzurro gli eventi che soddisfano ai requisiti e che vengono utilizzati
per formare l’immagine finale
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Multicolor-STORM: Bates et al., Science 317, 1749–1753 (2007)
Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope) TIRFM
Activation: Ar+ (457nm) - Diode (532nm)
illuminazione a impulsi 0.05s (2 µW)
Readout: He-Ne laser (633 nm)
illuminazione continua (40 mW)
Acquisizione: 9 frames da 0.05 s ciascuno (per ogni laser) (20Hz)
totale: 100-5000 s
Fluorofori: Cy2/A647 – Cy3/A647
Microtubuli (in verde - Cy2/Alexa 647) e vescicole (in rosso - Cy3/Alexa 647) osservate in wide field (A) e con STORM (B e
C) localizzate tramite due laser di attivazione (457nm e 532nm) sotto la continua azione di un readout laser (657nm)
Bates et al., Science 317, 1749–1753 (2007)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
Problemi STORM e multicolor-STORM
Drift del campione durante l’acquisizione.
Soluzioni:
- microsfere fluorescenti
- correlazione tra centroidi adiacenti (un cluster di
localizzazioni potrebbe presentare una forma non sferica)
Cross-talk. Attivazione del fluoroforo da parte
i) del readout laser (633nm)
ii) del laser di attivazione sbagliato
Soluzioni:
- i) si risolve aumentando l’intensità degli activation laser
e riducendo l’intensità del readout laser
- per risolvere ii) occorrerebbero degli activation laser
con lungh. d’onda alle quali un solo fluoroforo è sensibile
PALMIRA
3D-STORM
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Considerazioni su (F)PALM/STORM
Vantaggi:
- tecnica molto semplice dal punto di vista strumentale, quindi costi contenuti
per la realizzazione (ad esempio il gruppo di ricerca del prof. Barry (Denver, Colorado) ha
modificato un microscopio TIRF della Zeiss aggiungendo i due laser necessari per la
tecnica PALM ottenendo uno strumento di nanoscopia a meno di 100 000 dollari)
- usando le molecole fluorescenti fotoattivabili è sufficiente un qualsiasi
microscopio a fluorescenza per superare il problema dell’axial blurring,
perché le molecole attivate non sovrappongono le loro PSFs: è quindi
sufficiente una soglia sul numero di fotoni per scartare gli eventi fuori fuoco
Svantaggi:
- tempi di acquisizione delle immagini molto lunghi (da pochi minuti a qualche ora)
quindi necessità di correggere il drift del campione
- necessità di far combaciare bene gli spettri di attivazione ed emissione
delle PA-FPs con gli spettri dei laser
- PA-FPs non puntiformi: questo comporta un errore nella loro localizzazione
e anche una possibile interferenza con la dinamica cellulare
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
PALMIRA
PALM with indipendently running acquisition
PALMIRA: Egner et al., Biophys J., 93(9):3285-90 (2007)
Microscopio: Leica DM IRE2 (inverted microscope)
Activation e Readout: Ar+ (5.0 kW/cm2) con CF
illuminazione continua
Acquisizione: continua a 500Hz
totale: 140 s (70000 frames)
Fluoroforo: rsFastLime (disattivabile)
AOTF: acousto-optical tunable filter
CF: cleanup filter (488/10)
DF: dichroic filter
NF e BP: notch (488-25) e bandpass (525/50) filter
Un unico laser (in figura Ar+) è
responsabile dell’attivazione e
dell’eccitazione delle molecole
fluorescenti.
Elementi molto importanti nel setup
sperimentale sono AOTF, CF e DF per
regolare lo spettro della radiazione incidente
in modo da trovare il giusto compromesso
tra i rate di attivazione e di eccitazione per
rispettare la condizione N A ≪ 2 S
R0 + 4 Dtm
Membrana di E. coli
Membrana di E. coli osservata con un microscopio
convenzionale wide-field (A) e con la tecnica PALMIRA (B)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
Come per (F)PALM, gli eventi che
contribuiscono a formare l’immagine
finale (B) devono superare una certa
soglia (35γ/evento)
Correzione
all’errore
introdotto
dal
movimento del campione (10 nm in 2’)
introducendo delle microsfere fluorescenti
rsFastLime
λattiv [nm]
λeccit [nm]
λemis [nm]
ΦFL
ε(λec) [l/M·cm]
384
496
522
0.68
125000
Spettro di emissione ed assorbimento di rsFastLime
Andresen et al., Nature Biotech. 26, 1035–1040 (2008)
PALMIRA
3D-STORM
PALMIRA
Microscopio: Leica DM IRE2 (inverted microscope)
Activation e Readout: Ar+ (3.55.0 kW/cm2) con CF
illuminazione continua
Acquisizione: continua a 500Hz
totale: 120 s (60000 frames)
Fluoroforo: rsFastLime (disattivabile)
Filamenti di α-tubilina osservati con un microscopio
wide-field (A) o con la tecnica PALMIRA (B)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
Vantaggi PALMIRA
- costi per la strumentazione molto contenuti dato che è richiesto un
microscopio a fluorescenza commerciale, un solo laser ed un kit di filtri e
specchi dicromatici
- riduzione dei tempi di acquisizione (2’-3’)
- riduzione del background grazie all’elevato frame rate (500Hz): non è
necessario utilizzare dei metodi dedicati alla riduzione del background,
come ad esempio TIRFM
- rsFastLime è reversibile, quindi ha il vantaggio che se in un ciclo off-onoff non emette un numero sufficiente di fotoni, ha ancora altre possibilità
per essere rivelata
Progetti per il futuro: studio tridimensionale dei campioni con l’utilizzo, ad
esempio, di un processo di attivazione a più fotoni
intro
PA-FPs
Super resolution
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
3D STORM
Sfruttando l’astigmatismo introdotto da una lente
cilindrica posta dopo l’obiettivo (fig A), è possibile
ricavare delle informazioni riguardo alla posizione
z della molecola fluorescente osservata
(Cy3/A647)
Osservando a varie posizioni z una singola
molecola fluorescente, si valutano le FWHM
lungo le direzioni x ed y del fit gaussiano di ogni
2
“spot” osservato
2
y− y
G ( x, y ) = he
−2
( x − x0 )
wx2
−2
(
0
w2y
)
+b
Il grafico delle FWHM in funzione della posizione z mostra la distanza tra i due piani di messa a fuoco dovuti all’astigmatismo.
L’intersezione delle due curve di calibrazione fissa una posizione di riferimento. Tali curve permettono di stimare la posizione
z di ogni “spot” rivelato.
La figura C mostra l’applicazione
della procedura appena descritta ad
una singola molecola fluorescente.
Le deviazioni standard lungo le tre
direzioni sono 9 nm lungo x, 11 nm
lungo y e 22 nm lungo z.
B. Huang, W. Wang, M. Bates, X. Zhuang, Science 319, 810-813 (2008)
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
3D STORM: Huang et al., Science 319, 810-813 (2008)
Microscopio: Olympus IX71 (inverted microscope)
Activation: 532nm (< 2 µW)
illuminazione a impulsi 0.05s (2 µW)
Readout: 657 nm (~40 mW)
illuminazione continua (40 mW)
Acquisizione: ? frames da 0.05 s ciascuno (per # attivaz)(20Hz)
totale: ? s
Fluoroforo: Cy3/A647
La fig B mostra l’applicazione
della tecnica a dei microtubuli.
I falsi colori indicano la
profondità
rispetto
alla
posizione di riferimento z=0. Il
rettangolo bianco della fig B è
riportato nelle figure C, D ed E
PALMIRA
3D-STORM
Angolo di incidenza dell’illuminazione non
eccedente l’angolo critico (pseudo-TIRFM)
(Cui et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 104,
13666 (2007))
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
L’accuratezza della localizzazione di una molecola peggiora
allontanandosi dalla posizione di riferimento z=0.
Si limita quindi la profondità di analisi del campione a soli 600
nm. Si scartano dall’analisi tutti gli spot che hanno FWHM
che non soddisfano queste condizioni:
- h > threshold
- FWHMx/FWHMy ≈ 1
- FWHM del cluster <1.6*25nm lungo x,y
FWHM del cluster <1.6*55nm lungo z
Dalla figura precedente si solo localizzati 202 clusters (con
~8 molecole/cluster) separati dai microtubuli (anticorpi non
legati in modo specifico nella cellula) e si è valutato il loro
FWHM
Risoluzione della tecnica
3D STORM nei tre assi
22 nm in x
28 nm in y
55 nm in z
come STORM
PALMIRA
3D-STORM
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
La sequenza delle figure B-H è una dimostrazione del fatto che con la tecnica 3D
STORM si riesce a mostrare la morfologia di strutture cellulari nanometriche.
La sequenza mostra delle vescicole di diametro 150-200 nm; in particolare le figure
F,G,H mostrano, in falsi colori, che la cavità interna a queste vescicole è risolta.
intro
Super resolution
PA-FPs
(F)PALM/STORM
PALMIRA
3D-STORM
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- www.microscopyu.com