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CROMATOGRAFIA
Cromatografia: insieme di tecniche che consentono di separare composti chimici,
componenti in campioni complessi e miscele, ai fini di un’analisi sia qualitativa che
quantitativa.
Cenni storici: nasce nel 900, grazie aL botanico di origine russa M. Tswett che coniò il termine
cromatografia, dal greco “kroma”: colore, “graphein”: scrivere”. Alla lettera: “ scrittura del
colore”. Riuscì infatti a separare i pigmenti fogliari mediante una colonna di vetro impaccata
con una matrice solida.
campione
Separazione: principio di ripartizione tra due fasi ,
FASE MOBILE e fase fissa, FASE STAZIONARIA.
t1
t2
t3
Sistema di rivelazione
Ripartizione differenziale tra fase mobile e fase stazionaria : K(r) = Cs/Cm
L’evoluzione di questa tecnologia, basata su uno schema alla base semplicissimo,
ha dato origine a metodiche altamente diversificate e versatili per consentire la
separazione ottimale di composti specifici o gruppi di composti, con
caratteristiche chimiche vicine, contenuti nei campioni da analizzare.
CROMATOGRAFIA E CHIMICA CLINICA
Separare/identificare/quantificare molecole di varia natura e origine
in campioni biologici, fluidi corporei o cellule, estratti di plasma, siero
e tissutali - miscele molto complesse
Molecole a basso PM: ~ ≤ 1500 Da:
•endogene: neurotrasmettitori, ormoni, metaboliti; ex.: catecolamine(noradrenalina, dopamina,
etc..); ormoni steroidei (ex. neurosteroidi) ; metaboliti (ex. amino acidi, basi azotate e nucleotidi,
colesterolo); peptidi; ex.: neuropeptidi (vasopressina, ossitocina, etc..); glutatione (tripeptidi)..
•esogene: farmaci, sostanze tossiche, inquinanti organici, nutrienti, ex: antidepressivi,
antitumorali – monitoraggio terapeutico; pesticidi, ftalati – tossicologia; vitamine, luteina –
monitoraggio stato nutrizionale.
Molecole a moderato PM: ~ 2000 ≤ PM ≤ 5000 Da
•endogene: peptidi antimicrobici – difese innate (ex. defensine); peptidi intestinali e
dell’appetito (NPY, etc..) ; polisaccaridi a medio PM; lipidi
•esogene: peptidi microbici o di origine infettiva –microbiologia ; beta-glucani - nutrizione
Molecole ad alto PM: > 5000 Da
endogene: macromolecole , proteine, acidi nucleici, zuccheri in fluidi corporei e tessuti etc..
- ricerca clinica
esogene: macromolecole di origine esogena – ricerca clinica
Classificazione della CROMATOGRAFIA:
in base alla forma del supporto cromatografico che contiene la
fase stazionaria e in base allo stato fisico della fase mobile
Supporto cromatografico – fase stazionaria:
•Cromatografia planare: su strato sottile, su gel o su carta (Thin-Layer
Chromatography, TLC; Paper Chromatography);
•Cromatografia su colonna: colonna contenente la fase stazionaria, una
matrice di varia natura in base al tipo di cromatografia
Cromatografia su colonna - stato fisico fase mobile:
•Cromatografia Liquida (Liquid Chromatography , LC)
•Gas cromatografia (Gas Chromatography, GC)
•Cromatografia Supercritica (Supercritical Fluid Chromatography, SFC)
Cromatografia Liquida su colonna : classificazione
Distinzione in base al meccanismo di separazione :
Polarità
Idrofilici
Idrofobici
-Adsorbimento - ripartizione
Apolari
Siti attivi sulla fase stazionaria, trattenimento
selettivo delle molecole da separare nel campione o
nella miscela. Idrofobicità-polarità delle molecole
da separare, della fase mobile e della fase
stazionaria. Fase normale – fase inversa.
Ionici
Polari non ionici
102
scambio ionico
adsorbimento
Presenza di cariche sulla fase stazionaria
e
competizione tra molecole ioniche del campione da
separare e della fase mobile .
Forze elettrostatiche – resine a scambio
ionico/cationico e anionico.
-Esclusione
Gel filtrazione, permeazione. Matrice
Separazione in base al peso molecolare.
inerte.
Peso molecolare (Da)
-Scambio ionico
ripartizione
103
fase
normale
fase inversa
C4-C18
104
esclusione
105
gel filtrazione
gel permeazione
-Affinità
fase stazionaria inerte coniugata con molecoleligandi che legano in modo specifico le molecole da
separare.
Ex.: Reazione Antigene- anticorpo.
Separazione e purificazione di macromolecole
biologiche.
106
affinità
Applicazioni prevalenti in base al PM e polarità o carica
degli analiti da separare
Cromatografia preparativa ; cromatografia analitica
CROMATOGRAFIA SU COLONNA a pressione atm
Raccolta di frazioni, rivelatore
Lavorando a pressioni molto più elevate della pressione
atmosferica, ex. 1200 psi , ha migliorato la prestazione
della cromatografia e la quantificazione di molte sostanze
in tempi molto più brevi.
HPLC
IL CROMATOGRAMMA E IL PICCO ANALITICO
Ap
TR
3000
Caratteristiche salienti
del picco analitico
Ap= Apice del picco;
H
Signal
2500
T’R
2000
1500
TM
0
H/2
WH
1000
500
H= Altezza del picco,
distanza tra la linea di
base e A; H/2: metà
altezza del picco; segnale
del rivelatore
Fs
1
Linea di base
2
3
Wb
4
5
6
7
8
Time, min
W1/2: Ampiezza del picco
(min), presa a H/2;
Wb: Ampiezza alla base
del picco (min), presa alle
tangenti dei punti di
flesso alla base dl picco.
Caratteristiche del cromatogramma:
Fs = Fronte del solvente; TM: o t0, definizione: tempo morto o tempo necessario affinché una
molecola non trattenuta dalla fase stazionaria attraversi V0= volume morto della colonna;
TR: tempo di ritenzione della sostanza (analita): TM + T’R = TR, dove T’R = distanza tra Fs e
punto intersezione della perpendicolare da Ap sulla linea di base.
BASI TEORICHE: equazioni che definiscono le caratteristiche di ELUIZIONE, RISOLUZIONE e
SIMMETRIA dei picchi degli analiti.
CARATTERISTICHE DI ELUIZIONE E RISOLUZIONE
Fattore di capacità: K’ = (V – V0/V0) oppure (t-t0/t0),
dato dal grado di ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile
Efficienza della colonna analitica:
Piatto teorico: sezione di colonna che è in grado di creare un
equilibrio di ripartizione tra le due fasi degli analiti .
Ampiezza del picco Wb e TR : N= 16 (TR/Wb), dove N= numero di
piatti teorici , espresso anche come altezza del piatto teorico H =
L/N, con L = lunghezza della colonna (cm); da cui: N= L/H
Neff = 16 (T’R/Wb)2 , formula del numero di piatti teorici effettivi.
Formula considerando W1/2
Neff = 5.55 (W1/2/ T’R)2
Altezza di un piatto teorico effettivo:
H = L/Neff o L/16 (Wb/T’R)2 più è piccola, più i picchi sono
stretti e meglio risolti. Equazione che definisce i piatti teorici in
funzione dei tempi di rit.
Equazione di Van Deemter (LC/HPLC): allargamento del picco
H= A/(1 + Cm/u1/2) + B/u + Csu + Cmu1/2
H = altezza piatto teorico ed efficienza colonna; più H è un valore
basso tanto più l’efficienza della colonna è elevata
u= velocità lineare della fase mobile; A, B e C: fattori che concorrono all’allargamento
del picco e alla diminuzione dei piatti teorici;
A = Diffusione di Eddy o diffusione “erratica” :
delle molecole trasportate nella fase mobile; queste
possono seguire percorsi diversi, ex. lineari o tortuosi;
B= Diffusione longitudinale; dispersione delle
molecole rispetto al flusso della fase mobile; a bassi
flussi ha un peso nell’equazione: B/u;
Cs , Cm = Diffusione data dall’affinità differenziale di
una molecola per la fase mobile o per la fase
stazionaria; effetto maggiore quanto più è veloce il
flusso della fase mobile: Csu e Cmu1/2, specie per Csu.
Cs= d2 spessore/Ds; Cm= d2impaccamento/Dm
B/u
Csu
Risoluzione dei
picchi e selettività:
H
≥ 1.5
Risoluzione =
(Δtr/Wm) =
0.589 Δtr/Wm1/2
H/2
min
min
CARATTERISTICHE DI SIMMETRIA
Fattore di asimmetria - Tailing factor:
fronting
Picchi simmetrici
Fattore di asimmetria
TF = AB/2AC
≈ 1.0
tailing
5%H
. A. C .B
min
High Performance/Pressure - Liquid Chromatography
cromatografia liquida ad alta prestazione/pressione
HPLC Column
colonne
U(H)PLC
Nano-HPLC
Principali tipi di rivelatore:
Waste
Potenziamento tecnologico del sistema
Colonne analitiche con caratteristiche chimico-fisiche peculiari
Colonne analitiche e sistemi U(H)PLC e nano-HPLC:
Rivelatori ad alte prestazioni
Alta velocità, alta produzione , alta risoluzione analitica
HPLC: SISTEMA MODULARE
Bottiglie con eluenti
Degasatore
Pompa
Miscelazione
ad alta e bassa pressione
Analisi isocratica
Termostato
colonne
Pre-colonna in linea
Cromatografia di ripartizione
in fase normale o inversa:
Colonne analitiche:
Analisi in gradiente
(eluizione binaria, etc.)
Siringa HPLC
Valvola d’iniezione
RP-LC: Reversed-phase
Liquid Chromatography
U(H)PLC: ultra performance
HPLC
Colonna analitica
per nano-HPLC
RIVELATORI
Ultravioletto (UV), UV-PDA,
Fluorimetro, detector elettrochimico, Spettrometro di
Massa
UV-PDA
Fluorimetro
Elettrochimico
HPLC con spettrometro di massa
Hyphenated HPLC: più rivelatori in serie
TECNICHE ESTRATTIVE:
Alta influenza sulla
riuscita dell’analisi cromatografica
Matrici biologiche complesse: ex. urine, siero/plasma, saliva, ago aspirato, cellule
Devono essere pulite il più possibile da contaminanti e interferenti analitici.
Per separare e quantificare piccole molecole - Deproteinizzazione:
precipitazione preliminare acida, TFA, TCA, H2SO4, HClO4
Estrazione in fase solida: cartucce contenenti materiale solido di varia natura, cartucce
estrattive con caratteristiche vicine a quelle della colonna analitica (ex. C18) –cartucce a
ritenzione per sostanze più o meno polari, resine a scambio ionico.
Estrazione in fase organica: Fase acquosa (campione) e fase organica – solvente
estrattivo. Anche su colonna. Solventi: Acetonitrile, Metanolo, n-esano/eptano o miscele di
questi, in condizioni acide o base
Potenziamento delle tecniche estrattive
Estrazione in fase liquida e solida ottimizzate – fase solida
Workstations- automatizzazione
Uso di standard(s) interno/i (SI): (Area o Altezza)analita/(Area o Altezza )SI
Tecniche di preparazione del campione per biopolimeri e macromolecoleProteine
Tecniche di ultrafiltrazione
Tecniche di precipitazione frazionata salting out: solubilità delle proteine
o al punto isoelettrico
Tecniche elettroforetiche
COME SI LAVORA:
-Matrice biologica:
a) extracelllulare: sangue, urine, plasma, siero, liquor, liquido sinoviale ,
liquido amniotico, mezzi di coltura ,etc.. ;
b) intracellulare: tessuti, colture cellulari, omogenati etc..
-Estrazione degli analiti dalla matrice:
preparazione del campione da iniettare per l’analisi – eliminare interferenze,
“pulire” il cromatogramma da composti interferenti; procedura che deve
garantire: integrità analita/i , giusta concentrazione finale nella soluzione
d’iniezione (in genere fase mobile) – se si sceglie di lavorare con SI , aggiunta
alla matrice prima o dopo l’estrazione – di solito conviene prima
-HPLC dell’estratto :
iniezione del campione estratto e analisi cromatografica con il metodo
preliminarmente messo a punto per l’analisi dell’analita/i. Scelta di: colonna,
fase mobile, rivelatore e condizioni cromatografiche (flusso/pressione,
temperatura), modalità isocratica o in gradiente. Interpretazione del
cromatogramma; analisi dei picchi; confronto con gli standards.
Analisi qualitatitiva: identificazione del picco - si possono ottenere informazioni sull’identità
del picco cromatografico sia dal tempo di ritenzione che dalle caratteristiche del rivelatore.
Riconoscimento in base al tempo di ritenzione: uso di standards; confronto tra i tR dei
picchi dello standards e quelli del campione;
Riconoscimento mediante il detector: ex. Il detector UV-fotodiodi (PDA o DAD) fornisce
l’analisi spettrale UV – confronto tra spettro UV del picco dello standard e spettro del picco nel
cromatogramma allo stesso tempo di ritenzione. Visualizza sostanze che assorbono in UV.
Uso di doppio detector in linea: ex. Fluorimetrico ed elettrochimico; Detector in spettrometria
di massa.
Analisi quantitativa: una volta identificato il picco o i picchi d’interesse si può procedere
all’analisi quantitativa. Il picco analitico può essere quantificato o misurandone l’altezza H
oppure integrandone l’area A. Se si usa lo standard interno (SI), si deve utilizzare anche l’H o
l’A dello SI.
Rette di calibrazione: utilizzando gli STDs dell’analita: iniezione di concentrazioni crescenti
dello standards aggiunte nella matrice biologica, es. plasma; estrazione e cromatografia.
Rette di calibrazione con lo SI: si procede come sopra ma si aggiunge ad ogni punto di
concentrazione una concentrazione fissa di SI; estrazione e cromatografia.
C= Aa x + b
C= (Aa/ASI) x + b
o
C = Hax + b
o
C= (Ha/HSI)x + b
ESERCITAZIONE:
HPLC – Cromatografia ad esclusione molecolare con rivelazione fluorimetrica:
separazione di proteine da estratto di saliva umana
Size exclusion
chromatography
Gel permeation
chromatography
(GPC)
Gel filtration
Chromatography
(GFC)
Prelievo di saliva
Trattamento del campione, tecniche di estrazione come altre
matrici biologiche. Fluidificazione.
Elettroforesi di proteine e separazione di frazioni specifiche.
Frazioni raccolte, derivatizzate con molecola fluorescente e iniettate come segue
Condizioni cromatografiche: corsa isocratica, flusso 0.5 ml min-1,,temperatura:
25 °C; colonna Zenix Sec100 (300 mm x 7.8 mm, 3 mm dpi); precolonna
Zenix ; Detector fluorescenza: λex: 496 nm – λem: 518 nm.
Composizione fase mobile: 97% soluzione NaH2PO4 150 mM, NaCl 200 mM, pH=7;
3% ACN (acetonitrile) – 97:3 (v:v) fase acquosa:fase organica.